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WO2005106016A1 - Ｔｈ１細胞の検出方法 - Google Patents

Ｔｈ１細胞の検出方法 Download PDF

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WO2005106016A1
WO2005106016A1 PCT/JP2005/008150 JP2005008150W WO2005106016A1 WO 2005106016 A1 WO2005106016 A1 WO 2005106016A1 JP 2005008150 W JP2005008150 W JP 2005008150W WO 2005106016 A1 WO2005106016 A1 WO 2005106016A1
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WO
WIPO (PCT)
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car
amino acid
protein
carl
acid sequence
Prior art date
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Application number
PCT/JP2005/008150
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English (en)
French (fr)
Inventor
Keiko Yamaguchi
Toshio Imai
Kenzo Muramoto
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eisai Co Ltd
Eisai R&D Management Co Ltd
Original Assignee
Eisai Co Ltd
Eisai R&D Management Co Ltd
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Publication date
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Priority to JP2006512835A priority patent/JP4635001B2/ja
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Priority to US13/840,851 priority patent/US9200066B2/en
Priority to US13/840,927 priority patent/US9175073B2/en
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    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting helper T cells and Thl cells, which are thought to be involved in cell-mediated immunity.
  • the present invention provides an antibody against coxsackie virus adenovirus receptor (CAR) or CAR ligand (CARL), which is a ligand on Thl that binds to CAR, using ThL cells. Regarding how to detect.
  • CAR coxsackie virus adenovirus receptor
  • CARL CAR ligand
  • the ratio of Thl cells and Th2 cells in a biological sample can be examined, and the subject from whom the biological sample has been collected can be diagnosed for atopic disease.
  • the present invention further relates to a method of screening for an inhibitor of the binding between CAR and CARL.
  • the present invention also relates to an antibody that inhibits the binding between CAR and CARL, a cell adhesion inhibitor containing the antibody, and a therapeutic agent for contact dermatitis.
  • An immune reaction in a living body has a common feature that it occurs locally and infiltration of immune cells is observed. That is, an efficient immune response does not occur without the necessary localization of the necessary immune cells.
  • the types of infiltrating immune cells vary depending on the tissue and disease. For example, Thl cells produce rheumatoid joints such as interleukin (IL) -12 and interferon (IFN) - ⁇ .Th2 cells that produce IL-4 and IL-5 accumulate in asthmatic lungs. Then By elucidating the cell infiltration mechanism that enables such selective cell invasion, it is thought that specific cell infiltration can be suppressed and the pathological state of the immune reaction can be controlled.
  • IL interleukin
  • IFN interferon
  • the infiltration of immune cells is roughly classified into the following four steps: (1) light contact with vascular endothelial cells via selectin, (2) activation of integrins by chemokine receptors, (3) Strong adhesion to vascular endothelial cells via integrins and (4) extravasation through vascular endothelial cells through intercellular spaces. Regarding the first three steps, the molecular mechanism has been elucidated! /, But extravasation is still unknown!
  • JAM-A and PECAM-1 have been reported as molecules involved in extravascular migration. ing. JAM-A and PECAM-1 are cell membrane proteins belonging to the immunoglobulin superfamily (IgSF) and function as cell adhesion molecules.
  • IgSF immunoglobulin superfamily
  • JAM-A binds to integrin a L
  • JAM-B binds not only to homophilic binding but also to JAM-C and integrin ⁇ 4 ⁇ 1.
  • JAM-C does not bind homophilically, but binds to JAM-B and integrin ⁇ / 32 !.
  • the molecules of the JAM family are involved in adhesion between endothelial cells, between leukocytes and endothelial cells, and between platelets and endothelial cells through homophilic or heterophilic bonds.
  • CAR coxsackie and adenovirus receptor
  • endothelia selective adheion molecule was identified as a molecule selectively expressed only in endothelial cells, but its expression in platelets has been reported thereafter.
  • Such molecular power belonging to IgSF By examining whether or not it is involved in the adhesion of epithelial cells, endothelial cells, leukocytes, and platelets, and elucidating the mechanism of cell invasion, it is necessary to control the pathology involving immune cells. Very important.
  • Non-Patent Document 1 Cohen C.J., Shieh J.T., Pickles R.J., Okegawa T., Hsieh J.T. and Bergelson J.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98 (26): 15191—15196
  • Non-Patent Document 2 Walters R.W., Freimuth P., Moninger T.O., Ganske I., Zabner J. and Welsh M.J. ⁇ Cell (2002) 110 (6): 789-799
  • Non-Patent Document 3 Moog-Lutz C, Cave-Riant F., Guibal F.C., Breau M.A., Di Gioia Y., Couraud P.O., Cayre Y.E., Bourdoulous S. and Lutz P.G. ⁇ Blood (2003)
  • an object of the present invention is to search for a cell adhesion molecule having a cell adhesion ability with a specific lymphocyte, identify a ligand of the molecule, and find a use of the adhesion molecule, the ligand and an antibody against them. It is in.
  • the present inventors searched for a cell adhesion molecule capable of adhering to activated lymphocytes by using a chimeric molecule of the extracellular region of a candidate molecule belonging to IgSF and a secreted alkaline phosphatase. Cell adhesion experiments on lymphocytes were performed. The results revealed that CAR functions as an adhesion molecule for activated lymphocytes.
  • ENSMUSG0000048534 is an unknown ligand for CAR
  • a chimeric protein of the extracellular region of this molecule and alkaline phosphatase was prepared, and the adhesive activity between B300 cells and B300 cells expressing CAR was examined.
  • CARL CAR Ligand
  • the gene encoding CARL was located on mouse chromosome 9 (46.9Mb).
  • the gene encoding CARL matched the mouse cDNA sequence of unknown function registered in GenBank as similar to AMICA (BC050133).
  • the human homologous gene for CARL is located in the mouse homologous region on the human chromosome, chromosome 11 (117.6 Mb), and has high amino acid sequence homology! ).
  • a molecule in which a partial amino acid sequence of human AMICA has been deleted has been reported as an adhesion molecule expressed in bone marrow-derived cells (Non-Patent Document 3).
  • CARL-expressing cells lacking two putative Ig-like domains were respectively prepared, and the adhesion activity of these cells to the CAR-AP chimeric protein was examined.
  • the CARL-expressing B300 cells and the domain 2 deficient CARL-expressing B300 cells did not adhere to the force domain 1 deficient CARL-expressing B300 cells adhered to the CAR-AP chimeric protein. Therefore, it became clear that the binding of CAR to CARL requires CARL domain 1.
  • a CARL-specific # 3 monoclonal antibody was obtained.
  • the # 3 antibody inhibited the adhesion of CAR-expressing B300 cells to the CARL-AP protein.
  • the # 3 antibody exerted a force that bound to CARL on the membrane of the full-length CARL-expressing B300 cell and the domain-2 deficient CARL-expressing B300 cell, and did not bind to the domain-1 deficient CARL-expressing B300 cell. Therefore, it was revealed that the # 3 antibody having the binding inhibitory activity recognizes domain 1 required for the binding between CAR and CARL.
  • CARL expression was examined in non-Thl cells, CARL was strongly expressed in neutrophils.
  • a therapeutic experiment was performed in a mouse model of contact dermatitis using the prepared # 3 anti-CARL antibody, and a therapeutic effect was observed.
  • the present inventors have found that CAR functions as an adhesion molecule to lymphocytes, that CARL is a novel ligand on CAR lymphocytes, that CARL is selectively expressed in Thl cells. Expression, selective attachment of Thl cells to CAR, binding of CAR to CARL requires domain 1, human and mouse CAR and CARL have similar properties It was shown. Therefore, the present invention relates to a method for detecting Thl cells using a direct interaction between CAR and CARL, and a kit for detection. In another aspect, the invention provides a method of detecting Thl cells using an antibody against CARL identified as a novel ligand on Thl cells.
  • the present invention relates to a method for examining the ratio of Thl cells to Th2 cells, and a method for diagnosing atopic disease based on the examined ratio.
  • the present invention relates to a method of screening for an inhibitor of the binding between CAR and CARL.
  • the present invention also relates to an antibody that inhibits the binding between CAR and CARL, and a composition containing the antibody that inhibits cell adhesion, for example, a composition for treating contact dermatitis. That is, the present invention, more specifically,
  • step (b) In the step (a), a step of detecting cells bound to CAR
  • the CAR binds to a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, wherein the amino acid sequence according to any one of the following (1) to (6): How to be a protein containing a sequence:
  • a kit for detecting Thl cells comprising CAR as a detection reagent.
  • step (b) In step (a), a step of detecting cells bound to the anti-CARL antibody
  • the anti-CARL antibody is an antibody that specifically binds to CARL, and the CARL binds to native CAR, according to any one of the following (1) to (9): How to be a protein:
  • SEQ ID NO: a protein encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the cDNA sequence of 3 or 4,
  • a protein comprising an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the protein of (1) to (5),
  • a protein comprising the amino acid sequence of the above proteins (1) to (5), wherein one or several amino acid residues are deleted, substituted, added or inserted.
  • a kit for detecting Thl cells which comprises an anti-CARL antibody as a detection reagent.
  • step (b) detecting the binding of CAR and CARL in step (a),
  • step (c) comparing the binding levels of CAR and CARL detected in step (b) with those in the absence of the test substance;
  • a method for screening an inhibitor of the binding between CAR and CARL comprising:
  • the CARL is a protein according to any one of the following (1) to (10), which binds to native CAR.
  • SEQ ID NO: a protein encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the cDNA sequence of 3 or 4,
  • a protein comprising an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the protein of (1) to (5),
  • CARL is a protein according to any one of the following (1) to (9):
  • SEQ ID NO: a protein encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the cDNA sequence of 3 or 4,
  • a protein comprising an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the protein of (1) to (5),
  • a protein comprising the amino acid sequence of the above proteins (1) to (5), wherein one or several amino acid residues are deleted, substituted, added or inserted.
  • the anti-CAR antibody was deposited with accession number FERM ABP-10317 as hybridoma®mCAR: 5E9-ll, as received under accession number FERM ABP-10318 as hybridoma®mCAR: 5Gll-ll-ll, Or deposited under accession number FERM ABP-10320 [17]
  • the antibody according to [17] which is produced from the hybridoma @mCAR: 4C9-ll.
  • a cell adhesion inhibitor comprising the antibody according to any one of [15] to [20].
  • a therapeutic agent for contact dermatitis comprising the antibody according to any one of [15] to [20].
  • FIG. 1 is a view showing that CAR functions as an adhesion molecule for activated T cells.
  • FIG. 2 is a view showing the effect of anti-CAR antibody power CAR on cell adhesion through homophilic binding.
  • FIG. 3 is a diagram and a photograph showing that CAR is not expressed on activated lymphocytes.
  • FIG. 4 is a view showing that cell adhesion activity to CAR varies depending on the state of lymphocyte stimulation.
  • FIG. 5 is a view showing an expression pattern of mRNA of CAR ligand (CARL).
  • FIG. 6 is a view showing cell adhesion by CAR ligand (CARL) and CAR and cell adhesion inhibition by anti-CAR antibody.
  • CARL CAR ligand
  • FIG. 7 is a view showing an amino acid sequence of CARL.
  • FIG. 8 is a diagram showing Kd values of CAR and CARL.
  • FIG. 9 is a view showing that CAR selectively adheres to Thl through binding to CARL selectively expressed in Thl cells.
  • FIG. 10A is a view showing inhibition of cell adhesion of Thl cells to CAR by an anti-CAR antibody.
  • FIG. 10B shows CARL expression in cells other than CD4-positive T cells.
  • FIG. 11 is a diagram showing that it is the first Ig-like domain of CARL, which is a regional force required for binding of CARL to CAR.
  • FIG. 12 is a view showing cell adhesion inhibition by an anti-CARL antibody.
  • FIG. 13 is a view showing that human CAR binds to human CARL.
  • FIG. 14 is a view showing cell adhesion inhibition by an anti-human CARL antibody.
  • FIG. 15 is a view showing the therapeutic effect of an anti-CARL antibody on contact dermatitis.
  • the present invention has shown that CAR binds to Thl cells via direct binding to CARL, which is specifically expressed on Thl cells.
  • the present invention relates to a method for detecting Thl cells using CAR.
  • Thl cells comprising: (a) a step of contacting a cell sample containing lymphocytes with CAR; and (b) a step of detecting cells bound to CAR in step (a). are provided.
  • the "cell sample containing lymphocytes" in the present detection method is not particularly limited, and examples include blood cell samples such as bone marrow and peripheral blood that are expected to contain lymphocytes.
  • peripheral blood is preferred because of ease of collection.
  • a cell sample and CAR is usually performed by adding a polypeptide to a reaction solution containing cells.
  • a reaction solution containing cells for example, the cell adhesion buffer (RPMI1640, 0.5% BSA, 20 mM HEPES (pH 7.4) described in Example 4 can be used.
  • the present invention is not limited thereto. The contact may be performed in any reaction solution as long as the CAR and Thl cells are stably maintained and their binding is not inhibited.
  • CAR and “CAR polypeptide” are represented by the number NM_001338.
  • a human protein consisting of an amino acid sequence (NP_001329) encoded by a nucleotide sequence registered in GenBank, and allele variants, splicing variants thereof, and proteins corresponding to the protein derived from non-human mammals, Includes native CAR.
  • CAR and CAR polypeptide include, in addition to the above-described native CAR, non-natural polypeptides that exhibit functions equivalent to the CAR.
  • CAR and CAR polypeptide include a protein having an amino acid sequence modified from a native CAR (modified CAR), a CAR produced as a recombinant protein (recombinant CAR), and the like. More specifically, "CAR” and "CAR polypeptide”
  • CAR an amino acid sequence obtained by fusing the protein described in (1) to (5) with a marker protein.
  • CAR and “CAR polypeptide” are used interchangeably.
  • mice Examples of mammals other than humans from which natural CARs are derived include, for example, mice (GenBank
  • Allele mutants and these mammalian-derived proteins can be obtained by using known techniques such as hybridization and PCR using a probe or primer prepared based on the above-described base sequence or amino acid sequence of CAR ( Samorook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Vol. 1--3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997); DNA Cloning techniques, By applying a practical approach 2nd ed., Oxford Univ.
  • a cDNA library or a genomic library is also obtained by obtaining a cDNA or a gene encoding the allele variant or protein and expressing the gene.
  • CAR can be prepared by a conventional protein synthesis method based on a known amino acid sequence.
  • CAR and “CAR polypeptide” include, in addition to the above-mentioned native CAR, a polypeptide having a function equivalent to that of the CAR.
  • the function of CAR can be confirmed, for example, by binding to CARL of the animal, SEQ ID NO: 1 for a mouse, and SEQ ID NO: 2 for a human.
  • proteins exhibiting a common biological activity are conserved in the course of evolution, both in their amino acid sequences and at the level of the genes encoding the proteins.
  • examples of the polypeptide having a function equivalent to that of the native CAR include a protein showing a high amino acid sequence homology with the native CAR, particularly at the active center thereof.
  • high amino acid sequence homology means, for example, 30, 35, 40, or 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more (for example, 80, 90 or 95% or more).
  • % identity means that the amino acid residues are identical when the two sequences are aligned with a space, if necessary, so that the largest value is obtained between the two amino acid sequences. (Conservative substitutions are not included in the match). The percent identity of such amino acid sequences can be determined using known software (BLAST (Altschul et al.).
  • CAR proteins showing high amino acid sequence homology to the activity equivalent to that of native CAR
  • Genes encoding proteins showing high amino acid sequence homology to the activity equivalent to that of native CAR can be prepared by preparing probes or primers based on the amino acid sequence or gene sequence of known native CAR, and It can be obtained by conventional techniques such as hybridization or PCR (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual 2nd ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press), By expressing the gene, a protein having a biological activity equivalent to that of the native CAR can be obtained.
  • the terms “CAR” and “CAR polypeptide” described in this specification include the amino acid sequence encoded by the polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide encoding the native CAR.
  • Such stringent hybridization conditions in the present invention include, for example, "2X SSC, 0.1% SDS, 50 ° C”, “2X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C", “1 X SSC, 0.1% SDS, 37 ° C '' and more stringent conditions such as ⁇ 2 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C '', ⁇ 0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C '' and ⁇ 0.2 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C ”.
  • Hybridization Solution After performing prehybridization at 55 ° C for 30 minutes or more in Hybridization Solution (CLONTECH), add a labeled probe and incubate at 37-55 ° C for 1 hour or more. Washing may be performed three times for 20 minutes at room temperature in 0.1% SDS, and once for 20 minutes at 37 ° C in 1X SSC, 0.1% SDS.
  • a higher temperature for example, 60 ° C., 68 ° C., etc.
  • more stringent conditions are obtained. be able to.
  • Those skilled in the art will consider other hybridization conditions such as the probe concentration, probe length, probe base sequence composition, reaction time, etc.
  • CAR and “CAR polypeptide” in the present specification further include a protein having an amino acid sequence modified from the above-mentioned native CAR.
  • modified CAR and “modified CAR polypeptide” include, for example, proteins in which a region not involved in binding to CARL of a native CAR has been deleted.
  • a polypeptide having an amino acid sequence capable of acting as an extracellular domain in the native CAR can be exemplified. Prediction of protein domains is possible from domain search sites, for example, http: @ smart.embHieidelberg.de /.
  • modified proteins of the present invention also include the modified CAR and the modified CAR polypeptide of the present invention.
  • a method of deleting or adding or substituting or inserting an arbitrary amino acid residue in the sequence is well known, for example, in a DNA encoding the same, for example, a site-specific method known in the art. Mutagenesis (e.g., Nucleic Acid Research, Vol. 10, No. 20, p. 6487-6500, 1982).
  • the term "one or several amino acids” means a number of amino acids that can be added, deleted or substituted by one or several site-directed mutagenesis methods.
  • the site-directed mutagenesis method can be performed, for example, using a synthetic oligonucleotide primer complementary to the single-stranded phage DNA to be mutated, except for the specific mismatch that is the desired mutation, as follows. it can. That is, a strand complementary to the phage is synthesized using the above-mentioned synthetic oligonucleotide as a primer, and a host cell is transformed with the obtained double-stranded DNA. The transformed bacterial culture is plated on agar and plaques are formed from single cells containing the phage.
  • the new colonies contain the phage having the mutation as a single strand, and the remaining 50% have the original sequence.
  • a DNA that completely matches the above-described DNA having the desired mutation is not hybridized with a DNA having the original strand that hybridizes.However, at a given temperature, the obtained plaque is hybridized with a synthetic probe labeled with a kinase treatment. Let it. Next, the black that hybridizes with the probe is picked up, cultured, and the DNA is recovered.
  • One or more amino acid substitutions, deletions or insertions that do not cause the amino acid sequence of a biologically active peptide such as an enzyme to lose its activity include the above-described site-directed mutagenesis, And a method of selectively cleaving the gene, removing, adding or substituting the selected nucleotide, and then ligating.
  • CAR and CAR polypeptide used in the present invention can also be made to CAR and CAR polypeptide used in the present invention according to known methods.
  • a conservative amino acid residue refers to an amino acid having the same side chain as the amino acid residue before substitution.
  • Amino acids can be classified, for example, into the following nine groups according to the chemical properties of their side chains (hereinafter, amino acids are represented by one-letter code): (1) Neutral hydrophobic side chains
  • Proteins modified by deglycosylation or dephosphorylation by chemical or enzymatic methods are also included in the modified CAR and modified CAR polypeptide of the present invention.
  • modified CARs can also be used as CAR and CAR polypeptide in the present invention.
  • Such alterations and modifications of the protein may be made for the purpose of increasing the stability and biological activity of the CAR and the CAR polypeptide. Whether or not the activity of the modified or modified protein is maintained can be confirmed, for example, by measuring the binding activity to CARL.
  • the maintenance of biological activity does not necessarily mean an activity level equivalent to that of the natural type CAR, but even if an activity higher than the original activity is obtained, the activity may be lower or lower in some cases.
  • the maintenance of biological activity does not necessarily mean an activity level equivalent to that of the natural type CAR, but even if an activity higher than the original activity is obtained, the activity may be lower or lower in some cases.
  • CAR and CAR polypeptide used in the present invention can be isolated from nature as described above, or can be produced as a recombinant protein.
  • "Recombinant CAR” and “recombinant CAR polypeptide” are marker proteins to facilitate detection, for example, enzymes such as alkaline phosphatase (SEAP), j8-galactosidase, glutathione-S-transferase (GST),
  • SEAP alkaline phosphatase
  • GST glutathione-S-transferase
  • the protein may be expressed as a fusion protein with a binding protein such as a maltose binding protein, an Fc region of an antibody, or a fluorescent protein such as a green fluorescent protein.
  • Particularly preferred fusion proteins include those obtained by binding a marker protein to the extracellular domain of native CAR.
  • a recombinant protein containing such a fusion protein can be produced using an appropriate expression system including, for example, an in vitro system and
  • an expression vector containing a chimeric gene comprising an appropriate transcriptional and translational control region and a sequence encoding a target protein operably linked to the control region is constructed.
  • the transcriptional and translational control regions contain DNA sequences that are recognized in the chosen host and are required for expression of the protein coding sequence.
  • DNA sequences include, for example, promoters, enhancers, polyadenylation signals, operator sequences, liposome binding sites, initiation signals, terminators and the like.
  • the expression vector preferably contains a promoter / enhancer element.
  • An “operably” linked or linked is a protein coding sequence linked downstream of a control region that is transcribed under the control of the control region without shifting the reading frame, and Means extracellularly expressed.
  • Suitable expression vectors for the recombinant CAR polypeptide can be those known for expression in mammalian cells, insect cells, plant cells, yeast cells and bacterial cells. Alternatively, a commercially available expression vector may be used.
  • host cells are transformed with the constructed expression vector.
  • Many cell lines have already been established as host cell lines, and various transformation methods suitable for those host cell lines have been established.
  • any of these known host cell strains can be used, and those skilled in the art can efficiently carry out transformation by appropriately employing an introduction method suitable for the selected host. it can.
  • transformation of prokaryotic cells can be carried out by calcium treatment, electoral portation, and the like.
  • a method using agrobacterium, The leaf disk method and the like are known, and for mammalian cells, the calcium phosphate precipitation method can be exemplified.
  • the transformed cells are cultured to express the target protein.
  • the host cells are cultured by a known method suitable for the selected cells. For example, when using mammalian cells as a host, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) (Virology 8: 396 (1959), minimal essential medium (MEM) (Sciencel 22: 501 (1952)),
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • MEM minimal essential medium
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • FCS fetal calf serum
  • FCS fetal calf serum
  • the recombinant protein can be secreted out of the cell by adding a secretion signal recognized by the selected host cell to the protein.
  • the expressed recombinant protein can be obtained from the host cell or, if secreted, from the culture medium.
  • transgenic plants can be produced to produce recombinant CAR polypeptides.
  • a protein using a transgenic animal, it is desirable to express the protein in a tissue-specific manner (for example, in milk) using a promoter that achieves tissue-specific expression.
  • the CAR polypeptide used in the present invention may be a purified protein.
  • a protein expressed by a recombinant technique can be purified according to a conventional protein purification means. Chromatography such as affinity, ion exchange, gel filtration, reverse phase, adsorption and hydrophobic interaction, ethanol precipitation, recrystallization, distillation, electrophoresis, dialysis, immunoprecipitation, solvent extraction, and ammonium sulfate precipitation are used for protein. It is well known as a method for purifying &) (Strategies for Protein Purincation ana Characterization: A Laboratory Course Manual, MArshak et al. Ed. 'Cold Spring Harbor Laboratory Press (199b)) and can be used for purifying CAR polypeptide.
  • Chromatography such as affinity, ion exchange, gel filtration, reverse phase, adsorption and hydrophobic interaction, ethanol precipitation, recrystallization, distillation, electrophoresis, dialysis, immunoprecipitation, solvent extraction, and ammonium sulfate precipitation are used for protein
  • the CAR polypeptide used in the present invention may be a purified CAR polypeptide purified by such known means, or optionally, a partially purified protein.
  • a purification method using a daltathione column is effective. If the CAR polypeptide is expressed as such a fusion protein, a purification method using a nickel column can be used if the CAR polypeptide is expressed by adding it to the CAR polypeptide. Unwanted portions can also be cleaved later using enzymes such as thrombin or Factor Xa.
  • the CAR polypeptide used in the detection of Thl cells of the present invention can also be used in the state of being bound to a carrier.
  • the carrier to be immobilized must be harmless to the CAR polypeptide and cells.
  • the shape of the carrier is not particularly limited as long as it does not hinder contact of cells with the polypeptide.
  • it may be in the form of a film, fiber, granule, hollow fiber, nonwoven, porous, honeycomb, or the like.
  • the polypeptide can be bound to the inner wall of a reaction vessel such as a plate, a petri dish, a test tube, beads, or the like.
  • a reaction vessel such as a plate, a petri dish, a test tube, beads, or the like.
  • the contact area between the polypeptide and the cell sample can be controlled.
  • Detection of Thl cells of the present invention is carried out after separating lymphocytes, preferably T cells, more preferably helper T cells, from a "cell sample containing lymphocytes" by a known method, or Is preferably detected from a “cell sample containing lymphocytes” as a cell that co-expresses a lymphocyte, preferably a T cell, more preferably a marker of a helper T cell, for example, CD4.
  • lymphocytes preferably T cells, more preferably helper T cells
  • the CAR polypeptide when expressed as a fusion protein with a marker protein, a method corresponding to the marker protein used, for example, an enzyme such as alkaline phosphatase, j8-galatatosidase, etc. Detected by its activity, if it is a binding protein such as daltathione-S-transferase, maltose binding protein, etc., it is detected by the binding activity of daltathione and maltose, respectively. If it is a fluorescent protein such as a fluorescent protein, it is detected by fluorescence.
  • an enzyme such as alkaline phosphatase, j8-galatatosidase, etc.
  • a binding protein such as daltathione-S-transferase, maltose binding protein, etc.
  • it is detected by the binding activity of daltathione and maltose, respectively.
  • a fluorescent protein such as a fluorescent protein, it is detected by fluorescence
  • the CAR polypeptide bound to the Thl cells can be detected using an antibody against CAR.
  • the antibody used must recognize a portion of the CAR polypeptide other than the one that binds to CARL on Thl cells.
  • the anti-CAR antibody can be produced by a general method as in the case of the anti-CARL antibody in the following section “Method for detecting Thl cells using anti-CARL antibody”. As a specific example of antibody production, the method of Example 5 is exemplified.
  • the CAR polypeptide may be designed as a fusion protein with another polypeptide recognized by the antibody so that it can be detected by an appropriate antibody (see Examples 3 and 4).
  • epitope-antibody system can also be used (Experimental Medicine 13: 85-90 (1995). J8-galactosidase, maltose binding protein, daltathione-S-transferase (GST), manufactured as a fusion protein with green fluorescent protein (GFP), etc.
  • GST daltathione-S-transferase
  • GFP green fluorescent protein
  • small epitope-antibody systems such as polyhistidine, influenza agglutinin HA, human c-myc, FLAG, and T7 are also known, and these tags can be used as CAR polypeptides.
  • the CAR polypeptide can be detected using a commercially available antibody thereto, or the CAR polypeptide can be radioactively labeled so that it can be detected using a scintillation counter.
  • biosensors utilizing the surface plasmon resonance phenomenon for example, using BIAcore X (BIAcore), Can be observed in real time without labeling the polypeptide.
  • cells expressing the CAR polypeptide and CARL bound to the polypeptide can be detected and recovered using a magnet. Magnet devices for such recovery have also been developed and are available (eg, MACS (Daiichi Kagaku)).
  • Thl cells expressing CARL can be selected by flow cytometry using a CAR polypeptide labeled with a cell sorter (FACS), fluorescence (eg, fluorescin isothiocyanate (FITC), phycoerythrin) and the like.
  • FACS cell sorter
  • fluorescence eg, fluorescin isothiocyanate (FITC), phycoerythrin
  • the present inventors have identified CARL as a ligand on the Thl of CAR.
  • the present invention relates to a method for detecting Thl cells using an anti-CARL antibody.
  • the Thl cell is obtained by (a) contacting a cell sample containing lymphocytes with an anti-Carl antibody, and (b) detecting a cell bound to the anti-Carl antibody in step (a). Can be detected.
  • the "cell sample containing lymphocytes” in the present method is not particularly limited, as in the case of the above-mentioned “Method for detecting Thl cells using CAR", and is expected to contain lymphocytes. Blood cell samples such as bone marrow and peripheral blood can be used.
  • the contact between the antibody and the cell sample can be performed in an appropriate reaction solution in the same manner as in the case of the CAR polypeptide.
  • CARL and “CARL polypeptide” are mice belonging to IgSF consisting of 379 residues having the amino acid sequence shown in FIG. 7 (SEQ ID NO: 1; GenBank Accession No. AAH50133). Proteins and allelic variants, splicing variants, and naturally occurring CARLs, such as proteins derived from mammals other than mice, corresponding to the proteins. Further, “CARL” and “CARL polypeptide” include, in addition to the above-mentioned native CARL, non-naturally occurring polypeptides having a function equivalent to the CARL.
  • CARL and CARL polypeptide include proteins having an amino acid sequence modified from native CARL (modified CARL), CARL produced as a recombinant protein (recombinant CARL), and the like.
  • CARL and “CARL polypeptide” are used interchangeably.
  • the cDNA sequence encoding the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is GenBank
  • GenBank Accession No.BC050133 SEQ ID NO: 3
  • GenBank Accession No. XM_194453 a mouse protein in which 37 amino acids are inserted in place of the first 11 amino acids of BC050133 and the 231rd arginine is glutamine is also known.
  • GenBank Accession as a human protein corresponding to the mouse protein
  • Human AMICA protein encoded by the cDNA sequence of No. AY138965 (SEQ ID NO: 4)
  • CARL has a signal sequence estimated by the SignallP program (underlined in FIG. 7) and a transmembrane region estimated by the SMART program (dotted underline in FIG. 7). Furthermore, it was estimated by the ScanProsite program that the asparagine residues boxed in FIG. 7 undergo sugar chain modification. Also, cysteine residues marked with an asterisk (*) in FIG. 7 were presumed to form a disulfide bond.
  • CARL is selectively expressed in Thl cells in lymphocytes, and it has been shown in the present invention that CAR selectively binds to Thl in lymphocytes depending on the expression of CARL.
  • proteins exhibiting a common biological activity are conserved in the course of evolution, both in their amino acid sequences and at the level of the genes encoding the proteins! Therefore, examples of mammals other than mice and humans from which "natural CARLJ and" natural CARL polypeptide "are derived in the present invention include, for example, rat, rabbit, and rabbit. Men, primates, such as monkeys, pima, cats, pigs, pigs, goats, sheep, and monkeys, gorillas, chimpanzees, and the like, can be mentioned. Allele mutants and these mammalian proteins can be obtained, for example, using known techniques such as hybridization and PCR using probes or primers prepared based on the known base sequence or amino acid sequence of CARL.
  • a first-class cDNA library or genomic library can also be obtained by obtaining a cDNA or gene encoding the allelic variant or protein and expressing the gene.
  • CARL can also be prepared by a conventional protein synthesis method (for example, a chemical synthesis method, a cell culture method, etc.) based on a known amino acid sequence.
  • CARL and "CARL polypeptide” refer to the CAR polypeptide of the animal or a human that binds to a peptide encoded by the nucleotide sequence registered in GenBank with the number NP_034118 in the case of a mouse. If so, it refers to the following proteins that bind to the peptide encoded by the nucleotide sequence registered in GenBank with the number NM001338.
  • SEQ ID NO: 2 human CARL protein comprising the amino acid sequence
  • a protein comprising an amino acid sequence encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the protein of (1) to (5),
  • a protein comprising the amino acid sequence of the above proteins (1) to (5), wherein one or several amino acid residues are deleted, substituted, added or inserted.
  • Acquisition of a gene encoding CARL exhibiting a biological activity equivalent to that of CARL described in SEQ ID NOs: 1 and 2 by hybridization can be performed by the CAR polypeptide described in the section of ⁇ Method for detecting Thl cells using CAR '' above. Can be carried out with reference to the description of the hybridization conditions, and one or several amino acid residues having the same biological activity as CARL described in SEQ ID NOs: 1 and 2 can be obtained.
  • the deletion, substitution, addition or insertion of the amino acid sequence can be performed using the amino acid sequence for obtaining the CAR polypeptide described in the section “Method for detecting Thl cells using CAR”. This can be done with reference to the description of how to delete 'addition' substitution or insertion of residues.
  • the anti-CARL antibody used in the detection of Thl cells of the present invention may be any polyclonal antibody, monoclonal antibody, chimeric antibody, single-chain antibody (scFV ) (Huston et).
  • the anti-CARL antibody may be modified with PEG or the like, if necessary.
  • the antibody may be produced as a fusion protein with j8-galactosidase, maltose binding protein, GST, green fluorescent protein (GFP), or the like, so that the antibody can be detected without using a secondary antibody.
  • GFP green fluorescent protein
  • An anti-CARL antibody can be produced by using CARL or a fragment thereof, or a cell expressing any of them as a sensitizing antigen.
  • CARL fragment When the CARL fragment is used as an antigen, it is preferable to use the extracellular region of CARL. If necessary (for example, when the antigen fragment to be used is short), it may be bound to a carrier such as serum albumin, keyhole limpet hemocyanin, or ovalbumin to form an immunogen. Further, in order to enhance the immune response to the antigen, a known adjuvant such as aluminum adjuvant, complete or incomplete Freund's adjuvant, or B. pertussis adjuvant is used as necessary.
  • a known adjuvant such as aluminum adjuvant, complete or incomplete Freund's adjuvant, or B. pertussis adjuvant is used as necessary.
  • a polyclonal antibody against CARL can be obtained as serum, for example, by immunizing a mammal with CARL or a fragment thereof together with an adjuvant as necessary.
  • mammals to be immunized are generally, but not limited to, rodents, ephedra, and primates.
  • rodents ephedra
  • primates For example, mouse, rat, hamster Primates such as rodents of the first order, ephedras such as the heron, and monkeys such as the cynomolgus monkey, rhesus monkey, baboon, and chimpanzee.
  • Immunization of animals is performed by appropriately diluting and suspending the sensitizing antigen with PBS or saline, emulsifying it with an adjuvant, if necessary, and then injecting it intraperitoneally, subcutaneously, or in the foot of the animal. . Thereafter, the sensitizing antigen mixed with Freund's incomplete adjuvant is preferably administered several times every 4 to 21 days. Antibody production can be confirmed by measuring the antibody level in the serum of the immunized animal. The obtained serum containing the antibody may be further purified if necessary.
  • a monoclonal antibody can be produced by the following procedure. First, a spleen is excised from an animal immunized according to the above-described method, and immune cells are separated from the spleen, and then fused with an appropriate myeloma cell using polyethylene glycol or the like to prepare a hybridoma. For cell fusion, see Galfre and Milstein (1981) Methods
  • myeloma cells include cells which allow the selection of fused cells by drugs.
  • a myeloma that enables such drug selection is used, the cells are cultured in a culture solution that kills other than the fused cells (HAT culture solution or the like), and the fused cells are selectively collected.
  • HAT culture solution or the like a culture solution that kills other than the fused cells
  • a clone that produces an antibody that binds to CAR is selected from the prepared hybridomas and hybridomas.
  • the monoclonal antibody can be obtained by transplanting the selected clone into the peritoneal cavity of a mouse or the like and collecting ascites from the animal.
  • Hybridomas also sensitize human lymphocytes that were first infected with the EB virus in vitro using an immunogen, and fused the sensitized lymphocytes with human-derived myeloma cells (such as U266). It can also be obtained by a method for obtaining a hybridoma producing an antibody (JP-A-63-17688). Human antibodies can also be obtained using antibody-producing cells produced by sensitizing a transgenic animal having a human antibody gene repertoire (WO92 / 03918; al. (1997) Nat.Genet.15: 146-156 etc.).
  • Examples of a method that does not use a hybridoma include a method in which immune cells such as lymphocytes that produce antibodies are immortalized by introducing a cancer gene to produce antibodies.
  • the present invention also includes human monoclonal antibodies.
  • the monoclonal antibody immunizes a human antibody-producing transgenic non-human mammal, such as a human antibody-producing transgenic mouse, with an immunogen (antigen) such as CARL or a fragment thereof, or cells expressing any of them.
  • the monoclonal antibody can be produced according to an existing general production method.
  • the antigen is immunized to the human antibody-producing transgenic non-human mammal together with Freund's Adjuvant, if necessary.
  • the polyclonal antibody can obtain both the immunized animal power and the obtained serum power.
  • a monoclonal antibody is prepared by preparing a fused cell (hybridoma) from the antibody-producing cell obtained from the immunized animal and a myeloma cell line (myeloma cell) having no autoantibody-producing ability, and cloning the hybridoma. It is produced by selecting a clone producing a monoclonal antibody showing a specific affinity for the antigen used for immunizing the mammal.
  • the desired immunogen is added, if necessary, together with Freund's adjuvant, subcutaneously to the human antibody-producing transgenic non-human mammal (particularly preferably, a “human antibody-producing transgenic mouse” described below).
  • Immunization is given by one or several injections or implantations intramuscularly, intravenously, in the footpad or intraperitoneally. Usually, immunization is performed 1 to 4 times about every 1 to 14 days after the initial immunization, and antibody-producing cells are obtained from the immunized mammal about 1 to 5 days after the final immunization. The number of immunizations and the time interval can be appropriately changed depending on the nature of the immunogen used.
  • a fusion cell (hypridoma) secreting a human monoclonal antibody is performed according to the method of Kohler and Milstein et al. (Nature, Vol. 256, p. 495-497, 1975) and a modification method equivalent thereto. be able to.
  • a human antibody-producing transgenic non-human mammal immunized as described above is also obtained from a spleen, lymph node, bone marrow, tonsil, etc., and preferably antibody-producing cells contained in the spleen, and preferably mice, rats, It is prepared by cell fusion with a myeloma cell having no autoantibody-producing ability derived from a mammal such as a guinea pig, a hamster, a heron or a human, more preferably a mouse, a rat or a human.
  • Myeloma cells used for cell fusion include, for example, mouse-derived myeloma. P3 / X63- AG8.653 (ATCC No. CRL-1580), P3 / NSI / 1- Ag4-1 (NS-1),
  • P3 / X63-Ag8.Ul P3U1
  • SP2 / 0-Agl4 Sp2 / 0, Sp2
  • NS0 PAI
  • FO or BW5147 rat-derived myeloma 210RCY3-Ag.2.3.
  • GM1500-6TG-Al-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 or CEM-T15 can be used.
  • the screening of cells producing monoclonal antibodies (eg, hybridomas) was performed by culturing the cells in, for example, a microtiter plate, and using the culture supernatant of the wells in which proliferation had been observed in the aforementioned immunization.
  • the reactivity to the immunizing antigen can be measured by, for example, an enzyme immunoassay such as RIA, ramo immunoassay (enzyme-iinKed immuno-solvent assay) or the like.
  • Production of monoclonal antibodies from hybridomas is performed in vitro, or in vivo, such as in mice, rats, guinea pigs, hamsters, or egrets, preferably in mice or rats, more preferably in ascites of mice. Isolation can be performed from the obtained culture supernatant or the ascites of a mammal.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be produced in large quantities by the following method.
  • hybridoma force Clones genes (such as cDNAs) encoding each of the heavy and light chains of the monoclonal antibody.
  • An expression vector is prepared by inserting the genes encoding the cloned heavy and light chains respectively separately or into a single vector.
  • the vector is introduced into a fertilized egg of a desired non-human mammal (such as a goat).
  • the fertilized egg into which the gene has been introduced is transplanted into the uterus of a foster mother to obtain a chimeric non-human animal.
  • the chimeric goat is further bred to another non-human mammal to thereby obtain a transgenic non-human mammal (genes) in which the genes encoding each of the heavy and light chains have been incorporated into endogenous genes. Make a giant, a wedge or a pig).
  • a low calcium medium such as Ham'F12 medium, MCDB153 medium or low calcium MEM medium and a high calcium medium such as MCDB104 medium, MEM medium, D-MEM medium, RPMI1640 medium, ASF104 medium or RD medium
  • the basal medium may contain, for example, serum, hormones, cytokins and Z or various inorganic or organic substances depending on the purpose.
  • the above-mentioned culture supernatant or ascites is subjected to a saturated ammonium sulfate, euglobulin precipitation method, a force proic acid method, a force prillic acid method, an ion exchange chromatography (DEAE Or DE52, etc.), affinity column chromatography such as an anti-immunoglobulin column or a protein A column.
  • the human monoclonal antibody of the present invention has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of each of the heavy chain and Z or light chain constituting the antibody. Heavy chain and Z or light chain human monoclonal antibodies are also included.
  • the anti-CARL antibody further includes an antibody fragment as described above.
  • Antibody fragments can be produced by treating a polyclonal or monoclonal antibody with an enzyme such as papain or pepsin. Alternatively, it can be produced by genetic engineering using a gene encoding an antibody fragment (Co et al. (1994) J. Immunol. L52: 2968-2976; Better and Horwitz (1989) Methods Enzymol. 178: 476-496; Pluckthun and Skerra (1989) Methods Enzymol. 178: 497-515; Lamoyi (l 986) Methods Enzymol. L21: 652-663; Rousseaux et al. (1986) 121: 663-669; Bird and Walker (1991) Trends Biotechnol. 9: 132-137).
  • the multispecific antibodies contained in the anti-CARL antibody include bispecific antibodies (BsAb), diapody (Db) and the like.
  • Multispecific antibodies are: (1) Antibodies with different specificities are converted to heterobifunctional linkers (Paulus (1985) Behring Inst.Mill. 78: 118-132); (2) Method of fusing hybridomas secreting different monoclonal antibodies to produce BsAb from the hybridomas (Millstein and Cuello (1983) Nature 305: 537-539); (3) Transfection of eukaryotic cell expression systems such as mouse myeloma cells by using different monoclonal antibody light and heavy chain genes (a total of four types of DNA).
  • Db is a dimeric antibody fragment composed of two divalent polypeptide chains that can be constructed by gene fusion, and can be produced by a known method (Holliger et al.).
  • the recovery and purification of antibodies and antibody fragments can be performed using protein A or G, or by a method similar to general purification of other proteins (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and David Lane ed., Old Spring Harbor Laboratory Press (1988)).
  • protein A is used for purification of the antibody of the present invention
  • a known protein A column such as Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (Pharmacia) and the like can be used.
  • the concentration of the obtained antibody can be determined by measuring the absorbance of the sample or the antigen-binding activity of the antibody in the sample.
  • the antigen-binding activity of an antibody can be measured by absorbance measurement, a fluorescent antibody method, an enzyme-linked immunosorbent assay (EIA), a radioimmunoassay (RIA), an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), or the like.
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the protein CAR or CARL, or a part thereof
  • examples of the sample containing the antibody include a culture supernatant of antibody-producing cells, a purified antibody, and the like. Subsequently, after adding a secondary antibody that recognizes the anti-CARL antibody, the plate is incubated.
  • the plate is washed, and the label added to the secondary antibody is detected. That is, when the secondary antibody is labeled with, for example, alkaline phosphatase, the antigen binding activity is measured by adding an enzyme substrate such as ⁇ -nitrophenyl phosphoric acid and measuring the absorbance.
  • an enzyme substrate such as ⁇ -nitrophenyl phosphoric acid
  • absorbance can be.
  • a commercially available system such as BIAcore (Amersham Pharmacia) can also be used for antibody activity evaluation.
  • Detection of Thl cells using the anti-CARL antibody of the present invention may be performed using "a cell sample containing lymphocytes”. Lymphocytes, preferably, T cells, more preferably, helper T cells are isolated by a known method, or lymphocytes, preferably T cells, are extracted from a “cell sample containing lymphocytes”.
  • a cell that co-expresses a T cell more preferably a marker of a helper T cell, for example, CD4.
  • the antibody may be immobilized on a suitable carrier before contact with the cells.
  • the antibody-bound cells are selectively purified by subjecting the antibody to affinity purification. It can also be detected and collected.
  • the anti-CARL antibody is conjugated to biotin
  • a complex of the antibody and the cell can be purified by contacting it with a plate, column, or the like to which avidin or streptavidin has been conjugated.
  • the anti-CARL antibody may be used by immobilizing it on an offset carrier as exemplified in the immobilization of CAR described above.
  • a fluorescent antibody method is used to detect Thl cells using an anti-CARL antibody.
  • ELISA a substance that can easily detect antibodies is used as a substrate or detected It is labeled with an enzyme (eg, peroxidase) that generates a possible product, allowed to act on a substrate, and the concentration of the substrate or product is measured using an absorbance meter, etc.
  • an enzyme eg, peroxidase
  • the San German ELISA is also known.
  • two types of antibodies that bind to different antigenic sites are used, and only one of the antibodies is labeled with an enzyme or the like for analysis.
  • Detection can be performed using a chiller counter, etc.
  • immunohistochemical staining an antibody is labeled, allowed to react with tissues or cells, and the label is detected using a microscope.
  • immunoprecipitation method an antibody is allowed to react with a cell sample, and then a carrier that specifically binds to immunoglobulin (such as protein G-Sepharose) is added to the reaction solution. Then, a cell-antibody complex is precipitated.
  • a carrier that specifically binds to immunoglobulin such as protein G-Sepharose
  • Thl cells can be detected by detecting an anti-CARL antibody.
  • Thl cells expressing CARL can be selected by flow cytometry using a cell sorter and an anti-CARL antibody labeled with fluorescence or the like, or using a Noosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon.
  • Flow cytometry and a method using a magnet as a carrier are particularly simple methods, and are preferable for detecting Thl cells of the present invention.
  • the above-described CAR polypeptide and anti-CARL antibody can also be included in a kit for detecting Thl cells.
  • the present invention relates to a kit for detecting Thl cells comprising a CAR polypeptide or an anti-CARL antibody.
  • the CAR polypeptide and the anti-CARL antibody may be included in a kit in a form immobilized on a carrier.
  • kits of the present invention in addition to the CAR polypeptide or the anti-CARL antibody, other materials required for detecting Thl cells can be combined.
  • reagents, containers, devices, and the like required for detection of polypeptides and antibodies can be included in the kit of the present invention.
  • the CAR polypeptide or anti-CARL antibody and other required materials included in the kit may be packaged separately, packaged together, or, in some cases, only partially together.
  • the shape of the package that can be packed together is not limited at all.
  • kits for detecting the polypeptide examples include a polypeptide, an antibody, and a buffer for diluting a cell sample.
  • an anti-CAR antibody may be included in the kit.
  • a secondary antibody for detecting the antibody and when the antibody is labeled with an enzyme, a substrate for a reaction catalyzed by the enzyme can be included.
  • a magnet or the like can be included in the kit.
  • the kit for detecting Thl cells of the present invention is preferably accompanied by instructions detailing the procedure for performing detection using the CAR polypeptide or anti-CAR antibody contained in the kit.
  • the instructions can be included in the kit in the form of a pamphlet or printed on the kit package.
  • the present invention also relates to a method for examining the ratio of Thl cells to Th2 cells.
  • the helper T cells are specifically detected (for example, using CD4 as a marker) in the cell sample containing lymphocytes.
  • Thl cells can be detected.
  • the ratio of Thl cells to Th2 cells in the cell sample thus examined can be used for diagnosis of a disease involving a selective imbalance of Thl or Th2 cells.
  • Thl is considered to be dominant in organ-specific autoimmune diseases
  • Th2 response is considered to be dominant in cancer, allergy, parasite infection and the like.
  • Diagnosis can be made by a method that tests the ratio of
  • Particularly preferred diseases diagnosed by the method of the present invention for examining the ratio of Thl cells to Th2 cells include atopic diseases. Therefore, the present invention relates to a method of diagnosing a subject for an atopic disease based on the ratio of Thl and Th2 cells determined by the method of the present invention for examining the ratio of Thl cells to Th2 cells.
  • Atopic diseases diagnosed by this method include bronchial asthma, allergic rhinitis, and atopic dermatitis.
  • Th2 cells are superior to Thl cells in these atopic diseases (Okazaki H. et al. (2002) Clin Exp Allergy. 32 (8): 1236-1242; and Kim JH et al. al. (2004) J Asthma. 41 (8): 869-876), it is possible to diagnose atopic dermatitis by examining the ratio of Thl cells to Th2 cells.
  • the present invention further provides a method for screening an inhibitor of the binding between CAR and CARL (CAR-CARL binding inhibitor). Specifically, (a) a step of contacting CAR and CARL in the presence of a test substance; (b) a step of detecting the binding of CAR and CARL in step (a); (c) a detected binding of CAR and CARL And (d) selecting a test substance that inhibits the binding of CAR and CARL as compared to the absence of the test substance as an inhibitor of the binding between CAR and CARL. In this step, a CAR-CARL binding inhibitor is screened. [0072]
  • the inhibitor of the binding between CAR and CARL is not particularly limited to a specific type of substance.
  • test substance used in the screening method of the present invention may be any substance.
  • Inhibitors screened by this method inhibit the binding between CAR and CARL, and thus inhibit the adhesion of CAR-expressing epithelial cells and endothelial cells to CARL-expressing active Thl cells.
  • the inhibitor obtained by this screening can be a candidate for a therapeutic or preventive drug for a disease caused by Thl cells.
  • CAR and the CAR polypeptide used here those described in the above section "Method for detecting Thl cells using CAR" are used.
  • CAR and CAR polypeptide are marker proteins for facilitating detection, for example, enzymes such as alkaline phosphatase (SEAP) and ⁇ -galatatosidase, binding proteins such as daltathione-S-transferase (GST) and maltose binding protein.
  • SEAP alkaline phosphatase
  • GST daltathione-S-transferase
  • it may be produced by expressing it as a fusion protein with a fluorescent protein such as an antibody Fc region or a green fluorescent protein.
  • CARL and “CARL polypeptide” used in the present invention are the same as CAR and CAR polypeptide, as described in the section “Thl cell detection method using anti-CARL antibody” above. And proteins having an amino acid sequence modified from natural CARL in addition to natural CARL.
  • the CARL polypeptide used in the present method is preferably a protein containing the extracellular domain of CARL, as long as it retains the ability to bind to CAR so that it can be used for screening for a CAR-CARL binding inhibitor. is there.
  • polypeptides having a function equivalent to that of CARL include domains required for binding of CARL of natural type CARL, particularly polypeptides containing domain 1, and amino acids high in natural type CARL and particularly in its active center. Proteins showing sequence homology can be mentioned.
  • domain 1 is a domain inferred to have homology to the Ig-like domain.
  • SEQ ID NO: 1 is a region that has amino acid sequences from the 30th to 139th amino acids
  • SEQ ID NO: 2 is This region consists of the 136th amino acid sequence. Prediction of protein domains is possible from domain search sites, for example, http: @ smart.emW-heidelberg.de /.
  • high amino acid sequence homology refers to, for example, 30, 35, 40, or 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more (eg, 80, 90 or 95% or more). Means identity.
  • the force of contacting CAR and CARL that bind to each other in the presence of the test substance This contact is usually carried out by adding CARL to the reaction solution containing CAR and the test substance, Conversely, the reaction is performed by adding CAR to the reaction solution containing CARL and the test substance.
  • the reaction solution used at this time is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction between CAR and CARL.
  • the contact time is not particularly limited, and the contact can be carried out for a time sufficient for binding CAR and CARL, for example, 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, or 5 minutes or more. With reference to Example 11 in which the affinity for the CAR and CARL extracellular regions was examined, these contact conditions can be determined as appropriate.
  • screening may be performed by binding either CAR or CARL onto a carrier.
  • a carrier various carriers exemplified in the above-mentioned “Method for detecting Thl cells using CAR” can be used.
  • an inhibitor is screened as follows. First, contact CAR and CARL in the presence of the test compound. At this time, it is assumed that the CAR is fixed as an example. After contact, wash the carrier thoroughly and wash away CARL not bound to CAR. Next, the detection of CARL bound to CAR is performed. Detection of CARL can be performed using an antibody against CARL. Alternatively, when using labeled CARL, the label may be appropriately detected.
  • CAR or CARL may be used as CAR or CARL.
  • Such a cell may be one in which a gene encoding CAR or CARL has been introduced into an appropriate host cell and expressed on the cell membrane.
  • screening of a CAR- CARL binding inhibitor can also be performed by a two-hybrid method (Dalton and Treisman (l 992) Cell 68: 597-612; Fields and Sternglanz (1994) Trends Genet. 10: 286- 292).
  • the two-hybrid method is a method for detecting the interaction between two types of proteins in vivo using the transcriptional activator GAL4 of yeast of the genus Saccharomyces.
  • GAL4 has a DNA binding domain and a transcription activation domain, and binds to the yeast GAL upstream activation sequence UAS to activate transcription. So, CAR or
  • An expression vector is constructed that encodes one of CARL as a fusion protein with a DNA binding domain and the other as a transcriptional activation domain.
  • a promoter containing the active ligase sequence UAS is constructed that encodes one of CARL as a fusion protein with a DNA binding domain and the other as a transcriptional activation domain.
  • An expression vector for a reporter gene operably linked to the above is prepared, and both expression vectors for the two fusion proteins are introduced into host cells. Then, by binding the CAR and CARL portions in the two fusion proteins, the reporter gene is expressed, and based on the expression, it can be determined whether or not CAR and CARL have bound. At this time, by adding the test substance to the system, it can be determined whether or not the test substance inhibits the binding between SCAR and CARL.
  • the test substance may be introduced into a host cell as an expression vector constructed so as to express the gene encoding the substance, if the gene can be encoded by the gene.
  • Various reporter genes are known, for example, Ade2 gene, lacZ gene, CAT gene, luciferase gene, HIS3 gene, / 3-galatatosidase, / 3-lactamase and the like can be used.
  • CAR-CARL binding inhibition pile The invention further relates to antibodies that inhibit the binding of CAR and CARL.
  • the antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single-chain antibodies
  • the antibody of the present invention may be produced as a fusion protein with j8-galactosidase, maltose binding protein, GST, green fluorescent protein (GFP), or the like so that detection can be performed without using a secondary antibody.
  • the antibody can be collected using avidin, streptavidin, or the like.
  • the antibody of the present invention can be obtained by using a cell expressing CAR or a fragment thereof, CARL or a fragment thereof, or a cell expressing any of them as a sensitizing antigen as described above in the section of ⁇ Method for detecting Thl cells using anti-CARL antibody ''. It can be produced in the same manner as the anti-CARL antibody described above.
  • the antibodies of the present invention are anti-CAR antibodies or anti-CARL antibodies.
  • the antibody of the present invention may be a hybridoma® mCAR: 5E9-ll internationally deposited under accession number FERM ABP-10317, a hybridoma® mCAR: 5Glllll internationally deposited under accession number FERM ABP-10318, and It may be an anti-CAR antibody produced from hybridoma @mCAR: 4C9-ll, which has been internationally deposited under the number FERM ABP-10320.
  • the antibody of the present invention may be an anti-CARL antibody produced from hybridoma @mCARL: # 3.11 internationally deposited under accession number FERM ABP-10319.
  • the antibodies of the present invention are not limited to these.
  • the monoclonal antibody produced by clone 5G11 obtained by the method described in Example 5 inhibits the binding between CAR and Thl cells.
  • the # 3 antibody obtained by the method described in Example 14 inhibits the adhesion between CARL and CAR-expressing cells.
  • Example 17 has been shown to be effective in treating contact dermatitis.
  • Example 16 shows that monoclonal antibodies against human CARL, # 5, # 49 and # 77, inhibit the adhesion between human CARL and cells expressing human CARL.
  • hybridomas 5E9, 5G11 and 4C9 obtained in Example 5 and the hybridoma # 3 obtained in Example 14 were deposited as follows.
  • 5E9 is the same as the following ®mCAR: 5E9-ll
  • 5G11 is the same as the following ®mCAR: 5Gl 1-1-1-11
  • # 3 is the following ®mCARL: # Same as 3.11 and 4C9 below
  • the antibody of the present invention inhibits the binding between CAR and CARL, it is expected that the antibody can suppress Thl cell adhesion, suppress cell adhesion in inflammation, and alleviate the disease state.
  • the binding of CAR and CARL is considered to be involved in the infiltration of Thl cells, and thus it is considered to be useful in elucidating the mechanism of cell invasion.
  • an antibody prepared using CAR or a fragment thereof as an antigen can be used for purification of CAR and a fragment thereof in the same manner as a general antibody. Furthermore, it can also be used in drug delivery systems targeting CAR.
  • An antibody prepared using CARL or a fragment thereof as an antigen can be used for purification of CARL and a fragment thereof and in a drug delivery system targeting CARL as in the case of CAR.
  • CAR-CARL binding inhibitor it is expected to suppress the adhesion of Thl cells and alleviate the disease state in diseases such as rheumatism and the like, in which the action of Thl cells contributes.
  • These antibodies of the present invention can be candidates for treating or preventing a disease in which Thl cells contribute. Indeed, in the present invention, it has been shown that anti-CARL antibodies are effective in treating contact dermatitis (Example 17).
  • the present invention since the antibody of the present invention inhibits the binding between CAR and CARL, it inhibits the adhesion of CARL-expressing epithelial cells and endothelial cells to CARL-expressing active Thl cells. Can be used. Therefore, the present invention relates to an inhibitor of cell adhesion comprising the antibody of the present invention. Such a composition can be used for examining the binding ability of CAR and CARL.
  • the inhibitor of the present invention is, for example, one in which the antibody of the present invention is dissolved in an appropriate buffer or the like. In addition, if necessary, preservatives, preservatives, stabilizers, etc. It does not affect sex and can be squeezed in a range.
  • the antibody of the present invention suppresses Thl cell adhesion, it is expected to be able to suppress cell infiltration in inflammation and alleviate the disease state. It is expected that it can be used as a therapeutic or preventive drug for diseases in which the action of Thl cells contributes.
  • a composition containing the antibody of the present invention can be used as a therapeutic or prophylactic agent for contact dermatitis.
  • a human antibody or a humanized antibody should be used in consideration of immunogenicity if the therapeutic and prophylactic agents are used for humans. It is desirable to do.
  • Formulation of an antibody can be carried out based on a known method for producing an antibody formulation in consideration of its properties.
  • the composition of the present invention When the composition of the present invention is used as a therapeutic or prophylactic agent, the composition contains the antibody of the present invention as an active ingredient, and is appropriately mixed with a physiologically acceptable carrier, excipient, diluent, and the like. Is done.
  • the method of administration can be either oral or parenteral, but parenteral administration is preferred.
  • injections, suppositories, nasal administration, pulmonary administration, transdermal administration, etc. Is mentioned.
  • Examples of injections can be administered systemically or locally, for example, by intravenous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intravenous infusion and the like.
  • the composition of the present invention When intended for administration as an injection, the composition of the present invention may be in the form of sterile water, physiological saline, an emulsifier, a suspending agent, a surfactant, a stabilizer, a vehicle, a preservative, etc. It is conceivable to formulate an effective amount of the antibody of the present invention in combination.
  • the composition When the composition is intended to be administered as an oral preparation, capsules, granules, suspensions, powders, tablets, emulsions, solvents and the like can be selected as the dosage form of the composition of the present invention.
  • emulsifier or surfactant examples include stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, glyceryl monostearate, sucrose fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, and the like.
  • suspending agent examples include, in addition to the surfactant, hydrophilic polymers such as polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, methinoresenorelose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and hydroxypropylcellulose.
  • hydrophilic polymers such as polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, methinoresenorelose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and hydroxypropylcellulose.
  • stabilizer examples include those commonly used in medicine.
  • vehicle examples include medicines such as ribosomes, microspheres, and lipid vesicles. Can be mentioned,
  • preservative examples include methyl paraben, propyl paraben, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • the sterile composition for injection can be formulated using an aqueous solution for injection, such as distilled water for injection, or an oily solution for injection, according to ordinary pharmaceutical practice.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mantol, and sodium chloride. It may be used in combination with an agent, for example, an alcohol, specifically, ethanol, a polyalcohol, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, a nonionic surfactant, for example, Polysorbate 80 TM or HCO-50.
  • an agent for example, an alcohol, specifically, ethanol, a polyalcohol, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, a nonionic surfactant, for example, Polysorbate 80 TM or HCO-50.
  • Oily liquids for injection include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizer. It may also be combined with a buffer such as a phosphate buffer and a sodium acetate buffer, a soothing agent such as proforce hydrochloride and a stabilizer such as benzyl alcohol, phenol and an antioxidant.
  • a buffer such as a phosphate buffer and a sodium acetate buffer
  • a soothing agent such as proforce hydrochloride
  • a stabilizer such as benzyl alcohol, phenol and an antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled into an appropriate ampule.
  • the anti-Nect-5 antibody of the present invention may be in the form of a business preparation in which a suitable vehicle such as an aqueous solution for injection or an oily solution is added to the lyophilized ampoule at the time of use.
  • the dose of the inhibitor of the present invention may be sufficient if it is an amount sufficient to suppress the adhesion of Thl cells in a lesion in which a pathological condition is formed by the action of Thl cells. It varies depending on the purpose of treatment, administration method, etc. in addition to body weight, symptoms, etc., and those skilled in the art can determine an appropriate dose in consideration of these conditions and the activity of the selected antibody. . For example, it can be selected in the range of 1 to 5 times a day, 0.0001 to 1000 mg, preferably 0.01 to 100 mg, more preferably 0.1 to 10 mg per kg of body weight at a time. Alternatively, for example, the dose can be selected within the range of 0.001 to 100,000 mg / body, preferably 0.1 to 10,000 mg / body, more preferably 1 to 100 mg / body per patient.
  • mouse heart cDNA library (Clontech Quick Clone 7133-1) was used for JAM-A, JAM-B, and JAM-C, mouse small intestinal cDNA for ESAM, and mouse spleen cDNA for CAR.
  • Each primer was designed based on the sequence of GenBank TM (JAM-A (U89915), JAM-B (AF255911), JAM-C (AJ300304), ESAM (AF361882), CAR (NM009988) and amplified by PCR. For example, the following primers were used for CAR: No: 5)
  • the obtained cDNA fragment was expressed in the expression vector pMXII IRES-EGFP (
  • Oncogene (2000) 19 (27): 3050-3058 After insertion into Oncogene (2000) 19 (27): 3050-3058), it was introduced into the 293 / EBNA-1 cell line (Invitrogen) together with the packaging vector, pCL-Eco (Imgenex, San Diego, CA), and recombined. A retrovirus was produced. This virus solution was used to infect the B300 cell line, and EGFP-positive cells were separated by cell sorting to obtain expression cells.
  • the 293 / EBNA-1 cell line was cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% FCS, and the B300 cell line was cultured in RPMI-1640 medium containing 10% FCS and 55 ⁇ M 2-mercaptoethanol.
  • the mouse spleen was ground on a 100 m mesh, and the erythrocytes were lysed to obtain splenocytes.
  • CD4 positive cells were isolated from splenocytes using MACS (Miltenyi Biotec). 4x10 7 splenocytes were suspended in 70 ⁇ l of PBS containing 1% FCS and 2 mM EDTA, and FcR blocking
  • the magnetic beads with immobilized anti-CD4 antibody were dried and reacted at 4 ° C for 20 minutes. After washing, positive selection was performed using AutoMACS. The proportion of CD4-positive cells was 90% or more. Purified CD4 positive cells The plate was immobilized with the CD3 antibody at 1 ⁇ g / ml and cultured in the presence of the anti-CD28 antibody at 10 / zg / ml. Two days later, IL-2 was added and cultured at 20 ng / ml, and activated lymphocytes 7 to 9 days after activation were used in the experiment.
  • the endogenous Sail site of PCDNA3.1 (+)-Neo vector was deleted by digestion with Sail, followed by blunting.
  • the cDNA fragment of SEAP (His) lO is pDREF-SEAP His6-Hyg (J. Biol. Chem., 1996, 271, 21514-21521), with Hindlll at the 5 'end and Xhol at the 3' end. Amplification was performed by PCR using the primers that had been prepared. The resulting cDNA fragment was digested with Hindlll and Xhol, and then transferred to a pCDNA3.1 (+)-Neo vector lacking the Sail site.
  • the extracellular region of the adhesion molecule was obtained by using the full-length cDNA obtained in Example 1 as a ⁇ type primer with Sail at the 5 ′ end and Notl at the 3 ′ end (for example, for CAR, (Primer). Number: 5) Issue: 7)
  • AP chimeric protein secreted chimeric protein
  • the resulting AP chimeric protein expression vector was introduced into a 293 / EBNA-1 cell line using TransIT LT1 (TAKARA # V2300), and cultured for 4 days for 5 days.
  • the AP chimera protein secreted into the culture supernatant is collected by centrifugation, and filtered through a 0.22 m filter.Then, Hepes (pH 7.4) and sodium azide have final concentrations of 20 mM and 0.02%, respectively. And stored at 4 ° C.
  • AP chimeric protein concentration Detects alkaline phosphatase activity in the Great EscApe detection
  • a cell adhesion experiment using an AP chimeric protein was performed. First, 50 ⁇ l of 10 / zg / ml anti-alkaline phosphatase antibody (Seradyn MIA1802) was added to a 96-well ELISA plate (Nunc), and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes to solidify. After washing the plate with PBS, non-specific binding sites were blocked with Block Ace (Dainippon Pharmaceutical). The AP chimeric protein was diluted to a final concentration of 10 nM, added to the gel, allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and immobilized.
  • Activated lymphocytes are suspended in cell adhesion buffer (RPMI 1640, 0.5% BSA, 20 mM HEPES (pH 7.4)), fluorescently labeled with Calcein-AM (Dojin), and 1 x 10 5 cells / well The reaction was carried out at 37 ° C. for 1 hour. Non-adherent cells are removed by washing, and a cell lysate (10 mM TrisHCl (pH 8.0), 1% TritonX-100) is removed, followed by Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL
  • COUNTER Perkin Elmer
  • the measurement was performed at an excitation wavelength of 485 nm and a detection wavelength of 535 nm, and the adherent cells were quantified.
  • the degree of cell adhesion was expressed as a percentage of adhered cells to added cells.
  • Immobilization of extracellular AP chimeric proteins of JAM-A, JAM-B, JAM-C, CAR and ESAM revealed that CAR functions as an adhesion molecule to activated lymphocytes (Fig. 1).
  • the CAR-AP chimeric protein was purified for use as an antigen for immunization. Purification was performed using the His Trap Kit (Amersham Biosciences # 17-1880-01) utilizing the histidine tag present at the C-terminus of the AP chimeric protein. The culture supernatant containing the CAR-AP chimeric protein was added to a 1 ml HiTrap chelating HP column (Amersham # 17-0408-01), washed with a 20 mM imidazole solution, and the CAR-AP chimeric protein was removed from the column. Elution was performed using a 500 mM imidazole solution. The concentration of the CAR-AP chimeric protein was calculated by measuring the enzyme activity using the Great EscApe detection kit (CLONTECH # K2041-1) and quantifying the protein using the Protein Assay kit II (BIO-RAD 500-0002JA).
  • the obtained CAR-AP chimeric protein was mixed with TiterMax to immunize WKY rats.
  • Immunity Lymphocytes were isolated from the isolated rats, mixed so that the ratio of P3 myeloma cells to lymphocytes was 1: 5, and cell fusion was performed using a PEG 1500 solution (Boehringer 783-641).
  • Hybridomas were selected in a HAT medium (GIBCO BRL 31062-011), and the obtained culture supernatants of the hybridomas were subjected to screening by a sandwich ELISA using the CAR-Fc chimeric protein. Cloning was performed from the positive well to obtain three types of clones (4C9, 5E9, 5G11).
  • CDlla M17 / 4 eBioScience 14-0111
  • CD18 GAME-46 BD 555280
  • CD29 (2C9.G2 BD 553343)
  • CD49d Rl-2 BD 553153
  • CD51 RMV-7 BD 552299
  • CD61 GAME -46 BD 555280
  • CD4 positive cells immediately after purification with MACS (resting CD4 + cells) and 2 days after activation with anti-CD3 antibody, add 20 ng / ml IL-2 or 25 ng / ml IL-15 for another 5 days
  • the adhesion activity of the cultured activated lymphocytes to the CAR-AP chimeric protein was examined. The results revealed that activated lymphocytes stimulated with IL-2 adhered, but activated lymphocytes stimulated with IL-15 and resting CD4 + cells did not adhere.
  • the TK1 cell line also did not adhere (Fig. 4).
  • ENSMUSG0000048534 The expression pattern correlated with the adhesive activity was shown.
  • ENSMUSG0000048534 To examine whether it is an unknown ligand for force CAR, cells expressing this molecule were generated.
  • the template used was IL-2 stimulated lymphocyte cDNA, and the primers were
  • the chimeric protein of the extracellular region of the adhesion molecules JAM-A, JAM-B, JAM-C, CAR, ESAM
  • AP chimeric protein of the extracellular region of the adhesion molecules
  • mCARL R1 [ID: 1830]
  • CARL CAR Ligand
  • CARL is a molecule belonging to IgSF that has 379 amino acids and has two Ig-like domains extracellularly (Fig. 7).
  • the CARL gene is located on mouse chromosome 9,
  • XM_194453 (gi38089807) showed high similarity in addition to BC050133 (gi29477100).
  • XM_194453 (gi38089807) is a mutant in which 37 amino acids are inserted in place of the first 11 amino acids of BC050133 (gi29477100), and the 231st arginine becomes glutamine. According to orthologue prediction of mouse Ensemble, it is registered as AMICA in human
  • AMICA The homology of AMICA (ENST00000292067, ENST00000303475) was 38.2% and 37.7% at the amino acid level, respectively. Since the human AMICA locus is located in the homologous region on the human chromosome of mouse CARL, chromosome 11 (llq23.3), human AMICA is considered to be the human homologous gene of mouse CARL, human CARL. Recently, human JAML (AJ515553) was reported as an adhesion molecule expressed on bone marrow-derived cells (Blood, 2003 (102), 3371-3378), but this molecule was 560-596 bp of human CARL (ENST00000292067).
  • the human KJAML differs from human CARL in that the amino acid sequence at positions 94 and 161 to 205 consisting of 394 amino acids is the same as human CARL.
  • a dissociation equilibrium constant Kd value was determined by the following method using a Binocore X (manufactured by BIAcore) biosensor based on surface plasmon resonance. I asked. First, a 50 g / ml anti-alkaline phosphatase antibody (manufactured by Seradyn) was immobilized on a sensor chip CM5 (manufactured by BIAcore) by the amino coupling method.
  • a culture supernatant containing the CAR-AP chimeric protein or the control AP chimeric protein diluted to 20 nM with HBS-EP buffer (manufactured by BIAcore) is added, and 500 RU of the AP chimeric protein is immobilized on the sensor chip.
  • Phased. Protein interactions Then, the culture supernatant containing the CARL-Fc chimeric protein diluted with HBS-EP buffer (BIAcore) to 20, 6, and 0.6 nM, respectively, was added at 210 ⁇ l / min for 210 seconds and measured.
  • the values of the association rate constant and the dissociation rate constant obtained using BIAevaluation software version 3.2 (BIAcore) revealed that the dissociation equilibrium constant between CAR and CARL was 4.8 nM (FIG. 8).
  • Thl and Th2 cells were prepared.
  • the CD4 positive cells purified by MACS were added to a plate on which 1 ⁇ g / ml of anti-CD3 antibody was immobilized, and stimulated in the presence of 10 g / ml of anti-CD28 antibody.
  • 15 ng / ml IL-12 in the presence of 10 ng / ml IL-12 and 10 g / ml anti-IL-4 antibody (MP4-25D2; PharMingen)
  • Anti-CD3 antibody stimulation was performed in the presence of -4 and 15 g / ml anti-IL-12 antibody (24910.1; R & D Systems).
  • the cells separated into Thl were cultured by adding 20 ng / ml IL-2 and 10 ng / ml IL-12, and the cells differentiated into Th2 were added to 20 ng / ml IL-2
  • the cells were cultured with ng / ml IL-4 added, and cells 7 to 9 days after stimulation were used in the experiment. It was confirmed that Thl cells differentiated by IFN- ⁇ production, and Th2 cells differentiated by IL-4 production.
  • the expression of CARL mRNA and the expression of HPRT mRNA (control) were examined by real-time PCR using RNA obtained from these cells, it was found that CARL was selectively expressed in Thl cells. It was lucky ( Figure 9A).
  • CARL in cells other than CD4-positive T cells was analyzed.
  • Spleen and peripheral blood capillar cells of C57BL / 6 male mice were prepared, suspended in FACS buffer (PBS / 1% FBS / 1 mM EDTA) containing 5% mouse serum and 5% rat serum, and FcR blocking solution was added and reacted on ice for 10 minutes.
  • FACS buffer PBS / 1% FBS / 1 mM EDTA
  • a modified vector pMX MCS2.2 IRES Puro into which cgcggatcctaattaattaaggtttaaactgtcgacgaattcgcggccgccacgcgttcgcga and IREII / Puro were inserted was prepared.
  • a signal sequence and a FLAG tag were inserted between BamHI and Sail of pMX MCS2.2 IRES Puro to prepare a modified vector pMX ssFLAG MCS2.2 IRES Puro.
  • the signal sequence of CARL is composed of the 1st to 20th amino acids, the 1st Ig-like domain (domain 1), the 30th to 139th amino acids, and the 2nd Ig-like domain (domain 2) It was presumed to be the 143rd to 254th amino acid (SignalP;
  • full-length CARL refers to a protein that also has the power of the 379th amino acid from the 21st amino acid
  • domain 1-deficient CARL refers to a protein that has the amino acid powers of the 21st to 29th amino acids and 140th to 379th amino acids
  • the two-defective CARL indicates a protein consisting of amino acids 21 to 139 and amino acids 255 to 379, respectively.
  • the recombinant retrovirus produced by the method described in Example 1 was used to infect the B300 cell line, and transfected cells were selected with 5 ⁇ g / ml puromycin to obtain expression cells.
  • the expression of CARL lacking the Ig-like domain on these cell surfaces was confirmed using an anti-FLAG antibody (manufactured by SIGMA) (FIG. 11A).
  • SIGMA anti-FLAG antibody
  • FIG. 11B full-length CARL-expressing B300 cells and domain 2 deficient CARL-expressing B300 cells were found to bind to the CAR-AP chimeric protein.
  • B300 cells expressing domain 1-deficient CARL did not adhere (Fig. 11B). Therefore, it became clear that the binding of CAR to CARL requires CARL domain 1.
  • anti-CARL antibody # 3 was obtained by the method described in Example 5. As a result of examining the specificity by FACS, the antibody # 3 reacted with the CARL-expressing B300 cells but did not react with the parental B300 cells (FIG. 12A). When the expression of CARL in Thl and Th2 cells prepared by the method described in Example 12 was examined using the # 3 antibody, it was found to be strongly expressed selectively in Thl cells (FIG. 12B). The # 3 antibody also inhibited the adhesion of CAR-expressing B300 cells to the CARL-AP protein (FIG. 12C).
  • mice To confirm that the same phenomenon is observed in humans, cells expressing full-length human CAR and cells expressing full-length human CARL, and AP chimeric protein and human CARL cells in the extracellular region of human CAR An outer region AP chimeric protein was prepared.
  • As an expression vector pMX MCS2.2 IRES Puro obtained in Example 13 was used. Cloning of full-length cDNAs of human CAR and CARL was performed as follows. For type I, cDNA synthesized from human whole brain (Clontech) was used. Each primer was designed as follows based on the sequence of GenBank TM (human CAR (NM-001338), human CARL (AY138965)) and amplified by PCR.
  • hCAR F CGCGTCGACATGGCGCTCCTGCTGTGCTTCGTG (SEQ ID NO: 11)
  • hCAR R2 GCGGGCGGCCGCCTATACTATAGACCCATCCTTGCT (SEQ ID NO: 12)
  • hCARL F CGCGTCGACATGTTTTGCCCACTGAAACTCATC (SEQ ID NO: 13)
  • hCARL R2 GCGGGCGGCCGCTCAAAAGGCTTGCTGTGTTTTTGG (SEQ ID NO: 14)
  • Each of the obtained cDNA fragments was inserted into an expression vector pMX MCS2.2 IRES Puro, and recombinant retroviruses were respectively produced by the method described in Example 1.
  • Expressed cells were obtained by selecting the transfected B300 cell line with 5 ⁇ g / ml puromycin.
  • the AP chimeric protein in the extracellular region of human CAR and CARL was prepared by the method described in Example 3 using the following primers.
  • hCAR F CGCGTCGACATGGCGCTCCTGCTGTGCTTCGTG (SEQ ID NO: 11)
  • hCAR R GCGGGCGGCCGCTTTATTTGAAGGAGGGACAACGTT (SEQ ID NO: 15)
  • hCARL F CGCGTCGACATGTTTTGCCCACTGAAACTCATC (SEQ ID NO: 13)
  • hCARL R GCGGGCGGCCGCATTACCACCCAAGACCAGAGGCCT (SEQ ID NO: 16)
  • Human CAR expression The expression of human CAR on the surface of B300 cells was determined using an anti-human CAR antibody (manufactured by upstate biotechnology), and the expression of human CARL on the surface of human CARL-expressing B300 cells was determined using a human CAR-AP chimeric protein. Each was confirmed ( Figure 13A). When the adhesive activity between human CAR-expressing B300 cells and the human CARL-AP chimeric protein was examined by the method described in Example 4, the binding between human CAR and human CARL was detected. Similarly, when the adhesive activity between human CARL-expressing B300 cells and the human CAR-AP chimeric protein was examined, the binding between human CAR and human CARL was detected (FIG. 13B). [Example 16] Preparation of monoclonal antibody against human CARL and cell adhesion of anti-human CARL antibody
  • Example 15 Using the human CARL-AP chimeric protein obtained in Example 15 as an antigen for immunization, four kinds of mouse anti-human CARL antibodies (# 5, # 49, # 77, # 85) were obtained by the method described in Example 5. Got. As a result of examining the specificity by FACS, the culture supernatant of # 5 reacted with human CARL-expressing B300 cells, but did not react with the parental B300 cells (FIG. 14A). Similar results were obtained with the # 49, # 77, and # 85 clones. Among these antibodies, culture supernatants of # 5, # 49, and # 77 inhibited the adhesion of human CAR-expressing B300 cells to the human CARL-AP chimeric protein (FIG. 14B).
  • CHS Contact hypersensitivity
  • Thl cells are CD4 + T lymphocytes, and when activated, sites such as IL-2, IL-12, tumor necrosis factor (TNF)
  • Th2 response is dominant in disease states such as cancer, allergy (atopic disease, etc.) and parasitic infections, but it is suggested that induction of Thl response may improve these states.
  • Thl phenotype Is reported to increase the secretion of IFN a, j8 and ⁇ , and IL-12, IL-18, etc., and enhance host immune defense against intracellular pathogens such as viruses. Therefore, the method for detecting Thl cells of the present invention can be used, for example, in the diagnosis of diseases involving selective imbalance of Th cells or Th2 cells, biased activity, etc. Wear. It can also be used in determining the therapeutic effect of such a disease.
  • the present invention relates to a method of screening for an inhibitor of the binding between CAR and CARL.
  • Inhibitors of the binding between CAR and CARL also include antibodies.These inhibitors inhibit cell adhesion between CAR-expressing epithelial cells and endothelial cells and CARL-expressing Thl cells. . Therefore, these inhibitors and compositions containing the inhibitors are expected to suppress the adhesion of Thl cells. These inhibitors and compositions containing the inhibitors can be expected to have therapeutic effects on autoimmune diseases involving Thl cells.
  • the present invention further provides an antibody that inhibits the binding of CAR and CARL.
  • Such an antibody is expected to suppress Thl cell adhesion, suppress cell adhesion in, for example, contact dermatitis, and alleviate the disease state, similarly to the above-mentioned substances.
  • the binding of CAR and CARL is considered to be involved in the infiltration of Thl cells, and thus it is considered to be useful in elucidating the mechanism of cell invasion.

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Abstract

発明者らは、細胞間接着部位に局在することが知られている接着分子CARが活性化リンパ球の接着分子として機能することを発見した。さらに、リンパ球に発現する新規のCARに対するリガンドCARLを同定し、該リガンドがTh1細胞で選択的に発現することを明らかにした。また、抗CAR抗体により活性化リンパ球のCAR分子への接着を阻害できることが判明した。そこで本発明は、Th1細胞をCARまたは抗CARL抗体により検出する方法、及び、Th1細胞の接着を抑制する阻害剤をCARとCARLの結合を指標としてスクリーニングする方法を提供するものである。さらに、本発明は、CARとCARLとの結合の阻害剤をスクリーニングする方法、CARとCARLとの結合を阻害する抗体、及び該抗体を含む治療組成物に関する。これらは、Th1細胞の浸潤が関与する炎症等の疾患の診断において、及びその病態を緩和する薬剤を提供していく上で役立つものと期待される。

Description

明 細 書
Thl細胞の検出方法
技術分野
[0001] 本発明は、細胞性免疫に関与すると考えられているヘルパー T細胞、 Thl細胞の検 出方法に関する。具体的には、本発明は、コクサツキ一ウィルス 'アデノウイルス受容 体 (coxsackie and adenovirus receptor;CAR)または、 CARと結合する Thl上のリガンド である CARリガンド (CARL)に対する抗体を用 、て Thl細胞を検出する方法に関する 。この方法を用いて生体試料中の Thl細胞及び Th2細胞の比率を検査し、生体試料 を採取した被験者をアトピー性疾患について診断することができる。本発明はさらに 、 CARと CARLとの結合の阻害剤をスクリーニングする方法に関する。また、 CARと CARLとの結合を阻害する抗体、及び該抗体を含む細胞接着阻害剤、および接触性 皮膚炎治療剤に関する。
背景技術
[0002] 生体での免疫反応は局所的に生じ、免疫細胞の浸潤が認められるという共通した 特徴がある。すなわち、必要な免疫細胞が適切に局所へ導かれることなくして、効率 良い免疫反応は生じない。また、浸潤している免疫細胞は、組織や疾患によって、種 類が異なっている。例えば、リウマチの関節にはインターロイキン (IL)-12、インターフ ェロン (IFN)- γなどを産生する Thl細胞力 喘息の肺には IL-4、 IL-5などを産生する Th2細胞が多く集積して 、る。このような選択的な細胞浸潤を可能にする細胞浸潤機 構を解明することで、特定の細胞浸潤を抑制することが可能となり、免疫反応の病態 を制御できるものと考えられて 、る。
[0003] 免疫細胞の浸潤は、大きく次の 4つのステップに分類される： (1)セレクチンを介した 血管内皮細胞との軽い接触、（2)ケモカイン受容体によるインテグリンの活性化、（3)ィ ンテグリンを介した血管内皮細胞との強い接着、そして、（4)血管内皮細胞の細胞間 隙を通り抜ける血管外遊走である。最初の 3つのステップについては、分子機構の解 明が進んで!/、るが、血管外遊走につ!、ては未だ不明な点が多 、。
[0004] 最近では、血管外遊走に関与している分子として、 JAM-Aや PECAM-1が報告され ている。 JAM-Aと PECAM-1は、ィムノグロブリンスーパーファミリー（IgSF)に属する細 胞膜蛋白質であり、細胞接着分子として機能する。
[0005] JAM-A、 JAM-B及び JAM- Cからなる JAMファミリ一は、細胞外に 2個の Ig様ドメイン を持ち、上皮細胞、内皮細胞、白血球、血小板などで発現していることが報告されて いる。 JAM- Aは、ホモフィリックな結合にカ卩えて、インテグリン a L |8 2と結合することが 報告されている。 JAM-Bは、ホモフィリックな結合に加えて、 JAM- Cやインテグリン α 4 β 1と結合することが報告されている。また、 JAM-Cは、ホモフィリックに結合しないが 、 JAM-Bやインテグリン α Μ /3 2と結合することが報告されて!、る。このように、 JAMファ ミリ一の分子は、ホモフィリックあるいはヘテロフィリックな結合を介して、内皮細胞間、 白血球と内皮細胞間、血小板と内皮細胞間の接着に関与している。
[0006] JAMファミリー以外にも、細胞外に 2個の Ig様ドメインを持つ分子が数多く存在する。
それらのうち、 JAMファミリーの分子と同様の局在を示すことが報告されて 、るものが ある。例えば、 CAR (coxsackie and adenovirus receptor)は、コクサツキ一ウイノレスとァ デノウィルスの受容体として同定され、上皮細胞や内皮細胞のタイトジャンクションや アドへレンスジャンクションに局在する (非特許文献 1及び 2)。また、 ESAM
(endothelia卜 selective adheion molecule)は、内皮細胞でのみ選択的に発現する分子 として同定されたが、その後血小板での発現が報告されている。
[0007] このような IgSFに属する分子力 上皮細胞、内皮細胞、白血球、血小板の接着に関 わっているかを調べ、細胞浸潤機構を解明することは、免疫細胞が関わる病態を制 御する上で非常に重要である。
[0008] 非特許文献 1： Cohen C.J., Shieh J.T. , Pickles R.J. , Okegawa T.， Hsieh J.T.および Bergelson J.M.、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98(26): 15191— 15196
非特許文献 2 : Walters R.W., Freimuth P., Moninger T.O., Ganske I., Zabner J.およ び Welsh M.J.ゝ Cell (2002) 110(6):789- 799
非特許文献 3 : Moog- Lutz C, Cave-Riant F., Guibal F.C. , Breau M.A. , Di Gioia Y.， Couraud P.O. , Cayre Y.E., Bourdoulous S.および Lutz P.G.ゝ Blood (2003)
102(9):3371-3378
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0009] 特定のリンパ球と接着能を持つ細胞接着分子は、当該リンパ球の選択的な細胞浸 潤に寄与しているものと考えられることから、このような細胞接着分子及びそのリガン ドを明らかにすることにより、特定のリンパ球の細胞浸潤の抑制、さらには、免疫反応 の病態の制御が可能となることが期待される。そこで、本発明の目的は、特定のリン パ球と細胞接着能をもつ細胞接着分子を探索し、その分子のリガンドを同定して、当 該接着分子、リガンド及びそれらに対する抗体の用途を見出すことにある。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは、活性化リンパ球と接着能をもつ細胞接着分子を探索するため、 IgSF に属する候補分子の細胞外領域と分泌型アルカリフォスファターゼとのキメラ分子を 用いて、活性化リンパ球の細胞接着実験を行った。その結果、 CARが活性化リンパ 球に対する接着分子として機能することが明らかとなった。
[0011] 次に、 CARに対するモノクローナル抗体を作製し、 CARに特異的な 3種類の抗体（ 4C9、 5E9及び 5G11)を得た。 CARのホモフィリックな結合による細胞接着は、 5G11に より阻害され、 4C9及び 5E9により亢進された。また、 CARと活性化リンパ球の細胞接 着は、 4C9及び 5G11によって阻害され、 5E9では抑制はみられな力つた。抗体の細胞 接着阻害活性は、抗体の結合部位に依存することが示唆された。
抗 CAR抗体を使って活性化リンパ球における CARの発現を調べたところ、細胞表 面上には CAR蛋白質の発現は認められず、 CARmRNAの発現も認められなかった。 したがって、活性化リンパ球は CARのホモフィリックな結合により細胞接着しておらず 、活性化リンパ球には CARに対する未知のリガンドが発現していることが示唆された。 そこでまず、 CARに対する未知のリガンドカインテグリンである可能性を検討した。 CDlla、 CD18、 CD29、 CD49d、 CD51、 CD61に対する抗体の細胞接着に与える効果 を調べた。しかし、 CARと活性化リンパ球の接着は、いずれの抗体によっても阻害さ れなかった。
[0012] また、 CARに対する未知のリガンドを同定するため、 CARに接着するリンパ球の状 態を調べた。 IL-2で刺激した活性化リンパ球は CARに接着するが、 IL-15で刺激した 活性化リンパ球は接着しないことが明らかになった。 T細胞株 TK1細胞及び休止期 CD4+T細胞も CARに接着しなかった。さらに、 CAR細胞外領域とアルカリフォスファタ ーゼ (AP)のキメラ蛋白質 (CAR-AP)を用いて、各種リンパ球の細胞表面への結合を 調べた。 IL-2で刺激した活性化リンパ球に CAR-APは結合したが、 IL-15で刺激した 活性化リンパ球、 T細胞株 TK1細胞及び休止期 CD4+T細胞への CAR-APの結合は 見られなかった。
[0013] 次に、 CARに対する未知のリガンドが IgSFの一員である可能性を検討した。 Mouse Ensembleのデータベースを検索して CARおよび JAMファミリー分子の染色体におけ る位置を調べた。これらの分子は、 1、 9、 16番染色体に分かれてクラスターを形成し て存在していた。そこで、 CARおよび JAMファミリー分子の近傍に存在する 50個の IgSFの分子に着目し、各種リンパ球における発現をリアルタイム PCRで調べた。その 結果、 ENSMUSG0000048534が CARへの接着活性と相関のある発現パターンを示し た。そこで、 ENSMUSG0000048534力 CARに対する未知のリガンドであるかどうかを調 ベるため、この分子の細胞外領域とアルカリフォスファターゼのキメラ蛋白質を作製し 、 B300細胞および CAR発現 B300細胞との接着活性を調べた。その結果、 CAR発現 B300細胞のみが接着し、その接着は 5G11によって阻害された。以上の結果より、 ENSMUSG0000048534がリンパ球上の新規な CARに対するリガンドであることが明ら 力となったので、 CARL(CAR Ligand)と命名した。
[0014] CARLをコードする遺伝子は、マウス 9番染色体 (46.9Mb)に位置していた。 CARLを コードする遺伝子は、 similar to AMICA(BC050133)として GenBankに登録されている 機能未知のマウス cDNA配列と一致した。 CARLのヒト相同遺伝子は、ヒト染色体上の マウス相同領域 11番染色体 (117.6Mb)に位置し、アミノ酸配列の相同性の高!ヽ、 GenBankに登録されている機能未知のヒト cDNA配列 AMICA(AY138965)であると考 えられる。最近、ヒト AMICAの一部アミノ酸配列を欠失した分子（ヒ KJAML(AJ515553) )が、骨髄由来細胞に発現する接着分子として報告された (非特許文献 3)。 BIAcoreを 用いて蛋白質相互作用を解析した結果、 CARと CARLの細胞外領域は直接結合し、 その結合親和定数は 4.8nMであることが明ら力となった。さらに、 CARLは、リンパ球に おいては Thl細胞で選択的に発現し、 CARLの発現に依存して CARがリンパ球にお いては Thl細胞と選択的に接着することが示された。 [0015] さらに、推定される 2つの Ig様ドメイン（ドメイン 1およびドメイン 2)を欠損させた CARL 発現細胞をそれぞれ作成し、これら細胞の CAR-APキメラ蛋白質に対する接着活性 を調べたところ、全長型 CARL発現 B300細胞とドメイン 2欠損型 CARL発現 B300細胞 は、 CAR-APキメラ蛋白質に接着した力 ドメイン 1欠損型 CARL発現 B300細胞は接 着しなかった。したがって、 CARと CARLの結合には CARLのドメイン 1が必要であるこ とが明ら力となった。
[0016] 次に、 CARLに特異的な #3モノクローナル抗体を得た。この #3抗体を用いて、 Thlお よび Th2細胞における CARLの発現を調べたところ、 Thl細胞で選択的に強く発現し ていた。また、 #3抗体は、 CARL-AP蛋白質に対する CAR発現 B300細胞の接着を阻 害した。さらに、 #3抗体は、全長型 CARL発現 B300細胞とドメイン 2欠損型 CARL発現 B300細胞の膜上の CARLと結合した力 ドメイン 1欠損型 CARL発現 B300細胞では結 合しな力つた。したがって、結合阻害活性を持つ #3抗体は、 CARと CARLの結合に必 要なドメイン 1を認識していることが明らかとなった。
Thl細胞以外での CARLの発現を調べたところ、 CARLは好中球に強く発現して ヽ た。また、作製した #3抗 CARL抗体を用いて、マウスの接触性皮膚炎モデルにて治療 実験を行ったところ治療効果が認められた。
[0017] ヒト CAR発現 B300細胞とヒト CAR-APキメラ蛋白質との接着活性を調べたところ、ヒト CARとヒト CARLの結合が検出された。同様に、ヒト CARL発現 B300細胞とヒト
CAR-APキメラ蛋白質およびヒト CARL-APキメラ蛋白質との接着活性を調べたところ 、ヒト CARとヒト CARLの結合が検出された。したがって、マウスで得られた現象力 ヒ トでも同様に見られることが確認された。さら〖こ、ヒト CARLに対するモノクローナル抗 体を作成したところ、 CARLの CAR発現細胞への結合を阻害する抗体が見出された。 抗ヒト CARL抗体にも、マウス同様、細胞接着阻害活性、および接触性皮膚炎に対 する治療活性があることが示された。
[0018] 以上をまとめると、本発明者により、 CARがリンパ球に対して接着分子として機能す ること、 CARLが CARのリンパ球上の新規リガンドであること、 CARLが Thl細胞で選択 的に発現すること、 CARに対して Thl細胞が選択的に接着すること、 CARと CARLの 結合にドメイン 1が必要であること、ヒトとマウスの CARと CARLは同様の特性を有する ことが示された。そこで、本発明は、 CAR及び CARLの直接的な相互作用を利用した Thl細胞の検出方法、及び検出のためのキットに関する。別の態様として、本発明は Thl細胞上の新規なリガンドとして同定された CARLに対する抗体を用いて Thl細胞 を検出する方法を提供する。このような Thl細胞の検出により、生体試料中の Thl細 胞及び Th2細胞の比率を検査し、生体試料を採取した被験者をアトピー性疾患につ いて診断することができる。よって、本発明は Thl細胞と Th2細胞の比率を検査する 方法、及び、その検査された比率に基づきアトピー性疾患について診断する方法に 関する。
さらに別の態様として、本発明は、 CARと CARLとの結合の阻害剤をスクリーニング する方法に関する。また、 CARと CARLとの結合を阻害する抗体、及び該抗体を含む 細胞接着を阻害する組成物、例えば、接触性皮膚炎を治療する組成物に関する。 即ち本発明は、より具体的には、
[1] (a)リンパ球を含む細胞試料を CARと接触させる工程、及び
(b)工程 (a)にお 、て、 CARと結合した細胞を検出する工程
を含む Thl細胞を検出する方法であって、 CARが、配列番号: 1または 2のアミノ酸配 列を含むポリペプチドに対して結合する、以下 (1)〜(6)いずれかに記載のアミノ酸配 列を含む蛋白質である方法：
(1)天然型 CARのアミノ酸配列、
(2)天然型 CARをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でノヽィ ブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列、
(3)天然型 CARのアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換 、付加または挿入されたアミノ酸配列、
(4)天然型 CARのアミノ酸配列と 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列、
(5)前記 (1)〜(4)のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列、
(6)前記 (1)〜(5)に記載の蛋白質とマーカー蛋白質を融合させたアミノ酸配列。
[2] CARが担体に結合されている、 [1]記載の方法。
[3] CARを検出試薬として含む、 Thl細胞を検出するためのキット。
[4] CARが担体に結合されている、 [3]記載のキット。 [5] (a)リンパ球を含む細胞試料を抗 CARL抗体と接触させる工程、及び
(b)工程 (a)にお ヽて、抗 CARL抗体と結合した細胞を検出する工程
を含む Thl細胞を検出する方法であって、抗 CARL抗体は、 CARLに特異的に結合 する抗体であり、 CARLは天然型 CARと結合する、以下 (1)〜(9)いずれかに記載の蛋 白質である方法：
(1)配列番号: 1のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)配列番号: 1のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(3)配列番号: 2のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(4)配列番号: 2のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(5)前記 (1)〜(4)のアミノ酸配列中の Ig様ドメイン 1を含む蛋白質、
(6)配列番号: 3または 4の cDNA配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、
(7)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してストリ ンジヱントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配 列を含む蛋白質、
(8)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列と 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を 含む蛋白質、
(9)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸残基が欠 失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質。
[6] 抗 CARL抗体が担体に結合されている、 [5]記載の方法。
[7] [1ほたは [5]に記載の方法を含んで成る、 Thl細胞と Th2細胞の比率を検査する 方法。
[8] [7]に記載の方法に基づいて検査された Thl細胞と Th2細胞の比率に基づき、細 胞試料を採取された被験者がアトピー性疾患であるかどうかを判定する方法。
[9] 抗 CARL抗体を検出試薬として含む、 Thl細胞を検出するためのキット。
[10] 抗 CARL抗体が担体に結合されている、 [9]記載のキット。
[11] 細胞試料を採取された被験者がアトピー性疾患であるかどうかを判定する [9] 記載のキット。 [12] (a)被験物質存在下で CAR及び CARLを接触させる工程、
(b)工程 (a)における CAR及び CARLの結合を検出する工程、
(c)工程 (b)にお 、て検出された CAR及び CARLの結合レベルを、被験物質不在下 の場合と比べる工程、及び
(d)被験物質不在下の場合と比べ、 CAR及び CARLの結合を抑制する被験物質を、 CARと CARLとの結合の阻害剤として選択する工程
を含む、 CARと CARLとの結合の阻害剤をスクリーニングする方法であって；
該 CARLは天然型 CARと結合する、以下 (1)〜(10)いずれかに記載の蛋白質であり、
(1)配列番号: 1のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)配列番号: 1のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(3)配列番号: 2のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(4)配列番号: 2のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(5)前記 (1)〜(4)のアミノ酸配列中の Ig様ドメイン 1を含む蛋白質、
(6)配列番号: 3または 4の cDNA配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、
(7)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してストリ ンジヱントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配 列を含む蛋白質、
(8)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸残基が欠 失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質、
(9)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列と 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を 含む蛋白質、
(10)前記 (1)〜(8)に記載の蛋白質とマーカー蛋白質を融合させた蛋白質； 該 CARは、配列番号: 1または 2のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して結合する 、以下 (11)〜(15)いずれかに記載のアミノ酸配列を含む蛋白質である方法。
(11)天然型 CARのアミノ酸配列、
(12)天然型 CARをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でノヽ イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列、 (13)天然型 CARのアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換 、付加または挿入されたアミノ酸配列、
(14)前記 (11)〜(13)のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列、
(15)前記 (14)に記載の蛋白質とマーカー蛋白質を融合させたアミノ酸配列。
[13] CARまたは CARLのどちらか一方が担体に結合されている、 [12]記載の方法。
[14] CAR及び Zまたは CARL力 宿主細胞において発現ベクターより発現される、 [12]記載の方法。
[15] CAR及び CARLの結合を阻害する抗体であって、 CARLが以下 (1)〜(9)いずれ かに記載の蛋白質である抗体：
(1)配列番号: 1のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)配列番号: 1のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(3)配列番号: 2のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(4)配列番号: 2のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(5)前記 (1)〜(4)のアミノ酸配列中の Ig様ドメイン 1を含む蛋白質、
(6)配列番号: 3または 4の cDNA配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィズ するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、
(7)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してストリン ジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列 を含む蛋白質、
(8)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列と 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を 含む蛋白質、
(9)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸残基が欠 失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質。
[16] CAR及び CARLがヒト由来である、 [15]記載の抗体。
[17] 抗体が抗 CAR抗体である、 [15]または [16]記載の抗体。
[18] 抗 CAR抗体が、受領番号 FERM ABP-10317において寄託されたハイブリド 一マ ®mCAR:5E9-l-l、受領番号 FERM ABP-10318において寄託されたハイブリド 一マ ®mCAR:5Gll-l-l-ll、または受領番号 FERM ABP-10320において寄託され たハイブリドーマ @mCAR:4C9-l-lより産生される、 [17]記載の抗体。
[19] 抗体が抗 CARL抗体である、 [15]または [16]記載の抗体。
[20] 抗 CARL抗体が、受領番号 FERM ABP-10319において寄託されたハイブリド 一マ @mCARL:#3.11より産生される、 [19]記載の抗体。
[21] [15]〜[20]のいずれか一項記載の抗体を含む細胞接着阻害剤。
[22] [15]〜[20]の ヽずれか一項記載の抗体を含む接触性皮膚炎治療剤。
を提供するものである。
図面の簡単な説明
[図 1]CARが活性化 T細胞に対する接着分子として機能することを示した図である。
[図 2]抗 CAR抗体力CARのホモフィリックな結合を介する細胞接着に及ぼす効果を示 した図である。
[図 3]活性化リンパ球上には CARが発現していないことを示した図および写真である
[図 4]リンパ球の刺激の状態によって、 CARに対する細胞接着活性が異なることを示 した図である。
[図 5]CAR ligand (CARL)の mRNAの発現パターンを示した図である。
[図 6]CAR ligand (CARL)と CARによる細胞接着と抗 CAR抗体による細胞接着阻害を 示した図である。
[図 7]CARLのアミノ酸配列を示した図である。
[図 8]CARと CARLの Kd値を求めた図である。
[図 9]Thl細胞で選択的に発現している CARLとの結合を介して CARが Thlと選択的 に接着することを示した図である。
[図 10A]抗 CAR抗体による Thl細胞の CARに対する細胞接着阻害を示した図である。
[図 10B]CD4陽性 T細胞以外の細胞における CARLの発現を示した図である。
[図 11]CARLの CARとの結合に必要な領域力 CARLの 1番目の Ig様ドメインであること を示した図である。
[図 12]抗 CARL抗体による細胞接着阻害を示した図である。
[図 13]ヒト CARとヒト CARLが結合することを示した図である。 [図 14]抗ヒト CARL抗体による細胞接着阻害を示した図である。
[図 15]接触性皮膚炎に対する抗 CARL抗体の治療効果を示した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0021] CAR fflいた Thl糸田 屮, 法
本発明により、 CARが、 Thl細胞上に特異的に発現する CARLとの直接的な結合を 介して Thl細胞と結合することが示された。そこで、本発明は、 CARを用いた Thl細胞 を検出する方法に関する。具体的には、本発明により、（a)リンパ球を含む細胞試料を CARと接触させる工程、及び (b)工程 (a)にお 、て CARと結合した細胞を検出する工程 を含む Thl細胞の検出方法が提供される。
[0022] 本検出方法における「リンパ球を含む細胞試料」は特に限定されず、リンパ球を含 むことが期待される骨髄、末梢血等の血液細胞試料が例示される。特に採取の容易 性から、末梢血が好ましい。
[0023] 細胞試料と CARとの接触は、通常、細胞を含む反応溶液中にポリペプチドを添加し て行う。細胞を含む反応液としては、例えば、実施例 4に記載の細胞接着バッファー (RPMI1640, 0.5%BSA、 20mM HEPES(pH7.4》を用いることができる。しかしながら、 本発明はこれに限定されず、 CAR及び Thl細胞が安定に維持され、これらの結合が 阻害されない限りどのような反応溶液中で接触を行ってもよい。
[0024] 本明細書において「CAR」及び「CARポリペプチド」は、 NM_001338の番号で
GenBankに登録される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列（NP_001329)からなる ヒト蛋白質、並びに、そのアレル変異体、スプライシングバリアント、及び、該蛋白質に 対応するヒト以外の哺乳動物由来の蛋白質のような、天然型 CARを含む。さらに、「 CAR」及び「CARポリペプチド」は、上述の天然型 CARに加えて、該 CARと同等の機 能を示す非天然型のポリペプチドを含む。例えば、「CAR」及び「CARポリペプチド」 は、天然型 CARから改変されたアミノ酸配列を有する蛋白質 (改変型 CAR)、及び組 換え蛋白質として製造された CAR (組換え CAR)などを含む。より具体的には、「CAR 」及び「CARポリペプチド」は、
(1)天然型 CARのアミノ酸配列、
(2)天然型 CARをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でノヽイブ リダィズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列、
(3)天然型 CARのアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換、 付加または挿入されたアミノ酸配列、
(4)天然型 CARのアミノ酸配列と 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列、
(5)前記 (1)〜(4)のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列、および
(6)前記 (1)〜(5)に記載の蛋白質とマーカー蛋白質を融合させたアミノ酸配列； を含む。本明細書において、「CAR」及び「CARポリペプチド」は互換的に使用される
[0025] 天然型 CARの由来となるヒト以外の哺乳動物としては、例えば、マウス (GenBank
NP_034118)、ラット、ゥサギ、ィヌ、ゥマ、ネコ、ブタ、ゥシ、ャギ、ヒッジ、及びサル、ゴ リラ、チンパンジー等の霊長類を挙げることができる。アレル変異体、及び、これらの 哺乳動物由来の蛋白質は、例えば、上記 CARの塩基配列またはアミノ酸配列を元に 作製したプローブまたはプライマーを利用してハイブリダィゼーシヨン、 PCR等の公知 の技術 (Samorook et al.(1989)Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Vol.1— 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press； Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons (1987-1997); DNA Cloning l ore techniques, a practical approach 2nd ed., Oxford Univ. (1995》を応用して cDNAライブラリーまたはゲノムラ イブラリー等カも該アレル変異体または蛋白質をコードする cDNAまたは遺伝子を取 得し、該遺伝子を発現させることにより得ることができる。また、公知のアミノ酸配列を 元に、慣用の蛋白質合成法により CARを調製することも可能である。
[0026] 上述したように、「CAR」及び「CARポリペプチド」は、上述の天然型 CARの他、該 CARと同等の機能を示すポリペプチドを含む。 CARの機能は、例えば当該動物の CARL,マウスであれば配列番号: 1、ヒトであれば配列番号: 2のアミノ酸配列力 なる 蛋白質との結合により確認できる。一般に、共通の生物活性を示す蛋白質はそのァ ミノ酸配列においても、また該蛋白質をコードする遺伝子レベルにおいても、進化の 過程で保存されていることが知られている。そこで、天然型 CARと同等に機能を示す ポリペプチドとしては、天然型 CARと特にその活性中心において高いアミノ酸配列相 同性を示す蛋白質を挙げることができる。 CARと結合するマウス CARLに対応するヒト AMICAは、全体のアミノ酸配列では 37.4%の相同性があった。そこで、本発明にお いて高いアミノ酸配列相同性とは、例えば、 30、 35、 40、または 50%以上、好ましくは 60%以上、より好ましくは 70%以上（例えば、 80、 90または 95%以上）の同一性を意 味する。ここで、「％同一性」という用語は、 2つのアミノ酸配列の間で最大の数値が得 られるよう、必要に応じスペースを含めて該 2つの配列を整列させた場合のアミノ酸残 基同士が一致する割合 (保存的置換は一致に含まれない）として定義される。このよ うなアミノ酸配列の％同一性は、公知のソフトウェア (BLAST (Altschul et
al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410; http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov.参照）、 BLAST— 2、 Mcgalign等)を用いて計算することができる。当業者であれば、これらの公知のソフトゥ エアを用いた同一性の計算時に必要とされる各調節可能なパラメーターを、感度等 を考慮して適宜決定することができる。
天然型 CARと同等の活性に対して高いアミノ酸配列相同性を示す蛋白質をコード する遺伝子は、公知の天然型 CARのアミノ酸配列若しくは遺伝子配列を元にプロ一 ブ、またはプライマーを作製し、ノ、イブリダィゼーシヨンまたは PCR等の慣用の手法に より得ることかでさ (Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A laboratory manual 2nd ed., Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press)、該遺伝子を発現させることによ り、天然型 CARと同等の生物活性を有する蛋白質を得ることができる。そこで、本明 細書中に記載の「CAR」及び「CARポリペプチド」には、天然型 CARをコードするポリ ヌクレオチドに対してストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドに よりコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質が含まれる。このような本発明における ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件としては、例えば、「2 X SSC、 0.1%SDS、 50°C」、「2 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」、「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」、よりストリンジェン トな条件として「2 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」、「0.5 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」及び「0.2 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」の条件を挙げることができる。より詳細には、 Rapid- hyb buffer(Amersham Life Science)を用いた方法として、 68°Cで 30分間以上プレハイブリ ダイゼーシヨンを行った後、プローブを添カ卩して 1時間以上 68°Cに保ってハイブリッド 形成させ、その後 2 X SSC、 0.1%SDS中、室温で 20分間の洗浄を 3回行い、続いて 1 X SSC、 0.1%SDS中、 37°Cで 20分間の洗浄を 3回行い、最後に 1 X SSC、 0.1%SDS中 、 50°Cで 20分間の洗浄を 2回行うことができる。その他、例えば Expresshyb
Hybridization Solution(CLONTECH)中、 55°Cで 30分間以上プレハイブリダィゼーシ ヨンを行った後、標識プローブを添カ卩して 37〜55°Cで 1時間以上インキュベートし、 2 X SSC、 0.1%SDS中、室温で 20分間の洗浄を 3回、 1 X SSC,0.1%SDS中、 37°Cで 20 分間の洗浄を 1回行ってもよい。ここで、例えば、プレハイブリダィゼーシヨン、ハイブリ ダイゼーシヨン及び 2度目の洗浄の際の温度をより高く (例えば、 60°C、 68°C等)設定 することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。当業者であれば、ノ ッフ ァ一の塩濃度、温度に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列 構成、反応時間等のその他のハイブリダィゼーシヨン条件を加味し、 CARのアイソフ オーム、ァレリック変異体、及びその他の種由来の対応する遺伝子を得るための条件 を設定することができる。ハイブリダィゼーシヨン法については、 Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.、し old Spring Harbor Press(1989))、 Current Protocols in Molecular BiologyOohn Wiley&Sons(1987— 1997》、 DNA Cloning l:Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.(Oxford University(1995》等を実験手引きとすることが できる。
本明細書中の「CAR」及び「CARポリペプチド」には、さらに、上記天然型 CARから 改変されたアミノ酸配列を有する蛋白質が含まれる。このような「改変された CAR」及 び「改変された CARポリペプチド」としては、例えば、天然型 CARの CARLとの結合に 関与しない領域を欠失させた蛋白質が挙げられる。特に好ましい天然型 CARの一部 を欠失させた蛋白質として、天然型 CAR中の細胞外ドメイン力もなるアミノ酸配列を有 するポリペプチドを例示することができる。蛋白質のドメインの予測はドメイン検索サイ ト、例えば http：〃 smart.embHieidelberg.de/から可能である。その他、天然型 CARの 1若しくは数個のアミノ酸残基または適当なポリペプチド鎖を天然型 CARに付加した 蛋白質、天然型 CARのアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸残基を置換ま たは挿入した蛋白質も本発明の改変された CAR及び改変された CARポリペプチド〖こ 含まれる。公知のアミノ酸配列を有する蛋白質において、該配列中の任意のアミノ酸 残基を欠失 ·付加'置換または挿入する方法は周知であり、例えばそれをコードする DNAに例えば、周知技術である部位特異的変異誘発 (例えば、 Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p.6487- 6500, 1982参照）を施すことにより作成できる。本 明細書において「1又は数個のアミノ酸」とは、 1回又は数回の部位特異的変異誘発 法により付加、欠失または置換できる程度の数のアミノ酸を意味する。部位特異的変 異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一 本鎖ファージ DNAに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように 行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファー ジに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖 DNAで宿主細胞を形質転換する。形 質転換された細菌の培養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細胞から プラークを形成せしめる。そうすると、理論的には 50%の新コロニーが一本鎖として 変異を有するファージを含有し、残りの 50%が元の配列を有する。上記所望の変異 を有する DNAと完全に一致するものとはハイブリダィズする力 元の鎖を有するもの とはハイブリダィズしな 、温度にぉ 、て、得られたプラークをキナーゼ処理により標識 した合成プローブとハイブリダィズさせる。次に該プローブとハイブリダィズするブラー クを拾い、培養し DNAを回収する。
尚、酵素などの生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を喪失せしめない 1又 は複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を施す方法としては、上記の部位特異的 変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法及び遺伝子を選択的に開裂し 、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加または置換し、次いで連結する方法もあ る。
本発明で用いる CAR及び CARポリペプチドについても、公知の方法に従って、この ような改変を加えることができる。天然型 CARのアミノ酸配列中、 1以上の任意のァミノ 酸配列を別のアミノ酸残基で置換する場合、保存的アミノ酸残基による置換を行うこ とが望ましい。保存的アミノ酸残基とは、置換前のアミノ酸残基と同様の側鎖を有する アミノ酸を指す。アミノ酸は例えば、その側鎖の化学的性質に従って、次の 9群に分 類することができる (以下、アミノ酸は一文字表記による)： (1)中性疎水性側鎖
(A,F,L,M,P,V,W);(2)中性極性側鎖 (C,G,N,Q,S,T,Y);(3)塩基性側鎖 (H,K,R);(4)酸性 側鎖 (D,E);(5)脂肪族側鎖 (A,G,I,L,V);(6)脂肪族水酸基側鎖 (S,T);(7)ァミン含有側鎖 (H,K,N,Q,R);(8)芳香族側鎖 (F,W,Y);(9)硫黄含有側鎖 (C )。その他、天然型 CAR中 の 1以上のアミノ酸残基をグリコシルイ匕またはリン酸ィ匕等により修飾した蛋白質、及び
、化学的または酵素的手法により脱グリコシルイ匕または脱リン酸ィ匕により改変した蛋 白質も、本発明の改変された CAR及び改変された CARポリペプチドに含まれる。この ような改変された CARもまた、本発明にお 、て CAR及び CARポリペプチドとして利用 され得る。このような蛋白質の改変及び修飾は、 CAR及び CARポリペプチドの安定性 及び生物学的活性を上げることを目的として行うことが考えられる。改変または修飾さ れた蛋白質の活性が維持されているかどうかは、例えば、 CARLとの結合活性を測定 することにより確認することができる。ここで、生物学的活性の維持とは、必ずしも、天 然型 CARと同等な活性レベルを意味するわけではなぐ元の活性より高い活性が得 られても、場合によってはより低 、活性となってもょ 、。
[0030] 本発明において用いる CAR及び CARポリペプチドは、天然より上述のようにして単 離する他、組換え蛋白質として製造することもできる。「組換え CAR」及び「組換え CARポリペプチド」は、検出を容易にするためのマーカー蛋白質、例えばアルカリフ ォスファターゼ（SEAP)、 j8 -ガラクトシダーゼ等の酵素、グルタチオン- S-トランスフエ ラーゼ (GST)、マルトース結合蛋白質等の結合蛋白質、抗体の Fc領域、緑色蛍光蛋 白質等の蛍光蛋白質との融合蛋白質として発現させて製造してもよい。特に好まし い融合蛋白質として、天然型 CARの細胞外ドメインにマーカー蛋白質を結合したもの を挙げることができる。このような融合蛋白質を含む組換え蛋白質は、例えば、 in vitro系及び宿主-ベクタ一系を含む適当な発現系を利用して産生することができる。
[0031] 一般的には、最初に適当な転写及び翻訳制御領域と、該制御領域に作動可能に 連結された目的とする蛋白質をコードする配列とからなるキメラ遺伝子を含む発現べ クタ一を構築する。転写及び翻訳制御領域は、選択した宿主において認識され、蛋 白質コード配列の発現に必要とされる DNA配列を含む。このような DNA配列には、例 えば、プロモーター、ェンハンサー、ポリアデ-ル化シグナル、オペレーター配列、リ ポソーム結合部位、開始シグナル、ターミネータ一等が含まれる。真核細胞を宿主と する場合、発現ベクターは、好ましくは、プロモーター/ェンハンサーエレメントを含む 。「作動可能に」連結または結合とは、制御領域下流に結合された蛋白質コード配列 力 読み枠がずれたりすることなぐ該制御領域の制御により転写され、宿主中また は細胞外へ発現されることを意味する。組換え CARポリペプチドのための、適当な発 現ベクターとしては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞及び細菌細胞 における発現用の公知のものを使用できる。市販の発現ベクターを用いてもょ 、。
[0032] 次の工程では、構築した発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する。既に多くの 細胞株が宿主細胞株として確立されており、それらの宿主細胞株に適した形質転換 法も種々確立されている。組換え CARポリペプチドの製造に当たっては、これら公知 のいずれの宿主細胞株を用いてもよぐ当業者であれば選択した宿主に適した導入 法を適宜採用して効率良く形質転換を行うことができる。例えば、これらの方法に限 定されるわけではないが、原核細胞の形質転換はカルシウム処理、エレクト口ボーレ ーシヨン等により行うことができ、植物細胞についてはァグロバタテリゥムを用いた方 法、リーフディスク法等が知られており、哺乳動物細胞についてはリン酸カルシウム沈 降法を例示できる。その他、核マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、 DEAE- デキストラン法、細胞融合、電気パルス穿孔法、リポフエクタミン法 (GIBCO BRL)、 FuGENE6試薬 (Boehringer- Mannheim)を使用する方法等も知られて!/、る。哺乳動物 細胞の形質転換の詳細については、 Keown et al.(1990)Methods in
Enzymol.185:527- 537及び Mansour et al. (1988)Nature 336:348- 352等の文献を参 照することができる。天然型のグリコシルイ匕が必要な場合、哺乳動物細胞を宿主とし て選択することが好ましい。哺乳動物細胞としては、 A431、 BHK、 CHO、 COS, CV-1 、 Hela、 HL-60、 Jurkat、 205、 293細胞を含む多数の細胞が知られており、組換え CARポリペプチドの製造に使用することができる。
[0033] 次の工程では、形質転換された細胞を培養し、 目的とする蛋白質を発現させる。宿 主細胞の培養は、選択した細胞に適した公知の方法により行う。例えば、哺乳動物 細胞を宿主とする場合、 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)(Virology8:396 (1959》、 minimal essential medium (MEM) (Sciencel22:501(1952))、
RPMI16400.Am.Med.Assoc. 199:519(1967》、 199(Proc.Soc.Biol.Med.73:l(1950))、 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)等の培地を用い、必要に応じ、ゥシ胎 児血清 (FCS)等の血清を添加し、 pH約 6〜8、 30〜40°Cにおいて 15〜200時間前後の 培養を行う。途中、必要に応じ培地の交換を行ったり、通気及び攪拌を行ったりして もよい。組換え蛋白質は、選択した宿主細胞において認識される分泌シグナルを蛋 白質に付加しておくことにより、細胞外へと分泌させることができる。発現された組換 え蛋白質は、宿主細胞、または分泌させた場合には培養液より取得することができる
[0034] また、必要に応じ、トランスジエニック動物（Susumu(1985)Nature315:592- 594;Lubon
(1998)Biotechnol.Annu.Rev.4: 1-54等参照）、トランスジヱニック植物等を作成し、そ れらにより組換え CARポリペプチドを産生させることも可能である。トランスジェニック 動物による蛋白質生産を行う場合、組織特異的発現を実現するプロモーターを利用 して、蛋白質を組織特異的 (例えば、乳汁中)に発現させることが望ましい。
[0035] 本発明において使用する CARポリペプチドは、精製された蛋白質であってもよい。
例えば、組換え技術により発現された蛋白質を慣用の蛋白質精製手段に従って精 製することができる。ァフィユティー、イオン交換、ゲル濾過、逆相、吸着及び疎水性 相互作用等のクロマトグラフィー、エタノール沈澱、再結晶、蒸留、電気泳動、透析、 免疫沈降、溶媒抽出、及び硫酸アンモニゥム沈澱等の手法が蛋白質の精製法として 公知で &)り (Strategies for Protein Purincation ana Characterization: A Laboratory Course Manual, MArshak et al. ed.'Cold Spring Harbor Laboratory Press(199b )、 CARポリペプチドの精製に利用することができる。本発明にお 、て利用される CARポ リペプチドは、このような公知の手段により精製された精製 CARポリペプチド、または 、場合により、部分的に精製された蛋白質であってもよい。また、例えば、 CARポリべ プチドを GSTとの融合蛋白質として発現させた場合には、ダルタチオンカラムを用い た精製法が有効である。一方、ヒスチジンタグを CARポリペプチドに付加して発現さ せた場合には、ニッケルカラムを用いた精製法が利用できる。 CARポリペプチドをこ のような融合蛋白質として製造した場合には、必要に応じて精製後にトロンビンまた はファクター Xa等の酵素を使用して、不要な部分を切断することもできる。
[0036] 本発明の Thl細胞の検出において使用される CARポリペプチドは、担体に結合さ せた状態で用いることもできる。固定する担体は、 CARポリペプチド及び細胞に対し て無害なものである必要がある。例えば、合成または天然の有機高分子化合物、ガ ラス、ポリスチレン等の有機高分子材料、シリカゲル、アルミナ、活性炭等の無機材料 、及びこれらの表面に多糖類、合成高分子等をコーティングしたものが考えられる。 担体の形状には特に制限はなぐ細胞のポリペプチドに対する接触を妨げな 、もの であればよい。例えば、膜状、繊維状、顆粒状、中空糸状、不織布状、多孔形状、ハ 二カム形状等のものが挙げられる。例えば、プレート、シャーレ、試験管等の反応容 器の内壁、ビーズ等にポリペプチドを結合することができる。使用する担体の厚さ、表 面積、太さ、長さ、形状、大きさを種々変えることにより、ポリペプチドと細胞試料との 接触面積を制御することができる。
[0037] 本発明の Thl細胞の検出は、「リンパ球を含む細胞試料」から公知の方法により、リ ンパ球、好ましくは T細胞、さらに好ましくはヘルパー T細胞を分離した後に行うか、あ るいは「リンパ球を含む細胞試料」から、リンパ球、好ましくは T細胞、さらに好ましくは ヘルパー T細胞のマーカー、例えば CD4を共発現する細胞として検出することが好ま しい。
本発明の Thl細胞検出方法としては、 CARポリペプチドをマーカー蛋白質との融合 蛋白質として発現させた場合は、採用したマーカー蛋白質に対応した方法、例えば アルカリフォスファターゼ、 j8 -ガラタトシダーゼ等の酵素であれば酵素活性により検 出し、ダルタチオン- S-トランスフェラーゼ、マルトース結合蛋白質等の結合蛋白質で あればそれぞれ結合するダルタチオン、マルトースの結合活性により検出し、抗体の Fc領域であれば Fc結合蛋白との結合により、緑色蛍光蛋白質等の蛍光蛋白質であ れば蛍光により検出する。
[0038] また、マーカー蛋白質との融合蛋白として発現させな力つた場合は、 Thl細胞と結 合した CARポリペプチドを、 CARに対する抗体を用いて検出することができる。抗 CAR抗体を用いて検出を行う場合、用いる抗体は、 Thl細胞上の CARLと結合してい る以外の CARポリペプチドの部分を認識するものでなければならな 、。抗 CAR抗体 は、次の「抗 CARL抗体を用いた Thl細胞検出方法」の項における、抗 CARL抗体と 同様に、一般的な手法により製造することができる。抗体製造の具体例として、実施 例 5の方法が例示される。その他、適当な抗体により検出可能なように、 CARポリぺプ チドを抗体により認識される別のポリペプチドとの融合蛋白質として設計してもよい（ 実施例 3及び 4参照)。市販のェピトープ-抗体系を活用することもできる (Experimental Medicine 13:85-90(1995》。 j8 -ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白 質、ダルタチオン- S-トランスフェラーゼ (GST)、緑色蛍光蛋白質 (GFP)等との融合蛋 白質として製造して、二次抗体を用いることなく検出できるようにしてもよい。その他、 ポリヒスチジン、インフルエンザ凝集素 HA、ヒト c- myc、 FLAG, T7等の小さなェピトー プ-抗体系も公知であり、これらのタグを CARポリペプチドに付加し、それらに対する 市販の抗体を用いて CARポリペプチドを検出することもできる。その他、 CARポリぺプ チドを放射性標識することによりシンチレーシヨンカウンターを用いて検出できるよう にすることも可能である。また、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサー（ 例えば、 BIAcore X (BIAcore》を使用して、 CARポリペプチドと Thl細胞との相互作用 を、ポリペプチドを標識することなぐリアルタイムに観察することもできる。
[0039] さらに、例えば、担体として磁性粒子を用い、 CARポリペプチド及び該ポリペプチド に結合した CARLを発現して ヽる細胞を、磁石を利用して検出'回収することもできる 。このような回収のための磁石装置も開発されており、利用可能である (例えば、 MACS (第一化学))。また、セルソーター (FACS)、及び蛍光 (例えば、フルォレシンイソ チオシァネート (FITC)、フィコエリスリン)等により標識した CARポリペプチドを使用して フローサイトメトリーにより CARLを発現する Thl細胞を選別することもできる。
[0040] 杭 CARL杭体 用いた Thl細胞檢出 法
本発明者らにより、 CARの Thl上のリガンドとして CARLが同定された。そこで、本発 明は、抗 CARL抗体を用いた Thl細胞の検出方法に関する。具体的には、（a)リンパ 球を含む細胞試料を抗 CARL抗体と接触させる工程、及び (b)工程 (a)にお ヽて抗 CARL抗体と結合した細胞を検出する工程により、 Thl細胞を検出することができる。
[0041] 本方法おける「リンパ球を含む細胞試料」は、上記「CARを用いた Thl細胞検出方 法」の項の場合と同様に、特に限定されず、リンパ球を含むことが期待される骨髄、 末梢血等の血液細胞試料を用いることができる。
また、抗体と細胞試料との接触も、上記 CARポリペプチドの場合と同様にして適当 な反応溶液中で行うことができる。
[0042] ここで、「CARL」及び「CARLポリペプチド」は、図 7に記載のアミノ酸配列 (配列番号 :l;GenBank Accession No. AAH50133)を有する 379残基からなる IgSFに属するマウス 蛋白質、並びに、そのアレル変異体、スプライシングバリアント、及び、該蛋白質に対 応するマウス以外の哺乳動物由来の蛋白質のような、天然型 CARLを含む。さらに、「 CARL」及び「CARLポリペプチド」は、上述の天然型 CARLに加えて、該 CARLと同等 の機能を示す非天然型のポリペプチドを含む。例えば、「CARL」及び「CARLポリべ プチド」は、天然型 CARLから改変されたアミノ酸配列を有する蛋白質 (改変型 CARL )、及び組換え蛋白質として製造された CARL (組換え CARL)などを含む。本明細書 において、「CARL」及び「CARLポリペプチド」は互換的に使用される。
配列番号: 1のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする cDNA配列は、 GenBank
Accession No.BC050133(配列番号: 3)として登録されている。また、その変異体として 、 BC050133の最初の 11アミノ酸の代わりに 37アミノ酸が挿入され、 231番目のアルギ ニンがグルタミンとなったマウス蛋白質（GenBank Accession No.XM_194453)も公知 である。該マウス蛋白質に対応するヒト蛋白質として、 GenBank Accession
No.AY138965(配列番号: 4)の cDNA配列によりコードされるヒト AMICA蛋白質
(GenBank Accession No.AAN52117;配列番号: 2)を挙げることができる。 CARLは、 SignallPプログラムにより推定されたシグナル配列（図 7中下線部）及び SMARTプログ ラムにより推定された膜貫通領域 (図 7中点下線)を有する。さらに、 ScanPrositeプログ ラムにより、図 7中四角で囲われたァスパラギン残基が糖鎖修飾を受けることが推定さ れた。また、図 7中アステリスク (*)をつけたシスティン残基はジスルフイド結合を形成 すると推定された。 CARLは、リンパ球においては Thl細胞で選択的に発現し、 CARL の発現に依存して CARはリンパ球においては Thlと選択的に結合することが本発明 において示された。一般に、共通の生物活性を示す蛋白質はそのアミノ酸配列にお いても、また該蛋白質をコードする遺伝子レベルにおいても、進化の過程で保存され て！ヽることが知られて!/ヽるので、本発明における「天然型 CARLJ及び「天然型 CARL ポリペプチド」の由来となるマウス及びヒト以外の哺乳動物としては、例えば、ラット、ゥ サギ、ィヌ、ゥマ、ネコ、ブタ、ゥシ、ャギ、ヒッジ、及びサル、ゴリラ、チンパンジー等の 霊長類を挙げることができる。アレル変異体、及び、これらの哺乳動物由来の蛋白質 は、例えば、上記 CARLの公知塩基配列またはアミノ酸配列を元に作製したプローブ またはプライマーを利用してハイブリダィゼーシヨン、 PCR等の公知の技術を応用して cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリ一等カも該アレル変異体または蛋白質をコ ードする cDNAまたは遺伝子を取得し、該遺伝子を発現させることにより得ることがで きる。また、公知のアミノ酸配列を元に、慣用の蛋白質合成法 (例えば、化学合成法、 細胞培養法等）により CARLを調製することも可能である。
本発明における「CARL」及び「CARLポリペプチド」とは、当該動物の CARポリぺプ チド、マウスであれば NP_034118の番号で GenBankに登録される塩基配列によりコー ドされるペプチドと結合する、ヒトであれば NM 001338の番号で GenBankに登録される 塩基配列によりコードされるペプチドと結合する、以下の蛋白質を指す。
(1)配列番号: 1(マウス CARL)のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)上記 (1)のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(3)配列番号: 2(ヒト CARL)のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(4)上記 (2)のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(5)前記 (1)〜(4)のアミノ酸配列中の Ig様ドメイン 1を含む蛋白質、
(6)配列番号: 3(マウス cDNA)または配列番号: 4(ヒト cDNA)の cDNA配列に対してストリ ンジェントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、
(7)上記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してストリン ジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列 を含む蛋白質、
(8)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列と 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を 含む蛋白質、および
(9)上記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸残基が欠 失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質。
配列番号: 1及び 2に記載の CARLと同等の生物活性を示す CARLをコードする遺伝子 のハイブリダィゼーシヨンによる取得は、上記「CARを用いた Thl細胞検出方法」の項 の、 CARポリペプチドを取得する際のノ、イブリダィゼーシヨン条件の説明を参照して 行うことができ、配列番号: 1及び 2に記載の CARLと同等の生物活性を示す 1または数 個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列の取得は、上記 「CARを用いた Thl細胞検出方法」の項の、 CARポリペプチドを取得する際のアミノ酸 残基を欠失 '付加'置換または挿入する方法の説明を参照して行うことができる。
[0045] 本発明の Thl細胞の検出において用いられる抗 CARL抗体は、 Thl細胞上の CARL に対して結合できるものであればよぐポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメ ラ抗体、一本鎖抗体 (scFV)(Huston et
al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;The Pharmacology of Monoclonal Antibody,Vol.l l3,Rosenburg and Moore ed. 'Springer Verlag(1994)p.269— 315)、ヒト 化抗体、多特異性抗体 (LeDoussal et al.(1992)Int.J.Cancer Suppl.7:58- 62;Paulus (1985) Behring Inst.Mitt.78:118-132;Millstein and
Cuello(1983)Nature305:537-539;Zimmermann(1986)Rev.Physiol.Biochem. Pharmacol. 105: 176-260;Van Dijk et al.(1989) Int.J.Cancer43:944- 949)、並びに、 Fab、 Fa 、 F(ab' )2、 Fv等の抗原結合部位を含む抗体断片が含まれる。さらに、抗 CARL抗体は 必要に応じ、 PEG等により修飾されていてもよい。その他、該抗体は、 j8 -ガラクトシダ ーゼ、マルトース結合蛋白質、 GST、緑色蛍光蛋白質 (GFP)等との融合蛋白質として 製造して、二次抗体を用いることなく検出できるようにしてもよい。また、ピオチン等に より抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の回収を行 免るようにすることちでさる。
[0046] 抗 CARL抗体は、 CARL若しくはその断片、またはそれら!/ヽずれかを発現する細胞 を感作抗原として用いることにより製造することができる。 CARL断片を抗原として使 用する場合には、 CARLの細胞外領域を用いることが好ましい。必要に応じ (例えば、 使用する抗原断片が短い場合）、ゥシ血清アルブミン、キーホールリンペットへモシァ ニン、卵白アルブミン等の担体に結合して免疫原としてもよい。また、抗原に対する 免疫応答を強化するため、必要に応じ、アルミニウムアジュバント、完全または不完 全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント等の公知のアジュバントを使用するこ とちでさる。
[0047] CARLに対するポリクローナル抗体は、例えば、 CARLまたはその断片を、必要に応 じアジュバントと共に哺乳動物に免疫し、該動物より血清として得ることができる。ここ で免疫する哺乳動物としては、一般的には、特にこれらに限定されるわけではないが 、ゲッ歯目、ゥサギ目、霊長目の動物が使用される。例えば、マウス、ラット、ハムスタ 一等のゲッ歯目、ゥサギ等のゥサギ目、力-クイザル、ァカゲザル、マントヒヒ、チンパ ンジ一等のサルを含む霊長目の動物が挙げられる。動物の免疫化は、感作抗原を PBSまたは生理食塩水で適宜希釈及び懸濁し、必要に応じさらにアジュバントを混合 して乳化した後、動物の腹腔内、皮下または足躕に注射することにより行う。その後、 好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を 4〜21日毎に数回投 与する。抗体の産生は、免疫化した動物の血清中の抗体レベルを測定することにより 確認することができる。得られた抗体を含む血清は、さらに必要に応じ精製してもよい
[0048] 一方、モノクローナル抗体は以下の手順により製造することができる。まず、上述の 方法に従って免疫化した動物より脾臓を摘出し、該脾臓より免疫細胞を分離してから 適当なミエローマ細胞とポリエチレングリコール等を用いて融合し、ノ、イブリドーマを 作製する。細胞の融合については、 Galfre and Milstein(1981)Methods
Enzymol.73:3- 46等の文献を参照することができる。ここで、特に適当なミエローマ細 胞として、融合細胞の薬剤による選択を可能にする細胞が挙げられる。このような薬 剤選択を可能にするミエローマを用いた場合、融合細胞以外を死滅させるような培養 液 (HAT培養液等)中で細胞の培養を行い、融合細胞を選択的に回収する。次に、作 成されたノ、イブリドーマの中から、 CARに対して結合する抗体を産生するクローンを 選択する。選択したクローンをマウス等の腹腔内に移植し、該動物の腹水を回収する ことによりモノクローナル抗体を得ることができる。
[0049] ハイプリドーマはまた、最初に EBウィルスに感染させたヒトリンパ球を in vitroで免疫 原を用いて感作し、感作リンパ球をヒト由来のミエローマ細胞 (U266等)と融合し、ヒト 抗体を産生するハイプリドーマを得る方法 (特開昭 63-17688号公報)によっても得るこ とができる。また、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジエニック動物を感 作して製造した抗体産生細胞を用いて、ヒト抗体を得ることもできる (WO92/03918; al.(1997)Nat. Genet.l5: 146- 156等）。ハイプリドーマを用いない方法としては、抗体を 産生するリンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子の導入により不死化して抗体を産生させ る方法が例示される。 [0050] 本発明は、ヒトモノクローナル抗体も含む。当該モノクローナル抗体は、ヒト抗体産 生トランスジエニックマウスのようなヒト抗体産生トランスジエニック非ヒト哺乳動物に、 CARL若しくはその断片、またはそれらいずれかを発現する細胞等の免疫原 (抗原） を免疫し、モノクローナル抗体の既存の一般的な製造方法に従って製造することが できる。
即ち、例えば、該抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant) とともに、該ヒト抗体産生トランスジエニック非ヒト哺乳動物に免疫する。ポリクローナル 抗体は、該免疫感作動物力も得た血清力も取得することができる。またモノクローナ ル抗体は、該免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄 腫系細胞 (ミエローマ細胞)から融合細胞 (ハイプリドーマ）を調製し、該ハイブリドー マをクローンィ匕し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノ クローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
[0051] さらに具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、所望の免疫原を、 必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant)とともに、該ヒト抗体産生トラ ンスジヱニック非ヒト哺乳動物（特に好ましくは後述の「ヒト抗体産生トランスジエニック マウス」）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に 1乃至数回注 射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約 1乃至 14日毎に 1乃至 4回免疫を行って、最終免疫より約 1乃至 5日後に免疫感作された 該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。免疫を施す回数及び時間的インター バルは、使用する免疫原の性質などにより、適宜変更することができる。
[0052] ヒトモノクローナル抗体を分泌する融合細胞 (ハイプリドーマ）の調製は、ケーラー及 びミルシュタインらの方法（Nature, Vol.256, p.495-497, 1975)及びそれに準じる修 飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作されたヒト抗体産生トラ ンスジヱニック非ヒト哺乳動物力も取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、 好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハ ムスター、ゥサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来 の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合させることにより調製される。
[0053] 細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマ P3/X63- AG8.653 (ATCC No. CRL- 1580)、 P3/NSI/1- Ag4- 1 (NS- 1)、
P3/X63- Ag8.Ul (P3U1)、 SP2/0- Agl4 (Sp2/0,Sp2)、 NS0、 PAI、 FOあるいは BW5147 、ラット由来ミエローマ 210RCY3- Ag.2.3.、ヒト由来ミエローマ U- 266AR1、
GM1500- 6TG- Al- 2、 UC729- 6、 CEM- AGR、 D1R11あるいは CEM- T15を使用する ことができる。モノクローナル抗体を産生する細胞 (例えば、ハイプリドーマ）のスクリ 一ユングは、該細胞を、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られた ゥエルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫抗原に対する反応性を、例えば RIA、ramo immunoassayノゃ ELI¾A、enzyme—iinKed immuno— solvent assay)等の酵 免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
ハイプリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイプリドーマをインビトロ、ま たはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはゥサギ等、好ましくはマウスまたはラ ット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、また は哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。
また、本発明のモノクローナル抗体は、下記のような方法により大量に製造すること ができる。
(1)該ハイブリドーマ力 該モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードする 遺伝子（cDNAなど）クロー-ングする。
(2)クロー-ングされた重鎖及び軽鎖の各々をコードする遺伝子を、各々別々または 単一のベクターに挿入することにより発現ベクターを調製する。
(3)該ベクターを所望の非ヒト哺乳動物 (ャギなど)の受精卵に導入する。
(4)遺伝子導入した受精卵を仮親 (Foster mother)の子宮に移植し、キメラ非ヒト動物 を得る。
(5)該キメラャギを別の非ヒト哺乳動物とさらに交配することにより該重鎖及び軽鎖の 各々をコードする遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックな非ヒト 哺乳動物（ゥシ、ャギ、ヒッジまたはブタなど）を作製する。
(6)該トランスジエニック非ヒト哺乳動物のミルク中から当該ヒトモノクローナル抗体遺 伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得する（日経サイエンス、 1997年 4月 号、第 78頁乃至 84頁)。 [0055] この方法により作製されるヒトモノクローナル抗体も本願発明に包含される。該モノク ローナル抗体産生細胞をインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、 試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイプリドーマを増殖、維 持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられる ような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地 を用いて実施することが可能である。
[0056] 基本培地としては、例えば、 Ham'F12培地、 MCDB153培地あるいは低カルシウム MEM培地等の低カルシウム培地及び MCDB104培地、 MEM培地、 D- MEM培地、 RPMI1640培地、 ASF104培地あるいは RD培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、 該基本培地は、 目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイト力イン及び Zまたは種 々無機あるいは有機物質等を含有することができる。
[0057] モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸 アンモ-ゥム、ユーグロブリン沈澱法、力プロイン酸法、力プリル酸法、イオン交換クロ マトグラフィー（DEAEまたは DE52等）、抗ィムノグロブリンカラムあるいはプロテイン A カラム等のァフィ二ティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
[0058] 本発明のヒトモノクローナル抗体には、該抗体を構成する重鎖及び Zまたは軽鎖の 各々のアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され たアミノ酸配列を有する重鎖及び Zまたは軽鎖力 なるヒトモノクローナル抗体も包 含される。
[0059] 抗 CARL抗体には、さらに上述したように抗体断片が含まれる。抗体断片は、ポリク ローナル抗体またはモノクローナル抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理するこ とにより製造し得る。または、抗体断片をコードする遺伝子を用いて、遺伝子工学的 に製造することも可能である (Co et al.(1994)J.Immunol.l52:2968-2976;Better and Horwitz(1989) Methods Enzymol.178 :476-496 ; Pluckthun and Skerra(1989)Methods Enzymol.178: 497-515 ;Lamoyi(l 986)Methods Enzymol. l21:652-663;Rousseaux et al.(1986)121: 663- 669;Bird and Walker(1991)Trends Biotechnol.9:132- 137参照)。
[0060] 抗 CARL抗体に含まれる多特異性抗体には、二特異性抗体 (BsAb)、ダイアポディ (Db)等が含まれる。多特異性抗体は： (1)異なる特異性の抗体を異種二機能性リンカ 一により化学的にカップリングする方法 (Paulus(1985)Behring Inst.Mill.78: 118-132) ; (2)異なるモノクローナル抗体を分泌するハイプリドーマを融合して、該ハイブリドーマ より BsAbを産生させる方法 (Millstein and Cuello(1983)Nature305:537- 539) ; (3)異なる モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子 (全部で 4種類の DNA)によりマウス骨髄 腫細胞等の真核細胞発現系をトランスフ クシヨンした後、二特異性の一価部分を単 離する方法 (Zimmermann(l 986)Rev. Physio . Biochem. Pharmacol.105:176- 260 ; Van Dijk et al.(1989) Int.J.Cancer43:944- 949)等により作成することができる。一方、 Dbは 遺伝子融合により構築され得る二価の 2本のポリペプチド鎖力 構成されるダイマー の抗体断片であり、公知の手法により作製することができる（Holliger et
al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444- 6448;EP404097;WO93/l 1161参照）。
[0061] 抗体及び抗体断片の回収及び精製は、プロテイン Aまたは Gを用いて行う他、一般 的なその他の蛋白質の精製と同様の方法によっても行うことができる (Antibodies:A Laboratory Manual, Harlow and David Lane ed.,し old Spring Harbor Laboratory Press(1988))。例えば、本発明の抗体の精製にプロテイン Aを利用する場合、 Hyper D、 POROS、 Sepharose F.F.(Pharmacia)等の公知のプロテイン Aカラムを使用すること ができる。得られた抗体の濃度は、試料の吸光度、または、試料中の抗体の抗原結 合活性を測定することにより決定することができる。
[0062] 抗体の抗原結合活性は、吸光度測定、蛍光抗体法、酵素免疫測定法 (EIA)、放射 免疫測定法 (RIA)、酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA)等により測定することができる。 ELISAによる測定を行う場合、蛋白質 (CAR若しくは CARL、またはその一部)を固相化 し、目的とする抗体を含む試料を添加する。ここで、抗体を含む試料としては、抗体 産生細胞の培養上清、精製抗体等が考えられる。続いて、抗 CARL抗体を認識する 二次抗体を添加した後、プレートをインキュベートする。その後、プレートを洗浄し、 二次抗体に付加された標識を検出する。即ち、二次抗体が、例えばアルカリフォスフ ァターゼで標識されて 、る場合には、 ρ-ニトロフエ二ルリン酸等の酵素基質を添加し て吸光度を測定することで、抗原結合活性を測定することができる。また、抗体の活 性評価に、 BIAcore(Amersham Pharmacia)等の市販の系を利用することもできる。
[0063] 本発明の抗 CARL抗体を用いた Thl細胞の検出は、「リンパ球を含む細胞試料」か ら公知の方法により、リンパ球、好ましくは T細胞、さらに好ましくはヘルパー T細胞を 分離した後に行うか、あるいは「リンパ球を含む細胞試料」から、リンパ球、好ましくは
T細胞、さらに好ましくはヘルパー T細胞のマーカー、例えば CD4を共発現する細胞 として検出することが好ま 、。
また本発明の抗 CARL抗体を用いた Thl細胞の検出方法にぉ 、ては、細胞との接 触前に、抗体を適当な担体に固定ィ匕してもよい。または、 CARLを発現する細胞と抗 CARL抗体とが結合する条件下で細胞試料と抗体とを接触させた後、抗体のァフィ二 ティーによる精製を行うことにより、抗体に結合した細胞を選択的に検出 ·回収するこ ともできる。例えば、抗 CARL抗体をピオチンと結合しておけば、アビジンまたはストレ ブトアビジンを結合したプレート、カラム等に対して接触させることで抗体及び細胞の 複合体を精製することができる。また、抗 CARL抗体は、上述の CARの固定において 例示した 、ずれの担体に固定して用いてもょ 、。
より具体的に抗 CARL抗体を用いて Thl細胞を検出する方法として、蛍光抗体法
(Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, 0ra ed., Academic Press(1996)参照) 、 ELISA, RIA、免疫組織染色法及び免疫細胞染色法を含む免疫組織化学染色法（ 例えば、 ABC法、 CSA法； Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, 3rd ed" Academic Press(1996)参照)、ウェスタンブロット、免疫沈降法等がある。 ELISAにおい ては、抗体を容易に検出することができる物質を基質とするか、または検出可能な生 成物を生じる酵素 (例えば、ペルォキシダーゼ)により標識し、基質を作用させ、基質 または生成物の濃度を吸光度計等により測定する。 ELISAの一つとして、サンドイツ チ ELISAも知られている。この方法では、異なる抗原部位に結合する 2種類の抗体を 使用し、一方の抗体のみを酵素等により標識して分析を行う。 RIAでは、抗体に放射 線標識を施す。標識した抗体は、シンチレーシヨンカウンタ一等を用いて検出するこ とができる。免疫組織化学染色法では、抗体を標識し、組織または細胞と反応させた 後、顕微鏡を用いて標識を検出する。標識としては蛍光物質、色素を生じる反応を 触媒する酵素を用いる。免疫沈降法では、抗体と細胞試料とを反応させた後、免疫 グロブリンに特異的に結合する担体 (プロテイン G-セファロース等)を反応液に添加し 、細胞と抗体の複合体を沈降させる。 [0065] また、 CARポリペプチドを用いる場合と同様に、抗 CARL抗体の検出を行うことにより Thl細胞を検出することができる。例えば、セルソーター及び蛍光等により標識した抗 CARL抗体を使用してフローサイトメトリーにより、または、表面プラズモン共鳴現象を 利用したノィォセンサーを用いて CARLを発現する Thl細胞を選別することもできる。 フローサイトメトリー及び磁石を担体とする方法は、特に簡便な手法であり、本発明の Thl細胞の検出に当たって好ましいものである。
[0066] Thl糸田 ίΒ)¾キット
上述の CARポリペプチド及び抗 CARL抗体は、 Thl細胞を検出するためのキットに 含ませることもできる。そこで、本発明は、 CARポリペプチドまたは抗 CARL抗体を含 む Thl細胞を検出するためのキットに関連する。 CARポリペプチド及び抗 CARL抗体 は、担体に固定された形でキットに含むようにすることもできる。
[0067] 本発明のキットには、 CARポリペプチドまたは抗 CARL抗体に加えて、その他 Thl細 胞の検出に必要とされる材料を組合せることができる。例えば、ポリペプチド及び抗 体の検出に必要とされる試薬、容器、装置等を本発明のキットに含めることができる。 キット中に含まれる CARポリペプチドまたは抗 CARL抗体、及びその他の必要とされる 材料は、個別に梱包されても、一つにまとめて梱包されても、または、場合により一部 のみを一緒にまとめて梱包してもよぐそのパッケージの形体は何等限定されない。
[0068] 検出に必要とされる材料としては、ポリペプチド、抗体または細胞試料を希釈するた めの緩衝液等を挙げることができる。その他、ポリペプチドの検出のため、例えば、抗 CAR抗体をキット中に含めてもよい。その他、抗体を検出するための 2次抗体、抗体 が酵素標識されている場合には、該酵素が触媒する反応の基質等を含めることがで きる。その他、ポリペプチドまたは抗体が磁性粒子に結合されている場合には、磁石 等をキット中に入れることもできる。本発明の Thl細胞を検出するためのキットには、 好ましくは、キットに含まれる CARポリペプチドまたは抗 CARL抗体を用いて検出を行 う手順を詳述した説明書が添付される。説明書は、パンフレットの形でキット中に含め る他、キットのパッケージ上等に印刷することもできる。
[0069] Thl細胞と Th2細胞の比率を檢杳する方法
上記、 CARまたは抗 CARL抗体を用いた Thl細胞の検出方法、及び Thl細胞検出 用のキットは、生体試料中の Thl細胞と Th2細胞の比率の検査に利用することができ る。そこで、本発明はまた、 Thl細胞と Th2細胞の比率を検査する方法に関する。具 体的には、リンパ球を含む細胞試料力 ヘルパー T細胞を特異的に検出し (例えば、 CD4をマーカーとして）、さらに、上述の CARまたは抗 CARL抗体を用いた Thl細胞の 検出方法により、 Thl細胞を検出することができる。このようにして検査された細胞試 料における Thl細胞と Th2細胞との比率により、 Thlまたは Th2細胞の選択的不均衡 が関与する疾患の診断に利用することができる。例えば、臓器特異的な自己免疫疾 患では Thlが、一方、癌、アレルギー、寄生虫感染等では Th2応答が支配的であると 考えられており、これらの疾患を本発明の Thl細胞と Th2細胞の比率を検査する方法 により診断することができる。
[0070] 本発明の Thl細胞と Th2細胞の比率を検査する方法により診断させる特に好ましい 疾患としてアトピー性疾患を挙げることができる。そこで、本発明は、本発明の Thl細 胞と Th2細胞との比率を検査する方法により決定された Thlと Th2細胞の比率に基づ き、被験者をアトピー性疾患について診断する方法に関する。本方法により診断され るアトピー性疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎が含まれ る。
こららアトピー性疾患では Thl細胞より Th2細胞が優位となっていることが知られて おり (Okazaki H. et al.(2002) Clin Exp Allergy. 32(8): 1236-1242 ;および Kim J.H. et al. (2004) J Asthma. 41(8):869-876)、 Thl細胞と Th2細胞の比率を検査することによ り、アトピー性皮膚炎を診断することが可能となる。
[0071] CAR-CARL結合阻害剤スクリーニング方法
本発明によりさらに、 CARと CARLとの結合の阻害剤（CAR-CARL結合阻害剤）をス クリーニングする方法が提供される。具体的には、（a)被験物質存在下で CAR及び CARLを接触させる工程； (b)工程 (a)における CAR及び CARLの結合を検出する工程； (c)検出された CAR及び CARLの結合程度を、被験物質不在下の場合と比べる工程； 並びに、（d)被験物質不在下の場合と比べ、 CAR及び CARLの結合を抑制する被験 物質を、 CARと CARLとの結合の阻害剤として選択する工程により、 CAR-CARL結合 阻害剤のスクリーニングを行う。 [0072] CARと CARLとの結合の阻害剤は、特に特定の種類の物質に限定されない。そこで 、本発明のスクリーニング方法において使用する被験物質はどのような物質であって もよい。例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、合 成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞 (微生物、植物細胞、動物細胞） の抽出液及び培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または 動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げ られる。本方法によりスクリーニングされた阻害剤は、 CARと CARLの間の結合を阻害 し、ひいては CARを発現する上皮細胞及び内皮細胞と、 CARLを発現する活性 Thl 細胞の接着を阻害するものである。従って、このような阻害剤は、リウマチ等の Thl細 胞の働きが一因となっている疾患において Thl細胞の接着を抑制し、病態を緩和す るものと期待される。そこで、本スクリーニングにより得られる阻害剤は、 Thl細胞が一 因となる疾患の治療または予防薬候補となり得る。
[0073] ここで用いる、 CAR及び CARポリペプチドは、上記「CARを用いた Thl細胞検出方 法」の項において説明したものを使用する。天然型 CARに加え、 CARLとの結合能を 維持した断片、改変体、修飾体等を用いることができる。 CAR及び CARポリペプチド は、検出を容易にするためのマーカー蛋白質、例えばアルカリフォスファタ一ゼ（ SEAP)、 β -ガラタトシダーゼ等の酵素、ダルタチオン- S-トランスフェラーゼ（GST)、 マルトース結合蛋白質等の結合蛋白質、抗体の Fc領域、緑色蛍光蛋白質等の蛍光 蛋白質との融合蛋白質として発現させて製造してもよ 、。
一方、本発明において使用される「CARL」及び「CARLポリペプチド」とは、 CAR及 び CARポリペプチドと同様に、上記「抗 CARL抗体を用いた Thl細胞検出方法」の項 において説明したように、天然型 CARLに加えて、天然型 CARLから改変されたァミノ 酸配列を有する蛋白質が含まれる。本方法において用いられる CARLポリペプチドは 、 CAR-CARL結合阻害剤のスクリーニングに使用することができるよう、 CARに対する 結合能を保持していればよぐ好ましくは、 CARLの細胞外ドメインを含む蛋白質であ る。さら〖こ、 CARLと同等に機能を示すポリペプチドとしては、天然型 CARLの CARとの 結合に必要なドメイン、特にドメイン 1を含むポリペプチド、及び天然型 CARLと特にそ の活性中心において高いアミノ酸配列相同性を示す蛋白質を挙げることができる。こ こでドメイン 1は、 Ig様のドメインとの相同性力 推察されるドメインで、例えば配列番 号: 1では 30番目から 139番目のアミノ酸配列力もなる領域であり、配列番号: 2では 27 番目から 136番目のアミノ酸配列からなる領域である。蛋白質のドメインの予測はドメ イン検索サイト、例えば http：〃 smart.emW-heidelberg.de/から可能である。 CARと結 合するマウス CARLに対応するヒト AMICAは、全体のアミノ酸配列では 37.4%の相同 性があった。そこで、本発明において高いアミノ酸配列相同性とは、例えば、 30、 35、 40、または 50%以上、好ましくは 60%以上、より好ましくは 70%以上（例えば、 80、 90 または 95%以上）の同一性を意味する。
[0074] 最初の工程 (a)において、互いに結合する CARと CARLとを被験物質存在下で接触 させる力 この接触は、通常、 CAR及び被験物質を含む反応溶液中に CARLを添カロ するか、逆に、 CARL及び被験物質を含む反応溶液中に CARを添加して行う。この時 使用する反応溶液は、 CARと CARLの反応を阻害しないものであればよぐ特に限定 されない。また接触の時間も特に限定されず、 CARと CARLが結合するのに十分な時 間、例えば、 1分、 2分、 3分または 5分以上接触させることができる。 CAR及び CARL細 胞外領域との親和性を調べた実施例 11を参考に、これらの接触条件は適宜決めるこ とがでさる。
[0075] ここで、 CARまたは CARLのどちらか一方を担体上に結合してスクリーニングを行つ てもよい。担体は、上記の「CARを用いた Thl細胞検出方法」において例示される各 種担体を使用することができる。ポリペプチドの一方を担体上に固定した場合には、 例えば、次のようにして阻害剤のスクリーニングを行う。まず、被験化合物存在下にお いて CAR及び CARLを接触させる。この際、例示として CARを固定すると想定する。接 触後、担体の洗浄を十分に行い、 CARに結合されていない CARLを洗い流す。次に 、 CARに結合された CARLの検出を行う。 CARLの検出は、 CARLに対する抗体を用 いて行うことができる。または、標識された CARLを使用する場合には、該標識を適宜 検出してもよい。
[0076] また、 CARまたは CARLの一方を発現して!/、る細胞を、それぞれ本発明における
CARまたは CARLとして用いてもよい。このような細胞は、 CARまたは CARLをコードす る遺伝子を適当な宿主細胞に導入し、細胞膜上に発現させたものであってもよ ヽ。 [0077] さらに、 CAR- CARL結合阻害剤のスクリーニングは、ツーハイブリッド法によって行う こともできる (Dalton and Treisman(l 992)Cell68:597-612 ;Fields and Sternglanz(1994) Trends Genet.10:286-292)。例えば、 Clontech社製の MATCHMAKER Two-Hybrid system, Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit及び MATCHMAKER One-Hybrid system, Stratagene社製の HybiZAP Two-Hybrid Vector System等の巿 販の系を利用したスクリーニングが可能である。ツーハイブリッド法は、サッカロマイセ ス属酵母の転写ァクチべ一ター GAL4を用いて、 2種類の蛋白質間の相互作用を in vivoで検出する方法である。 GAL4は、 DNA結合ドメイン及び転写活性ドメインを有し 、酵母の GAL上流活性化配列 UAS に結合し転写を活性ィ匕する。そこで、 CARまたは
G
CARLの一方を DNA結合ドメイン、そして他方を転写活性ドメインとの融合蛋白質とし てコードする発現ベクターを作成する。また、活性ィヒ配列 UASを含むプロモーター
G
に作動可能に連結したレポーター遺伝子の発現ベクターを作成し、前記 2つの融合 蛋白質の発現ベクター共に、宿主細胞に導入する。すると、 2つの融合蛋白質中の CARと CARL部分が結合することにより、レポーター遺伝子が発現し、その発現を元 に CARと CARLが結合したかどうかを判定することができる。この時、被験物質を系中 に加えておくことにより、該被験物質力 SCARと CARLの結合を阻害するかどうかを判定 することができる。被験物質は、遺伝子によりコード可能であれば、該物質をコードす る遺伝子を発現するように構築した発現ベクターとして、宿主細胞に導入してもよ ヽ。 レポーター遺伝子としては、種々のものが公知であり、例えば、 Ade2遺伝子、 lacZ遺 伝子、 CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、 HIS3遺伝子、 /3 -ガラタトシダーゼ、 /3 - ラクタマーゼ等が利用できる。
[0078] CARと CARLとの相互作用は、表面プラス、モン共鳴現象を利用したバイオセンサー ( 例えば、 BIAcore(Amersham Pharmacia》を使用してポリペプチドを標識することなく、 リアルタイムに観察することもできる。そこで、 CARと CARLを接触させる際に被験物質 をカロえておくことにより、該被験物質が CAR-CARL結合の阻害剤として働くかどうかを 、このようなバイオセンサーを用いて検出することもできる。具体的な方法については 、例えば、実施例 11を参照することができる。
[0079] CAR-CARL結合阻害杭体 本発明はさらに、 CAR及び CARLの結合を阻害する抗体に関する。本発明の抗体 には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体
(scFV)(Huston et al. (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879- 5883;The
Pharmacology of Monoclonal Antibody, Vol.11ύ, Rosenburg and Moore ed., Springer Verlag(1994)p.269- 315)、ヒト化抗体、多特異性抗体 (LeDoussal et
al.(1992)Int.J.Cancer Suppl.7:58— 62;Paulus (1985) Behring
Inst.Mitt.78: 118-132;Millstein and Cuello(1983)Nature305:537— 539; Zimmermann ( 1986)Rev. Physiol . Biochem. Pharmacol .105: 176-260 ; Van Dijk et al.(1989) Int. J. Cancer43:944-949)、並びに、 Fab、 Fa 、 F(a ） 2、 Fv等の抗原結合部位を含む抗 体断片が含まれる。さら〖こ、本発明の抗体は必要に応じ、 PEG等により修飾されてい てもよい。その他、本発明の抗体は、 j8 -ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、 GST、緑色蛍光蛋白質 (GFP)等との融合蛋白質として製造して、二次抗体を用いるこ となく検出できるようにしてもよい。また、ピオチン等により抗体を標識することによりァ ビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の回収を行えるようにすることもできる。 本発明の抗体は、 CAR若しくはその断片、 CARL若しくはその断片、またはそれらい ずれかを発現する細胞を感作抗原として用いることにより、上記「抗 CARL抗体を用い た Thl細胞検出方法」の項にお 、て説明した抗 CARL抗体と同様に製造することがで きる。好ましい態様において、本発明の抗体は、抗 CAR抗体または抗 CARL抗体であ る。例えば、本発明の抗体は、受領番号 FERM ABP-10317において国際寄託された ハイプリドーマ ®mCAR:5E9-l-l、受領番号 FERM ABP-10318において国際寄託さ れたハイブリドーマ ®mCAR:5Gl l-l-l-l l、および受領番号 FERM ABP-10320にお いて国際寄託されたハイブリドーマ @mCAR:4C9-l-lより産生される抗 CAR抗体であ つてもよい。または、本発明の抗体は、受領番号 FERM ABP-10319において国際寄 託されたハイプリドーマ @mCARL:#3.11より産生される抗 CARL抗体であってもよい。 しかし、本発明の抗体はこれらに限定されることはない。以下の実施例に詳しく開示 されるように、例えば、実施例 5記載の方法により得られたクローン 5G11が産生するモ ノクローナル抗体は、 CARと Thl細胞の結合を阻害するものである。また、実施例 14 記載の方法により得られた #3抗体は、 CARLと CAR発現細胞との接着を阻害するもの であり、さらに、接触性皮膚炎の治療に効果を有することが実施例 17に示されている 。また、ヒト CARLに対するモノクローナル抗体、 #5、 #49および #77は、ヒト CARLとヒト CAR発現細胞との接着を阻害することが実施例 16に示されている。
[0081] 実施例 5において得られたハイプリドーマ 5E9、 5G11および 4C9ならびに実施例 14 において得られたハイプリドーマ #3を、下記の通り寄託した。本明細書において、 5E9 とは下記の ®mCAR:5E9-l-lと同一であり、 5G11は下記の ®mCAR:5Gl 1-1-1-11と 同一であり、 #3は下記の ®mCARL:#3.11と同一であり、および 4C9は下記の
@mCAR:4C9-l-lと同一である。また、該ハイブリドーマが産生する抗体については、 該ハイブリドーマと同一の名称を用いるものとする。
[0082] @mCAR:5E9-l-l
(1)寄託機関の名称'あて名
名称:独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566)
(2)国際受領日： 平成 17年 4月 12日（国内寄託日：平成 16年 4月 27日）
(3)国際受領番号： FERM ABP-10317
(国内受託番号： P-20031、国内受領番号： FERM AP-20031)
[0083] @mCAR:5Gl 1-1-1-11
(1)寄託機関の名称'あて名
名称:独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566)
(2)国際受領日： 平成 17年 4月 12日（国内寄託日：平成 16年 4月 27日）
(3)国際受領番号： FERM ABP-10318)
(国内受託番号 P-20032、国内受領番号 FERM AP-20032)
[0084] @mCARL:#3.11
(1)寄託機関の名称'あて名
名称:独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566)
(2)国際受領日： 平成 17年 4月 12日 (3)国際受領番号： FERM ABP-10319
[0085] @mCAR:4C9-l-l
(1)寄託機関の名称'あて名
名称:独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566)
(2)国際受領日： 平成 17年 4月 12日
(3)国際受領番号： FERM ABP-10320
[0086] 本発明の抗体は、 CARと CARLの結合を阻害するものであることから、 Thl細胞の接 着を抑制し、炎症における細胞接着を抑制し、病態を緩和できるものと期待される。 また、 CAR及び CARLの結合は、 Thl細胞の浸潤に関与すると考えられることから、細 胞浸潤機構を解明する上でも役立つものと考えられる。
特に、本発明の抗体のうち、 CARまたはその断片を抗原として作製した抗体は、一 般的な抗体と同様に、 CAR及びその断片の精製に使用することができる。さらに、 CARをターゲットとしたドラッグデリバリーシステムにおいても利用可能である。
CARLまたはその断片を抗原として作製した抗体は、 CARと同様に、 CARL及びそ の断片の精製、 CARLをターゲットとしたドラッグデリバリーシステムにお ヽて利用する ことができる。また、上記 CAR-CARL結合阻害剤と同様に、リウマチ等の Thl細胞の 働きが一因となっている疾患において Thl細胞の接着を抑制し、病態を緩和するもの と期待される。これらの本発明の抗体は、 Thl細胞が一因となる疾患の治療または予 防薬候補となり得る。実際、本発明において、抗 CARL抗体が接触性皮膚炎の治療 に効果を有することが示されて 、る（実施例 17)。
[0087] 杭 CAR杭体含有組成物および杭 CARL杭体含有組成物
本発明の抗体は上述のように、 CARと CARLの結合を阻害するものであることから、 CARを発現する上皮細胞及び内皮細胞等の細胞と、 CARLを発現する活性 Thl細胞 の接着の阻害に利用することができる。そこで、本発明は、本発明の抗体を含む細胞 接着の阻害剤に関する。このような組成物は、 CAR及び CARLの結合能を調べる際 に使用できる。本発明の阻害剤は、例えば、本発明の抗体が適当な緩衝液中等に 溶解されたものである。さらに、必要に応じ保存剤、防腐剤、安定化剤等を抗体の活 性に影響しな 、範囲でカ卩えることができる。
[0088] また、本発明の抗体は、 Thl細胞の接着を抑制することから、炎症における細胞浸 潤を抑制し、病態を緩和できるものと期待されるので、このような抗体を含む組成物 は、 Thl細胞の働きが一因となる疾患の治療または予防薬として利用できるものと期 待される。例えば、本発明の抗体を含む組成物は、接触性皮膚炎の治療薬または予 防薬として利用することができる。このような治療薬または予防薬として抗体を用いる 場合には、該治療薬及び予防薬がヒトに対して使用されるのであれば、免疫原性を 考慮して、ヒト抗体またはヒト化抗体を使用することが望ましい。
[0089] 抗体の製剤化は、その特性を勘案して公知の抗体製剤の製造方法に基づ!、て行 うことができる。治療薬または予防薬として本発明の組成物を使用する場合には、該 組成物は本発明の抗体を有効成分として含み、生理学的に許容される担体、賦形剤 、希釈剤等が適宜混合される。投与方法は、経口、非経口投与のいずれでも可能で あるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤、座剤、経鼻投与剤、経 肺投与剤、経皮投与などが挙げられる。注射剤の例としては、例えば、静脈内投与、 筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、点滴静注などにより全身または局部的に投与 することができる。注射剤として投与することを目的とする場合、本発明の組成物の剤 形として、滅菌水や生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、べヒクル、 防腐剤などと適宜組み合わせて本発明の抗体の有効量を製剤化することが考えられ る。また、経口剤として投与することを目的とする場合、本発明の組成物の剤形として 、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、散剤、錠剤、乳剤、溶剤等を選択することができる。 上記乳化剤または界面活性剤としては、例えばステアリルトリエタノールァミン、ラウ リル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、モノステアリン酸グリセリン 、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル等を挙げることができ、
上記懸濁剤としては、前記界面活性剤のほか、例えばポリビニルアルコール、ポリ ビニルピロリドン、メチノレセノレロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシェチルセ ルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子を挙げることができ、 上記安定剤としては、一般に医薬に使用されるものを挙げることができ、 上記べヒクルとしては、リボソーム、マイクロスフェア、脂質小胞体などの一般に医薬 に使用されているものを挙げることができ、
上記防腐剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、 ベンジルアルコール、フ ネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等を挙げるこ とがでさる。
[0090] 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水などの注射用水溶液や注射用の油性 液を用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液として は、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば D—ソル ビトール、 D—マンノース、 D—マン-トール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解 補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピ レンダリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルべ ート 80™、 HCO— 50と併用してもよい。
注射用の油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸 ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝 液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロ力イン、安定剤、例えばベン ジルアルコール、フエノール、酸化防止剤と配合してもよい。
調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。また、本発明の抗 Nec卜 5 抗体を凍結乾燥させたアンプルに、注射用の水溶液や油性液などの適当なべヒクル を使用時に適量添加するという、用事調製の形態でもよい。
[0091] 本発明の阻害剤の投与量は、 Thl細胞の作用により病態が形成されている病変部 において、 Thl細胞の接着を抑えるのに十分な量であればよぐ患者の年齢、性別、 体重、症状等に加え、治療目的、投与方法等により変化するが、当業者であれば、こ れらの条件及び選択した抗体の活性を考慮し、適当な投与量を決定することができ る。例えば、一日にっき 1〜5回の範囲で、一回につき体重 lkgあたり 0.0001〜1000 mg、好ましくは 0.01〜100 mg、より好ましくは 0.1〜10 mgの範囲で選ぶことが可能で ある。あるいは、例えば、患者あたり 0.001〜100000 mg/body、好ましくは 0.1〜10000 mg/body、より好ましくは 1〜100 mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができる。
なお、本明細書中で引用した全ての刊行物は、参照として組み入れられる。
実施例 [0092] 以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるも のではない。
[実施例 1] 接着分子全長発現細胞の作製
接着分子 JAM- A、 JAM- B、 JAM- C、 ESAM、 CARの全長 cDNAのクローニングは以 下のように行った。テンプレートには、 JAM- A、 JAM- B、 JAM- Cについては mouse heart cDNA library (Clontech Quick Clone 7133- 1)を、 ESAMについてはマウス小腸 cDNA、 CARについてはマウス脾臓 cDNAを用いた。それぞれのプライマーは、 GenBank™の配列（JAM- A(U89915)、 JAM- B(AF255911)、 JAM- C(AJ300304)、 ESAM(AF361882)、 CAR(NM009988》をもとに設計し PCRで増幅した。例えば CARに ついては以下のプライマーを使用した。 番号: 5)
: 6)
得られた cDNA断片は、発現ベクター pMXII IRES- EGFP (
Oncogene(2000)19(27):3050-3058)に挿入した後、 293/EBNA- 1細胞株（Invitrogen) にパッケージングベクター、 pCL- Eco (Imgenex, San Diego, CA)とともに導入し、組替 えレトロウイルスを作製した。このウィルス液を B300細胞株に感染させ、 EGFP陽性細 胞をセルソーティングにより分離することで発現細胞を得た。 293/EBNA-1細胞株は 、 10% FCSを含む Dulbecco's modified Eagle's培地で、 B300細胞株は、 10% FCSと 55 μ Μ 2-メルカプトエタノールを含む RPMI-1640培地で培養した。
[0093] [実施例 2] 活性化リンパ球の調製
マウス脾臓を 100 mのメッシュ上ですり潰し、赤血球を溶血して脾細胞を得た。 CD4陽性細胞は、 MACS (Miltenyi Biotec)を用いて脾細胞から単離した。 1% FCSと 2mM EDTAを含む PBS 70 μ 1に 4x107個の脾細胞を懸濁し、 FcR blocking
reagent(Miltenyi Biotec社製)で処理した後、抗 CD4抗体固相化磁気ビーズをカ卩え、 4 °Cで 20分間反応を行った。洗浄後、 AutoMACSを用いてポジティブセレクションを行 つた。 CD4陽性細胞の割合は、 90%以上であった。精製した CD4陽性細胞を、抗 CD3抗体を 1 μ g/mlで固相化したプレートに加え、抗 CD28抗体 10 /z g/ml存在下で培 養した。 2日後に IL- 2 20 ng/mlを加えて培養し、活性化後 7から 9日目の活性化リンパ 球を実験に用いた。
[実施例 3] 接着分子の細朐外領城とアルカリフォスファターゼのキメラ蛋白質の作 まず、 pcDNA3.1(+)- SEAP(His)10- Neoベクターを、以下のように作製した。
PCDNA3.1 (+) -Neoベクター（CLONTECH社製）の内在性の Sailサイトは、 Sailで消 化した後、平滑ィ匕を行うことにより欠損させた。 SEAP (His)lOの cDNA断片は、 pDREF-SEAP His6— Hyg (J. Biol. Chem., 1996, 271, 21514-21521)を铸型として、 5' 端に Hindlllを 3'端に Xholを付カ卩したプライマーを用いて用いて PCRで増幅した。得ら れた cDNA断片を Hindlllと Xholで消化した後、 Sailサイトを欠損させた pCDNA3.1 (+) —Neoベクターに揷人した。
次に、接着分子の細胞外領域は、実施例 1で得られた全長 cDNAを铸型として、 5' 端に Sailを 3'端に Notlを付カ卩したプライマー（例えば CARについては、以下のプライ マー）を用いて PCRで増幅した。 番号: 5) 号: 7)
増幅した cDNA断片を Sailと Notlで消化した後、上記 pcDNA3.1(+)-SEAP(His)
10
-Neoベクターに挿入した。これにより、接着分子の細胞外領域と分泌型ヒト胎盤性ァ ルカリフォスファターゼカ ¾個のアミノ酸リンカ一 (Ala-Ala-Ala)で結合され、さらに C末 端に 10個のヒスチジンタグ (His) のついた分泌キメラ蛋白質 (以下 APキメラ蛋白質）
10
の発現が可能となる。得られた APキメラ蛋白質発現ベクターは、 TransIT LT1 (TAKARA #V2300)を用いて 293/EBNA- 1細胞株へ導入し、 4力ら 5日間培養を行つ た。培養上清中に分泌された APキメラ蛋白質は、遠心分離により培養上清を回収し 、 0.22 mのフィルターでろ過した後、 Hepes (pH 7.4)とアジ化ナトリウムをそれぞれ 最終濃度が 20mM、 0.02%となるようにカ卩えて 4°Cで保存した。 APキメラ蛋白質の濃度 は、アルカリフォスファターゼ活性を the Great EscApe detection
kit(CLONTECH#K2041- 1)を用いて測定し、算出した。
[0095] [実施例 4] 固相化した CARに対する活性化リンパ球の接着
リンパ球に対する接着分子として機能する分子を同定するために、 APキメラ蛋白質 を用いた細胞接着実験を行った。まず、 96ゥエル ELISAプレート (Nunc)に 10 /z g/mlの 抗アルカリフォスファターゼ抗体（Seradyn MIA1802)を 50 μ 1ずつ加え、 37°Cで 30分 間静置して固相化した。プレートを PBSで洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬） で非特異的結合部位をブロックした。 APキメラ蛋白質を最終濃度 10 nMになるように 希釈してゥヱルに加え、室温で 30分間静置し、固相化した。活性化リンパ球は、細胞 接着バッファー（RPMI 1640、 0.5% BSA、 20 mM HEPES (pH 7.4))に懸濁して、 Calcein-AM (同仁）で蛍光標識した後、 1ゥエルあたり 1 x 105個ずつ加え、 37° Cで 1 時間反応させた。非接着細胞を洗浄して除き、細胞溶解液（10 mM TrisHCl (pH 8.0)、 1% TritonX- 100)をカ卩えた後、 Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL
COUNTER (Perkin Elmer)を用いて、励起波長 485 nm、検出波長 535 nmで測定し、 接着細胞を定量した。細胞接着の程度は、添加した細胞に対する接着した細胞の割 合をパーセントで表した。 JAM-A、 JAM- B、 JAM- C、 CAR, ESAMの細胞外 APキメラ 蛋白質を固相化した結果、 CARが活性化リンパ球に対して接着分子として機能する ことが明らかとなった（図 1)。
[0096] [実施例 5] CARに対するモノクローナル杭体の作製
免疫用の抗原として用いるために、 CAR-APキメラ蛋白質の精製を行った。精製は 、 APキメラ蛋白質の C末端に存在するヒスチジンタグを利用して、 His Trap Kit (Amersham Biosciences #17- 1880- 01)を用いて行った。 CAR- APキメラ蛋白質を含む 培養上清を 1 mlの HiTrap chelating HPカラム（Amersham #17-0408-01)に添カロし、 20 mMイミダゾール溶液で洗浄した後、カラムから CAR-APキメラ蛋白質を、 500 mM イミダゾール溶液を用いて溶出した。 CAR-APキメラ蛋白質の濃度は、 the Great EscApe detection kit (CLONTECH #K2041- 1)を用いた酵素活性測定と Protein Assay kit II (BIO- RAD 500-0002JA)を用いた蛋白定量により算出した。
得られた CAR-APキメラ蛋白質は、 TiterMaxと混合して WKYラットに免疫した。免疫 したラットからリンパ球を単離して、 P3ミエローマ細胞とリンパ球の比率が 1 : 5となるよう に混合し、 PEG1500溶液 (ベーリンガー社 783- 641)を用いて細胞融合を行った。 HAT培地（GIBCO BRL 31062- 011)でハイブリドーマを選択し、得られたハイプリドー マの培養上清は、 CAR-Fcキメラ蛋白質を用いたサンドイッチ ELISAによるスクリー- ングに付した。陽性ゥエルからクロー-ングを行い、 3種類のクローン（4C9、 5E9、 5G11)を得た。 FACSにより特異性を検討した結果、 5G11クローンは CAR発現 B300細 胞に対してのみ反応し、親株の B300細胞及び JAM-A、 JAM- B、 JAM- C、 ESAM発現 B300細胞には反応しなかった（図 2A)。また同様の結果が、 4C9及び 5E9クローンでも 得られた。
[0097] [実施例 6] 杭 CAR杭体の細朐榇羞阳.害活件
CARのホモフィリックな結合を介した細胞接着に及ぼす抗体の効果を調べるため、 B300/CAR細胞および固相化した CAR-APキメラ蛋白質に抗 CAR抗体 10 μ g/mlを 加え、室温で 10分間前処理した後、抗体存在下での細胞接着活性を検討した。その 結果、 B300/CAR細胞の CAR-APキメラ蛋白質への接着は、 5G11抗体によって抑制 され、 4C9及び 5E9抗体によって亢進された。活性化リンパ球の CAR-APキメラ蛋白質 への接着は、 4C9及び 5G11抗体によって抑制された力 5E9抗体による亢進は観察 されなかった（図 2B及び図 2C)。
[0098] [実施例 7] 活件化リンパ球における未知の CARに対するリガンドの存在
活性化リンパ球が CARを発現し、固相化した CAR-APキメラ蛋白質とのホモフィリツ クな結合を介して接着しているかどうかを検討した。まず、細胞表面上での CARの発 現を抗 CAR抗体と FACSを用いて検討した。活性化リンパ球を 5G11抗体と反応させた 後、 PE標識ャギ抗ラッ HgG抗体と反応させ、 FACSCallibur(Becton Dickinson)を用い て測定した。し力しながら、活性化リンパ球表面上での CARの発現は検出されなかつ た（図 3A)。次に RT-PCRを用いて CARの mRNAの発現を検討したが、 mRNAの発現 も検出されな力つた（図 3B)。したがって、活性化リンパ球では CARは発現しておらず 、リンパ球細胞表面上には未知の CARに対するリガンドが存在することが示唆された そこでまず、 CARに対する未知のリガンドカインテグリンである可能性を検討した。 CDlla (M17/4 eBioScience 14- 0111)、 CD18 (GAME- 46 BD 555280)、 CD29 ( 2C9.G2 BD 553343)ゝ CD49d (Rl- 2 BD 553153)ゝ CD51 (RMV-7 BD 552299)、 CD61 (GAME-46 BD 555280)に対する抗体の細胞接着に与える効果を調べた。し かし、 CARと活性化リンパ球の接着は、いずれの抗体によっても阻害されなカゝつた。
[0099] [実施例 8] 各種リンパ球の固相化 CAR-APキメラ蛋白質への細朐接着活性と
CAR-APキメラ蛋白質との結合活性
次に、 CARに接着するリンパ球の特徴を検討した。 MACSで精製した直後の CD4陽 性細胞 (休止期 CD4+細胞)及び、抗 CD3抗体で活性化して 2日後に 20 ng/ml IL-2ま たは 25 ng/ml IL- 15加えてさらに 5日間培養した活性化リンパ球の CAR-APキメラ蛋 白質に対する接着活性を調べた。その結果、 IL-2で刺激した活性化リンパ球は接着 するが、 IL- 15で刺激した活性化リンパ球及び休止期 CD4+細胞は接着しな ヽことが 明らかになった。また、 TK1細胞株も接着しな力つた（図 4)。
次に、各種リンパ球の CAR-APキメラ蛋白質の細胞表面上への結合活性を検討し た。細胞は、 40nM CAR-APキメラ蛋白質と 4°Cで 30分間反応させた後、 FMATBlue標 識マウス抗アルカリフォスファターゼ抗体と 4°Cで 30分間反応させた。結合は、 FACS により検出した。その結果、 IL-2で刺激した活性化リンパ球に CAR-APキメラ蛋白質 は結合した力 IL-15で刺激した活性化リンパ球や休止期 CD4+細胞、 TK1細胞株に は結合しないことが明らかとなった（図 5)。
[0100] [実施例 9] CARに対する新規リガンド CARL CAR ligand)の同定
次に、 CARに対する未知のリガンドが IgSFである可能性を検討した。まず、 CARおよ び JAMファミリー分子のマウス染色体における位置関係を調べた。 Mouse Ensemble のデータベースを検索した結果、これらの分子は、 9、 16番染色体に分かれてクラ スターを形成して存在していた。そこで、 CARおよび JAMファミリー分子の近傍に存在 する 116個の IgSFに着目し、各種リンパ球における発現をリアルタイム PCRで調べた。 全 RNAは、 RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、 5xl06個の TKl細胞 、 IL- 2刺激活性化リンパ球、および IL- 15刺激活性化リンパ球力も単離した。リアルタ ィム PCRは、 SYBR— green存在下で ABI 7700 Sequence Detect ion System (PE Applied- Biosystems)を用いて行った。その結果、 ENSMUSG0000048534が CARへの 接着活性と相関のある発現パターンを示した。 ENSMUSG0000048534力 CARに対す る未知のリガンドであるかどうかを調べるため、この分子の発現細胞を作製した。テン プレートには、 IL-2刺激活性化リンパ球の cDNAを用い、プライマーは、
ENSMUSG0000048534の配列をもとに以下の通り設計して、実施例 1に記載の方法で 発現細胞を得た。 列番号: 8) 番号: 9)
また接着分子（JAM-A、 JAM-B、 JAM- C、 CAR, ESAM)の細胞外領域と APのキメラ タンパク質は、実施例 3と同様に作製した。 ENSMUSG0000048534にコードされるリガ ンドのホモフィリックな結合を調べるため、このリガンドについても以下のプライマーを 用いて同様に APのキメラタンパク質を作製した。 列番号: 8)
mCARL R1:[ID:1830] この発現細胞を用いて、種々の接着分子の細胞外 APキメラ蛋白質に対する接着活 性を調べたところ、 CARのみに接着した（図 6A)。さら〖こ、この細胞外領域の APキメラ 蛋白質に対する CAR発現 B300細胞との接着活性を調べたところ、 CAR発現 B300細 胞は接着し、その接着は 4C9および 5G11によって阻害された（図 6B)。以上の結果よ り、 ENSMUSG0000048534がリンパ球上の新規な CARに対するリガンドであることが 明らかとなり、該リガンドを CARL (CAR Ligand)と命名した。
[実施例 10] CARLの特性
CARLは、 379アミノ酸力もなる IgSFに属する分子であり、細胞外には 2個の Ig様ドメ インを持っている（図 7)。 CARLの遺伝子は、マウス 9番染色体上に位置し、
EPITHELIAL V LIKE ANTIGEN 1 (ENSMUSG0000032092)と SODIUM CAHNNEL BETA- 2 SUBUNIT (ENSMUSG0000037714)の遺伝子にはさまれて存在する。 CARL は、 similar to AMICAとして登録されている BC050133 (gi29477100)と一致した。
CARLの塩基配列を NCBI nrで blastnにかけると、 BC050133 (gi29477100)以外に、 XM_194453 (gi38089807)が高い類似性を示した。 XM_194453 (gi38089807)は、 BC050133 (gi29477100)の最初の 11アミノ酸の代わりに 37アミノ酸が挿入され、 231番 目のアルギニンがグルタミンとなった変異体である。また、 mouse Ensembleの orthologue predictionによると、ヒトにおいては AMICAとして登録されている
ENSG00000160593力 SCARLのオルソログであると推定されて!、る。
ENSG00000160593には、 2つの転写産物が存在し、これら（ENST00000292067、 ENST00000303475)は 5，端のスプライシングバリアントの関係にある。それぞれの推 定アミノ酸配列を比較した結果、 ENST00000292067の最初の 14アミノ酸の代わりに、 ENST00000303475では異なる 4アミノ酸が挿入されていた。 CARLと
AMICA(ENST00000292067, ENST00000303475)の相同性は、アミノ酸レベルでそれ ぞれ 38.2%、 37.7%であった。ヒト AMICAの遺伝子座は、マウス CARLのヒト染色体上 の相同領域 11番染色体（llq23.3)に存在していることからヒト AMICAは、マウス CARL のヒト相同遺伝子ヒト CARLであると考えられる。最近、ヒト JAML (AJ515553)が骨髄由 来細胞に発現する接着分子として報告された (Blood, 2003 (102),3371-3378)が、こ の分子は、ヒト CARL (ENST00000292067)の 560-596 bpの 37塩基が欠損し、その配 列が 693と 694 bpの間に挿入された変異体である。ヒ KJAMLは、ヒト CARLと同じく 394 アミノ酸からなる力 94番目および 161番目から 205番目のアミノ酸配列は、ヒト CARL とは全く異なる。
「実施例 111 CARと CARLの細朐外領城の蛋白質間相互作用とその解離平衡定数
CARと CARL細胞外領域の蛋白質間相互作用とその親和性を調べるため、 BIAcore X (BIAcore社製)を用いた表面プラズモン共鳴現象を利用したノィォセンサーによ り、以下の方法で解離平衡定数 Kd値を求めた。まず、ァミノカップリング法でセンサ 一チップ CM5 (BIAcore社製)に 50 g/mlの抗アルカリフォスファターゼ抗体（ Seradyn社製）を固定した。次〖こ HBS- EP buffer (BIAcore社製)で 20 nMに希釈した CAR-APキメラ蛋白質またはコントロールの APキメラ蛋白質を含む培養上清を添加し 、 500 RUの APキメラ蛋白質をセンサーチップ上に固相化した。蛋白質間相互作用は 、 HBS-EP buffer (BIAcore)でそれぞれ 20、 6、 0.6 nMに希釈した CARL- Fcキメラ蛋 白質を含む培養上清を 20 μ 1/minで 210秒間添カ卩し測定した。 BIAevaluation software version 3.2 (BIAcore)を用いて得られた結合速度定数と解離速度定数の値から、 CARと CARLの解離平衡定数は、 4.8 nMであることが明らかとなった（図 8)。
[実施例 12] CARLの Thl細胞での選択的発現および CARに対する Thl細胞の選択 的接着
Thlおよび Th2における CARLの発現を調べるため、 Thlおよび Th2細胞の調製を行 つた。 MACSで精製した CD4陽性細胞は、抗 CD3抗体 1 μ g/mlを固相化したプレート に加え、抗 CD28抗体 10 g/ml存在下で刺激した。 Thlへ分ィ匕させる場合は、 10 ng/ml IL-12と 10 g/ml抗- IL- 4抗体（MP4- 25D2; PharMingen)存在下で、 Th2へ 分化させる場合は、 15 ng/ml IL-4と 15 g/ml抗 IL- 12抗体 (24910.1; R & D Systems)存在下で抗 CD3抗体刺激を行なった。 2日後、 Thlへ分ィ匕させた細胞は 20 ng/ml IL- 2と 10 ng/ml IL- 12を加えて培養を行い、 Th2へ分化させた細胞は 20 ng/ml IL-2と 15 ng/ml IL-4を加えて培養を行って、刺激後 7から 9日の細胞を実験に用い た。 Thl細胞は、 IFN- γの産生により、 Th2細胞は、 IL-4の産生によりそれぞれ分化 していることを確認した。これらの細胞から得られた RNAを用いて、リアルタイム PCRで 、 CARLの mRNA発現および HPRTの mRNAの発現（コントロール）を調べたところ、 CARLが Thl細胞で選択的に発現して 、ることが明らカとなった（図 9A)。また、 CAR-APキメラ蛋白質を用いて、細胞表面上への結合活性を調べたところ、同様に Thl細胞に選択的に結合活性が認められた（図 9B)。さらに、 Thlおよび Th2細胞の CAR-APキメラ蛋白質に対する接着活性を調べたところ、 CARLの発現と一致して Thl細胞のみが選択的に CARに接着することが明ら力となった（図 9C)。また、その接 着は 4C9および 5G11によって阻害された（図 10A)。
さらに、 CD4陽性 T細胞以外の細胞における CARLの発現を解析した。 C57BL/6雄 マウスの脾臓および末梢血カゝら細胞を調整し、 5%マウス血清、 5%ラット血清を含む FACS緩衝液（PBS /1% FBS/1 mM EDTA)に懸濁し、 FcRブロッキング溶液を加えて 氷上で 10分反応させた。次に、蛍光標識抗 mCARL抗体と種々の蛍光標識細胞系列 マーカー抗体と氷上で 30分反応させた後、 FACScal¾urを用いて測定した。 その結果、正常マウスの免疫組織では、脾臓から調製した CD3陽性 T細胞、 CDllb 陽性骨髄系細胞、 CDllc陽性榭状細胞、 B220陽性 B細胞で、 CARLの発現がみられ 力 DX5陽性 NK細胞、 F4/80陽性単球/マクロファージでは、 CARLの発現がみられ なかった。また、末梢血から調製した SSC high/ Grl陽性好中球では、 CARLの発現 がみられた力 SSC high/ F4/80陽性好酸球では、 CARLの発現がみられなかった。（ 図 10B)。
[0104] [実施例 13] Ig様ドメイン欠損型 CARL発現細胞の作製
CARLにおける mCARの結合領域を決定するため、 Ig様ドメイン欠損型 mCARL発現 細胞を作製した。発現ベクターの改変は、以下のように行った。まず、
Oncogene(2000)19(27):3050- 3058と同様の手法により、 pMX(J. Biol. Chem.,2002, 277, 5583-5587)の BamHIと Sailの間にあらたなマルチクロー-ングサイト（
cgcggatcctaattaattaaggtttaaactgtcgacgaattcgcggccgccacgcgttcgcga と IRE¾/Puroを 挿入した改変ベクター pMX MCS2.2 IRES Puroを作製した。次に、 pMX MCS2.2 IRES Puroの BamHIと Sailの間にシグナル配列と FLAGタグを挿入し、改変ベクター pMX ssFLAG MCS2.2 IRES Puroを作製した。
[0105] CARLのシグナル配列は、 1番目から 20番目のアミノ酸、 1番目の Ig様ドメイン（ドメイ ン 1)は、 30番目から 139番目のアミノ酸、 2番目の Ig様ドメイン（ドメイン 2)は、 143番目 から 254番目のアミノ酸であると推定された (SignalP;
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/, SMART；
http://smart.embl-heidelberg.de/ )。したがって、全長型 CARLとは、 21番目力ら 379 番目のアミノ酸力もなる蛋白質を、ドメイン 1欠損型 CARLとは、 21番目から 29番目の アミノ酸と 140番目から 379番目のアミノ酸力もなる蛋白質を、ドメイン 2欠損型 CARLと は、 21番目から 139番目のアミノ酸と 255番目から 379番目のアミノ酸からなる蛋白質を それぞれ示す。
[0106] 全長型 CARL及びドメイン 1欠損型 CARLのクローユングは、実施例 9で得た CARLの 全長 cDNAを铸型として用いて PCRで増幅し、得られた cDNA断片を発現ベクター pMX ssFLAG MCS2.2 IRES Puroに挿入した。ドメイン 2欠損型 CARLのクロー-ング では、 134番目から 139番目のアミノ酸配列と 255番目から 260番目のアミノ酸配列に相 当する塩基配列及びその相補的な配列力 なるプライマーを用いた二段階 PCRによ り、 cDNA断片を増幅した。実施例 1に記載の方法で作製した組替えレトロウイルスを B300細胞株に感染させ、遺伝子導入細胞を 5 μ g/mlピューロマイシンで選択するこ とにより発現細胞を得た。これら細胞表面における Ig様ドメイン欠損型 CARLの発現は 、抗 FLAG抗体（SIGMA社製）を用いて確認した（図 11A)。これら細胞の CAR-APキメ ラ蛋白質に対する接着活性を実施例 4に記載の方法で調べたところ、全長型 CARL 発現 B300細胞とドメイン 2欠損型 CARL発現 B300細胞は、 CAR-APキメラ蛋白質に対 して接着した力 ドメイン 1欠損型 CARL発現 B300細胞は接着しな力つた（図 11B)。し たがって、 CARと CARLの結合には CARLのドメイン 1が必要であることが明ら力となつ た。
[0107] [実施例 14] CARLに針するモノクローナル杭体の作製、杭 CARL杭体を用いた Thl 細qに: ける あ び細q接羞阳.害活件
実施例 9で得た CARL-APキメラ蛋白質を免疫用の抗原として用いて、実施例 5に記 載の方法で抗 CARL抗体 #3を得た。 FACSにより特異性を検討した結果、 #3抗体は、 CARL発現 B300細胞に対して反応し、親株の B300細胞には反応しなかつた（図 12A) 。 #3抗体を用いて、実施例 12に記載の方法で調製した Thlおよび Th2細胞における CARLの発現を調べたところ、 Thl細胞で選択的に強く発現していた（図 12B)。また、 #3抗体は、 CARL-AP蛋白質に対する CAR発現 B300細胞の接着を阻害した（図 12C) 。実施例 13で得た細胞を用いた免疫染色において、 #3抗体は、全長型 CARL発現 B300細胞とドメイン 2欠損型 CARL発現 B300細胞の膜上の CARLと結合した力 ドメイ ン 1欠損型 CARL発現 B300細胞では結合しな力つた。したがって、結合阻害活性を持 つ #3抗体は、 CARと CARLの結合に必要なドメイン 1を認識していることが明ら力とな つた o
[0108] [実施例 15] ヒト CARとヒト CARLの結合
マウスで得られた現象力 ヒトでも同様にみられることを確認するため、ヒト CARの全 長発現細胞およびヒト CARLの全長発現細胞、ならびにヒト CARの細胞外領域の AP キメラ蛋白質およびヒト CARLの細胞外領域の APキメラ蛋白質を作製した。発現べク ターは、実施例 13で得た pMX MCS2.2 IRES Puroを用いた。 ヒト CARおよび CARLの全長 cDNAのクロー-ングは以下のように行った。铸型には 、 human whole brain (Clontech社製）から合成した cDNAを用いた。それぞれのプライ マーは、 GenBank™の配列（ヒト CAR (NM— 001338)、ヒト CARL (AY138965))をもとに 下記の通り設計し、 PCRで増幅した。
hCAR F CGCGTCGACATGGCGCTCCTGCTGTGCTTCGTG (配列番号： 11) hCAR R2:GCGGGCGGCCGCCTATACTATAGACCCATCCTTGCT (配列番号： 12 )
hCARL F CGCGTCGACATGTTTTGCCCACTGAAACTCATC (配列番号： 13) hCARL R2:GCGGGCGGCCGCTCAAAAGGCTTGCTGTGTTTTTGG (配列番号： 14)
得られた cDNA断片はそれぞれ、発現ベクター pMX MCS2.2 IRES Puroに挿入し、 実施例 1に記載の方法で組換えレトロウイルスをそれぞれ作製した。遺伝子導入 B300 細胞株を、 5 μ g/mlピューロマイシンで選択することにより発現細胞を得た。ヒト CAR および CARLの細胞外領域の APキメラ蛋白質は、下記のプライマーを用い実施例 3 に記載の方法で作製した。
hCAR F CGCGTCGACATGGCGCTCCTGCTGTGCTTCGTG (配列番号： 11) hCAR R GCGGGCGGCCGCTTTATTTGAAGGAGGGACAACGTT (配列番号： 15 )
hCARL F CGCGTCGACATGTTTTGCCCACTGAAACTCATC (配列番号： 13) hCARL R GCGGGCGGCCGCATTACCACCCAAGACCAGAGGCCT (配列番号： 16)
ヒト CAR発現 B300細胞表面におけるヒト CARの発現は、抗ヒト CAR抗体（upstate biotechnology社製）を用いて、ヒト CARL発現 B300細胞表面におけるヒト CARLの発現 は、ヒト CAR-APキメラ蛋白質を用いて、それぞれ確認した（図 13A)。ヒト CAR発現 B300細胞とヒト CARL-APキメラ蛋白質との接着活性を実施例 4に記載の方法で調べ たところ、ヒト CARとヒト CARLの結合が検出された。同様に、ヒト CARL発現 B300細胞 とヒト CAR-APキメラ蛋白質との接着活性を調べたところ、ヒト CARとヒト CARLの結合 が検出された（図 13B)。 [0109] [実施例 16] ヒト CARLに対するモノクローナル抗体の作製および抗ヒト CARL抗体 の細胞接着阳.害活件
実施例 15で得たヒト CARL-APキメラ蛋白質を免疫用の抗原として用いて、実施例 5 に記載の方法で 4種類のマウス抗ヒト CARL抗体（#5、 #49、 #77、 #85)を得た。 FACSに より特異性を検討した結果、 #5の培養上清は、ヒト CARL発現 B300細胞に対して反 応し、親株の B300細胞には反応しな力つた（図 14A)。また同様の結果が、 #49、 #77, #85クローンでも得られた。これら抗体のうち、 #5、 #49、 #77の培養上清は、ヒト CARL-APキメラ蛋白質に対するヒト CAR発現 B300細胞の接着を阻害した（図 14B)。
[0110] [実施例 17] 接触件皮膚炎に針する杭 CARL杭体の治療効果
接触性過敏反応 (CHS)は、 6週齢マウスを用い、以下のように誘導した。まず、 0.4 0/0ジニトロフルォロベンゼン (WAKO社製）を 1匹あたり 25 μ 1マウス腹部に塗布し、 CHSを惹起する 5日及び 4日前に感作させた。抗 CARL抗体 #3は、 1匹あたり 500 μ gを CHS惹起の 5日前と当日に尾静脈力 投与した。そして、 1匹あたり 20 1の 0.4%ジ- トロフルォロベンゼンを耳介部に塗布し CHSを惹起した。惹起から 24時間後、左右の 耳介の厚みを計測したところ、抗体処理により耳介の腫脹が抑制された（図 15)。 実施例 12に示す通り、 CARLは活性ィ匕した Thl細胞及び好中球に発現が認められ 、抗 CARL抗体は CARLと CARの相互作用を抑制することにより、 CHSを抑制している と考えられた。
産業上の利用可能性
[0111] 本発明により、 Thl細胞を検出する方法が提供される。 Thl細胞は、 CD4+Tリンパ球 であり、活性ィ匕されると IL-2、 IL-12、腫瘍壊死因子 (TNF) |8、リンフォトキシン (LT)、及 び IFN- γ等のサイト力インを分泌し、主に細胞性免疫に関与する。リウマチ、クローン 病、 1型糖尿病、多発性硬化症等を含む臓器特異的な自己免疫疾患の発症には、 Thlが主体的な役割を果たしていると考えられている。また、 Thlまたは Th2細胞の選 択的不均衡または偏った活性ィ匕は、ある種の慢性炎症性またはアレルギー性の疾 患の病因となっていると考えられている。一方、癌、アレルギー（アトピー性疾患等）、 寄生虫感染症等の疾病状態では、 Th2応答が支配的であるが、 Thl応答を誘導する ことにより、これらの状態が改善される可能性が示唆されている。即ち、 Thl表現型へ のシフトにより、 IFN a、 j8及び γ、並びに IL-12、 IL- 18等の分泌が増大し、ウィルス 等の細胞内病原体に対する宿主の免疫防御が強化されると報告されている。そこで 、本発明の Thl細胞を検出する方法は、例えば、 Thほたは Th2細胞の選択的不均 衡、偏った活性ィ匕等が関与する疾患の診断'病態の解明において利用することがで きる。また、このような疾患の治療効果の判定においても利用することができる。
[0112] さらに、本発明は、 CARと CARLとの結合の阻害剤をスクリーニングする方法に関す る。 CARと CARLとの結合の阻害剤には抗体も含まれる力 このような阻害剤は、 CAR を発現する上皮細胞及び内皮細胞と、 CARLを発現する Thl細胞との細胞接着を阻 害するものである。従って、これらの阻害剤、及び該阻害剤を含む組成物は、 Thl細 胞の接着を抑制するものと期待される。これらの阻害剤、及び該阻害剤を含む組成 物により、 Thl細胞が関与する自己免疫疾患の治療効果が期待できる。
[0113] 本発明によりさらに、 CAR及び CARLの結合を阻害する抗体が提供される。このよう な抗体は、上述の物質と同様に、 Thl細胞の接着を抑制し、例えば接触性皮膚炎等 における細胞接着を抑制し、病態を緩和できるものと期待される。また、 CAR及び CARLの結合は、 Thl細胞の浸潤に関与すると考えられることから、細胞浸潤機構を 解明する上でも役立つものと考えられる。

Claims

請求の範囲 [1] (a)リンパ球を含む細胞試料を CARと接触させる工程、及び (b)工程 (a)にお 、て、 CARと結合した細胞を検出する工程 を含む Thl細胞を検出する方法であって、 CARが、配列番号: 1または 2のアミノ酸配 列を含むポリペプチドに対して結合する、以下 (1)〜(6)いずれかに記載のアミノ酸配 列を含む蛋白質である方法： (1)天然型 CARのアミノ酸配列、 (2)天然型 CARをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でノヽィ ブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列、 (3)天然型 CARのアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換 、付加または挿入されたアミノ酸配列、 (4)天然型 CARのアミノ酸配列と 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列、(5)前記 (1)〜(4)のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列、(6)前記 (1)〜(5)に記載の蛋白質とマーカー蛋白質を融合させたアミノ酸配列。 [2] CARが担体に結合されている、請求項 1記載の方法。 [3] CARを検出試薬として含む、 Thl細胞を検出するためのキット。 [4] CARが担体に結合されている、請求項 3記載のキット。 [5] (a)リンパ球を含む細胞試料を抗 CARL抗体と接触させる工程、及び (b)工程 (a)にお ヽて、抗 CARL抗体と結合した細胞を検出する工程 を含む Thl細胞を検出する方法であって、抗 CARL抗体は、 CARLに特異的に結合 する抗体であり、 CARLは天然型 CARと結合する、以下 (1)〜(9)いずれかに記載の蛋 白質である方法：
(1)配列番号: 1のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)配列番号: 1のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(3)配列番号: 2のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(4)配列番号: 2のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(5)前記 (1)〜(4)のアミノ酸配列中の Ig様ドメイン 1を含む蛋白質、
(6)配列番号: 3または 4の cDNA配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、
(7)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してストリ ンジヱントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配 列を含む蛋白質、
(8)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列と 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を 含む蛋白質、
(9)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸残基が欠 失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質。
[6] 抗 CARL抗体が担体に結合されている、請求項 5記載の方法。
[7] 請求項 1または請求項 5に記載の方法を含んで成る、 Thl細胞と Th2細胞の比率を 検査する方法。
[8] 請求項 7に記載の方法に基づ 、て検査された Thl細胞と Th2細胞の比率に基づき、 細胞試料を採取された被験者がアトピー性疾患であるかどうかを判定する方法。
[9] 抗 CARL抗体を検出試薬として含む、 Thl細胞を検出するためのキット。
[10] 抗 CARL抗体が担体に結合されている、請求項 9記載のキット。
[11] 細胞試料を採取された被験者がアトピー性疾患であるかどうかを判定する請求項 9 記載のキット。
[12] (a)被験物質存在下で CAR及び CARLを接触させる工程、
(b)工程 (a)における CAR及び CARLの結合を検出する工程、
(c)工程 (b)にお 、て検出された CAR及び CARLの結合レベルを、被験物質不在下 の場合と比べる工程、及び
(d)被験物質不在下の場合と比べ、 CAR及び CARLの結合を抑制する被験物質を、 CARと CARLとの結合の阻害剤として選択する工程
を含む、 CARと CARLとの結合の阻害剤をスクリーニングする方法であって；
該 CARLは天然型 CARと結合する、以下 (1)〜(10)いずれかに記載の蛋白質であり、
(1)配列番号: 1のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)配列番号: 1のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(3)配列番号: 2のアミノ酸配列を含む蛋白質、 (4)配列番号: 2のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(5)前記 (1)〜(4)のアミノ酸配列中の Ig様ドメイン 1を含む蛋白質、
(6)配列番号: 3または 4の cDNA配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、
(7)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してストリ ンジヱントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配 列を含む蛋白質、
(8)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸残基が欠 失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質、
(9)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列と 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を 含む蛋白質、
(10)前記 (1)〜(8)に記載の蛋白質とマーカー蛋白質を融合させた蛋白質； 該 CARは、配列番号: 1または 2のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して結合する 、以下 (11)〜(15)いずれかに記載のアミノ酸配列を含む蛋白質である方法。
(11)天然型 CARのアミノ酸配列、
(12)天然型 CARをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でノヽ イブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列、
(13)天然型 CARのアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸残基が欠失、置換 、付加または挿入されたアミノ酸配列、
(14)前記 (11)〜(13)のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含むアミノ酸配列、
(15)前記 (14)に記載の蛋白質とマーカー蛋白質を融合させたアミノ酸配列。
[13] CARまたは CARLのどちらか一方が担体に結合されている、請求項 12記載の方法。
[14] CAR及び Zまたは CARL力 宿主細胞において発現ベクターより発現される、請求 項 12記載の方法。
[15] CAR及び CARLの結合を阻害する抗体であって、 CARLが以下 (1)〜(9)いずれかに 記載の蛋白質である抗体：
(1)配列番号: 1のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(2)配列番号: 1のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、 (3)配列番号: 2のアミノ酸配列を含む蛋白質、
(4)配列番号: 2のアミノ酸配列中の細胞外ドメインを含む蛋白質、
(5)前記 (1)〜(4)のアミノ酸配列中の Ig様ドメイン 1を含む蛋白質、
(6)配列番号: 3または 4の cDNA配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィズ するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、
(7)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対してストリン ジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列 を含む蛋白質、
(8)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列と 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を 含む蛋白質、
(9)前記 (1)〜(5)の蛋白質のアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸残基が欠 失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含む蛋白質。
[16] CAR及び CARLがヒト由来である、請求項 15記載の抗体。
[17] 抗体が抗 CAR抗体である、請求項 15または 16記載の抗体。
[18] 抗 CAR抗体が、受領番号 FERM ABP-10317において寄託されたハイブリドーマ ®mCAR:5E9- 1- 1、受領番号 FERM ABP- 10318において寄託されたハイブリドーマ ®mCAR:5Gll-l-l-ll、または受領番号 FERM ABP-10320において寄託されたハ イブリドーマ @mCAR:4C9-l-lより産生される、請求項 17記載の抗体。
[19] 抗体が抗 CARL抗体である、請求項 15または 16記載の抗体。
[20] 抗 CARL抗体が、受領番号 FERM ABP-10319において寄託されたハイブリドーマ
@mCARL:#3.11より産生される、請求項 19記載の抗体。
[21] 請求項 15〜20の 、ずれか一項記載の抗体を含む細胞接着阻害剤。
[22] 請求項 15〜20の ヽずれか一項記載の抗体を含む接触性皮膚炎治療剤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011153992A (ja) * 2010-01-28 2011-08-11 Univ Of Tsukuba 可溶型ｃｄ１５５タンパク質を用いた癌の検出方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005106016A1 (ja) 2004-04-28 2005-11-10 Eisai R & D Management Co., Ltd. Ｔｈ１細胞の検出方法
WO2009039466A1 (en) * 2007-09-20 2009-03-26 Vanderbilt University Free solution measurement of molecular interactions by backscattering interferometry
EP3348575A1 (en) 2011-08-16 2018-07-18 Emory University Jaml specific binding agents, antibodies, and uses related thereto
US10465005B2 (en) 2011-08-16 2019-11-05 Emory Patent Group JAML specific binding agents, antibodies, and uses related thereto
EP2692354A1 (en) * 2012-08-03 2014-02-05 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Means for treating heart disease
EP3247988A4 (en) 2015-01-23 2018-12-19 Vanderbilt University A robust interferometer and methods of using same
WO2017132483A1 (en) 2016-01-29 2017-08-03 Vanderbilt University Free-solution response function interferometry

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030092888A1 (en) * 2001-06-01 2003-05-15 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843712A (en) * 1996-06-06 1998-12-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Sindbis virus expression system for recombinant antibody production
WO1998033819A1 (en) * 1997-01-30 1998-08-06 New York University Cellular receptors for subgroup c adenoviruses and group b coxsackieviruses
US20030060407A1 (en) * 1997-06-16 2003-03-27 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030130182A1 (en) * 1997-11-05 2003-07-10 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU6068300A (en) 1999-07-06 2001-01-22 Caliper Technologies Corporation Microfluidic systems and methods for determining modulator kinetics
CA2311201A1 (en) * 1999-08-05 2001-02-05 Genset S.A. Ests and encoded human proteins
US20030134352A1 (en) * 2002-01-04 2003-07-17 Freimuth Paul I. Facilitating protein folding and solubility by use of peptide extensions
KR100457792B1 (ko) * 2002-03-29 2004-11-18 크레아젠 주식회사 신규한 수지상 세포-특이 폴리뉴클레오타이드 및 이를포함하는 마이크로어레이
WO2005106016A1 (ja) 2004-04-28 2005-11-10 Eisai R & D Management Co., Ltd. Ｔｈ１細胞の検出方法
EP3348575A1 (en) 2011-08-16 2018-07-18 Emory University Jaml specific binding agents, antibodies, and uses related thereto

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030092888A1 (en) * 2001-06-01 2003-05-15 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Mammalian Gene Collection (MGC) Program Team. Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences.", PROC.NATL.ACAD.SCI USA, vol. 99, 2002, pages 16899 - 16903, XP002298284 *
BERGELSON J. ET AL.: "The murine CAR homolog is receptor for coxaxkie B viruses and adenovirus.", J.VIROL, vol. 72, no. 1, 1998, pages 415 - 419, XP002195888 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011153992A (ja) * 2010-01-28 2011-08-11 Univ Of Tsukuba 可溶型ｃｄ１５５タンパク質を用いた癌の検出方法

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