WO2005035014A1

WO2005035014A1 - 転写因子を利用した骨・軟骨再生用インプラント

Info

Publication number: WO2005035014A1
Application number: PCT/JP2004/015673
Authority: WO
Inventors: Hiroko Kojima; Toshimasa Uemura
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2003-10-15
Filing date: 2004-10-15
Publication date: 2005-04-21
Anticipated expiration: 2006-04-15
Also published as: JP4426532B2; CN1893986A; JPWO2005035014A1; US20070031465A1; EP1681067A1

Abstract

　本発明は、転写因子の遺伝子を組み込んだウイルスベクターを生体内で徐放させ、転写因子活性を持続的に発現させることにより、良好な骨・軟骨再生を可能にするインプラントに関する。

Description

明細書転写因子を利用した骨 ·軟骨再生用インプラント技術分野

本発明は、転写因子を利用したインプラントに関する。より詳しくは、転写因子の遺伝子を組み込んだウィルスベクタ一を生体内で徐放させ、転写因子活性を持続的に発現させることにより、良好な骨 ·軟骨再生を可能にするィンプラントに関する。背景技術

骨は再生能力の限られた組織であり、その修復には自家骨の再移植や人エインプラントによ！)置換 ·補充が必要となる。しかし、自家骨の使用は患者の負担が大きく、その採取量にも限界がある。また、人エインプラン卜には、生体骨に匹敵するだけの強度や機械的特性、生体適合性が期待できないという問題がある。

これに対し、生体から取り出した自己の細胞を in vi troで培養 ·組織化して限りなく生体に近い組織を再構築し、これを再び生体内に戻すという再生医療の研究が進められている。この研究が実現すれば、それは損傷組織に対する最も理想的な治療方法となる。

再生医療においては、生体外で細胞をより早く目的の組織に増殖 ·分化させること、また移植組織を速やかに欠損部に融合'組織化させることが、重要な問題となる。これを解決する方法として、細胞の分化誘導をつかさどるサイトカイン（液性因子）を直接細胞に導入するいくつかの技術が知られている。たとえば、 T G F— /3 1を含浸させたコラーゲンスポンジ上で骨髄細胞等を培養する技術（特開 200卜 316285号）、 bFGFを含有するコラーゲン一軟骨細胞複合体による軟骨組織再生治療材（特開平 8-3199号) 等が公知である。しかし、増殖因子そのものを細胞に添加する方法では、添加した増殖因子が速やかに拡散してしまうため、増殖因子活性の十分な持続が望めないという問題がある。一方、リポフエクシヨン法により増殖因子の遺伝子を細胞に導入する方法も試みられているが、この方法は樹立細胞株ではある程度の成功をおさめても、初代培養細胞に対しては殆ど 0 に近い導入効率しか得られていない。

最近、骨芽細胞の分化には転写因子、特に runt 型及び Helix-Loop-Helix (HLH)型の転写因子が重要な意味を持つことが、多くの研究者により明らかにされてきた。例えば runt 型転写因子としては、 Pebp2alphaA (Pebp2 a A) /CbfaKHLH型転写因子としては、 Scleraxis, Id - 1、 I-mfa 等が骨芽細胞分化に重要な意味を持つことが報告されている (Konori, T. et al., (1997) Cell 89， p755-764; Ac amp or a, D. et al. , (1999) Development 126, p3795-3809; Tribioli, C. et al. , (1999) Development 126, p5699-5711; Satokata, I. et al. , (2000) Nature Genet. 24, p391-395; Cserjesi, P. et al. , (1995) Development 121, pl099-1110; Ng, L. J. et al. , (1997) Dev. Biol. 183, pl08-121)_o

そして、発明者らは、この転写因子（Cbial) 遺伝子を導入した骨芽細胞を j8— TCP等の生分解性材料を足場として培養、組織化し（KKojima, T. Uemura, (2002) Molecular Biology of the Cell, Vol.13 supplement, p543a; Toshimasa Uemura, Hiroko Koj ima, (2002) Tissue Engineering, Vol.8, No.6, pll29)、生体に移植することで、良好な骨 ·軟骨組織再生が可能になることを報告している（国際公開第 03/011343号）。この方法は、効率の良い骨 ·軟骨再生を可能にするという点においては非常に優れた技術である。しかし、患者体内からの細胞の単離、生体外での組織構築、生体内への再移植という工程は、現実の臨床適用においては決して容易ではない。発明の開示

本発明は、整形外科領域及び歯科領域における、より簡便かつ安全な骨 · 軟骨再生の手段を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、 ]3— T C Pやハイドロキシァパタイト等の生体適合性材料を用いて生体内で転写因子の遺伝子導入用ウィルスベクターを徐放させる方法を見出した。そして、この方法によれば、低濃度のウィルスベクターでも転写因子の遺伝子を導入した細胞を移植する方法と同等の骨 ·軟骨再生が可能になることを実証し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は骨 ·軟骨誘導性転写因子の遺伝子を導入したアデノウィルスベクター又はレトロウイルスベクターを含む生体適合性材料からなる骨 ·軟骨再生用インプラントに関する。

本発明のインプラントにおいて、骨 ·軟骨誘導性転写因子としては、例えば、 CbfaL Dlx- 5、 BapxL Msx2、 Scl eraxi s及び Sox- 9 から選ばれる 1 種又は 2種以上を利用することができる。なかでも、 Cbf alが好ましい。また、本発明のインプラントにおいて、生体適合性材料としては、例えば、ハイドロキシアパタイト、 a - T C P、 j3 - T C P、コラーゲン、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、及びポリグリコール酸、ならびにこれらの 2種以上で構成される複合体から選ばれるいずれかを利用することができる。なかでも、 /3 -T C Pが好ましい。

本発明によれば、生体内で骨 ·軟骨再生を促す転写因子活性が長期的に発現され、損傷を受けた骨 ·軟骨の良好な再生が可能になる。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明は、骨，軟骨誘導性転写因子の遺伝子を組み込んだウィルスべクターを含む生体適合性材料からなるインプラントに関する。該インプラントは、歯槽骨再生や大腿骨再生など、歯科領域及び整形外科領域における骨♦軟骨再生に用いられる。

1. 転写因子

本発明に用いられる転写因子は、未分化の細胞を骨及び Z又は軟骨に分化誘導する、骨'軟骨誘導性の転写因子であり、例えば Cbfal、Dlx- 5、Bapxl、 Msx2、 Scleraxis, Sox - 9 が挙げられる。 Cbialは 1993年京都大学の小川らによってクローニングされ、大阪大学の小守らにより間葉系幹細胞から骨芽細胞に分化誘導するのに必要不可欠であることが確認された転写因子である (Komori, T. et al. , (1997) Cell 89, 755-764)。この Cbialには 2つのアイソフォーム、 tU-lと pebp2aAが存在する。 Dlx- 5は、 Drosophila distalless (DID 遺伝子の相同遺伝子で、軟骨骨膜や内膜の骨化に関わる転写因子である（Acampora, D. et al. , (1999) Development 126, 3795-3809)。 Bapxlは、 Drosophi la bagpipe homeobox遺伝子の相同遺伝子で、特に脊髄における間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化に関わっており、 Cbial 遺伝子の調節遺伝子の 1つと考えられている（TriMoli, C. et al. , (1999) Development 126, 5699 - 5711)。 Msx2 は、 Drosopliila muscle segment homeobox (Ms ) 遺伝子の相同遺伝子で頭蓋骨の骨化に関わっており、 Cbial遺伝子の調節遺伝子の 1つと考えられている（Satokata, I. et al. , (2000) Nature Genet. 24, 391-395)。 Scleraxisは、間葉系幹細胞から軟骨細胞や結合組織への分化誘導に関わる転写因子である（Cserjesi, P. et al., (1995) Development 121, 1099-1110)。 Sox_9は、軟骨で発現しており、 type II Collagen等の軟骨分化に関わる遺伝子の発現調節をしている (Ng, L. J. et al.， (1997) Dev. Biol. 183, 108-121)。

本発明で用いられる転写因子の由来は特に限定されないが、移植の対象となる哺乳動物に由来する転写因子を用いることが好ましレ^したがって、ヒトを対象とした骨 ·軟骨再生においては、ヒト由来の転写因子を用いることが好ましく、マウスを対象とした骨 ·軟骨再生においては、マウス由来の転写因子を用いることが好ましい。

本明細書中において、前記 CbfaK Dlx- 5、 BapxK Msx2、 Scleraxis, Sox- 9 等の骨 ·軟骨誘導性転写因子には、そのすベてのォ一ソログを含むものとする。ここで「ォーソログ（Ortholog)」とはォ一ソロガス遺伝子 (orthologous gene) のことであり、進化的に同じ起源をもち構造と機能が類似した異なる種の遺伝子を意味する。これらの遺伝子の塩基配列は既に公知であり、 GenBank等の公共データベースよりその情報を入手することができる。例えば、マウス骨芽細胞由来 Cbfal 遺伝子の塩基配列は、 Accession No. AF010284、 AF005936等として GenBankに登録されている。また、ヒト Cbfalの塩基配列は、 Accession No. AH005498、匪 004348、 L40992 等として、 GenBankに登録されている。その他、ヒト Dlx- 5は Accession No. AK023493として、ヒト Bapxlは Accession No. 匪— 001189として、ヒト Msx2 « Access ion No. D31771として、ヒト Scleraxisは Accession No. BK000280 として、ヒト Sox- 9 は Accession No. Z46629 として、それぞれ GenBank に登録されている。

本発明で用いられる骨 ·軟骨誘導性転写因子の遺伝子は、上記配列情報を利用して常法により調製することができる。すなわち、骨芽細胞から全 RNA又はmRNAを抽出し、公知の配列を基に作製したプライマーを用いて、 PCR法により目的とする転写因子の cDNAを増幅する。 2. ウィルスベクタ一の作製

前記アデノウイルス又はレトロウイルスベクターは、周知の方法に基づいて調製することができる。例えばアデノウイルスベクタ一は、 Miyakeらの方法 (Miyake, S. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:1320-1324, (1993)) に基づいて調製することができる。ベクターはまた、市販のキット、例えば Adenovirus Cre/loxP Kit (宝酒造社製）等を用いて作製してもよい。このキットは、 P1ファージの Creリコンビナ一ゼとその認識配列である ΙοχΡ を用いた発現制御系 (Kanegae Y. et. al. , 1995 Nucl. Acids Res. 23, 3816) による組換えアデノウイルスベクター作製用キッ卜で、目的の転写因子遺伝子を組み込んだ組換えアデノウィルスベクターを簡便に作製することができる。なお、アデノウイルス感染の moi (multiplicity of infection) は、 10以上、好ましくは 50〜200、より好ましくは 100前後（80〜120程度）である。

3. 生体適合性材料

本発明で用いられる生体適合性材料とは、生体内に適用可能な材料であれば特に限定されず、例えば、ハイドロキシアパタイト、ひ- TCP、 β - TCP, コラーゲン、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、及びポリグリコール酸等を挙げることができる。これらの材料は 1種類であってもよいし、あるいは 2種以上を組み合わせた複合体であってもよい。

前記生体適合性材料は、ウィルスベクターの吸着が可能なように、有効吸着表面積が大きい多孔性（または微粒子の集合体）であることが望ましレ^ なお、本明細書中において「多孔（性）」とは、気孔率が少なくとも 3 0 %以上であることを意味するものとする。本発明の生体適合性材料において気孔の大きさは特に限定されないが、直径 50 m〜 500 m程度であることが好ましい。一方、骨のような硬組織用インプラントでは、初期強度も重要となる。セラミックス多孔体ではハイドロキシァパタイトゃ i3— TCPは強度が高く、本発明の生体適合性材料として好ましい。さらに、生体適合性材料は骨再生後に生体内で分解吸収されることがより好ましい。

iS— TCPはある程度の強度を有する生分解性セラミックス多孔体という点で、本発明にかかる生体適合性材料として特に好ましい。多孔性 iS _ TCPの圧縮強度は 3 Mパスカル程度で、生体骨（海綿骨で 7 Mパスカル程度）よりは弱いものの、臨床使用には十分な強度といえる。さらに、一 TC Pは生体内で徐々に分解してカルシウムイオンとリン酸イオンを放出し、骨芽細胞によるハイドロキシアパタイト合成が容易な環境を実現する。すなわち、 /3— TCPから放出されたカルシウムイオンとリン酸ィォンを利用して、周囲の骨芽細胞によるハイドロキシァパタイト合成が可能になる。合成されたハイド口キシァパタイ卜は骨の構成成分として、やがて硬い骨へと置換していく。実際、本発明のように転写因子の遺伝子を導入したウィルスベクタ一を吸着させ、周囲が骨をつくるのに適した環境であれば、 — TCPの分解部位にハイドロキシァパタイトを主成分とした新生骨が容易に構成される。つまり、；8—TCPはウィルスデリパリ一の担体や骨形成の足場としてだけでなく、それ自体が骨新生を積極的に促進させる機能を有する。

4. 生体適合性材料へのベクタ一の組み込み

生体適合性材料へのベクターの組み込み方法は特に限定されないが、できる限り均一に組み込まれることが好ましい。ベクタ一は前記生体適合性材料に化学的に結合されていてもよいし、単に物理的に吸着されているだけでもよい。例えば、 — TCPの場合であれば、ベクターを含む溶液（培地）に浸潰させることにより、 — TCP中にベクターを均一に吸着させることができる。必要であれば、ベクターを含む溶液が生体適合性材料内に十分いきわたるよう、適宜減圧してもよい。例えば、 l x i0⁸〜10⁹ pfu/ml の濃度のウィルスベクタ一液を血清の含有されていない適当な溶媒（例えば、生理食塩水等）又は培地で希釈し、そこに生体適合性材料からなるブロックを浸漬する。 100〜150 mmHg に減圧してブロック内を脱気し、プロック内にウィルスベクター液を十分浸透させる。

ベクターを吸着させた生体適合性材料は、好ましくは数時間以内に生体内に移植する。本発明の生体適合性材料は、生体内に埋入あるいは注入されると、骨再生に必要とされる期間にわたり、徐々に転写因子の遺伝子を導入したウィルスベクターを放出する。かくして、良好な骨再生が可能となる。

5 . その他

本発明のインプラントの形態及び形状は、特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、及びべ一スト状等、任意の形態及び形状を用いることができる。また、本発明のインプラントは他の材料と混合して用いても良い。例えば、ウィルスを吸着させた iS _ T C Pの顆粒をハイドロキシァパタイ卜の顆粒と混合して骨補填剤として使用することができる。こうした形態や形状は、インプラントの目的に応じて適宜選択すればよい。

本発明のインプラントは、その目的と効果を損なわない範囲において、骨 ·軟骨組織及び足場材料のほか、適宜他の成分を含んでいてもよい。そのような成分としては、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF)、血小板分化増殖因子（PDGF)、インスリン、インスリン様増殖因子（IGF)、肝細胞増殖因子（HGF)、グリア誘導神経栄養因子（GDNF)、神経栄養因子（NF)、ホルモン、サイト力イン、骨形成因子（BMP)、トランスフォーミング増殖因子（TGF)、血管内皮細胞増殖因子（VEGF) 等の増殖因子、骨形成タンパク質、 St、 Mg、 Ca及び C0₃等の無機塩、クェン酸及びリン脂質等の有機物、薬剤等を挙げることができる。

本発明のインプラントは、骨親和性が高く、生体適用後すみやかに生体骨と一体化し、骨欠損部の再生を可能にする。図面の簡単な説明

図 1は、ラット背上皮皮下移植実験の方法を示した模式図である。図 2は、ラット背上皮皮下移植実験におけるへマトキシリン /ェォジン染色像（移植後 3週目、背上皮皮下）を示す写真である。

図 3は、ラット大腿骨欠損部位移植実験の方法を示す模式図である。図 4は、ラット大腿骨欠損部位移植実験におけるへマトキシリンーェォジン染色像（移植後 2週目、；8 - TCPブロック）を示す写真である。

図 5は、ラット大腿骨欠損部位移植実験におけるへマトキシリンーェォジン染色像（移植後 6週目、 /3 -TCPブロック）を示す写真である。

図 6は、ラット大腿骨欠損部位移植実験におけるへマトキシリン—ェォジン染色像（移植後 3週目、 HAブロック）を示す写真である。

図 7は、ラッ卜大腿骨欠損部位移植後の jS - TCPブロックと HAブロックのへマトキシリンーェォジン染色像（移植後 3週目）を示す写真である。図 8は、ラット大腿骨欠損部位移植後のウィルス吸着ブロックとウィルス感染細胞吸着ブロックのへマトキシリンーェォジン染色像（移植後 8週目、 /3 - TCPブロック）を示す写真である。

図 9は、ラッ卜背上皮皮下移植実験におけるへマトキシリン—ェォジン染色像（移植後 20 日および 8週目、 0PLAコンポジット）を示す写真である。図 10は、ラット背上皮皮下移植実験におけるォステオカルシン免疫染色像（移植後 20日目、 0PLAコンポジット）を示す写真である。

図 1 1は、ラット大腿骨欠損部位移植実験におけるへマトキシリンーェォジン染色像（移植後 10日および 20日目、 0PLAコンポジット）を示す写真である。

図 12は、ラット大腿骨欠損部位移植実験におけるへマトキシリン—ェォジン染色像（移植後 3週目、 0PLAコンポジット）を示す写真である。本明細書は、本願の優先権の基礎である特願 2003— 355505号の明細書に記載された内容を包含する。発明を実施するための最良の形態

実施例 1：生体適合性材料を担体としたウィルスベクタ一の徐放研究 (1) j8-TCPブロックおよび HAブロック

1. アデノウイルスベクターの作製

マウスの骨芽細胞から単離した Total NA から AMY reverse transcriptaseを用いて cMAを合成し、これを鍀型として Cbfalの cDNA (GenBank Accession No. AF010284：配列番号 1 )に特異的なプライマーを用いて PCRにより cbfal cDNAを増幅して得た。

sense primer 5'-ATGCTTCATTCGCCTCACAAAC-3' (配列番号 2)

antisense primer 5'-TCTGTTTGGCGGCCATATTGA-3' (配列番号 3 )

Cbfal cDNAは TA cloning vector (Invitrogen, pCR II-TOPO)にクローニングして大量調製した。 Cbfal cDNAを制限酵素の Spe I と EcoR Vで切り出し、平滑末端化した後、 Adenovirus Cre/loxP kit (宝酒造， 6151) を用いてコスミドベクタ一 pAxCALNLwの Swa Iサイトに揷入し、 Ki'tの説明書に従って組換えアデノウイルスを作製した。作製したウィルスの力価は、約 10ⁿPFU/nilの値を示し、感染効率は非常に高いことが確認された。

2. 骨芽細胞の採取及び培養方法

Rat Bone Marrow Osteobrast (RBMO) は、 6週齢の Fisherラット（雄）の大腿骨より Maniatopoulos らの方法（Maniatopoulos, C. , Sodek, J. , and Mel cher, A. H. (1988) Cell Tissue Res. 254, 317-330) に従って採取した。細胞は、 15% FBS (Sigma, F-9423), Antibiotic-Antimycotic (GIBCO B L, 15240-062) 添加 MEM培地 (nacalai tesQue, 214- 42)で約 1週間培養した。その後 2日間 10 nM Dexamethasone、 lOmM )S -glycerophosphate, 5 /ig/ml vitamin C phosphateを添加した上記の培地で培養した。

3. ラット生体内移植実験

3. 1 ラット背上皮皮下移植実験

Cbfalと Creリコンビナーゼ遺伝子の組換えアデノウイルス混合液（IX 10⁹ pfu/ml) に j8- TCPブロック（Olympus, 2 mmX2 mmX2 mm) を 3時間浸漬した。 RBMOをトリプシン処理して剥がした後、細胞濃度を 100万個/] nl に調整して減圧下（lOOmHg) でブロックに吸着した。ラットの背上皮皮下にウィルス吸着ブロックあるいは未処理のブロックを移植した。 3 週間後に摘出したブロックをへマトキシリン /ェォジン染色して観察した。図 1 にラッ卜背上皮皮下移植実験の概要を示す。

3. 2 ラット大腿骨欠損部位移植実験

1) CMalと Creリコンビナーゼ遺伝子の組換えアデノウイルス混合液（1 X10⁹ pfu/ml) に jS- TCPブロック（Olympus, 2 mmX2 mmX2 mm), あるいはハイドロキシアパタイト（HA) ブロック（インターポア、 2 mmX2 mmX2 龍）を 3時間浸漬した。ラットの大腿骨にドリルで 2.5匪立方の穴を開けて欠損部位を作製し、そこにブロックを移植した。数週間後に摘出したゥィルス吸着ブロックあるいは未処理のブロックをへマトキシリン/ェォジン染色して観察した。

2 ) Cbfalと Creリコンビナ一ゼ遺伝子の組換えアデノウイルス混合液（1 X 10⁹ pfu/ml) に一 TCPブロック（Olympus, 2 mni X 2 mmX 2 mm) , あるいはハイドロキシアパタイト（HA) ブロック（インタ一ポア、 2 mmX 2 mm X 2 醒）を 3時間浸漬した。 RBM0をトリプシン処理して剥がした後、細胞濃度を 100万個/ ml に調整して減圧下（lOOmHg) でブロックに吸着した。ラットの大腿骨にドリルで 2. 5龍立方の穴を開けて欠損部位を作製し、そこにウィルス吸着ブロックあるいは未処理のプロックを移植した。数週間後に摘出したブロックをへマトキシリン/ェォジン染色して観察した。図 3にラット大腿骨欠損部位移植実験の概要を示す。

4 . 組織切片作製、染色法

摘出したブロックを 4% paraformaldehyde, 0. 05% glut araldehydeでマイク口ウェーブ固定し、翌日 10 % EDTA, 100 mM Tri s (pH7. 4)中で約 1週間脱灰した。脱灰後、エタノールで脱水し、パラフィンに包埋した。 5 ΠΙ の厚さの切片を作製し、脱パラフィン後、へマトキシリン続いてェォジンで染色した。

結果：

1 . ラット背上皮皮下移植実験結果

図 2に、背上皮皮下移植 3週間後のへマトキシリン /ェォジン染色結果を示す。ゥィルス吸着プロックの方はプロックの中心部分で（図 2右上、右下）骨が再生されている様子が観察できた。一方未処理のブロックの方では骨芽細胞様細胞は観察されるが骨化は進行していなかった（図 2左下）。

2 . ラット大腿骨欠損部位移植実験結果

1 ) /3 -TCPプロック（移植後 2週間）図 4に、 β -TCPプロック大腿骨欠損部位移植 2週間後のへマトキシリン /ェォジン染色結果を示す。 Cbfal遺伝子組み換えウィルス吸着プロックの方が、ブロックのポアの溶解が進行しており、ポアの周囲の骨化も進行していることが観察された（図 4左下、右下）。骨芽細胞を添加した方は添加していないものに比べて、若干ブロックの溶解及び骨化が進んでいるように見えた（図 4右下）。 Cbfal 遺伝子組み換えウィルスを吸着することで、骨再生を迅速に誘導できることが確認された。

2 ) ]3 - TCPブロック（移植後 6週間）

図 5に、 β -TCPプロック大腿骨欠損部位移植 6週間後のへマトキシリン /ェォジン染色結果を示す。 Cbfal遺伝子組み換えウィルス吸着ブロックの方がブロックの溶解が進行しており、また骨化の進行も顕著であった。特に皮質骨部位における迅速な骨再生と、骨髄腔における速やかなプロックの消失が観察された（図 5左下、右下）。骨芽細胞を添加した方が、骨 -骨髄再生の進行状況から判断して、 Cbfal 遺伝子の導入効果が若干強く現れることが観察できた（図 5右下）。

3 ) HAブロック（移植後 3週間）

図 6に、 HAブロック大腿骨欠損部位移植 6週間後のへマトキシリン /ェォジン染色結果を示す。 i3 - TCPブロックに比べて本実験で用いた HAプロックは、ポアサイズも気孔率も非常に高く、ウィルスの吸着する表面積が小さくなるため、ウィルス吸着の影響が顕著ではない。また HAは生分解性材料ではないため、欠損が修復された後も体内に残存し続けると考えられた。

4 ) ;3 - TCPブロックと HAブロックの比較（移植後 3週間）

図 7に、移植後 3週間で摘出した HAブロックと; 8 -TCPブロックの骨再生の様子を比較した結果を示す。 HAブロックに比べて生分解性のセラミツクス材料である多孔性 3 - TCPブロックの方が、骨 ·骨髄再生を促進させることがわかった。効果は特に皮質骨部分で顕著に認められる。 j3 - TCPプロックの場合、移植後ウィルスが生体内で徐々に拡散されるため、ブロック周囲に存在する骨髄にも影響を与えて骨再生を促すものと考えられた。 5 ) ウィルス吸着ブロックとウィルス感染細胞吸着ブロックの比較（移植後 8週間、 jS - TCPブロック）

図 8に、移植後 8週間で摘出したウィルス吸着プロックとウィルス感染細胞吸着プロックの骨再生の様子を比較した結果を示す。ウィルス感染細胞吸着プロックに比べてウイルス吸着プロックは、骨髄腔のプロックの溶解、骨髄への置換は若干劣るが、皮質骨部分の骨化の進行は同等、及びそれ以上に早いことが観察された。

考察：

生体適合性材料である多孔性 j3 - TCP及びハイドロキシァパタイト（HA) に Cbfalの c DNAを組み込んだウィルスベクターを吸着させ、生体内に移植して Cbfal遺伝子組み換えウィルスを徐放させることにより、骨 '骨髄再生が促進できることが確認された。また、骨 ·骨髄再生の進行状況から判断して、 Cbfal遺伝子導入用ウィルスベクターを吸着させた /3 -TCPプロックは、 Cbf al遺伝子を導入した骨芽細胞を吸着させた j3 -TCPブロックと同等の骨再生効果を有すると考えられた。

HA ブロックは /3 - TCP ブロックに比べてポアサイズも気孔率も非常に高く、結果的にウィルスが吸着する表面積が小さいと考えられる。そのためウィルス吸着の影響が /3 -TCPブロックほど顕著には確認できなかった。しかしながら、 HAブロックの染色像で皮質骨の部分に着目すると、ウィルス吸着担体の方がより良好に骨再生が促進されていることがわかる。 3 - TCP とは異なり、 HAは生分解性材料ではないため、欠損が修復された後も体内に残存し続けるという問題はあるものの、本発明のィンプラント材料として使用しうることが確認された。

ラットのようなげつ歯類は一般にアデノウイルスに感染しにくいため、ヒ卜の十倍以上の濃度を使用する必要があるといわれている。例えば、直接体内へ導入する場合、 10⁸から 10^1Qpfu のウィルスを注射するという (Okubo et al. , Life Science (2001) vol 70(3)： 325-36, Trudel et al. , Cancer Gene Therapy (2003), vol 10 (10)： 755-763, Hedman et al. , Cirvulation (2003), vol 107 (21)： 2677-2683)。本実施例では、 10⁹pfu/ml のウィルス液 1 mlに 2 ■立方のブロックを 10〜20個程度浸漬しているため、体内に導入されるウィルス量は 10⁹pfuよりさらに少ない。また、本発明の方法では、注射等による直接導入と異なり、ウィルスはブロックに吸着されているため、生体内移植後に血流に乗って拡散する可能性も低い。すなわち、本試験により、本発明の方法はより低濃度で効果的な骨軟骨再生を可能にすることが確認された。実施例 2 ：生体適合性材料を担体としたウィルスベクタ一の徐放研究 (2) 0PLAコンポジット

1. アデノウイルスベクタ一の作製

マウスの骨芽細胞から単離した Total RNA から AMV reverse transcriptaseを用いて cDNAを合成し、これを铸型として Cbialの cDNA に特異的なプライマー sense primer 5， -ATGCTTCATTCGCCTCACAAAC-3 ' (配列番号 2) と antisense primer 5， -TCTGTTTGGCGGCCATATTGA-3 ' (配列番号 3) を用いて PCRにより cbfal cDNA (GenBank Accession Number AF010284) を増幅し、シークェンスにより配列を確認した。 Cbfal cDNAは TA cloning vector (pCR II-TOPO, provided by invitrogen)にクロ一ニングして大量調製した。 Cbial cDNAを制限酵素 Spe Iおよび EcoR Vで切り出し、平滑末端化した。

マウス VEGFの cDNA (GenBank Accession Number 匪— 009505) は、東京工業大学渡辺氏より供与を受けた。 VEGFcDNAを大量調製し、制限酵素の EcoRIで切り出した後、平滑末端化した。 Cbial cDNAあるいは VEGF cDNA は Adenovirus Cre/loxP kit (宝酒造， #6151) を用いてコスミドベクタ一 pAxCALNLwの Swa Iサイトに揷入し、 Kitの説明書に従って組換えアデノウィルス（Adv-Cbfal) を作製した。作製したウィルスの力価は、それぞれ約 10^HPFU/mK 約 2.5xi0⁹PFU/mlと、非常に高い感染効率であった。これらのウィルスは E1領域欠失のため、標的細胞内では増殖することはできず、一過性の性質をもつ。また、目的遺伝子の上流にスタッファーをもっため、 Cre リコンビナ一ゼ発現ウィルスと共感染のときのみ遺伝子を発現する。 Creリコンビナーゼ発現アデノウイルス（Adv- cre) はキットに付属されていたものを用いた。

2. ラット生体内移植実験

担体として BD 3D 0PLAコンポジット（BD Falcon, #354614、 5mm x 3mm X 0.039cm²)を用い、生体内移植実験を行った。 BD 3D 0PLA (Open-Cell Polylactic Acid)コンポジットは、 D、 D_L、 L ポリ乳酸から合成された合成ポリマーコンポジッ卜で、高密度懸濁細胞の培養に効率的な多面体構造を有している。

2. 1 ラッ卜背上皮皮下移植実験

0PLAコンポジットは、 Adv- Cbfalと Adv- creの組換えアデノウイルス混合液（lX10⁹pfu/ml) に減圧下で脱気しながら 2分間浸漬し、その後 3時間以上静置した。ウィルス液を吸着させた 0PLAコンポジットはラットの背上皮皮下に移植した。ウィルス吸着 0PLA コンポジットあるいは未処理の OPLAコンポジットは数週間後に摘出して解析した。

2. 2 ラット大腿骨欠損部位移植実験

骨補填材料として上記 BD 3D OPLAコンポジット（BD Falcon, #354614、 5mmX3mmX0.039cm²)を用いた。滅菌下で四等分した OPLAコンポジットを Cbfal (Adv-Cbfal) あるいは VEGF (Adv-VEGF) と Creリコンビナーゼ遺伝子（Adv_cre) の組換えアデノウイルス混合液（lx 10⁹ pfu/ml) に減圧下で脱気しながら 2分間浸漬し、その後 3時間以上静置した。ラットの大腿骨に直径 2.5mm、深さ 2mmの穴をドリルで開けて欠損部位を作製し、ウイルス液を吸着させた OPLA コンポジットをそこに移植した。ウィルス吸着 OPLAコンポジットあるいは未処理の OPLAコンポジットは数週間後に摘出して解析した。

3. 組織切片作製、染色法

摘出したコンポジッ卜を 4¾ paraformaldehyde, 0.05% glutaraldehyde でマイクロウエーブ固定した後、翌日 10% EDTA, 100 mM Tris (pH7.4)中で約 1週間脱灰した。脱灰後、エタノールで脱水し、レモゾールで透徹し、パラフィンに包埋した。 5 ΠΙの厚さで切片を作製し、脱パラフィン後、へマトキシリン続いてェォジンで染色した。サンプルは光学顕微鏡（IX - 70, Olympus, Tokyo, Japan)で観察し、 CCD カメラ（Cool SNAP cf, ROPER Scientific)により取り込んだデジタルイメージは MetaMorph softwareで解析した。

免疫染色については、の厚さで切片を作製し、脱パラフィン後、 Proteinase K solution (DakoCytomation, Inc. , Glostrup, Denmark) 5 分間処理し、続いて Peroxidase Blocking Reagent (DakoCytomation)で処理した。切片を Blocking reagent (Roche, Basel, Switzerland)で非特異的蛋白質の吸着をブロッキングし、一次抗体の mouse monoclonal anU- osteocalcin antibody (Zymed Laboratories Inc. , San Francisco, CA)とー晚、 4°Cでィンキュベートした。二次抗体の Horseradishperoxidase conjugated secondary antibody (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) を加えて一時間ィンキュベ一卜し、 DAKO Li uid DAB substrate- chromogen (DakoCytomation)を用いて発色させた。その後、へマトキシリンで核染色した。サンプルは光学顕微鏡（IX-70, Olympus, Tokyo, Japan)で観察し、 CCDカメラ（Cool SNAP cf, ROPER Scientific)により取り込んだデジ夕ルイメ一ジは MetaMorph softwareで解析した。

結果：

1. ラット背上皮皮下移植実験結果

図 9に、へマトキシリンーェォジン染色像の観察結果（移植後 20日および 8週目）を示す。 Adv- Cbialウィルス吸着コンポジットの方は骨が再生されている様子が観察できる（写真右側、矢印）。一方コントロールのコンポジッ卜の方は、皮下の脂肪等の細胞が浸潤してきている様子は観察されるが骨化は進行していない（写真左側、 *印）。

図 10に、ォステオカルシン免疫染色像の観察結果（移植後 20日目）を示す。ォステオカルシンはポアの表面に接着している細胞で強く発現しており、石灰化が生じている部位でも観察された。ォステオカルシンの局在は石灰化が生じており、骨が再生されていることを示している（写真、矢印）。

2. ラット大腿骨欠損部位移植実験結果

図 1 1に、へマトキシリン—ェォジン染色像の観察結果（移植後 10日および 20日目）を示す。 Adv-Cbfalウィルス吸着コンポジットの方が、皮質骨の部分の骨再生が進行しており、皮質骨の欠損部位の大きさが小さくなつてきている様子が観察された（写真上段）。また移植後 20日目のサンプルでは、移植したコンポジットの溶解および順調な骨再生が観察され、さらに移植したコンポジッ卜と皮質骨の融合が観察できた（写真下段、右側）。一方、ウィルスを吸着していないコンポジット（コントロール）では、移植後 10 日目では骨再生がほとんど観察されず、 20 日目でもコンポジッ卜と皮質骨との融合も顕著ではない。これらの結果は、 Adv - Cbfal ウィルス吸着コンポジットでは、移植期間中に生体内で Adv- Cbfalが徐々に溶け出して周囲の細胞に働きかけ、活性化することにより迅速な骨再生を誘導できることを示唆する。

図 1 2に、へマトキシリンーェォジン染色像の観察結果（移植後 3週目）を示す。 Adv- Cbialウィルスおよび Adv- VEGFウィルス吸着コンポジットでは、移植したコンポジットの溶解が顕著であり、コンポジット内部の骨再生が進行している様子が観察された（写真下段）。特に、皮質骨部位における迅速な骨再生、および移植したコンポジッ卜と皮質骨の融合が観察された（写真下段）。

以上より、本発明の方法は 0PLAコンポジットを徐放性担体として用いた場合にも、効果的な骨軟骨再生を可能にすることが確認された。本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。産業上の利用の可能性

本発明によれば、より安全かつ簡便な骨 ·軟骨再生が可能となる。本発明のインプラントは、歯科領域あるいは整形外科領域における安全かつ簡便な骨 ·軟骨再生手段として利用できる。配列表フリーテキスト

配列番号 2—人工配列の説明： Cbfal増幅用センスプライマー配列番号 3—人工配列の説明： Cbfal増幅用アンチセンスプライマー

Claims

1. 骨 ·軟骨誘導性転写因子の遺伝子を導入したアデノウイルスベクタ一又はレトロウイルスベクターを含む生体適合性材料からなるィンプラン卜。

2. 骨 ·軟骨誘導性転写因子が、 Cbfal、 Dlx- 5、 BapxK Msx2、 Scleraxis

請

及び Sox- 9 からなる群より選ばれる 1種又は 2種以上である、請求項 1に記載のインプラント。

3. 骨 ·軟骨誘導性転写因子が Cbialである、請求項 1に記載のインプラン卜。

囲

4. 生体適合性材料が、ハイドロキシアパタイト、 a- TCP、 β-TC P、コラーゲン、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、及びポリダリコール酸、ならびにこれらの 2種以上で構成される複合体からなる群より選ばれるいずれかである、請求項 1〜 3項のいずれか 1項に記載のィンプラント。

5. 生体適合性材料が CPである、請求項 4に記載のインプラント。