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WO2006051729A1 - P450遺伝子の単離法 - Google Patents

P450遺伝子の単離法 Download PDF

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WO2006051729A1
WO2006051729A1 PCT/JP2005/020180 JP2005020180W WO2006051729A1 WO 2006051729 A1 WO2006051729 A1 WO 2006051729A1 JP 2005020180 W JP2005020180 W JP 2005020180W WO 2006051729 A1 WO2006051729 A1 WO 2006051729A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
seq
amino acid
protein
monooxygenase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2005/020180
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mitsutoshi Kubota
Miho Nodate
Taku Uchiyama
Norihiko Misawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kitasato Institute
Original Assignee
Kitasato Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kitasato Institute filed Critical Kitasato Institute
Priority to JP2006544862A priority Critical patent/JPWO2006051729A1/ja
Priority to US11/665,843 priority patent/US20080220419A1/en
Priority to EP05799974A priority patent/EP1811029A4/en
Publication of WO2006051729A1 publication Critical patent/WO2006051729A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a method for isolating a gene encoding a protein that functions as P450, an oligonucleotide useful for the method, a novel gene isolated by the method, a protein encoded by the gene, the protein
  • the present invention relates to a fusion type P450 monooxygenase containing, and a method for producing an acid-sodium compound using the enzyme.
  • the enzyme gene is isolated without going through the steps of separating and culturing microorganisms such as bacteria from samples such as seawater and soil and averaging the DNA extracted from the separated and cultured microorganisms.
  • This method is effective in isolating a new P450 gene from natural genetic resources, particularly when the amount of microorganisms having the target gene in the genetic resources is small.
  • the gene force synthesized P450 obtained in the present invention can be used as a biocatalyst for the production of useful substances in the chemical industry.
  • Cytochrome P450 monooxygenase is an oxygenated enzyme that is distributed in a wide range of biological species from bacterial power plants and mammals. In addition to reducing oxygen molecules to make one molecule of water, It is an iron enzyme that catalyzes the reaction of introducing the remaining oxygen atoms into various low-molecular organic compounds and converting them into oxidation products (one-atom oxygenation reaction). P450 not only maintains the molecular structure and basic catalytic mechanism, but also changes the structure of the substrate binding site, thereby dehydrating, epoxidizing, CC bond cleavage, aromatizing, and dehydrating.
  • the reaction catalyzed by P450 is based on the biosynthesis of animal hormones and plant secondary metabolites from the biosynthesis of foreign substances taken into the living body. From disassembly to power, it is diverse and extensive. Thus, P450 is attracting attention in the field of bioindustry because it is involved in the oxidation of all types of organic compounds. Specifically, studies are underway to synthesize new organic low molecular weight compounds and decompose environmentally hazardous substances by using P450 catalytic reactions for compounds that are difficult to oxidize using existing methods. . Recently, from an industrial point of view, biotechnology The use of P450 of microorganisms including bacteria has been devised for the purpose of application to conversion technology (Non-patent Document 1).
  • P450 which has been well studied in bacteria, has a structure fused with P4 50cam from Pseudomonas putida, the first crystal structure of which was solved by P450, and a reductase, which is necessary for the P450 acid-acid reaction.
  • Examples include P450BM3 derived from Bacillus megaterium. These enzymes have also been tried to improve enzyme activity and substrate specificity by molecular evolution engineering techniques! (Non-patent Document 1). However, the previously known bacterial P450 was very weak compared to the abundance of bacterial species. On the other hand, recent progress in genome analysis has brought a new phase to P450 research. The genome analysis of many bacteria has been completed, and it has become clear that there are many bacterial P450s.
  • P450 sequences in Mycobacterium tuberculosis there are 20 P450 sequences in Mycobacterium tuberculosis, and 18 P450 sequences in Streptomvces coelicolor. Was. Attempts have also been made to use the newly discovered P450 as an oxidase resource in bioconversion.
  • many P450s have recently been isolated and analyzed from microorganisms, and all of these P450s are derived from species that can be isolated and cultured.
  • the number of microorganisms that can be isolated and cultured is 1% or less regardless of the habitat environment such as soil and ocean (Non-patent Document 2), so P450 derived from microorganisms currently identified is limited, It is estimated that there are many P450s in the environment that are still difficult to isolate and identify.
  • Non-patent Document 3 a primer specific to the gene is designed from a known protein having the desired function or the amino acid sequence or base sequence of the gene, and then the DNA directly extracted from environmental samples such as soil and seawater is extracted. Perform PCR amplification and other DNA amplification reactions as a vertical type This is a method in which the amplified DNA fragment is isolated and then not amplified by the amplification reaction using the above-mentioned primer! Both ends of the gene are supplemented with the base sequences of known similar genes.
  • a library is produced as it is, many genes derived from microorganisms with high abundance are contained.
  • the target gene is a gene derived from a microorganism (rare microorganism) that exists only in a small amount in the soil, it is difficult to isolate the gene.
  • a library is created after normalizing DNA extracted directly from the natural environment such as soil using the difference in GC content A method is disclosed (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 Patent Document 1
  • this method of averaging cannot be used when the abundance of rare microorganisms and the GC content of microorganisms are similar.
  • Examples of compounds that are expected to be converted by the catalytic reaction of P450 include petroleum components such as alkanes (linear hydrocarbons). Alkanes are converted into diol dicarboxylic acids by acidifying both ends, and then used as industrial raw materials for polymers, fragrances, medicines and the like. Although it is currently synthesized by the petrochemical industry, there is a demand for an alternative to biotechnological production methods, and the acid-acid reaction at the alkane end by biological species is drawing attention.
  • CYP52 family members existing in yeasts such as Candida, maltosa (Candida m altosa) and Candida 'Tropicalis (Candida imEk ⁇ lk) are known as P450s that oxidize alkane ends (Non-patent Document 4).
  • Candida maltosa has been shown to have different specificities in terms of the types and chain lengths of the four types of gene forces belonging to the CYP52A subfamily that are strongly induced by alkanes in the CYP52A subfamily.
  • the Prokaryotic P450 presumed to be involved in the degradation of alkanes, was first discovered as a long-chain H-alkane-utilizing bacterium, Acinetobacter calcoaceticus EB104 strain ⁇ 104! (Non-patent document 5). Recently, the presence of P450 has been revealed in several types of bacteria such as Alcanivorax borkumensis and Rhodococcus ervthropolis, which have an alkane capital, and these P450s are CYP153A subfamily. (Non-patent document 6 and Dr. Nelson's homepage (http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html)).
  • Non-Patent Document 7 The P450 gene is a reductase-fused P450 and is expected to be applied to bioconversion technology with high expression efficiency in Escherichia coli, but it is mainly a side chain hydroxylation reaction rather than an alkane end. It has not been put into practical use. As described above, since P450 that performs alkane terminal oxidation reaction is expected to be used in industry, there is only limited knowledge that has been actively researched. It can be said that there is very little information.
  • P450 monooxygenase can be divided into two types (classes) depending on the method of electron transfer.
  • the first class (class I) is a NAD (P) H-iron protein (ferredoxin) reductase (reductase) containing flavin adenyl dinucleotide (FAD) as a coenzyme in the molecule. Reductase), and the iron protein (fredoxin) is used to supply electrons to the P450 protein from NAD (P) H (this class will be referred to as “three-component P450 monooxygenase in the future). ) O Mitochondrial and bacterial P450 monooxygenases usually belong to this class.
  • the second class is a NADPH-P450 reductase that contains FAD and flavin mononucleotide (FMN) as coenzymes in the molecule.
  • this class may be referred to as “binary P450 monooxygenase”.
  • O P450 monooxygen present in microsomes of mammalian liver Nase corresponds to this class II.
  • P450 (PB-1) derived from Corvnebacterium sp. EP1 was active in the presence of spinach-derived electron donors (Kawahara N, et al. Purincation and characterization or 2— ethoxyphenol— (Induced cytochrome P450 from Corynebacterium sp. strain EP1. Can J Microbiol. 45: 833-839, 1999). It is not applicable to 450, but it is currently used in search of an electron transfer protein that is compatible with each P450, and the force is compatible without much effort. In order to find a good electron transfer protein, it was necessary to focus on the P450 family with the ability to limit to certain bacterial species and high homology with each other, and to select a more functional electron transfer protein.
  • P450BM3 is derived from bacteria, both P450 body protein part (heme domain) and NADPH-cytochrome P450 reductase domain are exceptionally high in homology with P450 and P450 reductase belonging to class II derived from eukaryotes. Electron donation It is thought that it could be applied as a body.
  • P450BM3 is P450 derived from bacteria, it is different from P450 derived from general three-component bacteria belonging to class I.
  • P450BM3 only one example of successful production of a P450-reductase domain fusion enzyme using a bacterial P450 protein (successful production of an active fusion enzyme) is one example. It is simply a fusion of the components of P450 monooxygenase in the same system (S3 ⁇ 4besen, 0., et al. Putidaredoxin reductase —putidaredoxin—cytochrome P450cam triple fusion protein, construction of a self— su fficient Escherichia coli catalytic system. J Biol Chem. 271: 22462-9, 1996).
  • P450 monooxygenase that does not fall under any of the above-mentioned P450 monooxygenase fused type P450 monooxygenase belonging to class I or class II has been recently reported (Non-patent Document 8).
  • P450RhF P450 monooxygenase isolated from the Rhodococcus genus NCIMB9784
  • P450 body protein hemdomone
  • FMN flavin mononucleotide
  • the NADH-P 450 reductase domain and iron protein domain contained in the molecule are linked as a single polypeptide.
  • P450RhF P450 monooxygenase
  • Patent Document 1 Japanese Translation of Special Publication 2000-513933
  • Non-patent literature l Urlacher et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 64: 317-325 (2004)
  • Non-patent literature 2 Thomas et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 10494-10499 (2002)
  • Non-patent Reference 3 Okuta, A. et al, Gene. 212: 221-228 (1998)
  • Non-Patent Document 4 Ohkuma et al, J. Biol. Chem. 273: 3948-3953 (1998)
  • Non-Patent Document 5 Thomas et al, Biochem. Biophy. Res. Comm. 286: 652-658 (2001)
  • Non-Patent Document 6 Beilen et al, biocat 2004 Book of Abstracts, p. 233
  • Non-Patent Document 7 Glieder et al, Nat. Biotechol. 20: 1135-1139 (2002)
  • Non-Patent Document 8 Roberts, G.A., et al, Identification of a new class of cytochrome P450 from a Rhodococcus sp. J. Bacteriol. 184: 3898-3908, 2002.
  • the first object of the present invention is to provide a method for isolating various P450 genes from microorganisms that are efficient in microbial resources that exist in various environments, particularly those that are rare in the environment.
  • P450 monooxygenase is very diverse in terms of substrate specificity and reaction specificity, and is expected to be applied to various useful biocatalytic reactions.
  • CYP P450 protein
  • CYP CYP
  • active P450 monooxygenase must be reconstituted.
  • Coexistence of electron transfer proteins that appropriately donate electrons to body proteins is essential. However, it is difficult to find electron donors that respond to individual P450s, particularly new P450s.
  • the enzyme activity of the P450 monoxygenase system itself is generally weak and inactive. There is a strong demand for the development of a system that can handle various P450 proteins and perform efficient electron transfer.
  • the second object of the present invention is to construct such a system and produce active P450 monooxygenase Is to provide a method.
  • the present inventors have found that in the CYP153A subfamily formed by a plurality of P450 genes derived from microorganisms that assimilate petroleum components. We found a region in which the amino acid sequence was relatively well conserved, and found that it was possible to amplify new P450 gene fragments from various environmental DNA samples using primers designed based on this region! In addition, the cassette PCR method was used to create a hybrid gene between the amplified P450 gene and the known P450 gene, and then established a functional analysis method for the hybrid gene using the E. coli expression system.
  • P450RhF cytochrome P450 monooxygenase
  • NCIMB9784 strain As explained in “Background Art”, P450RhF is a fused P450 monooxygenase in which the P450 body protein and the P450 reductase domain (region) are fused and exist as a single polypeptide chain. .
  • Non-Patent Document 1 In general, actinobacteria such as Rhodococcus bacteria have a variety of catalytic functions involved in the conversion reaction of various organic compounds, and correspondingly have complicated enzyme systems. As it is known, it seems difficult to expect versatility for this novel enzyme such as P450RhF. Furthermore, it has been known that it is often difficult to cause a gene involved in an enzyme system derived from Rhodococcus bacteria to function in a general-purpose host such as E. coli.
  • the P450RhF of the present inventors could not be expected as a material for the purpose of the present inventors, that is, the development of an electron transfer system to the P450 having both versatility and efficiency. Even so, the present inventors cannot use the reductase region of P450RhF to act as an electron transfer system to P450 main body proteins derived from various bacteria, and furthermore, electron transfer becomes intramolecular transfer. As such, it was difficult to work as a fusion protein. As a result, unexpectedly, the P450RhF reductase domain has catalytic activity and strength by fusing the C450 terminus of a P450 body protein derived from a different bacterium through an appropriate linker region. I was able to make P450 monooxygenase which is difficult to inactivate.
  • Strain NCIMB9784 having a base sequence encoding cytochrome P450 protein (CYP) derived from bacteria.
  • CYP cytochrome P450 protein
  • a single polypeptide gene can be used to combine the monooxygenase activity of P450 and the ability to supply the NAD (P) H force of the P450RhF reductase domain within the same molecule.
  • An artificial fusion enzyme gene expression system encoding an artificial fusion enzyme is established. We applied the expression system to several P450 genes derived from different bacteria and succeeded in producing an artificial fusion enzyme in E. coli.
  • the produced artificial fusion enzyme has both functions of electron transfer and substrate acidity in a single molecule, and it was confirmed that the constructed fusion protein gene expression system can handle various P450 genes. . Furthermore, using the constructed fusion protein gene expression system, it was confirmed that the biocatalytic activity of P450 could be observed by a simple bioconversion reaction using an E. coli culture solution.
  • the present invention provides the following (1) to (23).
  • a P450 gene fragment comprising a base sequence encoding part or all of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 51 or 52, or a base sequence complementary thereto, and having a substantial function as a primer or probe Isolation oligonucleotide.
  • a P450 gene fragment comprising a step of extracting a nucleic acid from a sample, and a step of performing a nucleic acid amplification reaction using the extracted nucleic acid as a cage and using the oligonucleotide according to (1) or (2) as a primer Isolation method.
  • a step of isolating a P450 gene fragment using the oligonucleotide according to (1) or (2) as at least one primer, and the 5 ′ end and 3 ′ of the isolated P450 gene fragment A method for producing a hybrid P450 gene, comprising the steps of adding a 5 ′ end region and a 3 ′ end region of a known P450 gene to each of the ends.
  • a P450 gene isolation kit comprising the following (a) to (c):
  • [0030] Functions as P450, characterized by culturing host cells transformed with the expression vector according to (10) in a medium, and recovering the protein according to (11) from the obtained culture. Protein production method.
  • the substrate is n-hexane, n-heptane, n-octane, IT decane, 1-octene, cyclohexane, ⁇ -butylbenzene, 4-phenyl-1-butene, or 2- ⁇ 1-hexanol, 1-heptanol, 1-octanol, 1-decanol, 1,2-epoxyoctane, cyclohexanol, 4-phenyl-
  • the method for producing an oxidized compound according to (22) which is 1-butanol, 2-phenethyloxysilane, or 4-benzofuran-2-yl-butan-1-ol.
  • the present invention provides a method for efficiently isolating a novel P450 gene from a sample containing nucleic acids derived from various microorganisms such as environmental samples.
  • P450 gene force provided by the method of the present invention
  • the produced P450 can be used for the production of various low molecular weight organic compounds.
  • P450 monooxygenase of the present invention by producing the fused P450 monooxygenase of the present invention from existing and unknown P450 proteins, these P450 proteins can function as a one-component system having both functions of electron transfer and substrate oxidation.
  • P450 monooxygenase can be made This eliminates the need for experimentation on the reconstruction of a reaction system with an electron transfer protein, which was previously required for presentation of P450 monooxygenase activity. This speeds up screening for useful P450 biocatalytic activity, simplifies the purification of useful P450 enzymes, bioconversion processes of useful substances by microorganisms expressing the fusion enzyme gene, and the acidity of harmful substances in industrial wastewater. Practical application such as automatic removal becomes possible.
  • FIG. 1 A diagram showing the phylogeny based on the homology between the acquired amino acid sequence of P450 (SEQ ID NOs: 1 to 25) and the known P450 amino acid sequence.
  • FIG. 2 Changes in absorption spectra of crude extract A (Fig. 2A), crude extract B (Fig. 2B), and crude extract C (Fig. 2C) due to carbon monoxide aeration in the reduced state Figure.
  • FIG. 3 is a chart showing a chart obtained by analyzing a reaction solution with a gas chromatography mass spectrometer after an enzyme reaction using crude enzyme solutions B and D with octane and 1-decene as substrates.
  • FIG. 4 shows the structure of the expression plasmid pRED for producing fused P450.
  • FIG. 5 A comparison of the amount of 1-alcohol detected as an acid when an n -alkane having 6 to 8 carbon atoms is used as a substrate.
  • FIG. 6 A diagram showing a chart obtained by derivatizing a conversion reaction product using n-butylbenzene as a substrate by bacterial suspensions H5, H9, Alk and control Non, and analyzing it by a gas chromatography mass spectrometer.
  • FIG. 7 Chart showing analysis by gas chromatography / mass spectrometer after conversion reaction based on 4-phenyl-1-butene by bacterial suspensions H5, H9, Alk and control Non. Figure.
  • FIG. 8 shows the optical properties of artificially fused P450cam (FIG. 8A) and non-fused P450cam (FIG. 8B).
  • FIG. 9 A graph showing the ability of P450cam-producing Escherichia coli to produce a camphor power and a conversion to 5-hydroxy camphor.
  • FIG. 10 is a graph showing the ability to convert ⁇ -octane to 1-octanol by P450alk-producing Escherichia coli.
  • FIG. 11 Fusion and non-fusion ⁇ From 4-hydroxybenzoic acid by P450bzo-producing Escherichia coli 3,4
  • FIG. 6 is a graph showing the ability to convert to -dihydroxybenzoic acid.
  • FIG. 12 is a diagram showing the ability to convert 7-ethoxycoumarin to 7-hydroxycoumarin by fused and non-fused P450SU-1, SU-2 producing E. coli.
  • Lane No. 1 7-ethoxycoumarin
  • 2 7-hydroxycoumarin
  • 3 P450 non-owner
  • 4 pETP450SU-1 possession
  • 5 pSU-1RED possession
  • 6 pETP450SU-2 possession
  • 7 pSU-2RED holding stock.
  • P450 monooxygenase is a complex enzyme that requires an electron transfer protein in addition to cytochrome P450 body protein (CYP).
  • NAD (P) H force is also a protein that transmits electrons, and bacteria and eukaryotic mitochondria require the intermediation of ferredoxin reductase and ferredoxin.
  • Microsomes require the intervention of NADPH-P450 reductase.
  • P450 has a common sequence FXXGXR / HXCXG 50 to 60 residues before the C-terminus. This sequence is called the heme-binding region and is unique to P450.
  • P450 genes are classified based on the similarity of amino acid sequences, and the latest information is posted on Dr. Nelson's website (http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html).
  • genes belonging to the P450 superfamily are distinguished by the common prefix CYP followed by the family number, subfamily symbol, and gene number. In principle, if the amino acid sequences match 40% or more, they are classified into the same family, and if they match 55% or more, they are classified into the same subfamily.
  • the monooxygenase activity is a reaction in which oxygen molecules are reduced to produce one molecule of water, and the remaining oxygen atoms are introduced into various low-molecular organic compounds to convert them into oxidation products. It means the action of catalyzing.
  • P450 monooxygenase has the property that, when aerated with carbon monoxide in a reduced state, the absorption spectrum changes and a difference spectrum (CO difference spectrum) having a maximum at 450 nm appears.
  • Has monooxygenase activity Means a protein.
  • CYP153A1 was first discovered in Acinetobacter calcoaceticus EB104 strain (Non-patent Document 5). Later, P450 belonging to the CYP153 family was discovered even in several types of microorganisms capable of assimilating alkanes! (Dr. Nelson's website (http: ⁇ drnelson.utm em.edu/CytochromeP450.html)).
  • the CYP153A1 gene was expressed using Pseudomonas putida, which lost alkane (octane) assimilation ability, as the host, and the growth state in a medium containing octane was observed.
  • P450 is a monooxygenase that introduces a hydroxyl group at the end of octane
  • Non-patent Document 6 The present inventor is the first to report that P450 has an activity of introducing a hydroxyl group at the end of alkane, not limited to P450 belonging to the CYP153 family.
  • general P450 derived from microorganisms is thought to require the intermediation of ferredoxin reductase and ferredoxin as electron transfer proteins in order to catalyze the oxidation reaction.
  • the oligonucleotide for isolating the P450 gene fragment of the present invention (hereinafter referred to as “the present oligonucleotide”) is a base sequence encoding part or all of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 51 or 52, or a base sequence complementary thereto. And an oligonucleotide substantially having a function as a primer. By using this oligonucleotide as a primer, the P450 gene fragment can be isolated.
  • “oligonucleotide” means either deoxyribonucleotide or ribonucleotide
  • nucleic acid means DNA or RNAI deviation.
  • oligonucleotides are registered on Nelson's website (http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html)! Three P450 superfamily members belonging to CYP153A, namely CYP153A1 (accession no. AJ311718 ), CYP153A2 (accession no. AE 005680) It is designed based on the amino acid sequence of 153 13 & (SEQ ID NO: 57). In other words, this oligonucleotide was designed based on the conserved region of P450 predicted by the alignment of these sequences.
  • this oligonucleotide is designed to have a substantial function as a primer.
  • “having a substantial function as a primer” refers to a length and a base composition that allow specific annealing or hybridization, for example, specific annealing or hybridization. It has the meaning of (melting temperature). That is, this oligonucleotide frequently causes non-specific annealing due to its short sequence length or inappropriate base composition, eliminating oligonucleotides that cannot be used for specific amplification of P450. It means to do.
  • the length of the oligonucleotide having a substantial function as a primer is preferably 10 bases or more, more preferably 16 bases or more, and most preferably 18 bases or more.
  • Specific examples of suitable present oligonucleotides include oligonucleotides represented by the base sequences described in SEQ ID NOs: 53 to 56.
  • an assembly sequence may be added to the 5 ′ end of this oligonucleotide for the preparation of a noble or hybrid gene described later.
  • the assembly sequence is a sequence that can be annealed to a known P450 gene fragment.
  • a P450 gene fragment amplified using this oligonucleotide as a forward primer and a reverse primer has only the sequence of the region sandwiched between the forward primer and the reverse primer! That is, the 5 'terminal sequence including the start codon and the 3' terminal sequence including the stop codon are missing. This missing sequence can be compensated by annealing with the 5 ′ and 3 ′ end fragments of the known P450 gene and performing an extension reaction.
  • the sequence used for annealing with the 5 ′ end fragment or 3 ′ end fragment of the known P450 gene at this time is the assembly sequence.
  • the assembly sequence is usually the 3 ′ end sequence of a known 5 ′ end fragment.
  • the assembly sequence is usually the 5 ′ end sequence of a known 3 ′ end fragment.
  • This oligonucleotide includes those to which this assembly sequence is added.
  • the length of the added assembly sequence may be any length that can be annealed with a known 5′-end fragment or 3′-end fragment and does not interfere with the nucleic acid amplification reaction.
  • the base is preferably 5 to 50 bases, more preferably 10 to 20 bases.
  • This oligonucleotide can be synthesized according to methods known to those skilled in the art, such as the phosphite method and the phosphotriester method.
  • Isolation of a novel P450 gene fragment can be performed using the oligonucleotide described in the section “(1) Preparation of oligonucleotide for isolating P450 gene fragment”.
  • a novel P450 gene fragment can be isolated by carrying out an amplification reaction using the present oligonucleotide as a primer (hereinafter referred to as “the present isolation method”).
  • the sample to be isolated from the new P450 gene fragment may be any sample that appears to contain nucleic acids derived from prokaryotic organisms.
  • the sample include a sample derived from an environment in which unknown microorganisms are miscellaneous in addition to a culture in which microorganisms are artificially cultured.
  • environment-derived samples include seawater, fresh water, soil, and the like.
  • nucleic acid is usually extracted from a sample.
  • the nucleic acid to be extracted may be either DNA or RNA. DNA or RNA can be extracted using methods well known in the art as appropriate.
  • guanidine monosalt-cesium ultracentrifugation methods using glass beads, etc.
  • RNA extraction methods using glass beads, etc.
  • guanidinium thiomuenate-chloroform (AGPC) method can be used.
  • AGPC guanidinium thiomuenate-chloroform
  • Concentration of the sample can be performed by filtering the sample with a filter having an appropriate pore size.
  • the material of the filter used for filtration is not particularly limited as long as it is generally used for the filter.
  • cellulose acetate, nitrocellulose, cellulose mixed ester, polyvinylidene difluoride, polytetraflur Examples include polyethylene, polycarbonate, polypropylene, silver and the like.
  • a method has been devised in which a carrier impregnated with a medium is placed in water and the microorganisms attached to the carrier are efficiently recovered. (JP 2003-334064). Less than From the sample collected as described above, the nucleic acid can be extracted by the appropriate method described above after disrupting the cells with a surfactant such as SDS, if necessary.
  • a surfactant such as SDS
  • nucleic acids can be extracted by techniques known to those skilled in the art.
  • Examples of the method for extracting nucleic acid of soil force include the method of Zhou et al. (Zhou et al Appl. Environ. Microbiol. 62: 316-322 (1996)) and the method of Griffiths et al. (Griffiths. Appi. Environ. Microbiol. 66: 5488-5491 (2000)).
  • a P450 gene fragment can be isolated from the nucleic acid extracted as described above by using the oligonucleotide described in the section “(1) Preparation of oligonucleotide for isolating P450 gene fragment” as a primer.
  • the P450 gene fragment can be specifically amplified by carrying out a nucleic acid amplification reaction using the nucleic acid extracted as described above in a cage shape and using the oligonucleotide of the present invention as a primer.
  • the present oligonucleotide designed on the basis of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 51 is used as a forward primer
  • the present oligonucleotide designed based on the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 52 is used as a reverse primer.
  • the oligonucleotide used as a primer in the nucleic acid amplification reaction may be a degenerated primer.
  • the method for carrying out the nucleic acid amplification reaction is not particularly limited as long as the amplification reaction can be carried out using the oligonucleotide of the present invention as a primer, but the most suitable method is the principle of the polymerase chain reaction (PCR) method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Amplification is performed until the amplification product is detectable.
  • the PCR method synthesizes a base sequence between a pair of primers using DNA as a saddle and DNA polymerase.
  • the amplified fragment can be amplified exponentially by repeating a cycle including denaturation, annealing, and synthesis ability.
  • the optimum PCR conditions can be easily determined by those skilled in the art.
  • cDNA is prepared by reverse transcriptase reaction using RNA as a saddle, and then PCR is performed using the prepared cDNA as a saddle and a pair of primers.
  • the conditions under which specific amplification of the P450 gene occurs when this oligonucleotide is used as a primer can be appropriately set by those skilled in the art from the length and base composition of this oligonucleotide used as a primer. it can.
  • the amplified P450 gene fragment is fractionated by agarose gel electrophoresis etc. Then, it can be obtained by cutting out the band confirmed to be amplified and extracting the DNA.
  • the P450 gene fragment amplified by the method described in “(2) Isolation of a novel P450 gene fragment” does not include the sequencing force of the region sandwiched between the oligonucleotide and the region to be annealed. That is, the 5 ′ terminal region including the start codon and the 3 ′ terminal region including the stop codon are not included. Therefore, the P450 gene fragment amplified by the method described in (2) may not have a function as a P450 gene. In order to solve this problem and obtain a DNA fragment that functions as a P450 gene, both ends of the P450 gene fragment amplified by the method described in (2) should be supplemented with a known P450 gene sequence.
  • the known P450 gene used for the supplementation at both ends may be any known bacterial P450 gene, but it encodes the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 51 and 52. It is preferable that the nucleotide sequence includes An example of such a P450 gene is a gene belonging to CYP153A of the P450 superfamily registered on the homepage of Dr. Nelson (http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html).
  • the center is the base sequence of the unknown P450 gene, and both ends are known P450 genes.
  • a hybrid gene having the nucleotide sequence of can be prepared. This hybrid P450 gene can be produced by introducing it into a suitable host.
  • the 5'-terminal region of the P450 gene (from the start codon to the forward primer and annealing used in the amplification method described in (2)) To the region to be used: hereinafter referred to as “5-arm fragment”) and the 3 ′ end region (region power to anneal with the reverse primer used in the amplification method described in (2) up to the start codon: hereinafter referred to as “3-arm fragment” ”) And annealing, followed by extension reaction.
  • the primer used for obtaining the hybrid P450 gene may be one to which the assembly sequence described in the section “(1) Oligonucleotide for isolating P450 gene fragment” is added. Amplified P by using primers with assembly sequence added The annealing efficiency of the 450 gene fragment with the 5-arm fragment and 3-arm fragment can be increased.
  • the 5-arm fragment and the 3-arm fragment can be prepared by performing a nucleic acid amplification reaction using a DNA containing a known P450 gene that complements both ends as a saddle. Primer design and synthesis can be performed based on knowledge known to those skilled in the art.
  • the reaction conditions for the amplification reaction can be set based on knowledge known to those skilled in the art based on the length and base composition of the primer used.
  • the 5-arm fragment and the 3-arm fragment can be used as primers for the amplification reaction primer, the base of the region containing the start codon of the 5-arm fragment and the region containing the start codon of the 3_arm fragment It is preferable to add an oligonucleotide containing the sequence as a primer. Primer design and synthesis can be performed based on knowledge known to those skilled in the art.
  • the reaction conditions for the amplification reaction can be set based on knowledge known to those skilled in the art based on the length and base composition of the primer used.
  • the amplified novel P450 gene can be isolated by fractionating a nucleic acid fragment by agarose gel electrophoresis or the like, cutting out the band confirmed to be amplified and extracting the DNA.
  • a phage, a phagemid vector or a plasmid vector can be used as an expression vector to be introduced into the host.
  • the host is not particularly limited as long as the expression vector functions, and animal cells, yeast cells, actinomycetes, bacterial cells and the like can be used. Preferred examples of bacterial cells include Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • the expression vector must have an expression control region such as a promoter upstream of the inserted gene fragment or hybrid gene. Examples of such an expression control region include a promoter when E. coli is used as a host.
  • the host into which the expression vector has been introduced may be cultured in a suitable medium according to the host, and the resulting cells or the crude extract obtained by disrupting the cells may be used to measure the CO difference spectrum and the monooxygenase activity.
  • the CO difference spectrum was measured by treating the crude extract with sodium thionite (Na 2 S 0) and venting carbon monoxide, followed by absorption spectroscopy.
  • Monoxogenase activity is measured by the ability to cultivate host cells in the presence of a low molecular weight organic compound as a substrate under the expression conditions of a P450 gene fragment or hybrid gene and an electron transfer protein gene. This is done by reacting a crude extract of a host cell cultured by expressing an expression vector containing a gene fragment or gene, an hybrid gene, and an electron transfer protein gene, and examining whether or not substrate oxidation occurs. Can do.
  • the P450 gene fragment or the P450 hybrid gene can be obtained by extracting the cultivated bacterial cell DNA of the clone by the above method.
  • the P450 gene isolation kit of the present invention (hereinafter referred to as “this kit”) is for isolating the hybrid P450 gene described in “3. Cassette PCR method”.
  • This kit is characterized in that it contains at least the oligonucleotide described in the section “3. Cassette PCR method” and a 5-arm fragment and a 3-arm fragment.
  • oligonucleotides described in the section “(1) Preparation of oligonucleotide for isolating P450 gene fragment” are used as the forward primer and the reverse primer for the first-stage nucleic acid amplification primer.
  • an oligonucleotide containing a base sequence encoding part or all of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 51 is used as a forward primer, and part or all of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 52 is encoded.
  • An oligonucleotide containing a sequence complementary to the base sequence is used as a reverse primer.
  • This kit is characterized by including at least one set of these forward primer and reverse primer. These forward and reverse primers may be degenerated primers.
  • An assembly sequence may be added to the primer included in the kit.
  • This kit is characterized in that it contains the 5-arm fragment and 3-arm fragment described in “3. Cassette PCR”.
  • the 5-arm fragment is a nucleic acid fragment containing at least the region encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 51 in the known P450 gene.
  • the 3-arm fragment is a nucleic acid fragment containing at least the region encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 52 to the stop codon in the known P450 gene.
  • the primer described in the section “(1) Primer for nucleic acid amplification reaction at the first stage” is added with an assembly sequence, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 51 or 52 is not necessarily included. It does not have to contain the coding area.
  • the known P450 gene that forms the basis of the 5-arm fragment and the 3-arm fragment may be any bacterial origin, but the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 51 and 52 Including, is preferred to.
  • the 5-arm fragment and the 3-arm fragment may be single-stranded DNA or double-stranded DNA.
  • This kit may contain a buffer for nucleic acid amplification reaction, a dNTP mixture, enzymes (such as DNA polymerase) and the like.
  • a forward primer designed based on the region containing the start codon of the 5-arm fragment and a 3-arm fragment A reverse primer designed based on the region containing the termination codon of the fragment may be included.
  • the novel P450 gene of the present invention is a gene encoding the following protein (a) or (b).
  • the protein of (a) other than SEQ ID NO: 85 is based on DNA extracted from the environmental sample by the method described in “(3) Method for preparing hybrid P450 gene” in “3. Cassette PCR method”.
  • the protein produced by the hybrid P450 gene produced in The protein of SEQ ID NO: 85 is a protein encoded by a new gene (SEQ ID NO: 86) isolated from the Noudiadia strain Hou_Blue, which is a Gram-positive bacterium.
  • Specific examples of the gene encoding the protein (a) include the gene represented by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 26 to 50 or SEQ ID NO: 86.
  • the protein (b) is a protein in which an amino acid mutation is introduced into the protein (a) to such an extent that the P450 function is not lost.
  • Such mutations include artificial mutations in addition to those occurring in nature. Examples of the means for causing artificial mutation include, but are not limited to, site-specific mutagenesis (Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982).
  • the number of mutated amino acids is not limited as long as the monooxygenase activity is not lost, but it is preferably within 20 amino acids, more preferably within 10 amino acids.
  • This P450 gene is described in SEQ ID NO: 57 as a known gene that complements both ends according to the method described in “(3) Method for producing hybrid P450 gene” in “3. Cassette PCR method”.
  • the CYP153A13a gene cloned from the Alcanivorax borkmensis SK2 strain is used, which encodes the amino acid sequence of.
  • This P450 gene can be obtained by the method described below.
  • environmental sump The central sequence derived from the extracted DNA is synthesized by a known DNA synthesis method.
  • DNA extracted from Alforce-Borax 'Volcumensis SK2 is used as a saddle type, represented by a set of primers represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 54 and 61, or by nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 56 and 62 Perform a nucleic acid amplification reaction using a set of primers to amplify the 5-arm and 3-arm fragments.
  • the synthesized central sequence is annealed with the 5-arm fragment and 3-arm fragment, and an extension reaction is performed.
  • this P450 gene can be amplified by performing a nucleic acid amplification reaction using a set of primers represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 61 and 62.
  • the amplified P450 gene can be obtained by fractionation by agarose gel electrophoresis or the like, and cutting out a band fractionated around 1.4 Kbp.
  • the DNA fragment obtained by the method as described above can be confirmed to be the present P450 gene by determining the base sequence according to a known method such as the chain terminator method or the Maxam Gilbert method.
  • This P450 gene can also be obtained by chemical synthesis based on the base sequence information obtained only by the method described above.
  • novel P450 of the present invention is a protein represented by the following (a) or (b).
  • the novel P450 of the present invention can be obtained by introducing an expression vector containing the present P450 gene described in the section “5. Novel P450 gene” into an appropriate host cell and culturing it in a medium. Production of the expression vector and introduction into the host cell can be performed according to a known method as described above.
  • the novel P450 of the present invention obtained by force is disrupted by cultivating the host cell, and then subjected to, for example, ion exchange chromatography, partition chromatography, gel permeation chromatography, affinity chromatography in accordance with conventional methods. Purify according to methods widely used in the field of first-class protein purification and protein production It can be carried out. The selection of the P450 fraction in these chromatographies can be performed based on the presence or absence of a CO difference spectrum.
  • This P450 can be used as a catalyst to produce an acidic compound (hereinafter referred to as “the production method”).
  • the method for producing an oxidized compound include a method for producing a host cell into which an expression vector containing the present P450 gene has been introduced and a method for producing it using purified P450.
  • an electron transfer protein in general, the intervention of an electron transfer protein is required to catalyze the oxidation reaction by P450.
  • ferredoxin and ferredoxin reductase are often used as electron transfer proteins.
  • an oxidized compound is produced by a host cell, it is desirable to co-express a gene encoding an electron transfer protein or to express it as a fusion protein gene of an electron transfer protein and P450.
  • a transfer protein may be used.
  • the compound used as a substrate for this production method may be any compound that can react as a substrate for P450.
  • alcohol can be produced from alkane and epoxide can be produced from alkene.
  • this production method using a purified enzyme can be performed in solution, or by immobilizing the purified P450 on a suitable carrier and bringing it into contact with a substrate. it can.
  • the carrier on which the P450 can be immobilized is not particularly limited, but examples thereof include inorganic carriers such as glass beads and silica gel, cellulose, chitosan, sepharose, dextran, polypropyl alcohol, ethylene, butyl acetate copolymer, polyacrylamide, Obtained by organic carriers such as polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polymethyl methacrylate, cross-linked polybutyl alcohol, cross-linked polyacrylate, cross-linked polyacrylamide, cross-linked polystyrene, cross-linked cellulose, cross-linked agarose, cross-linked dextran, and combinations thereof And the like.
  • a functional group that can be used for the P450 immobilization reaction is present on the surface of the carrier.
  • these functional groups include hydroxyl groups, amino groups, and alkyl groups. Examples include hydride group, carboxyl group, thiol group, silanol group, epoxy group, amide group, halogen group, succinimide group, and acid anhydride group.
  • the P450 is immobilized on the carrier via a hydrophilic spacer.
  • a hydrophilic spacer for example, an appropriate organic molecule in which both ends are substituted with a strong lpoxyl group, amino group, aldehyde group, epoxy group or the like can be used.
  • P450RhF P450 monooxygenase isolated from Rhodococcus sp.
  • the NADH-P450 reductase domain (fredoxin reductase-like sequence) and the iron protein domain (ferredoxin-like sequence) contained in the molecule are connected as a single polypeptide.
  • the fused cytochrome P450 monooxygenase of the present invention adds a peptide having the same function as the reductase domain contained in this P450RhF to the C-terminal side of the P450 body protein via a linker part. It will be.
  • Peptides having the same function as the reductase domain contained in P450RhF include (a) a peptide having an amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 70, (b) one or more amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 70 A peptide consisting of an amino acid sequence to which is added, deleted or substituted, or (c) a DNA consisting of a base sequence set forth in SEQ ID NO: 69 or a DNA complementary thereto and DNA that hybridizes under stringent conditions. Examples include peptides.
  • the peptide (a) is a peptide of the reductase domain in P450RhF (region containing the NADH-P450 reductase domain and the iron protein domain).
  • the peptide (b) is a peptide in which the amino acid mutation of the degree (/) is introduced into the peptide (a) without losing the function of the peptide (a). Such mutations occur in nature. In addition to differences, it also includes artificial mutations. As a means for causing artificial mutation, the ability to include site-specific mutagenesis (Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982) is not limited to this. The number of mutated amino acids is not limited as long as the function of the peptide (a) is not lost, but is preferably within 20 amino acids, more preferably within 10 amino acids.
  • the peptide (c) is a peptide having the same function as the peptide (a) obtained by using hybridization between DNAs.
  • the “stringent condition” in the peptide of (c) means a condition in which only specific hybridization occurs and non-specific hybridization does not occur. Such conditions are usually about "1 X SSC, 0.1% SDS, 37 ° C", preferably about "0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C", and more preferably It is about “0.2 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C”.
  • DNA obtained by hybridization generally has high homology with the original DNA. High homology means 60% or more homology, preferably 75% or more homology, more preferably 90% or more homology.
  • the linker part must not lose the function of the two proteins (peptides) to be fused.
  • D a peptide having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 68, (e) a single or a plurality of amino acids attached to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 68, A peptide consisting of a deleted or substituted amino acid sequence, or (f) a peptide encoded by DNA that also has a base sequence ability described in SEQ ID NO: 67 or DNA complementary to it and stringent under stringent conditions Is preferred.
  • the peptide of (d) is a peptide existing between the P450 body portion of P450RhF and the reductase domain.
  • the peptide (e) is a peptide in which an amino acid mutation is introduced into the peptide (d) to such an extent that the function as a linker is not lost.
  • Such mutations include artificial mutations in addition to those occurring in nature.
  • site-specific mutagenesis Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982
  • the number of mutated amino acids is not limited as long as the function as a linker is not lost, but is preferably within 5 amino acids, More preferably, it is within 3 amino acids, and most preferably 1 amino acid.
  • the peptide of (f) is a peptide having the same function as the peptide of (d) obtained by using hybridization between DNAs.
  • the meaning of “stringent conditions” in the peptide (f) is the same as in the peptide (c).
  • P450 protein there are no particular restrictions on the P450 protein to be used.
  • bacterial genomic DNA libraries and DNA extracted from the environment such as proteins produced from DNA isolated using conventional methods such as PCR, or existing P450s.
  • a protein that produces a force such as a gene into which a mutation has been introduced by a random mutagenesis method using PCR or a DNA shuffling method, or a hybrid gene.
  • the P450 protein may be derived from bacteria, plants, or animals, but it is particularly preferable to use a protein derived from bacteria.
  • P450 body protein derived from bacteria include P450 body protein derived from Acinetobacter 1 'calcoa setum.
  • the protein described in the section “6. New P450” may be used.
  • the protein described in the section “8. Novel Fusion P450 Monooxygenase” can be used as a catalyst to produce an acidic compound.
  • the oxidized compound can be produced by a method using a host cell into which an expression vector containing the fused P450 monooxygenase gene has been introduced and a purified fused P450 monooxygenase. A method is mentioned.
  • this fusion type P450 monooxygenase has an electron transfer protein in itself, so an electron transfer protein such as ferredoxin or ferredoxin reductase (reductase) No intervention is required. Therefore, when an oxidized compound is produced by a host cell, it is not necessary to co-express a gene encoding an electron transfer protein. In addition, when an oxidized compound is produced by the purified fusion type P450 monooxygenase, it is not necessary to coexist with a new electron transfer protein.
  • the fused P450 monooxygenase can be purified by the same method as described in “7. Production of acid compounds by P450”.
  • the organic compound that is the substrate of this production method can react as a substrate for P450. It can be a thing. According to this production method, for example, alkanes (linear hydrocarbons), alkenes (linear hydrocarbons containing unsaturated bonds), cyclic hydrocarbons, alkanes and alkenes containing aromatic rings in the molecule, etc.
  • alkanes linear hydrocarbons
  • alkenes linear hydrocarbons containing unsaturated bonds
  • cyclic hydrocarbons alkanes and alkenes containing aromatic rings in the molecule, etc.
  • acidic compounds such as terminal methyl group hydroxides and terminal olefin epoxies.
  • 1-hexanol, 1-heptanol, 1-octanol, 1-decanol, 1,2-epoxyoctane, cyclohexanol, 4-phenyl-1-butanol, 2-phenethyloxysilane, or 4- Benzofuran-2-yl-butan-1-ol can be produced.
  • Groundwater is collected from the Kujian Oil Reserve Base in Iwate Prefecture, and hot spring water is collected from the abundant hot springs in Teshio-gun, Hokkaido.
  • the organism was selectively concentrated. Dissolve in 5 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0: 1 mM EDTA, 0.35 M sucrose) and 10 mg / ml proteinase K (10 mM Tris-HC1) per filter enriched with microorganisms. 200 ⁇ l was added and incubated at 37 ° C for 30 minutes. After incubation, the bacteria were suspended by vigorous stirring.
  • lysing solution 100 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0: 0.3 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% sodium dodecyl sulfate
  • 10 ml of phenol, chloroform, isoamyl alcohol 50: 4 9: 1 solution was added.
  • centrifugation 5000 rpm, 15 min
  • 2 volumes of 99% ethanol was added and stirred, and then cooled at ⁇ 80 ° C. for 2 hours. Thereafter, DNA was precipitated by centrifugation (15000 rpm, 15 min), cooled 70% ethanol was added, and further centrifugation (15000 rpm, 15 min) was performed to collect DNA as a precipitate fraction.
  • the present inventor has reported three amino acid sequences belonging to the CYP153A subfamily of the P450 superfamily, namely CYP153A1 (accession no. AJ311718), CYP153A2 (accession no. AE005680), and CYP153A13a (SEQ ID NO: 58).
  • CYP153A1 accession no. AJ311718
  • CYP153A2 accession no. AE005680
  • CYP153A13a SEQ ID NO: 58.
  • MFIAMDPP N-end
  • HRCMGNRL C-end
  • the designed primer is 5 '-ATGTTYATHGCNATG GAYCCNC-3, (SEQ ID NO: 53) and its complementary strand 5, -GNGGRTCCATNGCDATRAA CAT-3' as the conserved amino acid sequence MFIAMDPP side (N end side) (SEQ ID NO: 51) As the conserved amino acid sequence HRCMGNRL side (C-terminal side) (SEQ ID NO: 52), 5,-NARNCKRTTNCCCATRCANCKRTG-3 '(SEQ ID NO: 55) and its complementary strand 5'-CAYMGNTGYATGGGNAAYMGNYT-3 '( SEQ ID NO: 56).
  • Y is C or T
  • ⁇ is A, C or ⁇
  • ⁇ is A, T, G, or C
  • R is A or G
  • D is A
  • K is G or T
  • ⁇ is ⁇ or C.
  • the DNA prepared in Example 1 was used as a saddle, and an amplification reaction by PCR was performed using the primers designed in Example 2.
  • the primer combination is the primer of SEQ ID NO: 55 with respect to the primer of SEQ ID NO: 53.
  • DNA polymerase Amplitaq Gold manufactured by Applied Biosystems
  • each environmental sample 100 ng of the prepared DNA was added and finally adjusted with sterilized water to make 50 1 in total.
  • the reaction was performed at 94 ° C for 10 minutes, followed by one cycle of 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 1 minute, followed by 35 cycles, and finally 72 ° C For 10 minutes. Amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The expected length (about 0.85 Kbp) of DNA was excised from agarose and purified with QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen).
  • Example 4 Isolation of P450 gene from Al force-borax borkumensis SK2 strain
  • the present inventor is an alkane-utilizing marine bacterium Al force-borax borkumensis SK2 strain (DSM 11573 strain).
  • a DNA fragment containing CYP153A13a was isolated as follows.
  • a PCR Optimizer kit (manufactured by Invitrogen) was used to amplify for 40 cycles under the conditions of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes. Amplification was confirmed by 2% agarose electrophoresis. As a result, amplification of the P450 gene fragment (about 250 bp) was confirmed. Therefore, the cloned P450 gene fragment was cloned by hybridization using the amplified P450 gene fragment as a probe.
  • genomic DNA derived from Alforce-Borax 'vorcumensis is partially digested with the restriction enzyme 2mi 3AI, linked to the BamHI site of the cosmid vector SuperCos 1, and packaged into phage particles using LAMBDA I NN (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). It was Then, E. coli XL1-Blue MR strain was infected with the phage, and colonies resistant to the antibiotic ampicillin were picked up to prepare a cosmid library. Next, AlkPhos Direct Labelling and
  • DNA fragment from the CYP153A13a gene (SEQ ID NO: 58) cloned from the Alcanivorax borkumensis SK2 strain to the site encoding the conserved region (amino acid sequence MFIAMDPP), including the start codon.
  • the DNA fragment (hereinafter referred to as “3-arm”) up to the site codon that encodes the second conserved region (amino acid sequence HRCMGNRL) and the second conserved region (amino acid sequence HRCMGNRL) was amplified by PCR. 5-arm! /, I did a PCR as follows.
  • DNA polymerase Amplitaq Gold (Applied Biosystems) 0.5 unit, attached polymerase buffer 5 ⁇ 1, 2 mM dNTP 5 ⁇ 1, 50 pmol / ⁇ 1 SEQ ID NO: 61 (5 '-CACCATGTCAACGAGTTCAAGTA-3' ) And ply SEQ ID NO: 54 100 ⁇ g of a cosmid vector cloned with the CYP153A13a gene was added to each 4 ⁇ l of the monomer, and finally sterilized water was used to make a total of 50 1.
  • the reaction was 94 ° C for 10 minutes, followed by heat denaturation at 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 45 seconds and 72 ° C for 1 minute for 30 cycles, and finally 7 2 ° C10 Reacted for 1 minute.
  • Amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis.
  • a primer of SEQ ID NO: 62 (5, -TGATT ATTTTTTAGCCGTCAACT-3,) and a primer of SEQ ID NO: 56 were used in place of the above SEQ ID NOs: 61 and 54. Amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis.
  • the expected length of DNA was excised from agarose and purified with a QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen). Subsequently, a hybrid gene was prepared by PCR from the PCR product based on the prepared DNA sample prepared in Example 3 and the 5-arm and 3-arm fragments.
  • the reaction solution was DNA polymerase Amplitaq Gold (Applied Biosystems) 0.5unit, attached polymerase buffer 5 ⁇ 1, 2 mM dNTP 5 ⁇ 1, 50 pmol / ⁇ 1 primers of SEQ ID NO: 61 and 62 Add 20 ng of the PCR product based on the DNA prepared from the environmental sample obtained in Example 3, 4 ⁇ l, 5 ng of the 5-arm fragment and 5-arm fragment, and finally add sterile water.
  • the total amount was 50-1.
  • the reaction was 94 ° C for 10 minutes, followed by heat denaturation at 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 45 seconds and 72 ° C for 1 minute for 30 cycles, and finally 72 ° C for 10 minutes. Reacted. Amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis.
  • the expected length (about 1.4 Kbp) of DNA was excised from the agarose and purified with the QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen).
  • the purified hybrid gene was cloned into a sequencing vector (pENTR / SD / D-TOPO) (Invitrogen) using the GATEWAY system pENTR Directional TOPO Cloning Kits (Invitrogen).
  • the plasmid vector inserted with the hybrid gene obtained in Example 5 was transformed into E. coli (0 ne Shot TOP10 Chemically Competent E. coH Invitrogen), and transformed E. coli colonies were randomly selected. And plant in LB liquid medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) and transfer plasmid to QIAprep Spin Miniprep Kit
  • sequence reaction is converted into a chain terminator method, and then the ve Sequencing Fb Ready Reaction Kit (7
  • the base sequence of the reaction product was determined by analyzing with ABI prism 3730 DNA Analyzer (Applied Science).
  • those having a common sequence of FXXGXR / H XCXG and! P450 50 to 60 residues before the C-terminus of the deduced amino acid sequence were selected.
  • the amino acid sequences of the hybrid genes are shown in SEQ ID NOs: 1 to 25, and the nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 26 to 50.
  • Fig. 1 and Table 1 it is shown that the amino acid sequence between the conserved regions in the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 25 is different from the sequence between the conserved regions in the known amino acid sequence of P450. It was. As shown in Table 1, PCR is performed using DNA from microorganisms extracted from various environmental samples such as Bonabe, Norao, Kuji groundwater, Hokkaido hot spring water, and Niigata oil-contaminated soil. It was shown that a new P450 gene can be obtained by performing the above.
  • Example 7 Three types of hybrid genes that were shown to be novel sequences in Example 7 were expressed in E. coli, and their functionality was confirmed.
  • the gene coding for three types (SEQ ID NOs: 4, 5, 9) of P450 can be Inserted into a rasmid vector ( P DEST14 Invitrogen), transformed into E. coli DH5 ⁇ strain (Invitrogen), planted in LB liquid medium, and plasmid was transferred to QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Extracted.
  • the resulting plasmid was transformed into Escherichia coli BL21-AI strain (Invitrogen) and added to a 5 ml LB liquid medium supplemented with 50 ⁇ / ml ampicillin (Wako Pure Chemical Industries). After planting and culturing overnight, transfer 1 ml of the resulting culture solution to 100 ml LB liquid medium supplemented with 50 ⁇ / ml ampicillin at a final concentration, and incubate at 37 ° C for logarithmic growth phase 1 mM 5-aminolevulinic acid hydrochloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 0.5 mM FeCl were added. After incubation at 25 ° C for 30 minutes, 0.2% arabinose (
  • Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was added, followed by culturing. (25 ° C for 16 hours) After culturing, the cells are collected by a centrifuge and PBS (phosphate-buffered saline; 137 mM NaCl, 10 mM Na HPO and 2.68 mM KC1 containing 20% glycerol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ) Suspended, ultrasonic crusher
  • the supernatant obtained by crushing the cells and centrifuging was used as a crude extract.
  • a crude extract obtained from Escherichia coli containing a plasmid vector into which the gene encoding SEQ ID NO: 4 was inserted was obtained from crude extract A, and Escherichia coli containing a plasmid vector into which the gene encoding SEQ ID NO: 5 was inserted.
  • the resulting crude extract was designated as crude extract B, and the crude extract obtained from E. coli containing the plasmid vector into which the gene encoding SEQ ID NO: 9 was inserted was designated as crude extract C.
  • P450 is absorbed by sodium nithionite (Na S 0) and aerated with carbon monoxide
  • the novel P450 obtained this time must catalyze the oxidation reaction by interfering with ferredoxin reductase and ferredoxin as electron transfer proteins. It is done. Therefore, we devised the use of putidaredoxin and putidaredoxin reductase from Pseudomonas putida as electron transfer proteins, and cloned each gene.
  • a primer (5,-CGTCTCCCATGTCTAAAG TAGTGTATGTGT-3 '
  • the reaction was 94 ° C, heat denaturation for 10 min, 94 ° C for 30 seconds, 58 ° 45 seconds at C, 1 minute at 72 ° C As one cycle, which is carried out for 30 cycles, and finally reacted for 10 minutes at 72 ° C.
  • Amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. Thought A DNA having a specified length was excised from agarose and purified with a QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen).
  • the protein expression vector inserted with Pyudaredoxin derived from Pseudomonas' Putida isolated in Example 10 was transformed into Escherichia coli Rosseta DE3 (manufactured by Novagen), and inserted with Pyudaredoxin reductase from Pseudomonas putida.
  • the resulting protein expression vectors were transformed into E. coli BL21 DE3 pLysS strain (manufactured by Novazien), each of which was planted in 5 ml of LB liquid medium and cultured.
  • a crude enzyme solution composed of a crude extract of P450 and two types of electron transfer proteins, and crude enzyme solution C, and a crude enzyme solution composed only of two types of electron transfer proteins and a crude enzyme solution D And used for enzyme reaction.
  • Enzyme reactions were started by adding the substrate to each enzyme reaction solution to a final concentration of 1 mM, then leaving it at 25 ° C for 10 minutes, and adding NADP to a final concentration of 5 mM to start the enzyme reaction. .
  • octane, decane, and 1-decene were used as substrates.
  • hydrochloric acid was added to a final concentration of 0.2 N to stop the enzyme reaction.
  • ethyl acetate is added to the crude enzyme solution after the enzyme reaction, and component analysis of the ethyl acetate extract fraction of the crude enzyme solution is performed using a gas chromatography mass spectrometer (GCMS-QP5050A, manufactured by Shimadzu Corporation). The presence or absence of oxide on each substrate was observed.
  • GCMS-QP5050A gas chromatography mass spectrometer
  • Fig. 3 shows the analysis results of the fraction extracted with the reaction solution, ethyl acetate after the enzymatic reaction using octane and 1-decene as the substrates with crude enzyme solutions B and D.
  • octane was used as a substrate
  • 1-octanol and octanoic acid which are octane acids
  • the acid oxides of otatan were not detected.
  • Example 12 Construction of a plasmid for production of a fusion protein having an RhF reductase domain The ability of oxidizing the obtained P450 hybrid gene to various substrates can be easily observed by a bioconversion reaction using E. coli as a host. An expression plasmid for producing a fusion protein with an electron transfer protein (reductase domain) was constructed.
  • P450RhF The fused P450 monooxygenase (P450RhF) gene, which is a single polypeptide chain fused with the P450 body protein part (heme domain) and the reductase domain, was isolated from Rhodococcus sp. Strain NCIMB9784.
  • NCIMB9784 Non-Patent Document 8
  • base sequence is shown in SEQ ID NO: 67
  • amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 68
  • reductase domain base sequence is shown in SEQ ID NO: 69
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 70.
  • a primer (5'-GGGAATTC gtgctgcaccgccatcaaccg-3, ⁇ U number 71) containing a DNA fragment containing a gene encoding) and a restriction enzyme site from genomic DNA (5-gggagctctcagaggcgcagggccaggcg-3 ', SEQ ID NO: 72) was used for PCR amplification.
  • the obtained 1.0 kb DNA fragment was cleaved with EcoRI and Sasi and then inserted into the EmRi-Sasi site of E. coli vector pET2ia (Novagen).
  • this plasmid is called pRED.
  • the pRED map is shown in Figure 4.
  • Primers with restriction enzyme sites (5,-CACTAGTCatatgTCAACGAGTTCAAG TACA -3, SEQ ID NO: 73, 5,-CAGCACCaattGTTTTTTAGCCGTCAACTT -3, SEQ ID NO: 74) were designed, and 5 types (SEQ ID NO: 3) prepared in Example 5 were designed. , 5, 7, 9, and 11), the sequencing vector into which the gene encoding the new P450 was inserted was amplified in a vertical pattern by PCR. Note that the stop codon of each amplified P450 gene fragment is deleted. The obtained 1.4 kb DNA fragment was cleaved with restriction enzymes Mdgl and Mfel and inserted into the Ndgl-EmRl site of plasmid PRED.
  • the plasmid vector into which the gene encoding SEQ ID NO: 3 is inserted is pH3RED
  • the plasmid vector into which the gene encoding SEQ ID NO: 5 is inserted is pH5RED
  • the plasmid vector into which the gene encoding SEQ ID NO: 7 is inserted is pH7RED
  • SEQ ID NO: 9 is encoded.
  • the plasmid vector into which the gene is inserted is called pH9RED
  • the plasmid vector into which the gene encoding SEQ ID NO: 11 is inserted is called pHllRED.
  • a plasmid vector pAlkR ED into which the CYP153A13a gene cloned from the Al force-borax volcumensis SK2 strain was inserted was also prepared.
  • Plasmid vectors pH3RED, pH5RED, pH7RED, pH9RED, pHllRED, and pAlkR ED are each transformed into E. coli BL21-AI strain, planted in 5 ml LB liquid medium supplemented with a final concentration of 50 g / ml ampicillin After that, 1 ml of the obtained culture solution was transferred to 100 ml of LB liquid medium supplemented with 50 g / ml ampicillin at a final concentration, cultured at 30 ° C, and reached the logarithmic growth phase. -Aminolevulinic acid hydrochloride and 0.5 mM FeCl were added and incubated at 20 ° C for 30 minutes, followed by addition of 0.2% arabinose and subsequent cultivation.
  • Bacterial suspension containing pH3RED expressing strain is suspension H3, pH5RE Suspension suspension containing D-expressing strain Suspension H5, Suspension containing pH7RED-expressing strain Suspension H7, Suspension containing pH9RED-expressing strain Suspension H9, pHllRED expression
  • the bacterial suspension containing the strain was designated as bacterial suspension HI1
  • the bacterial suspension containing the pAlkRED-expressing strain was designated as bacterial suspension A1k.
  • n-alkanes such as hexane, octane and decane.
  • Bacteria Suspension Al Bacteria Suspension H3 Bacteria Suspension H5 Bacteria Suspension H7 Bacteria Suspension H9 Bacteria Suspension H U Oxide
  • Hybrid P450 is an unsaturated hydrocarbon It was confirmed to catalyze the epoxidation reaction of 1-otaten, a kind of
  • Example 16 Cyclic hydrocarbon conversion test using fused P450 monooxygenase
  • a bioconversion reaction test using cyclohexane, a kind of cyclic hydrocarbon (cycloalkane), as a substrate was made in Example 14.
  • Bacterial suspensions H3, H5, H7, H9, Hll, Alk were used.
  • 0.25 ml of substrate was added to 1 ml of each bacterial suspension, and reacted at 20 ° C for 24 hours.
  • 0.25 ml of hexane was added, and component analysis of the hexane extraction fraction was performed using a gas chromatography mass spectrometer.
  • the cyclohexanol produced by acidification of cyclohexane was identified and quantified.
  • Table 5 shows the amount (concentration) of oxide produced by the oxidation reaction.
  • hybrid P450 is a type of cyclic hydrocarbon. It was confirmed to catalyze the alcoholic reaction of oxane.
  • Example 17 Conversion test of aromatic hydrocarbon with fused P450 monooxygenase Bioconversion reaction test using aromatic hydrocarbon (alkane or alkene containing an aromatic ring in the molecule) as a substrate in Example 14 Using the prepared bacterial suspension H5, H9, Alk and the plasmid vector pAlkRED into Escherichia coli BL21-AI strain, and then culturing without performing protein expression induction treatment went. The substrate used was n-butylbenzene and 4-phenyl-1-butene.
  • Substrate was added to 1 ml of each bacterial suspension to a final concentration of 1 mM, reacted at 20 ° C for 8 hours, and hydrochloric acid was added to a final concentration of 0.2 N to react. Stopped. 0.25 ml of ethyl acetate was added, and the components of the ethyl acetate extract fraction were analyzed by gas chromatography mass spectrometry. When n-butylbenzene was used as a substrate, the ethyl acetate extract fraction was derivatized with a silylating agent TMS To H (GL Science Co., Ltd.), followed by component analysis.
  • TMS To H GL Science Co., Ltd.
  • Figure 6 shows the analysis results when n-butylbenzene is used as the substrate.
  • 4-Fel-1-butanol an oxide of n-butylbenzene, was detected in the fractions extracted from the bacterial suspensions H5, H9, and Alk.
  • no n-butylbenzene oxide was detected in the non-expressing bacterial suspension Non. It was first demonstrated by the present invention that P450 belonging to the CYP153 family converts n-butylbenzene to 4-phenyl-1-butanol.
  • Fig. 7 shows the results of analysis using 4-phenyl-1-butene as a substrate.
  • an oxide of 4-phenyl-1-butene was detected.
  • non-expressing bacterial suspension P450 In this case, 4-phenyl-1-butene oxide was not detected. It was first clarified by the present invention that P450 belonging to the CYP153 family converts 4-phenyl-1-butene to 2-phenethylsilane.
  • Primer4 (5- gggaattctaccgctttggtagtcgccgga —3, ⁇ ⁇ ⁇ U ⁇ 76) Amplified by PCR, the underlined portion indicates one site (Primer3) and E ⁇ RI site (Primer4), respectively, and the stop codon of the P450 gene
  • the resulting 1.3 kb DNA fragment was cleaved with Mdgl and E ⁇ RI and subcloned into the Hd £ l—E £ 2RI site of the plasmid pRED.
  • pCAMRED the P45 Ocam gene
  • a plasmid PETP450 cam was also prepared by cloning only this into the NdsI-EmRI site of pET21a.
  • the DNA was amplified by PCR using Primer5 (5'-CACT AGTCatatgTCAACGAGTTCAAGTACA-3 ', SEQ ID NO: 73) and Primer6 (5'-CAGCA CCaattGTTTTTTAGCCGTCAACTT-3', SEQ ID NO: 74).
  • the underlined portions indicate the Ndel site (Primer5) and Mfel site (Primer6), respectively.
  • P4 The 50 gene stop codon has been deleted.
  • the obtained 1.3 kb fragment was cleaved with Ndel and Mfel and subcloned into the I-EmRI site of the plasmid pRED constructed in the example.
  • the constructed plasmid is hereinafter referred to as pAlkRED.
  • the base sequence of the P450 alk (CYP153A13a) gene of Alcanivorax borkumensis SK2 strain (DSM11 573 strain) was cloned into the I-E £ 2RI site of pET21a as a comparison target shown in SEQ ID NO: 58 Plasmid pETP450alk was also generated.
  • GC-MS gas chromatography-mass spectrometer
  • the P450bzo gene was obtained from an environmental metagenomic library by Uchiyama et al. Using the SIGEX method (Ucmyama ⁇ , et al. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes.Nat Biotechnol. 23: 8 8-93, 2005, and GenBank code: AB186504).
  • Primer7 5'-CGATATaCatatgTtCAGtTTtgAcccctat-3 ', SEQ ID NO: 77
  • Primer8 5'-gGATTgcgtttgacgaatTTcacaaa-3', SEQ ID NO: 78
  • a 1.2 kb DNA fragment was amplified.
  • Primer9 5,-gggctcactttgt gaaattcgtcaaa
  • a 110 bp DNA fragment on the C-terminal fragment side of the ⁇ 450 gene was amplified using the sequence 3 ⁇ 4 ⁇ No.
  • the 20th T of primer 8 and 15th A of primer 9 are mutations introduced to delete the Em RI site in the gene. There is no substitution of the amino acid sequence by this mutation.
  • the amplified DNA fragments of 1.2 kb and 110 bp were mixed and PCR was performed again using Primer 7 and 10 as a saddle type to obtain a full-length fragment of P450bzo gene.
  • the underlined parts in Primer 7 and 10 indicate the site and EmRi site, respectively. Note that the stop codon of the P450 gene has been deleted.
  • the obtained 1.3 kb fragment was cleaved with 1 and E ⁇ RI and subcloned into the IE ⁇ RI site of the plasmid pRED constructed in the example.
  • the constructed plasmid is called pBzoRED below.
  • a plasmid pETP450bzo was also prepared in which only the P450bzo gene was cloned into the E2RI site of the E. coli vector pET21a.
  • the substrate was rapidly transformed into E. coli into which the plasmid pBzoRED, which is an artificial fusion enzyme gene expression strain, was introduced, and after 4 hours, the substrate was completely lost. Approximately 0.6 mM of 3,4-dihydroxybenzoic acid, a soy sauce, was produced. On the other hand, about half of the substrate (2.5 mM) remains in the E. coli introduced with the non-fused type of comparison (no RhF reductase domain) pETP450bzo, and the reaction product is about 0.1 mM. Met.
  • P450SU-1 (CYP105 A1) or P450SU-2 (CYP105B1) gene (Genes for two herbicide- indudble cytoch romes P—450 from StreDtomyces griseolus. J Bacteriol. 172: 3335—45 , 1990 and N A 1.3 kb DNA fragment containing CBI accession No. M32238 and M32239) was obtained by extracting genomic DNA from Streptomyces glyceros ATCC 11796 strain, and Primer 11 (5'-GGACTCCatatgACCGATACCGCCACGACG -3 ', SEQ ID NO: 81).
  • Primerl 2 (5'- CTGaattCCCAGGTGACCGGGAGTTCGTTGAC -3 ', SEQ ID NO: 82), or Primerl 3 (5'- GGACTCCatatgACGACCGCAGAACGCACC-3 ⁇ SEQ ID NO: 83) and Pri merl4 (5'- CTGaattCCCAGGCGATCGGCAGCGAGTGGAC -3', SEQ ID NO: 84) And amplified by PCR.
  • the underlined portion indicates one site (Primerl 1 and 13) and an EmRI site (Pri merl 2 and 14), respectively.
  • the stop codon of P450 gene has been deleted.
  • Each of the obtained 1.3 kb DNA fragments was cleaved with E ⁇ RI and then inserted into the Hdgl-EmRI site of the functional expression vector pRED constructed in Example 12, and fused P450SU-1 or fusion (1)
  • a plasmid for expression of the P450SU-2 gene was prepared.
  • the constructed plasmids are hereinafter referred to as pSU-lRED and pSU-2RED, respectively.
  • plasmids PETP450SU-1 and pETP450SU-2 in which only the P450SU-1 or P450S U-2 gene was inserted into the Mdel-E RI site of pET21a were also prepared.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) strain introduced with plasmid pSU-lRED or pSU-2RED, or pETP450SU-1 or pETP450SU-2 was cultured in the same manner as in Example 19 to induce gene expression.
  • 7-ethoxycoumarin, a substrate of P450SU-1 and SU-2 was added to the medium to a final concentration of 1 mM and incubated at 20 ° C for 74 hours.
  • the liquid layer containing the substrate and reaction product (7-hydroxycoumarin) in the reaction solution was extracted with ethyl acetate and analyzed by thin layer chromatography. As a result, both E.
  • coli carrying pSU-lRED or pSU-2RED which are plasmids for expressing the artificial fusion enzyme gene, detected the reaction product 7-hydroxycoumarin.
  • no reaction product was detected in E. coli into which the non-fusion plasmid PETP450SU-1 for comparison was introduced.
  • some reaction products were detected in Escherichia coli introduced with pETP450S U-2, the amount was less than that of the fusion strain PSU-2RED-bearing bacteria.
  • P450 derived from actinomycetes can also be applied to the function expression system according to the present invention. It became clear that it became a force.
  • Nocardiaceae strain Hou_blue a Gram-positive bacterium, has the ability to assimilate alkanes, petroleum-based hydrocarbons, from the soil of an oil eruption in Nishiyama-cho, Niigata Prefecture (oil contaminated soil in Niigata Prefecture). It is a novel bacterium isolated as an indicator.
  • This Hou_blue strain was deposited with the National Institute of Technology and Evaluation Biotechnology Headquarters (2-5-8 Kisarazu Kazusa Kamasa, Chiba Prefecture) on June 8, 2004 as deposit number NITE P_3. ing.
  • P450HB153 gene shows the amino acid sequence of the P450 protein encoded by its nucleotide sequence SEQ ID NO: 85) Isolated
  • a 1.3 kb DNA fragment containing this P450HB153 gene was extracted from the same strain, and the primer Hou-l (5, -GTAGGCCATATGAACGTAAT CGGTGCAGGT-3 ', SEQ ID NO: 87) and primer Hou-2 (5′-CATGAATTCGACCT GTTCCATCTCGGTCTC-3 ′, SEQ ID NO: 88) was used for PCR amplification.
  • the underlined parts indicate the Ndgl site and ERI site, respectively.
  • the stop codon of P450HB153 gene has been deleted.
  • the obtained 1.3 kb fragment was cleaved with 1 and EmRI and inserted into the Hdgl-EmRI site of the vector pRED constructed in Example 12 to construct plasmid pHB153-Red.
  • Example 28 Conversion of 2- n -butylbenzofuran by Escherichia coli producing P450HB153 by fusion with Escherichia coli BL21 (DE3) strain carrying plasmid pHB153-Red, the production of 2-i-butylbenzofuran (2-n-butylbenzoforan) A conversion test was performed. That is, Escherichia coli BL21 (DE3) strain was transformed with the plasmid pHB153-Red constructed in Example 27, and cultured in 3 ml of LB medium (containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin) at 30 ° C. for 16 hours.
  • LB medium containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin
  • 1 ml of this preculture was inoculated into 50 ml of M9-Dulcose medium (containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin) and cultured until the OD600 value was about 0.8.
  • IPTG was added as an inducer to a concentration of 0.2 mM, and further cultured at 25 ° C. for 16 hours.
  • This culture solution was centrifuged (8000 rpm, 5 min.) To precipitate the cells. After discarding the supernatant, add 10 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) and stir well to remove the cells. Collected in a 0 ml Falcon tube.
  • the soot substrate was dissolved in a small amount of DMSO to a concentration of 1.74 mg (final concentration 1 mM), added, and cultured with shaking at 20 ° C for 24 hours.
  • This ethyl acetate extract was purified by silica gel chromatography [diameter 1 cm X length 20 cm, developing solvent: hexane: ethyl acetate (5: 1)] to obtain pure compound 28-1 (0.4 mg) pure. I got a product. Compound 28-1 showed a molecular ion peak M + at m / z 190 (substrate + oxygen atom 1) by EI-MS. 'When the NMR spectrum was measured, the signal of the aromatic ring moiety was exactly the same as that of the substrate. However, the terminal methyl group of the substrate disappeared, and an oxymethylene group split into riblets and three methylene groups were observed at d3.70.
  • the present invention provides a method for efficiently isolating a novel P450 gene from a sample containing nucleic acids derived from various microorganisms such as environmental samples.
  • P450 produced from the P450 gene provided by the method of the present invention varies in substrate specificity and specific activity.
  • Alkanes, alkenes, cyclic hydrocarbons (cycloalkanes), aromatic hydrocarbons (intramolecular it can be used for oxidation reactions of various low-molecular organic compounds such as alkanes or alkenes having an aromatic ring.

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Abstract

　複数のP450間でアミノ酸配列が高度に保存された領域に基づいて設計したプライマーにより、試料中に含まれるP450遺伝子断片を増幅し、この断片と既知P450遺伝子とによってハイブリッド遺伝子を作製する方法を提供する。これにより培養工程や抽出したDNAの平均化工程を経ることなく、多様な微生物資源から効率よくP450遺伝子を単離することが可能になる。 　また、P450本体タンパク質のC末端側に、リンカー部分を介して、ロドコカッス属NCIMB9784株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼに含まれる還元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドを付加してなる融合型シトクロムP450モノオキシゲナーゼも提供する。これにより多様なP450本体タンパク質に対応し、尚且つ効率の良い電子伝達を行うシステムを構築し、活性のあるP450モノオキシゲナーゼを生産することが可能になる。

Description

P450遺伝子の単離法
技術分野
[0001] 本発明は、 P450として機能するタンパク質をコードする遺伝子の単離方法、該方法 に有用なオリゴヌクレオチド、該方法によって単離された新規遺伝子、該遺伝子がコ ードするタンパク質、該タンパク質を含む融合型 P450モノォキシゲナーゼ、及び該酵 素を用いた酸ィ匕化合物の生産法に関するものである。本発明の単離方法は、海水 や土壌等の試料から細菌等の微生物の分離 ·培養する工程や分離 ·培養した微生 物から抽出した DNAの平均化工程を経ずに、酵素遺伝子を単離できる方法であり、 自然界の遺伝子資源から、特に当該遺伝資源中に目的の遺伝子を有する微生物の 存在量が少ない場合において、新規の P450遺伝子を単離するのに有効である。本 発明で得られる遺伝子力 合成される P450は生体触媒として化学工業における有用 物質生産に利用することができる。
背景技術
[0002] シトクロム P450モノォキシゲナーゼは細菌力 植物や哺乳動物に至る広範囲の生 物種に分布している酸素添加酵素であり、酸素分子を還元して 1分子の水を作ると共 に、残りの酸素原子を様々な低分子有機化合物に導入して、酸化生成物に変換す る反応（1原子酸素添加反応)を触媒する鉄'ィォゥ酵素である。 P450は分子構造や 基本的な触媒機構を保ちつつ、基質結合部位の構造を変化させることで炭化水素 の水酸ィ匕のみならず、脱アルキル化、エポキシ化、 C-C結合切断、芳香化、脱水素、 還元など様々な酸化反応に対応しており、 P450によって触媒される反応は、動物の ホルモンや植物の 2次代謝産物の生合成から、生体内に取り込まれた異物の活性ィ匕 や生分解に至るまで、力なり多様で広範囲に及んでいる。このように P450はあらゆる 種類の有機化合物の酸ィ匕に関与することから、バイオインダストリ一分野において注 目を集めている。具体的には、既存の方法では酸化処理が難しい化合物に対して P4 50の触媒反応を利用することで、新 ヽ有機低分子化合物の合成や環境負荷物質 の分解処理を行う検討がなされている。また、最近では産業上の観点からも、バイオ コンバージョン技術への応用を目的として、細菌をはじめとする微生物の P450の利用 が考案されている（非特許文献 1)。細菌でよく研究されている P450としては、 P450で 初めて結晶構造が解かれたシユードモナス ·プチダ（Pseudomonas putida)由来の P4 50camと、 P450の酸ィ匕反応に必要な還元酵素と融合した構造を持つバチルス 'メガテ リウム（Bacillus megaterium)由来の P450BM3等が挙げられる。これらの酵素は、分子 進化工学的手法で酵素活性や基質特異性を改良する試みもなされて!/ヽる (非特許 文献 1)。し力しながら、従来知られていた細菌の P450は細菌種の豊富さに比べると 非常に少な力つた。一方、近年のゲノム解析の進展が P450研究に新局面をもたらし た。多くの細菌のゲノム解析が完結し、細菌の P450も多数存在していることが明らか となった。例えば、結核菌マイコバクテリゥム ·ッベルク口シス (Mycobacterium tubercu losis)には 20種類の P450配列が存在しており、放線菌ストレプトマイセス'セリカラー（ Streptomvces coelicolor)には 18種類の P450配列が存在していた。こうして新たに発 見された P450をバイオコンバージョン (生変換）における酸化酵素資源として利用す る試みも開始されている。以上のように最近では、微生物から多数の P450が単離され 解析が実施され始めているが、これらの P450はすべて、単離'培養の可能な生物種 に由来するものである。しかし、単離'培養が可能な微生物は、土壌、海洋等の生息 環境を問わず 1%以下であるので (非特許文献 2)、現在同定されている微生物由来の P450は限定的であり、未だ単離同定が困難な P450が環境中には多数存在すること が推定される。こうした未同定の P450の中には有機化合物の種々の酸ィ匕反応に関与 するものが多数存在することは否定できない。したがって、単離'培養が不可能また は困難な微生物 (難培養微生物）由来の P450を含め環境中から直接、多数の遺伝 子を単離し、迅速に機能解析を行うことは、産業利用の観点からも非常に有意義で ある。
微生物の単離'培養を経ずに環境中から直接、 目的遺伝子を単離'回収する例とし て、カセット PCR法という手法が Okutaらにより開発されている（非特許文献 3)。この方 法は、 目的とする機能を有する既知のタンパク質又はその遺伝子のアミノ酸配列ない し塩基配列から当該遺伝子に特異的なプライマーを設計した上で、土壌や海水等の 環境サンプル力 直接抽出した DNAを铸型として PCR等の DNA増幅反応を行 、、増 幅された DNA断片を単離した後、上記プライマーによる増幅反応で増幅されな!、遺 伝子の両端部を既知類似遺伝子の塩基配列で補う手法である。これ〖こより中央部が 環境から直接抽出した DNA由来の新規遺伝子配列、両端部が既知遺伝子配列から なるハイブリッド遺伝子が生成され、大腸菌などを宿主とするタンパク質発現系にハイ ブリツド遺伝子を組み込むことにより、効率的に得られた遺伝子の機能解析を行うこと が可能になる。この手法を用いて多様な新規遺伝子配列を獲得するためには、 DNA 増幅反応に用いるプライマーの配列、さらには、プライマー設計の基礎情報とする既 存のタンパク質又は遺伝子配列の相同性が重要である。しかし、 P450に関しては 1次 構造が著しく多様ィ匕しており、既知の配列力 多様な P450遺伝子を効率よく単離で きるプライマーは得られていなかった。なお、土壌等の自然界から直接、 DNAを回収 する際、存在量が多い微生物由来の DNA断片が多く回収され、このままライブラリー を作製すると、存在量が多い微生物由来の遺伝子が多く含まれてしまうことになり、 目的の遺伝子が、その土壌等では少ししか存在しない微生物 (稀少微生物）由来の 遺伝子である場合は、当該遺伝子の単離が困難となる。稀少微生物由来遺伝子の D NAの多様性を確保するための方法として、土壌等の自然界から直接抽出した DNA を、 GC含量の差を利用して平均化 (normalization)した後で、ライブラリーを作製する 方法が開示されている (特許文献 1)。しかし、この平均化の方法は、稀少微生物と存 在量が多 、微生物の GC含量が近似して 、る場合は、利用することができな 、。
P450の触媒反応による変換が期待される化合物として、アルカン (直鎖状炭化水素 )等の石油成分が挙げられる。アルカンはその両末端を酸ィ匕することによってジォー ルゃジカルボン酸に変換された後、ポリマー、香料、医薬等の工業原料として利用さ れている。現在は石油化学工業によって合成されているが、生物工学的製造法への 代替が望まれていることもあり、生物種によるアルカン末端の酸ィ匕反応は注目されて いる。アルカン末端の酸化反応を行う P450としては、カンジダ，マルトーサ (Candida m altosa)やカンジダ 'トロピカリス (Candida imEk^lk)などの酵母に存在する CYP52ファ ミリ一が知られている（非特許文献 4)。 カンジダ'マルトーサにおいてはアルカンによ つて強く発現誘導される CYP52Aサブファミリーに属する 4種類の遺伝子力 アルカン や脂肪酸といった基質の種類や鎖長に関して異なる特異性をもつことが示されてい る。アルカンの分解に関与すると推察される原核生物由来の P450としては、最初に 長鎖の H-アルカン資化細菌であるァシネトバクタ一'カルコァセッカス (Acinetobacter calcoaceticus) EB104株〖こお!/ヽて発見された（非特許文献 5)。最近ではアルカン資 ィ匕會を有するァノレ力ニボラックス ·ボノレクメンシス (Alcanivorax borkumensis)やロドコッ カス .エリス口ポリス (Rhodococcus ervthropolis)等の細菌数種類で P450の存在が明ら かとなり、これらの P450は CYP153Aサブファミリーを形成している（非特許文献 6、およ び、 Nelson博士のホームページ (http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html ) )。し力しながら、この P450がアルカンの末端に水酸基を付与すると言う直接の証拠 は得られていな力つた。また、分子進化工学的手法で得られたバチルス ·メガテリゥム 由来の P450の変異体 P450BM-3 139-3が、炭素数 3から 8のアルカンの酸化能を有し て!、ることが明ら力となった (非特許文献 7)。同 P450遺伝子は還元酵素融合型 P450 であり、大腸菌での発現効率も高ぐバイオコンバージョン技術への応用が期待され たが、アルカンの末端ではなく主に側鎖の水酸ィ匕反応であるため実用化には至って いない。以上述べてきたように、アルカン末端の酸化反応を行う P450は産業利用が 期待されるため、研究が盛んに行われてきている力 限定された知見しか存在しなく 、特に細菌由来の同 P450に関する情報は非常に少ないということが言える。
P450モノォキシゲナーゼは、電子伝達の方法の違いにより 2種類の組 (クラス）に分 けられる。 1つ目のクラス（クラス I)はフラビンアデ-ンジヌクレオチド（FAD； flavin adeni ne dinucleotide)を補酵素として分子内に含有する NAD(P)H-鉄ィォゥタンパク質（フ エレドキシン； ferredoxin)還元酵素（レダクターゼ； reductase)、及び、鉄ィォゥタンパ ク質（フ レドキシン）によって P450本体タンパク質に NAD(P)Hから電子供給が行わ れるものである（今後、このクラスを「三成分系の P450モノォキシゲナーゼ」と呼ぶこと がある。 ) oミトコンドリアや細菌の P450モノォキシゲナーゼは通常このクラスに属する 。第 2のクラス（クラス II)は、 FADとフラビンモノヌクレオチド（FMN ; flavin mononucleoti de)を補酵素として分子内に含有する NADPH- P450還元酵素力 鉄ィォゥタンパク質 の介在無しに NADPH力 P450本体タンパク質に電子供給を行うものである（今後、こ のクラスを「二成分系の P450モノォキシゲナーゼ」と呼ぶことがある。 ) o哺乳動物の肝 臓のミクロソーム中に存在する P450モノォキシゲナーゼがこのクラス IIに相当する。 [0006] 近年、細菌のゲノム解析が進むにつれ新しい P450 (CYP;本体タンパク質）の遺伝 子が数多く見つ力つて 、るが、その P450に対応する電子伝達タンパク質をコードする 遺伝子が不明な場合が多い。たとえば医薬品の合成などその利用が期待されている ストレプトマイセス (Streptomvces)属 45種にお!、て 170以上の P450遺伝子が見つかり ながら、それぞれに対応可能な電子伝達タンパク質の発見は 20個未満に留まって ヽ る (Parajuli N. et al. Genome analyses of Streptomvces peucetius ATCし 27952 for t he identification and comparison of cytochrome P450 complement with other Strepto mvces. Arch Biochem Biophys. 425: 233—241, 2004)。
[0007] 対応する電子供与体が不明な場合にも、同じ菌株内に存在する電子伝達タンパク 質や、別の菌株あるいは別の個体の P450電子伝達タンパク質を利用して酵素活性を 生じさせた例はある。たとえば、ストレプトマイセス属の P450の幾つかは、シユードモ ナス ·プナタ (Pseuaomonas putida 由来のフェレド = ンン (プテタレ キンン； putidare doxin)及びプチダレドキシン還元酵素と共存させることで P450モノォキシゲナーゼ活 性を示すことが報告された (有澤章ら，放線菌シトクロム P450および電子伝達タンパ クを共発現させた大腸菌による微生物変換系， 日本農芸化学会 2003年大会講演要 旨， p. 38, 2003) oまた、コリネパクテリゥム (Corvnebacterium sp.) EP1株由来の P450( PB- 1)はホウレンソゥ由来の電子供与体との共存で活性を示した（Kawahara N, et al. Purincation and characterization or 2— ethoxyphenol— induced cytochrome P450 from Corynebacterium sp. strain EP1. Can J Microbiol. 45: 833—839, 1999)。しかし当然 のことながら、前述の電子供与体や電子伝達タンパク質がすべての P450に適応でき るものではなく、個々の P450に於 、て相性の良 、電子伝達タンパク質を探索して用 いられているのが現状である。し力も、多大な労力をかけることなく相性の良い電子 伝達タンパク質を見つけるためには、ある菌種に限定する力、お互いに相同性が高 い P450ファミリーへと絞って P450研究を進めざるを得ない。さらに機能する電子伝達 タンパク質を選択できた場合でも、菌体内で P450と共発現させるには、遺伝子操作 や誘導条件の最適化検討 (たとえば、各構造遺伝子を別々のプラスミドにのせるのか 、同一プラスミド上で発現させるのか、その場合の遺伝子の順番、各遺伝子の誘導の タイミングなど）に多くの時間が費やされる。また、 in xiimでの P450機能解析におい ても、還元系酵素を別々に生産、精製し、それらを最適な割合になるよう検討しなが ら混合する、というステップを踏むため、ただ 1つの P450を機能解析するのにも多くの 時間と手間がかかる。これらのことから、莫大な P450遺伝子の構造に関する情報が蓄 積されているにもかかわらず、 P450遺伝子の機能に関する情報は少なぐ多種多様 な P450から目的とする基質特異性や触媒機能を持つ酵素を選択したり、新規に得ら れた P450が作用できる基質を探索する、 t 、つた選択系のハイスループットィ匕は難し いのが現状であった。
また、一般的な P450の問題点として、電子供与体力 シトクロム P450への電子伝達 が酵素反応の律速になるために、シトクロム P450—分子あたりの活性が低 、ことが挙 げられる。この点を改善する鍵となると思われるの力 珍しい例であるが、融合型 P450 モノォキシゲナーゼと呼ばれるものであり、 P450本体タンパク質と還元酵素が 1本の ポリペプチド鎖として繋がっているものである。よく知られている例は細菌バチラス 'メ ガテリゥム (Bacillus megaterium)由来の P450BM3 (非特許文献 8)を始めとして、カビ 由来の P450foxyなどである。これらの構造は、クラス IIに属する二成分系の P450モノ ォキシゲナーゼにおける P450本体タンパク質と、 FADと FMNを分子内に補酵素として 含有する NADPH-P450還元酵素と 、う構成成分力もなつて 、る。クラス IIの二成分系 と違う部分はこの 2つの構成成分がリンカ一部分を介して 1つのポリペプチドとして繋 がっているというところである。この融合型 P450モノォキシゲナーゼの特徴の 1つとし て、三成分系、二成分系の P450モノォキシゲナーゼと比べて酵素反応速度が速ぐ 高い活性を保有できることである。その理由として、 P450と還元酵素の融合により電 子が分子内伝達となった有利性が考えられ、 P450と還元酵素系の最も良い相互作 用をもつ立体構造を実現して 、る可能性がある。この融合型 P450モノォキシゲナー ゼを模倣して、人工的融合型 P450モノォキシゲナーゼを作った例は真核生物の P45 0において広く認められ、 N末端側にヒト肝臓 P450本体タンパク質を有し、 C末端側に 酵母ゃラット、あるいは前述の P450BM3由来 NADPH- P450還元酵素を付カ卩した人工 融合酵素などが作られている。 P450BM3は細菌由来でありながら、 P450本体タンパク 質部分 (ヘムドメイン）、 NADPH-シトクロム P450還元酵素ドメイン共に、例外的に真核 生物由来のクラス IIに属する P450及び P450還元酵素と相同性が高いため電子供与 体として適用され得たものと考えられる。このように P450BM3は細菌由来の P450であ りながら、クラス Iに属する三成分系の一般的な細菌由来の P450とは一線を画すもの である。
[0009] 一方、 P450BM3を除くと、細菌由来の P450本体タンパク質を用いて P450—還元酵 素ドメインの融合酵素作製の成功例 (活性のある融合酵素作製に成功した例）はわ ずか一例に留まり、し力も、それは元々同じシステム内の P450モノォキシゲナーゼの 構成成分を融合化したものにすぎない（S¾besen, 0., et al. Putidaredoxin reductase —putidaredoxin— cytochrome P450cam triple fusion protein, construction of a self— su fficient Escherichia coli catalytic system. J Biol Chem. 271: 22462-9, 1996)。一般 的な細菌由来の P450本体タンパク質と異種 P450モノォキシゲナーゼ成分由来の還 元酵素部分との融合ィ匕にっ 、ての試みの成功例はこれまでに報告されて 、な 、。こ れは先にも述べたように、細菌の P450機能システムが P450本体タンパク質、フェレド キシン、フェレドキシン還元酵素の三成分系力 成るため複雑であることが要因であ ろう。微生物の P450モノォキシゲナーゼの産業利用にお 、て人工融合化酵素は簡 便な酵素精製、または菌体内反応系を可能にするものでありながら、未だ確立された 技術ではない。
[0010] 前述した、クラス I、クラス IIに属する P450モノォキシゲナーゼゃ融合型 P450モノォキ シゲナーゼのいずれにも当てはまらない P450モノォキシゲナーゼが最近報告された (非特許文献 8)。これはロドコッカス (Rhodococcus)属 NCIMB9784株より単離された P 450モノォキシゲナーゼ（P450RhFと命名された）であり、 P450本体タンパク質（ヘムド メイン）、フラビンモノヌクレオチド（FMN)を補酵素にして分子内に含有する NADH-P 450還元酵素ドメイン、鉄ィォゥタンパク質ドメインが 1本のポリペプチドとして繋がった ものである。本 P450モノォキシゲナーゼ（P450RhF)における還元酵素ドメイン力 SFMN しか要求しないというのも新奇である。クラス Iの P450モノォキシゲナーゼにおける還 元酵素が FADを要求し、クラス IIや従来の融合型の P450モノォキシゲナーゼにおける 還元酵素が FADと FMNの両方を要求する力もである。したがって、 P450RhFは P450 モノォキシゲナーゼの中で極めて例外的なものであると考えられる。
[0011] 特許文献 1 :特表 2000-513933号公報 非特許文献 l : Urlacher et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 64: 317-325 (2004) 非特許文献 2 : Thomas et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 10494-10499 (2002) 非特許文献 3 : Okuta, A. et al, Gene. 212: 221-228 (1998)
非特許文献 4 : Ohkuma et al, J. Biol. Chem. 273: 3948-3953 (1998)
非特許文献 5 : Thomas et al, Biochem. Biophy. Res. Comm. 286: 652-658 (2001) 非特許文献 6 : Beilen et al, biocat 2004 Book of Abstracts, p. 233
非特許文献 7 : Glieder et al, Nat. Biotechol. 20: 1135-1139 (2002)
非特許文献 8 : Roberts, G.A., et al, Identification of a new class of cytochrome P450 from a Rhodococcus sp. J. Bacteriol. 184: 3898—3908, 2002.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 本発明の第一の目的は、多様な環境中に存在する微生物資源力 効率良ぐ特に 当該環境中では稀少な微生物から、多様な P450遺伝子を単離する方法を提供し、さ らには、新規な P450遺伝子及び該遺伝子によって合成される P450を提供し、該酵素 によって多様な有機化合物を酸ィ匕する手段を提供することである。
[0013] また、 P450モノォキシゲナーゼは、基質特異性や反応特異性に関して非常に多様 であるので、種々の有用な生体触媒反応への応用が期待されている。しかしながら、 ほとんどの P450本体タンパク質 (CYP)はそれだけでは触媒活性を持つことはできな いので、せつ力べ新規な P450遺伝子を見出しても、コードされる P450が作用できる基 質を特定し且つ実用化するためには多くの時間と労力が必要とされる。すなわち、 P4 50本体タンパク質が本来有しているはずの酵素活性 (触媒活性)を利用するには、活 性のある P450モノォキシゲナーゼを再構成しなければならず、そのためには P450本 体タンパク質に適切に電子供与する電子伝達タンパク質の共存が必須である。しか しながら、個々の P450、特に新規の P450に呼応する電子供与体を見つけるのは困難 なこと、さらには、一般的に P450モノォキシゲナーゼのシステムそのものの酵素活性 が弱く失活しゃすいことが知られており、多様な P450本体タンパク質に対応し尚且つ 効率の良い電子伝達を行うシステムの開発が強く求められていた。本発明の第二の 目的はこのようなシステムを構築し、活性のある P450モノォキシゲナーゼを生産する 方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0014] 本発明者らは、上記第一の目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、石油成 分を資化する微生物に由来する複数の P450遺伝子により形成されている CYP153A サブファミリーにおいてアミノ酸配列が比較的よく保存された領域を見出し、該領域 に基づ!/、て設計したプライマーにより様々な環境由来 DNAサンプル力 新規 P450遺 伝子断片の増幅が可能であることを見出した。さらに、カセット PCR法より、増幅され た P450遺伝子と既知 P450遺伝子間のノ、イブリツド遺伝子を作製した上で、大腸菌発 現系によるハイブリッド遺伝子の機能解析手法を確立し、検討を重ねた結果、環境中 力も得られた新規 P450配列とのノ、イブリツド遺伝子産物がモノォキシゲナーゼ活性を 有し、アルカン (直鎖状炭化水素)、アルケン (不飽和結合を含む直鎖状炭化水素)、 環状炭化水素、及び、分子内に芳香環を含むアルカンやアルケンなどの有機化合 物を基質とし、末端メチル基の水酸化反応や末端ォレフィンのエポキシ化反応等の 酸化反応を触媒することを見出した。
[0015] また、本発明者らは、上記の第二の目的を達成するため、汎用性と効率性を兼ね 備えた P450への電子伝達システムを開発すべく鋭意検討を重ねてきた。その過程で 、ロドコッカス属 (Rhodococcus sp.) NCIMB9784株のシトクロム P450モノォキシゲナー ゼ（P450RhF)に着目した。「背景技術」で説明したように、 P450RhFは P450本体タン ノ ク質と P450還元酵素ドメイン (領域）が融合して 1本のポリペプチド鎖として存在す る融合型 P450モノォキシゲナーゼである。融合型 P450モノォキシゲナ一と言っても、 前述したように P450BM3や P450foxyとは違 、、還元酵素領域には鉄-ィォウタンパク 質様コンポーネントと FMNタンパク質様コンポーネントを有するこれまでにない新奇な 構造を持っていた (非特許文献 1)。一般的に、ロドコッカス属細菌のようなァクチノバ クテリアの場合、種々の有機化合物の変換反応に関与する多様な触媒機能を有して おり、それに対応して煩雑な酵素系を有していることが知られているので、この新奇 な P450RhFのような酵素に汎用性を期待するのは難しいと思われた。さらには、ロドコ ッカス属細菌由来の酵素系に関与する遺伝子を大腸菌のような汎用宿主で機能発 現させるのは難しい場合が多いことが知られていた。したがって常識的に考えると、こ の P450RhFは、本発明者らの目的、すなわち汎用性と効率性を兼ね備えた P450への 電子伝達システムの開発への材料として期待することはできな 、と思われた。それで も本発明者らは、 P450RhFの還元酵素領域を利用し、種々の細菌由来の P450本体タ ンパク質への電子伝達システムとして働力せることはできないか、さらには電子伝達 が分子内伝達になるように融合タンパクとして働かせることはできな 、かと考え鋭意 検討を重ねた。その結果、思いがけないことに、この P450RhFの還元酵素ドメインを、 異種の細菌由来の P450本体タンパク質の C末に適切なリンカ一領域を介して融合ィ匕 させることにより、触媒活性があり、し力も失活しにくい P450モノォキシゲナーゼを作る ことができることがわ力 た。
[0016] 具体的には、細菌由来のシトクロム P450本体タンパク質 (CYP)をコードする塩基配 列を有する遣伝子 ロドコッカス属（Rhodococcus sp.) NCIMB9784株由来の P450Rh Fの還元酵素ドメインをコードする塩基配列を有する遺伝子を接続することにより、単 一のポリペプチド遺伝子とし、 P450の有するモノォキシゲナーゼ活性および P450RhF の還元酵素ドメインの有する NAD(P)H力 の還元力供給能を同一分子内に有する 人工融合酵素をコードする人工融合酵素遺伝子発現系を構築した。そして幾つかの 異種細菌由来 P450遺伝子につ 、てこの発現系を適用し、大腸菌に人工融合酵素を 生産させることに成功した。生産された人工融合酵素は単一分子内に電子伝達と基 質の酸ィ匕能の両機能を有しており、構築した融合タンパク遺伝子発現系が多様な P4 50遺伝子に対応できることを確認した。更に、構築した融合タンパク遺伝子発現系を 用いれば、大腸菌培養液を用いた簡易な生変換反応により P450の生体触媒活性を 観察できることを確認した。
[0017] 本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
[0018] 即ち、本発明は、以下の（1)〜（23)を提供するものである。
[0019] (1)配列番号 51又は 52記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列、 又はそれと相補的な塩基配列を含み、かつプライマー又はプローブとして実質的な 機能を有する P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド。
[0020] (2)配列番号 53〜56記載の 、ずれかの塩基配列、又はそれと相補的な配列の一 部または全部を含み、かつプライマー又はプローブとして実質的な機能を有する P45 0遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド。
[0021] (3) (1)又は（2)記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一方のプライマーとして使用す ることを特徴とする P450遺伝子断片単離法。
[0022] (4)試料カゝら核酸を抽出する工程、及び抽出した核酸を铸型とし、（1)又は（2)記載 のオリゴヌクレオチドをプライマーとして核酸増幅反応を行う工程を含む P450遺伝子 断片単離法。
[0023] (5) (1)又は（2)記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一方のプライマーとして使用し て P450遺伝子断片を単離する工程、及び単離された P450遺伝子断片の 5'末端及び 3'末端のそれぞれに既知 P450遺伝子の 5'末端領域及び 3'末端領域を付加する工程 を含むハイブリッド P450遺伝子の作製方法。
[0024] (6)既知 P450遺伝子が、配列番号 57記載のアミノ酸配列をコードする P450遺伝子で ある（5)記載のハイブリッド P450遺伝子の作製方法。
[0025] (7)以下の（a)〜（c)を含むことを特徴とする P450遺伝子単離用キット、
(a) (1)又は（2)記載のオリゴヌクレオチド、
(b)既知 P450遺伝子の 5 '末端領域を含む DNA断片、
(c)既知 P450遺伝子の 3 '末端領域を含む DNA断片。
[0026] (8)以下の（a)又は (b)の 、ずれかのタンパク質をコードする遺伝子、
(a)配列番号 1〜25のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号 1〜25のいずれかのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸配 列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ P450として機能するタ ンパク質。
[0027] (9)配列番号 26〜50のいずれかの塩基配列力 なり、 P450として機能するタンパク 質をコードする遺伝子。
[0028] (10) (8)又は（9)記載の遺伝子を含有する発現ベクター。
[0029] ( 11)以下の（a)または（b)の!、ずれかのタンパク質、
(a)配列番号 1〜25のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号 1〜25のいずれかのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸配 列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列力もなりかつ、 P450として機能するタ ンパク質。
[0030] (12) (10)記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培地で培養し、得られ る培養物から（11)記載のタンパク質を回収することを特徴とする P450として機能する タンパク質の製造法。
[0031] (13) (11)記載のタンパク質を基質と反応させ、酸化化合物を得ることを特徴とする 酸化化合物の生産法。
[0032] (14) P450本体タンパク質の C末端側に、リンカ一部分を介して、ロドコカツス属 NCIM B9784株由来のシトクロム P450モノォキシゲナーゼに含まれる還元酵素ドメインと同 様の機能を持つペプチドを付加してなる融合型シトクロム P450モノォキシゲナーゼ。
[0033] (15)ロドコカツス属 NCIMB9784株由来のシトクロム P450モノォキシゲナーゼに含まれ る還元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドが、 (a)配列番号 70記載のアミノ酸 配列からなるペプチド、（b)配列番号 70記載のアミノ酸配列において 1もしくは複数 個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列力 なるペプチド、又は (c) 配列番号 69記載の塩基配列力もなる DNA又はそれと相補的な DNAとストリンジ ント な条件下でハイブリダィズする DNAがコードするペプチドであることを特徴とする（14 )に記載の融合型シトクロム P450モノォキシゲナーゼ。
[0034] (16)リンカ一部分力 （d)配列番号 68記載のアミノ酸配列力もなるペプチド、（e)配 列番号 68記載のアミノ酸配列において 1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしく は置換されたアミノ酸配列力 なるペプチド、又は (f)配列番号 67記載の塩基配列 力もなる DNA又はそれと相補的な DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズす る DNAがコードするペプチドであることを特徴とする（14)又は（15)に記載の融合型 シトクロム P450モノォキシゲナーゼ。
[0035] (17) P450本体タンパク質力 細菌由来の P450本体タンパク質であることを特徴とす る（ 14)乃至（ 16)の 、ずれか一項に記載の融合型シトクロム P450モノォキシゲナー ゼ。
[0036] (18) P450本体タンパク質力 （11)記載のタンパク質、又は配列番号 57若しくは配 列番号 85のアミノ酸配列力もなるタンパク質であることを特徴とする（14)乃至（16) のいずれかに記載の融合型シトクロム P450モノォキシゲナーゼ。 [0037] (19) (14)乃至（18)のいずれかに記載の融合型シトクロム P450モノォキシゲナーゼ をコードする DNA。
[0038] (20) (19)記載の DNAを導入した微生物。
[0039] (21) (20)記載の微生物を培養し、培養物又は菌体から融合型シトクロム P450モノォ キシゲナーゼを採取することを特徴とする融合型シトクロム P450モノォキシゲナーゼ の生産方法。
[0040] (22) (14)乃至（18)のいずれか一項に記載の融合型シトクロム P450モノォキシゲナ 一ゼを基質と反応させ、酸化化合物を得ることを特徴とする酸化化合物の生産法。
[0041] (23)基質が、 n-へキサン、 n-ヘプタン、 n-オクタン、 ITデカン、 1-オタテン、シクロへ キサン、 β-ブチルベンゼン、 4-フエニル- 1-ブテン、又は 2-η-ブチルベンゾフランであ り、生産される酸ィ匕化合物がそれぞれ 1-へキサノール、 1-ヘプタノール、 1-オタタノ ール、 1-デカノール、 1 ,2-エポキシオクタン、シクロへキサノール、 4-フエニル- 1-ブタ ノール、 2-フエネチルォキシラン、又は 4-ベンゾフラン- 2-ィル-ブタン- 1-オールであ ることを特徴とする（22)記載の酸化化合物の生産法。
[0042] (24)以下の（a)又は（b)の!ヽずれかのタンパク質をコードする遺伝子、
(a)配列番号 85のアミノ酸配列力 なるタンパク質、
(b)配列番号 85のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換 もしくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ P450として機能するタンパク質。
[0043] (25)配列番号 86の塩基配列力 なり、 P450として機能するタンパク質をコードする 遺伝子。
発明の効果
[0044] 本発明により、環境サンプル等の雑多な微生物由来の核酸を含むサンプルから、 新規 P450遺伝子を効率的に単離する方法が提供される。本発明の方法によって提 供される P450遺伝子力 生産される P450は多様な低分子有機化合物の生産に利用 することができる。
[0045] また、既存および未知の P450タンパク質から本発明の融合型 P450モノォキシゲナ ーゼを作製することにより、これらの P450タンパク質を、電子伝達と基質の酸化反応 の両機能を有する一成分系の機能性 P450モノォキシゲナーゼにすることが可能とな り、従来 P450モノォキシゲナーゼ活性の提示に必要だった電子伝達タンパク質との 反応系の再構築検討実験の必要がなくなる。これにより、有用な P450生体触媒活性 のスクリーニングの高速化、有用な P450酵素の簡便な精製、融合酵素遺伝子を発現 した微生物による有用物質の生変換反応プロセスや産業廃水中の有害物質の酸ィ匕 的除去等の実用的応用が可能になる。
図面の簡単な説明
[図 1]獲得した新規 P450のアミノ酸配列（配列番号 1から 25)と既知 P450のアミノ酸配 列の相同性に基づく系統榭を示した図。
[図 2]還元状態での一酸化炭素の通気処理による、粗抽出液 A (図 2A)、粗抽出液 B (図 2B)および粗抽出液 C (図 2C)の吸収スペクトルの変化を示した図。
[図 3]粗酵素液 B、 Dによるオクタン、 1-デセンを基質とした酵素反応の後、反応液を ガスクロマトグラフィー質量分析計にて分析したチャートを表す図。
[図 4]融合型 P450作製用発現プラスミド pREDの構造を示した図。
[図 5]炭素数 6から 8の n-アルカンを基質とした場合に酸ィ匕物として検出された 1-アル コールの生成量を比較した図。
[図 6]菌懸濁液 H5、 H9、 Alk及びコントロールの Nonによる n-ブチルベンゼンを基質と した変換反応物を誘導体化し、ガスクロマトグラフィー質量分析計にて分析したチヤ ートを表す図。
[図 7]菌懸濁液 H5、 H9、 Alk及びコントロールの Nonによる 4-フエ-ル- 1-ブテンを基 質とした変換反応の後、ガスクロマトグラフィー質量分析計にて分析したチャートを表 す図。
[図 8]人工融合化 P450cam (図 8A)及び非融合化 P450cam (図 8B)の光学的性質を 示す図である。
[図 9]融合ィ匕及び非融合ィ匕 P450cam生産大腸菌によるショウノウ力 5-水酸ィ匕ショウノ ゥへの変換能を示す図である。
[図 10]融合ィ匕及び非融合ィ匕 P450alk生産大腸菌による η-オクタンから 1-ォクタノール への変換能を示す図である。
[図 11]融合ィ匕及び非融合ィ匕 P450bzo生産大腸菌による 4-ヒドロキシ安息香酸から 3,4 -ジヒドロキシ安息香酸への変換能を示す図である。
[図 12]融合ィ匕及び非融合ィ匕 P450SU- 1、 SU-2生産大腸菌による 7-エトキシクマリンか ら 7-ヒドロキシクマリンへの変換能を示す図である。レーン番号 1 : 7-エトキシクマリン、 2 : 7-ヒドロキシクマリン、 3 : P450非保有株、 4:pETP450SU- 1保有株、 5 :pSU- 1RED保 有株、 6 :pETP450SU- 2保有株、 7： pSU- 2RED保有株。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
1. P450モノォキシゲナーゼ
P450モノォキシゲナーゼは、シトクロム P450本体タンパク質（CYP)以外に電子伝達 タンパク質を必要とする複合酵素である。すなわち、 P450が活性を発揮するには、 N AD(P)H力も電子を伝達してくるタンパク質として、細菌や真核生物のミトコンドリアで はフェレドキシンレダクターゼとフェレドキシンの介在を必要とし、哺乳動物の肝臓ミ クロソームでは NADPH- P450レダクターゼの介在を必要とする。一次構造上の特徴 として P450には FXXGXR/HXCXGという共通配列が C末端から 50〜60残基手前に 存在する。この配列はヘム結合領域と呼ばれ、 P450に独特の配列であり、塩基配列 力 推定されるアミノ酸配列にこの配列が見つ力ると、その DNAは P450をコードして いる遺伝子とみなされる（大村ら編 P450の分子生物学 2003年 講談社サイェンテ ィフィック)。 P450遺伝子の分類はアミノ酸配列の類似度を基準にして行われ、最新情 報は Nelson博士のホームページ (http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html )に掲載される。公認された命名法において、 P450スーパーファミリーに属する遺伝 子は共通の接頭辞 CYPで始まり、それに続くファミリー番号、サブファミリー記号、遺 伝子番号によって区別される。アミノ酸配列が 40%以上一致すれば同一ファミリーに 、 55%以上一致すれば同一サブファミリーに分類されるのが原則である。
本発明において、モノォキシゲナーゼ活性とは、酸素分子を還元して 1分子の水を 作ると共に、残りの酸素原子を様々な低分子有機化合物に導入して、酸化生成物に 変換する反応を触媒する作用を意味する。また、 P450モノォキシゲナーゼとは、還元 状態で一酸ィ匕炭素を通気すると吸収スペクトルが変化し 450 nmに極大をもつ差スぺ タトル (CO差スペクトル）が現れる性質を有し、さらにモノォキシゲナーゼ活性を有す るタンパク質を意味する。
2. P450モノォキシゲナーゼ CYP153ファミリー
P450モノォキシゲナーゼ CYP153ファミリ一は、最初にァシネトバクタ一'力ノレコアセ ッカス (Acinetobacter calcoaceticus) EB104株にお!、て CYP153A1が発見された（非 特許文献 5)。その後、アルカンの資化能を有する微生物数種類でも CYP153ファミリ 一に属する P450が発見されて!、る（Nelson博士のホームページ（http：〃 drnelson.utm em.edu/CytochromeP450.html) )。 CYP153ファミリーの機能に関しては、アルカン（ォ クタン）資化能を喪失したシユードモナス ·プチダ (Pseudomonas putida)を宿主として 、 CYP153A1遺伝子を発現させ、オクタン入り培地での生育状態を観察することによ つて、同 P450がオクタンの末端に水酸基を導入するモノォキシゲナーゼであることを 示唆する報告がある（非特許文献 6)。なお、 CYP153ファミリーに属する P450に限らず 、 P450がアルカンの末端に水酸基を導入する活性を有して ヽることを直接観察した 報告は無ぐ本発明者によって初めて報告されるものである。なお、微生物由来の一 般的な P450は、その酸化反応を触媒するために電子伝達タンパク質としてフェレドキ シンレダクターゼ (ferredoxin reductase)とフェレドキシン（ferredoxin)の介在が必要で あると考えられている。
3.カセット PCR法
(1) P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチドの作製
本発明の P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド（以下「本オリゴヌクレオチド」と いう）は、配列番号 51又は 52記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基 配列、又はそれと相補的な塩基配列を含み、かつプライマーとして実質的に機能を 有するオリゴヌクレオチドである。本オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用すること により P450遺伝子断片の単離が可能となる。本発明において、「オリゴヌクレオチド」 とはデォキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドいずれをも意味し、「核酸」とは DN A又は RNAIゝずれをも意味する。
本オリゴヌクレオチドは、 Nelsonのホームページ（http://drnelson.utmem.edu/Cytoc hromeP450.html)に登録されて!、る P450スーパーファミリーの CYP153Aに属するもの 3つ、すなわち、 CYP153A1 (accession no. AJ311718)、 CYP153A2 (accession no. AE 005680)、じ丫？153 13& (配列番号57)のアミノ酸配列に基づいて設計されたもので ある。すなわち、本オリゴヌクレオチドは、これらの配列のァライメントによって予測さ れた P450の保存領域に基づいて設計されたものである。
また、本オリゴヌクレオチドは、プライマーとして実質的な機能を有するように設計さ れる。本発明において「プライマーとして実質的な機能を有する」とは、特異的なァ- 一リング又はノ、イブイダィズが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングま たはハイブリダィズが可能な長さ及び塩基組成 (融解温度)を有する、 、う意味であ る。すなわち、本オリゴヌクレオチドは、その配列の長さが短いために又はその塩基 組成が適切ではないために非特異的なアニーリングを頻繁に引き起こし、 P450の特 異的な増幅に使用できないオリゴヌクレオチドを排除することを意味するものである。 本オリゴヌクレオチドがプライマーとして実質的な機能を有する長さとしては、好ましく は 10塩基以上であり、さらに好ましくは 16塩基以上であり、最も好ましくは 18塩基以上 である。好適な本オリゴヌクレオチドの具体例としては、配列番号 53〜56記載の塩 基配列で表されるオリゴヌクレオチドを例示することができる。
また、本オリゴヌクレオチドには、後述するノ、イブリツド遺伝子の作製のために、 5 '末 端にアッセンブリー配列が付加されていてもよい。アッセンブリー配列とは、既知 P450 遺伝子断片とアニーリングすることができる配列のことである。本オリゴヌクレオチドを フォワードプライマー及びリバースプライマーとして用いて増幅された P450遺伝子断 片は、フォワードプライマーとリバースプライマーで挟まれた領域の配列しか有して!/ヽ ない。すなわち開始コドンを含む 5 '末端の配列と終始コドンを含む 3 '末端の配列が 欠けている。この欠けている配列は、既知の P450遺伝子の 5 '末端断片及び 3 '末端 断片とアニーリングさせ、伸長反応を行うことにより補うことができる。このとき既知 P45 0遺伝子の 5 '末端断片又は 3 '末端断片とのアニーリングに供される配列がアッセン ブリー配列である。本オリゴヌクレオチドがフォワードプライマーとして使用される場合 には、アッセンブリー配列は、通常既知 5 '末端断片の 3 '末端配列となる。また本オリ ゴヌクレオチドがリバースプライマーとして使用される場合には、アッセンブリー配列 は、通常既知 3 '末端断片の 5 '末端配列となる。本オリゴヌクレオチドには、このアツセ ンブリー配列が付加されたものも含まれる。 付加されるアッセンブリー配列の長さは既知 5'末端断片または 3'末端断片とのァ ニーリングが可能であり、かつ核酸増幅反応の妨げにならない長さであればよい。好 ましくは 5〜50塩基であり、さらに好ましくは 10〜20塩基である。
本オリゴヌクレオチドは、ホスファイト法やホスホトリエステル法等の当業者に公知の 方法に従って合成することができる。
(2)新規 P450遺伝子断片の単離
新規 P450遺伝子断片の単離は、「（1) P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチドの 作製」の項に記載のオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。通常は、本オリゴヌ クレオチドをプライマーとして増幅反応を行うことにより、新規 P450遺伝子断片を単離 することができる（以下、「本単離法」という）。
本単離法において、新規 P450遺伝子断片の単離を行う対象となる試料は、原核生 物由来の核酸が含まれていると思われるものであればどのようなものでもよい。試料 の例としては、微生物を人工的に培養した培養物の他、未知の微生物が雑多に含ま れている環境由来の試料等が挙げられる。環境由来の試料の例としては、例えば、 海水、淡水、土壌等が挙げられる。本単離法においては、通常、試料から核酸の抽 出を行う。抽出する核酸は、 DNA又は RNAのいずれでもよい。 DNA又は RNAは、当 技術分野で周知の方法を適宜使用して抽出することができる。例えば、 DNAを抽出 する場合には、フエノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用い る方法など、また RNAを抽出する場合には、グァ-ジン一塩ィ匕セシウム超遠心法、ホ ットフエノール法、又はチォシアン酸グアジ-ゥムーフエノールークロロホルム（AGPC )法などを利用することができる。また、試料が海水、淡水等の液体である場合には、 核酸の抽出作業を行う前に、試料の濃縮作業を行うことが望ましい。試料の濃縮は、 適当な孔径のフィルターで試料をろ過することにより行うことができる。ろ過に使用す るフィルターの材質は、フィルターに一般的に使用されるものであれば特に限定され ないが、例えば、セルロースアセテート、ニトロセルロース、セルロース混合エステル、 ポリビ-リデンジフロライド、ポリテトラフルォロエチレン、ポリカーボネート、ポリプロピ レン、銀等が例示される。また、培地を含浸させた担体を水中に設置し、担体に付着 した微生物由来を効率よく回収する手法も考案されている。（特開 2003-334064)。以 上のようにして回収した試料からは、必要に応じて SDS等の界面活性剤等で細胞を 破壊した後、上記記載の適当な方法で核酸を抽出することができる。
また、試料が土壌である場合にも、当業者に公知の技術によって、核酸を抽出する ことができる。土壌力 核酸を抽出する方法としては、例えば、 Zhouらの方法 (Zhou e t al Appl. Environ. Microbiol. 62: 316-322 (1996))や Griffithsらの方法（Griffiths. Ap pi. Environ. Microbiol. 66: 5488-5491 (2000))を挙げることができる。
上記のように抽出した核酸から、「（1) P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチドの 作製」の項に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることにより、 P450遺伝 子断片を単離することができる。上記のように抽出した核酸を铸型とし、本発明のオリ ゴヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行うことにより、 P450遺伝子 断片を特異的に増幅することができる。通常、配列番号 51記載のアミノ酸配列に基づ Vヽて設計された本オリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして使用し、配列番号 5 2記載のアミノ酸配列に基づいて設計された本オリゴヌクレオチドをリバースプライマ 一として使用する。なお、核酸増幅反応においてプライマーとして使用する本オリゴ ヌクレオチドは、縮重プライマー（degenerated primer)であってもよい。核酸増幅反応 を行う手法は、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅反応を行うことがで きる方法であれば特に限定されないが、最も適した方法としては、ポリメラーゼ連鎖反 応 (PCR)法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。増幅は、増幅産物 が検出可能なレベルになるまで行う。例えば、 PCR法は、 DNAを铸型として、 DNAポリ メラーゼにより、一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。 PCR法によれ ば、変性、アニーリング及び合成力もなるサイクルを繰り返すことによって、増幅断片 を指数関数的に増幅させることができる。 PCRの最適条件は、当業者であれば容易 に決定することができる。また RT-PCR法では、まず、 RNAを铸型として、逆転写酵素 反応により cDNAを作製し、その後、作製した cDNAを铸型として一対のプライマーを 用いて PCR法を行うものである。本オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた場合 において、 P450遺伝子の特異的な増幅が起こるような条件は、プライマーとして用い た本オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基組成から、当業者であれば適宜設定すること ができる。増幅された P450遺伝子断片は、ァガロースゲル電気泳動等によって分画 し、増幅の確認されたバンドを切り出して、 DNAを抽出することによって得ることができ る。
(3)ハイブリッド P450遺伝子の作製方法
「（2)新規 P450遺伝子断片の単離」記載の方法で増幅された P450遺伝子断片は、 本オリゴヌクレオチドとアニーリングする領域に挟まれた領域の配列し力含まな 、。す なわち、開始コドンを含む 5'末端領域及び終止コドンを含む 3'末端領域は含まれて いない。そのため、（2)記載の方法で増幅された P450遺伝子断片では、 P450遺伝子 としての機能を持たない場合がある。この問題を解決し、 P450遺伝子として機能する DNA断片を得るためには、（2)記載の方法で増幅された P450遺伝子断片の両端を 既知の P450遺伝子の配列で補えばよ 、。両端部の補充に使用する既知 P450遺伝子 は、これまでに公知となっている細菌由来の P450遺伝子であれば、どのようなもので もよ 、が、配列番号 51及び 52記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んで 、 ることが好ましい。そのような P450遺伝子の例としては、 Nelson博士のホームページ（ http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html)に登録されている P450スーパー ファミリーの CYP153Aに属する遺伝子を挙げることができる。
(2)記載の方法で増幅された P450遺伝子断片の両端部を既知の P450遺伝子の配 列で補うことにより、中央部が未知 P450遺伝子の塩基配列であり、両末端部が既知 P 450伝子の塩基配列であるハイブリッド遺伝子を作製することができる。このハイブリツ ド P450遺伝子は、適当な宿主に導入することにより、 P450を生産することが可能であ る。該 P450遺伝子は、（2)記載の方法で P450遺伝子断片の増幅を行った後、既知 P 450遺伝子の 5'末端領域（開始コドンから（2)記載の増幅法で使用されたフォワード プライマーとアニーリングする領域まで:以下、「5-armフラグメント」という）と、 3'末端 領域（（2)記載の増幅法で使用されたリバースプライマーとアニーリングする領域力 終始コドンまで:以下、「3-armフラグメント」という）とアニーリングさせた後、伸長反応 を行うことによって得ることができる。
ノ、イブリツド P450遺伝子を得る場合に使用するプライマーは、「（1) P450遺伝子断 片単離用オリゴヌクレオチド」の項で記載したアセンブリー配列を付加されたものでも よい。アッセンブリー配列を付加されたプライマーを使用することにより、増幅された P 450遺伝子断片と 5-armフラグメント及び 3-armフラグメントとのアニーリング効率を高 めることができる。 5-armフラグメント及び 3-armフラグメントは、両端部を補う既知 P450 遺伝子を含む DNAを铸型として核酸増幅反応を行うことにより作製することができる。 プライマーの設計及び合成は、当業者に公知の知見に基づいて行うことができる。ま た、増幅反応の反応条件は、使用するプライマーの長さ及び塩基組成に基づき、当 業者に公知の知見により設定することができる。 (2)記載の増幅反応により増幅され た P450遺伝子断片と 5-armフラグメント及び 3-armフラグメントとのアニーリング反応、 及びそれに続く伸長反応によって得られたハイブリッド P450遺伝子は、引き続き核酸 増幅反応を行うことによって増幅することができる。増幅反応のプライマーには、 5-ar mフラグメント及び 3-armフラグメントをそのままプライマーとして用いることもできるが、 5-armフラグメントの開始コドンを含む領域、及び 3_armフラグメントの終始コドンを含 む領域の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして加えた方が好ましい。 プライマーの設計及び合成は、当業者に公知の知見に基づいて行うことができる。ま た、増幅反応の反応条件は、使用するプライマーの長さ及び塩基組成に基づき、当 業者に公知の知見により設定することができる。増幅されたノヽイブリツド P450遺伝子 は、ァガロースゲル電気泳動法等によって核酸断片を分画し、増幅の確認されたバ ンドを切り出して DNAを抽出することにより単離することができる。
(2)記載の方法によって得られた P450遺伝子断片及び上述した方法によって得ら れたノヽイブリツド遺伝子力 モノォキシゲナーゼ活性を有するタンパク質、すなわち P 450コードする遺伝子であるかどうかは塩基配列力 推定されるアミノ酸配列に FXXG XR/HXCXG t 、う共通配列が C末端から 50〜60残基手前に存在するかどうかを調 ベることで確認することができる。また、得られた核酸断片を含む発現ベクターを適当 な宿主に導入し、宿主の培養菌体又は宿主菌体の細胞を破砕した粗抽出液を用い て CO差スペクトル及びモノォキシゲナーゼ活性の有無を調べることでも確認すること ができる。
発現ベクターの作製、宿主の選択及び宿主への発現ベクターの導入は、多くの実 験書に記載されているので（たとえば、 Sambrook, J., Russel.D. W.， Molecular Clonin g A Laboratory Manual, 3rd Edition, CSHL Press, 2001)、それらに従った公知の遺 伝子工学的手法により行うことができる。
宿主に導入する発現ベクターには、ファージ、ファージミドベクター又はプラスミドべ クタ一を用いることができる。また、宿主は、発現ベクターが機能するものであれば真 核細胞でも原核細胞でも特に限定されず、動物細胞、酵母細胞、放線菌、細菌細胞 等を使用することができる。細菌細胞の中で好適なものとしては、大腸菌、枯草菌等 が挙げられる。また、発現ベクターは、挿入した遺伝子断片又はハイブリッド遺伝子 の上流に、プロモーター等の発現調節領域を有している必要がある。そのような発現 調節領域の例としては、例えば大腸菌を宿主として使用した場合には、 プロモー ター等が挙げられる。発現ベクターを導入した宿主は、宿主に応じた適当な培地で 培養し、得られた菌体又は菌体を破砕した粗抽出液を用いて CO差スペクトル及びモ ノォキシゲナーゼ活性の測定を行えばよい。 CO差スペクトルの測定は、粗抽出液を 亜ニチオン酸ナトリウム (Na S 0 )で処理し、一酸化炭素を通気した後、吸光スぺタト
2 2 4
ルを測定し、 450 nmに極大をもつ差スペクトルを観察することで行うことができる。モノ ォキシゲナーゼ活性の測定は基質となる低分子の有機化合物の存在下において、 P 450遺伝子断片又はハイブリッド遺伝子、及び電子伝達タンパク質遺伝子を含む発 現ベクターが発現する条件で宿主細胞を培養する力、 P450遺伝子断片又はノ、イブリ ッド遺伝子、及び電子伝達タンパク質遺伝子を含む発現ベクターを発現させて培養 した宿主細胞の粗抽出液を反応させ、基質の酸化が起こるかどうかを調べることによ り行うことができる。
上記の方法によって、クローンの培養菌体力 DNAを抽出することにより、 P450遺 伝子断片又は P450ハイブリッド遺伝子を得ることができる。
4. P450遺伝子単離用キット
本発明の P450遺伝子単離用キット（以下、「本キット」という）は、「3.カセット PCR法」 の項に記載のハイブリッド P450遺伝子を単離するためのものである。本キットは、少な くとも、「3.カセット PCR法」の項に記載のオリゴヌクレオチドと、 5-armフラグメント及び 3-armフラグメントを含むことを特徴として 、る。
(1)一段階目の核酸増幅反応用プライマー
「3.カセット PCR法」の項に記載したように、ノ、イブリツド P450遺伝子を増幅するため には、二段階の核酸増幅反応を行う必要がある。一段階目の核酸増幅用プライマー には、「（1) P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチドの作製」の項に記載のオリゴヌ クレオチドがフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使われる。具体的に は、配列番号 51記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列を含むォ リゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして使用し、配列番号 52記載のアミノ酸配 列の一部又は全部をコードする塩基配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド をリバースプライマーとして使用する。本キットは、これらのフォワードプライマー及び リバースプライマーを少なくとも一組含むことを特徴としている。これらのフォワードプ ライマー及びリバースプライマーは縮重プライマー (degenerated primer)であってもよ い。
本キットに含まれるプライマーにはアッセンブリー配列が付加されていてもよい。
(2) 5- armフラグメント及び 3- armフラグメント
本キットは、「3.カセット PCR法」の項に記載した 5-armフラグメント及び 3-armフラグ メントを含むことを特徴としている。 5-armフラグメントは、既知 P450遺伝子において、 少なくとも、開始コドン力も配列番号 51記載のアミノ酸配列をコードする領域までを含 む核酸断片である。また、 3-armフラグメントは、既知 P450遺伝子において、少なくと も、配列番号 52記載のアミノ酸配列をコードする領域から終始コドンまでを含む核酸 断片である。なお、「（1)一段階目の核酸増幅反応用プライマー」の項に記載したプ ライマーが、アッセンブリー配列を付加されているものである場合には、必ずしも配列 番号 51又は 52記載のアミノ酸配列をコードする領域を含んでいる必要はない。 5-ar mフラグメント及び 3-armフラグメントの基となる既知 P450遺伝子は、細菌由来のもの であればどのようなものでも構わな 、が、配列番号 51及び 52記載のアミノ酸配列を コードする塩基配列を含んで 、ることが好まし 、。 5-armフラグメント及び 3-armフラグ メントは、一本鎖 DNAであってもよいし、二本鎖 DNAであってもよい。
(3)その他の成分
本キットは、核酸増幅反応用のバッファー、 dNTP混合物、酵素類 (DNAポリメラーゼ 等)等を含んでいてもよい。また、二段階目の核酸増幅反応のために、 5-armフラグメ ントの開始コドンを含む領域に基づ 、て設計されたフォワードプライマーと、 3-armフ ラグメントの終始コドンを含む領域に基づいて設計されたリバースプライマーを含んで いてもよい。
5.新規 P450遺伝子
本発明の新規 P450遺伝子（以下、「本 P450遺伝子」）は、以下の（a)又は (b)のタン パク質をコードする遺伝子である。
(a)配列番号 1〜25又は配列番号 85のいずれかのアミノ酸配列力もなるタンパク質
(b)配列番号 1〜25又は配列番号 85のいずれかのアミノ酸配列において 1もしくは 数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ P450 として機能するタンパク質
配列番号 85以外の（a)のタンパク質は、「3.カセット PCR法」の「（3)ハイブリッド P4 50遺伝子の作製方法」の項に記載された方法により、環境サンプル力 抽出した DN Aを基に作製されたハイブリッド P450遺伝子が生産するタンパク質である。配列番号 8 5のタンパク質は、グラム陽性細菌であるノカルディア科 Hou_Blue株より単離された新 規の遺伝子 (配列番号 86)によりコードされるタンパク質である。（a)のタンパク質をコ ードする遺伝子の具体的な例としては、配列番号 26〜50又は配列番号 86の 、ずれ かの塩基配列で表される遺伝子が挙げられる
(b)のタンパク質は、（a)のタンパク質に、 P450としての機能を失わせない程度のァ ミノ酸変異が導入されたタンパク質である。このような変異は、自然界において生じる 変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位 特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982)などを挙げることがで きるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、モノォキシゲナー ゼ活性を失わせない限り、その個数は制限されないが、好ましくは 20アミノ酸以内で あり、更に好ましくは 10アミノ酸以内である。
なお、本 P450遺伝子は、「3.カセット PCR法」の「（3)ハイブリッド P450遺伝子の作 製方法」の項に記載された方法にぉ 、て、両末端を補う既知遺伝子として配列番号 57記載のアミノ酸配列をコードするアル力-ボラックス ·ボルクメンシス (Alcanivorax b orkumensis) SK2株からクローニングした CYP153A13a遣伝子を使用している。
本 P450遺伝子は、以下に述べる方法によって得ることができる。まず、環境サンプ ル抽出 DNAに由来する中央部の配列を公知の DNA合成法によって合成する。次に 、アル力-ボラックス 'ボルクメンシス SK2から抽出した DNAを铸型として、配列番号 54 及び 61記載の塩基配列で表されるプライマーのセット、又は配列番号 56及び 62記 載の塩基配列で表されるプライマーのセットを用いて核酸増幅反応を行!、、 5-armフ ラグメント及び 3-armフラグメントを増幅する。次に、合成した中央部の配列と 5-armフ ラグメント及び 3-armフラグメントをアニーリングさせて伸長反応を行う。その後、配列 番号 61及び 62記載の塩基配列で表されるプライマーのセットを用いて核酸増幅反 応を行うことにより、本 P450遺伝子を増幅することができる。増幅された本 P450遺伝 子は、ァガロースゲル電気泳動法等によって分画し、 1.4Kbp付近に分画されたバン ドを切り出すことにより得ることができる。
上記のような方法によって得られた DNA断片は、チェーンターミネータ一法やマキ サム ギルバート法等の公知の方法に従って塩基配列を決定することにより、本 P45 0遺伝子であることを確認することができる。
なお、本 P450遺伝子は、上述した方法だけでなぐ塩基配列情報に基づいて化学 合成すること〖こよっても取得できる。
6.新規 P450
本発明の新規 P450は、以下の（a)又は (b)で示されるタンパク質である。
(a)配列番号 1〜25又は配列番号 85のいずれかのアミノ酸配列力もなるタンパク質
(b)配列番号 1〜25又は配列番号 85のいずれかのアミノ酸配列において、 1若しく は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ P450と して機能するタンパク質
本発明の新規 P450は、「5.新規 P450遺伝子」の項で記載した本 P450遺伝子を含 む発現ベクターを適当な宿主細胞に導入し、培地で培養することによって得ることが できる。発現ベクターの作製及び宿主細胞への導入は、既に述べた通り、公知の方 法に従って行うことができる。力べして得られる本発明の新規 P450は、宿主の培養菌 体を破砕した後、通常の方法に従って、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分配 クロマトグラフィー、ゲルパーミネーシヨンクロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグ ラフィ一等の蛋白質精製、蛋白質製造の分野で汎用されている方法に従って精製を 行うことができる。これらのクロマトグラフィーにおける P450画分の選択は、 CO差スぺ タトルの有無を目安に行うことができる。
7. P450による酸化化合物の生産
本 P450は、触媒として使用することにより、酸ィ匕化合物を生産することが可能である (以下、「本生産法」という）。酸化化合物の生産方法としては、本 P450遺伝子を含む 発現ベクターを導入した宿主細胞によって生産する方法と精製した P450によって生 産する方法が挙げられる。
いずれの方法においても、 P450により酸化反応を触媒するには一般的に電子伝達 タンパク質の介在が必要となる。細菌の場合は、フェレドキシンとフェレドキシンレダク ターゼが電子伝達タンパク質として使われることが多 、。宿主細胞によって酸化化合 物を生産する場合は、電子伝達タンパク質をコードする遺伝子を共発現させるか、電 子伝達タンパク質と P450との融合タンパク質遺伝子として発現させることが望ましい が、宿主細胞に由来する電子伝達タンパク質を利用しても良い。精製した P450によ つて酸化化合物を生産する場合は、電子伝達タンパク質と、 NAD(P)Hを添加し P450 と共存させることが望ましい。
本生産法の基質となる化合物は、 P450の基質として反応可能な 、ずれの化合物で もよい。本生産法によれば、例えば、アルカンからアルコールを、さらにアルケンから エポキシドを生産することができる。
また、精製酵素を使用した場合の本生産法は、溶液中にて行うことができるほか、 精製した本 P450を適当な担体に固定ィ匕し、基質と接触させることによつても行うことが できる。本 P450を固定ィ匕できる担体は、特に限定されないが、例えば、ガラスビーズ、 シリカゲル等の無機担体、セルロース、キトサン、セファロース、デキストラン、ポリピ- ルアルコール、エチレン.酢酸ビュル共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポ リメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、架橋ポリビュルアルコール、架橋ポリアクリレー ト、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、架橋セルロース、架橋ァガロース、架橋 デキストラン等の有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる複合担体 等が挙げられる。また、担体表面には、 P450の固定ィ匕反応に用い得る官能基が存在 することが好都合である。これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミノ基、アル デヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、エポキシ基、アミド基、ハロゲ ン基、サクシ二ルイミド基、酸無水物基等が挙げられる。
上記担体への P450の固定ィ匕においては、蛋白質の立体障害を小さくすることにより 吸着効率を向上させ、さらには非特異的吸着を抑えるために、親水性スぺーサーを 介して固定ィ匕することが好ましい。親水性スぺーサ一としては、例えば、両末端を力 ルポキシル基、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等で置換した適当な有機分子を 用!/、ることができる。
8.新規融合型シトクロム P450モノォキシゲナーゼ
融合型 P450モノォキシゲナーゼが最近報告された（Roberts, G.A., et al, Identified tion of a new class of cytochrome P450 from a Rhodococcus sp. J. Bacteriol. 184: 38 98-3908, 2002) oこれはロドコッカス（Rhodococcus)属 NCIMB9784株より単離された P 450モノォキシゲナーゼ（「P450RhF」と命名された）であり、 P450本体タンパク質（ヘム ドメイン）、フラビンモノヌクレオチド (FMN)を補酵素として分子内に含有する NADH- P450還元酵素ドメイン (フ レドキシン還元酵素様配列）、鉄ィォゥタンパク質ドメイン (フェレドキシン様配列）が 1本のポリペプチドとして繋がったものである。
本発明の融合型シトクロム P450モノォキシゲナーゼは、この P450RhFに含まれる還 元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドを P450本体タンパク質の C末端側に、リ ンカ一部分を介して、付加してなるものである。
P450RhFに含まれる還元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドとしては、（a)配 列番号 70記載のアミノ酸配列力もなるペプチド、 (b)配列番号 70記載のアミノ酸配 列において 1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列 からなるペプチド、又は（c)配列番号 69記載の塩基配列からなる DNA又はそれと相 補的な DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAがコードするぺプチ ドなどを例示できる。
(a)のペプチドは、 P450RhFにおける還元酵素ドメイン (NADH- P450還元酵素ドメィ ンと鉄ィォゥタンパク質ドメインを含んだ領域)のペプチドである。
(b)のペプチドは、（a)のペプチドに、 (a)のペプチドの機能を失わせな!/、程度のァ ミノ酸変異が導入されたペプチドである。このような変異は、 自然界において生じる変 異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特 異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982)などを挙げることができ る力 これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、（a)のペプチドの機 能を失わせない限り、その個数は制限されないが、好ましくは 20アミノ酸以内であり、 更に好ましくは 10アミノ酸以内である。
(c)のペプチドは、 DNA同士のハイブリダィゼーシヨンを利用することにより得られる (a)のペプチドと同様の機能を持つペプチドである。 （c)のペプチドにおける「ストリン ジェントな条件」とは、特異的なハイブリダィゼーシヨンのみが起き、非特異的なハイ ブリダィゼーシヨンが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、「1 X SSC、 0 .1%SDS、 37°C」程度であり、好ましくは「0.5 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」程度であり、更 に好ましくは「0.2 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」程度である。ハイブリダィゼーシヨンにより 得られる DNAは、元の DNAと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、 60%以上 の相同性、好ましくは 75%以上の相同性、更に好ましくは 90%以上の相同性を指す リンカ一部分は、融合させる二つのタンパク質 (ペプチド)の機能を失わせな 、もの であればどのようなものでもよ 、が、 (d)配列番号 68記載のアミノ酸配列力 なるぺ プチド、（e)配列番号 68記載のアミノ酸配列において 1もしくは複数個のアミノ酸が付 カロ、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるペプチド、又は (f)配列番号 67記載 の塩基配列力もなる DNA又はそれと相補的な DNAとストリンジヱントな条件下でノヽィ ブリダィズする DNAがコードするペプチドであることが好ましい。
(d)のペプチドは、 P450RhFの P450本体部分と、還元酵素ドメインとの間に存在す るペプチドである。
(e)のペプチドは、（d)のペプチドに、リンカ一としての機能を失わせない程度のアミ ノ酸変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変 異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特 異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982)などを挙げることができ る力 これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、リンカ一としての機 能を失わせない限り、その個数は制限されないが、好ましくは 5アミノ酸以内であり、 更に好ましくは 3アミノ酸以内であり、最も好ましくは 1アミノ酸である。
(f)のペプチドは、 DNA同士のハイブリダィゼーシヨンを利用することにより得られる (d)のペプチドと同様の機能を持つペプチドである。 (f)のペプチドにおける「ストリン ジェントな条件」の意味は、（c)のペプチドの場合と同じである。
使用する P450本体タンパク質に特に制限はなぐたとえば、細菌のゲノム DNAライ ブラリーや環境より抽出した DNAなど力も PCR法等の通常の方法を用いて単離して きた DNAから生産されるタンパク質や既存の P450に対して PCRによる無作為変異導 入法や DNAシャフリング法などにより変異を導入した遺伝子やハイブリッド遺伝子な ど力も生産されるタンパク質を使用できる。 P450本体タンパク質は、細菌、植物、動物 のいずれに由来するものを使ってもよいが、特に細菌由来のものを使用するのが好 ましい。細菌由来の P450本体タンパク質としては、ァシネトバクタ一'カルコアセッカ ム由来の P450本体タンパク質を例示できる。また、 P450本体タンパク質としては、「6. 新規 P450」の項に記載のタンパク質を使用してもよい。
9.融合型 P450モノォキシゲナーゼによる酸ィ匕化合物の生産
「8.新規融合型 P450モノォキシゲナーゼ」の項に記載したタンパク質は、触媒とし て使用することにより酸ィ匕化合物を生産することが可能である。酸化化合物の生産方 法としては、本融合型 P450モノォキシゲナーゼ遺伝子を含む発現ベクターを導入し た宿主細胞によって生産する方法と精製した本融合型 P450モノォキシゲナーゼによ つて生産する方法が挙げられる。
V、ずれの方法にぉ 、ても、本融合型 P450モノォキシゲナーゼはそれ自身の中に電 子伝達タンパク質を有しているので、フェレドキシンやフェレドキシン還元酵素（レダク ターゼ）といった電子伝達タンパク質の介在を必要としない。したがって、宿主細胞に よって酸化化合物を生産する場合は、電子伝達タンパク質をコードする遺伝子を共 発現させる必要はない。また、精製した本融合型 P450モノォキシゲナーゼによって酸 化化合物を生産する場合は、新たに電子伝達タンパク質を共存させる必要は無 ヽ。 なお、この融合型 P450モノォキシゲナーゼを精製する場合は、「7. P450による酸ィ匕 化合物の生産」の項に記載した方法と同様の方法により行うことができる。
本生産法の基質となる有機化合物は、 P450の基質として反応可能な 、ずれの化合 物でもよい。本生産法によれば、例えば、アルカン (直鎖状炭化水素）、アルケン (不 飽和結合を含む直鎖状炭化水素)、環状炭化水素、及び、分子内に芳香環を含む アルカンやアルケンなどの有機化合物を基質として、末端メチル基の水酸化体や末 端ォレフインのエポキシ体等の酸ィ匕化合物を生産することができる。具体的には、 n- へキサン、 n-ヘプタン、 n-オクタン、 n-デカン、 1-オタテン、シクロへキサン、 n-ブチル ベンゼン、 4-フエニル- 1-ブテン、又は 2-n-ブチルベンゾフランからそれぞれ 1-へキ サノール、 1-ヘプタノール、 1-ォクタノール、 1-デカノール、 1,2-エポキシオクタン、シ クロへキサノール、 4-フエニル- 1-ブタノール、 2-フエネチルォキシラン、又は 4-ベン ゾフラン- 2-ィル-ブタン- 1-オールを生産することができる。
実施例
以下、実施例により本発明について具体的に説明する。もっとも、本発明はこれに より限定されるものではない。
〔実施例 1〕環境由来 DNAの調製
多様な環境由来の DNAから P450遺伝子を獲得するため以下の環境由来サンプル 力 DNAを抽出した。
1.ポナぺ 'パラオ海域サンプル
培地を含浸させた担体を海水中に設置し、担体に付着した微生物由来の DNAを効 率よく回収する手法が考案されている（特開 2003-334064号公報)。今回、 NSW培地（ 0.1% NH NO、 0.002%クェン酸第二鉄、 0.002% K HPO、 0.05%酵母抽出液、 80%
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濾過海水、 1.5% 寒天）に滅菌済みの人工スポンジを入れ、培地を含ませた後、培地 中の寒天を凝固させた人工スポンジを作製し、この人工スポンジをミクロネシア連邦 共和国ポナぺ州沿岸、パラオ共和国沿岸の海底 5〜6 mの位置に設置した。設置し た人工スポンジは 3日後に引き上げて、微生物が付着した人工スポンジの小片を凍 結後粉砕し、人工スポンジに付着した微生物カゝら Dneasy Plant Kit (キアゲン社製)を 用いて DNAを回収した。
2.淡水サンプル
岩手県久慈巿石油備蓄基地から地下水、また、北海道天塩郡豊富温泉から温泉 水を回収し、フィルター（GV type: 0.22 μ m、 47 mm、ミリポア社製）により水中の微 生物を選択的に濃縮した。微生物を濃縮したフィルター 1枚に対して 5 mlの 10 mM Tr is-HClバッファー (pH 8.0: 1 mM EDTA, 0.35 M sucrose)と 10 mg/mlのプロティナ一 ゼ K (10 mM Tris- HC1に溶解) 200 μ 1を加え、 37°Cで 30分間インキュベートした。イン キュベート後、激しく攪拌し細菌を懸濁させた。沈殿を除いた後に lysing solution (10 0 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0: 0.3 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% sodium dodecyl sulfat e) 7.5 mlをカ卩ぇ激しく攪拌した。さらに、 10 mlのフエノール、クロロフオルム、イソミル アルコール 50 : 4 9 : 1の溶液を加えた。 5分後、遠心分離（5000 rpm, 15 min)を行 い、上層を回収した。次に、 2倍量の 99%エタノールを添加し攪拌後、—80°Cで 2時 間冷却した。その後、遠心分離（15000 rpm, 15 min)により DNAを沈殿させ、冷却 70 %エタノールをカ卩えて、さらに遠心分離（15000 rpm, 15 min)を行い沈殿画分として DNAを回収した。
3.土壌サンプノレ
新潟県西山町の原油採掘井戸の油汚染土壌 5 gに対して 5 mlの 10 mM Tris-HCl バッファー (pH 8.0: 1 mM EDTA, 0.35 M sucrose)と 10 mg/mlのプロティナーゼ K (1 0 mM Tris- HC1に溶解) 200 μ 1を加え、 37°Cで 30分間インキュベートした。インキュべ ート後、激しく攪拌し細菌を懸濁させた。沈殿を除いた後に lysing solution (100 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0: 0.3 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% sodium dodecyl sulfate) 7.5 mlをカ卩ぇ激しく攪拌した。さらに、 10 mlのフエノール、クロロフオルム、イソミルアルコ ール 50 : 4 9 : 1の溶液をカ卩えた。 5分後、遠心分離（5000 rpm, 15 min)を行い、上 層を回収した。次に、 2倍量の 99%エタノールを添加し攪拌後、 80°Cで 2時間冷却 した。その後、遠心分離（15000 rpm, 15 min)により DNAを沈殿させ、冷却 70%ェタノ ールをカ卩えて、さらに遠心分離（15000 rpm, 15 min)を行い沈殿画分として DNAを回 収した。
〔実施例 2〕 PCRプライマーの設計
本発明者は、報告されている P450スーパーファミリーの CYP153Aサブファミリーに 属するもの 3つ、すなわち、 CYP153A1 (accession no. AJ311718)、 CYP153A2 (acces sion no. AE005680)、 CYP153A13a (配列番号 58)のアミノ酸配列をァライメントした 際に、 2ケ所の保存領域、すなわち、 MFIAMDPP(N末側）、 HRCMGNRL (C末側）が あることを見出した。そこで、この 2つの保存領域のアミノ酸配列（MFIAMDPP、 HRC MGNRL)に基づいて 4種類のプライマーを設計した。設計したプライマーは、保存ァ ミノ酸配列 MFIAMDPP側（N末側）（配列番号 51)として 5 ' - ATGTTYATHGCNATG GAYCCNC- 3，（配列番号 53)とその相補鎖である 5， -GNGGRTCCATNGCDATRAA CAT-3 ' (配列番号 54)であり、保存アミノ酸配列 HRCMGNRL側（C末側）（配列番号 52)として 5，- NARNCKRTTNCCCATRCANCKRTG-3 ' (配列番号 55)とその相補 鎖である 5 ' - CAYMGNTGYATGGGNAAYMGNYT-3 ' (配列番号 56)であった。プラ イマ一配列中、 Yは Cまたは T、 Ηは A、 Cまたは Τ、 Νは A、 T、 G、または C、 Rは Aまた は G、 Dは A、 Gまたは T、 Kは Gまたは T、 Μは Αまたは Cである。
〔実施例 3〕 P450遺伝子の増幅
実施例 1で調製した DNAを铸型とし、実施例 2で設計したプライマーを用いて PCR 法による増幅反応を行った。プライマーの組み合わせは配列番号 53のプライマーに 対して配列番号 55のプライマーである。反応液は DNAポリメラーゼ Amplitaq Gold (ァ プライドバイオシステムズ社製） 0.5 unit、添付ポリメラーゼ用緩衝液 5 μ 2 τηΜ dN TPを 5 μ 1、 50 pmol/ μ 1の両プライマー各 4 μ 1、各環境サンプルより調製した DNAを 100 ng添加し、最後に滅菌水で調整し合計 50 1とした。反応は 94°C、 10分間の熱 変性後、 94°Cで 30秒、 58°Cで 45秒、 72°Cで 1分を 1サイクルとし、これを 35サイクル行 い、最後に 72°Cで 10分間反応させた。増幅の確認は 1.5%ァガロースゲル電気泳動 で行った。想定される長さ（約 0.85 Kbp)の DNAをァガロースから切り出し、 QIAquick Gel Extraction kit (キアゲン社製)により精製した。
〔実施例 4〕アル力-ボラックス ·ボルクメンシス SK2株からの P450遺伝子の単離 本発明者は、アルカン資化性の海洋細菌アル力-ボラックス ·ボルクメンシス (Alcan ivorax borkumensis) SK2株（DSM 11573株）から CYP153A13a (配列番号 58)を含む D NA断片を以下のようにして単離した。
最初に、長鎖の ITアルカン資化細菌であるァシネトパクター 'カルコァセッカス ( netobacter calcoaceticus) EB104株の P450モノォキシゲナーゼの配列 CYP153A1 (ac cession no. AJ311718)をもとに 2本のプライマー配列、配列番号 59 (5し GCCGATGG AGTTTATGGGCAAT-3')と配列番号 60 (5'- GTACCACATCACCACCTTGTCGC C-3')を設計し、アル力-ボラックス ·ボルクメンシス SK2株より抽出したゲノム DNAをテ ンプレートに PCR法で増幅した。 PCR Optimizer kit (インビトロゲン社製)により 16種類 のバッファーを用い、 94°Cで 1分、 55°Cで 2分、 72°Cで 3分の条件で 40サイクルの増幅 を行った。また、増幅の確認は 2%のァガロース電気泳動を行った。その結果、 P450遺 伝子断片 (約 250 bp)の増幅が確認された。そこで、増幅した P450遺伝子断片をプロ ーブとしてハイブリダィゼーシヨンによる P450モノォキシナーゼ遺伝子のクロー-ング を行った。最初に、アル力-ボラックス 'ボルクメンシス由来ゲノム DNAを制限酵素 2mi 3AIで部分分解し、コスミドベクター SuperCos 1の BamHIサイトに連結し、 LAMBDA I NN (和光純薬社製)を用いてファージ粒子にパッケージングした。そして、大腸菌 XL 1-Blue MR株に、そのファージを感染させ、抗生物質アンピシリンに耐性のコロニー をピックアップし、コスミドライブラリーを作製した。次に、 AlkPhos Direct Labelling and
Detection System (アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、添付のプロトコールに 従って、コロニーハイブリダィゼーシヨンを行った。標識されたポジティブクローンを回 収し AlkPhos Direct Labelling and Detection System (アマシャムバイオサイエンス社 製）を用い、添付のプロトコールに従って、サザンノ、イブリダィゼーシヨンを行った結 果、 P450モノォキシゲナーゼ遺伝子断片にノ、イブリダィズするバンドが検出された。 そこで、得られたクローンの DNA配列の解析を行った結果、 CYP153ファミリーに属す る P450モノォキシゲナーゼ遺伝子（CYP153A13a: DNA配列を配列番号 58、アミノ酸 配列を配列番号 57に示す。 )全長のクローニングが確認された。
〔実施例 5〕ハイブリッド遺伝子の作製
アル力-ボラックス .ボルクメンシス (Alcanivorax borkumensis) SK2株よりクローニン グした CYP153A13a遺伝子 (配列番号 58)から、開始コドンを含み、保存領域 (ァミノ 酸配列 MFIAMDPP)をコードする部位までの DNAフラグメント（以下「5- arm」とする）と 第 2の保存領域 (アミノ酸配列 HRCMGNRL)をコードする部位力 終始コドンまでの D NAフラグメント（以下「3- arm」 )を PCRによって増幅した。 5-armにつ!/、ては次の通り P CRを行った。反応液は DNAポリメラーゼ Amplitaq Gold (アプライドバイオシステムズ 社製） 0.5 unit,添付ポリメラーゼ用緩衝液 5 μ 1、 2mM dNTPを 5 μ 1、 50 pmol/ μ 1の 配列番号 61 (5 ' -CACCATGTCAACGAGTTCAAGTA-3 ' )と配列番号 54のプライ マー各 4 μ 1を CYP153A13a遺伝子がクロー-ングされたコスミドベクターを 100 ng添 加し、最後に滅菌水で調製し合計 50 1とした。反応は 94°C、 10分間の熱変性後、 94 °Cで 30秒、 58°Cで 45秒、 72°Cで 1分を 1サイクルとし、これを 30サイクル行い、最後に 7 2°C10分間反応させた。増幅の確認は 1.5%ァガロースゲル電気泳動で行った。 3-ar mフラグメントについては、上記配列番号 61と 54の代わりに配列番号 62 (5， -TGATT ATTTTTTAGCCGTCAACT- 3，）のプライマーと配列番号 56のプライマーを用いた。 増幅の確認は 1.5%ァガロースゲル電気泳動で行つた。想定される長さの DNAをァガ ロースから切り出し、 QIAquick Gel Extraction kit (キアゲン社製)により精製した。続 いて、実施例 3で得られた環境サンプル力 調製した DNAを基にした PCR産物、およ び 5-armと 3-armフラグメントから PCRによりハイブリッド遺伝子を作製した。反応液は D NAポリメラーゼ Amplitaq Gold (アプライドバイオシステムズ社製） 0.5unit、添付ポリメラ ーゼ用緩衝液 5 μ 1、 2mM dNTPを 5 μ 1、 50pmol/ μ 1の配列番号 61と 62のプライマ 一各 4 μ 1、実施例 3で得られた環境サンプルカゝら調製した DNAを基にした PCR産物 を 20 ng、 5-armフラグメント、 3-armフラグメントを 5 ng添カ卩し、最後に滅菌水で調製し 合計 50 1とした。反応は 94°C、 10分間の熱変性後、 94°Cで 30秒、 58°Cで 45秒、 72°C で 1分を 1サイクルとし、これを 30サイクル行い、最後に 72°C10分間反応させた。増幅 の確認は 1.5%ァガロースゲル電気泳動で行った。想定される長さ (約 1.4 Kbp)の DNA をァガロースから切り出し、 QIAquick Gel Extraction kit (キアゲン社製)により精製し た。精製したハイブリッド遺伝子は GATEWAYシステム pENTR Directional TOPO Clo ning Kits (インビトロゲン社製）を用いてシーケンス用ベクター（pENTR/SD/D- TOPO ) (インビトロゲン社製)へクローユングした。
〔実施例 6〕 DNA配列の解析
実施例 5で得られたハイブリッド遺伝子の挿入されたプラスミドベクターを大腸菌（0 ne Shot TOP10 Chemically Competent E. coHインビトロゲン社製）に开質転換し、形 質転換された大腸菌のコロニーをランダムに選抜し、 LB液体培地 (1%トリプトン、 0.5% イーストイクストラタト、 0.5% NaCl)に植え付け、プラスミドを QIAprep Spin Miniprep Kit
(キアゲン社製)で抽出した。次に、シーケンス反応をチェーンターミネータ一法に Dve Terminatorし ycle Sequencing Fb Ready Reaction Kit (7ノフイドサイ エンス社製）を用いて行い、反応生成物の塩基配列を ABI prism 3730 DNA Analyzer アプライドサイエンス社製）により解析することにより決定した。次に、得られた遺伝子 配列の中から、推定されるアミノ酸配列の C末端から 50〜60残基手前に FXXGXR/H XCXGと!、う P450の共通配列が存在するものを選択した。同一な配列を除 、たハイ ブリツド遺伝子のアミノ酸配列を配列番号 1から 25、塩基配列を配列番号 26から 50 に示す。
〔実施例 7〕配列解析
実施例 6で決定したノ、イブリツドィ匕 P450のアミノ酸配列（配列番号 1から 25)と既知 の P450のアミノ酸配列中の保存領域間（配列番号 51と 52)のアミノ酸配列を比較し た。配列比較はァライメントソフト Clustal W(Higgins, D. G.， Thompson, J. D.， and Gi bson, T. J., Methods Enzymol. 266, 383-402, 1996)を用いて行った。既知の P450の 配列は NCBIの Blast検索（http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/)を行うことにより得た。配列 比較の結果を図 1には系統樹として示し、既知の CYP153Aサブファミリー 4種との相 同性を表 1に示した。図 1と表 1の通り配列番号 1から 25のアミノ酸配列中の保存領 域間のアミノ酸配列は既知の P450のアミノ酸配列中の保存領域間の配列と異なる新 規なものであることが示された。さら〖こ、表 1に示したように、ボナべ、ノラオ海域、久 慈地下水、北海道温泉水、新潟石油汚染土壌といった多様な環境サンプル力ゝら抽 出した微生物由来の DNAを铸型として PCRを行うことにより新規の P450遺伝子を獲得 できることが示された。
[表 1]
相同性 （％)
配列番号 CYP153A13a CYP153A1 CYP153A2 CYP153A3 銬型 DNAの由来
1 65 67 55 49 新潟土壌
2 79 71 57 51 新潟土壌
3 79 70 57 51 新潟土壌
4 87 73 56 49 ポナぺ海域
5 88 74 57 50 ポナぺ海域
6 72 79 59 52 ポナぺ海域
7 72 79 57 51 ポナぺ海域
8 72 70 57 49 パラオ海域
9 73 75 58 51 新潟土壌
10 71 73 56 51 新潟土壌
11 71 73 56 50 新潟土壌
12 53 56 75 66 新潟土壌
13 55 54 69 66 久慈地下水
14 52 55 71 64 新潟土壌
15 52 52 66 64 パラオ海域
16 54 57 72 65 久慈地下水
17 56 57 69 63 久慈地下水
18 55 57 70 64 久慈地下水
19 55 57 69 63 パラオ海域
20 54 57 70 63 久慈地下水
21 55 57 70 63 久慈地下水
22 57 58 67 57 北海道温泉水
23 52 55 68 59 新潟土壌
24 53 56 70 62 新潟土壌
25 54 57 71 63 久慈地下水
〔実施例 8〕ハイブリッド遺伝子の発現
実施例 7で新規な配列であることが示されたハイブリッド遺伝子の 3種類を大腸菌に より発現させ、その機能性を確認した。 3種類 (配列番号 4、 5、 9)の P450をコードする 遺伝子を、 GATEWAYシステム LR Clonase反応を用いることで、タンパク質発現用プ ラスミドベクター (PDEST14インビトロゲン社製)に挿入し、これを大腸菌 DH5 α株 (イン ビトロゲン社製）に形質転換し、 LB液体培地に植え付け、プラスミドを QIAprep Spin M iniprep Kit (キアゲン社製)で抽出した。次に、得られたプラスミドを大腸菌 BL21-AI 株 (インビトロゲン社製）に形質転換し、終濃度 50 μ § / mlのアンピシリン (和光純薬 社製）が添加された 5mlの LB液体培地に植え付け、一晩培養したのち、得られた培 養液 1 mlを終濃度 50 μ § / mlのアンピシリンが添加された 100 mlの LB液体培地に植 え継ぎ、 37°Cで培養し対数増殖期に達した時点で 1 mM 5-アミノレブリン酸塩酸塩（ 和光純薬社製）、 0.5 mM FeClを添加し、 25°Cで 30分間培養後、 0.2%ァラビノース（
3
和光純薬社製)を添加し引き続き培養した。（25°C16時間)培養終了後、遠心分離機 により集菌し、 20%グリセロール（和光純薬社製）を含む PBS (phosphate-buffered sali ne; 137 mM NaCl, 10 mM Na HPO and 2.68 mM KC1)にけん濁し、超音波破砕機
2 4
により菌体を破砕し遠心分離により得られた上清を粗抽出液とした。配列番号 4をコ ードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターを含む大腸菌カゝら得られた粗抽出液を 粗抽出液 A、配列番号 5をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターを含む大腸 菌から得られた粗抽出液を粗抽出液 B、配列番号 9をコードする遺伝子を挿入したプ ラスミドベクターを含む大腸菌力 得られた粗抽出液を粗抽出液 Cとした。
〔実施例 9〕 CO差スペクトル分析による機能解析
P450は亜ニチオン酸ナトリウム (Na S 0 )で処理し、一酸化炭素を通気すると吸収
2 2 4
スペクトルが変化し 450 nmに極大をもつ差スペクトルが現れることが知られている。そ こで、実施例 8で得られた粗抽出液 A、粗抽出液 Bおよび粗抽出液 C 1 mlに対して一 酸ィ匕炭素を 1秒当たり数泡程度の速さで 1分間通気を行った後、亜ニチオン酸ナトリ ゥムを 2 mg加え混合し、 5分間放置した後、吸光スペクトルを測定し、処理前の粗抽 出液との間でスペクトルの比較を行った。図 2に示したように粗抽出液 A、 B、 C共に還 元条件下で一酸化炭素通気処理による 450 nmの吸光度の上昇が観察された。した がって、抽出液 A、 B、 Cがいずれにおいても可溶性で機能的な P450の発現が確認さ れたことになり、 3種類 (配列番号 4、 5、 9)のアミノ酸配列が P450として機能するタン パク質であることが示された。
〔実施例 10〕シユードモナス ·プチダ由来のプチダレドキシンとプチダレドキシンレダク ターゼの単離
一般的な微生物由来の P450と同様に、今回得られた新規 P450が酸化反応を触媒 するためには電子伝達タンパク質としてフェレドキシンレダクターゼ（ferredoxin reduc tase)とフェレドキシン (ferredoxin)の介在が必要であると考えられる。そこで、シユード モナス ·プチダ (Pseudomonas putida)由来のプチダレドキシン（putidaredoxin)とプチ ダレドキシンレダクターゼ（putidaredoxin reductase)を電子伝達タンパク質として活用 することを考案し、それぞれの遺伝子のクローユングを行った。
プチダレドキシンにおいては、プチダレドキシンをコードする遺伝子（accession no. D00528)より制限酵素サイトを付カ卩したプライマー（5，- CGTCTCCCATGTCTAAAG TAGTGTATGTGT-3 ' |£^ ^"63 、 5， - CGTCTCATCGATTACCATTGCCTATC GGGA-3'配列番号 64)を設計し、シユードモナス 'プチダ由来のゲノム DNAを铸型 として PCR法で増幅した。反応液は DNAポリメラーゼ Amplitaq Gold (アプライドバイオ システムズ社製） 0.5 unit,添付ポリメラーゼ用緩衝液 5 1、 2 mM dNTPを 5 μ 1、 50 pmol/ 1の両プライマー各 4 μ 1、調製した DNAを 100 ng添カ卩し、最後に滅菌水で調 整し合計 50 μ 1とした。反応は 94°C、 10 minの熱変性後、 94°Cで 30秒、 58°Cで 45秒、 72°Cで 1分を 1サイクルとし、これを 30サイクル行い、最後に 72°Cで 10分間反応させた 。増幅の確認は 1.5%ァガロースゲル電気泳動で行った。想定される長さの DNAをァ ガロースから切り出し、 QIAquick Gel Extraction kit (キアゲン社製)により精製した。 プチダレドキシンレダクターゼにお 、ては、プチダレドキシンレダクターゼをコードす る遺伝子（accession no. D00528 )より制限酵素サイトを付カ卩したプライマー（5，-CGT CTCCCATGAACGCAAACGACAACGTGG- 3，配列番号 65 、 5， - CGTCTCATCG ATCAGGCACTACTCAGTTCA- 3，配列番号 66)を設計し、シユードモナス'プチダ 由来のゲノム DNAを铸型として PCR法で増幅した。反応液は DNAポリメラーゼ Amplita q Gold (アプライドバイォシステムズ社製) 0.5 unit,添付ポリメラーゼ用緩衝液 5 1、 2 mM dNTPを 5 μ 1、 50 pmol/ μ 1の両プライマー各 4 μ 1、調製した DNAを 100 ng添カロ し、最後に滅菌水で調整し合計 50 1とした。反応は 94°C、 10 minの熱変性後、 94°C で 30秒、 58°Cで 45秒、 72°Cで 1分を 1サイクルとし、これを 30サイクル行い、最後に 72 °Cで 10分間反応させた。増幅の確認は 1.5%ァガロースゲル電気泳動で行った。想 定される長さの DNAをァガロースから切り出し、 QIAquick Gel Extraction kit (キアゲ ン社製)により精製した。
次に、 PCRによって単離したプチダレドキシンとプチダレドキシンレダクタ一ゼをコ一 ドする遺伝子全長を制限酵素 SMlBIで処理した。次いで、タンパク質発現用ベクター pET-28a (ノバジェン社製)も制限酵素 lおよび felで処理した。これらをライゲー シヨン (Ligation High,東洋紡社製)後、大腸菌 JM109株 (宝酒造社製）に形質転換し 、 LB液体培地に植え付け、プラスミドを QIAprep Spin Miniprep Kit (キアゲン社製） で抽出した。
〔実施例 11〕基質の酸化活性の観察
実施例 9において可溶性で機能的なタンパク質発現が確認された新規な P450であ る 3種類 (配列番号 4、 5、 9)の、基質に対する酸素添加活性を確認した。
実施例 10において単離したシユードモナス'プチダ由来プチダレドキシンの挿入し たタンパク質発現用ベクターは大腸菌 Rosseta DE3株 (ノバジェン社製）に形質転換 し、シユードモナス ·プチダ由来プチダレドキシンレダクタ一ゼの揷入したタンパク質 発現用ベクターは大腸菌 BL21 DE3 pLysS株 (ノバジヱン社製）に形質転換し、それ ぞれを 5mlの LB液体培地に植え付け、ー晚培養した。次に、得られた培養液 1 mlを、 プチダレドキシンの挿入したタンパク質発現用ベクターを形質転換した菌株において は終濃度 25 g / mlのカナマイシンが添加された 100 mlの TB液体培地 (1.2%トリプト ン、 2.4%イーストイクストラタト、 0.4%グリセロール、 0.231% KH PO
2 4、 1.254% K HPO )
2 4 に、プチダレドキシンレダクターゼの挿入したタンパク質発現用ベクターを形質転換 した菌株においては終濃度 50 g / mlのクロラムフエ-コールと終濃度 25 β g / m\ のカナマイシンが添加された 100 mlの TB液体培地にそれぞれ植え次いだ。それぞれ の培養液を 37°Cで培養し対数増殖期に達した時点で Isopropy卜 β -D- thiogalactopyr anoside (IPTG)を終濃度 0.5 mMになるように添カ卩し引き続き培養した。（30°C16時間） 培養終了後、遠心分離機により集菌し、 20%グリセロールを含む PBSにけん濁し、超 音波破砕機により菌体を破砕し遠心分離により得られた上清を粗抽出液とした。それ ぞれの粗抽出液と新規な P450である 3種類 (配列番号 4、 5、 9)を発現させた粗抽出 液を等量ずつ混合し粗酵素液とした。配列番号 4の P450と 2種の電子伝達タンパク質 の粗抽出液で構成される粗酵素液を粗酵素液 A、配列番号 5の P450と 2種の電子伝 達タンパク質の粗抽出液で構成される粗酵素液を粗酵素液 B、配列番号 9の P450と 2 種の電子伝達タンパク質の粗抽出液で構成される粗酵素液を粗酵素液 C、 2種の電 子伝達タンパク質の粗抽出液のみで構成される粗酵素液を粗酵素液 Dとし酵素反応 に使用した。酵素反応は、それぞれの酵素反応液に終濃度 1 mMになるように基質を 添加した後、 25°C10分間放置し、終濃度 5 mMになるように NADPを添加して酵素反 応を開始した。なお、基質としては、オクタン、デカン、 1-デセンを使用した。 25°C12 時間の反応の後、終濃度 0.2 Nになるように塩酸を添加し、酵素反応を停止した。次 に、酵素反応後の粗酵素液に酢酸ェチルを添加し、ガスクロマトグラフィー質量分析 計 (GCMS-QP5050A島津製作所社製)により粗酵素液の酢酸ェチル抽出画分の成 分分析を行うことで、各基質の酸化物の有無を観察した。
最初に、粗酵素液 B、 Dによるオクタン、 1-デセンを基質とした酵素反応の後、反応 液力 酢酸ェチルにより抽出した画分の分析結果を図 3に示す。オクタンを基質とし た場合、粗酵素液 Bから抽出した画分ではオクタンの酸ィ匕物である 1-ォクタノール及 びオクタン酸が検出された。一方、 P450が含まれていない粗酵素液 Dにおいてはオタ タンの酸ィ匕物は検出されな力つた。また 1-デセンを基質とした場合、粗酵素液 Bから 抽出した画分ではオクタンの酸ィ匕物である 1,2-エポキシデカン及び 1,2-デカンジォ ールが検出された。一方、 P450が含まれていない粗酵素液 Dにおいては 1-デセンの 酸ィ匕物は検出されなカゝつた。したがって、粗酵素液 Bに含まれる今回獲得された新規 な P450 (配列番号 5)がオクタンや 1-デセンと 、つた有機化合物の酸化反応を触媒す る活性を有することが明らかとなった。
次にオクタン、デカン、 1-デセンを基質として反応を行った後の粗酵素液 A、 B、 C および Dを分析した結果、検出した基質の酸化物を表 2に示す。
[表 2] 基質 粗酵素液 A 粗酵素液 B 粗酵素液 C 粗酵素液 D オクタン 1-ォクタノール 卜ォク夕ノール オクタン酸 未検出
オクタン酸 オクタン酸
デカン 未検出 デカン酸 未検出 未検出
1-デセン 未検出 1， 2-エポキシデカン N恢 Hi 未検出
1, 2-デカンジオール 粗酵素液 A、 B、 Cから抽出した画分ではオクタンの酸ィ匕物が検出され、各粗酵素液 に含まれる新規な P450の 3種類 (配列番号 4、 5、 9)がすべて酸素添加活性を保持し ていることが示された。また獲得した新規の P450の中にはオクタン、デカンといった鎖 長の異なるアルカンの酸化反応や、エポキシ化反応を触媒する反応を有するものが 存在していることが明ら力となった。
〔実施例 12〕 RhF還元酵素ドメインを有する融合タンパク質生産用プラスミドの構築 獲得した P450ハイブリッド遺伝子の種々の基質に対する酸化能を、大腸菌を宿主と した生変換反応により簡便に観察できるように、 P450と電子伝達タンパク質 (還元酵 素ドメイン）との融合タンパク作製用発現プラスミドの構築を行った。
P450本体タンパク質部分 (ヘムドメイン）と還元酵素ドメインが融合して 1本のポリべ プチド鎖として存在する融合型 P450モノォキシゲナーゼ（P450RhF)遺伝子がロドコッ カス属細菌 NCIMB9784株から単離されている (非特許文献 8)。そこで、ロドコッカス (β hdococcus sp.) NCIMB9784株由来 P450RhFのリンカ一配列（塩基配列を配列番号 6 7、アミノ酸配列を配列番号 68に示す。）とそれに続く還元酵素ドメイン (塩基配列を 配列番号 69、アミノ酸配列を配列番号 70に示す。 )をコードする遺伝子を含む DNA 断片 1.0 kbを、ゲノム DNAから制限酵素部位を付カ卩したプライマー（5'- GGGAATTC gtgctgcaccgccatcaaccg- 3 ,、 歹 U番 71)と (5 - gggagctctcagaggcgcagggccaggcg - 3'、配列番号 72)を用いて PCRにより増幅した。得られた 1.0 kbの DNA断片は、 EcoRI と Sasiで切断後、大腸菌ベクター pET2ia (ノバジェン社）の EmRi-Sasi部位に挿入し た。以下、このプラスミドを pREDと呼ぶ。 pREDのマップは図 4に示されている。
〔実施例 13〕 ノ、イブリツド P450と RhF還元酵素ドメインとの人工融合酵素化 獲得した P450ハイブリッド遺伝子の種々の基質に対する酸化能を、大腸菌を宿主と した生変換反応により観察するべぐ融合タンパク質生産用プラスミドベクター pRED に P450ハイブリット遺伝子を挿入することで、ハイブリッド P450の人工融合酵素化を 行った。本融合タンパク質は、ハイブリッド P450がリンカ一部分を介して RhF還元酵素 ドメインと繋がった構造になるようにデザインされて 、る。
制限酵素部位を付カ卩したプライマー（5，- CACTAGTCatatgTCAACGAGTTCAAG TACA -3，配列番号 73 、 5， - CAGCACCaattGTTTTTTAGCCGTCAACTT -3，配 列番号 74)を設計し、実施例 5で作製した 5種類 (配列番号 3, 5, 7, 9, 11)の新規 P 450をコードする遺伝子の挿入されたシーケンス用ベクターを铸型として PCR法で増 幅した。尚、増幅した各 P450遺伝子断片の終止コドンは削除してある。得られた 1.4 k bの DNA断片は、制限酵素 Mdglと Mfelで切断してプラスミド PREDの Ndgl-EmRl部位 に挿入した。配列番号 3をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターを pH3RED 、配列番号 5をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターを pH5RED、配列番号 7 をコードする遺伝子を挿入したプラスミドベクターを pH7RED、配列番号 9をコードする 遺伝子を挿入したプラスミドベクターを pH9RED、配列番号 11をコードする遺伝子を 挿入したプラスミドベクターを pHllREDとする。また、アル力-ボラックス ·ボルクメンシ ス SK2株よりクローユングした CYP153A13a遺伝子を挿入したプラスミドベクター pAlkR EDも作製した。
〔実施例 14〕 融合型 P450モノォキシゲナーゼによるアルカン (直鎖状炭化水素）の 変換試験
プラスミドベクター pH3RED、 pH5RED、 pH7RED、 pH9RED、 pHllRED、及び pAlkR EDをそれぞれ大腸菌 BL21-AI株に形質転換し、終濃度 50 g / mlのアンピシリンが 添加された 5mlの LB液体培地に植え付け、ー晚培養したのち、得られた培養液 1 ml を終濃度 50 g / mlのアンピシリンが添加された 100 mlの LB液体培地に植え継ぎ、 30°Cで培養し対数増殖期に達した時点で 1 mM 5-アミノレブリン酸塩酸塩、 0.5 mM FeClを添カ卩し、 20°Cで 30分間培養後、 0.2%ァラビノースを添カ卩し引き続き培養した。
3
(20°C16時間)培養終了後、遠心分離機により集菌し、 100 mMリン酸バッファー (pH = 7.5) 10 mlに懸濁した。 pH3RED発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液 H3、 pH5RE D発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液 H5 、 pH7RED発現菌株を含む菌懸濁液を菌 懸濁液 H7、 pH9RED発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液 H9、 pHllRED発現菌株 を含む菌懸濁液を菌懸濁液 HI 1、 pAlkRED発現菌株を含む菌懸濁液を菌懸濁液 A1 kとした。
次に、各菌懸濁液 1 mlに基質を 0.25 ml添カ卩し、 20°Cで 24時間反応を行った。尚、 基質としては、 n-へキサン、 n-ヘプタン、 n-オクタン、及び ITデカンを使用した。終濃 度 0.2 Nになるように塩酸を添カ卩し、反応を停止した後、へキサンを 0.25 ml添カ卩し、ガ スクロマトグラフィー質量分析計によりへキサン抽出画分の成分分析を行うことで、各 基質が酸化され生じた産物の同定と定量を行った。各菌懸濁液による酸化反応によ つて生成した酸ィ匕物の量 (濃度)を表 3に示す。
[表 3]
(基質）
菌懸濁液 Al k 菌懸躅液 H3 菌懸濁液 H5 菌懸濁液 H7 菌懸濁液 H9 菌懸濁液 HI 1 酸化物
(H-へキサン）
71 ± 14 ppm 148±8 ppm 187± 1 1 ppm 232 ± 26 ppm 559± 66 ppm 48± 2 ppm 卜へキサノール
(旦-ヘプタン）
269± 109 ppm 257±34 ppm 345± 106 ppm 49± 1 1 ppm 239±88 ppm 43±6 ppm
1-ヘプ夕ノール
(旦-オクタン）
359± 34 ppm 301 ±39 ppm 399±31 ppm 1 DJ± 14 ppm 141 ± 14 ppm 129±6 ppm 卜ォクタノール
(Π-デカン）
75± o3 ppm 43±30 ppm 28±31 ppm 2.5±4.4 ppm 42± 14 ppm 35 ±22 ppm 卜デカノ一ル 生変換反応による直鎖の炭化水素の変換試験を実施した場合も、菌破砕液より調 製した粗酵素液を用いて観察した試験結果 (実施例 11)と同様にハイブリッド P450は
、へキサン、オクタン、デカンといった n-アルカンのアルコール化反応を触媒すること が確認された。
また、図 5に示したように炭素数 6から 8の β-アルカンを基質とした場合に酸ィ匕物とし て検出された 1-アルコールの生成量を比較すると、菌懸濁液 Alkゃ菌懸濁液 Η5は基 質とした n-アルカンの炭素数が少なくなるに従い 1-アルコールの生成量が減少する 傾向を示したが、菌懸濁液 H9は基質とした n-アル力ンの炭素数が少なくなるに従い 1 -アルコールの生成量が増加する傾向を示した。
以上のように新規 P450による n-アルカン力 酸ィ匕物への変換量は、ハイブリット遺 伝子の armとして利用した既知 P450遺伝子 CYP153A13aによるアルカンの変換量とは 異なる特徴を示し、基質特異性や比活性が変化して!/ヽるものが存在して ヽることが明 らかとなつた。
〔実施例 15〕 融合型 P450モノォキシゲナーゼによるアルケンの変換試験
アルケン (不飽和を含む直鎖状炭化水素）の一種である 1-オタテンを基質とした生 変換反応試験を実施例 14で作製した菌懸濁液 H3、 H5、 H7、 H9、 Hll、 Alkを用いて 行った。各菌懸濁液 1 mlに基質を 0.25 ml添加し、 20°Cで 24時間反応を行った。終濃 度 0.2 Nになるように塩酸を添カ卩し、反応を停止した後、へキサンを 0.25 ml添カ卩し、ガ スクロマトグラフィー質量分析計によりへキサン抽出画分の成分分析を行うことで、 1- オタテンが酸ィ匕され生じた 1,2-エポキシオクタンの同定と定量を行った。各菌懸濁液 による酸化反応によって生成した酸化物の量 (濃度）を表 4に示す。
[表 4]
(基質）
菌懸濁液 Al k 菌懸濁液 H3 菌懸濁液 H5 菌懸獨液 H7 菌懸濁液 H9 菌懸濁液 H U 酸化物
( 1 -ォクテン）
1 122 ± 129 ppm 657± 33 ppm 1 1 97 ±26 ppm 1 15± 14 ppm 630± 61 ppm 2± 1 ppm 1，2-エポキシオクタン 表 4に示したように、ハイブリッド P450は、不飽和炭化水素の一種である 1-オタテン のエポキシ化反応を触媒することが確認された。
〔実施例 16〕 融合型 P450モノォキシゲナーゼによる環状炭化水素の変換試験 環状炭化水素（シクロアルカン)の一種であるシクロへキサンを基質とした生変換反 応試験を実施例 14で作製した菌懸濁液 H3、 H5、 H7、 H9、 Hll、 Alkを用いて行った 。各菌懸濁液 1 mlに基質を 0.25 ml添カ卩し、 20°Cで 24時間反応を行った。終濃度 0.2 Nになるように塩酸を添カ卩し、反応を停止した後、へキサンを 0.25 ml添カ卩し、ガスクロ マトグラフィー質量分析計によりへキサン抽出画分の成分分析を行うことで、シクロへ キサンが酸ィ匕され生じたシクロへキサノールの同定と定量を行った。各菌懸濁液によ る酸化反応によって生成した酸化物の量 (濃度）を表 5に示す。
[表 5]
(基質）
菌懸濁液 Alk 菌懸濁液 H3 菌懸獨液 H5 菌懸獨液 H7 菌懸獨液 H9 菌懸濁液 HI 1 酸化物
(シクロへキサン）
453 ±64 ppm 1 17± 7 ppm 299 ±37 ppm 7± 2 ppm 77 ± 1 1 ppm 290± 1 ppm シクロへキサノール 表 5に示したように、ハイブリッド P450は、環状炭化水素の一種であるシクロへキサ ンのアルコールィ匕反応を触媒することが確認された。
〔実施例 17〕 融合型 P450モノォキシゲナーゼによる芳香族炭化水素の変換試験 芳香族炭化水素 (分子内に芳香環を含むアルカンまたはアルケン)を基質とした生 変換反応試験を実施例 14で作製した菌懸濁液 H5、 H9、 Alkと、プラスミドベクター pA lkREDを大腸菌 BL21-AI株に形質転換後、タンパク質発現誘導処理を行わず培養す ることで作製した菌懸濁液 Nonを用いて行った。基質は n-ブチルベンゼンと 4-フエ- ル -1-ブテンを使用した。各菌懸濁液 1 mlに対して終濃度 1 mMになるように基質を添 加し、 20°Cで 8時間反応を行った後、終濃度 0.2 Nになるように塩酸を添加し、反応を 停止した。酢酸ェチルを 0.25 ml添カ卩し、ガスクロマトグラフィー質量分析計により酢酸 ェチル抽出画分の成分分析を行った。尚、 n-ブチルベンゼンを基質とした場合は酢 酸ェチル抽出画分をシリル化剤 TMSト H (GLサイエンス社）により誘導体化した後、 成分分析を行った。
図 6に n-ブチルベンゼンを基質とした場合の分析結果を示す。菌懸濁液 H5、 H9、 A lkから抽出した画分では n-ブチルベンゼンの酸化物である 4-フエ-ル- 1-ブタノール が検出された。一方、 P450が発現していない菌懸濁液 Nonにおいては n-ブチルベン ゼンの酸化物は検出されなかった。なお、 CYP153ファミリーに属する P450が n-ブチ ルベンゼンを 4-フエ-ル- 1-ブタノールに変換することは本発明により初めて明らか になったものである。
図 7に 4-フエ-ル -1-ブテンを基質とした場合の分析結果を示す。菌懸濁液 H5、 H9、 Alkから抽出した画分で 4-フエ-ル- 1-ブテンの酸化物である 2-フエネチルォキシラン (2- phenethy卜 oxirane)が検出された。一方、 P450が発現していない菌懸濁液 Nonに おいては 4-フエ-ル- 1-ブテンの酸化物は検出されなかった。なお、 CYP153ファミリ 一に属する P450が 4-フエ-ル- 1-ブテンを 2-フエネチルォキシランに変換することは 本発明により初めて明らかになったものである。
〔実施例 18〕 シユードモナス ·プチダ由来 P450の人工融合酵素化
シユードモナス ·プチダ（Pseudomonas putida)由来の P450cam遺伝子 (Nucleotide s equence of the Pseudomonas putiaa cytochrome P— 450cam gene and its expression ι n Escherichia coli. J Biol Chem. 261 : 1158—1163, 1986、及び、 NCBI accession No. M12546)を含む 1.3 kbの DNA断片は、 Pseudomonas putida ATCC 17453株からゲノム DNAを抽出し、そのゲノム DNAから Primer3 (5，- GActagtCatatgacgactgaaaccataca -3 、酉己歹1 J番 7り と Primer4 ( 5— gggaattctaccgctttggtagtcgccgga—3、酉己歹 U番 76)を 用いて PCRにより増幅した。下線部は 1部位（Primer3)、 E^RI部位 (Primer4)をそ れぞれ示している。尚、 P450遺伝子の終止コドンは削除してある。得られた 1.3 kbの D NA断片は、 Mdglと E^RIで切断して、前記のプラスミド pREDの Hd£l—E£2RI部位にサ ブクローンィ匕した。構築したプラスミドを以下 pCAMREDと呼ぶ。比較対象として、 P45 Ocam遺伝子のみを pET21aの NdsI—EmRI部位へクロー-ングしたプラスミド PETP450 camも作製した。
〔実施例 19〕 融合ィ匕 P450camの機能解析
大腸菌 BL2 KDE3)株を実施例 18で構築したプラスミド pCAMREDで形質転換し、 L B培地（アンピシリン 100 /z g/mlを含む） 3mLで 16時間、 30度で培養した。この前培養 液 1 mLを M9-グルコース培地（アンピシリン 100 μ g/ml含む） 50 mLに植菌し、 OD60 0値が約 0.8になるまで培養した。この培養液に誘導物質として IPTGを 0.2 mMになる よう加え、更に 25度で 16時間培養した。その後集菌し、 10 mMリン酸バッファー (pH = 7.0) 10 mLに懸濁、超音波破砕した。その後遠心 (10000 X g、 20分間)し、上清を無 細胞抽出液として抽出した。 2本のキュベットに無細胞抽出液を 0.8mlずつ分注し、サ ンプル側のキュベットに一酸ィ匕炭素を吹き込んだ後、両キュベット内にチォ硫酸ナトリ ゥム 5— 10 mgを添カ卩し、撹拌したのち 400- 500 nmのスペクトルを測定し、機能性 P45 0であるか判定した。また、同無細胞抽出液 0.8 mlに基質である樟脳（ショウノウ； camp hor)を 0.5 mMになるよう加えた時のスペクトル変ィ匕も観察した。その結果、図 8Aに示 すように人工融合 P450は非融合化 P450camスペクトル (図 8B)と同様のパターンを示し た。すなわち、還元状態での一酸化炭素との結合により 420 nm力 450 nmへのピー ク移動が見られ（図 8点線）、一酸ィ匕酸素の有無による CO差スペクトルを求めると 450 nmに極大吸収が確認された（図 8挿入図)。尚かつ基質と混合した場合、基質結合ス ベクトルである 390 nmへピーク極大が移動した（図 8A破線)。従って還元酵素領域と 人工融合ィ匕することによる悪影響 (立体障害による基質との結合阻害など）は無ぐ 融合型 P450camは酵素として機能性を持つことが確認された。
〔実施例 20〕 融合ィ匕 P450cam生産大腸菌によるショウノウの変換
プラスミド pCAMREDを含む大腸菌 BL2KDE3)株は実施例 19と同様に培養し、遺伝 子の発現誘導を行った。その後集菌し、 10 mMリン酸バッファー（pH = 7.0) 5 mLに 懸濁、 P450camの基質であるショウノウを終濃度 0.5m Mになるように添カ卩し、 25°Cで 2 4時間インキュベートした。反応直後、 3、 6、 24時間後の反応液をサンプリングし、酢 酸ェチルで基質及び反応産物（5 ' 水酸化物）を含む液層を抽出、ガスクロマト グラフィ一-質量分析装置 (GC-MS、島津 QP-5050)で分析し、同定を行った。その 結果、図 9に示すように人工融合酵素遺伝子発現菌株において 24時間後にはショウ ノウが完全に消失し、水酸化物である 水酸化ショウノウが検出された。一方、比 較対象の非融合型 (RhF還元酵素ドメインを持たな ヽ）プラスミド pETP450camを導入 した大腸菌 BL21(DE3)株では約 20%のショウノウが水酸ィ匕されたに留まった。なお、図 9中のグラフの縦軸は基質の消費及び変換産物の蓄積を示している。基質について は反応直後の濃度を 100%、変換産物については、基質を 100%消費した時の産物の 量の理論値を 100%として!/、る。
〔実施例 21〕 アル力-ボラックス ·ボルクメンシス由来 P450alkの融合ィ匕
アル力-ボラックス ·ボルクメンシス (Alcanivorax borkumensis) 由来の P450 alk (CY P153A13a)遺伝子を含む 1.3 kbの DNA断片は、アル力-ボラックス 'ボルクメンシス SK 2株（DSM11573株）からゲノム DNAを抽出し、そのゲノム DNAから Primer5 (5'- CACT AGTCatatgTCAACGAGTTCAAGTACA -3'、配列番号 73)と Primer6 (5'- CAGCA CCaattGTTTTTTAGCCGTCAACTT -3'、配列番号 74)を用いて PCRにより増幅し た。下線部は Ndel部位（Primer5)、 Mfel部位（Primer6)をそれぞれ示している。尚、 P4 50遺伝子の終止コドンは削除してある。得られた 1.3 kbの断片は、 Ndelと Mfelで切断 して実施例で構築したプラスミド pREDの I-EmRI部位にサブクローンィ匕した。構築 したプラスミドを以下 pAlkREDと呼ぶ。なお、 Alcanivorax borkumensis SK2株（DSM11 573株）の P450 alk (CYP153A13a)遺伝子の塩基配列は配列番号 58に示されている 比較対象として、 P450alk遺伝子のみを pET21aの I— E£2RI部位へクローユングし たプラスミド pETP450alkも作製した。
〔実施例 22〕 融合ィ匕 P450alk生産大腸菌によるアルカンの変換
プラスミド pAlkREDまたは pETP450alkを含む大腸菌 BL21(DE3)株は実施例 19と同 様に培養し、遺伝子の発現誘導を行った。その後集菌し、 10 mMリン酸バッファー (p H = 7.0) 5 mLに懸濁、その懸濁液 1.5 mLに P450alkの基質であるオクタンを 0.5 mL 添加し、 20°Cで 24時間インキュベートした。 24時間反応後のサンプルについて、オタ タンで反応産物（1-ォクタノール)を含む液層を抽出、ガスクロマトグラフィ一-質量分 析装置 (GC-MS、島津 QP-5050)で分析し、同定及び定量を行った。その結果、図 1 0に示すように人工融合酵素遺伝子発現菌株であるプラスミド pAlkREDを導入した大 腸菌において、 790.8 ppmの 1-ォクタノールが生産された。一方、比較対象の非融合 型 (RhF還元酵素ドメインを持たな 、)プラスミド pETP50alkを導入した大腸菌では 40.3 ppmであり、人工融合酵素発現菌株の約 5%程度に留まった。
〔実施例 23〕 環境 DNAサンプルより得られた P450bzoの融合ィ匕
P450bzo遺伝子は内山らにより SIGEX法を使って環境メタゲノムライブラリーより得ら れて 、る (Ucmyama Γ, et al. Substrate-induced gene-expression screening of envir onmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat Biotechnol. 23:8 8-93, 2005、及び、 GenBank code:AB186504)。サブクローン化された P450bzo遺伝 子について、 Primer7 (5'- CGATATaCatatgTtCAGtTTtgAcccctat -3'、配列番号 77 )と Primer8 (5'- gGATTgcgtttgacgaatTTcacaaa -3'、配列番号 78)を用いて P450遺 伝子の N末端側の 1.2 kbの DNA断片を増幅した。さらに、 Primer9 (5，- gggctcactttgt gaaattcgtcaaa
Figure imgf000049_0001
目列 ¾·号/■ 9)と PnmerlO (o - gggaattccgaaacggccaattccag 配列番号 80)を用いて、 Ρ450遺伝子の C末断片側の 110 bpの DNA断片を増幅した。 プライマー（primer) 8の 20番目の Tとプライマー 9の 15番目の Aは、遺伝子内部の Em RIサイトを削除するため導入した変異である。尚、この変異によるアミノ酸配列の置換 はない。増幅した 1.2 kbと 110 bpの両 DNA断片を混合し、これを铸型として Primer7、 10を用いて再度 PCRすることにより P450bzo遺伝子全長断片を得た。 Primer7、 10に おける下線部はそれぞれ 部位、 EmRi部位を示している。尚、 P450遺伝子の終 止コドンは削除してある。得られた 1.3 kbの断片は、 1と E^RIで切断して実施例で 構築したプラスミド pREDの I-E^RI部位にサブクローンィ匕した。構築したプラスミド を以下 pBzoREDと呼ぶ。
比較対象として P450bzo遺伝子のみを大腸菌ベクター pET21aの — E£2RI部位 へクロー-ングしたプラスミド pETP450bzoも作製した。
〔実施例 24〕 融合化 P450bzo生産大腸菌による 4-ヒドロキシ安息香酸の変換 プラスミド pBzoREDまたは pETP450bzoを含む大腸菌 BL21 (DE3)株は実施例 19と同 様に培養し、遺伝子の発現誘導を行った。その後集菌し、 10 mMリン酸バッファー (p H = 7.0) 5 mLに懸濁後、 P450bzoの基質である 4-ヒドロキシ安息香酸を終濃度 0.6 m Mになるよう添加し、 20°Cで 6時間インキュベートした。反応直後、 2、 4、 6時間後の反 応液をサンプリングし、酢酸ェチルで基質及び反応産物（3,4-ジヒドロキシ安息香酸） を含む液層を抽出、ガスクロマトグラフィ一-質量分析装置 (GC-MS、島津 QP-5050) で分析し、同定を行った。その結果、図 11に示すように、人工融合酵素遺伝子発現 菌株であるプラスミド pBzoREDを導入した大腸菌にぉ 、て、基質が急速に変換され、 4時間後には基質が完全に消失し、水酸ィ匕物である 3,4-ジヒドロキシ安息香酸が約 0. 6 mM生産された。一方、比較対象の非融合型 (RhF還元酵素ドメインを持たない)プ ラスミド pETP450bzoを導入した大腸菌では同時間を経た段階で基質の約半量 (2.5 m M )が残存し、反応産物も 0.1 mM程度であった。
〔実施例 25〕 ストレプトマイセス ·グリセォラス由来 P450SU-1または P450SU-2の融合 化
ストレプトマイセス'グリセオラス (Streptomvces griseolus)由来の P450SU- 1 (CYP105 A1)または P450SU- 2 (CYP105B1)遺伝子（Genes for two herbicide- indudble cytoch romes P— 450 from StreDtomyces griseolus. J Bacteriol. 172:3335—45, 1990、及び、 N CBI accession No. M32238及び M32239)を含む 1.3 kbの DNA断片は、ストレプトマイ セス.グリセォラス ATCC 11796株からゲノム DNAを抽出し、そのゲノム DNAから Primer 11 (5'- GGACTCCatatgACCGATACCGCCACGACG -3'、配列番号 81)と Primerl 2 (5'- CTGaattCCCAGGTGACCGGGAGTTCGTTGAC -3'、配列番号 82)、または Primerl 3 (5'- GGACTCCatatgACGACCGCAGAACGCACC-3\配列番号 83)と Pri merl4 (5'- CTGaattCCCAGGCGATCGGCAGCGAGTGGAC -3'、配列番号 84)を 用いて PCRにより増幅した。下線部は 1部位（Primerl 1および 13)、 EmRI部位（Pri merl2および 14)をそれぞれ示している。尚、 P450遺伝子の終止コドンは削除してあ る。得られた各々の 1.3 kbの DNA断片を と E^RIで切断した後、実施例 12で構 築した機能発現用ベクター pREDの Hdgl-EmRI部位に挿入し、融合化 P450SU-1また は融合ィ匕 P450SU-2遺伝子の発現用プラスミドを作製した。構築したプラスミドを以下 、それぞれ pSU-lRED、 pSU-2REDと呼ぶ。比較対象として、 P450SU-1または P450S U-2遺伝子のみを pET21aの Mdel—E RI部位に挿入したプラスミド PETP450SU- 1、 p ETP450SU- 2も作製した。
〔実施例 26〕 融合ィ匕 P450SU-1及び SU-2生産大腸菌による 7-エトキシクマリンの変 換
プラスミド pSU-lREDまたは pSU-2RED、または pETP450SU- 1または pETP450SU- 2 が導入された大腸菌 BL21(DE3)株を、実施例 19と同様に培養し、遺伝子の発現誘 導を行った。遺伝子の発現誘導と同時に P450SU- 1および SU- 2の基質である 7-エト キシクマリンを終濃度 1 mMになるよう培地に添カ卩し、 20°Cで 74時間インキュベートし た。酢酸ェチルで反応液中の基質及び反応産物（7-ヒドロキシクマリン)を含む液層 を抽出し、薄層クロマトグラフィーにて分析した。その結果、人工融合酵素遺伝子発 現用のプラスミドである pSU-lREDまたは pSU-2REDを保有する大腸菌は両菌株とも 、反応産物である 7-ヒドロキシクマリンが検出された。一方、比較対象の非融合型ブラ スミド PETP450SU-1を導入した大腸菌では反応産物が検出されなかった。 pETP450S U-2を導入した大腸菌では若干の反応産物が検出されたが、その量は融合ィ匕プラス ミド PSU-2RED保持菌と比較して少な力つた。
本実施例により、放線菌由来の P450も、本発明による機能発現システムに適応でき ることが明ら力となった。
〔実施例 27〕 P450HB153遺伝子の単離と融合ィ匕
グラム陽性細菌であるノカルディア科 Hou_blue株（Nocardiaceae strain Hou.blue)は 、新潟県西山町の石油噴出場の土壌 (新潟県石油汚染土壌)より、石油系炭化水素 であるアルカンの資化能を指標にして単離された新規の細菌である。本 Hou_blue株 は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 (千葉県木更 津巿かずさ鎌足 2-5-8)に、平成 16年 6月 8日に、寄託番号 NITE P_3として寄託され ている。
ノカルディア科 Hou_blue株由来から、 CYP153ファミリーに属する新規の P450遺伝子 [ 以後、本遺伝子を P450HB153遺伝子と呼ぶ (配列番号 86にその塩基配列力 配列 番号 85にコードされる P450タンパク質のアミノ酸配列が示されている）]を単離した。 すなわち、本 P450HB153遺伝子を含む 1.3 kbの DNA断片は、同株からゲノム DNAを 抽出し、そのゲノム DNAからプライマー Hou-l (5，- GTAGGCCATATGAACGTAAT CGGTGCAGGT -3'、配列番号 87)とプライマー Hou- 2 (5'- CATGAATTCGACCT GTTCCATCTCGGTCTC -3'、配列番号 88)を用いて PCRにより増幅した。下線部 はそれぞれ、 Ndgl部位及び E RI部位を示している。なお、 P450HB153遺伝子の終 止コドンは削除してある。得られた 1.3 kbの断片は、 1と EmRIで切断し、実施例 12 で構築したベクター pREDの Hdgl-EmRI部位に挿入し、プラスミド pHB153-Redを構築 した。
〔実施例 28〕 融合ィ匕 P450HB153生産大腸菌による 2-n-ブチルベンゾフランの変換 プラスミド pHB153-Redを有する大腸菌 BL21(DE3)株を用いて、 2-i ブチルベンゾ フラン（2-n-butylbenzoforan)の生変換試験を実施した。すなわち、大腸菌 BL21(DE3 )株を実施例 27で構築したプラスミド pHB153-Redで形質転換し、 LB培地 (アンピシリ ン 100 μ g/mlを含む） 3 mlで 16時間、 30°Cで培養した。この前培養液 1 mlを M9 -ダル コース培地（アンピシリン 100 μ g/ml含む） 50 mlに植菌し、 OD600値が約 0.8になるま で培養した。この培養液に誘導物質として IPTGを 0.2 mMになるよう加え、更に 25度 で 16時間培養した。この培養液を遠心分離し (8000 rpm, 5 min.)、菌体を沈澱させた 。上清を捨てたのち 50 mMりん酸緩衝液 (pH 7.0) 10 mlをカ卩え、良く撹拌して菌体を 5 0 ml容ファルコンチューブに回収した。ここ〖こ基質を 1.74 mg (終濃度 1 mM)になるよ うに少量の DMSOに溶解して添カ卩し、 20°Cで 24時間振とう培養した。
2-n-ブチルベンゾフランの変換試験を行った培養液を含むファルコンチューブ 10 本分の 100 ml (元培養 1 L相当）を用いて、酢酸ェチルと混合分配し、酢酸ェチル相 を分取し濃縮した。この酢酸ェチル抽出物（18.6 mg)を TLC [へキサン：酢酸ェチル（ 5： 1)で展開]に供したところ、 Rf値 0.21の産物 (ィ匕合物 28-1と呼ぶ）が生成して 、るこ とが判明した。本酢酸ェチル抽出物をシリカゲルクロマトグラフィー [直径 1 cm X長さ 20 cm,展開溶媒:へキサン:酢酸ェチル（5 : 1) ]にかけることにより精製し、化合物 28 -1 (0.4 mg)の純品を得た。化合物 28-1は EI-MSで m/z 190 (基質 +酸素原子 1)に 分子イオンピーク M+が観測された。 ' NMRスペクトルを測定したところ、芳香環部分 の信号は基質と全く同様であった。し力しながら基質の末端メチル基は消失し、 d 3.7 0にとリブレットに分裂したォキシメチレン基及び 3つのメチレン基が観測された。 DQF -COSYスペクトルの解析によりこれら計 4つのメチレン基は連続していることが判明し たことと、前述の EI-MSの結果から、変換ィ匕合物は末端のメチル基に水酸基が導入さ れたものと同定された。すなわち、化合物 28-1を下記に示す 4-ベンゾフラン- 2-ィル- ブタン- 1 -オール（4- benzoforan- 2- y卜 butan- 1 - ol)と同定した。
[化 1]
Figure imgf000053_0001
これは CASに記載のある化合物である力 微生物変換により得られたのは初めての 報告である。
[表 6] 化合物 28- 1 (4-benzofuran-2-yト butan- l-ol)の 400 MHz Ή NMRデータ (CDC13中)
Figure imgf000054_0001
産業上の利用可能性
本発明により、環境サンプル等の雑多な微生物由来の核酸を含むサンプルから、 新規 P450遺伝子を効率的に単離する方法が提供される。本発明の方法によって提 供される P450遺伝子から生産される P450は基質特異性や比活性が多様に変化して おり、アルカン、アルケン、環状炭化水素 (シクロアルカン)、芳香族炭化水素 (分子 内に芳香環を有するアルカンまたはアルケン)をはじめ多様な低分子有機化合物の 酸化反応に利用することができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願 (特願 2004-326139号、 特願 2005-83019号、特願 2005-83122号）の明細書および Zまたは図面に記載され ている内容を包含する。また、本発明で引用した全ての刊行物、特許および特許出 願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 51又は 52記載のアミノ酸配列の一部又は全部をコードする塩基配列、 又はそれと相補的な塩基配列を含み、かつプライマー又はプローブとして実質的な 機能を有する P450遺伝子断片単離用オリゴヌクレオチド。
[2] 配列番号 53〜56記載のいずれかの塩基配列、又はそれと相補的な配列の一部ま たは全部を含み、かつプライマー又はプローブとして実質的な機能を有する P450遺 伝子断片単離用オリゴヌクレオチド。
[3] 請求項 1又は 2記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一方のプライマーとして使用す ることを特徴とする P450遺伝子断片単離法。
[4] 試料から核酸を抽出する工程、及び抽出した核酸を铸型とし、請求項 1又は 2記載 のオリゴヌクレオチドをプライマーとして核酸増幅反応を行う工程を含む P450遺伝子 断片単離法。
[5] 請求項 1又は 2記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一方のプライマーとして使用し て P450遺伝子断片を単離する工程、及び単離された P450遺伝子断片の 5'末端及び 3'末端のそれぞれに既知 P450遺伝子の 5'末端領域及び 3'末端領域を付加する工程 を含むハイブリッド P450遺伝子の作製方法。
[6] 既知 P450遺伝子が、配列番号 57記載のアミノ酸配列をコードする P450遺伝子であ る請求項 5記載のハイブリッド P450遺伝子の作製方法。
[7] 以下の（a)〜（c)を含むことを特徴とする P450遺伝子単離用キット、
(a)請求項 1又は 2記載のオリゴヌクレオチド、
(b)既知 P450遺伝子の 5 '末端領域を含む DNA断片、
(c)既知 P450遺伝子の 3 '末端領域を含む DNA断片。
[8] 以下の（a)又は (b)の 、ずれかのタンパク質をコードする遺伝子、
(a)配列番号 1〜25のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号 1〜25のいずれかのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸配 列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ P450として機能するタ ンパク質。
[9] 配列番号 26〜50のいずれかの塩基配列力もなり、 P450として機能するタンパク質 をコードする遺伝子。
[10] 請求項 8又は 9記載の遺伝子を含有する発現ベクター。
[11] 以下の（a)または（b)の 、ずれかのタンパク質、
(a)配列番号 1〜25のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号 1〜25のいずれかのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸配 列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列力もなりかつ、 P450として機能するタ ンパク質。
[12] 請求項 10記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培地で培養し、得られ る培養物力 請求項 11記載のタンパク質を回収することを特徴とする P450として機能 するタンパク質の製造法。
[13] 請求項 11記載のタンパク質を基質と反応させ、酸化化合物を得ることを特徴とする 酸化化合物の生産法。
[14] P450本体タンパク質の C末端側に、リンカ一部分を介して、ロドコカツス属 NCIMB97 84株由来のシトクロム P450モノォキシゲナーゼに含まれる還元酵素ドメインと同様の 機能を持つペプチドを付カ卩してなる融合型シトクロム P450モノォキシゲナーゼ。
[15] ロドコカツス属 NCIMB9784株由来のシトクロム P450モノォキシゲナーゼに含まれる 還元酵素ドメインと同様の機能を持つペプチドが、 (a)配列番号 70記載のアミノ酸配 列からなるペプチド、（b)配列番号 70記載のアミノ酸配列において 1もしくは複数個 のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列力 なるペプチド、又は (c)配 列番号 69記載の塩基配列力もなる DNA又はそれと相補的な DNAとストリンジ ントな 条件下でノ、イブリダィズする DNAがコードするペプチドであることを特徴とする請求項 14に記載の融合型シトクロム P450モノォキシゲナーゼ。
[16] リンカ一部分力 （d)配列番号 68記載のアミノ酸配列力もなるペプチド、（e)配列番 号 68記載のアミノ酸配列において 1もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置 換されたアミノ酸配列力 なるペプチド、又は (f)配列番号 67記載の塩基配列からな る DNA又はそれと相補的な DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA 力 Sコードするペプチドであることを特徴とする請求項 14又は 15に記載の融合型シトク ロム P450モノォキシゲナーゼ。
[17] P450本体タンパク質力 細菌由来の P450本体タンパク質であることを特徴とする請 求項 14乃至 16のいずれか一項に記載の融合型シトクロム P450モノォキシゲナーゼ
[18] P450本体タンパク質力 請求項 11記載のタンパク質、又は配列番号 57若しくは配 列番号 85のアミノ酸配列力もなるタンパク質であることを特徴とする請求項 14乃至 1 6のいずれか一項に記載の融合型シトクロム P450モノォキシゲナーゼ。
[19] 請求項 14乃至 18のいずれか一項に記載の融合型シトクロム P450モノォキシゲナ ーゼをコードする DNA。
[20] 請求項 19記載の DNAを導入した微生物。
[21] 請求項 20記載の微生物を培養し、培養物又は菌体から融合型シトクロム P450モノ ォキシゲナーゼを採取することを特徴とする融合型シトクロム P450モノォキシゲナー ゼの生産方法。
[22] 請求項 14乃至 18のいずれか一項に記載の融合型シトクロム P450モノォキシゲナ 一ゼを基質と反応させ、酸化化合物を得ることを特徴とする酸化化合物の生産法。
[23] 基質が、 n-へキサン、 n-ヘプタン、 n-オクタン、 n-デカン、 1-オタテン、シクロへキサ ン、 β-ブチルベンゼン、 4-フエニル- 1-ブテン、又は 2-η-ブチルベンゾフランであり、 生産される酸化化合物がそれぞれ 1-へキサノール、 1-ヘプタノール、 1-ォクタノール
、 1-デカノール、 1,2-エポキシオクタン、シクロへキサノール、 4-フエニル- 1-ブタノー ル、 2-フエネチルォキシラン、又は 4-ベンゾフラン- 2-ィル-ブタン- 1-オールであるこ とを特徴とする請求項 22記載の酸ィ匕化合物の生産法。
[24] 以下の（a)又は (b)の 、ずれかのタンパク質をコードする遺伝子、
(a)配列番号 85のアミノ酸配列力 なるタンパク質、
(b)配列番号 85のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換 もしくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ P450として機能するタンパク質。
[25] 配列番号 86の塩基配列カゝらなり、 P450として機能するタンパク質をコードする遺伝 子。
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