WO2005028648A1

WO2005028648A1 - リンパ腫の病型および予後診断方法

Info

Publication number: WO2005028648A1
Application number: PCT/JP2004/014305
Authority: WO
Inventors: Masao Seto; Hiroyuki Tagawa; Yasuko Yoshida; Shigeki Kira
Original assignee: NGK Insulators Ltd; Aichi Prefecture
Current assignee: NGK Insulators Ltd; Aichi Prefecture
Priority date: 2003-09-22
Filing date: 2004-09-22
Publication date: 2005-03-31
Anticipated expiration: 2006-03-22
Also published as: EP1676914A1; JPWO2005028648A1; EP1676914A4

Abstract

CD5+DLBCL患者と、CD5-DLBCL患者の予後を診断する方法を提供する。リンパ腫患者から染色体DNAにおいて、(1)13q21.1-131.3領域の増幅があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;(2)1p36.21-p36.13領域の欠失があるCD5+DLBCL患者の予後は不良;および(3)5p15.33-p14.2領域の増幅があるCD5-DLBCL患者の予後は良好と判定する。

Description

明細書

リンパ腫の病型および予後診断方法

技術分野この出願の発明は、リンパ腫の病型と予後診断方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、悪性リンパ腫の予後症状を分子生物学的に診断する方法と、この方法に使用する材料に閧するものである。背景技術びまん性大細胞型 B 細胞リンパ腫（DLBCL) は非ホジキンリンパ腫症例の 30%余を占めており、臨床的に不均質である（Harris, N.L. et al. Blood, 84: 1361- 1392, 1994； Gatter, K. C. and Warnke R. A. Pathology & Genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues, pp 171- 174. Washington: IARC press, Lyon, 2001) 。近年、 DLBCLサ、ンプルの転写産物に対するマイクロアレイ分析から、生物学的に異なり、臨床的にも有意である DLBCL のサブタイプが明確に示されている（Alizadeh, A. A. et al. Nature (Lond.) , 403: 503-51 1 , 2000； Shipp, M. A. et al. Nat. Med., 8: 68-74, 2002) 。複数の遺伝子変異が DLBCL の病因に関連するものとして同定されているが、'全ゲノムスクリーニングはまだ実施されていない（Offit, K. et al. N. Engl. J. Med., 331 : 74-80, 1994； Kramer, M. H. H. et al. Blood, 92: 3152-3162, 1998) 。近年開発された DNA アレイによる比較ゲノムハイブリダイゼーシヨン（CGH) 技術によって、ゲノム全体にわたり高解像度でゲノムのコピー数変化を高速分析することが可能である。このようにして得られた DNA コピー数の定量的測定によって、腫瘍関連遺伝子の同定を行うことが容易になる可能' I生力あり（Weiss, M. M. et al. J. Pathol. , 200: 320-326, 2003) - またこれを用いれば腫瘍の分類が可能となると期待されている（O'Hagan, R. C. et al. Cancer Res., 63: 5352-5356, 2003) 。

CD5 は細胞表面分子の一つであり、 T 細胞上やリンパ器官ならびに腹腔の外套帯に位置する B細胞の部分集団上で生理学的に発現する。臨床上の CD5の発現は、慢性リンパ球性白血病（Muller-Hermelink, H. K. et al. Pathology & Genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues, pp 127- 130. Washington: IARC press, Lyon, 2001) やマントル細胞リンパ腫（Swerdlow, S. H. et al. Pathology & Genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues, pp 168- 170. Washington: IARC press, Lyon, 2001 ) に伴い生じることが多い。発明者らは、これまで DLBCL の症例において、 CD5 の発現が予後不良のマーカ一であることを同定している。すなわち CD5 陽性 ( CD5+) DLBCL は高齢時の発症、女性優勢、リンパ節外部位併発の増多に関連して生じている (Yamaguchi, M. et al. Blood, 99: 815-821 , 2002) 。また CD5+と CD5 陰性（CD5-) の DLBCL症例を比較して差分的に発現している転写産物に対して、マイクロアレイ分析を行うことにより、 CD5+ DLBCL に独特な疾患像が示されている（Kobayashi, T. et al. Cancer Res., 63: 60-66， 2003； Gascoyne, R. D. et al. Blood, 102: 178a- 179a, 2003) 。一方、染色体増幅は、腫瘍内で遺伝子が過剰発現する際に頻繁にみられるメカニズムである。そのため、増幅領域に存在する腫瘍遺伝子の同定と特徴決定を行うことにより、発癌の原因に関する重要な洞察が得られる可能性がある (Schwab, M. Cancer. Biol. , : 319-325, 1999) 。神経芽腫の MYCNや乳癌の HER2.などといった、活性化発癌遺伝子もやはり予後に関連がある（Schwab, M. Cancer. Biol" 4: 13- 18， 1993； Brodeur, G. M. et al. Science (Wash. DC) , 224: 1 121- 1 124, 1984； Slamon, D. J. et al. Science, 235: 177- 182, 1987) 。

13q21-qter にみられる高度な増幅は、血液癌や他の充実性新生物に観察されている。 13ql2-qterの増幅は、（DLBCL) (Rao, P. H. et al. Blood, 92: 234-240, 1998) 、マントル細胞リンパ腫（MCL) (Monni, O. et al. Genes Chromosomes Cancer, 21 : 298-307, 1998) 、濾胞性リンパ腫 (Neat, M. J. et al. Genes Chromosomes Cancer, 32: 236-243, 2001) 、原発性皮膚 B細胞リンパ腫（Mao, X. et al. Genes Chromosomes Cancer, 35: 144- 155, 2002) 、鼻タイプ NK/T細 S包リンパ腫 (Ko, Υ. Η. et al. Cytometry, 46: 85-91 , 2001) などにみられることが報告されている。 13q21-qter の増幅症例は、さらに固形腫瘍にも観察されており、グリオ一マ；非小細胞肺癌；膀胱癌；頭部ならびに頸部における扁平上皮細胞癌（Knuutila， S. et al. Am J Pathol. , 152: 1 107- 1 123, 1998 ) 、末梢神経鞘腫瘍 ( Schmidt, H. et al. Genes Chromosomes Cancer, 25: 205-211， 1999 ) 、悪性繊維性組織球種 (Lallamendy, M. L. et al. Am J Pathol., 151 : 1 153-61 , 1997) 、胞巣状横紋筋肉腫 (Gordon, A. T. et al. Genes Chromosomes Cancer, 28: 220- 226, 2000) 等にみられる。

発明の開示この出願の発明者らは、 2,088種類の BAC/PACクローン（細菌人工染色体 ZP1-誘導性人工染色体）を二重反復でスポッ卜した独自の DNAアレイによる CGHを確立し、これを 26例の CD5+ならびに 44例の CD5-DLBCL症例に適用した。その結果、両グループが共有するゲノム異常と、 CD5+DLBCLに固有の異常を同定し、さらにそのようなゲノム異常がリンパ腫の予後診断に有用であることを見出した。またさらに発明者らは、前記の DLBCL患者 70例のうち 18例には、 13q31- q32を含む 13qの増幅がみられることを見出すとともに、この増幅領域における新規遺伝子を同定した。そして、この新規遺伝子の発現レベルがリンパ腫の予後診断に有効でであることを見出した。この出願の発明は、以上のとおりの新規な知見に基づくものである。すなわち. この出願は、以下の発明を提供する。第 1 の発明は、 CD5 陽性のびまん性大細胞型 B 細胞リンパ腫 ( CD5+DLBCL) 患者と、 CD5 陰性のびまん性大細胞型 B 細胞リンパ腫 (CD5-DLBCL) 患者の予後を診断する方法であって、それぞれのリンパ腫患者から染色体 DNAを単離し、この染色体 DNAにおいて、

( 1) 第 13 染色体 q21. 1-q31.3 ( 13q21.1- 131.3 ) 領域の増幅がある CD5+DLBCL患者の予後は不良；

(2) 第 1 染色体 P36..21- p36. 13 ( 1ρ36.21-ρ36.13 ) 領域の欠失がある CD5+DLBCL患者の予後は不良；および

(3) 第 5 染色体 p l5.33-;pl4.2 ( 5 pl5.33-pl4.2) 領域の増幅がある CD5- DLBCL患者の予後は良好、

と判定することを特徴とする方法である。第 1発明の一態様は、染色体領域を含む複数の DNAプローブと患者からの染色体 DNA とのハイブリダィゼーシ.ヨンによって染色体領域の増幅または欠損を測定する方法である。第 1発明の別の態様は、 DNAプローブが BAC/PAC DNAクローンである方法である。第 1 発明における前記態様における好ましい形態は、ハイブリダィゼーションを固相単体上で行う方法である。第 2 発明は、前記の八ィプリダイゼーシヨンを固相単体上で行う方法に使用し、染色体領域を含む複数の DNA プローブを固相単体上に固定した DNA ァレィ'である。第 2発明の一つの態様は、 DNAプローブが BAC/PAC DNAクローンである DNAアレイである。第 3発明は、 CD5+DLBCL患者と、 CD5-DLBCL患者の予後を診断する方法であって、リンパ腫患者から生体試料を単離し、この生体試料において、

( 1) 13q21. 1- 131.3 領域に含まれる遺伝子の発現増加がある CD5+DLBCL患者の予後は不良；

(2) Ip36.21-p36. 13 領域に含まれる遺伝子の発現低下がある CD5+DLBCL 患者の予後は不良；および

(3) 5p l5.33-p l4.2 領域に含まれる遺伝子の発現増加がある CD5-DLBCL 患者の予後は良好、

と判定することを特徴とする方法である。第 3 発明における一つの態様は、 13q21.1- 131.3領域に含まれる遺伝子が、以下の特徴：

(a) SEQ ID NO : および SEQ ID NO: 5のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードすること；および Zまたは

(b) 以下の前駆 microRNA：

miR91-前駆- 13microRNA、 miR18-前駆- 1、 3microRNA、 miR19a- 前駆- 13microRNA、 miR19b-前駆- 13microRNA および miR92-前駆- 13microRNAと、

以下の成熟 microRNA：

miR- 17、 miR-91、 miR- 18、 miR— 19a、 miR-20、 miR- 19b およぴ miR-92

を転写すること、

を有する遺伝子 C 13orf25である方法である。第 3 発明に別の態様は、遺伝子の発現増加または発現減少を、遺伝子転写産物を測定することによって判定する方法である。第 3 発明における上記態様における好ましい形態は、遺伝子転写産物が mRNAである方法である。第 3発明において、遺伝子転写産物が mRNAである上記形態におけるさらに好ましい形態は、遺伝子の全長または一部である DNA プローブと、遺伝子 mRNA または cDNA とのハイブリダィゼーシヨンによって遺伝子の発現増加または発現減少を測定する方法である。第 3発明において、プローブと mRNAまたは cDNAとのハイブリダイゼ一ションを行う形態におけるさらに好ましい形態は、ハイプリダイゼ一ションを固相単体上で行う方法である。第 4 発明は、前記ハイプリダイゼーシヨンを固相単体上で行う方法に使用し、 DNAプローブを固相単体上に固定した DNAアレイである。第 3 発明の方法におけるさらに別の態様は、遺伝子転写産物がタンパク質である方法である。前記のタンパク質の増減を測定する方法における一つの形態は、タンパク質に特異的に結合する抗体を用いる方法である。第 5 発明は、前記抗体を用いて方法に使用する抗体であって、前記タンパク質と特異的に結合する抗体である。第 5発明の一態様は、 SEQ ID NO:4および SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を認識する抗体である。第 6発明は、以下の特徴：

(a) SEQ ID NO :4および SEQ ID NO :5のアミノ酸配列を含むタンパク質をコ

―ドすること；および Zまたは

(b) 以下の前駆 microRNA：

以下の成熟 microRNA：

miR- 17、 miR-91、 miR- 18、 miR— 19a、 miR-20, miR- 19b および miR-92

を転写すること、

を有する遺伝子 C13orf25の精製ポリヌクレオチドである。第 7 発明は、前記第 6 発明のポリヌクレオチドの一部連続配列からなり、遺伝子 C13orf24とストリンジェン卜な条件下で八イブリダイズするオリゴヌクレォチドプローブである。第 8発明は、前記第 7発明のオリゴヌクレオチドプローブを備えた DNAァレィである。第 9発明は、遺伝子 C13orf25 を PCR増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーである。なお、この発明における DLBCL患者の「予後良好」とは、あるゲノム領域で差（増幅、欠失、正常何れも含む）をもつ 2つの DLBCLの患者群間で、力ブランマイヤ一曲線を比較したとき、 log rank testの p値が、 0.05以下の有意差をもって生存率がよい患者群の状態を指す。また「予後不良」とは力プランマイヤ一曲線を比較したとき、 log rank testの p値が、 0.05以下の有意差で生存率が悪い患者群の態を指す。またこの発明における用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的には IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術は J. Sambrook, E. F. Fritsch & Τ· Maniatis,

"Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M.

Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed.， Vol. 1 to 4， (The Practical

Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) ; Aus bel, F. M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John 'Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座 1、遺伝子研究法 II」、東京化学同人（1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座 2、核酸 III (組換え DNA技術） J 、東京化学同人（1992); R. Wu ed.， "Methods in Enzvmology", Vol. 68 (Recombinant DNA) , Academic Press, New York (1980) ; R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100

(Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C) , Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D) , 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F)， Academic Press, New York (1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。

図面の簡単な説明図 1 は REC 1 細胞株の全ゲノムプロファイルならびにゲノム増加と損失を調ベた FISH分析の結果である。 A： REC 1 細胞株の全ゲノムプロファイルである _c 1 ,966種類の BAC/PACクローンそれぞれに対する log2比を、そのゲノム位置の関数としてプロットした。水平の点線は増加と減少の閾値を示す。 B： BAC、 RP1 1-430K10 (赤色信号）を 13q32 に有する細胞株に対する FISH 分析の結果である。矢印は 13q32増幅を示す。 C：二重色 FISH分析による 4q32.1減少の検出。分裂中間期の染色体には、それぞれ二対の赤色信号があり（BAC、 RP1 1- 154F14) 、それらにはそれぞれ一対の緑色信号が矢印付近に存在する (BAC、 RP1 1-312A15) 。これら 2種類の BAC間の物理的距離は 0.75Mbである。分裂中期細胞と染色体は DAPIにより逆染色した。図 2は Karpas 1718細胞株（SLVL) の第 16染色体と第 8p染色体の個別ゲノムプロファイルと、ゲノム増加（16p l3.3) と減少（8p21 ) を調べるための FISH 分析の結果である。 A：第 16 染色体の個々のゲノムプロファイル。これは BAC、 RP1 1-27M24遺伝子座（16p l3.3) の位置に大きな増幅を示している (log₂比、 +2.45) 。 B ： BAC、 RP1 1-27M24 による分裂中期と中間期の FISH 分析では、 16p l3.13 におけるゲノム増幅がみられる（矢印）。 C：第 8p 染色体の個別ゲノムプロファイル。 8ptel-p21 の位置に減少が示されている。 D : BAC、 RP1 1-353K12 と BAC；、 RP1 1-369E15 を用いた二重色 FISH分析。 8p のブレークポイントはこれらの BACs 間に存在することが示されている。 BAC、 RP1 1-369E15は BAC、 RP11-353K12に対して 500kbだけ動原体側に存在する。分裂中間期ならびに中期の染色体にはそれぞれ二対の赤色信号があり (BAC、 RP1 1-369E15) 、それらにはそれぞれ一対の緑色信号が矢印付近に存在する（BAC、 RP1 1-353K12) 。図 3は、個別の腫瘍に関する代表的なアレイ CGHプロファイルである。全ゲノムプロファイルを 3 種類の代表的な DLBCL 症例について示した（A： CD5+ 症例 1、 B： CD5+症例 2、 C ： CD5-症例 3) 。全てのクローンについて染色体位置を元に log₂比をプロットしたが、このとき垂直方向の点線棒は染色体の分離を示している。 BACs の配列はゲノム中の位置により、 lp テロメァから初めて Xq テロメァで終了するように並べた。 A : コピー数増加： Iq21.2-q24.3、 2p22. 1-pl6. 1、 7ptel-p21.3、 7p21. 1-pl 1.2 , 7q21. 1 l-q31.1、 8p l l .23、 8q24.13-qtel、 1 lq22.3-qtel、 13q21.32- 13q32.2 13q34-qtel、 15、 17q、 19ql3.43-qtel、 20、 21。コピー数減少： 1ρ36.32-ρ36.21 , 2ptel-p22.3 > 4ptel-p l5. 1 、 6ρ25·3-ρ22·3、 7ρ21 ·3、 7q31.33、 8ptel-p l2 > 8ql2. 1、 13q34-qtel、 14q22.2-q21.3、 17p。 B : コピー数増加： 3pl4.2-qtel、 7、 9ptel-q32.2、 12ptel-p l 1.2、 15q24.3-qteL 18。コピー数減少： lpteレ p35.1、 9p21、 15ql4-q21.1、 17p。 C : コピ一数増カロ： 1ρ36、 3、 6p、 7q21.1 1-qteL 1 1、 16p l3.3、 17cen-q23.2、 18。コピー数減少： 3p l4.2、 6ρ25.1-ρ22.3 , 6ql4.1-qtel、 9q22.33、 15q26.2-qtel、 17p。単一 BAC、 RP1 1-48E21 の log₂比率が- 2.01 であることから、 3pl4.2 遺伝子座におけるホモ接合性の減少が考えられる。図 4 は第 3p 染色体のゲノムプロファイルならびに最少共通減少をもとめる FISH 分析の結果である。 A :代表的な 3p の個別ゲノムプロファイルを 4 種類示す。最少共通減少は太い矢印で 3p l4.2 の位置に示す（BAC、 RP11-48E21 遺伝子座）。黒い 3本線は、各 DLBCL症例の個別プロファイルである。赤線は悪性腫瘍細胞株 OCI-LY13.2 の個別プロファイルである。テロメァの物理的距離は枠線の下に示す（Mb) 。 B と Cの FISH分析で用いたプローブの位置も、同様に小さな太い水平線で示す。プローブ A : BAC、 RP11-391P4。プローブ B： BAC、 RP1 1-48E21。プローブ C : BAC、 RP1 1-61 1H 10。プローブ Aはプローブ Bより 1Mbテロメァ側に存在する。プローブ Cはプローブ Bより 1Mb 動減退側に存在する。細い矢印は症例の減少領域を示す。 BAC、 RP1 1-48E21 には FHIT 腫瘍抑制遺伝子が含まれている。 B：プローブ A と B を用いた、 OCI-LY13.2細胞株に対する二重色 FISH分析。分裂中期の染色体には二対の赤色（プローブ A、赤）信号と、一対の緑色（プローブ B、綠）信号があり、それによってプローブ B のへテロ接合的減少が示されている。 C：プローブ B と C を用いた OCI-LY13.2 細胞株に対する二重色 FISH 分析。分裂中期の染色体には二対の赤色（プローブ C、赤）信号と一対の緑色信号（プローブ B、緑）があり、それによつてプローブ B (緑）のへテロ接合的減少が示されている。図 5は CD5⁺ DLBCLの特徴的増加に関する個別ゲノムプロファイル。 3種類の代表的事例を伴う第 10染色体と第 19染色体のアレイ CGH プロファイルを示す。垂直線は log₂比を示す。水平線は pテロメァから qテロメァまでの物理的距離を示す（Mb) 。 Log₂比が +0.2 以上である場合にゲノムコピー数増加を示し、 lo_g2比が- 0.2 以下である場合にゲノムコピー数減少を示す。水平の点線は増加と減少の閾値を示す。太い矢印は、これら 3 種類の症例の共通増加領域を示す。細い矢印は個別症例の増加領域を示す。水平の点線矢印は、 CD5+と CD5-DLBCL を比較して頻度に有意差のある増加領域を示す。 A :第 10 染色体の 3種類の代表的個別ゲノムプロファイル。 B：第 19染色体の 3種類の代表的個別ゲノムプロファイル。図 6 は CD5+DLBCLの特徴的減少の個別ゲノムプロファイルと最少共通領域。 3種類の代表的症例を伴う、個々の染色体のアレイ CGHプロファイルを示す。水平の点線は増加と減少の閾値を示す。太い矢印は、これら 3 種類の症例の共通減少領域を示す。細い矢印は、各症例の減少領域を示す。水平の点線矢印は、 CD5+と CD5-DLBCLを比較して頻度に有意差のある増加領域を示す。 A：第 l q 染色体の 3 種類の代表的個別ゲノムプロファイル。 B：第 8染色体の 3種類の代表的個別ゲノムプロファイル。図 7は 13q 増加、 1ρ36 減少、 5p 増加がみられる場合とみられない場合の、 CD5+ならびに CD5-DLBCL 症例に対する力プラン-マイヤー生存曲線。総生存は CD5+と CD5-グループについて示す。横軸：総生存。縦軸：確率。 A : 13q21. 1- q31.3増加の有無による CD5+症例の生存曲線（6例と 19例）、ならびに 13q21. 1-q3 1.3増加の有無による CD5-症例の生存曲線（6例と 35例）。 B： Ip36.21-p36.13 減少の有無による CD5+症例の生存曲線（6 例と 19 例）、ならびに Ip36.21 -p36. 13 減少の有無による CD5-症例の生存曲線（9 例と 32 例）。 C : 5p l 5.33-p l4.2 減少の有無による CD5+症例の生存曲線（4 例と 2 1 例）、ならびに 5p l 5.33-p l4.2 減少の有無による CD5-症例の生存曲線（7 例と 34例）。図 8は正常例と女性を対象にしたアレイ CGH分析。 A :正常男性と正常女性の DNAsを用いたアレイ CGHの代表的なゲノムプロファイルの比較。正常男性同士の同時ハイブリダィゼ一シヨン 6 例を実施し、 log₂比率（log₂ cy3/ cy5) における正常変動を定義した。対照実験では、各スポット（2x 1 ,966 クローン）に対して測定した蛍光 log₂比率の 95%以上が +0.2? -0.2 の範囲であった (データ示さず）。従って増加ならびに減少の log₂比率に対する閾値を、それぞれ log₂比率 +0.2ならびに- 0.2の範囲に定めた。アレイのデータは、各クロ一ン毎に対する二重スポットの平均 log₂比としてプロットした。横線は増加ならびに減少の log₂比率に関する閾値を表す。それぞれの BAC クローンに対する lo_g2比率は、それに対するゲノム位置の関数としてプロットしたが、このとき、第 1 染色体は左に、 X 染色体は右に、またそれぞれの染色体について、その順序は短腕テロメァ側から長腕テロメァ側に並べている。 B : X 染色体のコピー数変化に対する正規化 log₂比。正常男性 DNAを全ハイブリダィゼーシヨンの参照として用いた。アレイハイブリダィゼーシヨンを試験ゲノム DNA を用いて行つたが、この DNAは正常男性（1 X染色体）、正常女性（2 X染色体）、 X染色体のコピーを 3個、 4個 5個含む 3種類の細胞株に由来するものであった。各プロットは、 X染色体に由来する 57種類のクローンの正規化蛍光比全てに対する平均値を表す。それぞれの X 染色体クローンに対する比率は、常染色体クローンの平均蛍光強度比により正規化した。正常男性と正常女性によるアレイハイブリダィゼ一シヨンの蛍光強度比を 0 として定義した。次に正規化値した値を元に、各プロットを計算した。直線は、全データにわたる線形回帰を表し、傾きは 0.51、切片は 0.72であった。図 9はアレイ CGHのゲノムプロファイル。 A : Karpas 1718を用いた代表的なアレイ CGHのゲノムプロファイル。 BACsの配列は lp テロメァから始まり、 Xq テロメァで終わるゲノム内位置による。グラフ上の黒矢印は高レベルの増幅を示す（log₂比 > 1で定義）。 B : 3種類の細胞株（Karpas 1718、 Ree l , OCI- Ly7) ならびに 1例の DLBCL患者における、第 13染色体の詳細ゲノムプロフアイル。 68種類の BACならびに PACクロ一ンそれぞれに対する log₂比率は、それに対するゲノム位置の関数としてプロットしたが、このとき、染色体 13q セントロメァは左に、 13q テロメァは右になっている。水平の点線は増加と減少に関する閾値を示す。太い矢印は高レベルの増幅を（log₂比> 1 で定義）、細い矢印は中程度レベルの増幅を示す（0.2>10₈₂比> 1で定義）。 Karpas 1718は第 13q 染色体の 50Mb 以上におよぶ広範囲の増幅を示している。さらに、 Karpas 1718の高レベル増加が 13q22.2から 13q31.3 まで観察され、ここで特に 13q31.3が最高レベルの増幅を示している（log₂比 >2) 。同様な方法で、 13q31.3 には OCI- Ly7 と Reel の高レベル増幅が見られる。 Reel もまた 13q31.3 の近傍において広範囲の減少を示している。患者試料（D778) では 13q21.2- 13q31.3 ならびに 13q33.3-qter に広範囲の増幅が見られ、特に 13q31.1-q31.3は高レベルの増幅を示していた。図 10 は 13q31-_q32 に増幅が見られる細胞株と見られない細胞株に対する、 FISH 分析ならびに CGH 分析。 4 種類の細胞株（Karpas 1718、 Reel , OCI- Ly4、 Jurkat) に対する CGH の結果を示す。各染色体の右（緑）ならびに左

(赤）に位置する線は、それぞれ増加または減少した領域を示す。 BAC、 RP11-487A2 による分裂中期 FISH の代表的な結果を、各パネルの右側に示す。 CGH を用いて検査した第 13 染色体も、各記号の近くに示している。 3 種類の B 細胞リンパ腫細胞株、すなわち Karpas 1718 (A) 、 Ree l (B) 、 OCI-Ly4 (C) には 13q31-q32 に増幅が見られたが、 Jurkat (D) にはそれは見られなかった。 FISH分析では 3種類の B細胞株に 15コピー以上の増幅が示されているが、 Jurkatには増幅が見られなかった。それぞれの分裂中期染色体は、 DAPI で逆染色した。図 1 1 はアレイ CGH と分裂間期 FISHの組み合わせによる 13q31-q32 の分析。 A : 3種類の細胞株（Recl、 Karpas 1718、 OCI-Ly7) と 1種類の DLBCL 患者（D778) に対するアレイ CGH分析データのまとめ。縦軸は log₂比を示す。水平の点線は増加と減少に関する閾値を示し、それぞれ +0.2 と- 0.2の log₂比に設定してある。灰色のカコミ部分は、 3 種類の細胞株における高レベル増幅 ( Lo_g2 比> 1 ) の共通領域を示しており、これは RP1 1-360A9 から RP1 1- 481A22 まで伸長している。 B : 3 種類の細胞株（Karpas 1718、 OCI-Ly4、 Reel) の DNAシーケンスコピー数デ一夕のまとめ。この測定は分裂中期 FISH により実施し、 13q31.3 の BACクローン 19種類を用いたが、これにはアレイ CGHで用いなかった新しい BACである RP1 1-93M 14が含まれている。 10種類の分裂中間期の細胞を分析し、それぞれの細胞株ごとに、 BAC クローンシグナルの平均コピー数を計数した。縦軸はコピー数を、水平の点線は正常な 2 種類のコピーを示す。灰色のカコミ部分はコピー数増幅の共通領域を示しており、これは RP11-29C8から RP11-93M 14までの範囲に伸長している。 STSマ一力 —ならびに全ての BAC クローンの位置は Ensembl Genome Data Resource (http:/ /www.ensembl.org/) による記録情報をもとに確認した。下線のある BACクローンを FISH分析とアレイ CGHに用いた。細い矢印は GPC5遺伝子座を示す。図 12 は 13q31-q32増幅の候補遺伝子に対するノーザンブロット分析。ノーザンブロット分析を次の 6 種類の RNA に対して実施した。ヒト胎盤（レーン 1) 、 3種類の B細胞リンパ腫細胞株で 13q31-q32 に増幅が見られるもの（レーン 2： Recl、レーン 3： Karpas 1718、レーン 4： OCI-Ly4) 、 2 種類の T 細胞リンパ腫細胞株で増幅が見られないもの（レーン 5： Jurkat、レーン 6 : ATN- 1) 。 30種類の ESTsのうち 8種類と GPC5について、代表的で特徴的な発現パターンを示す。 GPC5 と BI481522 の発現には有意差はなかったが、 LOC 160824 、 AF339828 、 BC040320 、 AF339802 、 LOC 121734 、 AA705439、 N49442 は明らかに異なる発現パターンを示した。特に AF339828 と BC040320は同様なハイプリダイゼ一シヨンパターンを示しており、その発現は 13q31-q32におけるコピ一数増加に対する索引となる。図 13、 14、 15は GPC5 と BC040320に対する発現試験。細胞株と DLBCL 患者それぞれについて 13q31-q32 の増幅状態を、従来の CGH により調べ、これを試料名の上に示した。図 13 :細胞株と、 13q31-q32で増幅が見られる場合と見られない場合の DLBCL患者における、 GPC5 と BC040320 の発現パターン。 5種類の細胞株と、 13q31-q32で増幅が見られる DLBCL患者 2例における GPC5 の発現には、他の細胞株や増幅の見られない患者における場合と比較しての有意差はなかった。 BC040320 は 13q31-q32 で増幅の見られる細胞株 (レーン 1 ? 5) において発現しており、増幅の見られない細胞株ではこれより低いレベルで発現していた（レーン 6〜8 ) 。同様な方法で、 BC040320 は 13q31-q32で増幅の見られる DLBCL患者で強く発現していたが（レーン 9 と 10) 、増幅の見られない細胞株での発現は非常に弱かった（レーン 1 1 と 12) 図 14：血液学的悪性度を有する ¾数の細胞株における GPC5 と BC040320 の発現パターン。 13a31-q32 に増幅の見られる細胞株の一部には（レーン 9、 1 1 , 12) 、高レベルの増幅を示す 2種類の細胞株（レーン 1 と 2) に比べて弱いシグナルを示すものがある。 GPC5の発現は若干変動のある非常に弱いシグナルを示すが、有意差は無かった。 AML：急性骨髄性白血病細胞株。 MM：多発性骨髄腫細胞株。 NK/T : NK/T 細胞リンパ腫/白血病細胞株。図 15：複数の正常組織中における BC040320 と GPC5 の発現パターン。 13q31-q32 で高レベル増幅を示す 2 種類の細胞株の場合（レーン 1 と 2) と比較して、正常組織中での BC040320 の発現は、肺、胸腺、リンパ節を例外としてほとんど視認できない。図 16 は C 13orf25 遺伝子のェクソン-イントロン構造。 A： BC040320 と AF339828の 2種類の ESTsは、 13q31.3で増幅を示す細胞株で過剰発現されるものであり、これを水平の点線上に示す。 BC040320 は 4 個のェクソンに分割され、これは 2 種類の BAC クローン、すなわち RP1 1-282D2 と RP1 1 - 121J7 を囲んでいる。 AF339828 は BC040320 のテロメァ側に位置しており、 BC040320力、ら約 300bp離れて 1 る。 RT-PCRに用いたプライマセットを、ェクソンの下に示す。 B： RT-PCRにより得られた 2種類の転写産物。一方（転写産物- A) は BC040320 シーケンスと同一であり、 965-bp のヌクレオチドを含む 4個のェクソンにより構成される。他方（転写産物- B) は 5058-bpのヌクレォチドを含む 2 個のェクソンにより構成される。コンピュータ分析により、 bA121J7.2 (Vega— gene ID) の 32-AAポリぺプチドが転写産物- Aの cDNA中にコードされていることが判った。 ORFs の可能性がある部分を、灰色のボックスで示す。転写産物- Bシーケンスより 5種類の前駆体 microRNAs (miRNAs)

( miR91-前駆体- 13 マイクロ RNA、 miR18-前駆体- 13 マイクロ RNA、 miR19a-前駆体- 13 マイクロ RNA、 miR19b-前駆体- 13 マイクロ RNA、 miR92-前駆体- 13 マイクロ RNA) が得られ、転写産物- B 中の黒いボックスにより示しているが、これには 7 種類の成熟した microRNA が含まれている

( microRNA miR- 17、 miR-9 1、 miR- 18、 miR- 19a、 miR-20 , miR- 19b、 miR-92) 。 C：ポリペプチドシーケンスを同様に構造の下に示している。 13- AA のポリペプチドは転写産物- A と転写産物- B により共有されており、これを下線により示している。発明を実施するための最良の形態第 1発明は、 CD5+DLBCL患者と CD5-DLBCL患者から染色体 DNAを単離し、この染色体 DNAの特定領域の増幅および欠損について以下のとおりに判定する方法である

(1) 第 13 染色体 q21.1-q31.3 ( 13q21. 1- 131.3 ) 領域の増幅がある CD5+DLBCL患者の予後は不良と判定する。

(2) 第 1 染色体 ρ36 21-ρ36.13 ( 1ρ36.21-ρ36.13 ) 領域の.欠失がある CD5+DLBCL患者の予後は不良と判定する。

(3) 第 5 染色体 p l5.33-p l4.2 ( 5 p l5.33-p l4.2) 領域の増幅がある CD5- DLBCL患者の予後は良好と判定する。この第 1発明の一態様は、染色体領域を含む複数の DNAプローブと患者からの染色体 DNA とのハイブリダィゼーシヨンにようて染色体領域の増幅または欠損を測定する方法であり、 DNA プローブとしては、公知の BAC/PAC DNA クローンを使用することができる。すなわち、表 2〜7 に示した各染色体に対する BAC/PAC DNAクロ一ンのうち、前記（1)~ (3)の各染色体領域とハイプリダイズするクローンを選択して用いることができる。また、液相系で行うもともできるが、固相系、特に BAC/PAC DNAクローンを固相単体上に固定した DNAァレィを用いて行うことができる。このような DNA アレイを用いた方法は、後記の実施例に示した「アレイ CGH」法に準じて DNA アレイを作成し、実施することができる。第 3 発明は、前記 3 つの染色体領域（ 13q21. 1- 131.3 領域、 1ρ36.21- p36. 13 領域、 5p l5.33-p l4.2 領域）に含まれる遺伝子発現の増減を指標として DLBCL患者の予後を判定する方法である。このような遺伝子は、表 2〜7 に示した各染色体領域の遺伝子を対象として行うことができる。またこの出願の発明は、このような遺伝子として、 13q21.1- 131.3 領域に含まれる遺伝子 C13orf24を提供する（具体的な構成等については後記実施例 2を参照）。第 3 発明の予後診断方法は、患者の生体試料における各遺伝子（例えば C 13orf24) の発現量を測定し、この遺伝子の発現量を指標として DLBCL 患者の予後を診断する方法である。すなわち、各染色体領域の遺伝子発現量が健常者の生体試料と比較して有意に多いかまたは少ない患者を、 DLBCL 予後不良患者またはそのハイリスク者と判定する。また遺伝子発現量が「有意に多い」とは、患者の遺伝子発現量が健常者生体試料において測定された同一遺伝子と比較して、 10%以上、好ましくは 30%以上、さらに好ましくは 70%以上、最も好ましくは 100 %以上である場合を意味する。またさらに、この「有意に多い」とは、例えば同一被験者の複数試料についての当該遺伝子発現量の平均値と、複数の健常者試料における同様の平均値とを統計的に検定した場合、前者が後者よりも有意に多い場合である。被験対象となる各遺伝子はそれぞれ公知の方法によって容易に取得することができる。例えば、 cDNAの場合には、公知の方法（Mol. Cell Biol. 2， 161- 170, 1982； J. Gene 25, 263-269, 1983； Gene, 150， 243-250, 1994) を用て cDNA ライブラリ一を合成し、それぞれ公知の塩基塩基配列に基づいて作製したプローブ DNAを用いて、それぞれの cDNAを単離する方法によって取得することができる。得られた cDNA は、例えば、 PCR ( Polymerase Chain Reactionノ法、 NASBN 、 Nucleic acia seauence based amplification) 法、 TMA ( Transcription-mediated amplification ) 法および SDA ( Strand Displacement Amplification) 法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。また、この発明によって提供されるプライマ一セットを用い、ヒト細胞から単離した mRNA を铸型とする RT-PCR 法によっても必要量の各 cDNAを得ることができる。以上のとおりの遺伝子発現量を指標とする予後診断方法は、公知の遺伝子工学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定の遺伝子の発現を検知測定するために知られた手法、例えば in situ ハイブリダィゼーシヨン、ノーザンブロッティング、ドットブロット、 RNase プロテクションアツセィ、 RT- PCR、 Real-Time PCR (Journal of Molecular Endocrinology, 25, 169- 193(2000) およびそこで引用されている文献）、 DNA アレイ解析法（Mark Shena 編、 "Micro array Biochip Technology", Eaton Publishing, 2000年 3月）などによって HRF ポリヌクレオチド発現量を検知 ·測定して実施することができる。こうした技術を利用した遺伝子発現測定系、 DLBCL 疾患の検出系、 DLBCL 疾患のリスク検出系、それに利用する試薬、方法、プロセス、解析プログラムなどは、すべてこの発明の技術およびそれに利用するシステムに含まれる。この出願は、前記の第 .3 発明の方法に使用する材料として、特に以下の発明を提供する。すなわち、オリゴヌクレオチドプローブは、被験対象の遺伝子とストリンジェント（stringent) な条件下でハイブリダィゼーシヨンすることを特徴とする。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、例えば被験対象遺伝子の精製ポリヌクレオチドまたはその cDNA を適当な制限酵素で切断することによつても得ることができる。あるいは、 Carruthers ( 1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:41 1-418; Adams ( 1983 ) J. Am. Chem. Soc. 105:661 ; Belousov ( 1997) Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel ( 1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers ( 1994) Biochemistry 33:7886- 7896; Narang ( 1979 ) Meth. Enzymol. 68:90; Brown ( 1979 ) Meth. Enzymol. 68: 109; Beaucage ( 1981 ) Tetra. Lett. 22: 1859; 米国特許第 4,458,066号に記載されているような周知の化学合成技術により、 in vitroにおいて合成することができる。またストリンジェントな条件とは、前記のポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、およびその他公知の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダィゼーション温度を上昇させるかによってストリンジエンシー（stringency) は増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、 NaCl 約 750 mM 以下およびクェン酸三ナトリウム約 75 mM以下、より好ましくは NaCl約 500 mM以下おょぴクェン酸三ナトリウム約 50 mM以下、最も好ましくは NaCl約 250 mM以下およびクェン酸三ナトリウム約 25 mM以下である。ストリンジェン卜な有機溶媒濃度は、ホルムァミド約 35%以上、最も好ましくは約 50%以上である。ストリンジエンドな温度条件は、約 30で以上、より好ましくは約 37で以上、最も好ましくは約 42で以上である。その他の条件としては、八ィプリダイゼ一シヨン時間、洗浄剤（例えば、 SDS) の濃度、およびキャリアー DNA の存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、. 様々なストリンジエンシーを設定することができる。 1つの好まし態様としては、 750 mM NaCL 75 mM クェン酸三ナトリウムおよび 1% SDSの条件で、 30での温度によりハイプリダイゼ一シヨンを行う。より好ましい態様としては、' 500 mM NaCL 50 mM クェン酸三ナトリウム、 1% SDS、 35%ホルムアミド、 100 g/ral の変性サケ精子 DNA の条件で、 37"Cの温度により八イブリダイゼ一シヨンを行う。最も好ましい態様としては、 250 mM NaCl、 25 mM クェン酸三ナトリウム、 1% SDS、 50%ホルムアミド、 200 g/mlの変性サケ精子 DNAの条件で、 42 の温度によりハイブリダィゼーシヨンを行う。また、ハイブリダィゼーシヨン後の洗浄の条件もストリンジェンシ一に影響する。この洗诤条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジエンシーは増加する。例えば、洗浄のためのストリンジェン卜な塩条件は、好ましくは NaCl約 30 mM以下おょぴクェン酸三ナトリウム約 3 mM以下、最も好ましくは NaCl約 15 mM以下およびクェン酸三ナトリウム約 1 .5 mM 以下である。洗浄のためのストリンジェントな温度条件は、約 25 以上、より好ましくは約 42 以上、最も好ましくは約 68で以上である。 1つの好ましい態様としては、 30 mM NaCl、 3 mM クェン酸三ナトリウムおよび 0. 1 % SDS の条件で、 25 の温度により洗浄を行う < より好ましい態様としては、 15 mM NaCl、 1.5 mMクェン酸三ナトリウムおよび 0. 1% SDS の条件で、 42での温度により洗浄を行う。最も好ましい態様としては、 15 mM NaCl、 1.5 mMクェン酸三ナトリウムおよび 0. 1 % SDSの条件で、の温度により洗浄を行うことである。またこのオリゴヌクレオチドプローブは当該技術分野で使用されている標識を付加することもできる。標識は、ラジオアイソトープ（RI) 法または非 RI法によって行うことができるが、非 RI 法を用いることが好ましい。非 RI 法としては、蛍光標識法、ピオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シァニン色素（例えば、 Cy Dye TMシリーズの Cy3、 Cy5等）、ローダミン 6G試薬、 N-ァセトキシ -N2- ァセチルァミノフルオレン（AAF) 、 AAIF (AAF のヨウ素誘導体）などを使用することができる。また標識法としては、当該分野で知られた方法（例えばランダムプライム法、ニック ' トランスレーション法、 PCRによる DNAの増幅、ラベリングティリング法、 in vitro transcription法等）を適宜選択して使用できる。例えば、 HRF オリゴヌクレオチドに官能基（例えば、第一級脂肪族アミノ基、 SH 基など）を導入し、こうした官能基に前記の標識を結合して標識化ォリゴヌクレオチドプローブを作成することができる。この発明の DNAアレイは、前記のオリゴヌクレオチドプローブまたは遺伝子 cDNA の全長または一部をターゲットキヤプチヤープローブとしている。 DNA ァレイの作製方法としては、固相担体表面で直接ォリゴヌクレオチドを合成する方法（オン，チップ法）と、予め調製したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレォチドを固相担体表面に固定する方法とが知られている。この発明の DNA ァレィは、このいずれの方法でも作製することができる。オン ·チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィ一技術およぴ固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（マスキング技術：例えば、 Fodor, S.P.A. Science 251 :767, 1991 ) 等によって行うことができる。一方、予め調製したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、官能基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、 Lamt re, J.B. et al. N cl. Acids Res. 22:2121-2125, 1994; Guo, Z. et al. Nucl. Acids Res. 22:5456-5465, 1994) 。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスぺーサーゃクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Yershov, G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4913, 1996) 。また、シリカマイクロアレィ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプアビジンを含むァガロ —スの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでピオチン化オリゴヌクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダィゼーシヨンを可能にする方法も知られている（Sosnowski, R.G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1 1 19- 1 123, 1997) 。また、プローブを固相基体表面に滴下させてスポッティングを行う場合には、ピン方式（例えば米国特許第 5,807,5223号）によって行うこともできるが、 JP200レ 116750A公報や JP 2001- 186881A 公報に開示されているィンクジエツト方式を採用することが、均一で一定形状のスポット形成のために好ましい。また、このインクジエツト方式では、個々のプローブスポットに含まれるプロ一プ数を等しくすることができるため、プローブ長の違いによるハイブリダィゼ一シヨンの違いを正確に測定することができる。さらに、 JP 2001- 186880A公報に開示されているような、スポッティング重ね打ちを行うこと、あるいは WO 03/038089 A1号パンフレットに開示された組成からなるプロ一プ溶液（保湿性物質を含む溶液）を使用することも、好ましいスポット形成のために推奨される。

スポッティングの後は、冷却、スポットに対する水分付加（湿度〜 80%程度に一定時間保持）、焼成乾燥による固定化処理等を行うことによって、各スポットを固相基体上に固定するし、マイクロアレイを完成することができる。なお、マイクロアレイの固相基体は、通常のマイクロアレイに使用されるガラス（スライドガラス）の他、プラスチック、シリコーン、セラミック等を使用することもできる。このマイクロアレイを使用して診断する場合には、例えば患者の細胞から単離した mRNA を铸型として、 cDNA を合成し、 PCR 増幅する。その際に、標識 dNTP を取り込ませて標識 cDNA とする。この標識 cDNA をマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキヤプチヤープローブ（オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）にハイブリダィズした cDNA を検出する。 Λイブリダィゼ一シヨンは、 96穴もしくは 384穴プラスチックプレートに分注して標識 cDNA水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、 l~ 100nl 程度とすることができる。ハイブリダィゼ一シヨンは、室温〜70 の温度範囲で、 6~20 時間の範囲で実施することが好ましい。八イブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識 cDNA を除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS) を用いることが好ましい。緩衝液としては、クェン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クェン酸緩衝液を用いることが好ましい。この発明のオリゴヌクレオチドプライマ一は、各遺伝子の公知の塩基塩基配列に基づき設計し、合成 ·精製の各工程を経て調製することができる。なお、ブライマ一設計の留意点として、例えば以下を挙げることができる。プライマ一のサィズ（塩基数）は、铸型 DNA との間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、 15-40 塩基、望ましくは 15-30 塩基である。ただし、 LA (long accurate) PCR を行う場合には、少なくとも 30 塩基が効果的である。センス鎖（5'末端側）とアンチセンス鎖（3，末端側）からなる 1組あるいは 1対（2 本）のプライマーが互いにァニールしないよう、両プライマ一間の相補的配列を避けると共に、プライマ一内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、铸型 DNA との安定な結合を確保するため GC 含量を約 50%にし、プライマー内において GC- richあるいは AT-richが偏在しないようにする。アニーリング温度は Tm (melting temperature) に依存するので、特異性の高い PCR産物を得るため、 Tm値が 55-65でで互いに近似したプライマーを選定する。また、 PCR におけるプライマー使用の最終濃度が約 0. 1〜約 l ii M になるよう調整する等を留意することも必要である。また、ブライマ一設計用の市販のソフトウェア、例えば OligoTM [National Bioscience Inc. (米国）製] 、 GENETYX [ソフトウェア開発（株）（日本）製] 等を用いることもできる。以上のとおりの材料を使用することによって、 CD5+DLBCL 患者の予後を、例えば以下のように判定することができる。一つの形態は、オリゴヌクレオチドプローブを用いて被験対象遺伝子（例えば C 13orf25) の発現量（mRNA量）を検出する方法（ノーザンプロット分析法）である。この診断方法は、少なくとも以下の工程：

(a) 患者の生体試料より RNAを調製する工程；

(b) 工程 (a)で調製された RNAを電気泳動分離する工程；

(c) 工程 (b)で分離された RNAをオリゴヌクレオチドプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする工程；

(d) 工程（e)で RNAにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの標識量を遺伝子発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および (e) 正常生体試料と比較して有意に高いかまたは低い遺伝子発現量を、 DLBCL 患者の予後の程度を示す指標として使用する工程、

を含むことを特徴とする。また別の形態は、 DNAアレイを使用する方法である。この方法は、少なくとも以下の工程：

(a) 患者の生体試料より RNAを調製する工程；

(b) 工程（a)で調製した RNAから、標識 cDNAを調製する工程、

(c) 工程 (b)で調製した標識 cDNAを DNAァレイに接触させる工程；

(d) 工程（c)で DNAアレイのキヤプチヤープローブに八イブリダイズした標識 cDNAの標識量を遺伝子発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程'；および

(e) 正常生体試料と比較して有意に高いかまたは低い遺伝子発現量を、 DLBCL 患者予後の程度を示す指標として使用する工程、

を含むことを特徴とする。さらに別の形態は、プライマーセットを用いて、遺伝子 mRNAの発現量を測定する方法（RT-PCT法）である。この方法は、少なくとも以下の工程： (a) 患者の生体試料より RNAを調製する工程；

(b) 工程 (a)で調製した RNAを铸型とし、プライマーセットを用いて cDNAを合成する工程；

(c) 工程 (b)で合成された cDNA量を遺伝子発現量の指標とし、正常生体試料の結果と比較する工程；および

(d) 正常生体試料と比較して有意に高いかまたは低い遺伝子発現量を、 DLBCL 患者の予後の程度を示す指標として使用する工程、

を含むことを特徴とする。またさらに、第 3 発明の診断方法は、前記のノーザンプロット法、 DNA ァレィ法、 RT-PCR法を適宜に組み合わせて行うこともできる。なお、以上の各診断方法においては、標識の観察や標識量の測定には、標識の種類に応じて当該分野で知られた方法を適宜選択して使用でき、例えば暗視野顕微鏡、位相差顕微鏡、反射コントラスト顕微鏡、'螢光顕微鏡、デジタルイメージング顕微鏡、電子顕微鏡などによる方法も使用することができる。第 3 発明の別の態様は、各被験遺伝子の転写産物として、タンパク質を対象とする方法である。タンパク質量を指標とする予後診断方法は、公知の遺伝子ェ学および分子生物学的技術に従い、当該分野で特定のタンパク質量を検知測定するために知られた手法、例えば in situ Λイブリダィゼーシヨン、ウエスタンプロッティング、各種の免疫組織学的方法などによって被験夕ンパク質量を検知 '測定して実施することができる。こうした技術を利用したタンパク質量測定系、 DLBCL の予後検出系、 DLBCL のリスク検出系、それに利用する試薬、方法、プロセス、解析プログラムなどは、すべてこの発明の技術およびそれに利用するシステムに含まれる。この第 3発明における予後診断は、一つの好ましい形態として、被！ ^タンパク質に特異的に結合する抗体を使用する。なおここで言う「抗体」とは、広義の意味で使用されるものであってよく、所望のポリペプチドおよび関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種ェピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また 1価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型 (intact)分子並びにそれらのフラグメントおよび誘導体も表すものであり、 F(ab')₂、 Fab'および Fabといったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原またはェピト一プ（epitope) 結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、または、例えば、クヮドローム（quadrome) 、トリオーム（triome) などの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディォタイプ抗体、さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合または八イブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用したり、 DNA組換え技術を用いて調製される抗体、本明細書で記載し且つ定義する標的抗原物質あるいは標的ェピトープに閧して中和特性を有したりする抗体または結合特性を有する抗体を包含していてよい。特に好ましい抗体は、天然型のタンパク質（ポリペプチド）を特異的に識別できるものである。すなわち、抗体は被験タンパク質の部分べプチドを抗原として調製された抗体であり、好ましくは、一つのタンパク質の異なる部位を認識する抗体のセットして使用される。このような抗体作成のためのペプチドは、例えば、 C13orf24遺伝子産物を対象タンパク質とする場合には、 SEQ ID NO:4および 5のアミノ酸配列からなるペプチドであり、ペプチド合成機を使用して、例えば Fmoc-bop 法で合成する。 HRFペプチドの N末端にはシスティンを導入してもよい。合成したペプチドは Boiidasphere、 C18カラム（Waters) などを用いた高速液体クロマトグラフィ一などにより精製して免疫抗原として使用する。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、タンパク質やその一部断片（オリゴペプチド）を免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、タンパク質ポリヌクレオチドの組換えべクタ一を注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによつて作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ゥサギ, ャギ、ヒッジ、ゥシ、ゥマ、ブ夕、ィヌ、ネコ、サル、ニヮトリなどが用いられる。さらには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい場合もある。感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われ、例えば村松繁、他編、実験生物学講座 14 、免疫生物学、丸善株式会社、昭和 60年、日本生化学会編、続生化学実験講座 5、免疫生化学研究法、東京化学同人、 1986 年、日本生化学会編、新生化学実験講座 12 、分子免疫学 III、抗原 ·抗体，補体、東京化学同人、 1992年などに記載の方法に準じて行うことができる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物などの腹腔内または皮下に注射することにより行われる。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。免疫化剤を（必要に応じアジバントと共に）一回又はそれ以上の回数哺乳動物に注射することにより免疫化される。代表的には、該免疫化剤および Zまたはアジパントを哺乳動物に複数回皮下注射あるいは腹腔内注射することによりなされる。免疫化剤は、上記抗原ペプチドあるいはその関連ペプチド断片を含むものが挙げられる。免疫化剤は、免疫処理される哺乳動物において免疫原性であることの知られているタンパク質（例えば上記担体タンパク質類など）とコンジュゲートを形成させて使用してもよい。アジュバントとしては、例えばフロイン卜完全アジュバント、リビ (Ribi)アジュパント、百日咳ワクチン、 BCG 、リピッド八、リボソーム、水酸化アルミニウム、シリカなどが挙げられる。ポリクロ一ナル抗体を含む抗血清は、免疫された動物を所定の期間飼育した後、当該動物から採血した血液から調製することができる。得られた抗血清は、 HRFを認織するものであることを確認した後、本発明所定の活性成分として供される。この発明の抗体としては、哺乳動物由来のモノクローナル抗体として得られたものを使用することもできる。抗原物質に対して作製されるモノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる任意の方法を用いて産生される。修飾語「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団から得られているというその抗体の性格を示すものであって、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要があるとみなしてはならない。個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なった抗原決定基（ェピトープ）に対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常の（ポリクローナル）抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクロ一ナル抗体は、八イブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリン類の夾雑がないあるいは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイプリッド抗体及びリコンビナン卜抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来や免疫グロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり、あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、あるいはへテロジーニアスなタンパク質と融合せしめたりして得ることができる（例えば、米国特許第 4816567 号； Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987 など）。また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クロ一ン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、 1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996) ίこ従レ ^ 作製することができる。この発明の抗体は必要に応じてそれをより精製された形態のものとして使用される。抗体を精製 ·単離する手法としては、従来公知の方法、例えば硫酸アンモニゥム沈殿法などの塩析、セフアデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換ク口マトグラフィ一法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、ァフィ二ティ ' クロマトグラフィ一法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製して用いることができる。好ましくは、抗血清、モノクローナル抗体を含有する腹水などは、硫安分画した後、 DEAE—セファロ一スの如き、陰イオン交換ゲル及ぴプロテイン A カラムの如きァフィ二ティ ·カラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好ましくは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識する部位など）を固定化したァフィ二ティ · クロマトグラフィー、プロティン Aを固定化したァフィ二ティ · クロマトグラフィー、ヒドロキシァパタイト · クロマトグラフィーなどが挙げられる。これら抗体をトリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られる Fab、 Fab'、 F(ab')₂といった抗体フラグメントにして使用してもよい。抗体は、既知の任意の検定法、例えば競合的結合検定、直接及び間接サンドイッチ検定、及び免疫沈降検定に使用することができる（Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147- 158 (CRC Press, Inc. , 1987) 。抗体を検出可能な原子団にそれぞれコンジュゲートするには、当分野で知られる任意の方法を使用することができ、例えば、 David et al.， Biochemistry, 13 卷， 1014- 1021 頁 ( 1974); Pain et al, J. Immunol. Meth. , 40: pp.219-231 ( 1981) ;及び "Methods in Enzymology", Vol. 184, pp. 138- 163 (1990) により記載の方法が挙げられる。標識物を付与する抗体としては、 I_gG 画分、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部 Fab'を用いることができる。抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、この発明ではそれらから適宜選んで用いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに使用されるものが種々知られており、この発明においても勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。特に好適に使用されるものとしては、例えばガラス, 例えばアミノアルキルシリルガラスなどの活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ一アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニル, ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネート、ポリメタクリレート、ポリスチレン、スチレン一ブタジエン共重合体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、スチレンーメタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、ァクロレイン一エチレングリコールジメタクリレー卜共重合体など、架橋化アルブミン、コラ一ゲン、ゼラチン、デキストラン、ァガロース、架橋ァガロース、セルロース、微結晶セルロース、カルボ午シメチルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたもの、シリコンガムなど、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられる。担体としては、粒子、微粒子、マイクロパーティクル、メンブレン、ろ紙、ビ —ズ、チューブ、キュベット、試験容器の内壁、例えば試験管、タイタ一プレート、タイターゥエル、マイクロプレート、ガラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの固体物質（物体）の表面などが挙げられる。これら担体と抗体との結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりする化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出来る。この発明の抗体には、それぞれ標識物質によって標識化された抗体も含まれる _c 標識としては、酵素、酵素基質、酵素阻害物質、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コロイドなど、非金属元素粒子、例えばセレンコロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。好ましい標識物質は、酵素、放射性同位体または蛍光色素をふくむ化学物質を使用することができる。酵素は、 turnover numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特の制限はなく、通常の EIA に用いられる酵素を使用できる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ基、力ルポキシル基、メチル基、ァシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利用することもできる。酵素標識などは、ピオチン標識体と酵素標識ァビジン (ストレプトアビジン) に置き換えることも可能である。このように、ピオチン—アビジン系を使用したり、抗 HRF抗体に対する抗体などの二次的な抗体を使用するなど、当該分野で公知の感度増強法を適宜採用することができる。標識は、複.数の異なった種類の標識を使用することもできる。こうした場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすることもできる。代表的な酵素標識としては、西洋ヮサビペルォキシダーゼなどのペルォキシダーゼ、大腸菌 3 -D- ガラクトシダーゼなどのガラクトシダ一ゼ、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース- 6-リン酸化脱水素酵素、グルコースォキシダ一ゼ、ダルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、力タラ一ゼ、ゥシ小腸アルカリホスファタ一ゼ、大腸菌アル力リホスファターゼなどのアル力リフォスファタ一ゼなどが挙げられる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができ、 4-メチルゥンベリフェリルフォスフエ一トなどのゥンベリフエロン誘導体、ニトロフエニルホスフェートなどのリン酸化フエノール誘導体などが挙げられ、例えば酵素としてペルォキシダーゼを使用する場合には、 3，3', 5, 5'—テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファタ一ゼを用いる場合には、パラニトロフエノール等を用いることができる。本発明においては、信号の形成に 4-ヒドロキシフエニル酢酸、 0-フエ二レンジァミン（OPD)、テトラメチルペンジジン（TMB)、 5-ァミノサリチル酸、 3,3-ジァミノべンジジンテトラヒドロクロライド（DAB)、 3-ァミノ- 9- ェチルカルバゾ一ル (AEC)、チラミン、ルミノール、ルシゲニンルシフェリン及ぴその誘導体、 Pholad luciferinなどと西洋ヮサビ .ペルォキシダーゼなどのペルォキシダーゼ、ルミジェン PPD、（4-メチル）ゥンベリフェリル- リン酸、 P-ニトロフエノール- リン酸、フエノール-リン酸、プロモクロロインドリルリン酸 (BCIP)、

AMPAKTM(DAKO)、 AnipliQ™(DAKO)などとアルカリフォスファターゼ、 4 -メチルゥンべリフェリル- β -D-ガラクトシドといったゥンベリフェリルガラクトシド、 0-ニトロフエノール- /3 -D-ガラクトシドといったニトロフエ二ルガラクトシドなどと /3 -D-ガラクトシダーゼ、グルコース- 6-リン酸 ·デヒドロゲナーゼ、

ABTSなどとグルコースォキシダ一ゼなどの酵素試薬の組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾキノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノ一ル化合物、リポ酸、ダル夕チオンなどのチオール化合物、フエノール誘導体、フエロセン誘導体などを酵素などの働きで形成しうるものが使用できる。放射性同位体としては、 ³²P、 ¹²⁵I、 ¹⁴C、 ³⁵S、 ³H等の通常の RIAで用いられているものを使用することができる。蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合物としては、フルォレセィンィソチオシァネ一ト（FITC)、例えばローダミン B イソチオシァネート、テトラメチルローダミンイソチオシァネート（RITC)、テトラメチル口一ダミンィソチオシァネートアイソマ一 R(TRITC)などの口一ダミン誘導体、 7-ァミノ- 4-クマリン- 3-酢酸、ダンシルク口リド、ダンシルフルオリド、フルォレスカミン、フィコピリプロテイン、ァクリジニゥム塩、ルミフェリン、ルシフェラーゼ、ェクオリンなどのルミノール、イミダゾール、シユウ酸ェステル、希土類キレート化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。蛍光色素としては、通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。発色、螢光などを含めた生成する信号などを検知するには、視覚によることもできるが、公知の装置を使用することもでき、例えば螢光光度計、プレートリーダーなども使用できる。また、放射性同位体（アイソトープ）などの出す信号を検知するには、公知の装置を使用することもでき、例えばガンマ一カウンター、シンチレ一ションなども使用することができる。抗体を標識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、ァミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うことができ、公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適用できる。免疫原性複合体作製に使用されることのできる縮合剤、担体との結合に使用されることのできる縮合剤などを用いることができる。縮合剤としては、例えばホルムアルデヒド、ダルタルアルデヒド、へキサメチレンジイソシァネート、へキサメチレンジイソチォシァネ一卜、 Ν,Ν'-ポリメチレンビスョードアセトアミド、 Ν，Ν'-エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシ二ミジルスクシネート、ビスジァゾベンジジン、 1-ェチル -3-(3-ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド、スクシンィミジル 3- (2-ピリジルジチォ）プロビオネ一ト（SPDP)、 N-スクシンィミジル 4- (N-マレイミドメチル）シクロへキサン- 1- カルポキシレート（SMCC)、 N-スルホスクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル）シクロへキサン- 1-カルボキシレ一ト、 N-スクシンィミジル (4-ョードアセチル）アミノベンゾエート、 N-スクシンィミジル 4- (1-マレイミドフエニル）ブチレ一ト、 Ν-( ε -マレイミドカプロィルォキシ）コハク酸イミド（EMCS)、イミノチオラン、 S-ァセチルメル力プトコハク酸無水物、メチル -3-(4'-ジチォピリジル）プロピオンイミデート、メチル -4-メルカプトブチリルイミデート、メチル -3-メルカプトプロピオンイミデート、 N-スクシンィミジル -S-ァセチルメルカプトァセテ一トなどが挙げられる。このような抗体を用いた診断方法における一つの態様は、抗体と被験タンパク質との結合を液相系において検出する方法である。例えば、抗体を標識化した標識化抗体と生体試料とを接触させて標識化抗体とタンパク質を結合させ、この結合体を分離する。分離は、タンパク質 +標識化抗体の結合体を公知の分離手段（クロマト法、固相法等）によって分離する方法等によって行うことができる。また公知のウエスタンブロット法に準じた方法を採用することもできる。標識シグナルの測定は、標識として酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレ一シヨンカウンタ一等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。液相系での診断の別の方法は、抗体（一次抗体）と生体試料とを接触させて一次抗体と被験タンパク質を結合させ、この結合体に標識化した二次抗体を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体 +抗原ペプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をピオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、 Fc領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクロ一ナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は前記と同様とすることができる。抗体を用いた別の診断法は、抗体とタンパク質との結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量の被験タンパク質の検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、抗体を埤脂プレートまたはメンプレン等に固定化し、この固定化抗体に被験タンパク質を結合させ、非結合タンパク質を洗浄除去した後、プレート上に残った抗体 +夕ンパク.質結合体に標識化した二次抗体を結合させて、この標識化抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、「ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) J として広く用いられている方法である。 2週類の抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、いずれか一方をポリクロ一ナル抗体とすることもできる。この発明での予後診断はまた、免疫染色、例えば組織あるいは細胞染色、免疫電子顕微鏡、ィムノアツセィ、例えば競合型ィムノアッセィまたは非競合型ィムノアッセィで行うことができ、放射免疫測定法 (RIA)、蛍光免疫測定法 (FIA)、ルミネッセント免疫測定法 (LIA)、酵素免疫測定法 (EIA)、 ELISAなどを用いることができ、 B-F分離を行ってもよいし、あるいは行わないでその測定を行うことができる。好ましくは RIA、 EIA、 FIA、 UAであり、さらにサンドイッチ型アツセィが挙げられる。サンドイッチ型アツセィには、同時サンドイッチ型アツセィ、フォワード（forward)サンドイツチ型アツセィあるいは逆サンドイツチ型アツセィなどが包含されてよい。この出願の発明におけるタンパク質量の測定系としては、例えば組織に対しては免疫染色、免疫電子顕微鏡などの蛋白測定系、組織抽出物、血液、体液等に対しては EIA、 RIA、 FIA、 .LIA、ウエスタンブロッテイングなどの蛋白測定系を実施することもできる。

EIAの測定系において、例えば競合法では、抗体を固相化抗体として使用し、標識抗原および非標識抗原（抗原としては、被験タンパク質あるいはそのフラグメントペプチドなどが挙げられる）を使用し、また非競合法で、例えばサンドィツチ法では、固相化抗体や標識抗体を利用できる他、抗体を直接標識したり、固相化せずに、抗体に対する抗体を標識したり、固相化して行うこともできる。感度増幅法としては、例えば、非酵素標識一次抗体との組み合わせでは、高分子ポリマーと酵素と一次抗体を利用するもの（Envision試薬を応用したもの； Enhanced polymer one-step staining (EPOS))が挙げられ、非酵素標識二次抗体との組合せでは、例えば PAP(peroxidase-antiperoxidase)法などの酵素と抗酵素抗体複合体の組合せ、 SABC(avidin-biotinylated peroxidase complex)法などのピオチン標識二次抗体とピオチン標識酵素—ァビジン複合体の組合せ、 ABC(streptavidin-biotin complex"法、 LSAB(labeled streptavidin-biotin) ί¾ などのビォチン標識二次抗体とピオチン標識酵素一ストレブ卜アビジン複合体の組合せ、 CSA(catalyzed signal amplification)法などの SABCとビォチン標識夕イラマイドと酵素標識ス卜レプトアビジンの組合せ、高分子ポリマーで二次抗体と酵素を標識してあるものなどが挙げられる。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江寛編，「ラジオィムノアツセィ」，講談社，昭和 49 年発行；入江寛編，「続ラ.ジオイムノアツセィ」，講談社，昭和 54年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」，医学書院，昭和 53年発行；石川栄治ら編，

「酵素免疫測定法」（第 2版），医学書院，昭和 57年発行；石川栄治ら編，「酵素免疫測定法」（第 3版），医学書院，昭和 62年発行； H. V. Vtmakis et al. (ed.), "Methods in Enzymology" _? Vol. 70 (Immunochemical Techniques, Part A)， Academic Press, New York (1980); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology" , Vol. 73 (Immunochemical Techniques, Part B)， Academic Press, New York (1981); J. J. Langone et al. (ed.) ₃ "Methods in Enzymology", Vol. 74 (Immunochemical Techniques, Part C)， Academic Press, New York (1981); J. J. Langone et al. (ed.) _? "Methods in

Enzymology", Vol. 84 (Immunochemical Techniques, Part D: Selected Immunoassays), Academic Press, New York ( 1982); J, J. Langone et al. (ed,), "Methods in Enzymology", Vol. 92 (Immunochemical Techniques, Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods), Academic Press, New York (1983); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods i Enzymology" , Vol. 121 (Immunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) , Academic Press, New York

(1986); J. J. Langone et al. (ed.)， "Methods in Enzymology" , Vol. 178 (Antibodies, Antigens, and Molecular Mimicry) , Academic Press, New York (1989); M. Wilchek et al. (ed.)， "Methods in Enzymology", Vol. 184 (Avidin-Biotin Technology) , Academic Press, New York ( 1990); J. J.

Langone et al. (ed.)_? "Methods in Enzymology" _? Vol. 203 (Molecular

Design and Modeling: Concepts and Applications， Part B; Anibodies and Antigens, Nucleic Acids, Polysaccharides, and Drugs), Academic Press, New York (1991)等の記載、あるいはそこで引用された文献中にある記載〕。なお、この出願によって提供される予後診断方法は、タンパク質量を測定する方法と、遺伝子の発現量を測定する方法（例えばノーザンプロッティング法、 RT-PCR法、 DNAアレイ法等) とを適宜に組み合わせて行うこともできる。以下、実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが. の発明は以下の例によって限定されるものではない。

実施例 1

CD5+ならびに CD5-の DLBCL症例におけるゲノム異常を DNA アレイ CGH によって分析した。 1. 材料と方法

1- 1. 患者

26例の de novo CD5⁺ DLBCL症例ならびに 44例の CD5- DLBCLの DNA 試料を分析した。これらの試料は愛知がんセンターならびに協力施設において、施設の審査会による承認を得て、患者よりインフォームドコンセントを得た状態で入手した。全ての患者は既発表論文で報告されている（Yamaguchi, M. et al. Blood, 99: 815-821 , 2002； Harada, S. et al. Leukemia, 13: 1441- 1447, 1999； Karnan, S. et al. Genes Chromosomes Cancer, 39: 77-81 , 2004) 。 ■ CD5+ならびに CD5-症例の年齢中央値は、それぞれ 61 歳と 56 歳であった。

CD5+症例のうち 68%が女性であり、 80%が進行期にあり（ III- IV) 、 72%に LDH 上昇が見られ、 24%が一般状態不良、 28%がリンパ節外部位の併発を有していた。 CD5-症例の患者では 41%が女性、 52%が進行期にあり（III-IV) 、 45%に LDH上昇が見られ、 10%が一般状態不良、 38%がリンパ節外部位の併発を有していた。全試料とも、治療開始以前の診断時に取得した。

1-2. DNA試料

DNA抽出は、合計 70例の DLBCL症例、すなわち 26例の CD5+ DLBCL症例ならびに 44例の CD5- DLBCL症例より得たリンパ腫標本を元に、標準的なフエノール ·クロ口ホルム法を用いて実施した。正常 DNA の調製は健常な男性ドナーの末梢血リンパ球を元に行った。 1-3. 悪性リンパ細胞株

この実験で用いた細胞株は、 Karpas 1718 (有毛リンパ球を有する脾臓リンパ腫： SLVL、 Dr. A. Karpass, Cambridge University, UKより提供）、 O.CI- LY13.2 ( DLBCL、 Dr. R. Dalla-Favera, Columbia Universit より提供） (Tweeddale, M. E. et al. Blood, 69: 1307- 1314, 1987) 、 REC 1 (マン卜ル細胞リンパ腫細胞株、 Dr. M. Dyer, Leicester University, U より提供）

(Martinez-Climent, J. A. et al. Blood, 98: 3479-3482, 2001) であった。細胞株は 37 °C、 5% C0₂-95%空気中にて、 10%胎児ゥシ血清を添加した RPMI 1640培地において維持した。

1-4. コピー数の線形性評価

複製数変化に伴うアレイ CGH シグナルの線形性を試すために、以下の細胞株のうち一つに対して、正常男性 DNA のアレイハイブリダィゼーションを実施した。 GM04626 ； 47XXX、 GM01415D ； 48XXXX、 GM05009C ； 49XXXXX (Kallioniemi, A. et al. Science (Wash. DC) , 258: 818-821 , 1992； Pinkel, D. et al. Nat. Genet., 23: 41-46, 1998) 。これらの細胞株は NIGMS Human Genetics Cell Repository Coriell Institute ior Medical Researchより入手し、 37^ , 5% C0₂-95%空気中にて、 2x 必須アミノ酸類、ビタミン類、ならびに 20%胎児ゥシ血清を添加した MEM Eagle-Earle培地において維持した。

1-5. アレイ CGHのための BAC/PACクローンの選別

アレイは 2,088 種類の BAC/PAC クローンにより構成されており、概して 1.5-Mb の解像度で全ヒトゲノムをカバ一している。 BAC クローン（BACs) は RP11ならびに RP13ライブラリより得ており、 PACクローン（PACs) は RP1、 RP3、 RP4、 RP5 ライブラリより得ている。使用する BAC/PAC クローンの選別は、 NIBC (http:/ /www.ncbi.nlm.ni .gov/ ) ならびに Ensembl Genome Data Resouces (http://www.ensembl.org/) より得た情報を元に実施した。これらのクローンの取得元は、 Children's Hospital ( Oakland Research Institute, Oakland, CA; Http:/ /bacpac. chori.org/ ) にある BACPAC Resource Centerであった。クローンのシーケンス分析は 1番〜 22番染色体ならびに X 染色体を元に行った。それぞれの染色体内部でのクローンのシーケンス分析は、 Ensembl Genome Data Resources of Sanger Center Instituteの 2004 年 1 月版を元に実施した。アレイ CGH に使用する全てのクロ一ンは、 FISH分析により染色体上の位置を確認した。

1-6. スライド上スポッティングのための DNA増幅

10ngの BAC (または PAC) DNAをテンプレートに、変性オリゴヌクレオチドをプライマーに用いた PCR (DOP-PCR) (Hakan, T. et al. Genomics, 13: 718-725, 1992) を 5'-ァミン修正 DOPプライマ：

5'-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3'： SEQ ID NO: l) を用いて行い、 TaKaRa PCR Thermal Cycler MP ( TaKaRa、 Tokyo、 Japan) により Ex Taqポリメラ一ゼ（TaKaRa) を用いて増幅した。 3 分間の 94で変性段階に続き、 94°Cで 30秒間、 37-72 の直線傾斜で 10分間、 72 で 1分間の過程を 25回繰り返し、最後に 72でで 7分間の伸長を行った。

1-7. DNAスポッティングとガラススライドの品質管理

DOP-PCR 産物をエタノール沈殿させ、蒸留水中に溶解し、次に等量の DNA スポッティング液 DSP0050 (Matsunami、 Osaka、 Japan) を添加した（〜1 /i gの DNA/ l) - その結果得られた DNA試料をインクジェット方式（NGK：、 Nagoya、 Japan ) による自動装置で、 CodeLink™ 活性ィ匕スライド

(Amersham Biosciences, Piscataway、 NJ) 上に二 Ik反復的にスホットした。試験には、 2,088 種類のクローンが完全かつ均一に二重反復的スポットされていることが確認されたガラススライドのみを使用した。

1-8. アレイハイブリダィゼーシヨン

アレイ製造ならぴにハイブリダィゼ一シヨンは、 Pinkel et al ( Nature (Lond.) , 20: 207-21 1， 1998) ならびに Hodggson et al. (Nat Genet., 29: 459-464, 2001 ) の方法に従って実施した。詳細なプロトコルはカリフォルニァ大学（San Francisco , CA) の Joe Gray 博士から提供頂いた。試験対象 (腫瘍）ならびに対照（正常） DNA の 1 i g を Dpnll で消化し、それぞれ cyanine3-dUTPならびに cyanine5-dUTP (Amersham Pharmacia Biotech^ Piscataway NJ) を用いた Bio prime DNA 標識システム（Invitrogen Life Technologies, Inc. , Tokyo ^ Japan) により標識した。未取り込み蛍光ヌクレォチドは Sephadex G- 50 スピンカラム (Amersham Biosciences) を用いて除去した。試験対象 DNA ならびに対照 DNA は、 50 g のヒト Cot- 1 DNA (Invitrogen Life Technologiies) と混合し、沈殿させ、 45 lのハイブリダィゼーシヨン混合液中で再懸濁したが、この混合液の成分は 50%ホルムアミド、 10%硫酸デキストラン、 2x SSC、 4% SOS. 10 g/ 1酵母 tRNA (Invitrogen Life Technologies) であった。ハイブリダイゼ一ション溶液は 73でまで加熱して 5分間置くことで DNA変性を行い、続いて 37 :で 45分間ィンキュベ一トすることで反復シーケンスをプロックした。 DNA をスポッ卜したガラススライドは、 70%ホルムアミド /2x SSC中で 73 で 4分間にわたり変性し、続いて冷却した 70%、 85%、 100%エタノール中でそれぞれ 5 分間脱水し、風乾した。ハイブリダィゼ一シヨンは 200 1 の 50%ホルムアミド / 2x SSC を用いて、緩やかに振動するテーブル上の容器中で 66時間にわたり実施し、続いてハイブリダィゼーシヨン後洗浄を、 50%ホルムアミド / 2x SSC中で 50 にて 15分間、 2x SSC/ 0. 1% SDS中で 50 にて 30分間、そして PN緩衝液（0. 1 M NaH₂P0₄、 pH 8を得るための 0. 1 M Na₂HP0₄、 0. 1% NP-40) 中で室温にて 15分間にわたり実施した。次にガラススライドを室温にて 2x SSC中に浸し、さいごに室温にてそれぞれ 2 分ずつ 70%、 85%、 100%エタノール中で脱水し、風乾した。スラドのスキヤニンク ¾；、 Agilent Micro Array Scanner ( Agilent Technologies, Palo Alto, CA) を用いて実施し、得られたアレイ像の分析を、 Genepix Pro 4. 1 (Axon Instruments, Inc. , Foster City, CA) を用いて行つた。 DNA スポットを自動的にセグメント化し、局所バックグラウンドを減算し，シグナル強度を得た。次に 2 種類の色素のシグナル強度比（Cy3 強度/ Cy5 強度）を各スポッ卜毎に計算し、染色体位置の順に Excel シート上で log₂比に変換してから正規化した。 1 -9. データセットの正規化各試料の「log₂比」に対する正規化は、全てのクローンについて、 log₂比率の中間値を計算することにより実施した。この「log₂比」は、各クローンについて二重化されたスポットの平均 log₂ 比を示す。続いて、 log₂ 比が「中央値 +SDxA」以上であるか、「中央値- SDxA」未満であるクローンを選別した。「A」は各実験における全クローンの log₂比プロットを参照することにより、正常領域として視覚的に決定した。「A」の範囲はほぼ 0.5から 1.0であった。次に選択したクローンの平均 lo_g2比率を計算し、これを「X」として定義した。最終的に、各クローンの log₂比から対応する「X」値を減算して「Y」値を得た。この試験ではそれぞれの. log₂比の分析を「Y」値をもとに行った。クロ一ンを視覚的に選択し、各実験毎に SD を計算し、 SDが 0.15 を超えないことを確認した。

1- 10. FISH分析

正常な男性リンパ球と細胞株から、分裂中期の染色体を調製した。ニックトランスレ一シヨンキット（Vysis Inc.、 Downers' Grove、 IL) により Spectrum Green-dUTP または Spectrum Red-dUTP (Vysis) を用いて、約 200ng の BAC/PACsを標識した。標識化 DNAとのヒト Cot- 1 DNAをエタノ一ル中で共沈殿させ、の蒸留水と 7 ίί 1のハイプリダイゼーシヨン緩衝液（50% ホルムアミド、 20%デキストラン硫酸、 2x SSC) に溶解した。細胞株の分裂間期染色体スライドの調製は、標準法に従って行った。ハイブリダィゼ一シヨンは、 70%ホルムアミド /2x SSC 中 73" で変性させたスライド上において、 37 で 12-24 時間にわたり実施した。次にこのスライドを、 0.4x SSC/0.3% NP-40 中 75 で、また 2x SSC/0.1% NP-40中室温で洗浄した。スライドの乾燥後、 DAPI (4,6-diamino-2-phenylindole) -II (Vysis) を用いて染色体を逆染色した。染色体の同定は、 DAPI-染色の縞模様を元に行った。デジタルイメージ分析は BX-60-RF 顕微鏡（ Olympus ) ならびに IP Lab Scientific Imaging Software ( Scanaly tics Inc.、 Fairfax, VA) を用いて実施した。

1- 1 1. 統計分析

ゲノム領域を分析して 2 種類の患者グループ間における統計的差違を求めるため、次のようにデ一夕セットを構築した。ゲノム変化は、コピー数増加について +0.2、コピー数減少について- 0.2 の log₂比の閾値により定義した。各症例について、増加したクローン（log₂ 比>+0.2 ) は「1」、増加のないクロ一ン (log₂比<0.2) は「0」としてェクセルテンプレートに入力した。同様に減少したクローンは「1」、減少のないクローンは「0」として各症例ごとに別のェクセルテンプレートに入力した。遺伝子増加または減少を示す症例は、 CD5+ダループまたは CD5-グループの各単一クローン毎に Excelを用いて計数した（合計 1 ,966 クローン）。その後以下の目的のためにデータ分析を行った。 1) CD5+ と CD5-グループ間における、各単一クローンの増加または減少頻度の比較（増加 ·減少それぞれ 1 ,966 回試験、合計 3,932 回試験）。 2) 単一クローンの増加または減少を示す症例と、それぞれの増加または減少を示さない症例の間における、総生存の比較（CD5発現の有無状態につき増加と減少それぞれ 1，966 回試験、最大合計 7，864 回試験）。前者の分析にはフィッシャーの直接確率検定を適用し、後者の分析には 2 群の間の生存曲線を比較するログランク検定を適用した。各分析毎に候補クローンをスクリーニングするための P値は P<0.05であった。候補クローンが同定された場合には、以下のクローンを有するクローン集団を評価した。 n 番目のクローンとそれに続く k個のクローン（K≥0) が候補クローンであることが判明した場合には、連続した関連を求めるための ρ 値は次式 (1)にて計算される： n+k

--ri この時、各クローンはゲノム全体にわたり独立していると仮定する。ここでは複数回の試験を適用したため（最大 11，796回試験）、従来のボンフェロー二法を適用してアルファエラーを定義し、最終結論を求めた。従ってここでは、 ρ値が 0.05/ 12,000 ( =4.2 X 10-6 ) 未満である場合を統計的有意であると定義した (Wright, SP. Biometrics, 48: 1005- 1013, 1992) 。統計分析の実施は、全て統計パッケ一ジ STATA ver.8 ( College Station, TX) を用いて行った。

2. $π

2- 1. CGHアレイの品質

CGH アレイを評価するだめ、ここでは最初に正常な男性 DNA 同士のハイブリダィゼ—シヨンを 6例の異なる場合について実施した。クローンあたり SEの平均は、 6例の正常試料中の平均クローン変動性を示しており、この对照群では 3%になった。スポットされた 42 例のクローンは、全クローンの平均蛍光強度の 10%未満を示すことが判明した。 62例のクローンは、参照比率の偏差が 1.0 からとなる最も極端な平均試験になり、 18 例のクローンはこの正常対照群において最大 SD を有していた。そのため 122 例のクローンを以後の分析から外した。各スポット（二重化した 1，966クローン）の蛍光の log₂比は +0.2から- 0.2 の範囲内であった。そのため log₂比率がこの範囲を超える場合に有意と考えた。コピー数と log₂比率の間の線形性は、 X 染色体のコピー数が異なるヒト繊維芽細胞株を用いて確認した（実施例 2 参照）。次に複数の悪性リンパ腫細胞株に対してアレイ CGHを実施し、この系が増加と減少を検出出来るかどうか確認した。図 1A には REC 1 細胞株の全ゲノムプロファイルを示すが、この株は 13q31.3 (BAC、 RP1 1-430K10) の増カロと 4q32. 1 (BAC、 RP1 1- 154F14) の減少等の、複数の遺伝子座におけるゲノム異常を有することが判明している。ァレイ CGHデータに従うように、対応する BAC を用いた FISH分析によっても、これらの増加と減少が引き続き検出された（図 1B ) 。図 2 に示すのは、 Karpass 1718細胞株の第 16染色体（図 2A) ならびに第 8p染色体（図 2C) に対する、個々のアレイ CGHプロファイルである。このプロファイルに示されるのは、単一ピークの 16p l3. 13の増加（BAC、 RP1 1-24M 12) (図 2A) ならびに BAC、 RP1 1-353K12 と BAC、 RP11-369E15の間の 8p21 区切り点であつた。これらの結果は同様に、その後で行った FISH分析により確認された（図 2Bと 2D) 。これらの知見から、アレイ CGHの精度と高い分解能が示された。 2-2. DLBCL症例に関するゲノムプロファイルとデ一夕分析

次にアレイ CGH分析を実施し、 CD5⁺ならびに CD5- DLBCL症例の間のゲノム変化を比較した。 X 染色体上の全クローン（57 クローン）は性別が不一致であるため個別に分析した。合計 70 例の DLBCL症例を登録した。 4 例（CD5+ DLBCL症例で 1例、 CD5-の症例で 3例）にはなんらゲノム異常は見られなかつた。このため、 CD5+ DLBCLである 25症例と CD5- DLBCLである 41症例をデ一夕分析に供した。 CD5+ならびに CD5- DLBCL のゲノム増加と減少の平均サイズを表 1 に示す。全ゲノム中におけるこれらの有効範囲率も表中にまとめてある。平均して、 CD5+グループは CD5-グループより大きなコピ一数増加分画を含む一方、前者は後者より小さなコピー数減少分画を含んでいた。

図 3 に示すのは、代表的な 2種類の CD5+ (図 3Aと 3B) 試料と、 1種類の CD 5- (図 3C) 試料の全ゲノムプロファイルである。コピー数の変化は高解像度でゲノム全体にわたり容易に検出できた。低レベル増幅を示す領域（log₂比率 +2.0~ + 1.0 として定義）、ならびにヘテロ接合性欠失が示唆される領域（log₂ 比率- 1.0〜- 0.2として定義）も同様に識別可能であった。

この発明では、「増加または消失の共通領域」を次のように定義した。 i) 少なくとも 3 種類の連続するクローンが連続して配列しており（解像度 3〜5Mb 以上）、それらのクローンが 20%以上の症例で増加または減少を示す場合、あるいは、 ii) 3 種類未満であるならば、クローンが大きなコピー数増加を示すか (lo_g2比率 >+ 1.0で定義）、ホモ接合性の減少を示す場合（Iog₂比率 <- 1.0で定義）（2p l6. 1の増加、 3p l4の減少、 9p21の減少）。「共通領域」内部において、「最少共通領域」を最大症例数により共有される領域として定義した。「最少共通領域」内に最も頻出する BAC/PAC クローン、及びそれに含まれる代表的な遺伝子（悪性リンパ腫の公知の候補腫瘍遺伝子及び腫瘍抑制遗伝子） (Monni, 0. et al. Blood, 87: 5269-5278, 1996； Rao, P. H. et al. Blood, 92: 234-240, 1998； Wright, G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 9991-9996. 2003) は表 2及び 3に記載してある。

CD5⁺グループ（25例）の共通増加領域は、 Iq21.2-q32.3、 Iq42.2-q42.3, 2pl6. 1 、 3、 5pl3.2-pl3. 1 , 6p25.3-p22.3 , 7p22.2-q31. 1 , 8q24.13- q24.22、 I lq22.1-q25 , 12、 13q21. 1-q34 , 16p l3.3-q21、 17q23.2-q24.3 , 18、 19pl3.13- ql3.43、 Xであり、 CD5+グループの共通減少領域は 1ρ36·32- ρ36.23、 1ρ36.21-ρ36.13 , 1ρ35.1-ρ34·3、 Iq43-q44、 3ρ14.2、 6ql4.1- q27、 8ρ23.3-ρ21.2, 9ρ21、 15ql3.1-ql4、 17pl3.3-pl 1.2であった。

CD5-グループ（41 例）の共通増加領域は、 slq21.1-q31.1、 lq32. l-q32.2、 3p25.2-q29, 5ql3.2-pl3.1 , 5pl4.1-ρ13.2、 6p25.3-pl2.3 , 7、 8q24.13- q24.21、 9q24.2-pl3.2、 1 Iq23.2-q24.2, 12ql3.2-q21.2、 16pl3.3、 18、 X であり、 CD5-グループの共通減少領域は Ip36.32-p36.23、 3pl4.2、 6ql2- q25.2、 6q27、 9p21、 15ql5.2-q21.1、 17p 13.3_p 11.2であった。

CD5+と CD5-の両グループのうち 20%以上の事例で観察される増加領域は、 Iq21.1-q31.1. Iq32.1-q32.2、 3p25.2-q29, 5pl3.2-pl3.1 , 6p25.3-p21.1、 7p22.2-q31.1 、 8q24.13-q24.21 、 1 Iq23.2-q24.3 、 12ql3.2-q21.2 、 16pl3.3、 18、 Xであり、 CD5+と CD5-の両グループのうち 20%以上の事例で観察される減少領域は、 Ip36.32-p36.31, 3pl4.2、 6ql4. l-q25.2> 6q27、 9p21、 17ρ13.3-ρ11·2であった。

以上の CD5+または CD5-グループのいずれかの共通領域の中で、 2ρ16.1 (REL 遺伝子座、 BAC、 RP11-17D23) の増加、 3pl4.2 (FHIT 遺伝子座）の減少、 9ρ21.1 (ρ16ΐΝκ 遺伝子座）の減少を示す症例の一部には、単一クローンまたは連続する 2 クローンによるゲノム異常が見られた。 2pl6.1増加をみた 13症例のうち 3例にこのような増加が見られた。 DLBCL状態で 2pl6.1 増カロをみた 3 症例中 2 例には、連続するわずか 2 個のクロ一ン（BACs、 RP11- 17D23 ならびに RP11-511I11) に著しく高レベルの増加（log₂ >+1.5) がみられた。 DLBCL状態での 3pl4.2の減少はこれまでに報告されていない。

全 66例中 18例（28%) に 3pl4.2 の減少がみられた。 3pl4 を含むクローンのうち、 BAC、 RP11-48E21 (FHIT座）が単独減少していたのは 18例中 13 例であり（CD5+ DLBCLの 7例と CD5-の 11例）、このとき周辺の BACsで明確なコピー数減少を示すものはなかった（図 4A) 。単独減少をみた 13 例のうち、 13 例中 2 例がホモ接合性減少であると思われた（10₈₂比<-1.0) 。従ってこの FHIT座は最少共通領域であると考えられ、またこれは進行性悪性リンパ腫患者より確立した OCI-LY13.2細胞株においても欠失していた（Karnan, S. et al. Genes Chromosomes Cancer, 39: 77-81, 2004) 。 FISH分析はこのァレィ CGH データに一致していた（図 4B と C) 。同様に BAC クローン RP1 1- 14912 ( p l 6iNK_4a座を含む）は、合計 66例の DLBCL症例のうち 9p21 の減少を示す 32例の 9例にて単独減少しており（9例中 2例がホモ接合性減少と思われる）、従ってこれが最少共通領域であると考えられる。

最後に、男性患者のみについて X 染色体を分析した（CD5+グループ： 10 例、 CD5-グループ： 25例）。 CD5+グループの 10例中 2例と、 CD5-グループの 15 例中 3例には、 X染色体全域にわたり軽度のコピー数増加がみられ（+0.2<log₂ 比率く + 1.0) 、重度の増加はみられなかった。 CD5+グループの 2 例について、 Xq21に軽度の減少（- l<log₂比率く- 0.2) がみられた。

2-3. CD5+ DLBCLのゲノムコピ^ "数変化特性

次に、 CD5+と CD5-グループ間のクローン増加と減少の頻度を比較した。候補クローンについて単一クローンベースのスクリーニングを行ったところ、 48 種類のクローンが、 CD5 -グループと比較して CD5+グループのほうにおいて高頻度（p<0.05) で増加または減少していることが判明した。これら 48 種類のクローンでは、 10p l5.3-p l4 では 6 種類中 6 種類（6/6) のクローンが、 12p l2では 3種類中 3種類（3/3) のクローンが、 16p l2では 5種類中 3種類 (3/5) のクローンが、 19p l3.33-ql3.4では 9種類中 9種類（9/9) のクロ一ンが連続的に配列していた（Sanger Center Institute の Ensembl Genome Data Resources^ 2004年 1 月版の全ゲノムマッピング位置による）。 16p l2 における 5例中 2例（2/5) のクローンと、残る 48例中 25例のクローンは単一で P<0.05 を示し、すなわち隣接するクローンに CD5+と CD5-グループ間での差違がみられなかった。

CD5-グループと比べて CD5+グループにおいて、 20 種類のクローンが比較的高頻度で有意に減少していることが判明した。これらの中で、 lq43では 9例中 3例（3/9) のクローンが、 Iq43-q44では 9例中 6例（6/9) のクローンが、 8p23では 7例中 2例（2/7) のクローンが、 8p23では 7例中 5例（5/7) のクローンが連続的であり、残る 20例中 4例のクローンは単一で P<0.05を示し，すなわち隣接するクローンに C )5⁺と CD5-グループ間での差違がみられなかつた。多重比較を行ったため、上記のように単一クローンベースでスクリーニングしたクローンについて、その後多重比較修正を実施し、 CD5+と CD5-グループ間で頻度差が存在するという意味で統計的に有意であるクローンを判別した。 n番目のクローンとそれに続く k 個のクローン（k≥0) が候補クローンであることがスクリーニングにより判明した場合は、連続した関連を求めるための p 値は前記 1- 11の式 (1)にて計算される。この時、各クローンは独立していると仮定する。ここでは複数回の試験を適用したため（最大 1 1 ,796回試験）、従来のボンフエ口一二法を適用してアルファエラーを定義し、最終結論を求めた。従ってここでは、 p 値が 0.05/ 12,000 (=4.2 X 10-6 ) 未満である場合を統計的有意であると定義した。 CD5+ DLBCLの 10p l5.3-p l4増加、 19p l3.33-ql3.43増カロ、 Iq43-q44減少、 8p23.2-p23.1 減少の式（1)の値はく 4.2 x 10-6であったため、これらの領域は CD5+グループに特徴的であると考えられる。しかし CD5+ DLBCLにおける他のクローンの式（1)の値はこの基準では有意性を示さなかった。

10種類の増加クロ一ンと 6種類の減少クローンについて、 CD5+と CD5-グループ間の症例頻度に差違が見られたが（p<0.05) 、複数比較修正を実施した後には、これらのクローンに有意性はみられなかった。

従って 10p l5.3-p l4ならびに 19ql3.33-ql3.43 の増加と、 Iq43-q44ならびに 8p23.2-p23.1 の減少は CD5+ DLBCL に特徵的である。また CD5- DLBCL に特徴的である増加や減少は無かった。 CD5+ DLBCL とその中に含まれる BAC クローンに特徴的な領域を、表 4 (増加）ならびに表 5 (減少）中にリストアップしている。 CD5+ DLBCL症例の第 10 染色体、第 19 染色体、第 lq染色体、第 8染色体に対する個別ゲノムプロフアイリングの代表例 3種類を、それぞれ図 5A、図 5B、図 6、図 6Bに示す。 2-4. DLBCL症例の予後に影響するゲノムコピー数変化

次に、特定ゲノム増加または減少の存在の有無に従って症例を層別化し、カブラン-メイヤー法とログランク検定を用いてこれらの症例の生存確率を分析した < CD5+または CD5-グループ中でコピー数変化（増加/減少）の異常を示すクロ一ンを、全てスクリーニング対象とした。続いて、複数比較修正を実施し、スクリ一二ングログランク検定により p<0.05を示すクローンを調べた。 CD5+グループでは、 252 種類のクローン（増加が 98 種類、減少が 154 種類）が単一クローンベースのログランク検定により、予後に関して p<0.05であることが示された。これら 252 種類のクローンのうち、 18 種類のクローンが 1ρ36.21-ρ34.3 に連続配列しており、複数比較修正によって生存について有害な影響を及ぼすことが判明した（p<4.2 X 10-6) 。 252種類中 44種類のクローンは、 13q について分析された 65 種類のクローンに分類された。 13q21. 1- q31.3では 44例中 29例（29/44) のクロ一ンが、また 13q31.3-q34では 44 例中 15例（15/44) のクローンが、それぞれ連続的に配列されたクローンであり、複数比較修正により予後不良に結びつくことが判明した（p<4.2 X 10-⁶) 。残る 190 例のクローンは、統計的有意性に欠けると分類された（p<4.2 X 10- 6) 。 '

CD5-グループでは 252種類のクローン（増加が 197例、減少が 55例）が予後について単一クローンべ一スで p<0.05 となった。これらのクロ一ン 252 種類のうち、 34種類のクローンが 5pについて分析した 38種類のクローンに分類された。 34種類のクロ一ンのうち、 5pl5.33-p l4.2では 34例中 19例が、また 5p l3.2-p l2では 34例中 5例が、それぞれ連続配列したクローンであり、複数比較修正により生存に対して望ましい影響があることが判明した（p<4.2 X 10-6) 。残る 218 例のクロ一ンは統計的に有意ではなかった（p>4.2 10-6) 。

13q21.33-q31.1 増加、 1ρ36.21-ρ36.13 減少、 5p l5.33-p l4.2 増加の存在の有無による CD5+と CD5-症例の生存曲線を、それぞれ図 7に示す。

表 6 に示すように、 13q21.1-q34増加を示す CD5+ DLBCL症例では、当該遺伝子領域の増加がみられない CD5+症例と比較して有意に生存が悪化していた。同様に 1ρ36.21-ρ34.3の減少を示す CD5+ DLBCL症例は、当該遺伝子領域の減少がみられない CD5+症例と比較して、有意に生存が悪化していた（図 7) 。対照的にこれに対応する領域の減少は、 CD5- DLBCL 症例の生存に影響しなかつた。逆に 5pが増加している CD5- DLBCL症例の総生存は当該増加のみられない場合と比べて優れていたが、 CD5+ DLBCL症例の生存に対して 5p 増加は影響しなかった（データ示さず）。表 1

DLBCL症例のコピ - -数変化

全症例 CD5+ 0LBGL C05— OLBCL n=66 n=25 n=41

コピ一数増加

平均ゲノムサイズ（Mb) ^a 335. 6 370. 9 311. 1

平均ゲノム ¾ 11. 8 13. 4 10. 9 コピー数減少

平均ゲノムサイズ（Mb) 148. 2 110. 5 174. 4

平均ゲノム ¾； 5. 2 3. 8 6. 8 カバーされる全ゲノム（Wlb、 + 染

2, 988

色体）

カバ一される全ゲノム（Mb、 -X 染

2, 834

色体）

クローン数（+X染色体） 1， 966

クローン数（-X染色体） 1， 907

クローン間の平均距離（Mb) 1. 5

クローン間の最大距離（Mb) 25. 1 ^aゲノム変化のサイズは、影響されるクローンの合計として定義され、それ自体の中心から隣接する 2種類のクローンの中心までの距離の 1/2をそれぞれ示している (Vel tman, J. A. et a l . Cancer Res. , 63 : 2872 - 2880， 2003参照）。

表 2

Table 2 Most frequently gained clones of each common repon in each gro p

CD5⁺(n=25) _ CD5^_ (n=41) All (n=66)

Cytogenetic

Chromosome Clone name position Oenes^c %^d

Chr.l PU-367J7^Afr lq23.1 HDGF 36 29.3 31.8 RPI U263K19 lq22 MUC1 20 26.8 24.2

MDM4 24 24.4 25.8

RP5-9560l8^a lq42.2 PGBD5 20 22.7 2X2

Chr zpio.i REL 24 17.1 19.7

Chr.3 RP 11-33905 3p22.3 CCR4 40 24.4 30.3

Jpi J rVXrl 36 24.4 28.7

Krll-oolAli CU4/ 48 24.4 33.3

RP11-362K14 3q2b.2 EVT'l 44 31.7 36.3

RPU-211G3 3q27-3 BCL6 56 36.6 43-9

Chr.5 rll- 1712J 5pli. 20 22.0 21.2 nr.o MUMI 24 29.3 27.3

RP3-431A14 6p21.31 p2J 29 26.6 33.3

Chr.7 KPll-49oDlo 7p 2.2 CARDJS 24 39.0 33.3

RP11-221B19 7p21.2 ETV1 20 24.4 22.7

RPH-240H8 7pl5.3 IL6 24 26.8 ' 25.8

34.1 2S.S 1

22.7 hr.y 一 12 26.6

Chr.ll RP11-!44G7 1 lq223 DDXI0 36 j 2.2

RPI1-770 18 llq23.3 DDX6 32 22.7 25.8

RP11-758H14 Hq23.3 MIL 40 31.7 34.8

RPU-1007G5" llq24.3 ETS1 56 29.3 39.3

Chr.12 RP11-100C20⁰ 12pl2.1 BCAT1 44 17.1 25.8 .

RP11-181L23* 12ql3.3 GU . 32 .4 21.2

RPl l-571M6^fr 12ql4.1 CDK4 32 24.4 21.2

RP11-450G15* 12ql5 MDM2 32 24.4 27.2

Chr-13 RPU-335P18^fl 13q21.32 32 12.2 19.7

RPIl-l2iJ7 13q31.3 CUorfiS 24 9.7 16.7

RPU461N23^a 13q32.3 EBI2 32 17.1 21.2

Chr.16 RP1]-473M20^& 16pl3.3 NK4 36 65.9 56.1

RPll-548B6^a 16pI2 1 PKCbeta 28 7.3 15.1

Chr.17 RP11-371B4⁰ 17q23.2 20 4.9 20.6

Chr.18 KPU-380M21 18q21.t SMAD2 26 39.4 39.4

RP11-4G6 18q21.1 MALTl 36 39.0 37.9

RP11-28F1^& 18q21.1 BCL2 36 41.5 39.4

RP11-676J15⁰ 18q22.3 NETOJ 44 38.8 47.0

Chr.l RP11-50I11⁰ 19ql3.41 BAX 56 14.6 30.3

RPll-45K21^fl I9ql3.43 PEG3 56 26.8 37.9

¹ Most frequently gained clones in CDa DLBCL.

b Most fequently gained clones in CD5" DLBCL.

: Genes contained in clones.

% of cases with copy number gdn. 表 3

Table 3 Most frequently lost clones of each common region in each ψοιψ

CD5⁺ (n=25) CD5" (n=41) All (n=66)

Cytogenetic

Chromosome Clone name posuion

Chr.l lp36.32 40

KP11-473 A10^a

RP5-1125Nl l^fl lp35.2 28 22 24,2

RPlM39E19^a lq44 NU 016009 24 0 9.1

Chr.3 3pl4.2 FHIT 28 26.8 28.7

Chr.6 RP11-329G3 6q21 BLIMPl 44 36.6 39.4

RP11-421D16⁶ 6q27 AF6 24 19.5 21.2

Chr.8 RP11-240A17⁰ 8p23.3 36 7.3 18.1

Chr.9 RPl 1-14912 9p21.3 pl6 40 31.7 34.8

Chr.15 RPl 1-207° I5ql3.2 24 17.1 19.7

RP11-164J23* I5q21.1 16 29.3 24.2

Chr.17 RP11-199F11° 17pl3.1 p53 36 26.8 303

RP11-187D20^& 17pl2 MAP2K4 20 39 . 30.3

' ost frequently gained clones in CD5⁺ DLBCX.

' Most fequently gained clones in CDS' DLBCL.

' enes contained in clones.

' % of cases with copy number gain.

表 4

Table 4 List of BA C clones showing chracteristic fains of CDS DLBCL

CD5⁺ (n=25> CD5" (n=41) All (n=66)

Chromsome

Clone name" band Mega base* Gene %^c % ^c % ^c Fisher's ''

KP11-362D13 10pl5.3 2.2 16 0 6.1 0.0176

RP11-453F1 10pl5.2 3.3 16 0 6.1 0.0176

RP11-154P1 I 10pl5.1 4.3 16 0 6.1 0.0176

RP11-445P17 10pl5.1 5.1 AKR1C4 16 0 6.1 0.0176

RP11-563J2 lOplS.l 6.3 16 0 6.1 0.0176

RP11-379F12 10pl4 8.1 GATA3 16 0 6.1 0.0176

RP11-124P12 19ql3.33 52.2 40 17.1 25.8 0.0476

RP11-3N16 19ql3.41 53.3 LIG1 48 29.3 28.8 0.0113

RPl 1-50111 19ql3.41 54.5 BAX. CD37 56 14.6 30.3 0.0007

RP11-25A12 19ql3.42 55.4 IL4I1 48 19.5 31.8 0.0051

RP11-256B9 19ql3.43 57.5 ZNF137 44 14.6 25.8 0.0046

RP11-158G19 19ql3.43 59.1 MYDM 44 14.6 25.8 0.0046

RP11-705C4 19ql3.43 60.7 ILll 48 19.5 30.3 0.0259

RP11-45K21 19ql3.43 61.8 PEG3 56 26.8 37.9 0.0216

RP11-43B2 19ql3.43 62.6 56 17.1 31.* 0.0022

RP11-420P11 19ql3.43 64.1 44 22.0 30.3 NS(0.0964) a List ofBAC/PAC clones from p telomere to q telomere for each chromosome number.

b Based on Ensembl genome mapping position (http://www. Ensembl.org).

c % of cases with copy number gain.

d P values of Fisher's exact test in frequency of cases between CD5 and CD5" DLBCL.

e Not significant

表 5

Table 5 List ofBAC clones showing chracteristic loss of CDS ⁺ DLBCL group and statistic analysis

C 5⁺ (n=25) CD5' (n= I) All (n=66) _

Chromsome

Clone name⁰ band Mega base* Gene %^c % ^c % ^c Fisher's P^rf

RP11-435F13 lq 4 238.1 RGS7 24 0 9.1 0.0019

RP11-269F20 lq44 240.6 AKT3 20 0 7.6 0.0059

RP11-424N15 lq44 241.5 ADSS 20 0 7.6 0.0059

RP11-74P14 lq44 242.9 Q96QW3 20 0 7.6 0.0059

RP11-439E19 lq44 243.7 NM 016002 24 0 9.1 0.0019

RP11-152M6 lq44 243.9 20 0 7.6 0.0059

RP11-18D5 8p23.3 0.3 NM1S1648 28 4.9 13.6 0.0214

RP11-240A17 8p23.3 1.2 36 7.3 18.1 0.0066

RP11-82K8 8p23.3 2.1 36 14.6 22.7 NS' (0.06お)

RP11-29A2 8p23.2 5.1 32 9.8 18.2 0.0449

RP11-728L1 8p23.2 5.6 32 9.8 18.2 0.0449

RP11-18L2 8p23.1 8.6 MASL1 24 2.4 10.6 0.0099

RP11-24114 8p23.1 10.0 32 9.8 18.2 0.0449

RP11-254E10 8p23.1 11.2 32 7.3 16.7 0.0154

° List ofBAC PAC clones from p telomere to q telomere for each chromosome number.

b Based on Ensembl genome mapping position (http^/ww . Ensembl.org).

c % of cases with copy number loss..

d p values of Fisher's exact test in frequency of cases between CDD and CD5" DLBCL.

e Not significant

表 6

Table 6 List of SAC clones associated with inferior orognosis of gains in the CDS DLBCL group and statistic analysis

CD5⁺ (n=25) CD5" (n-4n _

Chromsome

lone name b≥nd Mega base ene

±Ί·1-1741ΐυ 4o. oo RBI lb u.uiy?/

-103 1 13ql4.2 47.0 OPR38 1Z n No

RP.11-364I19 13ql4.2 49.5 RFP2 12

RPI1-24B19 13ql4.3 50.8 DDX26 20 0.0Ul)35 1 . ao NS

RP1I-456BIS 13q21.1 53.3 16 o.oouy7 7 NS

KPl 1-50511 13q21.1 54.8 16 o.oooyv NS

KF11-334013 13q21.1 57.2 20 O.O0U09 y.o 0.0305 ft £

RPI 1-430 13q21.2 5S.5 DIAPHS 24 0.00019 9.6 0.0305

RP11-459E2 13q21.2 58.8 TDRD3 24 0.00117 14.6 NS

RP11-168G22 I3q21.31 60.9 bA539I23 24 0.00631 12.2 NS

KP11-468L10 13q21.31 62.8 24 NS P11-335P18 13q21.32 64.9 32 NS

RPI 1-370A2 13q21.33 67.1 28 0.00477 i .2 NS

RPI 1-280J7 13q21.33 68.9 24 0.00631 12.Z NS

RP11-11C5 I3q21.33 70.9 24 0.00631 9.6 0.0305

RP11-459P23 13q22.1 72.6 hA459P23.1 24 0.00631 12.2 NS

RPU-182M20 13q22.2 73.7 bA182M20.2 24 0.00631 9.6 0.0305

RP11-388E20 13q22.3 76.6 24 0.00631 9.6 NS

RP11-263K14 13q31.1 78.5 24 0.00631 9.6 NS

RP11-193G17 13q31.1 80 PTMA 20 0.03369 14.6 NS

KP11-115N13 13q31.1 80.9 20 0.0336y NS

R 11-395N17 13q31.1 83.5 20 0.03369 17.1 NS

RP11- 7N10 13q31.1 84.6 20 0.0336 14.6 NS

RP11-29C8 I3q31-I 83.9 24 ' U.U3U53

RP11-50&F17 13q31.1 84.9 20 I4

RP11-456P14 13q31.2 8D.1 Y918 24 0.UU631 12.2 NS P11-360A9 13q31.2 8 .8 20 0.0336y 12.2 NS

4

RP11-158A8 13q31.3 88.7 28 NS 9.8 NS

RP11-430 10 13q31.3 89.4 GPC5 28 NS 17.1 NS

RP11-121J7 13q3L3 89.9 CJ3orP5 24 0.00631 9.7 NS

RPU-71K7 I3q31.3 91.5 GPC6 20 0.00009 9.7 0.0305

RP1 I-342E2 13q31.3 92.5 GPC6 20 0.00009 9.7 NS

RPU-124B17 13q32.1 92.8 DCT 20 0.00009 12.2 NS

RPI 1-199B17 13q32.1 95.4 20 0.00009 17.1 NS

RP1I-461N23 13q323 97.5 EBJ2 32 0.00023 17.1 NS

RP11- 84I6 13q33.2 101.1 ERCC5 20 0.00009 17.1 NS

KP11-317H7 13q33.1 102.3 16 0.00009 9.7 NS

RP11-I66E2 13q33.2 104.5 G72 20 0.00009' 7.3 NS

RPU-272L14 13q33.2-3 104.7 EFN 2 16 0.00147 9.7 NS

RP11-346C 13q33.3 106.1 ba232k22.1 24 0.00631 9.7 NS

RP11-313L9 13q34 108.1 IRS2 28 0.00155 14.6 0.0378

R 11-65D24 13q34 109.8 24 0.00631 14.6 NS

RP11-391H12 I3q34 111.8 CULA4 24 0.00631 22.0 NS

RP11-569D9 13q34 112.8 CDC16 24 0.01158 24.4 NS

° List ofBAC/PAC clones from telomere to q telomere for each chromosome number."

h Based on Ensembl genome mapping position (http^/www. Ensembl.org).

e Genes contained in clones.

d % of cases with copy number gain.

e p values oflogrank test between cases with copy number gain and those without such copy number gain.

, Not significant 表 7 fable / List ofBAC clones associated with inferior prognosis oflosses in the CDS ^ DLBCL grouD and statistic analysis

CD5⁺ (n=25) CD5" (n=41)

Chromsome

Clone name⁰ band Mega base* Gene^c %^d log-rank P' %^d log-rank P°

KP5-888M10 lp36.21 12.2 Q9UIM0 16 0.00112 14.6 NS "

RP5-1177E19 lp36.21 13.2 PRDM2 12 0.00007 17.1 NS

RP3-410I8 lp36.21 14.4 Q9UIL2 20 0.00045 14.6 NS

RP11-276H7 lp36.13 15.8 EPHA2 20 0.00011 12.2 NS

RP11-473A10 lp36.13 16.8 NM 018125 24 0.00004 22.0 NS

RP5-1056L3 lp36.13 19.4 NBLl 12 0.00019 12.2 NS

RP11-401M16 lp36.I2 20.2 NM 018584 24 0.00004 12.2 NS

RP11-63N8 lp36.12 21.6 RAPIGAI 12 <0.00001 14.6 NS

RP1-74M1 lp36.12 . 22.8 EPHB2 20 0.004098 19.5 NS

RP3-462023 lp36.11 24.3 NM mm 12 0.00019 17.1 NS

RP11-111D20 lp36.11 25.8 PAFAH2 12 0.00019 12.2 NS

RP1-159A19 lp36.11 27.5 NM 015699 16 0.0052 19.5 NS

RP11-242024 lp35.3 29.1 EPB41 16 0.01959 22.0 NS

RP5-1125N11 lp35.2 32.2 HDAC1 28 0.04845 19.5 NS

RP4-8UH24 lp35.1 32.6 28 0.00529 1Φ.6 NS

RP5-I007G16 lp35.1 33.7 NM 145205 24 0.00585 17.1 NS

RP5-997D16 lp34.3 34.7 DLP3 24 0.00855 19.5 NS

RP4-789D17 lp34.3 35.7 EIF2C1 16 0.01959 17.1 NS

RP3-423B22 lp34.3 37.4 NGP1 20 0.00732 22.0 NS

List oi BAC PAC clones from p telomere to q telomere for each chromosome number.

b Based on Ensembl genome mapping position (http://w w. Ensembl.org).

c Genes contained in clones.

d % of cases with copy number loss.

° P values oflogrank test between cases with copy number loss and those without such conv number loss.

•^Not significant

3. 考察

DLBCL は臨床的に不均質であることが知られているが、不均質性の原因となる分子イベントを解明する手段はこれまでに存在しない。しかし現在、アレイ技術の出現によって、そのような分析が可能となりつつある。遺伝子転写産物に対するマイクロアレイ分析により、 DLBCLは少なくとも 3種類の、臨床的関連を有する異なるサブグループにより構成されていることが判明した（Wright, G. et al. Pro Natl. Acad. Sci. USA, 100: 9991-9996. 2003) 。ァレイ CGH法をうまく利用して各種腫瘍のゲノム変異の分析が行われているが（Hackett, C. S. et al. Cancer Res. , 63: 5266-5273, 2003； Veltman, J. A. et al. Cancer Res., 63: 2872-2880, 2003； Wilhelm, M. et al. Cancer Res. , 62: 957-960, 2002) 、 DLBCL については実施されていない。この試験では、独自のアレイ CGH を確立し、 DLBCL70 症例について分析を行った。この分析により、 DLBCL におけるゲノムの増加ならぴに減少が初めて明らかになった。また、ゲノム増加ならびに減少のみられる領域を同定することができたが、これらは臨床的サブタイプと患者の生存に関連していた。

使用するアレイ CGH の精度を確認するため、ここではまず、正常な男性 DNA を用いた試験ハイプリダイゼーションにおいて予想される蛍光を示さないクローンは除外した。次にコピー数に従って log₂比率を確認した。最後に既知のゲノム異常を有するリンパ腫細胞株を用いて、使用するアレイが予想される増加と減少を検出できることを確認した。精度を確認した次に、アレイの分解能を調べた。その目的のため、ここではアレイ CGH を、 DLBCL試料のゲノム異常を検出するための従来の CGH法と比較した（従来の CGH によるデータは他に幸告されている）（Karnan, S. et al. Genes Chromosomes Cancer, 39: 77- 81 , 2004) 。アレイ CGHによって従来の CGHでは検出不可能であった、複数の遺伝子座の異常が判明した。 3p l4.2 の減少はそのような一例である。この減少部位は、アレイ CGHでは DLBCL症例 66例中 18例に検出されたが、従来の CGH では全く検出されなかった。 18 例中 13 例の原因となる領域は、単一 BACの RP1 1-48E21 によりカバ一されていたが、これは FHIT腫瘍抑制遺伝子を含んでいた。従って、アレイ CGHは従来の CGHより高感度であることが判つた。これらの知見から、アレイ CGHは異常遺伝子の同定ならびに絞り込みを行うための有用なツールになると思われる。しかしアレイ CGHはゲノムコピー数変化のみを同定するものであり、そのため遺伝子発現に影響しうる染色体の転座、変異や後生的なイベントなどを検出することはできない。アレイ CGH法を、転写産物に対するマイクロアレイ分析や、染色体の SKY 分析などといった他の新規開発技術と組み合わせて応用すれば、 DLBCL の原因となる分子イベントの理解がさらに容易になることだろう。

従来の CGH によりこの試験で用いた患者試料を分析したところ、 6種類の増カロ頻発領域（3q、 6p、 I lq21-q24、 12q、 13q22-q32、 18q、 X) ならびに 4 種類の減少頻発領域（lp、 6q、 17p、 19p) が判明している（Karnan, S. et al. Genes Chromosomes Cancer, 39: 77-81， 2004) 。同じ患者試料集団を対象 'にアレイ CGH分析を行ったところ、（ここでは通常、連続する 3クローンのレベルを一般に増加または減少領域として定義しているため） CGH により同定された領域以外に、少なくとも 5種類の増加頻発領域が新しく判明した。 3p l4や 9p21 などといった、最少一般減少領域も判明した。しかし CGH により判明している 19p の減少は、アレイ CGH では確認されなかった。このように従来 CGH とアレイ CGH の間に見かけ上の不一致が生じる理由は、現時点で全く不明というわけではない。一つの可能性として第 19 染色体には異質染色質のプロックが含まれており、これらは従来の CGHによる評価が難しい。そのためこれらの領域に対する従来 CGHの結果に対する信頼性が低いことが、不一致の理由かもしれない。他の研究者らによる報告によれば、従来の CGH法を用いると、 Iq21-q23、 2p l2-p l6、 3q26-q27、 7ql l、 8q24、 9q34、 1 lcen- 1 lq23、 12p、 12cen-ql3、 13q32、 16p l2、 16q21、 18q21-q22、 22ql2 力 S増カ卩頻発領域であり、また lptel- lp34、 6q23-qtel、 8ptel-8p22、 17p l2、 22q が減少頻発領域であった (Monni, O. et al. Blood, 87: 5269-5278, 1996； Rao, P. H. et al. Blood, 92: 234-240, 1998； Berglund, M. et al. Mod. Pathol., 15: 807-816， 2002) 。これらの中で 9q34 と 22ql2については、今回実施したァレイ CGHにより増加頻発領域として同定できず、 9q34と 22ql2の増加は合計 66例の DLBCL症例中、それぞれ 5 (7.6%) と 6 (9. 1%) であった。この不一致はおそらく分析対象となった患者試料の違いと、採用方法の感度差が原因であろう。

ァレイ CGH 分析により CD 5+ならびに CD5-グループの両方に、ほとんど同一のゲノム異常パターンが存在することが判明した。しかし 10p l5.3-p l4 と 19p l3.33- 13.43 の増加、ならびに Iq43-q44 と 8p23.2-p23. 1 の減少（表 4 と 5) は CD5+ DLBCL に特徴的であることが判ったが、それにもかかわらず CD5+ DLBCL における 10p l5.3-p l4 は低頻度であった（16%) 。これらの知見を他の特徴的な臨床的挙動と併せることにより、 CD5+ DLBCL が別個の存在であることが示唆されうる。 10p l5.3-p l4 と Iq43-q44 の領域を含む遺伝子はこれまで悪性疾患に関連していると報告されたことはなかったが、 19ql3.4 領域には BAX、 PEG3 (Kohda, T.， et al. Genes Cells, 6: 237-247, 2001) 、 CD37、 IL4RIなどの腫瘍関連遺伝子が含まれており、この IL4RIは縦隔原発大細胞型 B 細胞リンパ腫の原因遺伝子であることが判明している（Copie- Bergman, C. et al. Blood, 101 : 2756-2761 , 2003) 。 8p23のゲノム減少は白血病性マントル細胞リンパ腫（MCL) に頻繁に見いだされており、この遺伝子の欠失はおそらく MCL患者における白血病性の播種ならぴに予後不良に関連してレる（Martinez-Climent, J. A. et al. Blood, 98: 3479-3482, 2001) 。

8p23 が MCLだけでなく CD5+ DLBCLでも頻繁に減少していることから、この遺伝子座に腫瘍抑制遺伝子が含まれており、それは CD5+ DLBCLならびに白血病性 MCLの患者の予後不良の原因となっている可能性が考えられるだろう。

13q21. 1-q34の増加と 1ρ36.21-ρ34.3の減少は CD5+症例の生存に有害な影響を及ぼすことが判明したが、これらの領域は CD5-症例についてそのような影響を及ぼすことはなかった。

CD5+の症例とは対照的に、今回は CD5-DLBCLに特徵的なゲノム領域は、増加や減少のいずれにおいても見いだすことが出来なかった。しかし CD5-DLBCL 症例において 5p の増加に関連して、生存率の改善がみられた。より多くの症例を分析して、この領域が予後に果たす役割を解明する必要があることは明らかである。

まとめると、この試験では DLBCL症例について初めてアレイ CGH分析を行レ、 DLBCL において頻繁に変化しているゲノム領域を見いだした。 CD5+と CD5-の症例を比較して、 CD5+DLBCL グループに特有なゲノム変化を同定できた。アレイ CGH分析はリンパ腫発生の遺伝的背景に関する新しい洞察を提供することになる。

実施例 2

1 . 材料と方法

1- 1. 細胞株、腫瘍標本と CGH法

使用した細胞株は Karpas 1718 (有毛リンパ球を有する脾リンパ腫： SLVL)

(Martinez-Climent, J. A. et al. Blood, 101 : 3109-31 17, 2003) 、 OCI-Ly4、 OCI-Ly7、 OCI-ly8 ( DLBCL、 Columbia University, NY, NY の R. Dalla- Favera 博士から提供）、 Ree l (マントル細胞リンパ腫： MCL、 Leicester University, Leicester, UKの M. Dyer博士から提供）（Martinez-Climent, J. A. et al. Blood, 98: 3479-3482， 2001) 、 Karpas 422 (B細胞リンノ腫細胞株） (Dyer, M. J. et al. Blood, 75: 709-714, 1990) 、 ATN- 1 (成人 T細胞リンノ腫糸田株、 Nagoya University School of Medicine, Nagoya, Ja anの T. Naoe博士力ら提供） (Naoe, T. et al. Cancer Genet Cytogenet., 34: 77- 88. 1988 ) であった。 SUDHL6 ( Southwestern University Diffuse Histiocytic Lymphoma 細胞株、 B 細胞リンパ腫）、 SP49 (MCL 細胞株）、 Jurkat (T 細胞急性リンパ性白血病）、その他の細胞株については他の文献に説明されている（Takizawa, J. et al. Jpn J cancer Res. , 89: 712-718， 1998) 。各種コピー数の X染色体を持つ細胞株は、 NIGMS Human Genetics Cell Repository Conell Institute lor Medical Research (.Camden-. NJ) より購入した。患者試料はインフォームドコンセントにより収集しており、またこの実験は愛知がんセンターの IRB (施設審査委員会）の承認を得た。細胞株は全て 10%ゥシ胎児血清を添加した RPMI 1640 中で維持した。ゲノム DNAの抽出は、プロティナーゼ K 消化とフエノール · クロ口ホルム抽出を用いた標準処置により行った。従来 CGH とアレイ CGHで使用する正常 DNAの調製は、正常男性より得た末梢血リンパ球を用いて行った。「従来型」 CGH の実施は、メ一力一のプロトコルに従って実施した（Vysis、 Downers Grove、 IL) 。 1-2. アレイ CGH

アレイ製造ならびにハイブリダィゼーションの実施は、それぞれ Hodgson et al (Nat Genet. , 29: 459-464, 2001) ならびに Pinkel et al (Nat. Genet. , 23: 41-46, 1998) に記載の方法に従って行った。アレイは 2,088種類の BACならびに PAC クローンにより構成され、ほぼ 1.5-Mb の解像度でヒトゲノムをカバ一しており、 BACクローンについては RP1 1、 13のライブラリを、 PACクロ一ンについては RP1、 3、 4、 5 をもとにしている。これらのクローンの入手先は、 Oakland、 CAにある Children's Hospital Oakland Research Institute内の BACPAC Resource Center (http: / /bacpac.chori.org/ ) である。各クローンの培養は、クロラムフエ二コール（25 j g/ml) 存在下の Terrific Broth (TB) 培地中で行い、 BACならびに PAC DNAの抽出は plasmid Mini-kit (QIAGEN、 Germantown, MD) を用いて行った。各クローンの位置確認はやはり FISH分析により行った。これらのクローンのおよそ 10%は予想された位置に確認されなかったため試験から除外し、確認されたクローンを用いてアレイ CGH を行つた。 10ngの BACならびに PAC DNAをテンプレートに用いて、プライマ二 5'- CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3' ( SEQ ID ΝΟ: 1 ) を用いた変性オリゴヌクレオチドプライマ二使用 PCR ( DOP-PCR) を行った（Hakan, T. et al. Genomics, 13: 718-725, 1992) 。増幅は Takara PCR Thermal Cycler MP (TaKaRa> Tokyo, Japan) と ExTaqポリメラーゼ（TaKaRa) を用いて行つた。 DOP-PCR産物をエタノール沈殿により濃縮し、蒸留水で溶解し、続いて等量の DNA スポッティング溶液 DSP0050 (MATSUNAML OSAKA, JAPAN) を添加した（ ~ 1 ^ g/ ^ 1 ) 。 DNA は二重に、 CodeLink™活性化スライド ( Amersham Biosciences、 Piscataway、 NJ ) 上に機械的にスポットした (NGK Insulators, Ltd. , Nagoya、 Japan) 。試験 DNA ならびに対照 DNA (各 l g) を Dpnllで消化し、 Bio prime DNA labeling system (Invitrogen Life Technologies, Inc；.、 Tokyo Japan) により、それぞれ cyanine3-dUTP ならびに cyanine5-dUTP (Amersham Pharmacia Biotech、 Piscataway、 NJ) を用いて標識した。取り込まれなかった蛍光ヌクレオチドは、 Sephadex G-50スピンカラム（Amersham Biosciences) を用いて除去した。標識化された l gの試験 DNAならびに対照 DNA試料を、 lOO gの Human Cot- 1 DNA (Invitrogen Life Technologies) と混合して沈殿させ、その後 45 μ 1のハイブリダイゼーション混合液中にペレットを再懸濁したが、この混合液の内容は 50%ホルムアミド、 10%デキストラン硫酸、 2x SSC、 4% SDS、 10 i g/ l 酵母 tRNA (Invitrogen Life Technologies) であった。このハイブリダィゼ一ション溶液を 73°Cで 5分間加熱して DNAを変性させ、続いて 37 で 45分間ィンキュベ一トして反復配列のブロッキングがなされるようにした。 DNA をスポッ卜したスライドは、 70%ホルムアミド /2x SSCを含む溶液中で 73でで 4分間にわたり変性させ、続いてそれぞれ 5分ずつ、 70%、 85%, 100%冷エタノール中で脱水して風乾させた。ハイブリダィゼーシヨンは、緩やかに振動するテープル上で、湿度調節のために 200 Uの 50%ホルムアミドと 2x SSCを含む容器中で 48時間にわたり行い、これに続いてハイブリダィゼーシヨン後洗浄を、 50% ホルムアミド /2x SSC中 50でで 15分間、 2x SSC/0.1% SDS中 50でで 30分間、 0. 1M NaH₂P0₄、 ρΗ8の 0. 1M Na₂HP0₄、 0. 1% NP-40により構成される P 緩衝液中室温で 15 分間行い、 2x SSC 中室温ですすぎを行い、最後に室温にてそれぞれ 2 分ずつ 70%、 85%、 100%エタノール中で脱水して風乾した。スキャニング分析は基本的に Agilent Micro Array Scanner ( Agilent Technologies. Palo Alto、 CA) を用いて実施した。このようにして得たアレイ像を、 Genepix Pro 4. 1を用いて分析した（Axon Instruments, Inc.、 Foster City CA) 。 DNA スポットを自動的に分割し、局所的バックグラウンドを減算し、 2種類の色素の全体的強度と蛍光強度比を各スポットごとに計算した。 2種類の色素の蛍光強度比（Cy3 強度/ Cy5 強度〉は log₂強度比に変換した（lo_g2 比）。

この実験で用いるアレイについて、正常男性に対する正常男性の同時八イブリダイゼ一シヨン 6 種類を実施し、 log₂比の正規変動を定義した。この実験では 122種類のクローンが、全クローンの蛍光強度の平均値の 1 / 10未満を示したため、これらをアレイ CGH 分析から除外した。残った 1，966 種類のクロ一ンを用いて、アレイ CGH分析を行った。各スポット（2x 1,966 クローン）について測定された蛍光 log₂比率の 95%以上が +0.2? -0.2の範囲になった。増加と減少の log₂比の閾値は、それぞれ +0，2 と- 0.2 の log₂比に設定した。また、各試料の log₂比を次に述べる方法に従って正規化した。

全クローンの平均 log₂比を計算し、 lo_g2比が「中央値 + SD X Aj 以上、または「中央値一 SD XA」未満であるクローンを選択した。「A」は各実験ごとの全てのクローンの log₂比のプロットを参照することにより、正常領域として視覚的に定義した。また「A」はほぼ 0.3から 0.7の範囲に割り当てられた。次に選択されたクローンについて、平均 log₂比率を計算し、この平均 log₂比率を「X」とした。最後に各クローンの log₂比から「X」を引いて「Y」値を得た。この試験では、それぞれの log₂比について Γγ」値をもとに分析した。ここではクローンを視覚的に選択し、それぞれの実験ごとに SD値を計算し、その SD値が 0. 15 を上回らないことを確認した。もし上回る場合には当該値は CGH分析のために信頼できないと見なした。

正常男性と正常女性のアレイ八イブリダイゼーションを実施し、 X染色体のあるコピー数に何らかの変化があるかどうかを調べた。コピー数変化に伴う線形性を確認するため、正常に対して、異なる X 染色体数を有する各細胞株 (GM04626： 47ΧΧΧ； GM01415D： 48ΧΧΧΧ； GM05009C： 49ΧΧΧΧΧ) のアレイハイプリダイゼ一シヨンも、同様に実施した。これらの細胞株は NIGMS Human Genetics Cell Repository Coriell Institute for Memcal Research り取得した。 X染色体の BACまたは PACクローン 57種類をこの分析に用いた。それぞれの八イブリダィゼ一シヨンごとに、これらのクローンの平均 log₂比率を計算した。

1-3. FISH分析

13q31-q32 上の BAC クローンの位置を、 Ensembl Genome Data Resources (http:/ /www.ensembl.org/ ) による保管データをもとに確認した。およそ 15Mb をカバーするアレイ CGHにより示された、 13q31-q32 の高レべル増幅領域周辺に位置する 19 種類の BAC クローンを用いた FISH分析を、 3 種類の細胞株に対して用いた（Karpas 1718、 OCI-Ly4、 Reel ) 。細胞株のそれぞれの分裂間期染色体スライドは、標準法に従って調製した。 FISH の実施は文献（Tagawa, H. et al. Oncogene, in press, 2003) 記載の方法に従って実施した <

1-4. ESTsと遺伝子の位置

13q31.3 染色体領域上に位置する ESTs と遺伝子は、 National Center for Biotechnology Information ( NCBI ； http: / /www.ncbi.nlm.nih.gov/ ) 、 Ensembl genome data resource ( ttp: / /www. ensembl.org/ ) 、 the University of California at Santa Cruz ( UCSC ； http: / /www.genome.ucsc.edu/ ) を参照した。アレイ CGH と FISH分析により、 13q3 1-q32 における共通増幅領域は BAC の RP1 1-360A9 から BAC の RP1 1-93M 14 までに渡っていることが示された。この領域には互いに重複しない 65種類の独立した ESTsと、 GPC5が含まれていた（表 8) 。

1-5. 逆転写ポリメラ一ゼ連鎖反応（RT-PCR) 分析

FISHならびにアレイ CGHにより、 13q3 1.3上に高い増幅が見られた 3種類の細胞株、すなわち Rec l、 Karpas 1718、 OCI-Ly4 を用いて RT-PCR分析を行った。胎児脳より得た cDNAも分析した。 RNA試料中に混在したゲノム DNA による増幅を避けるため、 RNA を増幅グレードの DNasel ( Invitrogen Life Technologies, Inc.) で処置し、その後で試料の cDNA合成を行ったが、これは SuperScriptll (GIBCO-BRL, Div. of Life Technologies, Inc. , Gaitherburg、 USA) を用いて実施した。すなわち、それぞれ 5 μΛ のトータル RNA を逆転写し、 40 Ai lの蒸留水中に溶解した cDNAとした。 RT-PCRは 65種類の ESTs と GPC5について、特異的プライマ二を用いて実施した（表 8) 。各プライマ二の設計は、 Tm 値が 55でから 60°Cの範囲になるようにした。増幅の実施には Thermal- Cycler (Perkin- Elmer Corporation^ Norwalk、 CT) を用いた。 RT- PCRは、文献 ( Motegi, M. et al. Am J Pathol., 156 : 807-812， 2000) に記載されている夕ツチダウン PCR法により実施した。すなわち反応の内容は、 10 サイクルの変性（94で、 0.5分）、アニーリング（63 、 0.5分、 2サイクルごとに 1で減少）、伸長（72t、 2.5 分）に続き、 35 サイクルの変性（94で、 0.5分）、アニーリング（58 ：、 0.5分）、伸長（72で、 2.5分）を行い、最後に 72で、 5分の最終伸長を行った。原則として反応のアニーリング温度は 63でから 58·Όの範囲であった。さらに RT-PCRを異なる条件下においても実施したが、これはアニーリング温度を 651：から 60でに、または 60°Cから 55 に変化させて行った。 PCR 産物が得られなかった場合には、新しいプライマ二セットを設計してそれらが本当に陰性であることを確認した。 PCR 産物は全て電気泳動により分離し、 QIA quick™ Gel Extraction Kit ( QIAGEN) を用いて精製した。精製 PCR産物に対する TAクロ一ニングを、 pBluescriptll SK (-)を用いて実施し、 ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, VA) を用いてシーケンス分析を行った。 1-6. ノーザンブロット分析

ノーザンブロットは、 30種類の ESTs と GPC5 cDNAを用いて、 5種類の細胞株（Recl、 Karpas 1718、 OCI-Ly4、 Jurkat、 ATN- 1) ならびにヒト胎盤に対して実施した。さらに行った分析では候補遺伝子である BC040320 と GPC5 を用いたが、これは当該領域に対する候補遺伝子としてこれまでに報告されていること力、ら対象に含めた (Yu, W. et al. J Hum Genet. , 48: 331-335, 2003) 。ここでは 13q31-q32 において高度な増幅を示す細胞株（Recl、 Karpas 1718、 OCI-Ly4) 、ならびに増幅を示さない細胞株（Jurkat、 ATN- 1 ) に対して、各 ESTs と GPC5の発現を比較した。 BC040320 と GPC5の発現を詳しく調べるため、複数の細胞株と患者についてノーザンプロット分析も実施した。ノーザンブロットハイブリダィゼーシヨン法は標準法により実施した（Naoe, T. et al. Cancer Genet Cytogenet., 34: 77-88. 1988) 。それぞれの RT-PCR産物を、 PCR を用いて標識した特異的プローブとして用いた。すなわち、 10ng の RT- PCR 産物を [ a -³²P]-dCTP を用いて、 PCR により標識化した。反応の実施は変性（94 、 0.5 分）、アニーリング（55°C、 0.5 分）、伸長（72 、 2.5 分）の過程を 25 回繰り返し、 5 分間にわたり 72で最終伸長を行うというものであつた。全ての細胞 RNA (5 g) は、 1%ァガ口一ス /0.66Mホルムアルデヒドゲル上で大きさにより分画し、 Hybond-N⁺ナイロン膜（Amersham Pharmacia Biotech, Tokyo, Japan) 上に転写した。次にこの膜を 42Όで [ a -32p]_dCTP 標識化プローブを用いて一夜 ίこわたりハイブリッド化し、洗浄し、その後 ΒΙΟΜΑΧ™ MSフィルムに曝露した（EKC、 Rochester, NY) 。 1-7. 候補遺伝子の分析

BC040320 は 13q31-q32 増幅領域の候補遺伝子であるが、これをさらに分析した。候補遺伝子のシーケンスを確認するために BC040320のェクソン 1 とェクソン 4の間で RT-PCRを行ったが、ここでは BC040320 のェクソン 1 側についてデザィンしたプライマ二 5'-TCCGGTCGTAGTAAAGCGCAGGCG-3' ( SEQ ID NO:2 ) と、ェクソン 4 側についてデザインした 5 CTGAAGTCTCAAGTGGGCAT-3' (SEQ ID NO:3) を用いた。 PCR反応は RT- PCRの箇所で説明した方法と同様に行った。

2. 結果

2- 1. ァレイ CGH分析

BAC/PAC クローン 1，966種類からなるアレイ CGH を、正常男性と正常女性を比較して調査し、常染色体に由来する信号の log₂比はほとんどが +0.2 から -0.2 の範囲にあることを示した（図 8A) 。コピー数変化の線形性については、異なる数の X 染色体を有する細胞株を用いて調べた。図 8B に示すように、それぞれ計算された平均蛍光比率をプロットした結果から、蛍光比は一つのコピー数の変化に比例することが示された。 4 種類の細胞株（Karpas 1718、 Rec l、 OCI-Ly4、 OCI-Ly7) と 1例の DLBCL患者（D778) を調べるために用いたァレイ CGH によって、 13q31-q32 にコピー数変化の高度な増加が見られることが判った。図 9Aには、 Karpas 1718に関するアレイ CGHの代表的な結果を示している。 3種類の細胞株（Karpas 1718、 Recl、 OCI-Ly7) ならびに 1例の DLBCL患者 (D778) より得られた第 13染色体に関する詳細な結果は、図 8B に示している。従来の CGHならびに FISH分析により、これらのアレイ CGH デ一夕が明確に確認された（図 9) 。

2-2. 13q31-q32における共通増幅領域

13q31-q32 における単位複製配列を絞り込むため、 3種類の細胞株（Karpas 1718、 Reel , OCI-Ly4) について、 13q31-q32 に位置する 19BAC/PAC プローブ（図 10A) を用いて FISH分析を実施したところ、 13q31-q32での共通増幅領域は、 RP11-29C8 と RP1 1-93M 14 の間に位置することが判明した。高分解能アレイ CGH データは図 10B に示している。 Karpas 1718 と D778 (DLBCL患者試料）では、第 13q染色体に 50Mb を超える広範囲の増幅が見られた。高レベルの増幅（log₂比> 1 として定義）を示す小規模なゲノム領域が 13q22.2力ら 13q31.3 まで伸長しており、ここで特に 13q31.3 の領域は 2 を上回る、比較的高い log₂比を示していた。同様に、 OCI-Ly7 と Reel もやはり高レベルの増幅を示し、それは 13q31.3 に限定されていた。これらの結果から、高レベルの共通増幅領域は RP11-360A9から RP1 1-481A22 まで伸長していることが明らかになった。この FISH ならびにアレイ CGH の結果をもとに、 RP11-360A9 と RP11-93M 14 の間のゲノム領域を、 4種類の細胞株と 1 例の DLBCL患者における共通かつ最少の増幅領域として規定した。 2-3. 染色体 13q31.3の ESTsに関する RT-PCR分析

65種類の ESTs と GPC5 は 13q31.3 の共通増幅領域に位置しているが、これらの発 Sについて、 3種類の細胞株（Karpas 1718、 OCI-Ly4p、 Reel) ならびに胎児脳に由来する cDNA を用いて、 RT-PCR解析を行った。 RT-PCR産物をゲル電気泳動により調べた。陽性シグナルが見られる場合に、予想サイズのバンドが検出されたと定義した。その結果のまとめを表 8 に示す。 30 種類の ESTs と GPC5が予想サイズのバンドを示し、これらは 13q31.3 の増幅が見られる 3 種類の細胞株全てにおいて陽性であることが判明し、またそれらをヌクレオチド配列により確認した。 15 種類の ESTs も同様に予想サイズを示したが， RT-PCR '分析ではわずか 1 または 2種類の細胞株でしか示されず、そのためこれらは、 13q31.3 における増幅に関連する候補 ESTsより除外した。残った 21 種類の ESTs は OCI-Ly4 と胎児脳のいずれにおいてもパンドを全く示さなかつた。これらについて、同様に他のプライマセットを用いて調べたが、やはりバンドが検出されなかったため、これらも候補 ESTsより除外した。このようにして- 65種類中 35種類の ESTsを除外し、以後の分析を行わなかった。 2-4. ノ一ザンブロット処理

30種類の ESTs と GPC5の発現パターンを同定するため、ヒト胎盤である 6 種類の RNAs、 13q31.3 増幅を示す 3 種類の B 細胞リンパ腫細胞株（Recl、 Karpas 1718、 OCI-Ly4) 、 13q31.3増幅を示さない 2種類の T細胞リンパ腫細胞株（Jurkat、 ATN- 1 ) について、ノーザンブロットを用いた。 22 種類の ESTs については、全ての細胞株においてほとんど検出可能なバンドが見られなかった（表 9) 。図 1 1 に代表的な ESTsの発現パターンを示す。 AF339828 と BC040320では、約 6kbの転写産物と 6kbより大きなスメァ状のバンドによる同様な発現パターンが見られた。信号が観察されたのは 3 種類の B細胞リンパ腫細胞株のみであり、ヒト胎盤や T 細胞株では観察されなかった。 GPC5 は 13q31-q32 における共通増幅領域の内部に不完全に含まれる遺伝子であるが、これは全ての細胞株とヒト胎盤において、約 5kb の転写産物の弱い発現を同様な強度で示した。他の ESTs の 13q31.3 におけるコピー数に関しては、細胞株とヒト胎盤を比べてなんら違いが見られなかった。そのため、 AF339828 と BC040320を 13q31.3 における増幅に関する最も可能性の高い標的遺伝子であると考えた。 2種類の ESTsを用いて、患者試料や正常組織を含む各種試料に対する研究をさらに行い、また 13q31.3 増幅に関する標的遺伝子であると報告されている GPC5についても調べた。

BC040320 プローブを用いたノ一ザンブロットの結果を図 12 に示す。 13q31-q32 における増幅を示す細胞株 5 種類（Rec l、 Karpas 1718、 OCI- Ly4、 OCI- Ly7、 OCI-Ly8) において、高レベルの BC040320 発現が観察された。この 5 種類の細胞株の場合より低レベルの発現が、増幅の見られない 3 種類の細胞株（Karpas 422、 SP49、 SUDHL6) で観察された。さらに、増幅を示す患者 2 例では、増幅を示さない他の患者 2 例と比較して高い発現が見られた。これらの結果から示されるのは、従来の CGH とアレイ CGHの両方により示されるコピー数の増加と並行して、 BC040320 の発現が生じていることである。同じ膜上で、 13q31 -q32での増幅を示す細胞株 5種類における GPC5の発現は、増幅を示さないそれ以外の細胞株の場合と顕著に異なることはなく、そのために GPC5 は候補遺伝子である可能性が低いと考えられる。また、各種造血性細胞株（T 細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄性白血病、 NK/T細胞リンパ腫）について BC040320 の発現パ夕一ンを調べた（図 14) 。高レベル増幅を示す 2 種類の細胞株と比較した場合に、一部の細胞株は弱いシグナルを示した。 GPC5 cDNAもやはり非常に弱いシグナルを示し、顕著な違いはなかったが、ある程度の変化があった。正常組織を調べた場合、肺、胸腺、リンパ節を例外として BC040320シグナルはほとんど観察できなかった（図 15) 。

結論として、それぞれのプローブを用いたノーザンブロットの結果から、 13q31-q32 におけるコピー数の増加と並行して BC040320 の発現が生じており、従って BC040320が候補遺伝子である可能性が最も高いことが判明した。 2-5. 候補遺伝子の全長、ゲノム位置、特徴決定

FISH, アレイ CGH、ノーザンプロット分析の結果をもとに、 AF339828 と BC040320 が可能性の最も高い候補遺伝子であるところまで絞り込んだ。これらの候補遺伝子を C13orf25 ( Chromosome 13 open reading frame 25) と命名したが、これは HUGO Gene Nomenclature Committee (http:/ /www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/) の勧告に従ってレる。

この遺伝子と cDNA構造の特徴をさらに調べるために、ここで BC040320のェクソン 1-ェクソン 4について RT-PCRを実施した。 2種類の転写産物を入手し、シーケンス分析により短いものが転写産物- A、長いものが転写産物- B であることが判明した（図 14) 。 Vega Genome Browserを用いたデ一夕ベース検索によれば、 bA121J7.2 (Vega— gene ID) もやはりこの領域に存在することが示された（http:/ /vega.sanger.ac.uk/) 。 32 アミノ酸（AA) からなるぺプチドが bA121J7.2であると予想された。またこの bA121J7.2 であると予想される 32-AAペプチドは、転写産物- Aであると予想された。さらに同じ開始コドンから、 70-AA のポリペプチドが転写産物- B であると予想された。また特筆すベき点として、 7種類の microRNAs (miRNA) (microRNA miR- 17 miR-91、 miR- 18、 miR- 19a、 miR-20、 miR- 19b、 miR-92) を含む、 5 .種類の前駆体 microRNAs (miR91-前駆体- 13 マイクロ RNA、 miR18-前駆体- 13 マイクロ RNA、 miR19a-前駆体-： 13マイク口 RNA、 miR19b-前駆体- 13マイクロ RNA、 miR92-前駆体- 13 マイクロ RNA) もやはり転写産物- B のシーケンス内に認められた（図 14) 。表 8

Table 8 RT^PCR analysis

BAG clones, EST and STS Marker was refered to the informaton obtained £rom Ensembl genome data resource. arpas

BAC EST/GENE STS Marker Forward primer Reverse primer FB' Heel m& OCI-Ly4

360ΑΘ AW664738 D13S1467 5'*gccacatggtcaggttaaac 5'*cttcactaccttgcgactct ND* ND

27D9 AA309162 5'-ggctctcatttagctaaat^ 5'-aagaagtggttgagacaaca + + +

15NS no EST

321E13 A 236754 D13S1175 5'- gagatggcacagcagttgaa 5'-tagttcaaactctacctgca ND D

447M23 no EST

370B1 LOG121723 5'-aactactggtga ggactgca 5'-caagttccccttctgcagaa ND ND

AW059B67 5'-aaggcttagctattatgctg 5'-ac3atgaggaaaa ctccca ++ ++ ++

275J18 BC042969 D13S1818 5'-ctggtcacacatccacaatg 5'-cagtggaaictgagtcctag ++ + + ++

AA628299 5'-cagaaggagtgttaagtctg 5'-caagaagaagctgccagtat ++ ■H- ++

143010 no EST

309H8 BG183515 D13SX239 5'-ctcatgactgtaatcccagc 5'-§tgatgccgtgaaatgagtc + + + +

BG191981 5'-ttcagtgacctcactgactg S'" gaggattttgcagtcatcgc ND ND -

114G1 LOC160824 D13S767 5'-aggttttgtcagccacacct B'-gaactatccgtaccttgtcc - ++ +

75N6 AA398228 5'-ctgtaccattgtgcccagaa S'-atgactcagtccttctggct ND ND -

86C3 no EST D13S265

51A2 no EST

18M3 no EST

388D4 LOC144774 5*-cactgtggcagttatacggt 5'-caatggttttccgcaccagt ND ND

LOC121727 S'-cctgggaaggatggtttctt 5*-ttacaacacaaggg gcacac + + ++

409J23 no EST

392A19 LOC121729 5''ggagccattact caagacc 5'-agaccagtac tgtccagct + ++ •H- ++

BG776186 5*-tggacacgtgagtgtgtttc 5'-atgagctcaggcagctctat + ++ +

LOC121728 5'-tgataggagacagacctgac 5'-tccagtcatcctgaggtaga ND D

5'-tcacacagtgtgactcacag 5'- tgatctcctctctgtagtgc

BG186078 D +

5'· acccaagggaatattgacac 5'-gaagctagggaagcagtatt

• AA487882 D +

S'-tgcagtaggtggcaatctca 5'-tcgacttggactccatgaga

BM542991 ND ND

5'-ccttggag gcttaaggtag S'-actagggctcfcttgtagacc

505P2 BM695971 D13S1234 ND ++

5'-gctgtgattgcgaagaagtg 5'-tccatatgtgagtgtggcag

158A& AI027278 ND +

5'-acgccaagctctBatacgac 5'ctcgggctatggtatatgac

BG927281 ND ND ++ ++ 丄

+ + ON

+ ++ 。3w。

O 。

+ Q

+ + + ON

++ +十 ++ W. ^

++ ++ ++ ON in si

++ ++ ++ ON osso^oos

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ON ON oss a ^

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+ + + ON oeiiseia 9LLVPl00n

2onx ^ 。

+ + + + ^ 。

^ :》

69

S0£ l0/ 00Zd£/∑Jd 8t9簡 SOOZ OAV AL70873 δ'-gtaatcccagcactttggga 5'-tcttgttcttgtcccccagt ND

5*-tacctgggtaaccaagactx: 5'-ctctgttcactgcattgaag

487A2 AF339802 D13S1490 ND

5'- tgttgaccgactgsgtgs&c 5'- ttatggtgaagtccttcccc

H56919 ND

5-cgtactctagagttaaccaa 5'-atgattgtaagttccctgag

AA705439 ND

S'-atcctcatttctca^ggct 5'-cctgtctgctctalgaagct

W86832 ND

5'-tggctgggcagaaatctgaa 5'-tacaggtctgttcgccacat

N49442 ND

5'-tccctagcaatgtgatgtac 5*-ctaaggtattcctaggctca

ND

5'-gtagtaggtagaactgtcct 5'-atctaccc cggcaattttc

T84913 ND BU656134 5'-tgctagggctggagtacaat S'-cattttctcttggctcaccc ND

5^T-ccagcaactg aatacatgc 5'-tcttcaaatccttgcctctg

93M14 AW105 49 ND

5'-acagccttctttggagaBtg 5*-tccaagggcacagtggaatt

AV75 6B1 ND

•Fetal Brain.⁶ Not Done. Detection of ¾ thin band or ^da thick band from the result of electrophoresis.

表 9

Table 9 Northern Mot analysis

Each signal of those ESTs and GPC-5 was visuall evaluated after one week expose.

Northern Blot

probe

BAC EST/gene sizeCkb)

Bize(bp)

placenta Reel Karpas 1718 OCI-Lv4 Jurkat

RP11-27D9 AA309162 130

RP11-370B1 AW059867 160

RP11-275J18 BC042969 440

AA628299 220

RP11-309H8 BG183515 440

RP11-U4G1 LOC16082 550

RP11-388D4 LOC121727 420

RP11-392A19 LOC121729 350 1.5

RP11-158A8 AA888411 300

RP11-432D3 LOC144776 500

RP11-430 10 BQ477741 240

BI481522 210 5.5

BU729287 46D

BM703078 470

LOC121734 240 0.8 ++ +++

BE466687 390

RP11-282D2 BC040320 400

RP11-121J7 A 339828 410

AA701926 240

BF908089 100

BX107378 420

AA599001 200

GPC5 600

AL043638 200

AL708734 250

RP11-487A2 AF339802 320 +/-

H56919 160

AA705 39 290 15 + ++ , +/· +/-

N49442 320 15 +++ +/- +/-

T84913 200

BU656134 390 3. 考察これまでに広範囲のヒト腫瘍について 13q の遺伝子変化が報告されていおり、これには造血性悪性疾患も含まれている。 FISH ならびに CGH を用いた近年の分子遺伝学的研究により、造血性悪性疾患では 13q31-q32 における増幅がしばしば検出されることが示されている。 B 細胞悪性疾患においては、 13q21- qter における増幅が頻繁に現れている（Rao， P. H. et al. Blood, 92: 234-240, 1998； Monni, O. et al. Genes Chromosomes Cancer, 21 : 298-307， 1998； Neat, M. J. et al. Genes Chromosomes Cancer, 32: 236-243, 2001； Mao, X. et al. Genes Chromosomes Cancer, 35: 144- 155， 2002) 。近年、 B細胞リンパ腫細胞株における 13q31-q32 増幅領域に対する候補遺伝子として、 GPC5の存在が提唱されている（Yu, W. et al. J Hum Genet. , 48: 331-335, 2003) 。今回の試験では、アレイ CGH を用いて GPC5遺伝子座のゲノム変異を、またノーザンプロットを用いて GPC5 の発現を調べた。 13q31.3 における 2Mb のゲノム領域中の GPC5 シーケンスは、おおよそ BAC、 RP1 1- 121J7 力、ら BAC、 RP1 1-268K13 までの範囲にわたっている。実施した Reel に関するアレイ CGHデータによれば、ェクソン 6 とェクソン 7 の間に存在する GPC5 のイントロンを位置付ける BAC、 RP1 1-481A22 の log₂比は、コピー数の減少を示していることが判った（log₂比 =-0.76) 。アレイデータの示すところによれば、この BAC のテロメァ側に位置する他の BAC も、やはり減少を示しているという。 GPC5のェクソン 3、ェクソン 4、ェクソン 5を含む新しい BACクローンである RP1 1-93M 14を用いて Reel に対する FISHを行ったが、そのデ一夕でもやはりコピー数の減少が見られた。これらの結果から GPC5 遺伝子座は、細胞株の 13q31-q32 における共通増幅領域内部に完全には含まれておらず，この対立遺伝子中の GPC5は機能していないこともない可能性が考えられる。ノーザンブロットにより同様に示されるところでは、 13q31-q32 の増幅を示す細胞株における GPC5 の発現は、増幅を示さない他の細胞株の場合と比べて有意差がなかった。一方、 BC040320 と AF339828 はいずれも 13q31-q32の増幅を示す B細胞リンパ腫細胞 *においてのみ発現しており、 13q31-q32 の増幅を示さない T 細胞リンパ腫ゃヒト胎盤などでは発現しなかった。これらの ESTs は 13q31-q32 における共通増幅領域に完全に含まれていた。ノーザンブロットを用いた詳細な分析から、 BC040320 の発現は、従来法ならびにアレイ CGH の両者により示されるコピー数の増加に、ほぼ並行して見られることが示された。ノーザンブロット分析により、 BC040320 は 13q31-q32 の増幅が見られる B 細胞リンパ腫細胞株において特に過剰発現しており、リンパ腫組織を含む正常組織ではほとんど発現していないことが示された。しかし 13q31-q32 の増幅が見られない SP49 (MCL 細胞株）や SUDHL6 (B 細胞リンパ腫細胞株）においても、 BC040320のわずかな mRNAの発現が見られることから（図 14) 、この発現はコピー数の増加によるものではなく、おそらくまだ完全に理解されていない他の理由により生じているのだろう。これらの結果から、 BC040320 が 13q31- q32 の増幅に対する候補遺伝子である可能性が最も大きいと考えられる。発明者らはこの候補遺伝子を C 13orf25 ( Chromosome 13 open reading frame 25) と命名した。

C13orf25 cDNAの妥当性を確認するために RT-PCRを行い、 2種類の転写産物（転写産物 - A と - B ) . が得られだ。 Vega ゲノムブラウザ (http: / /vega.sanger.ac.uk/) により bA121J7.2 という遺伝子の存在が予想されたが、これは転写産物- A cDNA内で 32-AAポリペプチドをコードしている。転写産物- B 中の可能性のある ORFも同様に予想され、これは同一の ATGから開始する 70-AAのポリペプチドをコードしている（図 14) 。 C 13orf25のゲノム構造は 3'側で不完全になっている可能性があるが、これは BC040320 と同一のハイブリダィゼーシヨンパターンを示す AF339828 力 C 13orf25 の近傍に観察され、 C 13orf25の 300-bp下流に位置しているためであった。 BC040320 を用いたノーザンプロット分析では複数のパンドが存在したため、各種トランスクリプ卜も同様に産生される可能性があつたが、しかし RT-PCR では主要な転写産物が示された。 NCBI BLAST (http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ) を用いたコンピュータ解析の結果から、 C13orf25 の予想タンパク質にはこれらのトランスクリプト中の推定ドメィンが含まれていないことが示された。

7 種類の microRNA (miRNA) (microRNA miR- 17、 miR-91 , miR- 18、 miR- 19a、 miR-20、 miR- 1 b miR-92) を含む、 5種類の前駆体 microRNAs ( miR91-前駆体- 13 マイクロ RNA、 miR18-前駆体- 13 マイクロ RNA、 miR19a-前駆体- 13 マイクロ RNA、 miR19b-前駆体- 13 マイクロ RNA、 miR92-前駆体- 13 マイクロ RNA) が転写産物- B のジーケンスから得られた。報告によれば、ヒト（Kawasaki, H., and Taira, K. Nature (Lond.) , 423: 838-842, 2003) ならびに C. eleganss し Lee, R. C. et al. Cell, 75: 843- 854, 1993； Reinhart, B. J. et al. Nature (Lpnd.) , 403: 901-906, 2000； Pasquinelli, A. E. et al. Nature (Lond.), 408: 86-89, 2000； Slack, F. J. et al. Mol Cell, 5: 659-669, 2000) における microRNAの機能は、標的遺伝子の発現を調節することでる。 A. thaliana において、 miRNAs はやはり mRNA の開裂を媒介してレる (Llave, C. et al. Science (Wash. DC) , 297: 2053-2056， 2002； Tang, G. et al. Genes Dev. , 17: 49-63, 2003) 。近年の Calin et al. の報告 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 15534- 15529， 2002) ίこよれ ¾、 1曼性リンパ性白血病と、 miR- 15 と miR- 16 に関する遺伝子を含む第 13染色体の節の欠失との間に関係があるという。 C13orf25遺伝子上にこれらの miRNAが存在することから、腫瘍発生過程に関する洞察が得られるであろう。

この実施例 2の試験では、 C13orf25が増幅に関する候補遺伝子として最も可能性が高く、 GPC5 はそうではないことを示すことができた。 C 13orf25遺伝子の発現はゲノム増幅に関連して生じ、腫瘍発生ならびにその結果生じる予後不良化に重要な役割を果たしている可能性がある。

7 種類の miRNAs を含む C 13orf25 の機能についてさらに調査を行うことによって、腫瘍発生に C 13orf25が果たす役割に関する洞察が得られることが期待される。

産業上の利用可能性以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、 DLBCL 患者の予後が正確に診断可能となる。この出願の発明は、医療関係分野や各種の試薬製造分野等の産業分野で利用可能である。

Claims

請求の範囲

1. CD5 陽性のびまん性大細胞型 B細胞リンパ腫（CD5+DLBCL) 患者と、 CD5 陰性のびまん性大細胞型 B 細胞リンパ腫（CD5-DLBCL) 患者の予後を診断する方法であって、それぞれのリンパ腫患者から染色体 DNA を単離し、この染色体 DNAにおいて、

( 1) 第 13 染色体 q21.1-q31.3 ( 13q21.1- 131.3 ) 領域の増幅がある CD5+DLBCL患者の予後は不良；

(2) 第 1 染色体 p36.21-p36.13 ( 1ρ36.21-ρ36. 13 ) 領域の欠失がある CD5+DLBCL患者の予後は不良；および

(3) 第 5 染色体 p l5.33-p l4.2 (5 p l5.33-p l4.2) 領域の増幅がある CD5- DLBCL患者の予後は良好、

と判定することを特徴とする方法。 2. 染色体領域を含む複数の DNA プローブと患者からの染色体 DNA とのハイプリダイゼーションによって染色体領域の増幅または欠損を測定する請求項 1の方法。

3. DNAプローブが BAC/PAC DNAクローンである請求項 2の方法。

4. ハイプリダイゼーションを固相単体上で行う請求項 2または 3の方法。

5. 請求項 4の方法に使用し、染色体領域を含む複数の DNA プローブを固相単体上に固定した DNAアレイ。

6. DNAプローブが BAC/PAC DNAクローンである請求項 5の DNAァレイ。

7. CD5+DLBCL 患者と、 CD5-DLBCL 患者の予後を診断する方法であつて、リンパ腫患者から生体試料を単離し、この生体試料において、 ( 1) 13q21. 1- 131.3 領域に含まれる遺伝子の発現増加がある CD5+DLBCL患者の予後は不良；

(2) Ip36.21-p36.13 領域に含まれる遺伝子の発現低下がある CD5+DLBCL 患者の予後は不良；および

と判定することを特徴とする方法。

8. 13q21. 1- 131.3領域に含まれる遺伝子が、以下の特徴：

(a) SEQ ID NO:4および SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードすること；および Zまたは

(b) 以下の前駆 microRNA：

以下の成熟 microRNA：

miR- 17, miR-91、 miR- 18、 miR— 19a、 miR-20 , miR- 19b および miR-92

を転写すること、

を有する遺伝子 C 13orf25である請求項 7の方法。

9. 遺伝子の発現増加または発現減少を、遺伝子転写産物を測定することによって判定する請求項 7の方法。

10. 遺伝子転写産物が mRNAである請求項 9の方法。

1 1. 遺伝子の全長または一部である DNA プローブと、遺伝子 mRNA または cDNA とのハイブリダィゼ一シヨンによって遺伝子の発現増加または発現減少を測定する請求項 10の方法。

12. 八ィプリダイゼーションを固相単体上で行う請求項 11の方法。

13. 請求項 12 の方法に使用し、 DNA プローブを固相単体上に固定した DNAァレイ。

14. 遺伝子転写産物がタンパク質である請求項 9の方法。

15. 夕ンパク質に特異的に結合する抗体を用いて遺伝子転写産物の増減を判定する請求項 1 4の方法。

16. 請求項 15の方法に使用する抗体。

17. SEQ ID NO:4および SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を認識する請求項 16の抗体。

18. 以下の特徴：

(a) SEQ ID NO:4および SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む夕ンパク質をコードすること；および/または

(b) 以下の前駆 microRNA：

以下の成熟 microRNA：

' miR- 17、 miR-91 > miR- 18、 miR— 19a、 miR-20、 miR- 19b および miR-92

を転写すること、

を有する遺伝子 C13orf24の精製ポリヌクレオチド。

19. 請求項 18 のポリヌクレオチドの一部連続配列からなり、遺伝子 C 13orf25 とストリンジェントな条件下でハイプリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。

20. 請求項 19のオリゴヌクレオチドプローブを備えた DNAアレイ。

21. 遺伝子 C13orf25 を PCR増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー。