WO2005007694A1

WO2005007694A1 - ＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドおよびその治療上の用途

Info

Publication number: WO2005007694A1
Application number: PCT/JP2004/010547
Authority: WO
Inventors: Kyogo Itoh; Shigeki Shichijo
Original assignee: Green-Peptide Co Ltd; Kurume University
Current assignee: Kurume University; BrightPath Biotherapeutics Co Ltd
Priority date: 2003-07-16
Filing date: 2004-07-16
Publication date: 2005-01-27
Anticipated expiration: 2006-01-16
Also published as: JPWO2005007694A1

Description

明細書

HER 2/n e uペプチドおよびその治療上の用途技術分野 '

本発明は、 HER 2/n e uの癌抗原ペプチドに関する。更に詳細には、本発明は、細胞性免疫ならぴに液性免疫を惹起できる HLA— A24または一 A2結合性 HER 2/n e uペプチド、およぴ該ペプチドを含有する癌ワクチン等に関する。背景技術

生体における免疫システムは、癌に対して重要な役割を果たしている。この免

(腫瘍免疫）では、細胞傷害性 T細胞（CTL) が強力なェフエクタ一として作用しており、腫瘍細胞内で産生された腫瘍抗原に対して応答して、長期間にわたって免疫を付与することができる。腫瘍抗原は特定細胞内で分解されて 8—1 1個のアミノ酸からなる抗原ペプチドとなり、これが主要組織適合性抗原であるヒト白血球抗原 (HLA) 分子と結合して腫瘍細胞表面上に提示される。このように HL A分子によって腫瘍細胞表面上に提示された寧いぺプチド配列は、 CTLによって認識される（Townsend. A.， et al. , Annu. Rev. Immunol. 7， 601-624, 1989)。つまり、 CTLは、この抗原ペプチドと H L Aとの複合体を認識して腫瘍細胞を傷害する。

HLAは、クラス I抗原とクラス I I抗原に大別される細胞膜抗原である。 C TLにより抗原ペプチドとともに認識されるのはクラス I抗原であり、ほとんど全ての有核細胞上に発現している。 HLAクラス I抗原はさらに HLA— A、 B、 Cなどに分類され、その遺伝子には多型が存在する。そのうちの HLA— A24 アレル（a 1 1 e 1 e) は日本人の約 60% (多くは、その 95%の遺伝型が A 2402である）、コーカサス人の 20%、アフリカ人の 1 ^%に、 HLA— A 2ァレルは日本人の約 40。/。、中国人の約 53。/。、北アメリカ白人の約 49 %、南アメリカ白人の約 38%、およびアフリカ黒人の約 23%にみられる。 HLA 分子は、様々な腫瘍抗原の抗原提示に決定的な役割を果たしているとの報告がなされている (Bauer, M. P. , et al. , in Histcompatibility Testing, ed.

Teraski. P. I. (Springer, Berlin) , p 955， 1980； McMichael, A. J. , et al. , J. Exp. Med. 152, Suppl. 2， 195—203， 1980； Wolfel. T. E.'， et al.， J. Exp. Med. 170， 797—810， 1989； Slovin, S. F. , et al. , J. Immunol. 137， 3042 -

3048, 1986； Schendel, D. J. , et al. , J. Immunol. 151， 4209-4220, 1993) 。したがって、 H L Aクラス I分子によって腫瘍細胞表面上に提示され、かつ、腫瘍特異的 C T Lによって認識される抗原べプチドを同定することは、癌免疫療法において癌ワクチンとして用いるペプチドワクチンの開発につながるものと考えられている（Peoples, G. Ε·， et al.： Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92,

432-436, Jan. 1995) 。

しかしながら、ペプチドワクチンとして使用できる可能性のあるヒト腫瘍関連抗原（T AA) は、 MAG E (melanoma antigen, メラノーマ抗原）などのわずかな例外を除き間接的にしか示されていない（van der Bruggen. P. , et al.， Science, 254, 1643-1647， 1-991) ₀ そのような遺伝子やペプチドを検出することは、力かる腫瘍免疫の存在を実証することになるが、メラノーマは残念ながら悪性腫瘍のわずか 3 %、また癌死亡率全体のわずか 1 %を占めるだけである

(Fraumeni, J. F. , et al. in Cancer: Principles and Practice of Oncology, eds. DeVita, V. T. , et al. , p. 154, 1993) 。

近年、特に乳癌の予後ならびに治療効果を予測する重要な因子として注目を集めているのが、 H E R 2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) である。この H E R 2はヒト上皮増殖因子受容体の 1つであり、その H E R 2遺伝子は、膜貫通型チロシンキナーゼ受容体をコードし、多くの固形癌、特に乳癌において高い頻度で過剰発現していることが認められている。この H E R 2の過剰発現が発癌性への形質転換を惹起し、細胞増殖の促進と調節異常をもたらすことが明ら力にされている。また、 H E R 2の過剰発現と予後との相関関係が、多くの臨床研究において報告されている。特に、乳癌における H E R 2の過剰発現は、乳癌の予後ならびに治療効果を予測する重要な指標として認識されている。

H E R 2の 1つである H E R 2 Z n e uは、上皮増殖因子受容体と高い相同性を有する 185キロダノレトンの膜貫通型チロシンキナーゼ受容体である

(Caussens, L. , et al. , Science, 230, 1132-1139, 1985， 1985； Yamamoto, T.， et al. , Nature, 319， 230-234， 1986) 。 HER2Zn e uは、様々な上皮腫瘍において発現が高く、特に結腸直腸癌においてはその原発部位ばかりではなく転移領域においても高発現している（Tanaka, H.， et al.， Brit. J. Cancer,

84(1), 94-99, 2001) 。更に、卵巣癌と乳癌の約 30ないし 40 %に過剰発現していると報告されている（Slamon, D. J.， et al. , Science, 244, 707 - 712， 1989) 。 HER2/n e uは、数多くの悪性腫瘍に高発現しているのに対して、正常細胞では発現していないか、または低レベルでしか発現していないことから、プロトタイプ TAAとして考えられており、癌免疫療法の強力な抗原候補となり得る。

日本人とコーカサス人に最も共通しているアレルの 1つでる HLA— A 24 に対する結合親和性を有するぺプチドの中から HER2Zn e uの CTLェピトープを同定したとの報告がある（Tanaka, H.， et al.， Brit. J. Cancer, 84(1), 94-99, 2001) 。この報告では、 HL A— A 24結合性 HER 2/n e uぺプチドであるコード HE1 (アミノ酸位置 8— 16) ： Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leuを、最も強い親和性を有し、 C T L誘導能を有するヮ'クチン候補べプチドとして同定している。他の HER 2/n e u由来 H LA— A 24結合性ぺプチドである HER 2 p 63 (A) ： Thr Tyr Leu Pro Ala Asn Ala Ser Leuおよび HER 2 p 63 (T) ： Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leuも、卵巣癌患者と健常人において CTLを誘導するとの報告がされている（Okugawa, T. , et al. , Eur. J. Immunol. , 000, 30； 3338—3346) 。 HL A— A 2結合性 HE R 2 /n e uペプチドも数多く報告されている（Peoples, G. E.， et al: : Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 92， 432—436， Jan. 1995； Fisk, B.， et al.， J. Exp. Med. , 181， 2109—2717， 1995； Ioannides et al. , Cell Immunol, 151:225,

1993； Peiper et al. , Eur J Immunol, 27: 1115， 1997； Brossart et al. , Can Res, 58: 732， 1998； Brossart et al. , Can Res, 58： 732, 1998； Anderson et al. , Clin Can Res, 6： 4192, 2000； Kono et al. , Clin Can Res, 8: 3394， 2002； Lee et al. , Anticancer Res, 22: 1481， 2002; Murray et al. , Clin Can Res, 8: 3407, 2002; Scardino et al. , Eru J Iramuno, 31： 3261, 2001； Scardino et al. , J Immunol, 168: 5900, 2002) 。

また、 HER2/n e u由来 HLA— A24結合性ペプチドのうち、 HER 2 /n e uタンパク質の膜貫通型膜部分からなるアミノ酸 9個のぺプチド（GP 2、アミノ酸位置 654— 662) が卵巣癌と乳癌の両者の HER 2 Zn e u陽性腫瘍細胞中で幅広く発現され、それを癌特異的に認識する C T Lが見い出され

(Peoples, G. E. , et al.： Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 432-436， Jan. 1995； Yamamoto, T. , et al. , Nature (London) 319， 230-234， 1986； Falk, et al. , Nature (London) 351, 290-296， 1991) 、 G P 2は癌免疫療法のぺプチドワクチンとして有用であろうと考えられている（Peoples, G. E. , et al.： Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 92, 432-436， Jan. 1995) 。 HLA— A2結合性 HER 2/n e uペプチド p 369-377 (p 369) を、癌免疫療法として、 HE R 2/n e uを過剰発現している転移性乳癌、卵巣癌または結腸直腸癌の H L A — A 2陽性癌患者に対して使用した事例も報告されている（Zaks， T.Z.， et al. , Cancer Res. 58， 4902-4908, Nov. 1, 1998) 。 '

以上のように、 H LA拘束性 CTLを誘導することができるいくつかの免疫原性を有する HER 2/n e uぺプチドがすでに報告されている。しかしながら、知る限りにおいては、これらのペプチドで誘導された CTLは、初期臨床試験において in vivoで腫瘍細胞を認識しなかった (zum Buschenfelde, C. M. , et al. , Cancer Res. 62， 2244-2247, April 15, 2002； Disis, M. L. , et al. , J. Clin.

Oncol. , 11, 3363-3367， 1997； Jager, E. , et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12198-12203, 2000) 。この失敗は、一部には、これらのペプチドの免疫原性が弱かつたことによると思われる。

抗腫瘍免疫応答においては、 C T Lのみならずヘルパー T細胞も決定的な役割を果たしている。ヘルパー T細胞と CTLの両方の応答を誘導することができる抗原ペプチドを同定し、それをワクチンとして導入できれば、癌免疫療法を効果的に実施できると考えられている。

かかる背景に基づいて、以下のような HER 2ノ11 e uペプチドが報告されている（Kobayashi, H. , et al. , Cancer Res. 60, 5228—5236, Sept. 15, 2000)。報告されているペプチド内の C T Lェピトープのアミノ酸配列を以下に示す（括弧内の数字は C T Lェピトープのァミノ酸開始位置を示す）： HER1124: Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro ; HER765 (768) ： Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro; HER822 (825) ： Trp Cys Met Gin lie Ala Lys Gly Met ; HER883

(888) ： Trp Met Ala Leu Glu Ser lie Leu Arg; HER765 (768) ： Leu Asp Glu

Ala Tyr Val Met Ala Gly; HER883 (886) ： lie Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser lie ; HER605 (608) ： Leu Ser Tyr Met Pro lie Trp Lys Phe ; HER62 (65) ： Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe ; HER648 (651) ： Leu Thr Ser lie lie Ser Ala Val Val。

H E R 2が乳癌などの多数の癌において高レベルで発現すことから、液性免疫と細胞性免疫におけるターゲットになりうるとの報告がなされている（zum Buschenfelde, C. M. , et al. , Cancer Res. 62， 2244-2247, April 15， 2002)。

H E R 2 / n e u抗原に対する細胞性および液性免疫応答は、相当の割合の乳癌ならびに卵巣癌患者に検出される (Peoples, G. E.， et al.： Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92， 432-436, Jan. 1995； Disis, M. L. , et al. , Cancer Res.， 54,

16-20, 1994) 。また、ヒト型化抗 H E R 2 / n e u抗体であるハーセプチンが、その腫瘍が H E R 2 / n e u抗原を過剰発現している乳癌患者において腫瘍を退縮させることが報告されている（Vogel, C. L.， et al. , J. Clin. Oncol. , 20, 719-726, 2002； Burstein, H. J. , et al. , J. Clin. Oncol. ,. 21， 46 - 53， 2003) 。

C T Lェピトープペプチドとして同定されたペプチドのいくつかが、第 1相臨床試験にぉレ、て細胞性ならびに液性免疫応答の両者を誘導する能力を有していることが (Mine, T.， et al. , Cancer Sci.， 94： 548-56， 2003) 、また細胞†生免疫応答ならびに液性免疫応答の両者を誘導することができるプチドが免疫原性を有するということが報告されている（Noguchi, Μ·， et al. , Prostate, 57：

80-92, 2003) 。その生物学的役割はまだ解明されていないが、ワクチン投与後の血清中の抗ぺプチド抗体のレベルがぺプチドワクチンを投与した進行肺癌患者の生存と非常によく相関していることが判明した（Mine, T. , et al. , Cancer Sci. , 94： 548-56, 2003) 。以上のことから、細胞性おょぴ液性免疫応答の両者を誘導する新規な HER 2 /n e uペプチドを同定することは、効果の高いペプチドワクチンの開発および癌免疫療法の発展に重要であろう。発明の開示

そこで本発明は、 HL A— A24または一 A 2拘束性に細胞傷害性 T細胞（C TL) によて認識され、 CTLを誘導し、かつ液性免疫を誘導する、ペプチドワクチンの新規候補として有用な HER 2/n e uペプチドを同定し、 HER 2 /n e u陽性癌患者に有効な癌免疫療法を提供することを目的としている。

本発明者らは、 HER 2Zn e u特異的な細胞性免疫および液性免疫応答を誘導する CTLェピトープペプチドを同定した。 HL A— A 24または一A 2結合性ペプチドに対する I gGが、試験した癌患者の血清中に高頻度に検出された。また、これらペプチドが該患者の末梢血単核細胞（PBMC) 中においてべプチド特異的および腫瘍反応性 C T L活性を誘導することを見出し、本発明を完成した。 '

即ち、本発明は、

( 1 ) 特異的な細胞傷害 ¾£T細胞を誘導し、かつ特異的な抗体を誘導する Η Ε R 2/n e uの HLA— A24または一 A 2結合性抗原べプチドを含むポリぺプチドまたは変異ポリぺプチド；

(2) 抗原ペプチドが HER 2₃₄₂_₃₅。（配列番号 1) 、 HER 2₄₈₅— ₄₉₃

(配列番号 2) 、 HER 2_{5 5 3}-56 i (配列番号 3) 、 HER 2₉₀₇-₉₁₅ (配列番号 4) 、 HER 2₄₄₄_₄₅₃ (配列番号 5) 、 HER 2₄₆₆— ₄₇₄ (配列番号 6) 、 HER 2₄₈₄_₄₉₃ (配列番号 7) 、 HER 2₇₈₅_₇₉₄ (配列番号 8) 、または HER 2₈₅₁— ₈₅₉ (配列番号 9) である、上記 (1) 記載のポリべプチド'；

(3) HER 2₃42- 35 o (配列番号 1) 、 HER 2₄₈₅— ₄₉₃ (配列番号 2) 、 HER 2₅₅₃-56 i (配列番号 3) 、 HER 2₉₀₇-₉₁₅ (配列番号 4) 、 HER 2₄₄4-453 (配列番号 5) 、 HER 2₄₆₆_₄₇₄ (配列番号 6) 、 HER 2₄₈₄— ₄ 93 (配列番号 7) 、 HER 2₇₈₅— ₇₉₄ (配列番号 8) 、または HER 2₈₅₁一 ₈₅ 9 (配列番号 9) である抗原ペプチド； '

(4) 上記 (1) または（2) 記載のポリペプチドまたは請求項 3記載の抗原ぺプチドをコードするオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもしくはその相補鎖である核酸配列分子；

(5) 上記（4) 記載の核酸配列分子を含有するベクター.；

(6) 上記（1) または（2) 記載のポリペプチドまたは上記 (3) 記載の抗原べプチドを特異的に認識する抗体。

(7) 上記（1) または（2) 記載のポリペプチド、上記 (3) 記載の抗原べプチド、または上記（4) 記載の核酸配列分子を含む、特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導し、力つ特異的な抗体を誘導するための医薬糸且成物；

(8) 癌を処置するための、上記 (7) 記載の医薬組成物；

(9) 上記（1) または（2) 記載のポリペプチド、上記 (3) 記載の抗原べプチド、または上記（4) 記載の核酸配列分子、によって特異的に誘導される H ER 2/n e u反応性細胞傷害性 T細胞； .

(1 0) HER 2_{34 35}。（配列番号 1) 、 HER 2_{48 493} (配列番号

2) 、 HER 2_{55 3}_56 i (配列番号 3) 、または HER 2_{9 915} (配列番号 4) である抗原べプチドと HLA— A24抗原との複合体を認識する H E R 2 / n e u反応性細胞傷害性 T細胞；

( 1 1) HER 2₄₄₄— ₄₅₃ (配列番号 5) 、 HER 2₄₆₆_₄₇₄ (配列番号 6) 、 HER 2_{484 493} (配列番号 7) 、 HER 2_{7 794} (配列番号 8) 、または HER 2₈₅₁ー₈₅₉ (配列番号 9) である抗原ペプチドと HLA— A2抗原との複合体を認識する HER 2 /n e u反応性細胞傷害性 T細胞；

( 1 2) 上記（ 2 ) 記載のポリぺプチドまたは上記（ 3 ) 記載の抗原べプチドを用い、 HER 2/n e u反応性細胞傷害性 T細胞を誘導する方法；

( 1 3 ) 上記（ 1 ) または（ 2 ) 記載のポリぺプチドまたは上記 ( 3 ) 記載の抗原ぺプチドを使用して癌を処置する方法；

( 1 4) 癌の処置における上記（1) または（2) 記載のポリペプチドまたは上記（3) 記載の抗原ペプチドの使用に関する。 '

また、本発明は、本発明の核酸配列分子、および/または個体由来の試料中の該ぺプチドもしくは該ポリべプチドをマーカーとして分析し、該ぺプチド関連疾病を診断する診断方法に関する。

本発明の HER 2/n e uぺプチドは、細胞性免疫ならぴに液性免疫によって認識され、またそれらを惹起するので、癌ワクチンとして、あるいは該ペプチド関連疾病の診断等に有用である。 ' 図面の簡単な説明

図 1は、乳癌患者（P t) 3名と女性健常者 (HD) 1名の血清中における H LA— A 24結合性モチーフを有する HER 27η e u由来ペプチドに反応する I g Gの検出を示すグラフ。

図 2は、吸収試験による抗ぺプチド I g Gのぺプチド特異性を示すダラフ。図 3は、 HLA— A24結合性ぺプチド刺激により誘導される MH C拘束性細胞傷害活性を示すグラフ。

図 4Aは、乳癌患者（P t) 6名の血清中における HLA— A2結合性モチーフを有する HER 27η e u由来ペプチドに反応する I g Gの検出を示すグラフ。図 4 Bは、吸収試験による抗ぺプチド I g Gのぺプチド特異性を示すグラフ。図 5Aは、 HLA— A2結合性ぺプチド刺激により誘導された C T Lの細胞傷害活性を示すグラフ。標的細胞として SKOV 3—A2およ SKOV 3— n u 1 1を使用。

図 5 Bは、 HLA— A 2結合性ぺプチド刺激により誘導された C T Lの細胞傷害活性を示すグラフ。標的細胞として SKOV 3—八2ぉょび3 0¥ 3— 1111 1 1を使用。

図 5 Cは、 HLA— A2結合性べプチド刺激により誘導された C T Lの細胞傷害活性を示すダラフ。標的細胞として 1— 8 7細胞株 (HLA-A2陽性）および QG 5 9 (HL A— A 2陰性）を使用。

図 5 Dは、 HLA— A2結合性ぺプチド刺激により誘導された C T Lの細胞傷害活性を示すグラフ。標的細胞として 1— 8 7細胞株（HL A— A 2陽性）、 Q G 5 9 (HLA— A2陰性）および P HA芽球化細胞を使用。

図 6 Aは、 HLA— A2結合性ぺプチド刺激により誘導された C T Lの MH C 拘束性および C D 8 +T細胞依存性。標的細胞として T 2細胞（H L A_ A 2陽性、 ATCC寄託番号： CRL— 1992) を使用。

図 6 Bは、 HLA— A2結合性ぺプチド刺激により誘導された C T Lの MH C 拘束性ならびに C D 8 + T細胞依存性、および C T Lのぺプチド特異的細胞傷害活性の確認。

図 7は、ウェスタンブロットによる各種細胞株における HER 2/n e uタンパク質の同定。

発明を実施するための最良の形態 .

(ぺプチドぉよぴポリぺプチド）

1. 本発明のペプチド

本発明の抗原ペプチドは、特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導し、かつ特異的な抗体を誘導する、 HER 2/n e uの HLA— A24または一 A 2結合性ぺプチドである。そのアミノ酸残基数は通常 8— 11個、好ましくは 9— 1 1個、より好ましくは 9個または 10個である。その例として、 HER 2₃₄₂_₃₅。（配列番号 1) 、 HER 2₄₈₅— ₄₉₃ (配列番号 2) 、 HER 2₅₅₃_₅₆₁ (配列番号 3) または HER 2₉₀₇一 ₉₁₅ (配列番号 4) 、 HER 2₄₄₄_₄₅₃ (配列番号 5) 、 HER 2₄₆₆_₄₇₄ (配列番号 6) 、 HER 2₄₈₄— ₄₉₃ (配列番号 7) 、 H ER 2₇₈₅— ₇₉₄ (配列番号 8) 、または HER 2₈₅₁— ₈₅₉ (配列番号 9) などが挙げられる。「HER 2₃₄₂_₃₅₀」とは、 HER 2/n e uの全アミノ酸配列のァミノ酸位置 342-350に相当するぺプチドを意味する。また、本明細書および図面において「HER 2₃₄₂— ₃₅。」は、そのアミノ酸配列開始位置の番号により「HER2/n e u 342」とも表記される。 HER2/n e uの全アミノ酸配列は受託番号 P 04626として Ge n e B a n kに登録されている（配列番号 10) 。

「特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導し、かつ特異的な抗体を誘導する」とは、特異的な細胞性免疫および液性免疫応答を誘導することを意味する。細胞性免疫および液性免疫応答の両者を誘導しうることから、高い免疫原性を有すると言える。また、本発明の抗原べプチドは、上記配列番号 1ないし 9のいずれか 1つの了ミノ酸配列で示されるぺプチドと、好ましくは約 70 %以上、より好ましくは約 80 %以上、さらに好ましくは約 90 %を超える相同性を有する変異べプチドであってもよレ、。このような相同性をもつペプチドは、少なくとも HL A— A 24 または H L A— A 2拘束性 C T Lによる認識性の強さを指標にして選択することができる。これらペプチドのアミノ酸数は、 HL A分子と結合して抗原提示細胞表面上に提示されうる数であり、かつ C T Lにより認識されェピトープぺプチドとしての性質を有する数であればよく、少なくとも約 8個以上、好ましくは約 9個以上、さらに好ましくは 9個ないし 10個である。

本発明の抗原べプチドを含むポリぺプチドは、通常ァミノ酸残基数 8 _ 50個、好ましくは 9— 30個であり、 111^ ー八24または：^11^八_ 2拘束性〇丁1^ による認識性の強さを指標にして選択される。含まれる抗原プチドは、 HER 2₃42-35 o (配列番号 1) 、 HER 2₄₈₅— ₄₉₃ (配列番号 2) 、 HER 2_{5 5 3}-5 e x (配列番号 3) または HER2₉。_{7 915} (配列番号 4) 、 HER 2₄₄₄— ₄₅₃ (配列番号 5) 、 HER 2₄₆₆_₄₇₄ (配列番号 6) 、 HER 2₄₈₄_₄₉₃ (配列番号 7) 、 HER 2₇₈₅_₇₉₄ (配列番号 8) 、または HER 2_{8 859} (配列番号 9) が特に好ましい。

本発明の変異ポリぺプチドは、前述のポリぺプチドと好ましくは約 70 %以上、より好ましくは約 80 %以上、さらに好ましくは約 90 %を超える相同性を有し、 HLA— A24または HLA— A2拘束性 CTLによる認識性の強さを指標にして選択されるポリペプチドである。 '

ァミノ酸配列の相同性を決定する技術はそれ自体公知であり、例えば、ァミノ酸配列を直接決定する方法、推定される塩基配列を決定後に該塩基配列に基づレヽてこれにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等を用いることができる。変異ぺプチドおよび変異ポリぺプチドには、本発明の抗原べプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列に対して、 1個ないし数個のアミノ酸を欠失、置換、付カロ、挿入した、あるいは誘発変異を有するアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。欠失、置換、付加、挿入などの変異あるいは誘発変異を導入する手段はそれ自体公知であり、例えばウルマーの手法などを利用することができる。さらに、本発明のぺプチドは、その構成ァミノ基もしくはカルボキシル基などを修飾するなど、機能の著しい変更を伴わない程度に改変することも可能である。

なお、本明細書において、「本発明のペプチド」と単に記載した場合、特記なき限り、本発明の抗原ぺプチドならびにポリぺプチドおよびそれらの変異ぺプチド、変異ポリペプチドを含んでいるものと理解すべきである。

本発明のぺプチドは、 HLA— A24または HLA— A2拘束性 CTLにより認識され、該 CTLを活性ィヒすることができ、腫瘍抗原としての機能を有する。本発明のぺプチドは、通常のぺプチド化学において公知の方法により製造することができる（ペプチド合成（丸善） 1975年； " Peptide Synthesis" , Interscience, New York, 1996； ihe Proteins ， ol. 2， Academic Press

Inc. , New York, 1976) 。

2. 本発明の抗原ペプチドの同定

本発明の抗原べプチドは、 HER2Zn e uのァミノ酸配列（配列番号 10 ) の一部に相当し、かつ HLA— A 24または一 A 2結合性モチーフを有する候補ペプチドの中から、液性免疫による認識およびペプチド特異的 CTLの誘導能に基づいて選択する。

液性免疫による認識は、 HER2/n e uの HLA— A24または一 A 2結合性ぺプチドに反応する I g Gが、乳癌患者の血清中に検出できるかどうかを調べることによつて検討することができる。ぺプチド特異的 I g Gは、血清サンプルについて、候補ペプチドを使用して EL I S Aにより測定する。ペプチド特異的 I gGは、血清サンプルを 0. 05%ツイーン 20—ブロックエース（登録商標、 MEGMI LK、日本）で連続的に希釈し、希釈血清をペプチド固定プレートに添加して、二次抗体としてラビット抗ヒト I gG (γ) 鎖特異的を用いて検出することができる。

ペプチド特異的 CTL誘導能については、初めに、 HER2/n e u陽性乳癌患者からの末梢血単核細胞（PBMC) を候補ペプチドと共に培養し、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対する、その PBMCの I FN— γ産生能を測定する。次に、上記の I FN— γ産生を示した PBMCについて、更に標準 6時間⁵¹ C rリリースアツセィにてペプチドパルス標的細胞に対する傷害性を測定してべプチド特異的 CTL誘導能を検討する。

3. 本発明のペプチドの選択

本発明の抗原べプチドの変異ぺプチド、本発明の抗原べプチドを含むポリぺプチドおよびその変異ポリペプチドは、 HLA— A24またはHLA— A2拘束性 CTLによる認識性の強さを指標にして選択することができる。 CTLによる認識性は、それらペプチドをパルスした標的細胞に対する、それらペプチドの基礎となる抗原べプチドに特異的な CTLの、 I FN—γ産生および細胞傷害 1"生により評価することができる。

(核酸配列分子） '

本発明の核酸配列分子は、本発明のペプチドのアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもしくはそれらに対する相補鎖であり、少なくとも約 24個以上の塩基からなる。核酸配列分子は、典型的遺伝子工学的方法に従レヽ、 ί列：ば Molecular Cloning ， 2nd ed.， Cold .Spring Harbor Laboratory Press (1989)のような標準的テキストの記載に従い容易に調製することができる。

本発明の核酸配列分子を含有するベクターは、遺伝子発現に常套的に用いられるべクタ.一に本発明の核酸配列分子を組み込んだものであり、プラスミドベクタ一およびウィルスベクターが含まれる。ウィルスベクターの例としては、レトロウィルス、アデノウイルス、アデノ関連ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクチニァウィルス、ボックスウィルス、ポリオウイルス、またはシンドビスウィルス等が挙げられる。

(HER 2/n e u反応性 CTL) .

HER2/n e u反応性 C T Lは、乳癌や卵巣癌などの患者から得た P B M C を、本発明のぺプチドまたは核酸配列分子を用いて CTLェピトープぺプチドを提示させた抗原提示細胞と共に培養することで誘導できる。 CTLの誘導は、前述のように I FN— γ産生おょぴ標準 6時間⁵¹ C rリリースアツセィにて確認する。誘導した HER2/n e u反応性 CTLは、本発明のペプチドの効能の測定ゃ、また、養子免疫療法にも利用可能である

従って本発明のぺプチドまたは核酸配列分子は、 CTL誘導剤として使用でき、また H E R 2 Zn e u反応性 C T Lの誘導方法に使用できるといえる。

(抗体）

本発明に係る抗体は、本発明のぺプチドを免疫学的に認識することができるものであって、本発明のペプチドの抗原決定基を利用し作製することができる。この抗原決定基は、少なくとも 5個、より好ましくは少なくとも 8— 1 0個のアミノ酸で構成される。このアミノ酸配列は、配列番号 1ないし 9に記載のァミノ酸配列と完全に相同である必要はないが、少なくともこのアミノ酸配列からなるぺプチドが、 C T Lによる認識性を有するものであることが必要である。

本発明の抗体は、本発明のぺプチドまたはその抗原決定基をアジュバントの存在または非存在下で、単独または担体に結合して、動物に対して液性免疫応答および/または細胞性免疫応答等の免疫誘導を行うことによつて産生することができる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されるものではなく、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等を使用することができる。免疫される動物としては、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ゥマ等が好適に用いられる。得られたポリクローナル抗体は、好ましくは免疫ァフィ二ティーク口マトグラフィ一法などのそれ自体公知の抗体回収法によつて血清から取得することができる。

一方、モノクローナル抗体は、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞を回収し、それ自体公知の永久増殖^細胞へ導入することによって生産することができる。このようにして得られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、精製用抗体、試薬、標識マーカー等として利用することができる。

(医薬組成物）

本発明に係る医薬組成物は、本発明のペプチド、核酸配列分子、ベクター、または抗体を、単独または複数組合せて利用することによって調製することができる。 '

具体的には、例えば、本発明のペプチドは、癌を処置するため、いわゆる癌ヮクチンとして使用することができる。本発明のペプチドによって処置することができる癌として乳癌、卵巣癌等があげられるが、特に乳癌が好ましい。

1種類のぺプチドのみでも癌ワクチンとして有効であるが、好ましくは複数種類のペプチドを組合せて使用するのがよい。癌患者の CTLは、複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であるので、 1種類のぺプチドを癌ワクチンとして使用するよりも、複数の異なる腫瘍抗原を組合せて癌ワクチンとして使用する方が、より高い効果が得られることが期待される。腫瘍抗原を組合せて使用する場合、本発明のぺプチドから選ばれるぺプチドを組み合わせて使用してもよい。

また、本発明に係る癌ワクチンは、細胞性おょぴ液性免疫の賦活のために、適当なアジュバントの存在または非存在下で、単独で使用するかまたは担体に結合して使用することができる。使用する担体は、それ自体人体に対して有害作用をおこさない限り、特に限定されるものではなく、例えば、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等を使用することができる。剤形としては、それ自体公知のぺプチド製剤の手段を応用して適宜選択できる。その投与量は、 CTLによる認識性により変化するが、一般的には活性本体として 0. O lmg〜：！ O OmgZ日 /成人ヒト、好ましくは 0. lmg〜l Omg/日/成人ヒトである。これを数日ないし数月に 1回投与する。 ·

本発明に係る医薬組成物は、例えば、ベクターに担持させて直接体内に導入する方法またはヒトから細胞を採取して体外で導入する方法などによつて利用することができる。使用できるベクターとしては、例えば、レトロウイルス、アデノウィルス、ワクシニアウィルス等が挙げられるが、レトロウィルス系が好ましい。無論これらウィルスは複製欠陥性である。その投与量は、 CTLによる認識性により変化するが、一般的には、上記抗原ペプチドをコードする DNA含量として 0. 1 μ g- 10 Omg/日/成人ヒト、好ましくは 1 μ g— 5 Omg 日成人ヒトである。これを数日ないし数月に 1回投与する。

以下、本発明を実施例によってより詳細に説明するが、本発明は下記実施例によって一切限定されるものではない。実施例

実施例 1

HLA-A24結合性抗原ぺプチド

(材料および方法） 1. サンプノレおよび細胞株

乳癌と診断された 17名の患者から血清、末梢血単核細胞（ P B M C ) および組織を採取した。これらの乳癌組織中での H E R2/n e uの発現程度を調べ、スコア 0と 1 +の癌組織を HE R2/n e uに対して陰性と判断し、他方スコ了 2および 3の癌組織を H E R 2 / n e uに対して陽性と判断した。また、 P B M

Cと血清を 9名の女性健常者 (HD) から採取した。全ての血清は一 80°Cで保存し、 PBMCは一 196°Cで凍結保存した。 HER 2 /n e uを発現するヒト卵巣癌細胞株 SKOV3 (HLA-A3/28) と、その HLA— A24 トランスフェクト SKQV3—A24は三重大学の好意により提供きれた（Okugawa et al.， A novel human HER2 - derived peptide homologous to the mouse Kd - restricted cytotoxic T lymphocytes in ovarian cancer patients and healthy individuals) 。 C I R— A2402 (HLA— 2402トランスフエクタント細胞株）は血液細胞白血病由来突然変異細胞株であり、熊本大学の好意により提供れ 7こ (Dr. Masafumi Takiguchi (Kumamoto University, Kumamoto, Japan _Λ 文献： Karaki S, et al. , HLA-B51 transgenic mice as recipients for production of polymorphic HLA_A， B-specif ic antibodies. Iramunogenetics, 37： 139-142, 1993. ) 。また、 PBMCからのフィトへマグルチニン（PHA) —芽球化 T細胞は、 C rリリースアツセィの標的細胞のネガティブコントロールとして使用した。

2. ぺプチド特異的 I g Gの定量

図 1に示される 10個のぺプチドは委託合成したものを使用した。具体的には、 HER 2/n e u由来ペプチドである HER 2₈— ₁₆、 HER 2_{6 3}一 _{7 1}、 HER 2₃₄₂— ₃₅。（配列番号 1) 、 HER 2_44Q— ₄₄₈、 HER 2₄₈₅— ₄₉₃ (配列番号 2) 、 HER 2₅₅₃-56 i (配列番号 3) 、 HER2₉。₇— ₉₁₅ (配列番号 4) 、 HER 2₉₆₈— ₉₇₆、 HER 2₁₀₂₂— ₁₀₃₀、 HE R 2 ₂丄 ₂— ₂₂₀を本実験に用いた。

そのうちで、 11£1 2₈ー₁₆と11£1 2₆₃— ₇₁とは111^ 一八24拘束性〇丁 Lによって認識されるぺプチドとして報告されている。被験者には H I Vキヤリァはいなかったので、 HLA— A24結合性モチーフを有する H I Vペプチド (RYLRDQQLL) をネガテイブコント口ールとして使用した。血清中のぺプチド特異的 I g Gレベルは、既報のように E L I S Aによって測定した（Ohkouchi, S. , et al. , Non-mutated tumor-rejection antigen peptides elict type - 1 allergy in the majority of healthy individuals. Tissue Antigen, 59: 259 -, 2002.、 Kawamoto N et al.， IgG reactive to CTL-directed epitopes of self- antigens is either lacking or unbalanced in atopic dermatitis patients. Tissue Antigens, 61: 352-361， 2003. ) 。 '

血清または血漿サンプルは、 0. 0 5%ツイーン 20_ブロックエース（ME GM I LK、日本）で連続的に希釈し、希釈血清（1ゥヱル当り 100 μ L) をぺプチド（1ウエノレ当り 2 0 μ g) 固相化 Nu n c C o v a 1 i n kプレートに添加した。抗体はゥサギ抗ヒト I g G (γ鎖特異的）を用いて検出した。

E L I S Αの感度限度を決定するために、 1 4名の健常者（H I V陰性）からの血清について、上記アツセィによって、ネガテイブコント口ールぺプチドとしての H I Vぺプチドの反応性を調べた。 E L I S Aによる光密度の平均士 S D値は 0. 04 0 ± 0. 0 3 0で示された。平均 +SD値（0. 0 7 0) をカットォフ値として決定した。血清サンプノレ中の抗ペプチド抗体活性の特異性を試験するために、血清サンプル（0. 0 5 %P B S Tで X 1 00倍希釈） 1 0 0 μ 1 ( 1 ゥエル当り）を、プレートウエル中の固相化ペプチド（1ゥエル当たり 2 0 μ _§ /m 1ぺプチド溶液で固相化）に 3 7でで 2時間静置し結合させた。この結合操作を 3度繰り返した後、 E L I S Aでその活性を試験した。

3. CTL誘導

HLA-A24陽性乳癌患者 8名と HLA— A24陽性健常者 5名からの P B MCを CTL誘導アツセィの対象として使用した。ペプチド特異的 CTLの誘導のために、既報のように（Ito， M. , S. Shichijo, Y. Miyagi, T. Kobayashi, N. Tsuda, A. Yamada, N. Saito, and K. Itoh. , Identification of SART3- derived peptides capable of inducing HLA-A2~r e s triced and tumor-specific CTLs in cancer patients with different HLA-A2 subtypes. Int. J. Cancer 88： 633， 2000. ) 、 P BMCを 9 6ゥエルミクロカルチャープレートのウエノレ中で各ぺプチド（ 1 0 M) を添加した I L— 2含有培地 200 μ Lを用いて培養した。 .

培養 14日目に、細胞を回収し、洗浄した後、対応するペプチドまたはネガテイブコントロールペプチド（上記 HI Vペプチド）をパルスした C 1 R— A 24 (HLA-A2402 c DNAをトランスフヱクトした、形質細胞性白血病由来変異細胞株（C 1 R) ) に応答する I FN— γ産生能について試験した。 18時間培養した後、培養上清を集めて EL I SAにて I FN—γを測定した。陽性応答を示す PBMCを回収して更に I L— 2だけと 10— 14日間培養して大量の細胞を得、標準 6時間⁵¹ C rリリースアツセィに付した。抑制試験のために、それぞれ 20 _δ/πι 1の抗 HLAクラス I抗体（W6/32、 I gG2 a) 、抗 HLA— A2抗体（BB7.2、 I g G 2 b) 、抗 CD 8抗体（Nu—T sん、 I gG2a) 、抗 HLAクラス II抗体（H— DR— 1、 I g G 2 a) 、抗 CD4抗体（Nu— Th/i、 I gGl) を用いた。抗 CD14抗体（JML— HI 4、 I g G 2 a) をコントローノレとして使用した。 Two-tailed Student' s -試験を用いて統計学的分析を行った。

(液性免疫によって認識されるペプチドの同定） '

HLA— A24結合性モチーフを有する HER 2/n e u由来ぺプチドに反応する I gGが乳癌患者（HER 2Zn e u陽性腫瘍の患者 13名と HER 2/n e u陰性患者 4名）と女性健常者（HD) 8名の血清中に検出できるかどうかを調べた。 .

その結果、ペプチド HER 2₃₄₂— ₃₅。、 HER2_{4S 5}— ₄₉₃、 HER 2₅₅₃-₅₆ い HER 2₉₀₇— ₉₁₅および HER 2₉₆₈— ₉₇₆に反応する有意レベルの I gGがそれぞれ 8名、 4名、 4名、 3名および 1名の HL A— A 24陽性乳癌患者から検出された。これら陽性の血清は、その腫瘍が免疫組織ィヒ学的試験により HER 2/n e u陰性であった 1例 (P t 10) を除いて、全て HER 2/n e u陽性腫瘍の患者由来のものであった。これに対して、残り 5種類のペプチド（そのうちの 2種類は HLA— A 24拘束性 CTLによって認識されると報告されている CTLェピトープペプチドである）に反応する有意レベルの I gGは全く検出されなかった。また、 8名の健常者のうち、 1名、 4名および 1名の血清からそれぞれ HER 2₆₃一 ₇₁、 11£1 2₃₄₂ー₃₅。と^1£1 2₅₅₃ー₅₆₁に反応する有意レべルの I g Gが検出された。

4例（P t 5、 9、 13および HD7) の代表的結果を図 1に示し、概要を表 1に示す。

HER2/neuぺプチドに対する液性および細胞性応答

HER2/neuぺプチドに対する応答 ( I J 産生 pg/iii l ) - /0D (450nm)

適剰発現

；

/_

/-

/ -

/- ；

/- ；一

し誘導

抗べブチド抗体

ァ産生能について各べブチドにっきゥルすつ試験した。値はゥヱルのうち最良の結果であり、ペプチド（性対照）に対するパックグラウンドの溼生を差し引いてある。

ベプチドをパルスし細胞と比絞して、対応べブチドをパルスした細胞に対して、〗以上の産生が察された場合にベブチド特異的しの誘導が成功したと判断した · 抗べブチドは. 実施に記載のようににより！?折し^, ' ' "

ブランク：測定せす

カットオフ値より低い値は—で示した。

抗ぺプチド I g Gのぺプチド特異性は吸収試験により確認した。その代表的結果を図 2に示す。抗 HER 2₅₅₃— ₅₆₁活性は、ネガティブコントロールとして使用した H I Vぺプチドを含む HL A— A 24結合性モチーフを有する無関係なペプチドによって吸収され、一方 HLA— B4601結合性モチーフを有する H I Vペプチドでは吸収されなかった。このことは、抗 HER 2₅₅₃_₅₆₁ぺプチド I g Gの、 HL A— A 24結合性モチーフを有するぺプチドに対する交差反応を示唆している。

これらの知見に基づいて、 HER 2₃₄₂一 ₃₅₀、 HER 2₄₈₅一 ₄₉₃、 HER 2₅ ₅₃一 ₅₆₁および HER 2₉₀₇一 ₉₁₅ペプチドおよび以前報告された CTLェピトープペプチド（HER2₈— ₁₆および HER 2₆₃— ₇₁ペプチド）について、 CTL 誘導能を試験した（CTL誘導能は、 10種類全部で行った；表 1参照）。

(細胞性免疫によって認識されるべプチドの同定）

乳癌患者 8名（H E R 2陽性腫瘍患者 6名と H E R 2陰性腫瘍患者 2名）および女性健常者（HD) 5名からの PBMCを 6種類のぺプチド（純度 90 %以 ί E丄 2₃42— 350、 H C Κ 2485-493 HLR ^ ₅53-'561 HE 29_{0 7}

- 915ペプチド、 HER2₈— ₁₆、 HER 2_{6 3}一 ₇₁ペプチドまたはコントロールとしての H I Vぺプチドとともにそれぞれ培養し、対応するぺプチドをパルスした C 1 R— A24細胞に応答した I FN— γ産生について試験をした。その結果も表 1に示している。

上記 8名の患者のうち、患者 1名と 2名において、それぞれ HER 2₈_₁₆ならぴに HER 2₆₃— ₇₁がペプチドに特異的な I FN— y産生を誘導した。また、患者 4名、 5名、 2名および 1名において、それぞれ HER 2₃₄₂— ₃₅。、 HE R 2₄₈₅— ₄₉₃、 HER 2₅₅₃— ₅₆₁および HER2₉。₇— ₉₁₅が、ペプチドに特異的な I FN— γ産生を誘導した。更にこれらペプチドのいくつかは、 2、 3名の健常ドナーにおいてもかかる活性を誘導した。

これらの P BMCによって産生された I FN— γのレベルは抗クラス I抗体 (W6/32) または抗 CD 8抗体によって有意的に抑制されるが、他の抗体によっては抑制されない。このことは、これらの CTL活性が HLAクラス I拘束性 C D 8陽性 T細胞によって担われていることを示唆している。更に、 311〇¥3_ 24細胞（HL A— A 24陽十生、 HER2/n e u陽性）を標的細胞として用いて⁵¹ C rリリースアツセィを行い、上記陽性応答を示す PBMCにおいて有意レベルの CTLが誘導されていることを確認した。一方、試験した全ての事例において SKOV 3細胞（HL A— A 24陰性、 HER 2陽性）および PHA—芽球化 T細胞（HLA— A24陽性）は傷害されず、このことはこれら細胞に対する C T Lが誘導されていないことを示している。 2つの事例（P t 1 0、 1 3) の代表的結果を図 3に示す。ネガティブコントロールとしての H I Vぺプチドで刺激した PBMCはかかる細胞傷害性を示さなかった。抗クラス I抗体による抑制試験により、この細胞傷害性の H L Aクラス I拘束性を確認した。

以上の結果より、ペプチド HER 2₃₄₂— ₃₅。、 HER 2₄₈₅— ₄₉₃、 HER 2₅ _{5 3}一 ₅₆₁および HER2₉。₇_₉₁₅を、細胞性免疫および液性免疫の両者を誘導可能な HLA— A 24結合†生抗原べプチドとして同定した。実施例 2

HLA-A2結合性抗原ぺプチド

実施例 1と同様の手法により HER2/n e uの HLA— A2結合性抗原ぺプチドを同定した。 .

表 2に示す 1 2種類のペプチド（HER 2₄₄₄— ₄₅₃ (配列番号 5) 、 HER 2₄₆₆_₄₇₄ (配列番号 6) 、 HER 2₄₈₄— ₄₉₃ (配列番号 7) 、 HER 2₇₈₅_₇

94 (配列番号 8) および HER 2_{85 1}— ₈₅₉ (配列番号 9) を含む）に対する抗体のスクリーニング結果を表 2に示す。また、 6例の代表的結果を図 4 Aに、ぺプチド特異性の確認の結果を図 4 Bに示す。複数の血清で認されたぺプチドに関する CTL誘導の結果は表 3に示す。なお、 HER 2/n e u 3 6 9は、 C TLが認識するコモンェピトープとして報告されているペプチドであり（Fisk et al. , ent ill cat ion of an immunodominant peptide of HER2/neu

protooncogene recognized by ovarian tumor-specific cytotoxic T

lymphocyte lines. J. Exp. Med. , 181: 2109-2117, 1995. ) 、本実験ではコントローノレとして用いている。表 2

HE 2/neu S

HER2/tieu

-f ]0g 4 4 4gg 4g 661 g5

Pt,2 Al 1/24 0.119 0,134

Pt.3 A226 0.099

Pt.^ A24 33 0.094 0,073 0.113 0.091 rt A2/21 0.205

Pt.6 A2/26 0.121 0.078 0.088 0.150 0.157 0.146 0.090 0.145 0.129 0.082 0.064

Pt.7 A2/24 iS D 0.133 ill ND 0.086 ND 0.167 ND ND ND

Pt.8 A2433 0.086 0.084 0.112 0.083 0.121 0.073 0.06/ 0.097

Pt.9 All/24 .087 0,105 0.163 0.123 0.132 0.109 0.112 0,171 0.078 0.075 0.079

RIO A2/24 ND 0.121 0.122 0.167 0.177 ND 0.109 ND 0.189 ND ND ND

Pt.ll A2/11 0.114

Pt.12 A2+/A24-

Pt.]3 A224 0.083 0.077 0.0S2

R14 A2/24 S 0.063 0.061 0.191 0.130

P 5 A24/26

PU6 A2/24 0.075 0.087 0.132 0.1 Π 0.100 0.136 0.146 0.315 0.085 O.OSS 0.076

PL17 A24/33 s 0.084 0.084 0.115 0.120 0.093 0.079 0.157 0.084 0.136

R18 A2

PU9 D 0.159 0.183 0.181 0.185 ND 0.143 ND 0.183 ND ND ND

Pt.27 A224 0.096 0.277 0.170 0.205 ND 0.075 ND 0.122 ND ND ND

Pl.31 A2 24 ND 0.332 0.324 0.413 0.296 ND 0.457 ND 0.414 ND ND ND

Pl35 A2/26 ND 0.158 0.301 0.276 0.437 ND 0.124 ND 0.271 ND ND ND

PUS A2+/A24- 0.119 0.076 W 0.064 ND 0.174 ND ND ND

Pt39 A2/11 0.108 0.327 0.203 W 0.252 ND 0.393 ND ND ND

4/15 9/23 13/23 15/23 12/23 9/15 15/23

26.7 39.1 56.5 65.2 52.2 60 65.2

HD1 A24/26

HD2 All/33

HD3 A26/31 0.106 · . - HD4

HD5 A2/24

HD6 A24

HD7 A24 0.064 0.074 - 0.073 - 0.100 - HD8 A2/26 • 0.102 - 0.094 0.094 0.127 0.138 0.108 0.213 . 0,074 . HD9 A24/33 0.080 - · - H 10 26 - · 0.062 0.181 0.195 0.Π2 0.144 0,132 0.261 0.086 0.184 0.072 HD11 N 0.117 0.134 0.191 0.183 ND 0.117 D 0.209 ND ND N HD12 A2/24 D 0.069 0.064 0.081 0.102 ND 0.062 ND 0.120 ND ND ND

0/10 3/12 3/12 4/12 4/12 3/10 2/10 7/12 1/10 3/10 1/10 0 25.0 25.0 33.3 33.3 30.0

20.0 5S.3 10.0 30.0 10.0

1 ： 1 0 0希釈血清の O Dが 0. 0 6以上だった場合に、対応ペプチドに反応する I g Gが陽性と判断した。

D：試驗せず表 3

HER2/neuぺプチド対する細胞性応答

ΐ™·γ¾

また、誘導された CTLのうち、細胞が増えた分について、 ⁵¹C rリリースアツセィ、および抗体おょぴコールド標的細胞による抑制試験を行った。 ⁵¹ C rリリースアツセィによる細胞傷害活性の結果を図 5に、抑制試験の結果を図 6 に示す。各種細胞株における HER 2 /n e uタンパク質の発現は図 7に示す。以上の結果より、ペプチド HER 2₄₄₄— ₄₅₃ HER 2₄₆₆— ₄₇₄ HER2₄ ₈₄— ₄₉₃ HER 2₇₈₅_₇₉₄、および HER 2₈₅₁— ₈₅₉を、細胞性免疫および液性免疫の両者を誘導可能な HL A— A 2結合性抗原ぺプチドとして同定した。産業上の利用の可能性 '

CTLェピトープペプチドに対して反応する I gGは、癌患者のワクチン投与前の血清中ならびに健常者の血清中にしばしば検出される。また、ワクチン投与後の血清中の抗ぺプチド抗体レベルは、ぺプチドワクチンを投与した進行肺癌患者の生存と深く相関関係を有していた。更に、これらのペプチドに反応する I g Gは、アトピー性疾患を有する患者の血清中では不足しているかまたはパランスを失っているかである。癌患者における抗腫瘍免疫応答のメ力 -ズムはいまだ明らかではないが、以上の結果は、これらペプチドに対する I gGが種々の疾患に対する宿主防御において役割を果たしていることを示唆している。

抗ペプチド I gGは、試験をした限りにおいては、ペプチドが由来したタンパク質には反応せず、またインビボ（in vivo) で腫瘍細胞の細胞増殖を直接阻害することも、腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞傷害活性を導き出すこともなかつた。したがって、本発明における抗 HER 2Zn e uペプチド I gGは、腫瘍細胞に対する直接的作用には役割を果たしていないようである。むしろ、これらの抗体は、腫瘍部位周辺の炎症反応の誘導を介して腫瘍部位に免疫適合細胞を浸潤させるのに関与していると考えられる。

本発明は、 HLA— A24または一 A2陽性ならびに HER 2/n e u陽性乳癌患者に対する HER 2/n e uペプチドをベースにした免疫療法に対して扉が新しく開くことができることが期待される。

Claims

請求の範囲

1. 特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導し、かつ特異的な抗体を誘導する HER 2/n e uの HLA— A24または一 A2結合†生抗原べプチドを含むポリぺプチドまたは変異ポリぺプチド。 ·

2. 抗原ペプチドが HER 2₃₄₂— ₃₅。（配列番号 1) 、 HER 2₄₈₅— ₄₉₃ (配列番号 2) 、 HER 2₅₅₃-56 i (配列番号 3) 、 HER 2₉₀₇_₉₁₅ (配列番号 4) 、 HER 2₄₄₄— ₄₅₃ (配列番号 5) 、 HER 2₄₆₆— ₄₇₄ (配列番号 6) 、 HER 2₄₈₄_₄₉₃ (配列番号 7) 、 HER 2₇₈₅_₇₉₄ (配列番号 8) 、または HER 2_{85 859} (配列番号 9) である、請求項 1記載のポリペプチド。

3. HER 2₃₄₂_₃₅。（配列番号 1) 、 HER 2₄₈₅— ₄₉₃ (配列番号 2) 、 HER 2_{55 3}_56 i (配列番号 3) 、 HER 2₉₀₇_₉₁₅ (配列番号 4) 、 HER

2₄₄4-453 (配列番号 5) 、 HER 2₄₆₆-474 (配列番号 6 ) 、 HER 2₄₈₄— ₄ ₉3 (配列番号 7) 、 HER 2₇₈₅_₇₉₄ (配列番号 8) 、または HER 2₈₅₁_₈₅ 9 (配列番号 9) である抗原ペプチド。

4. 請求項 1または 2記載のポリぺプチドまたは請求項 3記載の抗原べプチドをコードするオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもしくはその相補鎖である核酸配列分子。

5. 請求項 4記載の核酸配列分子を含有するベクター。

6. 請求項 1または 2記載のポリペプチドまたは請求項 3記載の抗原べプチドを特異的に認識する抗体。

7. 請求項 1または 2記載のポリペプチド、請求項 3記載の抗原ペプチド、または請求項 4記載の核酸配列分子を含む、特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導し、かつ特異的な抗体を誘導するための医薬組成物。

8. 癌を処置するための、請求項 7記載の医薬組成物。

9. 請求項 1または 2記載のポリペプチド、請求項 3記載の抗原ペプチド、または請求項 4記載の核酸配列分子によって特異的に誘導される HER 2/n e u 反応性細胞傷害性 T細胞。

10· HER 2₃42-35 o (配列番号 1) 、 HER 2₄₈₅— ₄₉₃ (配列番号 2) 、 HER 2₅₅₃_₅₆₁ (配列番号 3) 、または HER 2_{9 915} (配列番号 4) である抗原べプチドと HLA— A24抗原との複合体を認識する HER 2/n e u 反応性細胞傷害性 T細胞。

1 1· HER 2_{444 453} (配列番号 5) 、 HER 2₄₆₆_₄₇₄ (配列番号 6) 、 HER2_4S4_₄₉₃ (配列番号 7) 、 HER 2_{7 794} (配列番号 8) 、または HER 2₈₅₁_₈₅₉ (配列番号 9) である抗原ペプチドと HLA— A2抗原との複合体を認識する HER 2/n e u反応性細胞傷害性 T細胞。

12. 請求項 2記載のポリペプチドまたは請求項 3記載の抗原ペプチドを用い、 HER 2/n e u反応性細胞傷害性 T細胞を誘導する方法。

13. 請求項 1または 2記載のポリペプチドまたは請求項 3記載の抗原ぺプチドを使用して癌を処置する方法。

14. 癌の処置における請求項 1または 2記載のポリぺプチドまたは請求項 3 記載の抗原べプチドの使用。