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WO2006041135A1 - STAT3リン酸化抑制及びNotch1発現抑制剤 - Google Patents

STAT3リン酸化抑制及びNotch1発現抑制剤 Download PDF

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WO2006041135A1
WO2006041135A1 PCT/JP2005/018882 JP2005018882W WO2006041135A1 WO 2006041135 A1 WO2006041135 A1 WO 2006041135A1 JP 2005018882 W JP2005018882 W JP 2005018882W WO 2006041135 A1 WO2006041135 A1 WO 2006041135A1
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WO
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inhibitor
group
notch
stat3
cells
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PCT/JP2005/018882
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English (en)
French (fr)
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Bang Luu
Ellane Mohier
Masashi Yamada
Hiroto Suzuki
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Meiji Dairies Corp
Original Assignee
Meiji Dairies Corp
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Publication date
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Priority to CN2005800351045A priority patent/CN101039663B/zh
Priority to CA2583699A priority patent/CA2583699C/en
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    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/07—Retinol compounds, e.g. vitamin A
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a non-peptide low molecular weight compound that acts as a factor that determines cell fate.
  • the compound acts on the transmission system with STAT signal and Notch signal by decreasing STAT3 phosphate and suppressing Notchl receptor expression.
  • the compound acts as an agent for inducing differentiation of undifferentiated cells (stem cells). Due to these characteristics, the compound is useful as a prophylactic / therapeutic agent for pathological conditions induced by dysfunction of both STAT signal and Notch signaling system.
  • Notch signaling is a mechanism that is related to cell fate decisions in the developmental and adult phases and does not change much (Non-patent Document 1). Notch signaling is involved in cell fate decisions in many tissues. Notch functions between adjacent cells that have the same function.
  • Notch signaling actively promotes the differentiation of various cell types.
  • the Notch signal in the nervous system promotes distribution to the first mouth site.
  • Notch signals were first confirmed in Drosophila and then in vertebrates. This depends on the transmembrane receptor encoded by the Notch gene (Non-Patent Documents 1 to 3), which is activated by a transmembrane ligand (encoded by a gene such as Delta or agged). Is done. This activation control regulates the proteolytic cleavage of Notch and the transcription of the fragments present in the molecule that bind to the CBF protein, which together activate the transcription of the HES gene. works as a transcription complex. And since HES inhibits transcription of the pro-euron gene MASH1, the activation of Notch in the cell causes the neural stem cells to differentiate into neurons. prevent.
  • Notch signaling dysfunction leads to various diseases such as tumors, cancers, neurodegenerative diseases such as Arnno's disease (Non-Patent Documents 2 to 3).
  • Cell fate determinants that act on Notch signaling systems have become targets for new drugs.
  • Strategies used to date target factors downstream of the Notch signaling system (eg, suppress ligand binding, inhibit receptor proteolytic cleavage, and repress its transcription to the nucleus. Therefore, none of them was able to suppress the expression of Notch.
  • Non-Patent Literature 1 S. Artavanis- Tsakonsa, M. Rand, R. Lake, Notch Signaling: Cell and ont rol and Signal Integration in Development, science Vol. 284 Page 770-776 (1999)
  • Non-Patent Literature 2 A. Zlobin, M. Jang, L. Miele, Toward the rational design of cell fate m odifiers: Notch signaling as a target for novel biopharmaceuticals .Current Pharm aceutical Biotechnology July l (l) Page 86-106 (2000)
  • Non-Patent Document 3 B. Nickoloff, B. Osborne, L. Miele Notch signaling as a therapeutic ta rget in cancer: anew approach to the development of cell fate modiiying agents.One ogene Vol 22 (42) Page6598-6608 (2003)
  • Cell fate determination is a critical event during development, as in adulthood. They control processes such as cell proliferation, differentiation and apoptosis. Such process disorders are the origin of many pathologies.
  • An object of the present invention is to provide a low molecular weight compound that specifically acts on the expression of Notchl gene.
  • Cyclohexenone long-chain alcohols have been previously reported to have neurotrophic effects that promote neuronal survival and neurite outgrowth (Gonzales de Ag uilar et al., Brain Res (2001) 920, 65-73).
  • the present inventors have demonstrated in a test using neurospheres that the compound suppresses the differentiation of neural stem cells into astrocytes and promotes differentiation into neural cells (PC T: WO 02/29014 A2).
  • STAT3 is activated by being phosphorylated by a large amount of cytodynamic ins (growth factors and hormones). To date, seven STAT families have been identified, some of which can be activated quite specifically. The biological role of STAT3 has been elucidated by studies with knockout mice and Cre-LoxP recombination, and STAT3 plays an important role in various biological functions such as cell proliferation, inhibition of apoptosis, and cell motility. It shows that it plays an important role. On the other hand, the action of STAT 3 on ES (embryonic stem cells) cells suppressed self-proliferation of ES cells and promoted differentiation. Inhibition of STAT3 signaling has been correlated with many cancer cell lines such as blood cancer, breast cancer, head cancer, and cervical cancer (reviewed in Bromber g and Darnell Oncogene (2000) 19, 2468-2473).
  • ES embryonic stem cells
  • the present invention provides:
  • R ⁇ R 2 and R 3 each represent a hydrogen atom or a methyl group, and X represents a linear or branched alkyl, alkylene or alkenylene group having 10 carbon atoms
  • an antitumor agent comprising the compound of (1) as an active ingredient
  • a STAT signal and Notch signal transmission system dysfunction improving agent comprising the compound of (1) as an active ingredient
  • the compound represented by the formula (1) exhibits an excellent phosphate inhibitory effect and Notchl expression inhibitory effect of STAT3, and is useful as a therapeutic agent for STAT signal and Notch signal transduction system dysfunction.
  • STAT signal and Notch signal transduction system dysfunction causes various tumors, cancer, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease. It is also useful as a preventive and therapeutic agent for tumors, cancer and various neurodegenerative diseases.
  • FIG. 1 is a graph showing an increase or decrease in gene expression with or without the addition of cyclohexenone long-chain alcohol of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the phosphate inhibitory action of STAT3 by the cyclohexenone long-chain alcohol-added card of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing test results showing in vitro antitumor activity of cyclohexenone long-chain alcohol of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing test results showing the ex vivo antitumor activity of cyclohexenone long-chain alcohol of the present invention.
  • X is a linear or branched alkyl, alkylene or alkylene group having 10 to 28 carbon atoms, but in the case of a branched alkylene or alkylene group.
  • Examples of the side chain include an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • Examples of the side chain alkyl group include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, isopentyl group, neopentyl group, tert - A pentyl group, a hexyl group, an isohexyl group, a heptyl group, an octyl group, a nonyl group, a decyl group, and the like can be mentioned. Of these, a methyl group is particularly preferable.
  • substitution of the side chain to a linear alkylene group or alkene group is preferably at the 3 and Z or 7 positions.
  • a linear alkyl group having 10 to 18 carbon atoms more preferably a linear alkyl group having 10 to 28 carbon atoms, is particularly preferable.
  • R 2 and R 3 each represent a hydrogen atom or a methyl group, but it is more preferred that at least one is a methyl group.
  • the compound represented by the formula (1) may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt, or a solvent or hydrate thereof.
  • the compound (1) may have various isomers, and these isomers are also included in the present invention.
  • the compound represented by the formula (1) can be prepared by a known method, for example, according to the production method described in JP 2000-297034.
  • the compound represented by the formula (1) can be administered either orally or parenterally (intramuscular, subcutaneous or intravenous injection, suppository, etc.).
  • binder examples include polybutyl alcohol, polyvinyl ether, ethyl cellulose, methyl cellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropinolecellulose, hydroxypropinorestarch, and polyvinylpyrrolidone.
  • Examples of the disintegrant include starch, agar, ungelatinized, crystalline cellulose, calcium carbonate, sodium hydrogen carbonate, calcium citrate, dextran, and pectin.
  • Examples of the lubricant include magnesium stearate, talc, polyethylene darcol, silica, hydrogenated vegetable oil, and the like.
  • As the colorant those permitted to be added to pharmaceuticals can be used.
  • As a flavoring agent cocoa powder, coconut powder, coconut brain, aromatic acid, heart power oil, dragon brain, cinnamon powder and the like can be used. These tablets and granules contain sugar It is possible to coat appropriately if necessary.
  • parenteral administration when preparing injections, add pH adjusters, buffers, stabilizers, preservatives, etc., if necessary, and make subcutaneous, intramuscular, and intravenous injections by conventional methods.
  • the injection may be prepared as a solid preparation by lyophilization after storing the solution in a container.
  • One dose may be stored in a container, or multiple doses may be stored in the same container.
  • the dose of the compound of the present invention as a pharmaceutical is usually 0.01 to 1000 mg per day for an adult, preferably 0.1 to 500 mg. Administer in 4 divided doses.
  • JP 2000-297034 2 was synthesized by the method described in, 4, 4 trimethyl-3 (15-hydroxy-pentadecyl) construed dissolved as hexene one 1-on into single 2-cyclopropyl an ethanol 10- 2 M, preferably the concentration The final dilution was 1 lZml. 2, 4, 4—Trimethyl 3 (15 hydroxypentadecyl) 2 cyclohexene 1-one was added at different times and for various periods in cell culture. The control was ethanol / zlZml ethanol (ethanol at this dilution has no effect on the differentiation of the culture). Each experiment was repeated at least three times.
  • Neurospheres were cultured in “neurosphere medium” containing lOngZml of EGF at different conditions for different times (3, 12 or 24 hours prior to RNA extraction as described in the text) .
  • Nerve cells derived from mouse 13-14 day fetal brain
  • astrocytes derived from Wistar rat newborn brain
  • oligodendrocytes derived from Wistar rat newborn brain
  • 2, 4, 4 trimethyl 3 15 hydroxypenta Decyl
  • RNA was purified from cultured cells and reverse-transcribed. Three independent RNA samples were prepared for each experiment.
  • RNA for neurospheres 3 ⁇ g of total RNA for neurospheres, astrocytes and oligodendrocytes [2g, Nekenkei Itoda [Kotsu! — MLV reverse transcriptase (Invitrogen), 0.5 mM dNTP (QBiogen), 5 mM DTT (Invitrogen), 0.01 gZ 1 random hexamer (Invitrogen), 20 U RNaseOUT (registered trademark) (Invitrogen) Synthesized for 20 hours at 37 ° C with 20 1 reaction mixture containing.
  • One-tenth total cDNA was amplified with 20 ⁇ l of reaction mixture containing 1.25 U Taq DNA Polymerase (Invitrogen), 0.5 mM dNTPs (QBiogen) and 0.5 ⁇ l of each primer. . PCR conditions were adjusted for each primer and cell type to be studied. Primers were designed as follows to suit both rat and mouse specimens.
  • Notchl F 5 and TGCCAAATGCCTGCCAGAAT-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • Notchl R 5, -CATGGATCTTGTCCATGCAG-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • Notch2 F 5'-GAGGCGACTCTTCTGCTGTTGAAGA-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Notch2 R 5 and ATAGAGTCACTGAGCTCTCGGACAG-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • Notch3 F 5'- ACACTGGGAGTTCTCTGTGAG-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • Notch3 R 5,-GCTGTCTGCTGGCATGGGATA-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • Notch4 F 5'-CTTCTCGTCCTCCAGCTCAT-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • Notch4 R 5,-GCTGACATCAGGGGTGTCAC-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Typical cycling conditions are 30 at 94 ° C for all genes studied except for HES-5 where the program is 94 ° C for 30 seconds, 63 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 2 minutes. Seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds.
  • the PCR experiment was repeated twice. The results show that 2, 4, 4 trimethyl 3 (15 hydroxypentadecyl) 1 2 cyclohexene 1 1-on for untreated cells (control conditions normalized to GAPDH and adjusted to 100%) Percentage expression in gene expression of treated cells. The relative amount of mRNA was quantified by Babylmager analysis and NIHimagel.
  • Notch-2 Molecular analysis of key gene expression of Notch pathway by RT-PCR revealed that 2, 4, 4-trimethyl-3 (15-hydroxypentadecyl) -2-cyclohexene 1-one treatment It was found that while the expression levels of other Notch receptors (Notch2-4) remained unchanged, the levels of Notchl mRNA and then HES5 were always reduced.
  • 3T3 Ras transformed fibroblasts from mice or 3T3 fibroblasts (from mice) Incubate for 1 day in DMEM medium containing 10% FBS at a concentration of 10,000 Zml each. After that, 2, 4, 4-trimethyl-3 (15-hydroxy-pentadecyl) to 2 cyclohexene one 1-one (or ethanol as a control) for 6 days treatment of 10- 5 M to each cell.
  • the fibroblast cells transformed with Ras, 2, 4, 4 was treated with trimethyl 3 (15-hydroxy-pentadecyl) 2-cyclopropyl hexene one 1-one (10- 6 M), compared to untreated cells. Untransformed cell lines (treated and untreated) were used as controls. From Fig. 3, 2, 4, 4 Trimethyl 3 (15 hydroxypentadecyl) 1-2 cyclohexene 1-on cells transformed with Ras Reducing the tumor foci of the strain has become apparent. This finding was accompanied by a molecular decrease in Notchl expression.
  • the 3T3 Ras transformed fibroblast (derived from mouse) or 3T3 fibroblast (derived from mouse), 50 1 (10- 3 M) of 2, 4, 4-trimethyl-3 (15-hydroxy-pentadecyl) hexene 1 to single 2 cyclo Apply ON and process in a test tube for 3 days. Resuspend 2xl0 7 cells in 400 ⁇ l DMEM medium and inject 200 ⁇ l into 7 week old Swiss NuZNu mice (male) symmetrically. 2, 4, 4 Trimethyl-3 (1) on the 2nd, 8th, and 15th day after injection 5 Hydroxypentadecyl) 2 cyclohexene 1-one was given IP to mice
  • the compound represented by the formula (1) exhibits excellent STAT3 phosphorylation suppression effect and Notchl expression suppression effect, and is useful as a therapeutic agent for STAT signal and Notch signal transduction system dysfunction. Furthermore, it is useful as a prophylactic / therapeutic agent for various tumors and cancers and various neurodegenerative diseases.

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Description

STAT3リン酸化抑制及び Notchl発現抑制剤
技術分野
[0001] 本発明は、細胞の運命を決定する因子として働く非ペプチド性低分子化合物に関 するものである。該化合物は、 STAT3のリン酸ィ匕を減少させ、 Notchl受容体の発現を 抑える事で、 STATシグナル及び Notchシグナルで伝達系に作用する。その結果、該 化合物は、未分化細胞 (幹細胞)の分化誘導剤として作動する。これらの特質により、 該化合物は、 STATシグナル及び Notchシグナル伝達系の両方の機能障害により誘 導される病態の予防 *治療剤として有用である。
背景技術
[0002] Notchシグナル伝達は、発育期及び成人期における細胞運命決定に関係しており 、かつあまり変化することのないメカニズムである（非特許文献 1)。 Notchシグナル伝 達は多くの組織において、細胞運命の決定に関与している。 Notchの機能は、同じ機 能を持つ隣接する細胞間に作用する。
多くの場合、それは、初期の分ィ匕運命に向力 分ィ匕を阻害する。そして、その代わり に第二の代替運命に細胞を分化させ、あるいは細胞を未分化の状態にとどまらせる 。この機能は、細胞の多様性の起源である。この役割のほか、 Notchシグナルは様々 な細胞のタイプの分化を積極的に促進する。例えば、神経系において Notchシグナ ルはァスト口サイトへの分ィ匕を促進する。
分子的には、 Notchシグナルは、最初にショウジヨウバエ、次に脊椎動物において 確認された。これは、 Notch遺伝子 (非特許文献 1〜3)によりコードされている膜貫通 受容体に依存しており、それは（Deltaのような遺伝子又 ίお aggedによりコードされる )膜貫通リガンドにより賦活化される。この賦活ィ匕は一連の Notchのタンパク質分解切 断、及び CBFタンパク質に結合する、分子内に存在するフラグメントの核への転写を 制御しており、それらは併せて HES遺伝子の転写を賦活化する転写複合体として作 用する。そして、 HESはプロ-ユーロン遺伝子である MASH1の転写を阻害するの で、 Notchの細胞内での賦活ィヒにより、その神経幹細胞が神経細胞へ分化するのを 防ぐ。
その多機能により、 Notchシグナル伝達の機能障害は、腫瘍や癌、アルッノヽイマ一 病などの神経変性疾患等様々な疾患を招く（非特許文献 2〜3)。 Notchシグナル伝 達系に作用する細胞運命決定因子は、新しい医薬品のターゲットとなっている。これ まで用いられてきた戦略は、 Notchシグナル系の下流にある因子を標的にしている（ 例えば、リガンドの結合を抑制する、受容体のタンパク質分解切断を阻害する、それ の核への転写を抑制するなど)ことにより、 Notch機能を調節することを目的としている ため、これらはいずれも Notchの発現を抑制しているのものではなかった。
非特干文献 1 : S. Artavanis- Tsakonsa, M. Rand, R. Lake, Notch Signaling: Cellし ont rol and Signal Integration in Development, science Vol. 284 Page 770-776(1999) 非特許文献 2 : A. Zlobin, M. Jang, L. Miele, Toward the rational design of cell fate m odifiers: Notch signaling as a targetfor novel biopharmaceuticals . Current Pharm aceutical Biotechnology July l(l)Page 86-106 (2000)
非特許文献 3 : B. Nickoloff, B. Osborne, L. Miele Notch signaling as a therapeutic ta rget in cancer: anew approach to the development of cell fate modiiying agents. One ogene Vol 22(42) Page6598- 6608 (2003)
[0003] 細胞運命の決定は、成人期と同様に、発育期において重大な事象である。それら は細胞の増殖、分化及びアポトーシスのようなプロセスを制御する。このようなプロセ スの障害は、多くの病態の起源である。
したがって、細胞運命の決定因子の開発は、医薬品開発の主要な目的の一つとな つている。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明の目的は、 Notchl遺伝子の発現に特異的に作用する低分子化合物を提供 することである。
課題を解決するための手段
[0005] シクロへキセノン長鎖アルコールはこれまでに神経細胞の生存及び神経突起の伸 展を促進する神経栄養作用を有することが既に報告されている（Gonzales de Ag uilarら、 Brain Res (2001) 920, 65— 73)。
さらに、本発明者らは、該化合物が神経幹細胞のァストロサイトへの分ィ匕を抑制し、 神経細胞への分化を促進することを、ニューロスフェアを用いた試験で証明した (PC T:WO 02/29014 A2)。
[0006] STAT3は、多量のサイト力イン（成長因子及びホルモン）によってリン酸化されること で賦活化される。現在までに、 7種の STATファミリーが特定されており、それらの内の いくつかはかなり特異的に賦活ィ匕されうる。 STAT3の生物学的役割は、ノックアウトマ ウスや Cre— LoxP組み換えによる研究により明らかになって来ており、 STAT3が細 胞増殖、アポトーシスの抑制、及び細胞運動などの様々な生物学的機能において重 要な役割を担っていることを示している。一方、 ES (胚性幹細胞)細胞に対する STAT 3の作用は、 ES細胞の自己増殖を抑制し、分化を促進した。 STAT3シグナルの阻害 は、血液癌、乳癌、頭部癌、頸部癌などの多くの癌細胞株と相関している（Bromber g及び Darnell Oncogene (2000) 19, 2468— 2473に概説）。
[0007] 本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、下記の式（1)で表さ れるシクロへキセノン長鎖アルコールに STAT3のリン酸化抑制及び Notchlの発現抑 制作用を有していることを見出し、本発明を完成させた。
[0008] すなわち本発明は、
(1)下記の式 (1)
[化 1]
Figure imgf000005_0001
(式中、 R\ R2及び R3はそれぞれ水素原子又はメチル基を示し、 Xは炭素数 10 の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル、アルキレン又はアルケニレン基を示す） で表される化合物を有効成分として含有する STAT3リン酸化抑制剤及び Notchl発現 抑制剤、
(2)前記（1)の化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤、及び
(3)前記（1)の化合物を有効成分として含有する STATシグナル及び Notchシグナル 伝達系機能障害改善剤、
に関する。
発明の効果
[0009] 式（1)で表される化合物は、優れた STAT3のリン酸ィ匕抑制効果及び Notchl発現抑 制効果を示し、 STATシグナル及び Notchシグナル伝達系機能障害治療剤として有 用である。また、 STATシグナル及び Notchシグナル伝達系機能障害により各種腫瘍 や癌、アルツハイマー病等の神経変性疾患等の疾病が引き起こされることが明らかと なっており、式（1)で表される化合物は、各種腫瘍や癌および各種神経変性疾患の 予防 ·治療薬としても有用である。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]本発明のシクロへキセノン長鎖アルコール添加の有無による遺伝子発現の増 減を示す図である。
[図 2]本発明のシクロへキセノン長鎖アルコール添カ卩による STAT3のリン酸ィ匕抑制作 用を示す図である。
[図 3]本発明のシクロへキセノン長鎖アルコールの in vitroにおける抗腫瘍活性を示 す試験結果を示す図である。
[図 4]本発明のシクロへキセノン長鎖アルコールの ex vivoにおける抗腫瘍活性を示 す試験結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 上記式（1)中、 Xは炭素数 10〜28の直鎖状又は分岐状のアルキル、アルキレン又 はァルケ-レン基であるが、分岐状のアルキレン又はァルケ-レン基の場合の側鎖と しては炭素数 1〜10のアルキル基が挙げられる。当該側鎖アルキル基としては、例 えば、メチル基、ェチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、 se c-ブチル基、 tert-ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、 tert- ペンチル基、へキシル基、イソへキシル基、ヘプチル基、ォクチル基、ノニル基、デシ ル基、などが挙げられ、このうち特にメチル基が好ましい。また直鎖状のアルキレン基 又はァルケ-レン基 (少なくとも 1つの炭素-炭素二重結合を有するアルケン構造を 意味する）への側鎖の置換は、 3及び Z又は 7位が好ましい。これらの Xのうち、炭素 数 10〜28の直鎖状アルキル基がより好ましぐ炭素数 10〜18の直鎖状アルキル基 が特に好ましい。また、
Figure imgf000007_0001
R2及び R3はそれぞれ水素原子又はメチル基を示すが、 少なくとも 1個がメチル基である場合がより好ましい。
[0012] また、式（1)で表される化合物は、薬学的に許容される塩、又はその溶媒もしくは水 和物の形態であってもよい。またこの化合物（1)には、各種の異性体が存在し得るが 、これらの異性体も本発明に含まれる。
[0013] この式（1)で表される化合物は、公知の方法で調製することができるが、例えば特 開 2000-297034記載の製法に従って製造することができる。
[0014] また、式（1)で表される化合物は、経口投与又は非経口投与 (筋肉内、皮下又は静 脈内注射、坐薬など）のいずれでも投与できる。
[0015] 経口用製剤を調製する場合、賦形剤、さらに必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢 剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により、錠剤、被服錠剤、顆粒剤、力 プセル剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、油性又は水性の懸濁液剤などとする 。賦形剤としては、例えば、乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶 セルロースなどが挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビュルアルコール、ポリビ ニルエーテル、ェチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラ チン、シェラック、ヒドロキシプロピノレセルロース、ヒドロキシプロピノレスターチ、ポリビニ ルピロリドンなどが挙げられる。
[0016] 崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン未、結晶セルロース、炭酸カル シゥム、炭酸水素ナトリウム、クェン酸カルシウム、デキストラン、ぺクチンなどが挙げ られる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレンダリ コール、シリカ、硬化植物油などが挙げられる。着色剤としては、医薬品に添加するこ とが許可されているものが使用できる。矯味矯臭剤としては、ココア末、ノ、ッカ脳、芳 香酸、ハツ力油、竜脳、桂皮末などが使用できる。これらの錠剤や、顆粒剤には、糖 衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングしてもよい。
非経口投与の例として、注射剤を調製する場合、必要により、 pH調整剤、緩衝剤、 安定化剤、保存剤などを添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。 注射剤は、溶液を容器に収納後、凍結乾燥などによって、固形製剤として、用時調 製の製剤としてもよい。また、一投与量を容器に収納してもよぐまた、多投与量を同 一の容器に収納してもよい。
本発明の化合物の医薬としての投与量は、ヒトの場合、成人 1日当たり通常 0. 01 〜1000mg、好ましくは、 0. l〜500mgの範囲で、 1曰量を 1曰 1回、あるいは 2〜4回 に分けて投与する。
実施例
[0017] 以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも のではない。
実施例 1
[0018] 遺伝子発現試験
2, 4, 4 トリメチル 3 (15 ヒドロキシペンタデシル）一 2 シクロへキセン一 1—ォ ンによる処理
特開 2000-297034に記載の方法で合成した 2, 4, 4 トリメチルー 3 (15 ヒドロキシ ペンタデシル）一 2—シクロへキセン一 1 オンをエタノールに 10— 2Mとなるように溶 解し、望ましい濃度で培養液に加え、最終希釈が 1 lZmlとなるようにした。 2, 4, 4 —トリメチル 3 (15 ヒドロキシペンタデシル） 2 シクロへキセン一 1—オンは、細 胞培養における異なる時間及び種々の期間加えた。コントロールは、 Ι /z lZmlのェ タノールとした (この希釈濃度において、エタノールは培養液の分化に全く影響を与 えない)。各実験は、少なくとも 3回繰り返した。
[0019] ニューロスフェアの生成、維持及び分ィ匕
プロトコルは Grandbarbeら、 Development (2003) 130, 1393— 1402より採用し た。簡単に説明すると、 Tropepeら、 Dev. Biol. (1999) 208、 166— 188に記述 されているように、一次-ユーロスフェアをワイルドタイプ胚（E14. 5)の終脳から調製 し、 10ng/mlの EGFを含む、無血清培地（Reynolds及び Weiss、 Science (1992 ) 255、 1707— 1770)である「ニューロスフェア培地」での連続継代により、二次-ュ 一口スフエアとして維持した。様々な時間の増殖後、 50〜： L00個の-ユーロスフェア を 2ng/mlの EGF及び 0. 5%の FBSの存在下、ポリオル-チン（シグマ）コーティン グしたカバースリップに接種し、分化させた。
RT— PCR解析
ニューロスフェアを lOngZmlの EGFを含む「ニューロスフェア培地」中にて、様々な 条件で、異なる時間（本文に記載されているように、 RNA抽出の前に 3時間、 12時間 又は 24時間）培養した。神経細胞 (マウス 13— 14日胎児脳由来）、ァストロサイト (Wi star系ラット新生児脳由来)及びオリゴデンドロサイト (Wistar系ラット新生児脳由来)を 、 2, 4, 4 トリメチル 3 (15 ヒドロキシペンタデシル）一 2 シクロへキセン一 1— オン (又はエタノール)の存在下で 24時間培養した。 RNAは培養細胞カゝら精製し、 逆転写を行った。 3種の独立した RNAサンプルをそれぞれの実験用に調製した。 cD NAを、ニューロスフェアについては 3 μ gの全 RNAから、ァストロサイト及びオリゴデ ンドロサイト【こつ ヽて【ま 2 g、ネ申経糸田胞【こつ!/ヽて ίま 1. より、 200Uの M— MLV 逆転写酵素（Invitrogen)、 0. 5mMの dNTP (QBiogen)、 5mMの DTT (Invitrog en)、 0. 01 gZ 1のランダムへキサマー（Invitrogen)、 20Uの RNaseOUT (登 録商標）（Invitrogen)を含む 20 1の反応混合液により 37°Cで 1時間合成した。 10 分の 1の全 cDNAは、 1. 25Uの Taq DNA Polymerase (Invitrogen)、 0. 5mM の dNTPs (QBiogen)及び 0. 5 μ 1の各プライマーを含む 20 μ 1の反応混合液で増 幅した。 PCRの条件は、研究対象のプライマー及び細胞の種類ごとに調整した。プ ライマーは、ラット及びマウス検体の両者に適するように以下のように設計した。
Notchl F: 5し TGCCAAATGCCTGCCAGAAT- 3' (配列番号： 1)
Notchl R: 5，- CATGGATCTTGTCCATGCAG- 3' (配列番号： 2)
Notch2 F： 5'- GAGGCGACTCTTCTGCTGTTGAAGA- 3' (配列番号： 3)
Notch2 R: 5し ATAGAGTCACTGAGCTCTCGGACAG- 3' (配列番号： 4)
Notch3 F： 5'- ACACTGGGAGTTCTCTGTGAG- 3' (配列番号： 5)
Notch3 R: 5，- GCTGTCTGCTGGCATGGGATA- 3' (配列番号： 6)
Notch4 F： 5'- CTTCTCGTCCTCCAGCTCAT- 3' (配列番号： 7) Notch4 R: 5，- GCTGACATCAGGGGTGTCAC- 3' (配列番号： 8)
典型的なサイクル条件は、プログラムが 94°Cで 30秒、 63°Cで 30秒及び 72°Cで 2分 である HES— 5を除き、全ての研究対象の遺伝子について、 94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒及び 72°Cで 30秒だった。 PCR実験は、 2度繰り返して行った。結果は、未処理 細胞 (GAPDHに対して正規ィ匕した後、 100%に調整したコントロール条件）に対す る 2, 4, 4 トリメチル 3 (15 ヒドロキシペンタデシル）一 2 シクロへキセン一 1— オン処理済み細胞の遺伝子発現におけるパーセント表示である。 mRNAの相対量 は、 Babylmager解析及び NIHimagel. 36によって定量した。
[0021] RT— PCRによる、 Notch経路の鍵遺伝子発現の分子的な解析の結果、 2, 4, 4— トリメチル - 3 (15-ヒドロキシペンタデシル） - 2-シクロへキセン一 1 オン処理に より、他の Notch受容体（Notch2〜4)の発現レベルは変わらない一方で、 Notchlの m RNA、次いで HES5のレベルが常に減少することが分かった。
実施例 2
[0022] 2, 4, 4 トリメチル 3 (15 ヒドロキシペンタデシル） 2 シクロへキセン一 1— オン溶液 (10— 8M)を調製し、 STAT3とリン酸化 STAT3の抗体（ゥサギ由来抗 STAT3抗 体、 Cell Signaling社製）を用いて Western Blotを行い、 STAT3のリン酸化に対する 2, 4, 4 トリメチル 3 (15 ヒドロキシペンタデシル） 2 シクロへキセン一 1—オン 作用を確認した。
[0023] その結果は、図 2に示したとおり、 2, 4, 4 トリメチルー 3 (15 ヒドロキシペンタデ シル）—2—シクロへキセン— 1 オン存在下では STAT3のリン酸化物（P-STAT3)の バンドがコントロール (ィ匕合物非添加）に比べうすぐ STAT3のリン酸ィ匕が抑制されて いることが示された。
実施例 3
[0024] in vitro試験
3T3 Ras形質転換線維芽細胞のための実験プロトコル
3T3 Ras形質転換線維芽細胞を 10%FBS含有 DMEM培地で 3日間培養すると 、非形質転換細胞株との比較して「増殖巣 (foci)」の出現が認められる。
3T3 Ras形質転換線維芽細胞 (マウス由来)又は 3T3線維芽細胞 (マウス由来）を それぞれ 10, 000個 Zmlの濃度で 10%FBS含有 DMEM培地で 1日間培養する。 その後，それぞれの細胞に 10— 5Mの 2, 4, 4 トリメチル 3 (15 ヒドロキシペンタ デシル） 2 シクロへキセン一 1—オン（又はコントロールとしてエタノール）を 6日間 処理する。
軟寒天アツセィ
3T3 Ras形質転換線維芽細胞又は 3T3線維芽細胞を、 0. 625%の寒天 (DIFC O)及び 10— 6Mの 2, 4, 4 トリメチル 3 (15 ヒドロキシペンタデシル）一 2 シクロ へキセン 1 オンを含む、 5%FBS含有 DMEM培地中に 10, 000個/ mlの濃度 で培養する。
[0025] 近年、 Notchlの活性が、 Rasにより形質転換された細胞株の腫瘍性増殖巣を維持 するのに必要であることが示された。このような観察は、 Notchシグナル伝達を、腫瘍 形成 Rasのキー下流エフェクター中へ位置づけ、さらに、 Notchが新たな治療上のタ 一ゲットになる力もしれないことを確かにするものである（Weijzenら、 Nature Med . (2002) 8, 979— 986)。
Rasにより形質転換された繊維芽細胞を、 2, 4, 4 トリメチル 3 (15 ヒドロキシ ペンタデシル） 2—シクロへキセン一 1 オン（10— 6M)により処理し、未処理細胞と 比較した。非形質転換の細胞株 (処理済み及び未処理)をコントロールとして用いた 図 3より 2, 4, 4 トリメチル 3 (15 ヒドロキシペンタデシル）一 2 シクロへキセン 1 オンが、 Rasによって形質転換された細胞株の腫瘍性増殖巣 (foci)を減少させ ることが明ら力となった。この発見は、 Notchl発現の分子的な減少を伴っていた。 実施例 4
[0026] ex vivo試験
3T3 Ras形質転換線維芽細胞 (マウス由来)又は 3T3線維芽細胞 (マウス由来）を、 50 1(10— 3M)の 2, 4, 4 トリメチル 3 (15 ヒドロキシペンタデシル）一 2 シクロ へキセン 1 オンを適用して、試験管内で 3日間処理する。 2xl07個の細胞を 400 μ 1の DMEM培地に再懸濁し、 200 μ 1を 7週齢の Swiss NuZNuマウス（雄）に左 右対称に注射する。注射後 2日目、 8日目、及び 15日目に 2, 4, 4 トリメチル—3 (1 5 ヒドロキシペンタデシル） 2 シクロへキセン一 1—オンを、マウスに IP投与した
[0027] 図 4よりシクロへキセノン長鎖アルコールの投与により腫瘍の大きさが減少したこと が明らかとなった。
[0028] 本発明を特定の態様を参照して詳細に説明した力 本発明の精神と範囲を離れるこ となく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。 なお、本出願は、 2004年 10月 13日付けで出願された日本特許出願 (特願 2004 - 299415)に基づいており、その全体が引用により援用される。
産業上の利用可能性
[0029] 式（1)で表される化合物は、優れた STAT3のリン酸ィ匕抑制効果及び Notchl発現抑 制効果を示し、 STATシグナル及び Notchシグナル伝達系機能障害治療剤として有 用である。更には、各種腫瘍や癌および各種神経変性疾患の予防'治療薬として有 用である。

Claims

請求の範囲 [1] 下記の式（1)
[化 1]
Figure imgf000013_0001
(式中、
Figure imgf000013_0002
R2及び R3はそれぞれ水素原子又はメチル基を示し、 Xは炭素数 10〜28 の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル、アルキレン又はアルケニレン基を示す） で表される化合物を有効成分として含有する STAT3リン酸化抑制剤及び Notchl発現 抑制剤。
請求項 1記載の化合物を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
請求項 1記載の化合物を有効成分として含有する STATシグナル及び Notchシグナ ル伝達系機能障害改善剤。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013063504A1 (en) * 2011-10-26 2013-05-02 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Inc. Platinum compounds that inhibit constitutive stat3 signaling and induce cell cycle arrest and apoptosis of malignant cells
WO2022235932A1 (en) * 2021-05-05 2022-11-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of neuropathic pain using stat3 inhibitors

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996021438A1 (en) 1995-01-11 1996-07-18 Cornell Research Foundation, Inc. Regulating gene expression using retinoids with ch2oh or related groups at the side chain terminal position
WO1999008987A1 (en) 1997-08-13 1999-02-25 Meiji Milk Products Co., Ltd. Cyclohexenone long-chain alcohol and medicament containing same
JP2000297034A (ja) * 1999-02-10 2000-10-24 Meiji Milk Prod Co Ltd 神経変性疾患の予防又は治療薬
US20010049365A1 (en) 1998-07-16 2001-12-06 Achkar Charles C. Compositions and methods of treating abnormal cell proliferation
JP2002068973A (ja) * 2000-06-16 2002-03-08 Meiji Milk Prod Co Ltd 幹細胞分化誘導促進剤

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4169103A (en) * 1978-04-12 1979-09-25 Hoffmann-La Roche Inc. Nonatetraenoic acid derivatives

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996021438A1 (en) 1995-01-11 1996-07-18 Cornell Research Foundation, Inc. Regulating gene expression using retinoids with ch2oh or related groups at the side chain terminal position
WO1999008987A1 (en) 1997-08-13 1999-02-25 Meiji Milk Products Co., Ltd. Cyclohexenone long-chain alcohol and medicament containing same
JP2001515058A (ja) * 1997-08-13 2001-09-18 明治乳業株式会社 シクロヘキセノン長鎖アルコール及びこれを含有する医薬
US20010049365A1 (en) 1998-07-16 2001-12-06 Achkar Charles C. Compositions and methods of treating abnormal cell proliferation
JP2000297034A (ja) * 1999-02-10 2000-10-24 Meiji Milk Prod Co Ltd 神経変性疾患の予防又は治療薬
JP2002068973A (ja) * 2000-06-16 2002-03-08 Meiji Milk Prod Co Ltd 幹細胞分化誘導促進剤

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A ZLOBIN; M. JANG; L. MIELE: "Toward the rational design of cell fate modifiers: Notch signaling as a target for novel biopharmaceuticals", CURRENT PHARMACEUTICAL BIOTECHNOLOGY, vol. 1, no. 1, July 2000 (2000-07-01), pages 86 - 106
S. ARTAVANIS-TSAKONSA; M. RAND; R. LAKE: "Notch Signaling: Cell Control and Signal Integration in Development", SCIENCE, vol. 284, 1999, pages 770 - 776

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