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WO2005113742A1 - Device for regulation of the filling level of a medium in a culture vessel - Google Patents

Device for regulation of the filling level of a medium in a culture vessel Download PDF

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WO2005113742A1
WO2005113742A1 PCT/EP2005/005447 EP2005005447W WO2005113742A1 WO 2005113742 A1 WO2005113742 A1 WO 2005113742A1 EP 2005005447 W EP2005005447 W EP 2005005447W WO 2005113742 A1 WO2005113742 A1 WO 2005113742A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
medium
drain
culture
culture vessel
vessel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2005/005447
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Jürgen OSTWALD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Rostock
Original Assignee
Universitaet Rostock
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet Rostock filed Critical Universitaet Rostock
Publication of WO2005113742A1 publication Critical patent/WO2005113742A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/10—Petri dish
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/44—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of volume or liquid level

Definitions

  • the present invention relates to a device for regulating the fill level of the medium in a culture vessel, in which the desired fill level of the medium can be set, and to the use of this device for cell or tissue culture.
  • This device is especially for perfusion culture
  • a continuous medium exchange allows a particularly dense culture of cells.
  • a discontinuous medium ⁇ change affects many especially sensitive cells negative because fluctuations in nutrient concentration, pH, temperature and other factors may occur. With continuous exchange of medium, the cells are cultivated rather under conditions that resemble physiological conditions.
  • a further advantage in particular for longer lasting cultivations continuous culture media with a defined height is that by eliminating the frequent opening of the culture vessel for the discontinuous media ⁇ changing the risk of contamination is reduced.
  • a third advantage of the continuous culture in contrast to the discontinuous variant with longer cultivation times is that the workload is reduced.
  • Cell culture has a particular advantage if the height of the surface of the medium can be kept constant when exchanging medium. This is not always guaranteed in the case of discontinuous medium changes, for example due to possible evaporation.
  • a constant height of the surface of the medium is important for every cell culture in order to allow an optimal ratio of medium volume to the gas space above the medium and thus an optimal gas exchange.
  • precise height regulation is particularly important. For example, for the culture of various epithelia, e.g.
  • the liquid-air culture differs from the submerged culture in that the cells are cultivated at the interface between medium and air, so that a supply of medium is possible from below and there is contact with air from above.
  • the in vi tro generation of skin ⁇ equivalent is generally carried out in the liquid-air culture.
  • An apparatus for automatically regulating the fill level of the culture medium in the culture vessel can include electronic regulating the fill level with medium (cf., for example, DE 198 01 763).
  • medium cf., for example, DE 198 01 763.
  • an apparatus for controlling the height of the surface of medium in a culture ⁇ vessel, wherein the medium is supplied in a culture vessel by at least one inflow and at least one drain, the opening of which on the desired height of the surface of the medium is located, medium is removed cf. US 5, 565,353
  • the object of the invention is therefore to provide a device in which the desired fill level of the medium in the culture vessel can be set.
  • Such a device can also be used completely independently of the liquid-air culture if an exchange of medium in a culture vessel is desired with a constant but selectively adjustable filling level with medium.
  • an apparatus which comprises a culture vessel for cell and tissue culture, which comprises at least one inflow and at least one outflow for medium, the height of the outflow opening (s) within the culture vessel is adjustable.
  • culture vessel for cell and tissue culture means any vessel that is suitable for the culture of cells or tissues, preferably eukaryotic cells or tissues.
  • the culture vessel preferably consists of a material that is suitable for the culture of cells is suitable, in particular from a plastic or glass coated for cell culture.
  • the culture vessel preferably has the basic shape of a Petri dish, but other shapes are also possible, for example a rectangular outline or the shape of cell culture bottles.
  • the culture vessel should be designed in such a way that a sterile culture The cells should be sterile. For this purpose, visual and microscopic control of the cell culture in the closed culture vessel is preferred.
  • the culture vessel must at least partially consist of a transparent material, such as glass or plastic.
  • the advantages of this invention come in particular strong to wear when the culture vessel is relatively small, e.g. has less than 300, 200, 100 or 50 cm 2 base area.
  • the culture vessel preferably comprises an inlet and an outlet with an outlet opening. If, for example, several drains are included, at least the height of the lowest drain opening must be adjusted to regulate the fill level. The height of several drains can of course also be adjusted together.
  • medium is understood to mean any liquid which is contained in the cell for the culture of cells and whose filling level is to be adjusted. It is preferred to use a classic cell culture medium such as DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium), RPMI-Mediu (Roswell Park Memorial Institute), Iscove's Medium, etc., possibly with additives such as fetal calf serum, growth factors or antibiotics, but medium is also another liquid that is generally compatible with cell culture, such as PBS (Phosphate buffered saline)
  • solutions for detaching cells such as trypsin / EDTA, are also referred to as the medium, since the devices according to the invention are also particularly suitable for changing liquids in the culture vessel Different culture media can be made using the device.
  • the invention relates in particular to a device in which the drain opening is part of a drain connector.
  • the drain opening is the opening of the drain connection, which is located inside the culture vessel.
  • the drain connector is suitable for the passage of liquids.
  • the drain port is a pipe or hose.
  • the Drain connector has a round inner cross section.
  • the drain opening is preferably located at one end of the drain connector, but it can also be attached to the side if the end is closed. This can be useful if it is desired that the fill level of the medium cannot be set as desired, but, for example, that there should always be a certain minimum fill level. In this case, part of the drain connector can serve as a spacer.
  • the drain pipe is preferably guided through a seal in a wall of the culture vessel.
  • the wall of the culture vessel is the entire casing of the culture vessel, i.e. the side wall or side walls and the top and bottom of the culture vessel, i.e. also cover (as far as e.g. the top is designed as a removable cover) and bottom.
  • a seal rests on the drain pipe and provides a seal against the wall of the culture vessel.
  • a seal therefore ensures, insofar as it is in use in the area of the cell culture device, which is not filled with medium, for a sterile seal against the outside of the culture vessel, which does not have to be sterile. If the seal is in the area which is filled with medium, the seal must continue to prevent the medium from escaping, that is to say to form a seal which is sealed with respect to the medium.
  • the seal used is preferably suitable for both purposes.
  • a simple form of such a seal is elastic and therefore bears against both the drain pipe and the culture vessel.
  • Rubber or silicone seals are well known to those skilled in the art.
  • a possibly greased glass cut or the like may also be suitable, provided that a seal that is sealed against the medium is not required.
  • the seal is of a suitable size so that the drain port is movable in it.
  • the drain port is movably guided in the vertical direction through the top or bottom of the culture vessel.
  • the discharge nozzle is preferably guided through a seal on the top of the culture vessel.
  • the top of the culture vessel can be a lid, for example in the case of a petri dish.
  • the discharge nozzle preferably projects out of the culture vessel and over the seal. Then the discharge nozzle and with it the height of the discharge opening can be moved particularly easily without opening the vessel, which is always associated with the risk of contamination.
  • the length by which the drainage nozzle protrudes depends on the vertical movement of the drainage nozzle on how the height of the drainage opening is set.
  • the length by which the drain pipe can protrude from the culture vessel to a maximum or a minimum influences how far the level of the medium in the culture vessel should be able to be adjusted. This height can preferably be set as desired.
  • the drain socket should therefore be long enough that it protrudes from the culture vessel and over the seal at every setting.
  • drain socket for example with a stop below and / or above the vessel wall or the seal, in such a way that inadvertent excessive pushing in and / or complete removal of the drain socket is prevented.
  • the seal is an elastic piece of tubing which is connected at its lower end to a holder attached to the top of the culture vessel.
  • This holder can be designed differently, for example, an upwardly directed edge is possible around an opening, onto which the tube piece can be pushed.
  • the holder can be made from the same material as the culture vessel or from another suitable material consist.
  • the holder can be drawn homogeneously from the material on the top of the culture vessel (e.g. from glass) or appropriately shaped from the same or another suitable material and glued airtight via a hole in the top (e.g. with silicone adhesive, epoxy resin adhesive). At the upper end of the piece of tubing, this rests on the part of the drain connection which protrudes from the culture vessel.
  • FIG. 1 A device comprising such a culture vessel is shown schematically in FIG. 1.
  • the device is designed in such a way that the drain opening is part of a drain socket which comprises a non-movable part which is fixedly connected to the culture vessel and projects into the interior of the culture vessel, and a piece of hose which acts as a movable part of the drain nozzle on the non-movable one Part is plugged in and includes the drain opening.
  • the seal does not have to be formed separately, since its function is performed by the drain connector itself.
  • the height of the drain opening is adjustable by pushing the movable part more or less far onto the immovable part. In this embodiment, the height is not adjustable from the outside, but from inside the culture vessel.
  • sterile tweezers can be used to ensure the sterility of the inside of the vessel. If the vessel has a removable lid, this can be removed for adjustment, but also, for example, through the opening Such adjustment is possible in a cell culture bottle.
  • plugging into a connected part is equivalent to plugging onto a connected part, whereby a flow of the medium must be ensured.
  • the discharge nozzle preferably projects from above or from below into the interior of the culture vessel.
  • the movable and immovable part of the drain socket should have a straight basic shape.
  • the immovable part of the drain socket protrudes from a side wall into the interior of the culture vessel and can be angled or bent, the movable part having a straight shape.
  • a device comprising such a culture vessel is shown schematically in FIG. 2.
  • the drain opening is part of a drain connection which is angled or bent and is guided through a side wall of the culture vessel, the height of the drain opening being adjustable by rotating the drain connection. An angle of approximately 90 ° is preferred. If the drain pipe is guided through a seal and protrudes beyond the wall of the culture vessel and the seal, the height of the drain opening can be adjusted from the outside.
  • the drain opening can be part of a drain connection which comprises a straight, non-movable part which is fixedly connected to the culture vessel and which projects into the interior of the culture vessel, and an angled or bent hose piece which, as a movable part of the drain connection, rests on the non-movable part is attached and includes the drain opening. Then the height of the drain opening as described above, e.g. with tweezers, adjustable by rotating the moving part.
  • the supplied medium disturbs the surface of the medium, which can be disadvantageous, for example, for a liquid-air culture, or that Medium injected at the intake of the side walls or the top of the culture vessel, the culture vessel so out ⁇ forms should be that the inflow and the inflow opening is located below the opening of the drain, the gef the level of the culture medium with SLI determined.
  • the inflow opening can be an opening directly in the wall of the culture vessel, optionally with a holder for a hose to be fastened or a pipe connection.
  • the inflow opening can also be part of an inflow nozzle which is guided through a wall of the culture vessel, optionally by means of a seal or permanently connected to it.
  • an inflow nozzle is guided near the bottom of the vessel through a seal in a side wall.
  • An inflow nozzle can, if, for example, a petri dish or another standardized culture vessel is used, can also be passed through the cover. If the drain connection is also passed through the cover, such a cover, which comprises the drain and inflow essential to the invention, can be used in combination with any suitable petri dish lower part.
  • the invention also relates to an apparatus which further comprises a fresh medium storage vessel connected to the inflow and further comprising an old medium collecting vessel connected to the drain.
  • these vessels are preferably cooled.
  • the storage vessel with fresh medium can also e.g. be kept at the desired temperature of the cell culture if the cells are sensitive to temperature changes.
  • a collection container is not absolutely necessary, since the old medium that was in contact with the cells can also be discarded immediately.
  • the respective connection between the inflow and outflow and the storage or collecting vessel can be, for example, a pipe connection, but hoses are preferred because of their flexibility.
  • the device thus preferably further comprises at least one Hose connected to an inflow and at least one hose connected to an outlet.
  • at least one hose used on the device is made of silicone, preferably all hoses used.
  • the invention also relates to a device which further comprises at least one pump.
  • One pump can control the inflow of the medium and a second pump, or the same pump, can control the outflow of the medium.
  • the inflow and outflow of the medium can also e.g. are driven by gravity by placing the storage vessel with new medium over the culture vessel and the collection vessel under the culture vessel.
  • the amount of medium supplied must not exceed the amount of medium removed after filling the vessel to the desired height, since otherwise the level does not remain constant, but instead increases. Therefore, the amount of inflowing and outflowing medium must be coordinated.
  • the amount of the removed medium After the first filling of the culture vessel, the amount of the removed medium then automatically corresponds to the amount of the added medium, since, due to the design principle of the device, no more medium can be removed than can be supplied.
  • the inlet opening (s) and the outlet opening (s), the outlet connection (s), hoses and pump output (s) of the device are preferably designed and matched to one another such that the amount of the medium which can be removed is at least as large as or greater than that Amount of feedable Medium.
  • the capacity of all outflows is preferably greater than the capacity of all inflows.
  • the inflow and outflow of medium are preferably coupled via the same peristaltic pump.
  • the principle of the peristaltic pump is based on the marks or squeezing a 'flexible pump hose at one or more locations and by moving the reducency point in the desired conveying direction of the liquid.
  • the movement of the pressed point is realized with the help of a pump rotor, on the circumference of which there are roller-shaped rotor rollers.
  • the inner diameter of the hose determines the delivery rate.
  • the delivery rate is the same.
  • the inside diameter of the hose connected to the outflow is therefore preferably at least as large as the inside diameter of the hose connected to the inflow.
  • the inner diameter of the hose connected to the outflow is particularly preferably larger than the inner diameter of the hose connected to the inflow, since an inner diameter given as the same often leads to problems in practice, since the diameter of the hoses, which are generally used as inflows or outflows , are often not exactly the same.
  • the diameter of the pumping hoses in the peristaltic pump is decisive, so that the "pumping" hose has a slightly larger diameter than the " should have pumping "hose.
  • the other hoses e.g. from storage vessels to the pump, from the pump to the culture vessel
  • the device according to the invention is suitable for being used for cell and tissue culture. The invention therefore relates to the use of the device for cell and tissue culture, and to a method for cell or tissue culture, in which the culture is carried out in a device according to the invention.
  • the culture vessel is preferably placed in a suitable incubator, the temperature and CO 2 content of which can be optimally adjusted for the cultivated cells.
  • the cultured cells are preferably eukaryotic cells.
  • this device is used to cultivate cells that grow adherently or in the tissue.
  • the device can also be used for the culture of cells which do not grow adherently, since these cells also sediment shortly after sowing and are therefore only lost to a small extent in the exchange of medium. It is advisable not to choose an exchange rate that is too high.
  • the cells can adhere to the bottom of the culture vessel.
  • the cells can also e.g. in liquid air culture, e.g. the liquid-air culture of epithelium, attached to a matrix that can be introduced into the boundary layer between medium and air.
  • the cells bound or adhered to a matrix can also be submerged, either lying on the bottom of the culture vessel or held by a device above the bottom of the culture vessel.
  • the supply of nutrients is particularly important for the optimal culture of tissue, for example for transplantation, so that the device according to the invention is particularly suitable for this.
  • Various pieces of fabric may be in a culture vessel, are cultured in a petri dish, for example, the dene in various ⁇ compartments is divided. These do not prevent that Exchange of medium, however, enable the simultaneous cultivation of different defined tissue pieces without mixing them.
  • Compartmentalized means that the bottom of the vessel is divided by webs or the like so that different samples can be placed in the resulting compartments ("troughs") and do not mix during transport / movement of the culture vessel. The height of the webs is kept so that it is clearly below the height of the medium. The webs can be slidably attached.
  • the compartmentalization allows the comparative cultivation of, for example, cells that adhere to matrices made of different materials or of different tissue samples under otherwise identical conditions and allows the samples to be assigned reliably.
  • the device according to the invention is used to automatically or continuously harvest a soluble product which the cultured cells release into the cell culture medium.
  • the culture of the cells or of the tissue can thus be carried out with continuous or discontinuous exchange of medium.
  • the desired soluble product is obtained from the old medium vessel by purifying it.
  • the old medium does not necessarily have to be a waste product.
  • the cultured cells can be hybridoma cells that produce monoclonal antibodies.
  • This invention thus also provides a method for the production of antibodies or other soluble cell products which requires only a small amount of work due to the automation.
  • Other soluble products can be, for example, proteins that are expressed by the cells, the cells preferably being genetically modified for the expression of these proteins.
  • the cultured cells can also be fibroblasts or other cells, the culture supernatant of which is conveyed as a "conditioned medium" either directly or via a buffer vessel, preferably stored in a cool place, into a second culture vessel with other cells / tissues.
  • 11 culture vessel, 12: inflow, 13: discharge opening, 14: movable part of a drain connection, 15: non-movable part of a drain connection, 16: fill level of the medium in the culture container, 17: storage container with fresh medium, 18: collecting container for old medium, 19: lid of the culture vessel, 20: elastic hose, 21: holder, 22/22 ⁇ : drainage connection, 23: hose pump
  • Fig. 1 Device for automatic control of the level of the medium in a culture vessel, in which the drain port is guided by a seal on the top of the culture vessel.
  • Fig. 2 Device for automatically regulating the height of the surface of the medium, in which the drainage pipe is guided through a seal on the side wall of the culture vessel, a movable piece of hose being pushed onto a non-movable, angled part of the drainage pipe.
  • Fig. 3 Device for controlling the height of the surface of the medium in a culture vessel
  • A The main components of an embodiment of the system, peristaltic pump, storage and drainage vessel (usually in the refrigerator) and the culture vessel with suction of the medium from above are shown.
  • the illustration shows in detail an open culture vessel (petri dish) with suction from above.
  • a suitable device e.g. cells are grown indirectly on a matrix.
  • the chambers shown in the Petri dish do not prevent the exchange of medium, but allow the culture of defined cells or tissues in the different chambers.
  • FIG. C Shown is an open culture vessel (petri dish) with suction from below, into which e.g. a device for receiving or depositing matrix materials with cells can be introduced.
  • the device shown in the picture above consists of a mesh made of stainless steel, which stands on metal feet.
  • Fig. 4 Culture of fibroblasts under discontinuous (A) or continuous (B) media change Examples
  • FIG. 4A and B show fibroblasts after the same culture time, which were cultivated on a collagenized network (mesh size 150 ⁇ m). It can be seen that the cells from the culture with a continuous exchange of the medium (FIG. 4B) are denser - that is, they have proliferated more than with a discontinuous medium change (FIG. 4A).

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Abstract

The invention relates to a device for regulation of the filling level of a medium in a culture vessel (11), in which the desired filling level of the medium may be adjusted and the use of said device for cell or tissue culture.

Description

Vorrichtung .zur Regelung des Füllstands von Medium in einem Kulturgefäß Device for regulating the fill level of medium in a culture vessel

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Regelung des Füllstandes des Mediums in einem Kulturgefäß, bei der der gewünschte Füllstandes des Mediums einstellbar ist, sowie die Verwendung dieser Vorrichtung zur Zeil- oder Gewebekultur.The present invention relates to a device for regulating the fill level of the medium in a culture vessel, in which the desired fill level of the medium can be set, and to the use of this device for cell or tissue culture.

Diese Vorrichtung ist besonders zur PerfusionskulturThis device is especially for perfusion culture

(kontinuierlicher Zufluß und Abfluß von Medium) geeignet und wurde auf der Grundlage gebräuchlicher Zellkulturgefäße entwickelt. Ein automatischer, kontinuierlicher Austausch von Medium hat gegenüber einem diskontinuierlichen Mediumwechsel (continuous inflow and outflow of medium) and was developed on the basis of common cell culture vessels. An automatic, continuous exchange of medium has a discontinuous medium change

bei visueller Kontrolle bei der Zellkultur mehrere Vorteile, die sich insbesondere bei längeren Kulturzeiten mit öfterem Medienwechsel bemerkbar machen. Einen Vorteil stellt die optimale, konstante Versorgung mit Nährstoffen und der konstante Abtransport von toxischen StoffWechselprodukten dar. Ein kontinuierlicher Mediumaustausch erlaubt eine besonders dichte Kultur von Zellen. Ein diskontinuierlicher Medium¬ wechsel beeinflußt viele vor allem empfindliche Zellen negativ, da Schwankungen in Nährstoffkonzentration, pH-Wert, Temperatur und weiteren Faktoren auftreten können. Die Zellen werden bei kontinuierlichem Austausch von Medium eher unter Bedingungen kultiviert, die physiologischen Bedingungen ähneln .with visual control in cell culture, there are several advantages that are particularly noticeable during longer culture times with frequent media changes. An advantage is the optimal, constant supply of nutrients and the constant removal of toxic metabolic products. A continuous medium exchange allows a particularly dense culture of cells. A discontinuous medium ¬ change affects many especially sensitive cells negative because fluctuations in nutrient concentration, pH, temperature and other factors may occur. With continuous exchange of medium, the cells are cultivated rather under conditions that resemble physiological conditions.

Ein weiterer Vorteil insbesondere bei länger andauernden Kultivierungen einer kontinuierlichen Kultur mit definierter Medienhöhe besteht darin, dass durch Wegfall des häufigen Öffnens des Kulturgefäßes zum diskontinuierlichen Medien¬ wechsel die Gefahr der Kontamination sinkt.A further advantage in particular for longer lasting cultivations continuous culture media with a defined height is that by eliminating the frequent opening of the culture vessel for the discontinuous media ¬ changing the risk of contamination is reduced.

Ein dritter Vorteil der kontinuierlichen Kultur im Gegensatz zur diskontinuierlichen Variante bei längeren Kulturzeiten besteht darin, daß der Arbeitsaufwand reduziert ist.A third advantage of the continuous culture in contrast to the discontinuous variant with longer cultivation times is that the workload is reduced.

Ein besonderer Vorteil ergibt sich bei der Zellkultur, wenn beim Austausch von Medium die Höhe der Oberfläche des Mediums konstant gehalten werden kann. Dies ist bei diskontinuier- lichem Mediumwechsel z.B. wegen möglicher Verdunstung nicht immer gewährleistet. Prinzipiell ist eine konstante Höhe der Oberfläche des Mediums für jede Zellkultur wichtig, um ein optimales Verhältnis von Mediumvolumen zu dem Gasraum über dem Medium und damit einen optimalen Gasaustausch zu erlauben. Für einige spezielle Anwendungen ist eine genaue Regulation der Höhe jedoch besonders wichtig. Zum Beispiel wurde für die Kultur verschiedener Epithelien, z.B. von Cornea (Richard et al . , Curr Eye Res 1991, 10, 739- 749) oder von respiratorischem Epithel (Rhee et al., Ann Otol Rhinol Laryngol 2001, 110, 1011-1016; Yamaguchi, Arch Oto- laryngol Head Neck Surg 1996, 122, 649-654) gezeigt, dass eine Liquid-Air-Kultur diesem Gewebes im Vergleich zur subπversen Kultur eine stärkere zelluläre Differenzierung erlaubt.Cell culture has a particular advantage if the height of the surface of the medium can be kept constant when exchanging medium. This is not always guaranteed in the case of discontinuous medium changes, for example due to possible evaporation. In principle, a constant height of the surface of the medium is important for every cell culture in order to allow an optimal ratio of medium volume to the gas space above the medium and thus an optimal gas exchange. For some special applications, however, precise height regulation is particularly important. For example, for the culture of various epithelia, e.g. from Cornea (Richard et al., Curr Eye Res 1991, 10, 739-749) or from respiratory epithelium (Rhee et al., Ann Otol Rhinol Laryngol 2001, 110, 1011-1016 ; Yamaguchi, Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1996, 122, 649-654) showed that a liquid-air culture allows a stronger cellular differentiation compared to the subπvers culture.

Von der submersen Kultur unterscheidet sich die Liquid-Air- Kultur dadurch, dass die Zellen hier an der Grenzfläche zwi- sehen Medium und Luft kultiviert werden, so dass von unten eine Versorgung mit Medium möglich ist und von oben Kontakt zu Luft besteht. Auch die in vi tro Generation von Haut¬ äquivalenten erfolgt im allgemeinen in der Liquid-Air-Kultur.The liquid-air culture differs from the submerged culture in that the cells are cultivated at the interface between medium and air, so that a supply of medium is possible from below and there is contact with air from above. The in vi tro generation of skin ¬ equivalent is generally carried out in the liquid-air culture.

Eine Apparatur zur automatischen Regelung des Füllstandes des Kulturmediums in dem Kulturgefäß kann eine elektronische Regelung des Füllstands mit Medium umfassen (vgl. z.B. DE 198 01 763) . Einfacher ist jedoch der Einsatz einer Apparatur zur Regelung der Höhe der Oberfläche von Medium in einem Kultur¬ gefäß, bei der durch mindestens einen Zufluß Medium in ein Kulturgefäß zugeführt wird und durch mindestens einen Abfluß, dessen Öffnung sich auf der gewünschten Höhe der Oberfläche des Mediums befindet, Medium abgeführt wird (vgl. US 5, 565,353) .An apparatus for automatically regulating the fill level of the culture medium in the culture vessel can include electronic regulating the fill level with medium (cf., for example, DE 198 01 763). However easier to use an apparatus for controlling the height of the surface of medium in a culture ¬ vessel, wherein the medium is supplied in a culture vessel by at least one inflow and at least one drain, the opening of which on the desired height of the surface of the medium is located, medium is removed (cf. US 5, 565,353).

Probleme ergeben sich jedoch bei der Verwendung einer solchen Apparatur dann, wenn die gewünschte Höhe der Oberfläche des Mediums variabel sein soll, z.B. um verschiedene Kulturbedingungen bei einer submersen und einer nachfolgenden Liquid-Air-Kultur von Epithelzellen, bei der die Zellen an der Grenzfläche zwischen Medium und Luft kultiviert werden sollen, zu erreichen. Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, bei der der gewünschte Füllstands des Mediums in dem Kulturgefäß einstellbar ist. Eine solche Vorrichtung kann auch völlig unabhängig von der Liquid-Air-Kultur verwendet werden, wenn ein Austausch von Medium in einem Kulturgefaß bei konstanter, aber gezielt einstellbarer Füllhohe mit Medium, erwünscht ist.However, problems arise when using such an apparatus when the desired height of the surface of the medium is to be variable, for example about different culture conditions in a submerged and a subsequent liquid-air culture of epithelial cells, in which the cells at the interface between Medium and air should be cultivated to achieve. The object of the invention is therefore to provide a device in which the desired fill level of the medium in the culture vessel can be set. Such a device can also be used completely independently of the liquid-air culture if an exchange of medium in a culture vessel is desired with a constant but selectively adjustable filling level with medium.

Dieses Problem wird durch den Gegenstand der Ansprüche 1 bis 22 gelöst.This problem is solved by the subject matter of claims 1 to 22.

Um die gewünschte Höhe des Füllstands eines Kulturgefäßes mit Kulturmedium einzustellen, wird eine Vorrichtung bereitgestellt, die ein Kulturgefäß zur Zeil- und Gewebekultur umfaßt, das mindestens einen Zufluß und mindestens einen Abfluß für Medium umfaßt, wobei die Höhe der Abflußöffnung (en) innerhalb des Kulturgefäßes verstellbar ist.In order to set the desired level of the filling level of a culture vessel with culture medium, an apparatus is provided which comprises a culture vessel for cell and tissue culture, which comprises at least one inflow and at least one outflow for medium, the height of the outflow opening (s) within the culture vessel is adjustable.

Unter „Kulturgefäß zur Zeil- und Gewebekultur" wird im Rahmen dieser Anmeldung jedes Gefäß verstanden, dass zur Kultur von Zellen oder Gewebe, bevorzugt eukaryontischen Zellen bzw. Geweben, geeignet ist. Das Kulturgefäß besteht bevorzugt aus einem Material, das für die Kultur von Zellen geeignet ist, insbesondere aus einem zur Zellkultur beschichteten Kunststoff oder Glas. Bevorzugt hat das Kulturgefäß die Grundform einer Petrischale, aber auch andere Formen, z.B. ein rechteckiger Grundriß oder die Form von Zellkulturflaschen ist möglich. Das Kulturgefäß sollte so ausgeführt sein, dass eine sterile Kultur der Zellen möglich ist. Dafür sollte es steril verschließbar sein. Bevorzugt ist die visuelle und mikroskopische Kontrolle der Zellkultur in dem geschlossenen Kulturgefäß möglich. Dazu muß das Kulturgefäß zumindest teilweise aus einem transparenten Material, etwa Glas oder Kunststoff, bestehen.In the context of this application, “culture vessel for cell and tissue culture” means any vessel that is suitable for the culture of cells or tissues, preferably eukaryotic cells or tissues. The culture vessel preferably consists of a material that is suitable for the culture of cells is suitable, in particular from a plastic or glass coated for cell culture. The culture vessel preferably has the basic shape of a Petri dish, but other shapes are also possible, for example a rectangular outline or the shape of cell culture bottles. The culture vessel should be designed in such a way that a sterile culture The cells should be sterile. For this purpose, visual and microscopic control of the cell culture in the closed culture vessel is preferred. For this purpose, the culture vessel must at least partially consist of a transparent material, such as glass or plastic.

Die Vorteile dieser Erfindung, z.B. die Unnόtigkeit einer elektronischen Steuerung des Füllstands, kommen besonders stark zum Tragen, wenn das Kulturgefäß relativ klein ist, also z.B. weniger als 300, 200, 100 oder 50 cm2 Grundfläche hat. Das erfindungsgemäße Prinzip ist jedoch auch für größere Kulturgefäße genauso anwendbar. Bevorzugt umfaßt das Kulturgefäß einen Zufluß und einen Abfluß mit einer Abflußöffnung. Sind z.B. mehrere Abflüsse enthalten, so muss für eine Regelung des Füllstandes mindestens die Höhe der untersten Abflußöffnung verstellt werden. Die Höhe mehrerer Abflüsse kann selbstverständlich auch gemeinsam verstellt werden.The advantages of this invention, for example the unnecessary need for electronic control of the fill level, come in particular strong to wear when the culture vessel is relatively small, e.g. has less than 300, 200, 100 or 50 cm 2 base area. However, the principle according to the invention can also be used for larger culture vessels as well. The culture vessel preferably comprises an inlet and an outlet with an outlet opening. If, for example, several drains are included, at least the height of the lowest drain opening must be adjusted to regulate the fill level. The height of several drains can of course also be adjusted together.

Unter „Medium" wird im Rahmen dieser Anmeldung jede Flüssigkeit verstanden, die in dem Gefäß zur Kultur von Zellen enthalten ist, und deren Füllhöhe eingestellt werden soll. Dabei wird es sich bevorzugt um ein klassisches Zellkultur- medium, wie z.B. DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium), RPMI- Mediu (Roswell Park Memorial Institute), Iscove's Medium, etc. handeln, gegebenenfalls mit Zusätzen wie z.B. Fetalem Kälberserum, Wachstumsfaktoren oder Antibiotika. Unter Medium wird jedoch auch eine andere, im Allgemeinen für die Zellkultur verträgliche Flüssigkeit wie z.B. PBS (Phosphate buffered saline) verstanden. Auch Lösungen etwa zum Ablösen von Zellen, wie z.B. Trypsin/EDTA werden im Rahmen dieser Erfindung als Medium bezeichnet, da die erfindungsgemäße Vorrichtungen auch besonders zum Wechseln von Flüssigkeiten in dem Kulturgefäß geeignet ist. Auch ein gradueller Austausch von verschiedenen Kulturmedien kann mit Hilfe der Vorrichtung vorgenommen werden.In the context of this application, “medium” is understood to mean any liquid which is contained in the cell for the culture of cells and whose filling level is to be adjusted. It is preferred to use a classic cell culture medium such as DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium), RPMI-Mediu (Roswell Park Memorial Institute), Iscove's Medium, etc., possibly with additives such as fetal calf serum, growth factors or antibiotics, but medium is also another liquid that is generally compatible with cell culture, such as PBS (Phosphate buffered saline) Also within the scope of this invention, solutions for detaching cells, such as trypsin / EDTA, are also referred to as the medium, since the devices according to the invention are also particularly suitable for changing liquids in the culture vessel Different culture media can be made using the device.

Gegenstand der Erfindung ist insbesondere eine Vorrichtung, bei der die Abflußöffnung Teil eines Abflußstutzens ist. Die Abflußöffnung ist die Öffnung des Abflußstutzens, die sich im Inneren des Kulturgefäßes befindet. Der Abflußstutzen ist zum Durchleiten von Flüssigkeiten geeignet. Im Allgemeinen ist der Abflußstutzen ein Rohr oder Schlauch. Bevorzugt hat der Abflußstutzen einen runden Innenquerschnitt. Die Abflußöffnung befindet sich bevorzugt an einem Ende des Abflußstutzens, sie kann jedoch, bei einem verschlossenen Ende, auch seitlich angebracht sein. Dies kann sinnvoll sein, wenn erwünscht ist, dass der Füllstand des Mediums nicht beliebig einstellbar ist, sondern z.B. immer ein gewisser Mindest-Füllstand vorliegen soll. In diesem Fall kann ein Teil des Abflußstutzens als Abstandshalter dienen.The invention relates in particular to a device in which the drain opening is part of a drain connector. The drain opening is the opening of the drain connection, which is located inside the culture vessel. The drain connector is suitable for the passage of liquids. Generally, the drain port is a pipe or hose. Preferably the Drain connector has a round inner cross section. The drain opening is preferably located at one end of the drain connector, but it can also be attached to the side if the end is closed. This can be useful if it is desired that the fill level of the medium cannot be set as desired, but, for example, that there should always be a certain minimum fill level. In this case, part of the drain connector can serve as a spacer.

Der Abflußstutzen ist bevorzugt durch eine Dichtung in einer Wand des Kulturgefäßes geführt. Als Wand des Kulturgefäßes wird die gesamte Hülle des Kulturgefäßes bezeichnet, also die Seitenwand oder Seitenwände sowie Oberseite und Unterseite des Kulturgefäßes, d.h. auch Deckel (soweit z.B. die Oberseite als abnehmbarer Deckel ausgebildet ist) und Boden.The drain pipe is preferably guided through a seal in a wall of the culture vessel. The wall of the culture vessel is the entire casing of the culture vessel, i.e. the side wall or side walls and the top and bottom of the culture vessel, i.e. also cover (as far as e.g. the top is designed as a removable cover) and bottom.

Eine Dichtung liegt an dem Abflußstutzen an und sorgt für einen Abschluß gegenüber der Wand des Kulturgefäßes. Eine Dichtung sorgt daher, soweit sie sich bei Gebrauch der Vorrichtung zur Zellkultur in dem Bereich befindet, der nicht mit Medium gefüllt ist, für einen sterilen Abschluß gegenüber der Außenseite des Kulturgefäßes, die nicht steril sein muß. Befindet sich die Dichtung in dem Bereich, der mit Medium gefüllt ist, muss die Dichtung weiterhin ein Auslaufen des Mediums verhindern, also einen gegenüber dem Medium dichten Abschluß bilden. Bevorzugt ist die verwendete Dichtung für beide Zwecke geeignet.A seal rests on the drain pipe and provides a seal against the wall of the culture vessel. A seal therefore ensures, insofar as it is in use in the area of the cell culture device, which is not filled with medium, for a sterile seal against the outside of the culture vessel, which does not have to be sterile. If the seal is in the area which is filled with medium, the seal must continue to prevent the medium from escaping, that is to say to form a seal which is sealed with respect to the medium. The seal used is preferably suitable for both purposes.

Eine einfache Form einer solchen Dichtung ist elastisch und liegt daher sowohl an dem Abflußstutzen als auch dem Kulturgefäß an. Dichtungen aus Gummi oder Silikon sind dem Fachmann gut bekannt. Auch ein möglicherweise gefetteter Glasschliff o.a. kann jedoch geeignet sein, soweit ein gegenüber Medium dichter Abschluß nicht erforderlich ist. Die Dichtung hat eine geeigneter Größe, so daß der Abflußstutzen in ihr beweglich ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Abflußstutzen in vertikaler Richtung beweglich durch die Unter- oder Oberseite des Kulturgefäßes geführt. Bevorzugt ist der Abflußstutzen durch eine Dichtung an der Oberseite des Kulturgefaßes geführt. Die Oberseite des Kulturgefäßes kann, beispielsweise bei einer Petrischale, ein Deckel sein.A simple form of such a seal is elastic and therefore bears against both the drain pipe and the culture vessel. Rubber or silicone seals are well known to those skilled in the art. A possibly greased glass cut or the like may also be suitable, provided that a seal that is sealed against the medium is not required. The seal is of a suitable size so that the drain port is movable in it. In a preferred embodiment of the invention, the drain port is movably guided in the vertical direction through the top or bottom of the culture vessel. The discharge nozzle is preferably guided through a seal on the top of the culture vessel. The top of the culture vessel can be a lid, for example in the case of a petri dish.

Bevorzugt ragt der Abflußstutzen aus dem Kulturgefäß und über die Dichtung heraus. Dann kann der Abflußstutzen und mit ihm die Hohe der Abflußöffnung besonders leicht verschoben werden, ohne dass dafür ein Öffnen des Gefäßes notwendig wäre, das stets mit der Gefahr von Kontamination verbunden ist. Die Länge, um die der Abflußstutzen herausragt, ist bei einer vertikalen Beweglichkeit des Abflußstutzens davon abhängig, wie die Höhe der Abflußöffnung eingestellt ist. Die Länge, um die der Abflußstutzen maximal oder minimal aus dem Kulturgefäß herausragen kann, beeinflußt, wie weit die Höhe des Füllstandes des Mediums in dem Kulturgefäß verstellt werden können soll. Bevorzugt ist diese Höhe beliebig einstellbar. Der Ablaufstutzen sollte also so lang sein, dass er bei jeder Ein- Stellung aus dem Kulturgefäß und über die Dichtung herausragt.The discharge nozzle preferably projects out of the culture vessel and over the seal. Then the discharge nozzle and with it the height of the discharge opening can be moved particularly easily without opening the vessel, which is always associated with the risk of contamination. The length by which the drainage nozzle protrudes depends on the vertical movement of the drainage nozzle on how the height of the drainage opening is set. The length by which the drain pipe can protrude from the culture vessel to a maximum or a minimum influences how far the level of the medium in the culture vessel should be able to be adjusted. This height can preferably be set as desired. The drain socket should therefore be long enough that it protrudes from the culture vessel and over the seal at every setting.

Es kann sinnvoll sein, den Abflußstutzen, beispielsweise mit einem Anschlag unterhalb und/oder oberhalb der Gefäßwand bzw. der Dichtung so auszugestalten, dass ein versehentliches zu starkes Hineinschieben und/oder völliges Herausziehen des Abflußstutzens verhindert wird.It may be useful to design the drain socket, for example with a stop below and / or above the vessel wall or the seal, in such a way that inadvertent excessive pushing in and / or complete removal of the drain socket is prevented.

In einer Ausführungsform ist die Dichtung ein elastisches Schlauchstück, das mit seinem unteren Ende mit einer an der Oberseite des Kulturgefäßes angebrachten Halterung verbunden ist. Diese Halterung kann unterschiedlich ausgebildet sein, möglich ist z.B. ein nach oben gerichteter Rand um eine Öffnung herum, auf die das Schlauchstück aufgeschoben werden kann. Die Halterung kann aus dem gleichen Material wie das Kulturgefäß oder auch aus einem anderen geeigneten Material bestehen. Die Halterung kann homogen aus dem Material der Oberseite des Kulturgefäßes gezogen sein (z.B. aus Glas) oder aus dem gleichen oder einem anderen geeigneten Material zweckentsprechend geformt und über ein Loch in der Oberseite luftdicht aufgeklebt sein (z.B. mit Silikonkleber, Epoxidharzkleber) . An dem oberen Ende des Schlauchstückes liegt dieses an dem Teil des Abflußstutzens, der aus dem Kulturgefäß herausragt, an.In one embodiment, the seal is an elastic piece of tubing which is connected at its lower end to a holder attached to the top of the culture vessel. This holder can be designed differently, for example, an upwardly directed edge is possible around an opening, onto which the tube piece can be pushed. The holder can be made from the same material as the culture vessel or from another suitable material consist. The holder can be drawn homogeneously from the material on the top of the culture vessel (e.g. from glass) or appropriately shaped from the same or another suitable material and glued airtight via a hole in the top (e.g. with silicone adhesive, epoxy resin adhesive). At the upper end of the piece of tubing, this rests on the part of the drain connection which protrudes from the culture vessel.

Eine Vorrichtung, die ein derartiges Kulturgefäß umfaßt, ist schematisch in Figur 1 abgebildet.A device comprising such a culture vessel is shown schematically in FIG. 1.

Nach dem gleichen Prinzip, allerdings mit einer schrägen Halterung und Führung des Abflußstutzens, ist es auch möglich, den Abflußstutzen durch eine Seitenwand des Kulturgefäßes zu führen, und zwar bevorzugt so, dass der Abflußstutzen von schräg oben in das Kulturgefäß hineinragt.According to the same principle, but with an inclined mounting and guiding of the drain socket, it is also possible to guide the drain socket through a side wall of the culture vessel, preferably in such a way that the drain neck protrudes into the culture vessel obliquely from above.

Alternativ ist die Vorrichtung so ausgebildet, daß die Abflußöffnung Teil eines Abflußstutzens ist, der einen fest mit dem Kulturgefäß verbundenen, nicht beweglichen Teil umfaßt, der in das Innere des Kulturgefäßes hineinragt, sowie ein Schlauchstück, das als beweglicher Teil des Abflußstutzens auf den nicht beweglichen Teil aufgesteckt ist und die Abflußöffnung umfaßt. In dieser Ausführungsform der Erfindung, wie auch in anderen denkbaren Ausführungsformen, muss die Dichtung nicht separat ausgebildet sein, da ihre Funktion von dem Abflußstutzen selbst wahrgenommen wird. Die Höhe der Abflußöffnung ist verstellbar, indem der bewegliche Teil mehr oder weniger weit auf den unbeweglichen Teil aufgesteckt wird. Die Höhe ist bei dieser Ausführungsform nicht von außen, sondern von innerhalb des Kulturgefäßes verstellbar. Dazu kann bespielsweise eine sterile Pinzette verwendet werden, um die Sterilität der Innenseite des Gefäßes zu gewährleisten. Sofern das Gefäß einen abnehmbaren Deckel hat, kann dieser für das Einstellen abgenommen werden, aber auch z.B. durch die Öffnung einer Zellkulturflasche ist ein solches Einstellen möglich. Allgemein ist ein Einstecken in ein verbundenes Teil einem Aufstecken auf ein verbundenes Teil äquivalent, wobei ein Durchfluß des Mediums gewährleistet sein muß.Alternatively, the device is designed in such a way that the drain opening is part of a drain socket which comprises a non-movable part which is fixedly connected to the culture vessel and projects into the interior of the culture vessel, and a piece of hose which acts as a movable part of the drain nozzle on the non-movable one Part is plugged in and includes the drain opening. In this embodiment of the invention, as well as in other conceivable embodiments, the seal does not have to be formed separately, since its function is performed by the drain connector itself. The height of the drain opening is adjustable by pushing the movable part more or less far onto the immovable part. In this embodiment, the height is not adjustable from the outside, but from inside the culture vessel. For example, sterile tweezers can be used to ensure the sterility of the inside of the vessel. If the vessel has a removable lid, this can be removed for adjustment, but also, for example, through the opening Such adjustment is possible in a cell culture bottle. In general, plugging into a connected part is equivalent to plugging onto a connected part, whereby a flow of the medium must be ensured.

Bevorzugt ragt der Abflußstutzen von oben oder von unten in das Innere des Kulturgefäßes hinein. In diesem Fall sollten beweglicher und unbeweglicher Teil des AblaufStutzens eine gerade Grundform haben. Alternativ kann der unbewegliche Teil des AblaufStutzens von einer Seitenwand aus in das Innere des Kulturgefäßes hineinragen und gewinkelt oder gebogen sein, wobei der bewegliche Teil eine gerade Form hat. Eine Vorrichtung, die ein derartiges Kulturgefäß umfaßt, ist schematisch in Figur 2 abgebildet.The discharge nozzle preferably projects from above or from below into the interior of the culture vessel. In this case, the movable and immovable part of the drain socket should have a straight basic shape. Alternatively, the immovable part of the drain socket protrudes from a side wall into the interior of the culture vessel and can be angled or bent, the movable part having a straight shape. A device comprising such a culture vessel is shown schematically in FIG. 2.

In einer alternativen Ausführungsform ist die Abflußöffnung Teil eines Abflußstutzens, der gewinkelt oder gebogen ist und durch eine Seitenwand des Kulturgefäßes geführt ist, wobei die Höhe der Abflußöffnung durch eine Drehung des Abflußstutzens einstellbar ist. Bevorzugt ist ein Winkel von ca. 90°. Wenn der Abflußstutzen durch eine Dichtung geführt ist und über die Wand des Kulturgefäßes und die Dichtung hinausragt, kann die Höhe der Abflußöffnung von außen eingestellt werden.In an alternative embodiment, the drain opening is part of a drain connection which is angled or bent and is guided through a side wall of the culture vessel, the height of the drain opening being adjustable by rotating the drain connection. An angle of approximately 90 ° is preferred. If the drain pipe is guided through a seal and protrudes beyond the wall of the culture vessel and the seal, the height of the drain opening can be adjusted from the outside.

Alternativ kann die Abflußöffnung Teil eines Abflußstutzens sein, der einen geraden, fest mit dem Kulturgefäß verbundenen, nicht beweglichen Teil umfaßt, der in das Innere des Kulturgefäßes hineinragt, sowie ein gewinkeltes oder gebogenes Schlauchstück, das als beweglicher Teil des Abflußstutzens auf den nicht beweglichen Teil aufgesteckt ist und die Abflußöffnung umfaßt. Dann ist die Höhe der Abflußöffnung, wie oben beschrieben, z.B. mit einer Pinzette, durch Drehung des beweglichen Teils einstellbar.Alternatively, the drain opening can be part of a drain connection which comprises a straight, non-movable part which is fixedly connected to the culture vessel and which projects into the interior of the culture vessel, and an angled or bent hose piece which, as a movable part of the drain connection, rests on the non-movable part is attached and includes the drain opening. Then the height of the drain opening as described above, e.g. with tweezers, adjustable by rotating the moving part.

Will man vermeiden, dass bei Verwendung der Vorrichtung das zugeführte Medium die Oberfläche des Mediums stört, was z.B. für eine Liquid-Air-Kultur nachteilig sein kann, oder dass Medium bei der Zufuhr an Seitenwände oder Oberseite des Kulturgefäßes spritzt, so sollte das Kulturgefäß so ausge¬ bildet sein, dass der Zufluß bzw. die Zuflußöffnung unterhalb der Öffnung des Abflusses liegt, die den Füllstand des Kultur- gef ßes mit Medium bestimmt. Die Zuflußöffnung kann direkt eine Öffnung in der Wand des Kulturgefäßes sein, gegebenenfalls mit einer Halterung für einen zu befestigenden Schlauch oder eine Rohrverbindung. Die Zuflußöffnung kann jedoch auch Teil eines Zuflußstutzens sein, der durch eine Wand des Kulturgefäßes geführt ist, gegebenenfalls durch eine Dichtung oder damit fest verbunden. Bevorzugt ist ein Zuflußstutzen nahe dem Boden des Gefäßes durch eine Dichtung in einer Seitenwand geführt. Ein Zuflußstutzen kann, wenn z.B. eine Petrischale oder ein anderes genormtes Kulturgefäß verwendet wird, auch durch den Deckel geführt werden. Wenn auch der Abflußstutzen durch den Deckel geführt wird, kann ein solcher Deckel, der den für die Erfindung wesentlichen Abfluß und Zufluß umfaßt, in Kombination mit jedem passenden Petri- schalen-Unterteil verwendet werden.One wants to avoid that when the device is used, the supplied medium disturbs the surface of the medium, which can be disadvantageous, for example, for a liquid-air culture, or that Medium injected at the intake of the side walls or the top of the culture vessel, the culture vessel so out ¬ forms should be that the inflow and the inflow opening is located below the opening of the drain, the gef the level of the culture medium with SLI determined. The inflow opening can be an opening directly in the wall of the culture vessel, optionally with a holder for a hose to be fastened or a pipe connection. However, the inflow opening can also be part of an inflow nozzle which is guided through a wall of the culture vessel, optionally by means of a seal or permanently connected to it. Preferably, an inflow nozzle is guided near the bottom of the vessel through a seal in a side wall. An inflow nozzle can, if, for example, a petri dish or another standardized culture vessel is used, can also be passed through the cover. If the drain connection is also passed through the cover, such a cover, which comprises the drain and inflow essential to the invention, can be used in combination with any suitable petri dish lower part.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung, die ferner ein Vorratsgefäß mit frischem Medium umfaßt, das mit dem Zufluß verbunden ist, und die ferner ein Gefäß zum Sammeln alten Mediums umfaßt, das mit dem Abfluß verbunden ist. Bei Verwendung der Vorrichtung stehen diese Gefäße bevorzugt gekühlt. Alternativ kann das Vorratsgefäß mit frischem Medium aber auch z.B. bei der gewünschten Temperatur der Zellkultur aufbewahrt werden, falls die Zellen empfindlich gegenüber Temperaturänderungen sind. Ein Sammelgefäß ist nicht unbedingt notwendig, da das alte Medium, das in Kontakt mit den Zellen war, auch sofort verworfen werden kann.The invention also relates to an apparatus which further comprises a fresh medium storage vessel connected to the inflow and further comprising an old medium collecting vessel connected to the drain. When using the device, these vessels are preferably cooled. Alternatively, the storage vessel with fresh medium can also e.g. be kept at the desired temperature of the cell culture if the cells are sensitive to temperature changes. A collection container is not absolutely necessary, since the old medium that was in contact with the cells can also be discarded immediately.

Die jeweilige Verbindung zwischen Zufluß und Abfluß und Vorrats- bzw. Sammelgefäß kann z.B. eine Rohrverbindung sein, bevorzugt sind wegen ihrer Flexibilität jedoch Schläuche. Die Vorrichtung umfaßt also bevorzugt ferner mindestens einen Schlauch, der mit einem Zufluß verbunden ist, und mindestens einen Schlauch, der mit einem Abfluß verbunden ist. Insbesondere ist mindestens ein an der Vorrichtung verwendeter Schlauch aus Silikon, bevorzugt alle verwendeten Schläuche.The respective connection between the inflow and outflow and the storage or collecting vessel can be, for example, a pipe connection, but hoses are preferred because of their flexibility. The device thus preferably further comprises at least one Hose connected to an inflow and at least one hose connected to an outlet. In particular, at least one hose used on the device is made of silicone, preferably all hoses used.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung, die ferner mindestens eine Pumpe umfaßt. Ein Pumpe kann den Zufluß des Mediums steuern, und eine zweite Pumpe, oder dieselbe Pumpe, den Abfluß des Mediums. Alternativ können Zufluß und Abfluß des Mediums auch z.B. durch Schwerkraft getrieben werden, indem das Vorratsgefäß mit neuem Medium über dem Kulturgefäß und das Sammelgefäß unter dem Kulturgefäß angeordnet wird.The invention also relates to a device which further comprises at least one pump. One pump can control the inflow of the medium and a second pump, or the same pump, can control the outflow of the medium. Alternatively, the inflow and outflow of the medium can also e.g. are driven by gravity by placing the storage vessel with new medium over the culture vessel and the collection vessel under the culture vessel.

Damit bei Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung der Füllstand des Mediums in dem Kulturgefäß der Höhe der Abflußöffnung entspricht, darf - nach dem Füllen des Gefäßes zur gewünschten Höhe - die Menge zugeführten Mediums die Menge abgeführten Mediums nicht übersteigen, da sonst der Füllstand nicht konstant bleibt, sondern ansteigt. Daher muß die Menge zufließendes und abfließendes Mediums aufeinander abgestimmt werden. Nach dem ersten Füllen des Kulturgefäßes entspricht dann die Menge des abgeführten Mediums automatisch der Menge des zugeführten Mediums, da wegen des Konstruktionsprinzips der Vorrichtung nicht mehr Medium abgeführt als zugeführt werden kann. Der Fachmann wird unschwer, z.B. über die Leistung der Pumpen und/oder den Innendurchmesser der Schlauche, Zuflußöffnung (en) , Abflußöffnung (en) , Abflußstutzen etc., die Menge des zugeführten oder abgeführten Mediums so einstellen können, dass nicht zuviel Medium zugeführt wird.So that when using the device according to the invention the level of the medium in the culture vessel corresponds to the height of the discharge opening, the amount of medium supplied must not exceed the amount of medium removed after filling the vessel to the desired height, since otherwise the level does not remain constant, but instead increases. Therefore, the amount of inflowing and outflowing medium must be coordinated. After the first filling of the culture vessel, the amount of the removed medium then automatically corresponds to the amount of the added medium, since, due to the design principle of the device, no more medium can be removed than can be supplied. Those skilled in the art will easily, e.g. You can adjust the amount of the supplied or removed medium via the output of the pumps and / or the inside diameter of the hoses, inflow opening (s), outflow opening (s), outflow connection etc. so that not too much medium is supplied.

Bevorzugt sind die Zuflußöffnung (en) und die Abflußöffnung (en), der/die Abflußstutzen, Schläuche und Pumpenleis- tung(en) der Vorrichtung so ausgestaltet und aufeinander abgestimmt, dass die Menge des abführbaren Mediums mindestens so groß wie oder größer ist als die Menge des zuführbaren Mediums. Bevorzugt ist die Kapazität aller Abflüsse größer als die Kapazität aller Zuflüsse.The inlet opening (s) and the outlet opening (s), the outlet connection (s), hoses and pump output (s) of the device are preferably designed and matched to one another such that the amount of the medium which can be removed is at least as large as or greater than that Amount of feedable Medium. The capacity of all outflows is preferably greater than the capacity of all inflows.

Bevorzugt sind Zufluß und Abfluß von Medium über dieselbe Schlauchpumpe gekoppelt. Das Funktionsprinzip der Schlauch- pumpe beruht auf dem Abdrücken oder Abquetschen eines 'flexiblen Pumpenschlauches an einer oder mehreren Stellen und durch Bewegung der abgedrückten Stelle in gewünschter Förderrichtung der Flüssigkeit. Die Bewegung der abgedrückten Stelle wird mit Hilfe eines Pumpenrotors realisiert, an dessen Umfang sich walzenförmige Rotorrollen befinden. Die Rotordrehzahl (Bewegungsgeschwindigkeit der abgedrückten Stelle) und derThe inflow and outflow of medium are preferably coupled via the same peristaltic pump. The principle of the peristaltic pump is based on the marks or squeezing a 'flexible pump hose at one or more locations and by moving the abgedrückten point in the desired conveying direction of the liquid. The movement of the pressed point is realized with the help of a pump rotor, on the circumference of which there are roller-shaped rotor rollers. The rotor speed (movement speed of the depressed point) and the

Innendurchmesser des Schlauches bestimmen die Förderleistung.The inner diameter of the hose determines the delivery rate.

Bei einem gleichen Innendurchmesser von Schläuchen, die auf dieselbe Schlauchpumpe aufgespannt sind, ist die Förder- leistung also gleich.With the same inside diameter of hoses that are clamped onto the same hose pump, the delivery rate is the same.

Bevorzugt ist daher der Innendurchmesser des mit dem Abfluß verbundenen Schlauches mindestens so groß ist wie der Innendurchmesser des mit dem Zufluß verbundenen Schlauches. Besonders bevorzugt ist der Innendurchmesser des mit dem Abfluß verbundenen Schlauches größer als der Innendurchmesser des mit dem Zufluß verbundenen Schlauches, da ein als gleich angegebener Innendurchmesser praktisch oft zu Problemen führt, da die Durchmesser der Schläuche, die im allgemeinen als Zu- oder Abflüsse verwendet werden, oft nicht exakt gleich sind.The inside diameter of the hose connected to the outflow is therefore preferably at least as large as the inside diameter of the hose connected to the inflow. The inner diameter of the hose connected to the outflow is particularly preferably larger than the inner diameter of the hose connected to the inflow, since an inner diameter given as the same often leads to problems in practice, since the diameter of the hoses, which are generally used as inflows or outflows , are often not exactly the same.

Wenn die Regelung des Zu- bzw. Abflusses über eine Schlauchpumpe (oder mehrere Schlauchpumpen mit der gleichen Pumpleistung) erfolgt, so ist hierbei der Durchmesser der Pumpschläuche in der Schlauchpumpe entscheidend, so dass hier der „abpumpende" Schlauch einen etwas größeren Durchmesser als der „zupumpende" Schlauch haben sollte. Die sonstigen Schläuche (z.B. von Vorratsgefäßen zur Pumpe, von der Pumpe zum Kulturgefäß) sollten möglichst einen etwas größeren Durchmesser als die Pumpschläuche haben. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist dazu geeignet, zur Zell- und Gewebekultur verwendet zu werden. Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung der Vorrichtung zur Zeil- und Gewebekultur, sowie ein Verfahren zur Zeil- oder Gewebekultur, bei dem man die Kultur in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung durchführt. Zur Kultur der Zellen wird das Kulturgefäß bevorzugt in einen geeigneten Inkubator eingebracht, dessen Temperatur und C02-Gehalt für die kultivierten Zellen optimal eingestellt werden kann. Bevorzugt sind die kultivierten Zellen eukaryontische Zellen. Insbesondere werden mit Hilfe dieser Vorrichtung Zellen kultiviert, die adhärent oder im Gewebeverband wachsen. Aber auch bei der Kultur von Zellen, die nicht adhärent wachsen, kann die Vorrichtung eingesetzt werden, da auch diese Zellen kurze Zeit nach dem Aussäen sedi- mentieren und somit nur zu einem geringen Anteil bei dem Austausch von Medium verloren gehen. Dabei ist es empfehlenswert, die Austauschgeschwindigkeit nicht zu hoch zu wählen.If the inflow or outflow is controlled by a peristaltic pump (or several peristaltic pumps with the same pumping capacity), the diameter of the pumping hoses in the peristaltic pump is decisive, so that the "pumping" hose has a slightly larger diameter than the " should have pumping "hose. The other hoses (e.g. from storage vessels to the pump, from the pump to the culture vessel) should have a slightly larger diameter than the pump hoses. The device according to the invention is suitable for being used for cell and tissue culture. The invention therefore relates to the use of the device for cell and tissue culture, and to a method for cell or tissue culture, in which the culture is carried out in a device according to the invention. To culture the cells, the culture vessel is preferably placed in a suitable incubator, the temperature and CO 2 content of which can be optimally adjusted for the cultivated cells. The cultured cells are preferably eukaryotic cells. In particular, this device is used to cultivate cells that grow adherently or in the tissue. However, the device can also be used for the culture of cells which do not grow adherently, since these cells also sediment shortly after sowing and are therefore only lost to a small extent in the exchange of medium. It is advisable not to choose an exchange rate that is too high.

Falls die Vorrichtung zur Kultur von adhärenten Zellen verwendet wird, ist es möglich, dass die Zellen am Boden des Kulturgefäßes adhärieren. Alternativ können die Zellen auch, z.B. bei der Liquid-Air-Kultur, z.B. der Liquid-Air-Kultur von Epithel, an eine Matrix angeheftet sein, die in die Grenzschicht zwischen Medium und Luft eingebracht werden kann. Die an eine Matrix gebundenen oder adhärierten Zelle können auch, entweder auf dem Boden des Kulturgefäßes liegend oder durch eine Vorrichtung über dem Boden des Kulturgefäßes gehalten, submers kultiviert werden.If the device is used for the culture of adherent cells, it is possible for the cells to adhere to the bottom of the culture vessel. Alternatively, the cells can also e.g. in liquid air culture, e.g. the liquid-air culture of epithelium, attached to a matrix that can be introduced into the boundary layer between medium and air. The cells bound or adhered to a matrix can also be submerged, either lying on the bottom of the culture vessel or held by a device above the bottom of the culture vessel.

Für die optimale Kultur von Gewebe, z.B. zur Transplantation, ist die Versorgung mit Nährstoffen besonders wichtig, so dass die erfindungsgemäße Vorrichtung hierfür besonders geeignet ist. Verschiedene Gewebestücke können in einem Kulturgefäß, z.B. in einer Petrischale, kultiviert werden, die in verschie¬ dene Kompartimente aufgeteilt ist. Diese verhindern nicht den Austausch von Medium, ermöglichen jedoch die gleichzeitige Kultivierung verschiedener definierter Gewebestücke ohne deren Vermischung. Kompartimentiert bedeutet, dass der Boden des Gefäßes durch Stege o.a. so aufgeteilt ist, dass verschiedene Proben in die entstehenden Kompartimente („Tröge") platziert werden können und sich nicht bei Transport/Bewegung des Kulturgefaßes vermischen. Die Höhe der Stege ist so gehalten, dass sie deutlich unter der Höhe des Mediums liegt. Die Stege können verschiebbar angebracht sein. Die Kompartimentierung erlaubt die vergleichende Kultivierung z.B. von Zellen, die auf Matrizes aus verschiedenen Materialien adhärieren oder von verschiedener Gewebeproben unter ansonsten identischen Bedingungen und erlaubt die sichere Zuordnung der Proben.The supply of nutrients is particularly important for the optimal culture of tissue, for example for transplantation, so that the device according to the invention is particularly suitable for this. Various pieces of fabric may be in a culture vessel, are cultured in a petri dish, for example, the dene in various ¬ compartments is divided. These do not prevent that Exchange of medium, however, enable the simultaneous cultivation of different defined tissue pieces without mixing them. Compartmentalized means that the bottom of the vessel is divided by webs or the like so that different samples can be placed in the resulting compartments ("troughs") and do not mix during transport / movement of the culture vessel. The height of the webs is kept so that it is clearly below the height of the medium. The webs can be slidably attached. The compartmentalization allows the comparative cultivation of, for example, cells that adhere to matrices made of different materials or of different tissue samples under otherwise identical conditions and allows the samples to be assigned reliably.

In einer besonderen Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Vorrichtung dazu verwendet, ein lösliches Produkt, das die kultivierten Zellen in das Zellkulturmedium abgeben, kontinuierlich oder diskontinuierlich automatisch zu ernten. Die Kultur der Zellen bzw. des Gewebes kann also unter kontinuierlichem oder diskontinuierlichem Austausch von Medium durchführt werden. Das erwünschte lösliche Produkt gewinnt man aus dem Gefäß für altes Medium, indem man es daraus aufreinigt. Das alte Medium muß also nicht zwangsläufig ein Abfallprodukt sein.In a particular embodiment, the device according to the invention is used to automatically or continuously harvest a soluble product which the cultured cells release into the cell culture medium. The culture of the cells or of the tissue can thus be carried out with continuous or discontinuous exchange of medium. The desired soluble product is obtained from the old medium vessel by purifying it. The old medium does not necessarily have to be a waste product.

Zum Beispiel kann es sich bei den kultivierten Zellen um Hybridomzellen handeln, die monoklonale Antikörper produzieren. Damit stellt diese Erfindung auch ein Verfahren zur Produktion von Antikörpern oder anderen löslichen Zellprodukten bereit, das durch die Automatisierung nur einen geringen Arbeitsaufwand benötigt. Weitere lösliche Produkte können z.B. Proteine sein, die von den Zellen exprimiert werden, wobei die Zellen bevorzugt gentechnisch für Expression dieser Proteine verändert wurden. Zum Beispiel kann es sich bei den kultivierten Zellen auch um Fibroblasten oder andere Zellen handeln, deren Kulturüberstand als „konditioniertes Medium" entweder direkt oder über ein bevorzugt gekühlt gelagertes Puffergefäß in ein zweites Kulturgefäß mit anderen Zellen/Geweben befördert wird. Auf dieser Grundlage ist entweder eine regelrechte Kaskade von Kulturgefäßen mit jeweils kontinuierlicher Zufuhr und Abfuhr vorstellbar (mit mehreren hintereinander geschalteten Gefäßen) oder dei Mischung der Abflüsse mehrerer verschiedender Kulturgefäße in einem Puffergefäß (Sammlung verschiedener konditionierter Medien) , von dem aus dann ein Kulturgefäß (oder mehrere) mit dem konditionierten Medium versorgt wird.For example, the cultured cells can be hybridoma cells that produce monoclonal antibodies. This invention thus also provides a method for the production of antibodies or other soluble cell products which requires only a small amount of work due to the automation. Other soluble products can be, for example, proteins that are expressed by the cells, the cells preferably being genetically modified for the expression of these proteins. For example, the cultured cells can also be fibroblasts or other cells, the culture supernatant of which is conveyed as a "conditioned medium" either directly or via a buffer vessel, preferably stored in a cool place, into a second culture vessel with other cells / tissues. On this basis, either a real cascade of culture vessels with continuous supply and discharge in each case imaginable (with several vessels connected in series) or the mixing of the outflows of several different culture vessels in a buffer vessel (collection of different conditioned media), from which one culture vessel (or several) with the conditioned one Medium is supplied.

Die in den Abbildungen dargestellten Vorrichtungen illustrieren mögliche Ausführungsformen, die erfindungsgemäßen Vorrich- tungen sind jedoch nicht auf diese besonderen Ausführungsformen beschränkt. Weitere im Rahmen der Beschreibung offen¬ barte Ausführungsformen sind dem Fachmann leicht ersichtlich.The devices shown in the figures illustrate possible embodiments, but the devices according to the invention are not restricted to these special embodiments. Further in the description of open ¬ disclosed embodiments will be readily apparent to the skilled artisan.

Beschreibung der AbbildungenDescription of the pictures

Im Rahmen der folgenden Abbildungen haben die verwendeten Bezugszahlen folgende Bedeutung:In the following figures, the reference numbers used have the following meaning:

11: Kulturgefäß, 12: Zufluß, 13: Abflußöffnung, 14: beweglicher Teil eines Abflußstutzens, 15: nicht beweglicher Teil eines Abflußstutzens, 16: Füllstand des Mediums in dem Kulturgefäß, 17: Vorratsgefäß mit frischem Medium, 18: Sammelgefäß für altes Medium, 19: Deckel des Kulturgefäßes, 20: elastischer Schlauch, 21: Halterung, 22/22λ: Abflußstutzen, 23: Schlauchpumpe11: culture vessel, 12: inflow, 13: discharge opening, 14: movable part of a drain connection, 15: non-movable part of a drain connection, 16: fill level of the medium in the culture container, 17: storage container with fresh medium, 18: collecting container for old medium, 19: lid of the culture vessel, 20: elastic hose, 21: holder, 22/22 λ : drainage connection, 23: hose pump

Fig. 1: Vorrichtung zur automatischen Regelung des Füllstands des Mediums in einem Kulturgefäß, bei der der Abflußstutzen durch eine Dichtung an der Oberseite des Kulturgefäßes geführt ist.Fig. 1: Device for automatic control of the level of the medium in a culture vessel, in which the drain port is guided by a seal on the top of the culture vessel.

Fig. 2: Vorrichtung zur automatischen Regelung der Höhe der Oberfläche des Mediums, bei der der Abflußstutzen durch eine Dichtung an der Seitenwand des Kulturgefäßes geführt ist, wobei ein bewegliches Schlauchstück auf ein nicht bewegliches, gewinkeltes Teil des Abflußstutzens aufgeschoben ist.Fig. 2: Device for automatically regulating the height of the surface of the medium, in which the drainage pipe is guided through a seal on the side wall of the culture vessel, a movable piece of hose being pushed onto a non-movable, angled part of the drainage pipe.

Fig. 3: Vorrichtung zur Regelung der Höhe der Oberfläche von Medium in einem KulturgefäßFig. 3: Device for controlling the height of the surface of the medium in a culture vessel

A: Gezeigt sind die Hauptkomponenten einer Ausführungsform des Systems, Schlauchpumpe, Vorrats- und Ablaufgefäß (üblicherweise im Kühlschrank) sowie das Kulturgefäß mit Absaugung des Mediums von oben.A: The main components of an embodiment of the system, peristaltic pump, storage and drainage vessel (usually in the refrigerator) and the culture vessel with suction of the medium from above are shown.

B: Die Abbildung zeigt im Detail ein geöffnetes Kulturgefäß (Petrischale) mit Absaugung von oben. In dem Gefäß können entweder direkt oder nach Einbringung einer geeigneten Vorrichtung z.B. indirekt auf einer Matrix Zellen kultiviert werden. Die gezeigten Kammern in der Petrischale verhindern nicht den Austausch von Medium, erlauben jedoch eine Kultur definierter Zellen oder Gewebe in den verschiedenen Kammern.B: The illustration shows in detail an open culture vessel (petri dish) with suction from above. In the vessel either directly or after the insertion of a suitable device e.g. cells are grown indirectly on a matrix. The chambers shown in the Petri dish do not prevent the exchange of medium, but allow the culture of defined cells or tissues in the different chambers.

C: Gezeigt ist ein geöffnetes Kulturgefäß (Petrischale) mit Absaugung von unten, in die z.B. eine Vorrichtung zur Aufnahme bzw. Ablage von Matrixmaterialien mit Zellen eingebracht werden kann. Die oben im Bild abgebildete Vorrichtung besteht aus einem Siebgewebe aus nichtrostendem Stahl, welches auf Metallfüßen steht.C: Shown is an open culture vessel (petri dish) with suction from below, into which e.g. a device for receiving or depositing matrix materials with cells can be introduced. The device shown in the picture above consists of a mesh made of stainless steel, which stands on metal feet.

Fig. 4: Kultur von Fibroblasten unter diskontinuierlichem (A) oder kontinuierlichem (B) Medienwechsel BeispieleFig. 4: Culture of fibroblasts under discontinuous (A) or continuous (B) media change Examples

In Versuchsreihen wurde festgestellt, dass bei der diskontinuierlichen submersen Kultivierung von Fibroblasten auf kollagenisiertem Siebgewebe bei einer Medienhöhe von ca. 10 mm wesentliche Parameter des Mediums (DMEM, 10% fetales Kälberserum) bereits nach 24 Stunden komplett verändert waren. So hat sich nach dieser Zeit der Gehalt an Glukose als Hauptenergielieferant von ca. 5 mM auf ca. 0,2 mM reduziert, während der Gehalt an Laktat von ca. 1,5 mM (aus dem fetalen Kälberserum) auf ca. 9 mM erhöht war. Üblicherweise wird das Medium bei derartigen Kultivierungen erst nach ca. 3 Tagen gewechselt. Bei Kultur der Fibroblasten mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung unter kontinuierlichem Medienwechsel blieben Laktat- und Glukosewerte jedoch im wesentlichen stabil.In series of experiments it was found that in the discontinuous submerged cultivation of fibroblasts on collagenized sieve cloth with a media height of approx. 10 mm, essential parameters of the medium (DMEM, 10% fetal calf serum) were completely changed after 24 hours. After this time, the content of glucose as the main source of energy decreased from approx. 5 mM to approx. 0.2 mM, while the lactate content increased from approx. 1.5 mM (from the fetal calf serum) to approx. 9 mM was. With such cultivations, the medium is usually only changed after about 3 days. However, when the fibroblasts were cultivated with the device according to the invention with continuous media change, lactate and glucose values remained essentially stable.

In Figur 4A und B sind nach gleicher Kulturzeit Fibroblasten gezeigt, die auf kollagenisiertem Netzwerk (Maschenweite 150 μm) kultiviert wurden. Es ist zu erkennen, dass die Zellen aus der Kultur mit kontinuierlichem Austausch des Mediums (Fig. 4B) dichter sind - also stärker proliferiert haben als bei diskontinuierlichem Mediumwechsel (Fig 4A) . 4A and B show fibroblasts after the same culture time, which were cultivated on a collagenized network (mesh size 150 μm). It can be seen that the cells from the culture with a continuous exchange of the medium (FIG. 4B) are denser - that is, they have proliferated more than with a discontinuous medium change (FIG. 4A).

Claims

Patentansprüche : Claims: 1. Vorrichtung, umfassend ein Kulturgefäß zur Zeil- und Gewebekultur, das mindestens einen Zufluß und mindestens einen Abfluß für Medium umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die Höhe der Abflußöffnung innerhalb des Kulturgefäßes verstellbar ist.1. Apparatus comprising a culture vessel for cell and tissue culture, which comprises at least one inflow and at least one outflow for medium, characterized in that the height of the outflow opening is adjustable within the culture vessel. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Abflußöffnung Teil eines Abflußstutzens ist, der durch eine Dichtung in einer Wand des Kulturgefäßes geführt ist.2. Apparatus according to claim 1, characterized in that the drain opening is part of a drain connector which is guided through a seal in a wall of the culture vessel. 3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Abflußstutzen in vertikaler Richtung beweglich durch die Unter- oder Oberseite des Kulturgefäßes geführt ist.3. Apparatus according to claim 2, characterized in that the drainage pipe is movably guided in the vertical direction through the bottom or top of the culture vessel. 4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Abflußstutzen durch eine Dichtung an der Oberseite des Kulturgefäßes geführt ist.4. The device according to claim 3, characterized in that the drain port is guided by a seal on the top of the culture vessel. 5. Vorrichtung nach den Ansprüchen 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Abflußstutzen aus dem Kulturgefäßes und über die Dichtung herausragt.5. Device according to claims 3 and 4, characterized in that the drain pipe protrudes from the culture vessel and over the seal. 6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichtung ein elastisches Schlauchstück ist, das mit seinem unteren Ende mit einer an der Oberseite des Kulturgefäßes angebrachten Halterung verbunden ist.6. The device according to claim 5, characterized in that the seal is an elastic piece of tubing which is connected at its lower end to a holder attached to the top of the culture vessel. 7. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Abflußöffnung Teil eines Abflußstutzens ist, der einen fest mit dem Kulturgefäß verbundenen, nicht beweglichen Teil umfaßt, der in das Innere des Kulturgefäßes hineinragt, sowie ein Schlauchstück, das als beweglicher Teil des Abflußstutzens auf den nicht beweglichen Teil aufgesteckt ist und die Abflußöffnung umfaßt.7. The device according to claim 1, characterized in that the drain opening is part of a drain socket, which comprises a fixedly connected to the culture vessel, non-movable part, which projects into the interior of the culture vessel, and a piece of hose, which as a movable Part of the drain connector is attached to the non-moving part and includes the drain opening. 8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Abflußstutzen von oben oder von unten in das Innere des Kulturgefäßes hineinragt.8. The device according to claim 7, characterized in that the drain neck protrudes from above or from below into the interior of the culture vessel. 9. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1, 2 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Abflußöffnung Teil eines Abflußstutzens ist, der gewinkelt oder gebogen ist und durch eine Seitenwand des Kulturgefäßes geführt ist, wobei die Höhe der Abflußöffnung durch eine Drehung des Abflußstutzens einstellbar ist.9. Device according to claims 1, 2 and 7, characterized in that the drain opening is part of a drain socket which is angled or bent and is guided through a side wall of the culture vessel, the height of the drain opening being adjustable by rotating the drain socket. 10. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturgefäß so ausgebildet ist, dass der Zufluß für das Medium unterhalb der Öffnung des Abflusses liegt.10. Device according to claims 1 to 9, characterized in that the culture vessel is designed so that the inflow for the medium is below the opening of the drain. 11. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturgefäß zumindest teilweise aus Glas oder einem anderen transparenten Material besteht.11. The device according to claims 1 to 10, characterized in that the culture vessel consists at least partially of glass or another transparent material. 12. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie ferner ein Vorratsgefäß mit frischem Medium umfaßt, das mit dem Zufluß verbunden ist, und sie ferner ein Gefäß zum Sammeln alten Mediums umfaßt, das mit dem Abfluß verbunden ist.12. The device according to claims 1 to 11, characterized in that it further comprises a storage vessel with fresh medium, which is connected to the inflow, and it further comprises a vessel for collecting old medium, which is connected to the drain. 13. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie ferner mindestens einen Schlauch, der mit einem Zufluß verbunden ist, und mindestens einen Schlauch, der mit einem Abfluß verbunden ist, umfaßt.13. The device according to claims 1 to 12, characterized in that it further comprises at least one hose which is connected to an inflow, and at least one hose which is connected to a drain. 14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Schlauch aus Silikon ist. 14. The apparatus according to claim 13, characterized in that at least one hose is made of silicone. 15. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß sie ferner mindestens eine Pumpe umfaßt.15. Device according to claims 1 to 14, characterized labeled in ¬ is characterized in that it comprises at least a further pump. 16. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuflußöffnung (en) und die Abflußöff¬ nung (en), der/die Abflußstutzen, Schläuche und Pumpenleis¬ tung (en) so ausgestaltet und aufeinander abgestimmt sind, dass die Menge des abführbaren Mediums mindestens so groß wie oder größer ist als die Menge des zuführbaren Mediums .16. Device according to claims 1 to 14, characterized in that the inlet opening (s) and the Abflußöff ¬ voltage (s) of / outlet connection, hoses and pumps Leis ¬ device (s) are designed and coordinated so that the The amount of the medium that can be removed is at least as large as or greater than the amount of the medium that can be supplied. 17. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß Zufluß und Abfluß von Medium über dieselbe Schlauchpumpe gekoppelt sind.17. Device according to claims 1 to 16, characterized in that the inflow and outflow of medium are coupled via the same peristaltic pump. 18. Vorrichtung nach den Ansprüchen 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Innendurchmesser des mit dem Abfluß verbundenen Schlauches mindestens so groß ist wie der Innendurchmesser des mit dem Zufluß verbundenen Schlauches.18. Device according to claims 13 to 17, characterized in that the inner diameter of the hose connected to the drain is at least as large as the inner diameter of the hose connected to the inflow. 19. Verwendung der Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 18 zur Zeil- oder Gewebekultur.19. Use of the device according to claims 1 to 18 for cell or tissue culture. 20. Verfahren zur Zeil- oder Gewebekultur, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur in einer Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 18 durchführt.20. A method for cell or tissue culture, characterized in that the culture is carried out in a device according to claims 1 to 18. 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur unter kontinuierlichem oder diskontinuierlichem Austausch von Medium durchführt.21. The method according to claim 20, characterized in that one carries out the culture with continuous or discontinuous exchange of medium. 22. Verwendung und Verfahren nach den Ansprüchen 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebekultur eine Liquid/Air-Kultur von Epithel ist. 22. Use and method according to claims 19 to 21, characterized in that the tissue culture is a liquid / air culture of epithelium.
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