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WO2005001117A1 - Ｗｔ１ワクチン適応患者の選択方法 - Google Patents

Ｗｔ１ワクチン適応患者の選択方法 Download PDF

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WO2005001117A1
WO2005001117A1 PCT/JP2004/009378 JP2004009378W WO2005001117A1 WO 2005001117 A1 WO2005001117 A1 WO 2005001117A1 JP 2004009378 W JP2004009378 W JP 2004009378W WO 2005001117 A1 WO2005001117 A1 WO 2005001117A1
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hla
tetramer
antigen
seq
vaccine
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Haruo Sugiyama
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Individual
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    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism

Definitions

  • the present invention relates to a method for selecting a patient highly responsive to WT 1 vaccine and a method for treating cancer including the same. More specifically, the present invention relates to a method for selecting a patient having high WT1 vaccine responsiveness using the frequency of WT! L-specific CTL precursor cells as an index.
  • the WT 1 gene (Wilms' tumor gene 1) has been identified as one of the causative genes for a pediatric renal tumor, Wi 1 ms fl (Cell 60: 509, 1990, Nature 343: 774, 1990) .
  • the WT1 gene encodes the transcription factor WT1, which is a cell growth factor. It plays an important role in differentiation, apoptosis, and the formation of ⁇ .
  • Methods for in vitro quantification of antigen peptide-specific CTL include the HLA monomer method, HLA dimer method, HLA tetramer method (Science 274: 94, L996), HLA pentamer method, ELISP0T method (J. Immunol. Methods 110 29, 1988), real-time RT-PCR method (J. Immunol. Methods 210: 195, 1997), limiting dilution method (Br. J. Cancer 77: 1907, 1998), etc. are known.
  • HLA-tetramer consists of HLA CK chain and 2 microglobules
  • the complex (HLA monomer) in which burin is associated with the peptide is made into a tetramer by piotination and bound to fluorescently labeled avidin.
  • the frequency can be determined.
  • the HLA monomer method, HLA timer method, and 3 ⁇ 4 LA pentamer method can also measure the frequency of CTL based on the same principle.
  • CTL precursor cell precursor cell
  • the frequency of CTL progenitor cells for a specific cancer antigen is high, specific CTLs are efficiently induced when the antigen is administered as a cancer vaccine, and it is likely that the response by cancer vaccine therapy will be easily obtained. .
  • it is possible to select patients with a high frequency of CTL precursor cells specific for a particular cancer antigen before vaccine administration it will be possible to perform more effective treatment using that cancer antigen. Become.
  • An object of the present invention is to provide a method for selecting a patient having a high WT 1 -actin response t life, using the frequency of WT 1-specific C T L progenitor cells as an index.
  • WT1-specific CTL progenitor cells were found to exist. From this, it was clarified that the cancer antigen WT1 can be used to select patients with high WT1 vaccine responsiveness and to identify target molecules of the WT1 vaccine, using the frequency of WT1-specific CTL progenitor cells as an index. In addition, the frequency of revision 1-specific CTL precursors is high in patients with various cancers as described above. Therefore, it became clear that cancer can be diagnosed using the frequency of WT1-specific CTL progenitor cells as an index.
  • WT1-specific CTL progenitor cells were functionally subdivided, and among them, effector type CTL progenitor cells (hereinafter also simply referred to as effector cells) account for a high proportion. It was. Therefore, using the frequency of WT1-specific effector-type CTL progenitor cells as an index, it was revealed that WT1 ⁇ ctin responsiveness is high, and that patients can be selected and diagnosed for cancer.
  • P-monthly patients measured the frequency of WT1-specific CTL in patients undergoing treatment with WT1-derived cancer antigen peptides, and found that the increase in CTL frequency after peptide administration and treatment after peptide administration. We found that the effect is correlated.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • the frequency or amount of WT 1-specific CTL progenitor cells can be determined using the HLA monomer method, HL A dimer method, HL A tetramer method, HL A pentamer method, ellispot method, real-time RT-PCR method and limiting dilution.
  • the selection method according to (3) comprising:
  • step described in (4) above (c) is performed by measuring the proportion of HLA tetramer-binding cells in the CD8 positive or CD8ZCD3 positive CTL progenitor cells. ) The selection method described;
  • WT 1-derived cancer antigen peptide is Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn
  • HLA monomer method, HLA dimer method, HLA tetramer method, HLA pentamer method, eryspot method, real-time RT-PCR and real-time RT-PCR are used to measure the frequency or amount of WT 1-specific effector-type CTL progenitor cells.
  • Cancer antigen peptide derived from WT 1 is Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3) ⁇ Arg Met Phe Pro (13) or selected from Asn Ala Pro Tyr Leu (No. 4) and Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (SEQ ID NO: 5)
  • a method for diagnosing cancer including
  • the frequency or amount of WT 1-specific CTL progenitor cells can be determined using the HLA monomer method, HL A dimer method, HL A tetramer method, FiL A pentamer method, Erispot V method, real-time RT—PC R
  • the step described in (20) above (c) is carried out by measuring the ratio of HLA tetramer-binding cells in the CDL-positive or CD8 / CD3-positive CTL progenitor cells described in (20) above Method of diagnosis;
  • the cancer antigen peptide derived from WT 1 is Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3), Arg Met Phe Pro Asn
  • WT 1-derived cancer antigen peptides are Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3), Arg Met Phe Pro Asn Ala (29) or selected from Pro Tyr Leu (No. 4) and Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (SEQ ID NO: 5)
  • a method for identifying a patient-specific WT1 vaccine target molecule comprising:
  • the frequency or amount of WT 1-specific CTL precursor cysts can be determined using the HLA monomer method, HLA dimer method, HLA tetramer method, HLA pentamer method, ellispot method, real-time RT—PC R
  • HLA antigen which is a constituent of HLA monomer, HLA dimer, HLA tetramer or HL pentamer, is HLA-A24 antigen or HLA-A2 antigen;
  • WT 1-derived cancer antigen peptides are Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3), Arg Met Phe Pro Asn Selected from Ala Pro Tyr Leu (U number: 4) and Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (SEQ ID NO: 5);
  • a diagnostic agent for cancer comprising a HL monomer, HLA timer, HLA tetramer or H! LA pentamer containing a WT 1-derived cancer antigen peptide;
  • HLA antigen which is a constituent of HLA monomer, H and A dimer, HLA tetramer or HL A pentamer, is HLA-A 24 antigen or HLA-A 2 antigen;
  • WT 1-derived cancer antigen peptide is expressed as Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (J Number: 3), Arg (46) or selected from Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 4) and Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (SEQ ID NO: 5)
  • the step described in (53) (c) is carried out by measuring the ratio of HLA tetramer-binding cells in the CD8 positive or CD8ZCD3 positive CTL.
  • HLA antigen that is a component of the HLA tetramer is an HLA-A 24 antigen or an HLA-A2 antigen;
  • a cancer antigen derived from WT 1 Peptides are Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asm Leu (SEQ ID NO: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3),
  • the cancer antigen peptide derived from WT 1 is Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3), Arg Met Phe Pro Asn Selected from Ala Pro Tyr Leu ( ⁇ S ⁇ (J number: 4) and Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (guidance number: 5), (59) or
  • the present invention relates to a kit containing the clinical test agent according to any one of (59) to (61).
  • the present invention provides:
  • (c) determining whether the measurement result of (b) is higher than that of a healthy person, and determining a WT 1 ⁇ ctin responsiveness, selecting a patient with a high WT 1 ⁇ ctin responsiveness, Treating the selected patient with WT 1 or a cancer antigen peptide derived from WT 1; a method for treating cancer in the patient; and the selection method described in any of (2) to (16) above.
  • a method for treating cancer specific to the disease comprising administering a target molecule identified by a method for identifying a patient-specific WT 1 vaccine target molecule, and (34) to (40) Administering a target molecule identified by a method for identifying a patient-specific WT 1 vaccine target molecule, treating the patient-specific cancer;
  • Figure 1 is a graph showing the frequency of WT1-specific CTL progenitor cells in cancer patients and healthy volunteers.
  • the vertical axis shows the frequency of CTL precursors (progenitor cells).
  • blood cancer shows the results of HLA-A2402-positive rainbow organ malignant tumor patients
  • lung cancer shows the results of HLA-A2402-positive lung cancer patients
  • healthy people show the results of HLA-A2402-positive healthy people, respectively.
  • the present invention comprises the following steps (a), (b) and (c):
  • a method for selecting a patient having high WT 1 vaccine responsiveness, and a method for treating epilepsy in a patient selected by the method is provided.
  • the frequency is higher than before.
  • WT1-specific CTL progenitor cells exist. Therefore, patients with high WT1 vaccine responsiveness can be selected using the amount and frequency of WT1-specific CTL precursor cells as an index.
  • the skin test patient in step (a) refers to a patient suspected of having cancer or a cancer patient.
  • blood cancer such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer
  • patients with suspected solid cancers such as prostate cancer, uterine cancer, eclampsia cancer, ovarian cancer, or patients suffering from these cancers.
  • Preferred examples include patients suspected of having leukemia, myelodysplastic syndrome and lung cancer, or patients suffering from these cancers.
  • the biological sample isolated from the test patient in step (a) is not particularly limited as long as it contains CTL progenitor cells, but blood, lymph or cultures thereof, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from blood, Or a tissue infiltrated with T cells is exemplified.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the biological sample can be used as it is, or can be used after diluting or concentrating.
  • PBMC is preferably used, and the PBMC can be isolated by ordinary Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation.
  • any conventionally known method capable of measuring the presence frequency or amount of CTL may be used.
  • HLA monomer method HLA die
  • HLA tetramer method HLA pentamer method
  • elispot method real-time RT-PCR method
  • limiting dilution method any conventionally known method capable of measuring the presence frequency or amount of CTL.
  • the HLA tetramer method means that a complex (HLA monomer) in which an HLA antigen chain and] 32 microglopurin are associated with a target antigen peptide is biotinized and then bound to a fluorescently labeled avidin.
  • This is a method for detecting antigen peptide-specific CTL using the prepared HLA tetramer.
  • the CTL can be quantified by staining the antigen peptide-specific CTL with the HLA tetramer and praying with a flow cytometer.
  • Such a method for producing an HLA tetramer and a method for detecting CTL using the same are known, and can be carried out, for example, according to the method described in the literature (Science 274: 94, 1996).
  • the HLA monomer method is an antigen peptide-specific CTL using the HLA monomer (HLA antigen chain,] 32 microglobulin, biotin of an antigen peptide aggregate) used in the production of the HLA tetramer. It is a method of detecting.
  • HLA dimer method An HLA antigen ⁇ ; chain and Ig (immunoglobulin, for example, IgGl) are fused, and j32 microglobulin and antigen peptide are bound to the HLA dimer, and antigen peptide-specific CTL Is a way to detect
  • HLA dimer This bound antigen peptide-specific CTL can be detected, for example, by binding a labeled anti-IgGl antibody to IgGl.
  • the HLA pentamer method and the recently developed method were used to detect antigen peptide-specific CTLs using a pentamer in which 5 molecules of a complex of HLA antigen and antigen peptide were polymerized via the Coiled-Coil domain. It is a method to do. Since the complex of HLA antigen-antigen peptide can be labeled with a fluorescent dye, etc., it can be analyzed with a flow cytometer or the like as with the HLA tetramer method (http: ⁇ ⁇ . Pro immune, co. Uk / Reference, Teru)
  • HLA monomers, dimers, and tetramer opypentammers described above can be commissioned and synthesized, for example, by outsourcing to Prolramune or BD Biosciences.
  • the Elispot method is a method in which antibodies against cytokines such as IFN- ⁇ and GM-CSF produced by activated CTL are immobilized on a plate and stabbed with the target antigen or target antigen peptide.
  • cytokines such as IFN- ⁇ and GM-CSF produced by activated CTL
  • the CTL in the biological sample can be detected. It is a method of detection. Quantification of CTLs using the Elispot method is known and can be performed, for example, according to the method described in the literature (J. Immunol. Methods 110: 29, 1988).
  • Real-time RT-PCR is a method for measuring the amount of genes in IFN-T / and GM-CSF produced by activated CTLs by RT-PCR. This is a method for measuring the CTL frequency of the target antigen peptide reactivity. Methods for quantifying CTL using the real-time RT-PCR method are known, for example, the literature (J. Immunol.
  • the limiting dilution method is a method in which a biological sample containing CTL is seeded on a plate with varying cell density, cultured while stimulating with the target antigen or target antigen peptide, and the amount of cytokine produced by activated CTL is cytotoxic. This is a method to measure CTL frequency from the number of positive wells.
  • a method for quantifying CTL using the limiting dilution method is known, and can be performed according to the method described in the literature (Br. J. Cancer 77: 1907, 1998), for example.
  • the public arrowhead CTL quantification method as described above, the presence frequency or amount of WT1-specific CTL progenitor cells can be measured.
  • the determination of WT1 vaccine responsiveness in step (c) is based on the frequency or amount of WT1-specific CTL progenitor cells in the test patient obtained in step (b) (hereinafter referred to as the test patient value) that of healthy subjects. This can be done by comparing the (normal healthy person value) and determining the difference between the two. In this case, biological samples isolated and prepared from healthy individuals (blood, lymph fluid, PBMC, etc.) Force S is required, but these are obtained by collecting biological samples of people who are not affected by cancer. be able to.
  • “healthy person” refers to a person who has not been diagnosed with cancer.
  • the comparison between the test subject value and the healthy subject value can be performed by performing measurements on the subject biological sample and the healthy subject biological sample in parallel. If not performed in parallel, the average value of healthy persons obtained by measuring multiple (at least 2, preferably 3 or more, more preferably 5 or more) healthy human specimens under uniform measurement conditions Values or statistical intermediate values can be used for comparison. 2004/009378
  • the determination of whether or not the WT1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ctin responsiveness is high in the test patient can be carried out using as an index that the test subject value is 1.5 times or more, preferably 2 times or more, higher than the healthy subject value. That is, if the subject value is 1.5 times or more, preferably 2 times or more that of the healthy subject value, it is judged that the WT1 vaccine response is high. Patients who are judged to have high WT1 vaccine responsiveness are judged to be able to apply the WT1 vaccine, that is, the treatment with the WT1 vaccine can be successfully applied.
  • the HLA tetramer method is most preferable from the viewpoint of the ease and accuracy of the method. That is, as a preferred embodiment, the present invention provides a method for selecting and treating a breather with high WT1 vaccine responsiveness, characterized by using the HLA tetramer method.
  • the HLA monomer method, the HLA dimer method, and the HLA pentamer method are the same methods as the HLA tetramer method in principle, and are preferable CTL measurement methods. An example will be described.
  • the selection method for patients with high WT1 vaccine responsiveness using the HLA tetramer is as follows: Ingredients: The following steps (a), (b), (c) and (d):
  • step (a>) the “biological sample” and “test patient” in step (a>) are as described above.
  • HLA tetramer used in step (b) means that a complex (HLA monomer) in which a HLA antigen chain and 2 microglobulin are associated with a peptide (antigen peptide) is piotinated and bound to avidin. Refers to the tetramerization
  • the HLA tetramer is bound by a known ttl means such as flow cytometry or fluorescence microscope. It is preferable that the CTL progenitor cells are fluorescently labeled so that they can be easily selected or detected.
  • PE phycoerythrin
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • PerCP beridinine chlorophyll / reprotein
  • APC alophycosyanin
  • ECD phycoerythrin-one Texas red
  • HLA tetramers labeled with phycoerythrin cyocyanin 5.1 also referred to as PC5
  • the cancer antigen peptide derived from revision 1 used as a component of the HLA tetramer is derived from human WT1 (Cell, 60: 509, 1990, NCBI database Accession No. XP_034418, SEQ ID NO: 1) and is complexed with the HLA antigen. It forms a body and has HLA-restricted cystic T cell (CTL) induction (immunogenicity).
  • CTL HLA-restricted cystic T cell
  • the amino acid sequence of the cancer antigen peptide that can be bound has regularity (binding motif) for each type (Immunogenetics, 41, pl78, 1995, J. Immunol., 155: p4749, 1995).
  • the second amino acid among peptides consisting of 8 to 11 amino acids is tyrosine (Tyr), phenylarayun (Phe;), methionine (Met) or tryptophan (Trp).
  • the peptide derived from revision 1 as described above is modified to a part of its amino acid residue (including substitution, deletion, extension or addition (including addition of amino acids to the N-terminal and C-terminal of the peptide)) And preferably includes substitution of amino acid residues.
  • the substitution is preferably a substitution to an amino acid residue that can be taken on the motif.
  • WT1-derived peptides (including modified ones) as described above can be used in known cancer antigen peptide assembly methods (see, for example, W0 02/47474, Int J. Cancer: 100, 565-570 (2002)). By using this, a cancer antigen peptide derived from WT1 can be selected.
  • cancer antigen peptides derived from Amendment 1 include the following peptides:
  • the peptides described in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 are peptides that bind to HLA-A24 antigen and HLA-A2 antigen, and other peptides (SEQ ID NOs: 3, 5 6-18) are peptides that bind to the HLA-A24 antigen.
  • the cancer antigen peptide described in any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 can be mentioned.
  • the peptide can be synthesized according to a method used in normal peptide chemistry. Synthetic methods include literature (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins (The
  • the peptide may be a peptide in which the amino group of the N-terminal amino acid or the carboxyl group of the C-terminal amino acid is modified.
  • a modification group of the amino group of the N-terminal amino acid f, for example, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms having 1 to 6 carbons, a phenol group, a cycloalkoxide group, an acylol group, specifically, a carbon number 1 to 6 alkenyl groups substituted with a phenyl group, 1 to 6 alkanoyl groups substituted with a phenyl group, 5 to 7 carbons: a carbonyl group substituted with a T alkyl group, 1 to C atoms Alkylsulfonyl group of 6; phenylsulfonyl group; an alkoxycarbonyl group of carbon number 2 to 6; an alkoxy force substituted with phenol; a noreponinore group; a carboninoreole substituted with cycloalkoxy having 5 to 7 carbon atoms.
  • Examples of the modifying group of the carboxyl group of the C-terminal amino acid include an ester group and an amido group.
  • Specific examples of the ester group include a carbon number of 1 and a carbon number substituted with an alkenyl ester group having 6 carbon atoms or a phenyl group. Examples include 0 to 6 alkyl ester groups, cycloalkyl ester groups having 5 to 7 carbon atoms, etc.
  • Specific examples of amide groups include amide groups, 1 to 6 alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, and the like.
  • a substituted amide group an alkyl group having 0 to 6 carbon atoms substituted with a phenyl group, an amide group substituted with 1 or 2 carbon atoms, a 5- to 7-membered azacycloal containing a nitrogen atom of the amide group
  • Examples include amide groups that form cans.
  • the HLA antigen (alpha chain of HLA antigen), which is a component of the HLA tetramer, can be used with any subtype of HLA antigen: ⁇ but must use the same subtype as the subtype to be diagnosed or selected.
  • HLA antigens include HLA- ⁇ 24 antigens such as HLA- ⁇ * 2402, HLA-A * 0201, -A * O204, -A * 0205, -A * 020 ⁇ , etc.
  • HLA-A2 antigens, HLA-A * 2601 HLA-A26 antigen such as HLA- * 3101, HLA-A * 3303, HLA-A * l101 and the like.
  • HLA-A24 antigen HLA-A2 antigen
  • HLA-A26 antigen HLA-A26 antigen.
  • the base sequences and the amino acid sequences of these HLA antigens are known.
  • LA-A24 antigen Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995) and Genbank
  • the HLA-A2 antigen is disclosed in Genbank Accession No. M84379.
  • the HLA-A26 antigen is disclosed in Genbank Accession No. D14350. Therefore, based on the information of these known base sequences, the HLA antigen chain can be easily cloned by a conventional method such as PCR.
  • the ⁇ chain of the HLA antigen is preferably a soluble fragment in order to facilitate CTL binding and selection. Furthermore, for tetramerization by biotin-avidin binding, it is preferable that the C-terminus of the HLA antigen chain has a structure capable of biotinylation, that is, a biotin binding site is added. Masle.
  • HLA- ⁇ 2402 one of HLA- ⁇ 24
  • the positive primer 5,-CCATGGGCAGCCATTCTATGCGCTATTTTTCTACCTCCGT-3 '(SEQ ID NO: 19) and the reverse primer: -GGATCCTGGCTCCCATCTCAGGGTGAGGGGCTTGGGCAGACCCTC-3, sequence No. 20
  • the HLA-A * 2402 GenBank Acc. No.
  • M64740 expression plasmid is used as a saddle, By performing a PCR reaction, it is possible to obtain recombinant soluble HLA-A * 2402 a-chain cDM designed so that a specific lysine residue in the C-terminal tag can be biotinylated with the BirA enzyme.
  • the component of HLA tetramer; 3 2 microglobulin is preferably 3 2 microglobulin derived from human.
  • 8 2 microglobulin derived from this human is expressed as follows: Positive primer: 5,-CATATGATCCAGCGTACCCCGAAAATTCAG-3 '(SEQ ID NO: 21) and reverse primer: 5,-GGATCCTTACATGTCTCGATCCCACTTMC-3, (SEQ ID NO: 22 ), A human 2 microglopurin (GenBank Acc. No. ⁇ 0212 ⁇ 8) expression plasmid is used as a cocoon-shaped plasmid, and a PCR reaction is performed.
  • Avidin which is a component of the HLA tetramer, can be used with any conventionally known avidin, but is preferably fluorescently labeled in order to facilitate detection by flow cytometry, a fluorescence microscope, or the like.
  • Fluorescent color bans can be used without limitation, such as phycoerythrin ( ⁇ ), fluorescein isothiocyanate (FITC), peridinin chlorophyll protein
  • ECD Also referred to as ECD
  • PC5 Phycoerythrin cyocyanin 5.1
  • HLA a chain expression vector and i32 microglopurin expression vector are introduced into E. coli and mammalian cells capable of expressing the protein and expressed.
  • Escherichia coli eg ilBL21
  • the obtained monomeric HLA complex is mixed with an antigen peptide (WT1-derived cancer antigen peptide) to form a soluble HLA-peptide complex.
  • biotiny the sequence of the C-terminal part of the HLA chain in the HLA-peptide complex using the BirA enzyme.
  • An HLA tetramer can be prepared by mixing this piotinylated HLA-peptide complex with a fluorescently labeled avidin at a molar ratio of 4: 1.
  • step (b) protein purification by gel filtration or the like is preferably performed.
  • the step (b) is performed by bringing the HLA tetramer prepared as described above into contact with a biological sample (a biological sample containing CTL precursor cells isolated from a test patient).
  • the contact is preferably performed at 37 ° C.
  • the contact is preferably performed in a normal physiological buffer solution, for example, phosphate buffered saline (PBS) containing serum.
  • PBS phosphate buffered saline
  • step (b) the frequency or amount of WT1-specific CTL progenitor cells bound to the HLA tetramer is measured (step c).
  • the measurement may be performed using any conventionally known method.
  • the HLA tetramer is fluorescently labeled
  • the CTL progenitor cells bound to this HLA tetramer are fluorescently labeled. Therefore, the labeled CTL is detected or detected using a single cytometer, a fluorescent microscope, etc. Can be isolated.
  • the frequency of WT1-specific CTL progenitor cells bound to the HLA tetramer is: CD8 positive cells (CD8 positive [live CTL progenitor cells) or CD8 / CD3 positive cells (CD8 / CD3 positive CTL) It can be determined by measuring the ratio (frequency) of the HLA tetramer-binding cells to the progenitor cells.
  • the CD8-positive crescent can be labeled and detected using, for example, a fluorescently labeled mouse anti-human CD8 monoclonal antibody.
  • CD3-positive cells can be labeled and detected using a fluorescently labeled mouse anti-human CD3 monoclonal antibody.
  • the fluorescent dye used here must be different from the fluorescent dye used in the HLA tetramer. In other words, if the PE-recognized HLA tetramer is on the moon, it is necessary to distinguish between the fluorescent dyes, such as using FITC-labeled mouse anti-human CD8 monoclonal antibody and erCP-labeled mouse anti-human CD3 monoclonal antibody. .
  • HLA tetramer-binding cells when measuring the damage of HLA tetramer-binding cells to CD8-positive cells, for example, after contacting a labeled HLA tetramer with a biological sample, a FITC-labeled mouse anti-human CD8 monoclonal antibody is used. Add and react. Stained cells are analyzed with a flow cytometer or fluorescence microscope.
  • CD8 + CD8 + -Option, and a numerical value obtained by subtracting the percentage of proportion force et negative control ⁇ avidin positive 'cells (CD8 + avidin +) of tetramer positive cells among the (CD8 + tetramer +), WT1 antigen peptide singular specific CTL precursors Can be the proportion of cells (below):
  • CD3-positive / CD8-positive cells When measuring the ratio of HLA tetramer-binding cells to CD3-positive / CD8-positive cells, for example, after contacting an E-labeled HLA tetramer with a biological sample, FITC-labeled mouse anti-human CD8 monoclonal antibody and PerCP-labeled mouse anti-antibody Add additional human CD3 antibody to react, and analyze the stained cells with a flow cytometer or fluorescence microscope. Select CD3-positive and CD8-positive cells (CD3 + CD8 + ), and determine the proportion of tetramer-positive cells (CD3 + CD8 + tetramer + ) among them.
  • the WT1 vaccine responsiveness is determined. Specifically, the frequency or amount of WT1-specific CTL progenitor cells obtained in step (b) in the test subject (hereinafter referred to as the test patient value) is the same as that of the healthy subject (healthy subject value)] This can be done by judging the difference between the two. In this case, isolated from healthy people. Prepared raw materials (blood, lymph fluid, PBMC, etc.) are required, but these can be obtained by collecting the biological materials of people who do not suffer from cancer.
  • the term “healthy person” as used herein refers to a person who has not been diagnosed with cancer.
  • the comparison between the test subject value and the healthy subject value can be performed by performing measurements on the subject biological sample and the healthy subject biological sample in parallel.
  • X / a healthy person obtained by measuring multiple (at least 2, preferably 3 or more, more preferably 5 or more) healthy biological samples under uniform measurement conditions
  • Average values or statistical intermediate values can be used for comparison.
  • Whether or not the WT1 vaccine responsiveness is high in the test patient can be determined by using as an indicator that the test subject value is 1.5 times or more, preferably 2 times or more that of the healthy subject value. That is, if the subject value is 1.5 times or more, preferably 2 times or more that of the healthy subject value, it is judged that the WT1 vaccine response is high. Patients who are judged to have high WT1 vaccine responsiveness are judged to be able to apply the WT1 vaccine, that is, the treatment with the WT1 vaccine can be successfully applied.
  • the method for selecting patients as described above can be used not only for diagnosis of patients before administration of acupuncture but also for diagnosis and confirmation of efficacy after treatment with acupuncture.
  • the present invention also provides the following steps (a), (b) and (c):
  • a method for selecting a patient having high WT 1 vaccine responsiveness, and a method for treating cancer in a patient selected by the method is provided.
  • effector cells refer to CTL precursors that are CD 4 5 RA positive and CD 2 7 negative.
  • the frequency of the effector cells can be determined by measuring the ratio of the positive 0 4 5 RA positive power and CD 2 7 negative cells in the progenitor cells.
  • CD 4 5 RA in CTL progenitor cells in contact with 5 RA antibody and anti-CD 27 antibody, CD 8 positive or CD 8 ZC D 3 positive and HLA tetramer positive
  • CD 8 positive or CD 8 ZC D 3 positive and HLA tetramer positive By measuring the percentage of positive and CD 27-negative cells, it can be determined.
  • CM5RA positive cells are, for example, fluorescently labeled mouse anti-human CD45RA
  • a labeled antibody can be detected using a null antibody.
  • CD27 positive cells can be labeled and detected using, for example, a fluorescently labeled mouse anti-human CD27 monoclonal antibody.
  • the fluorescent dye used here must be different from the fluorescent dye used in the HLA tetramer, anti-CD8 antibody, or anti-CD3 antibody.
  • the specific method for measuring the progenitor cell can be performed in the same manner as the selection method using the presence frequency and quantity of CTL progenitor cells as an index.
  • the method for selecting patients with high responsiveness to cutin can also be applied to the diagnosis of cancer. That is, in the present invention, the frequency of WT1-specific CTL precursor cells is higher in patients such as hematopoietic malignant tumors and lung cancer patients than in healthy individuals. I put it out. Therefore, cancer can be diagnosed using the frequency of WT1-specific CTL progenitor cells or the frequency of WT1-specific effector-type CTL progenitor cells as an index. Cancers that can be diagnosed here include leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant linno. Hematological cancer such as tumor, stomach cancer, colon cancer, lung cancer,? Examples include solid cancers such as L cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, and ovarian cancer. Preferred examples include leukemia, myelodysplastic syndrome and lung cancer.
  • the present invention also provides the following steps (a)-(d):
  • a method for identifying patient-specific WT 1 vaccine target molecules is provided.
  • cancer patients before vaccine administration have a high frequency
  • WT1-specific CTL progenitor cells exist. Therefore, patient-specific WT1 vaccine target molecules (therapeutic target molecules) can be identified using the frequency of WT1-specific CTL progenitor cells as an index.
  • the identification method of the target molecule as described above is effectively used to identify a therapeutically optimal target molecule (antigen peptide) for a patient judged to have high WT1 vaccine responsiveness.
  • This method is carried out by measuring the presence frequency or amount of WT1-specific CTL progenitor cells by the method or limiting dilution method.
  • the HLA monomer method, HLA dimer fe, HLA tetramer method, and HLA pentamer method are used.
  • the HLA tetramer method will be described as an example.
  • the HLA tetramer method involves the following steps (a), (b), (c) and (d): (a) isolating a biological sample containing CTL progenitor cells from a test patient;
  • a plurality of HLA tetramers containing candidate 1-derived cancer antigen peptides are produced. Then, each HLA tetramer is brought into contact with a biological sample isolated from the subject patient, and the presence frequency or amount of correct 1-specific CTL progenitor cells bound to the HLA tetramer is measured. The measurement results for each HLA tetramer were compared, and the cancer antigen peptide contained in the HLA tetramer that showed the highest value (ie, the cancer antigen peptide most easily recognized by CTL) was the target for WT1 vaccine treatment for that patient. Identifies the molecule as a patient-specific target molecule.
  • the cancer antigen peptide used here may be any cancer antigen peptide derived from WT1, and examples thereof include the cancer antigen peptides described in SEQ ID NOs: 2 to 18.
  • the cancer antigen peptide described in any one of SEQ ID NOs: 2 to 5 is used.
  • a target molecule capable of treating a patient-specific cancer is identified.
  • a pharmaceutical composition for a patient for treating a patient specific cancer comprising a patient specific WT 1 vaccine target molecule identified by the identification method of the present invention, and Provided is a method of treating patient-specific cancer, wherein a target molecule identified by the identification method is administered.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a cancer vaccine and can contain an adjuvant or the like well known to those skilled in the art.
  • the present invention also provides an HLA monomer, an HLA dimer containing a cancer antigen peptide derived from WT1. 1.
  • HLA monomer an HLA dimer containing a cancer antigen peptide derived from WT1.
  • HLA dimer containing a cancer antigen peptide derived from WT1. 1.
  • HLA tetramer or HLA pentamer.
  • the clinical test agent of the present invention will be described using an HLA tetramer as an example.
  • the HLA tetramer which is a component of the clinical test drug of the present invention, piotinates a complex (HLA monomer) in which the HLA antigen chain and 2 microglopurin are associated with the WT1-derived cancer antigen peptide and binds to avidin.
  • the cancer antigen peptide used here is a cancer antigen peptide derived from WT1. Any cancer antigen peptide described in SEQ ID NOs: 2 to 18 can be mentioned, for example.
  • the cancer antigen peptide described in any one of SEQ ID NOs: 2 to 5 is used.
  • the method for preparing each component of the HIA tetramer and the method for producing the HLA tetramer are as described in the above section on selecting patients with high WT1 vaccine responsiveness.
  • the clinical test agent of the present invention can be used as one component of a kit for selecting patients with high WT1 vaccine response.
  • the kit may be a kit consisting only of the month's clinical test drug, or a kit containing the clinical test drug of the present invention and other components. Examples of other components in the kit include fluorescently labeled streptavidin, fluorescently labeled mouse anti-human CD8 monoclonal antibody, and fluorescently labeled mouse anti-human CD3 monoclonal antibody.
  • a fluorescently labeled mouse anti-human CD4SRA monoclonal antibody and a fluorescently labeled mouse anti-human CD27 monoclonal antibody can also be included.
  • PE phycoerythrin
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • PerCP peridinin chlorophyll protein
  • API alophycocyanin
  • ECD phycoerythrin-one Texas red
  • PC5 Phycoerythrin-cylanin 5.1
  • the clinical test agent and kit of the present invention can be used not only for selection of patients with high WT1 vaccine response but also for selection of target molecule (target molecule for treatment) of WT1 vaccine. Moreover, it can also be used as a diagnostic agent of cancer with the same component.
  • a method for determining the suitability of the WT 1 vaccine in the patient, and a method for determining the suitability of the WT 1 vaccine in the patient with a cancer antigen peptide derived from WT 1 or WT 1 A method of treating cancer in a patient is provided.
  • the frequency of correction 1-specific CTLs in patients undergoing treatment with a WT1-derived cancer antigen peptide (WT1 vaccine) was measured.
  • WT1 vaccine WT1-derived cancer antigen peptide
  • an increase in CTL frequency was correlated with therapeutic effect.
  • the frequency of WT1-specific CTL after administration of WT1 peptide increased by 1.5 times or more compared to the frequency of CTL before administration of peptide, it was defined as “immune reaction positive '14”.
  • the relationship between the therapeutic effect and the effect As a result, a positive correlation was found between immunoreactivity and therapeutic effect. From this result, it is clear that it is possible to determine whether or not treatment with the Stroke 1 vaccine is appropriate for the target patient using the immunoreactivity (increased frequency and amount of CTL) as an index.
  • the determination method of the present invention is effectively used to determine whether or not to continue the treatment by the peptide administration and the suitability of the treatment in the patient who is carrying out the WT1 vaccine administration.
  • steps ( a ) and (b) in the determination method of the present month is as described in the section of “Amendment of selection of patients with high vaccine responsiveness” above. Measure the frequency or amount of WT1-specific CTL by HLA monomer method, HLA dimer method, HLA tetramer method, HLA pentamer method, Eli spot method, real-time RT-PCR method or limiting dilution method, etc. Is done.
  • step (c) whether or not the treatment with WT1 vaccine is suitable is determined by determining the presence or amount of WT1-specific CTL in the patient after WT1 vaccine administration (hereinafter referred to as post-administration value). This can be done by determining the difference between the two before the vaccine administration (hereinafter referred to as pre-dose value).
  • post-administration value may be any timing after the first administration of WT1 vaccine, but in the case of a peptide administration schedule at intervals of 2 weeks, the 1st to 5th More preferred is the timing after administration of the first to third peptides after administration of WT1 ⁇ ctin.
  • the determination of whether or not the treatment with WT1 vaccine is suitable can be made with an index that the post-administration value of WT1 vaccine is 1.5 times higher than the pre-administration value. That is, if the post-dose value is 1.5 or more times higher than the pre-dose value, it is judged that treatment with WH ⁇ ctin is appropriate. Based on this finding, the present invention treats patients determined to be compatible by the method of the present invention for determining the suitability of the WT 1 vaccine in patients with WT 1 or a cancer antigen peptide derived from WT 1 Also provided is a method of treating cancer in the patient.
  • the HIA monomer method, the HLA dimer method, the HLA tetramer method, and the HLA pentamer method are most preferable from the viewpoint of the ease and accuracy of the method.
  • the HLA tetramer method will be described as an example.
  • the HIA tetramer method involves the following steps (a), (b), (c) and (d):
  • examples of the HLA antigen used as a component of the HLA tetramer include HLA-A24 antigen and HLA-A2 antigen.
  • cancer antigen peptides that are components of HLA tetramers for example, Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 2), Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3) Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 4) or Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (SEQ ID NO: 5).
  • an HLA containing the same peptide as the peptide used for therapy, or a peptide in which CTL induced by the peptide used for therapy exhibits cross-reactivity It is preferable to use a tetramer.
  • the HLA tetramer containing the peptide shown in SEQ ID NO: 2 or 3 and the HLA-A24 antigen is effectively used.
  • Step (d) is determined based on the comparison between the pre-administration value and the post-administration value as described above.
  • PBMC pre-administration sample
  • post-administration sample blood is collected from a patient who has been treated with peptide administration to separate PBMC
  • HLA tetramers are added to these pre-dose and post-dose samples, and peptides and specific CTLs are analyzed using the analysis method described in the section “Method for selecting patients with high WT1 vaccine responsiveness” and Example 3.
  • Measure and calculate the frequency of Treatment with the WT1 vaccine is suitable when the CTL frequency in the post-administration sample is 1.5 or more times higher than the CTL frequency in the pre-dose sample (expected to have a therapeutic effect with the WT1 vaccine) Judge.
  • the present invention also provides a clinical test for determining the suitability of a WT1 vaccine, comprising a HLA monomer, a HLA dimer, an HLA tetramer, or an HLA pentamer containing a cancer antigen peptide derived from WT1, and the clinical test
  • a kit containing the drug is provided.
  • ⁇ WT1 vaccine responsiveness is high. As described in the section “Laboratory for patient selection”.
  • Example 1 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
  • Example 1 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
  • Example 1 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
  • Example 1 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples. Example 1
  • AML acute myeloid leukemia
  • ALL acute lymphocytic leukemia
  • CML chronic myeloid leukemia
  • MDS myelodysplastic dysplasia
  • Peripheral blood mononuclear cells from collected blood by density gradient centrifugation of Ficoll-Hypaque
  • the amplified fragment was cleaved with restriction enzymes Ncol and BamHl and cloned into pETlld vector (Novagen).
  • the following forward primer 5,-CATATGATCCAGCGTACCCCGAAAATTCAG-3, (SEQ ID NO: 21) and reverse primer: 5'- GGATCCTTACATGTCTCGATCCCACTrAAC-3 '( Using SEQ ID NO: 22)
  • PCR was carried out using a human / 3 2 microglobulin (GenBank Acc. No. AB021288) expression plasmid as a saddle type.
  • the amplified fragment was cleaved with restriction enzymes Ndel and BaraHl and cloned into pETlla vector (Novagen).
  • Example 2 Immediately after thawing the frozen PBMC of Example 1, the suspension was resuspended in phosphate buffered saline (PBS) containing 0.5% urinary fetal serum (FCS) at IX 10 6 cells / ml. 2 liters of the tetramer solution (500 ⁇ g // il) prepared in step 1 was added and incubated at 37 ° C for 30 minutes. As a negative control, PE-labeled streptavidin (Becton Dickinson) was added instead of tetramer, and a sample treated in the same manner was also prepared.
  • PBS phosphate buffered saline
  • FCS urinary fetal serum
  • the mixture was rapidly cooled in ice, and 15 each of FITC-labeled mouse anti-human CD8 monoclonal antibody (BD Pharmigen) and erCP-labeled mouse anti-human CD3 antibody (BD Pharmigen) were added and incubated at 4 ° C for 30 minutes.
  • the stained cells were washed twice with PBS containing 0.5 ° / oFCS and then analyzed with a flow cytometer FACSort (Becton Dickinson).
  • CD 3 positive and CD8-positive cells select, tetramer positive cells of the selected cells (CD3 + CD8 + tetraraer +) PE -labeled streptavidin positive cells from the rate (frequency) negative irradiation of ( CD3 + CD8 + avidin + ) subtracted from WT1 antigen peptide specific value
  • the percentage of CTL progenitor cells was:
  • Table 2 shows the results of analysis of X100 cancer patients and healthy human PBMC.
  • Figure 1 shows the results plotted by disease. From this result, the proportion of CTL progenitor cells specific for the 1st peptide in CD3 / CD8-positive cells was 0.47 to 1.30% in healthy subjects, with an average of 0.82%. In patients with malignant tumors, 1.04-29.45% averaged 5.24%, and in lung cancer patients 0.33-5.97% averaged 2.44%. Hematopoietic organs were found to increase significantly in patients with malignant tumors and lung cancer (p. 0. 05).
  • AML acute myeloid leukemia
  • ALL Acute lymphoblastic leukemia
  • ALL Acute lymphoblastic leukemia (ALL) Inhaler 2 1. 78
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • MDS Myelodysplastic syndrome
  • MDS disease 3 Myelodysplastic syndrome
  • MDS Myelodysplastic syndrome
  • Lung cancer patients 1 5. 97 Lung cancer patients 2 3. 83 Lung cancer patients 3 2. 63 Lung cancer patients 4 1. 89 Lung cancer patients 5 1. 69 Lung cancer patients 6 0. 72 Patients with lung cancer 7 0. 33
  • WT1-positive lung cancer, breast cancer, or leukemia patients were included.
  • the immune response to the administered peptide was evaluated by measuring the peptide-specific CTL frequency by the same HLA tetramer method as in Example 3.
  • “Immune response positive” was defined as a peptide-specific CTL frequency increased at least 1.5-fold before peptide administration at any stage after peptide administration.
  • a decrease in B-heavy tumor marker value and a decrease in tumor cells and tumor volume were observed after peptide administration.
  • the correlation between immune response and therapeutic effect was evaluated by chi-square test for 19 cancer patients who were able to evaluate both immune response and therapeutic effect of peptide administration. As a result, out of 11 patients with a therapeutic effect, 8 (73%) were positive for the immune response, but of the 8 patients with no therapeutic effect, the immune response was positive.
  • CD45RA positive and CD 27 positive f Naive type, CD45RA negative and CD27 positive, and CD45RA negative and CD27 negative are classified as memory type, and CD45RA positive and CD27 negative are classified as effector type.
  • the effector type is a cell population showing strong CTL activity.
  • HLA-A * 2-402 positive cancer patients 14 hematological cancers, 10 solid cancers
  • HLA tetramer staining positive Using the collected HLA_A * 2402-positive healthy PBMC, HLA tetramer staining positive and
  • CD8 positive WT1 peptide-specific CTL progenitor cells Functional analysis of CD8 positive WT1 peptide-specific CTL progenitor cells was performed. Cells were stained with HLA tetramer, anti-CD8 antibody, anti-CD45RA antibody, and anti-CD27 antibody in the same manner as in Example 3 for single-cytometer analysis. The percentages of CD45RA positive / CD27 fertile naive, CM5RA negative memory, and CD45RA positive / CD27 negative effector types in the HLA tetramer positive and CD8 positive cell population were calculated. The ratios of naive, memory, and effector types were 23.7 °, 45.5%, and 30.8%, respectively, in cancer patients. On the other hand, in healthy people, they were 35.9% and 53.8% 8.9%, respectively.
  • Example 3 it was shown that WT1-specific CTL progenitor cells increased in cancer patients, but it was clear that the proportion of CTLs with effector-type functions increased in those cancer patients. became. From these results, it was shown that cancer patients can be diagnosed using the presence frequency of effector-type CTL precursor cells as an index.
  • a method for selecting patients with high WT 1 vaccine responsiveness using the frequency of WT 1-specific CTL progenitor cells as an index, a method for treating cancer using the same, and a clinical test for the selection Medicines are provided. According to the selection method of the present invention, it is possible to select a patient who is expected to be more effective with the WT1 actin therapy, and to perform an appropriate treatment for cancer.

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Description

明 細 書
WT 1ワクチン適応患者の選択方法 技術分野
本発明は、 WT 1ワクチン応答性が高い患者の選択方法およびそれを包含する 癌の処置方法に関する。 さらに詳しくは、 本発明は、 WT !L特異的 C T L前駆細 胞の頻度を指標とした、 WT 1ワクチン応答性が高い患者 選択方法などに関す る。 背景技術
WT 1遺伝子 （Wilms' tumor gene 1) は、 小児の腎腫瘍である W i 1 m s fl重 瘍の原因遺伝子の 1つとして同定された （Cell 60： 509, 1990 、 Nature 343： 774, 1990) 。 WT 1遺伝子は転写因子 WT 1をコードしており、 WT 1は細胞 の増殖。分化 ·アポトーシス及び Ιβの形成などに関する重要な働きをする
(Int. Rev. Cytol. 181： 151, 1998) 。 当初、 WT 1遺伝子は、 癌抑制遺伝子 と位置付けられていたが、 その後の研究により白血病及び 癌や乳癌を含む種々 の固形癌で発現が認められ、 むしろ癌の増殖を促進する癌直伝子としての作用を 有することが示された。 また、 WT 1由来のぺプチドで HLA— A* 0201陽性または HLA-A* 2402陽性の末梢血単核球を in vitroで刺激することにより、 ぺプチド特異 的な細胞傷害性 T細胞 （CTL) が誘導され、 これらの CTLは、 内因性に WT 1を発 現する白血病や固形癌の癌細胞を傷害することが示された。 これらの結果より、 WT 1は癌免疫療法の有望な標的分子であることが示されこ (Int. J. Heraatol 76： 127, 2002) 。
抗原ペプチド特異的な CTLを in vitroで定量する方法としては、 HLAモノマー 法、 HLAダイマー法、 HLAテトラマー法 （Science 274： 94, L996) 、 HLAペンタマ 一法、 ELISP0T法 （J. Immunol. Methods 110： 29, 1988) 、 リアルタイム RT - PCR 法 （J. Immunol. Methods 210： 195, 1997) 、 限界希釈法 （Br. J. Cancer 77： 1907, 1998) などが知られている。 HLA -テトラマーは、 HLA CK鎖と 2ミクログロ ブリンをペプチドと会合させた複合体 （HLAモノマー） をピオチン化し、 蛍光標 識したアビジンに結合させることにより 4量体化して作製する。 HLAテトラマー でぺプチド、特異的 CTLを染色し、 フロ一サイトメ一ターで解析することによりか! の頻度を |J定することができる。 HLAモノマー法、 HLAタィマー法及ひ ¾LAペンタ マー法も同様の原理に基づき CTLの頻度を測定することができる。
ワクチンによる刺激前の CTLを CTL前駆細胞 （プリカーサ一） と称している。 特 定の癌抗原に対する CTL前駆細胞の存在頻度が高ければ、 癌ワク ンとしてその 抗原を投与した場合に効率良く特異的な CTLが誘導され、 癌ワク ン療法による 奏効が得られやすいと考えられる。 すなわち、 特定の癌抗原に特異的な CTL前駆 細胞の存在頻度の高い患者をワクチン投与前に選択することが可能であれば、 そ の癌抗原を用いたより効果的な治療を行うことが可能となる。
しかしながら、 メラノーマ患者の末梢血単核球 （PBMC) を用いた HLAテトラマ 一による CTL前駆細胞の頻度測定についてはいくつかの報告がなされているが、 癌抗原ぺプチド特異的 CTL前駆細胞の頻度は低値であることが示されている （J. Irnmunother. 24： 66, 2001、 Hum. Gene. Ther. 13： 569， 2002) 。 このようなこ と力、ら、 抗原に対する CTL前駆細胞の存在頻度は一般的に低いと考えられており、 CTL前駆細胞の存在頻度を指標として癌ワクチンの適応患者を選 することは困 難であると考えられていた。 発明の開示
本発明の目的は、 WT 1特異的 C T L前駆細胞の頻度を指標とした、 WT 1ヮ クチン応答 t生が高い患者の選択方法などを提供することにある。
本発明者は、 WT1由来の癌抗原ペプチドを用いて HLAテトラマーを作製し、 造血 器悪性腫瘍及び肺癌の患者のヮクチン投与前の CTL前駆細胞の頻度を測定したと ころ、 驚くべきことに、 健常人に比べて、 従来にない高い頻度で CTL前駆細胞
(WT1特異的な CTL前駆細胞） が存在していることを見出した。 このことから癌抗 原 WT1に関しては、 WT1特異的な CTL前駆細胞の頻度を指標として、 WT1ワクチン応 答性が高い患者の選択や WT1ワクチンの標的分子の同定を行えることが明らかと なった。 また前記の如き種々の癌患者において訂 1特異的 CTL前駆糸 胞の頻度が高 かったことから、 WT1特異的 CTL前駆細胞の頻度を指標として、 癌の診断を行える ことも明らかとなった。
本発明者はさらに、 WT1特異的 CTL前駆細胞を機能的に細分頻したところ、 CTL 前駆細胞の中でも、 特にエフェクター型 CTL前駆細胞 （以下、 単にエフェクター 細胞とも称する） の占める割合が高いことを見出した。 従って WT1特異的なエフ ェクタ一型 CTL前駆細胞の存在頻度を指標として、 WT1ヮクチン応答性が高レ、患者 の選択や癌の診断が行えることも明らかとなった。
さらに本発 P月者は、 WT1由来の癌抗原ペプチドによる治療実施中の患者におけ る WT1特異的 CTLの頻度を測定したところ、 ぺプチド投与前に対するぺプチド投与 後の CTL頻度の増加と治療効果とが相関していることを見出した。
本発明は、 以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち本 明は、
(1) 以下の工程 (a) 、 (b) および （c) ：
(a) C T L前駆細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
( b ) 前記 （ a ) の生体試料中に存在する WT 1特異的な C T L前駆細胞の存在 頻度または量を測定する工程、
(c) 前記 （b ) の測定結果を健常人のそれと比較して高い力否かを判定し、 W T 1ワクチン応答性を判断する工程、
を含む、 WT 1 ワクチン応答性が高い患者の選択方法；
(2) WT 1特異的な CTL前駆細胞の存在頻度または量を、 HLAモノマー 法、 HL Aダイマー法、 HL Aテトラマー法、 HL Aペンタマ一法、 エリスポッ ト法、 リアルタィム R T— P C R法および限界希釈法のいずれかの方法により測 定する、 前記 （ 1) 記載の選択方法；
(3) HLAテトラマー法により測定する、 前記 （2) 記載の選択方法； (4> 以下の工程 (a) 、 （b) 、 (c) および （d) ：
(a) CT L前馬区細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
(b) WT1由来の癌抗原ペプチドを含有する H LAテトラマーと、 前記 （a) の生体試料とを接触させる工程、
(c) HLAテ トラマーに結合した WT 1特異的な CTL前駆細胞の存在頻度ま たは量を測定する工程、
(d) 前記 (c) の測定結果を健常人のそれと比較して高レ、か否かを判定し、 W T 1ワクチン応答性を判断する工程、
を含む、 前記 (3) 記載の選択方法；
(5) 前記 （4) に記載の工程 (c) 力 CD 8陽性または CD 8ZCD 3陽 性の C T L前駆細胞中での H L Aテトラマー結合細胞の割合を測定することによ り行われる、 前記 （4) 記載の選択方法；
(6) HLAテトラマーの構成成分である HLA抗原が HLA— A24抗原ま たは HLA— A2抗原である、 前記 （4) または （5) 記載の選択方法；
(7) WT 1由来の癌抗原ぺプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn
Leu (配列番号： 2) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3) 、 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配列番号： 4)および Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 5) より選択される、 前言己 （4) 〜 （6) い ずれか記載の選択方法；
(8) フローサイトメトリーを用いて行われる前記 (1) 〜 （7) いずれか記 載の選択方法；
(9) WT 1特異的な C T L前駆細胞の存在頻度または量が、 健常人の値と比 較して 1. 5倍以上高いことを指標として WT1ワクチン応答性を判断する、 前 記 （1) 〜 （8) いずれ力記載の選択方法；
(10) CTL前駆細胞がエフェクター型 CTL前駆細跑である、 前記 （1) 記載の選択方法；
(1 1) WT 1特異的なエフェクター型 CTL前駆細胞の存在頻度または量の 測定に、 HLAモノマー法、 HLAダイマー法、 HLAテトラマー法、 HLAぺ ンタマー法、 エリスポット法、 リアルタィム RT— PCR およぴ限界希釈法の いずれかの方法を利用する、 前記 (10) 記載の選択方法；
(1 2) HLAテトラマー法を利用する、 前記 (1 1) 記載の選択方法；
(1 3) 以下の工程 （a) 、 （b) 、 （c) および （d) ：
(a) CTL前駆細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
(b) WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する HLAテトヲマー、 抗 CD 8抗体、 抗 CD45 RA抗体おょぴ抗 CD 27抗体と、 前記 （a) の生体試料とを接触さ せる工程、
(c) CD8陽性または CD8ZCD3陽性であり、 かつ HLAテトラマー結合 陽性の CTL前駆細胞中での、 CD45 RA陽性かつ CD 27陰性のェフエクタ 一型 C T L前駆細胞の割合を測定する工程、
(d) 前記 (c) の測定結果を健常人のそれと比較して高いか否かを判定し、 W X 1ワクチン応答性を判断する工程、
を含む、 前記 （12) 記載の選択方法；
(14) HL Aテトラマーの構成成分である H 1^ 抗原が？1し 一 24抗原 または HLA— A 2抗原である、 前記 (13) 記讖の選択方法；
(1 5) WT 1由来の癌抗原べプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 2) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3 ) ヽ Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (酉己歹幡号： 4)およぴ Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 5) より選択される、 前記 （13) または
(14) 記載の選択方法；
(1 6) フローサイトメトリーを用いて行われる前記 （10) 〜 （15) いず れか記載の選択方法；
(1 7) 以下の工程 （a) 、 （b) および （c) ：
(a) CT L前駆細胞を含む生体試料を被験者より単離する工程、
( b ) 前記 （ a ) の生体試料中に存在する WT 1特異的な C T L前駆細胞の存在 頻度または量を測定する工程、
(c) 前記 (b) の測定結果を健常人のそれと比較して高い力否かを判定し、 癌 の罹患を判断する工程、
を含む、 癌の診断方法； ·
(1 8) WT 1特異的な CTL前駆細胞の存在頻度または量を、 HLAモノマ 一法、 HL Aダイマー法、 HL Aテトラマー法、 FiL Aペンタマ一法、 エリスポ V ト法、 リアルタイム RT— PC R法および限界希釈法のいずれかの方法により 測定する、 前記 （17) 記載の診断方法；
(1 9) HLAテトラマー法により測定する、 前記 （18) 記載の診断方法； (20) 以下の工程 （a) 、 （b) 、 （c ) および （d) ：
(a) CT L前駆細胞を含む生体試料を被驗者より単離する工程、
(b) WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する HLAテトラマーと、 前記 （a) の生体試料とを接触させる工程、
(c) HLAテトラマーに結合した WT 1特異的な CTL前駆細胞の存在頻度ま たは量を測定する工程、
(d) 前記 （c) の測定結果を健常人のそれと比較して高い力否かを判定し、 癌 の罹患を判断する工程、 .
を含む、 前記 （19) 記載の診断方法；
(21) 前記 （20) に記載の工程 （c) 力 CD8陽性または CD8/CD 3陽性の CT L前駆細胞中での HLAテトラマー結合細胞の割合を測定すること により行われる、 前記 （20) 記載の診断方法；
(22) HL Aテトラマーの構成成分である HLA抗原が HLA— A24抗原 または HLA— A2抗原である、 前記 （20) または （21) 記載の診断方法；
(23) WT 1由来の癌抗原ぺプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 2) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3) 、 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配列番号： 4)およぴ Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 5) より還択される、 前記 （20) 〜 （2 2) いずれか記載の診断方法；
(24) フローサイトメトリーを用いて行おれる前記 （1 7) 〜 （23) いず れか記載の診断方法；
(25) WT 1特異的な CTL前駆細胞の存在頻度または量力 健常人の値と 比較して 1. 5倍以上高いことを指標として癌の罹患を判断する、 前記 (17) 〜 （24) いずれか記載の診断方法；
(26) CTL前駆細胞がエフェクター型 CTL前駆細胞である、 前記 （1 7) 記載の診断方法；
(27) WT 1特異的なエフェクター型 CTL前駆細胞の存在頻度または量の 測定に、 HLAモノマー法、 HLAダイマ一法、 HLAテトラマー法、 HLAぺ ンタマー法、 エリスポット法、 リアルタイム R T— P C R法および限界希釈法の いずれかの方法を利用する、 前記 (26) 記載の診断方法；
(28) HLAテトラマー法を利用する、 前記 （27) 記載の診断方法； (29) 以下の工程 （a) 、 （b) 、 （c) および （d) ：
(a) CT L前駆細胞を含む生体試料を被験者より単離する工程、
(b) WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する H LAテトラマー、 抗 CD 8抗体、 抗 CD 45 RA抗体および抗 CD 27抗体と、 前記 （a) の生体試料とを接触さ せる工程、
(c) CD 8陽性または CD 8ZCD 3陽性であり、 かつ HL Aテトラマー結合 陽性の C T L前駆細胞中での、 C D 45 R A陽性かつ C D 27陰性のェフエクタ 一型 C T L前駆細胞の割合を測定する工程、
(d) 前記 (c) の測定結果を健常人のそれと比較して高い力否かを判定し、 癌 の罹患を判断する工程、 '
を含む、 前記 （28) 記載の診断方法；
(30) HL Aテトラマーの構成成分である HL A抗原が HLA— A 24抗原 または HLA— A2抗原である、 前記 （29) 記載の診断方法；
(31) WT 1由来の癌抗原ペプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 2) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3) 、 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配歹幡号： 4)および Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 5) より選択される、 前記 （29) または
( 30) 記載の診断方法；
(32) フローサイトメトリーを用いて行われる前記 （26) 〜 （31) いず れか記載の診断方法；
(33) 以下の工程 (a) 一 (d) ：
(a) CT L前駆細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
(b) 前記 （a) の生体試料に複数の ^T 1ワクチンの標的分子をそれぞれ適用 し、
(c) 前記 (b) の生体試料中それぞれに存在する WT 1特異的な CTL前駆細 胞の存在頻度または量を測定し、 それぞれ比較する工程、
(d) 前記 (c) の測定結果に基づいて、 その患者に有効な WT 1ワクチンの標 的分子を同定する工程、
を含む、 患者固有の WT1ワクチン標的分子の同定方法；
(34) WT 1特異的な CTL前駆綑胞の存在頻度または量を、 HLAモノマ 一法、 HL Aダイマー法、 HL Aテトヲマー法、 HL Aペンタマ一法、 エリスポ ット法、 リアルタイム RT— PC R法および限界希釈法のいずれかの方法により 測定する、 前記 （33) 記載の同定方
(35) H L Aテトラマー法により測 J定する、 前記 (34) 記載の同定方法；
(36) 以下の工程 (a) 一 (d) ：
(a) CT L前駆細胞を含む生体試科を被験患者より単離する工程、
(b) WT 1由来の複数の癌抗原ペプチドを含有する複数の HLAテトラマーと、 前記 (a) の生体試料とをそれぞれ接独させる工程、
(c) HLAテトラマーに結合した WT 1特異的な CTL前駆細胞の存在頻度ま たは量をそれぞれ測定し、 比較する工程、
(d) 前記 （c) の測定結果に基づいて、 その患者に有効な WT 1由来の癌抗原 ペプチドを同定する工程、
を含む、 前記 （35) 記載の同定方法；
(37) 前記 （36) に記載の工程 Cc) I CD8陽性または CD8ZCD
3陽性の C T L前駆細胞中での HL Aテトラマー結合細胞の割合を測定すること により行われる、 前記 （36) 記載の同定方法；
(38) HLAテトラマーの構成成分である HLA抗原が HLA— A24抗原 または HLA— A2抗原である、 前記 （36) または （37) 記載の同定方法； (39) WT 1由来の癌抗原ぺプチド、が、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn
Leu (配列番号： 2) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3 ) 、
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (酉己歹 lj番号： 4)および Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 5) より選択される、 前記 (36) 〜 （3
8) いずれか記載の同定方法；
(40) フローサイトメトリーにより冇われる前記 (33) 〜 （39) いずれ カ記載の同定方法；
(41) WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する HL Aモノマー、 HLAダイ マー、 HLAテトラマーまたは BiLAペンタマ一を成分とする、 WT 1ワクチン 応答性が高い患者の選択のための臨床検査薬；
(42) HLAモノマー、 HLAダイマー、 H L Aテトラマーまたは H L ぺ ンタマーの構成成分である HL A抗原が HLA— A 24抗原または HL A— A 2 抗原である、 前記 （41) 記載の臨床検査薬；
(43) WT 1由来の癌抗原ぺプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 2) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3) 、 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (酉己歹 U番号： 4)およぴ Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番 ： 5) より選択される、 前記 （41) またほ
(42) に記載の臨床検査薬；
(44) 前記 （41) 〜 （43) いずれか記載の臨床検査薬を含有するキッ 卜；
(45) 前記 （33) ~ (40) いずれ力記載の患者固有の WT 1ワクチン標 的分子の同定方法により同定された標的分子を含有する、 患者固有の癌を処置す るための当該患者用の医薬組成^)；
(46) WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する HL Aモノマー、 HLAタイ マー、 HLAテトラマーまたは H!LAペンタマ一を成分とする、 癌の診断薬 ；
(47) HLAモノマー、 Hし Aダイマー、 H L Aテトラマーまたは HL Aぺ ンタマーの構成成分である HL A抗原が HLA— A 24抗原または HLA— A 2 抗原である、 前記 (46) 記載の診断薬；
(48) WT 1由来の癌抗原ぺプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 2) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (酉己歹 [J番号： 3 ) 、 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配列番号： 4)および Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号 ： 5) より選択される、 前記 （46) また
(47) に記載の診断薬；
(49) 前記 （46) 〜 (48) いずれ力 己载の診断薬を含有するキット ；
(50) 以下の工程 （a) 、 （b) および （c) ：
(a) CTLを含む生体試料を 1ワクチン投与後の患者より単離する工程、
(b) 前記 (a) の生体試料中に存在する WT1特異的な CTLの存在頻度また は量を測定する工程、
(c) 前記 (b) の測定結果を WT 1ワクチン投与前のそれと比較して高い力、否 かを判定し、 WT 1ワクチンによる治療の適合性を判断する工程、
を含む、 該患者における該 WT 1ワクチンの適合性を判定する方法；
(5 1) WT 1特異的な CT Lの存在頻度または量を、 HLAモノマー法、 ： K
L Aダイマー法、 HL Aテトラマー法、 HL Aペンタマ一法、 エリスポット法、 リアルタイム R T— P C R法および限界希釈法のいずれかの方法により測定する、 前記 （50) 記載の判定方法；
(5 2) HLAテトラマー法により測定する、 前記 (5 1) 記載の判定方法 ； (5 3) 以下の工程 (a) 、 (b) 、 (c) および （d) ：
(a) CTLを含む生体試料を 1ヮクチン投与後の患者より単離する工程、
(b) WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する H LAテトラマーと、 前記 (a) の生体試料とを接触させる工程、
(c) HLAテトラマーに結合した WT 1特異的な CTLの存在頻度または量を 測定する工程、
(d) 前記 (c) の測定結果を 1ワクチン投与前のそれと比較して高い力、否 かを判定し、 WT 1ワクチンによる治療の適合性を判断する工程、
を含む、 前記 （52) 記載の判定方法；
(54) 前記 （5 3) に記載の工程 (c) 力 CD8陽性または CD 8ZCD 3陽性の C T L中での H L Aテ トラマー結合細胞の割合を測定することにより行 われる、 前記 （53) 記載の判定方法；
(5 5) HLAテトラマーの構成成分である HLA抗原が HLA— A 24抗原 または HLA— A2抗原である、 前記 （53〉 または （54) 記載の判定方法； (5 6) WT 1由来の癌抗原ぺプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asm Leu (配列番号： 2) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3) 、
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配歹幡号： 4)および Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番 ： 5) より選択される、 前記 （53) 〜 （5 5) いずれか記載の判定方法；
(5 7) フローサイトメトリーを用いて行われる前記 (50) 〜 （5 6) いず れか記載の判定方法；
(58) WT 1特異的な CTLの存在頻度または量が、 WT 1ワクチン投与前 の値と比較して 1.5倍以 _b高レヽことを指標として WT 1ワクチンによる治療が 適している力否かを判断する、 前記 （50) 〜 （57) いずれ力記載の判定方 法；
(59) WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する HL Aモノマー、 HLAダイ マー、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一を成分とする、 WT 1ワクチン の適合性の判定のための臨床検査薬；
(60) HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAぺ ンタマーの構成成分である BiLA抗原が HLA— A24抗原または HLA— A 2 抗原である、 前記 （59) 記載の臨床検査薬；
(61) WT 1由来の癌抗原ぺプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 2 ) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3〕 、 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (酉 S歹 (J番号： 4)および Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配歹番号： 5) より選択される、 前記 （59) または
(60) に記載の臨床検査薬；ならびに
(62) 前記 (59) 〜 （61) いずれか記載の臨床検査薬を含有するキッ ト、 に関する。
さらに、 本発明は、
(63) 前記 (1) に関連し、 以下の工程 (a) 、 (b) および （c) ：
(a) CT L前駆細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
(b) 前記 (a) の生体試料中に存在する WT 1特異的な CTL前駆細胞の存在 頻度または量を測定する工程、
(c) 前記 (b) の測定結果を健常人のそれと比較して高いか否かを判定し、 W T 1ヮクチン応答性を判断する工程、 により、 WT 1ヮクチン応答性が高い患者 を選択し、 該選択された患者を WT 1または WT 1由来の癌抗原べプチドによ 処置する、 該患者における癌を処置する方法、 および前記 (2) 〜 （16) いず れカゝ記載の選択方法に り遷択された患者における癌を処置する方法；
(64) 前記 （33) に関連し、 以下の工程 （a) - (d) ： (a) CT L前駆細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
(b) 前記 (a) の生^:試料に複数の WT 1ワクチンの標的分子をそれぞれ適用 し、
(c) 前記 (b) の生 試料中それぞれに存在する WT1特異的な CTL前駆細 胞の存在頻度または量を測定し、 それぞれ比較する工程、
(d) 前記 (c) の測定結果に基づいて、 その患者に有効な WT1ワクチンの標 的分子を同定する工程、
を含む、 患者固有の WT 1ワクチン標的分子の同定方法により同定された標的分 子を投与する、 当該患會固有の癌を処置する方法、 および前記 （34) 〜 （4 0) いずれ力記載の患者固有の WT 1ワクチン標的分子の同定方法により同定さ れた標的分子を投与する、 当該患者固有の癌を処置する方法；
(65) 前記 （50) に関連し、 以下の工程 (a) 、 (b) および （c) ：
(a) CTLを含む生体試料を WT 1ヮクチン投与後の患者より単離する工程、
(b) 前記 (a) の生体^:料中に存在する WT1特異的な CTLの存在頻度また は量を測定する工程、
(c) 前記 (b) の測定結果を WT 1ワクチン投与前のそれと比較して高い力否 かを判定し、 WT 1ワクチンによる治療の適合性を判断する工程、
を含む、 該患者における該 WT 1ワクチンの適合性を判定する方法により適合性 ありと判定された患者を、 WT 1または WT 1由来の癌抗原ペプチド tこより処置 する、 該患者における癌を処置する方法、 および前記 （51) 〜 （58) いずれ 力記載の判定方法により、 適合性ありと判定された患者における癌を処置する方 法；
に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 癌患者と健常汄における WT1特異的 CTL前駆細胞の存在頻度を示すグラ フである。 図中、 縦軸は CTL前駆体 （前駆細胞） の頻度を示す。 また図中、 血液 癌は HLA- A2402陽性の造虹器悪性腫瘍患者の結果を、 肺癌は HLA- A2402陽性の肺癌 患者の結果を、 健常人は HLA- A2402陽性の健常人の結果をそれぞれ示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 以下の工程 （a) 、 (b) および （c) ：
(a) CT L前駆細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
(b) 前記 （a) の玍体試料中に存在する WT 1特異的な CTL前駆細胞の存在 頻度または量を測定 1~る工程、
(c) 前記 (b) の測定結果を健常人のそれと比較して高い力否かを判定し、 W
T 1ワクチン応答性を判断する工程、
を含む、 WT 1ワクチン応答性が高い患者の選択方法、 および該方法により選択 された患者における瘙を処置する方法を提供する。
本発明においては、 ワクチン投与前の癌患者において、 従来にない高い頻度で
WT1特異的な CTL前駆細胞が存在していることを見出した。 従って WT1特異的な CTL 前駆細胞の量や頻度を指標として、 WT1ワクチン応答性が高い患者の選択を行う ことができる。
工程 （a) におけるネ皮験患者とは、 癌の疑われる患者、 若しくは癌患者を指す。 具体的には、 白血病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 悪性リンパ腫などの血 液性の癌や、 胃癌、 大腸癌、 肺癌、 乳癌、 胚細胞癌、 肝癌、 皮膚癌、 膀胱癌、 前 立腺癌、 子宮癌、 子宫類癌、 卵巣癌等の固形癌が疑われる患者、 若しくはこれら の癌に罹患した患者が例示される。 好ましくは白血病、 骨髄異形成症候群および 肺癌が疑われる患者、 若しくはこれらの癌に罹患した患者が挙げられる。
工程 （a) において被験患者より単離される生体試料は、 CTL前駆細胞を含む 限り特に制限はないが、 血液、 リンパ液またはこれらの培養物、 血液から単離し た末梢血単核球 (PBMC) 、 若しくは T細胞が浸潤した組織などが例示される。 生 体試料は、 そのまま使用することもできるし、 希釈または濃縮して使用すること もできる。 好ましくは PBMCが用いられ、 当該 PBMCは通常の Ficoll - Hypaqueの密度 勾配遠心法などにより単離することができる。
工程 （b) において生体試料中に存在する WT1特異的な CTL前駆細胞の存在頻度 または量を測定する手法は、 CTLの存在頻度または量を測定できる従来公知の如 何なる手法を用いても良い。 具体的には、 例えば HLAモノマー法、 HLAダイ マー法、 H L Aテトラマー法、 H L Aペンタマ一法、 エリスポ ト法、 リアルタ ィム R T— P C R法または限界希釈法などを用いることができる。
ここで HLAテトラマー法とは、 HLA抗原 鎖と ]3 2ミクログロプリンを目的抗原 ペプチドと会合させた複合体 （HLAモノマー） をビォチン化し、 蛍光標識したァ ビジンに結合させることにより 4量体化して作製した HLAテトラマーを用いて、 抗原ペプチド特異的 CTLを検出する方法である。 具体的には、 当該 HLAテトラマー で抗原べプチド特異的な CTLを染色し、 フロ一サイトメ一ターで角祈することに より当該 CTLを定量することができる。 このような HLAテトラマーの製造方法およ びそれを用いた CTLの検出方法は公知であり、 例えば文献 (Science 274： 94， 1996) に記載の方法に準じて行うことができる。
HLAモノマー法とは前記 HLAテトラマーの製造にぉ 、て用いられる HLAモノマー (H L A抗原ひ鎖、 ]3 2ミクログロブリン、 抗原ぺプチドの会合体をビォチンィ匕 したもの） を用いて抗原ペプチド特異的 CTLを検出する方法である。
HLAダイマー法とは HLA抗原 ο;鎖と Ig (ィムノグロブリン、 例えば IgGl)とを融 合させ、 これに j3 2ミクログロブリン、 抗原ペプチドを結合させた HLAダイマーを 用いて、 抗原ペプチド特異的 CTLを検出する方法である
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6671-6675 (1993) )。 HLAダイマー こ結合した抗原 ぺプチド特異的 CTLは、 例えば標識抗 IgGl抗体を IgGlに結合させることなどによ り、 検出することができる。
HLAペンタマー法と fま近年開発された手法であり、 HLA抗原と抗原ぺプチドとの 複合体 5分子が Coiled - Coilドメィンを介して重合した 5量体により、 抗原べプチ ド特異的 CTLを検出する方法である。 HLA抗原一抗原ぺプチドの複合体を蛍光色素 等で標識することができるため、 HLAテトラマー法と同様にフローサイトメータ 一等で解析することができる （http：〃丽. pro immune, co. uk /参,照） 。
以上に述べた HLAモノマー、 ダイマー、 テトラマーおょぴペンタマ一はいずれ も受託合成可能であり、 例えば Prolramune社や BD Biosciences社などに委託する ことにより合成することができる。
エリスポット法とは、 活性化 CTLが産生する IFN- γ、 GM- CSF等のサイトカイン に対する抗体をプレート上に固相化し、 目的抗原若しくは目的抗原ペプチドで刺 激した生体試料をプレートに添加し、 前記固相化抗体に結合した^体試料中の活 性化 CTLが分泌したサイトカインを抗サイトカイン抗体でスポットとして検出す ることにより、 生体試料中の CTLを検出する方法である。 当該エリスポット法を 用いた CTLの定量 ¾は公知であり、 例えば文献 （J. Immunol. Methods 110： 29, 1988) に記載の方法に準じて行うことができる。
リアルタイム RT—PCR法とは、 活性化 CTLが産生する IFN- T/、 GM- CSF等のサイト 力インの遺伝子量を RT-PCRにより測定することにより、 間接的に、 目的抗原若し くは目的抗原ぺプチド反応性の CTL頻度を測定する方法である。 当該リアルタイ ム RT- PCR法を用いた CTLの定量法は公知であり、 例えば文献 （J. Immunol.
Methods 210： 195, 1997) に記載の方法に準じて行うことができる。
限界希釈法とは、 CTLを含む生体試料を細胞密度を変えてプレートに播種し、 目的抗原若しくは目的抗原べプチドで刺激しながら培養して、 活性化 CTLが産生 するサイトカイン量ゃ細胞傷害性を測定し、 陽性ゥェル数から CTL頻度を測定す る方法である。 当該限界希釈法を用いた CTLの定量法は公知であり、 例えば文献 (Br. J. Cancer 77： 1907, 1998) に記載の方法に準じて行うことができる。 以上のような公矢口の CTL定量法を用いることにより、 WT1特異的な CTL前駆細胞 の存在頻度または量を測定することができる。
工程 （c ) における WT1ワクチン応答性の判断は、 工程 ( b ) で得られた被験 患者における WT1特異的な CTL前駆細胞の存在頻度または量 （以下被験患者値とい う） を、 健常人のそれ （健常人値） と比較し、 両者の違いを判定することによつ て行うことができる。 この場合、 健常人から単離 ·調製した生体試料 （血液、 リ ンパ液、 PBMC等） 力 S必要であるが、 これらは癌に罹患していない人の生体試料を 採取することによって、 取得することができる。 なお、 ここでいう 「健常人」 と は、 癌と診断されていない人をいう。
被験者値と健常人値との比較は、 被験者の生体試料と健常人の生体試料を対象 とした測定を並行して行うことで実施できる。 並行して行わない場合は、 複数 (少なくとも 2つ、 好ましくは 3以上、 より好ましくは 5以上） の健常人の生体 試料を用いて均一な測定条件で測定して得られた健常人値の平均値または統計的 中間値を比較に用いることができる。 2004/009378
16 被験患者において WT1ヮクチン応答性が高いか否かの判断 、 被験者値が健常 人値と比較して 1.5倍以上、 好ましくは 2倍以上多いことを指標として行うことが できる。 すなわち、 被験者値が健常人値と比較して 1.5倍以上、 好ましくは 2倍以 上多ければ、 WT1ワクチン応答性が高いと判断する。 WT1ワクチン応答性が高いと 判断された患者は、 WT1ワクチンが適用可能、 即ち WT1ワクチンによる治療を良好 に適用できると判断される。
前記 CTLの測定法のうち、 手法の容易さおよび精度の観点から最も好ましいの は HLAテトラマー法である。 すなわち好ましい形態として、 本発明は、 HLAテトラ マー法を用いることを特徴とする WT1ワクチン応答性が高い息者の選択方法およ ぴ処置方法を提供する。 なお前述のように、 HLAモノマー法、 HLAダイマー法およ び HLAペンタマ一法も原理的には HLAテトラマー法と同様の手法であり、 好ましい CTLの測定法であるが、 ここでは HLAテトラマー法を例にとり説明する。
当該 HLAテトラマーを用いた WT1ワクチン応答性が高い患者の選択方法おょぴ処 置方法は、 具^:的には以下の工程 （a) 、 （b) 、 (c) および （d) ：
(a) CTLfr駆細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
(b) WT1由来の癌抗原ペプチドを含有する HLAテトラマーと、 前記 （a) の生体試料とを接触させる工程、
(c) HLAテトラマーに結合した WT 1特異的な CTL前駆細胞の存在頻度ま たは量を測定" Tる工程、
(d) 前記 （c ) の測定結果を健常人のそれと比較して高いか否かを判定し、 W
T 1ワクチン^答性を判断する工程、
を含むものでおる。
ここで工程 (a> における 「生体試料」 および 「被験患者」 は、 前記した通り である。
工程 （b) において用いられる 「HLAテトラマー」 とは、 HLA抗原のひ鎖と 2 ミクログロプリ ンをペプチド （抗原ペプチド） と会合させた複合体 （HLAモノマ 一） をピオチン化し、 アビジンに結合させることにより 4量体化したものを指す
(Science 279： 2103-2106(1998)、 Science 274： 94-96 (1996))。 当該 HLAテト ラマーは、 フローサイトメトリー、 蛍光顕微鏡等の公知の検 ttl手段により結合し た CTL前駆細胞を容易に選別または検出することが出来るように、 蛍光標識され ていることが好ましい。 具体的には、 例えばフィコエリスリン (PE) 、 フルォレ セインイソチ才シァネート （FITC) 、 ベリジニンクロロフィ /レプロテイン (PerCP) 、 ァロフィコシァニン （APC) 、 フィコエリスリン一テキサスレッド (ECDとも称する） 、 フィコエリスリンーシァニン 5. 1 (PC5とも称する） などによ り標識された HLAテトラマーが挙げられる。
前記 HLAテトラマーの成分として用いられる訂1由来の癌抗原べプチドは、 ヒト WT1 (Cell, 60： 509, 1990、 NCBIデータベース Accession No. XP_034418、 配列番 号： 1 ) に由来し、 HLA抗原と複合体を形成して HLA拘束性の綑胞傷害性 T細胞 (CTL) の誘導括性 （免疫原性） を有するものである。
HLA分子には多くのサブタイプが存在し、 結合できる癌抗原ぺプチドのァミノ 酸配列にはそれぞれのタイプについて規則性 （結合モチーフ） が存在することが 知られている (Immunogenetics, 41, pl78, 1995、 J. Immunol. , 155 :p4749, 1995) 。 例えば LA-A24の場合、 8〜11アミノ酸からなるぺプチドのうちの第 2位のァミノ 酸がチロシン （Tyr) 、 フエ二ルァラユン (Phe；)、 メチォニン （Met) またはトリ プトファン （Trp) であり、 C末端のアミノ酸がフエ-ルァラニン (Phe)、 口イシ ン (Leu)、 イソロイシン（lie；)、 トリプトファン（Trp)またはメチォニン (Met)とな ることが知られている （J. Immunol. , 152， p3913, 1994、 Immunogenetics, 41, l78, 1995、 J. Immunol. , 155, p4307, 1994) 。
また HLA- A2のモチーフについては、 以下の表 1に示したモチーフが知られてい る (Immunogenetics, 41, pi 78, 1995、 J. Immunol. , 155 :p4749， 1995) 。
HLA- A2のタイプ N末端から 2番目のアミノ酸 C末端のアミノ酸
HLA - A0201 L, M V, L
HLA-A0204 L L
HLA-A0205 V, L, I , M L
HLA-A0206 V, Q V, L
HLA-A0207 L L
(ぺプチドの長さ fま 8〜： 11ァミノ酸） さらに近年、 HLA抗原に結合可能と予想されるぺプチド配列を、 インターネッ ト上、 NIHの BIMASのソフトを使用することにより検索することができる
(http : //bimas. dcrt. nih. gov/molbio/hla_bind/ ) 。 また BIMAS HLA peptide binding prediction analysis (J. Immunol. , 152， 163， 1994)を用いて検索すること も可能である。 このようにして検索 '同定された WT1由来ペプチドの具体例とし ては、 例えば国際公開第 2000/18795号パンフレツトの Tablel]：〜 TableXLVIに列挙 されたぺプチドが挙げられる。
以上のような訂1由来のぺプチドは、 そのアミノ酸残基の一部に改変 （置換、 欠失、 及ひン又は付加 （ペプチドの N末端、 C末端へのアミノ酸の付加も含 む） ） を有していても良く、 好ましくはアミノ酸残基の置換が挙げられる。 当該 置換は前記モチーフ上とり得るアミノ酸残基への置換が望ましい。
以上のような WT1由来のペプチド （改変体も含む） を、 公知の癌抗原ペプチド のアツセィ法 （例えば W0 02/47474号公報、 Int J. Cancer: 100, 565-570 (2002) 等参照） に供することにより、 WT1由来の癌抗原ペプチドを選択することができ る。
訂1由来の癌抗原ぺプチドの具体例としては、 例えば以下のぺプチドが例示さ れる ：
Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (酉 3歹 (1番号： 2 )
Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (酉己歹 !j番号： 3 )
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配歹幡号： 4 )
Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 5 )
Ser Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 6 )
Ala Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 7 )
Abu Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 8 )
Arg Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (酉己歹 [J番号： 9 )
Lys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 10)
Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配列番号： 11)
Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (配列番号： 12)
Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (配列番号： 13) Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (配歹 [f番号： 14)
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (配列番号： 15)
Arg Tyr Pro Ser Ser Gin Lys Lys Phe (酉己歹 U番号： 16)
Arg Tyr Pro Ser Ala Gin Lys Lys Phe (配歹 lj番号： 17)
Arg Tyr Pro Ser Abu Gin Lys Lys Phe (配歹 IJ番号： 18)
(ここで Abuはひ-アミノ酪酸である）
このうち配列番号： 2および配列番号： 4に記載のぺプチドは HLA- A24抗原およ び HLA- A2抗原に結合性のぺプチドであり、 またそれ以外のぺプチド （配列番号： 3、 5、 6〜18) は HLA- A24抗原に結合性のペプチドである。
好ましくは、 前記配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4および配列番 号： 5のいずれかに記載の癌抗原べプチドが挙げられる。
前記ペプチドは、 1つの HLAテトラマー中に 2種以上含有されていてもよい。 前記ペプチドは、 通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて合成す ることができる。 合成方法としては、 文献 （ぺプタイド ' シンセシス （Peptide Synthesis ) , Interscience, New York, 1966；ザ- プロテインズ (The
Proteins) ， Vol 2 , Academic Press Inc. ， New York, 1976；ぺプチド合成， 丸善 （株） ， 1975 ;ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 （株） ， 1985 ;医薬品の開 発 続 第 卷 'ペプチド合成， 広川書店， 1991) などに記載されている方法が け'られる。
前記ペプチドは、 その N末端アミノ酸のアミノ基または C末端アミノ酸のカル ボキシル基を修飾したべプチドであってもよい。
ここで N末端アミノ酸のァミノ基の修飾基として fま、 例えば 1〜 3個の炭素数 1から 6のアルキル基、 フエ-ル基、 シクロアルキゾレ基、 アシノレ基が挙げられ、 具体的には炭素数 1カゝら 6のアル力ノィル基、 フエニル基で置換された炭素数 1 力 ら 6のアルカノィル基、 炭素数 5から 7のシクロ： Tルキル基で置換されたカル ポニル基、 炭素数 1から 6のアルキルスルホニル基、 フエニルスルホ-ル基、 炭 泰数 2から 6のアルコキシカルボニル基、 フエ-ノレ £で置換されたアルコキシ力 ノレポニノレ基、 炭素数 5から 7のシクロアルコキシで置換されたカルボ二ノレ基、 フ ェノキシカルボニル基等が挙げられる。 C末端アミノ酸のカルボキシル基の修飾基としては、 例えばエステノレ基および ァミド基が挙げられ、 エステル基の具体例としては、 炭素数 1力、ら 6のアルキノレ エステル基、 フエニル基で置換された炭素数 0から 6のアルキルエステル基、 炭 素数 5から 7のシクロアルキルエステル基等が挙げられ、 アミ ド基の具体例とし ては、 アミド基、 炭素数 1から 6のアルキル基 1つまたは 2つで置換されたアミ ド基、 フエニル基で置換された炭素数 0カ ら 6のアルキル基 1つまたは 2つで置 換されたアミド基、 アミド基の窒素原子を含んで 5から 7員環のァザシクロアル カンを形成するアミド基等が挙げられる。
HLAテトラマーの成分である HLA抗原 （HLA抗原の α鎖） は、 如何なるサブタイ プの HLA抗原であっても用いること:^できるが、 診断または選択対象のサブタイ プと同じサブタイプを用いる必要 ある。 HLA抗原としては、 例えば HLA - Α*2402 等の HLA- Α24抗原、 HLA-A*0201, - A*O204， -A*0205， - Α*020β等の HLA- A2抗原、 HLA- A*2601等の HLA- A26抗原、 また HLA- *3101、 HLA- A*3303、 HLA- A*l 101などが挙げら れる。 具体的には、 例えば HLA- A24抗原、 HLA-A2抗原または HLA-A26抗原が挙げら れる。 これら HLA抗原の塩基配列おょぴァミノ酸配列は公知であり、 例えば LA- A24抗原については Cancer Res.， 55： 4248-4252 (1995)および Genbank
Accession No. M64740に開示されてレヽる。 また HLA- A2抗原については Genbank Accession No. M84379に開示されてレ、る。 また HLA-A26抗原については Genbank Accession No. D14350に開示されてレ、る。 従ってこれら公知の塩基配列の情報に 基づき、 PCR法等の常法により、 容易に HLA抗原の 鎖をクロ一ユングすることが できる。
当該 HLA抗原の α鎖は、 CTLの結合生や選別性を容易にするために可溶性断片で あることが好ましい。 さらに、 ビォチン一アビジン結合により 4量体化するため に、 当該 HLA抗原ひ鎖の C末端はビォチン化可能な構造を有していること、 すなわ ちビォチン結合部位が付加されていることが好ましレ、。
具体的には、 例えば HLA- Α2402 (HLA- Α24の 1種） の場合は、 正プライマー： 5， - CCATGGGCAGCCATTCTATGCGCTATTTTTCTACCTCCGT-3' (配列番号： 19)および逆向きプ ライマー： -GGATCCTGGCTCCCATCTCAGGGTGAGGGGCTTGGGCAGACCCTC- 3， （配列番号： 20)を用いて、 HLA-A* 2402 (GenBank Acc. No. M64740)発現プラスミドを铸型とし、 PCR反応を行うことにより、 C末端タグ中の特異的リジン残基を BirA酵素でビォチ ニル化可能なように設計された組換え可溶性 HLA- A* 2402 a鎖の cDMを得ることが できる。
HLAテトラマーの成分である ;3 2ミクログロブリンは、 ヒト由来の 3 2ミクログ ロブリンが好ましレ、。 当該ヒ ト由来の |8 2ミクログロブリンの cDNAは、 正プライ マー： 5，- CATATGATCCAGCGTACCCCGAAAATTCAG- 3' (配列番号： 21)および逆向きプラ イマ一： 5，- GGATCCTTACATGTCTCGATCCCACTTMC- 3， （配列番号： 22)を泪いて、 ヒ ト 2ミクログロプリン（GenBank Acc. No. ΑΒ0212δ8)発現プラスミドを鎊型とし、 PCR反応を行うことなどにより得ることができる。
HLAテトラマーの成分であるアビジンは、 従来公知の如何なるアビジンであつ ても使用すること力 Sできるが、 フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡等による検出 を容易にするために、 蛍光標識されていることが好ましい。 蛍光色禁は、 公知の ものを制限なく使用することができ、 例えばフィコエリスリン （ΡΕ) 、 フルォレ セインイソチォシァネート （FITC) 、 ペリジニンクロロフィルプロテイン
(PerCP) 、 ァロブイコシァニン （APC) 、 フィコエリスリン一テキ tスレッド
(ECDとも称する） 、 フィコエリスリンーシァニン 5. 1 (PC5とも称する） などが挙 げ、られる。
以上の HLAテトラマーの成分を含有する HLAテトラマーの作製法については、 文 献 (Science 279： 2103-2106 (1998)、 Science 274： 94-96 (1996)等) により周 知であるが、 簡単に述べると以下のようになる。
まずタンパク質を 現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、 HLA a鎖発現べクタ一 および i32ミクログロプリン発現ベクターを導入し発現させる。 ここでは大腸菌 (例え ilBL21) を用いることが好ましい。 得られた単量体 HLA複合体と抗原ぺプ チド （WT1由来の癌抗原ペプチド） とを混合し、 可溶性の HLA -ぺプチ 複合体を 形成させる。 次に HLA-ペプチド複合体における HLAひ鎖の C末端部位の酉己列を BirA 酵素によりビォチンィ匕する。 このピオチン化された HLA -ぺプチド複合体と蛍光標 識されたァビジンとを 4： 1のモル比で混合することにより、 HLAテトラマーを調 製することができる。 なお、 前記各ステップにおいて、 ゲルろ過等によるタンパ ク精製を行うことが好ましい。 前記工程 ( b ) は、 以上のようにして作製された HLAテトラマーと、 生体試料 (被験患者より単離された CTL前駆細胞を含む生体試料） とを接触させることに より行われる。 当該接触は 37°Cで行うことが好ましい。 また接触は、 通常の生理 的緩衝液、 例えば血清を含むリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中において行うこと が好ましい。
なお、 HLAテトラマーの代わりに蛍光標識したストレプトァビジンを添加して 同様の処理を行った陰†生対照も、 併せて作製しておくことが好ましレ、。
工程 （b ) の後、 HLAテトラマーに結合した WT1特異的な CTL前駆細胞の存在頻 度または量を測定する （工程 c ) 。 当該測定は、 従来公知の如何なる手法を用い て行っても良い。 HLAテトラマーが蛍光標識されている場合、 この HLAテトラマー に結合した CTL前駆細胞は蛍光標識されていることになるので、 フ口一サイトメ 一ター、 蛍光顕微鏡などを用いて標識された CTLを検出若しくは単離することが できる。
HLAテトラマーに結合した WT1特異的な CTL前駆細胞の存在頻度は、 ィ列えば、 CD8 陽性細胞 （CD8陽' [·生の CTL前駆細胞） 、 または CD8/CD3陽性細胞 （CD8/CD3陽性の CTL前駆細胞） に対する前記 HLAテトラマー結合細胞の割合 （頻度） を測定するこ とにより求めることができる。
ここで CD8陽性細月包は、 例えば蛍光標識したマウス抗ヒト CD8モノクローナル抗 体を用いて標識 ·検出することができる。 また CD3陽性細胞は蛍光標識したマウ ス抗ヒト CD3モノクローナル抗体を用いて標識 ·検出することができる。
ここで用いる蛍光色素は、 HLAテトラマーにおいて用いられる蛍光色素と異な るものを用いる必要がある。 すなわち、 PE 識した HLAテトラマーを月いる場合 は、 FITC標識したマウス抗ヒト CD8モノクローナル抗体、 およひ erCP標識したマ ウス抗ヒト CD3モノクローナル抗体を用いるというように、 蛍光色素を区別する 必要がある。
具体的な操作は、 CD8陽性細胞に対する HLAテトラマー結合細胞の害 ϋ合を測定す る場合は、 例えは Ε標識 HLAテトラマーと生体試料とを接触させた後、 FITC標識 マウス抗ヒト CD8モノクローナル抗体をさらに添加して反応させ、 染色された細 胞をフローサイトメータ一や蛍光顕微鏡で解析する。 CD8陽性細胞 （CD8+ ) を選 択し、 その中のテトラマー陽性細胞 （CD8+ tetramer+ ) の割合力 ら陰性対照のァ ビジン陽'性細胞 (CD8+ avidin+ ) の割合を差し引いた数値を、 WT1抗原ペプチド特 異的 CTL前駆細胞の割合とすることができる （以下） ：
WT1抗原ペプチド特異的 CTL前駆細胞 （％) =
[ (CD8+ tetramer+細胞数 ZCD8+細胞数） 一
(CD8+ avidin+細胞数 ZCD8+細胞数） ] X 100。
また、 CD3陽性 · CD8陽性細胞に対する HLAテトラマー結合細胞の割合を測定す る場合は、 例えば E標識 HLAテトラマーと生体試料とを接触させた後、 FITC標識 マウス抗ヒト CD8モノクローナル抗体及び PerCP標識マウス抗ヒ ト CD3抗体をさら に添加して反応させ、 染色された細胞をフローサイトメーターや蛍光顕微鏡で解 析する。 CD3陽性および CD8陽性細胞 （CD3+CD8+ ) を選択し、 その中のテトラマー 陽性細胞 （CD3+CD8+ tetramer+ ) の割合から陰性対照のアビジン陽性細胞
(CD3+CD8+ avidin+ ) の割合を差し引いた数値を、 WT1抗原ペプチド特異的 CTL前 駆細胞の割合とすることができる （以下） ：
WT1抗原ペプチド特異的 CTL前駆細胞 （％) =
[ (CD3+ CD8+ tetraraer+細胞数ノ CD!3+ CD8+細胞数）一
(CD3+ CD8+ avidin+細胞数 /CD3+ CD8+糸 B胞数） ] X 100。 以上の測定結果に基づき、 WT1ワクチン応答性を判断する。 具体的には、 工程 ( b ) で得られ广こ被験患者における WT1特異的な CTL前駆細胞の存在頻度または量 (以下被験患者値という） を、 健常人のそれ （健常人値） と]匕較し、 両者の違い を判定することによって行うことができる。 この場合、 健常人から単離。調製し た生 料 （血液、 リンパ液、 PBMC等） が必要であるが、 これらは癌に罹患して いない人の生体^;料を採取することによって、 取得することができる。 なお、 こ こでいう 「健常人」 とは、 癌と診断されていない人をいう。
被験者値と健常人値との比較は、 被験者の生体試料と健常人の生体試料を対象 とした測定を並行して行うことで実施できる。 並行して行わな X/、場合は、 複数 (少なくとも 2つ、 好ましくは 3以上、 より好ましくは 5以上） の健常人の生体 試料を用いて均一な測定条件で測定して得られた健常人値の平均値または統計的 中間値を比較に用いることができる。 被験患者において WT1ワクチン応答性が高いか否かの判断は、 被験者値が健常 人値と比較して 1.5倍以上、 好ましくは 2倍以上多レヽことを指標として行うことが できる。 すなわち、 被験者値が健常人値と比較して 1.5倍以上、 好ましくは 2倍以 上多ければ、 WT1ワクチン応答性が高いと判断する。 WT1ワクチン応答性が高いと 判断された患者は、 WT1ワクチンが適用可能、 即ち WT1ワクチンによる治療を良好 に適用できると判断される。
以上のような本突明の患者の選択方法は、 ヮクチン投与前の患者の診断のみな らず、 ヮクチン治療後の診断や効能の確認にも使用することができる。
本発明はまた、 以下の工程 （a) 、 (b) および （c) ：
(a) CTL前駆細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
(b) 前記 (a) の生!^料中に存在する WT 1特異的なエフェクター型 CTL 前駆細胞の存在頻度または量を測定する工程、
(c) 前記 (b) の測定結果を健常人のそれと比較して高い；^否かを判定し、 W T 1ヮクチン応答性を判断する工程、
を含む、 WT 1ワクチン応答性が高い患者の選択方法、 および該方法により選択 された患者における癌を処置する方法を提供する。
本発明において〖ま、 WT1特異的 CTL前駆細胞の機能的細分類を行った結果、 健常 人に比して特にエフェクタ一細胞の占める割合が高いことを見出した。 従って WT1特異的なエフェクター型 CTL前駆細胞の量や頻度 （割合） を指標として、 WT1 ワクチン応答性が高い患者の選択を行うことができる。 当該エフェクター型 CTL 前駆細胞を指標とした選択方法は、 前述した CTL前駆細胞全体の存在頻度や量を 指標とした選択方法において健常人との差が明確でなかった湯合等においても、 さらに詳細な解析手法として用いることができる。
具体的には以下の工程 （a) 、 (b) 、 (c) および （d) ：
(a) CTL前駆細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
(b) WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する H LAテトラマー、 抗 CD 8抗体、 抗 CD45 RA抗体および抗 CD 27抗体と、 前記 （a) の生体試料とを接触さ せる工程、
(c) CD 8陽性または CD 8 ZCD 3 P易性であり、 かつ HL Aテトラマー結合 陽性の C T： L前駆細胞中での、 C D 4 5 RA陽性かつ C D 2 7陰性のェフエクタ 一型 C T L前駆細胞の割合を測定する工程、
( d ) 前記 ( c ) の測定結果を健常人のそれと比較して高い力否かを判定し、 W T 1ワクチン応答性を判断する工程、
5 を含む選択方法、 および該方法により選択された患者における癌を処置する方法 が例示される。
ここで 「エフェクター細胞」 とは C D 4 5 R A陽性力つ C D 2 7陰性である CTL前駆細 を指す。 当該エフェクター細胞の頻度は、 （^し前駆細胞中でのじ0 4 5 R A陽性力、つ C D 2 7陰性細胞の割合を測定することにより、 求めることがで L0 きる。 具体的には、 被験サンプルを H L Aテトラマー、 抗 C D 8抗体、 抗 C D 4
5 R A抗体および抗 C D 2 7抗体と接触させ、 C D 8陽性または C D 8 ZC D 3 陽性であり、 かつ H L Aテトラマー陽性の CTL前駆細胞 （WTL特異的 CTL前駆細 胞） 中での C D 4 5 R A陽性かつ C D 2 7陰性細胞の割合を測定することにより、 求めること力 Sできる。
:5 ここで CM5RA陽性細胞は、 例えば蛍光標識したマウス抗ヒ ト CD45RAモノクロ一
ナル抗体を用いて標識 '検出することができる。 また CD27陽性細胞は、 例えば蛍 光標識したマウス抗ヒト CD27モノクローナル抗体を用いて標識 '検出することが できる。 ここで用いる蛍光色素は、 HLAテトラマー、 抗 CD8抗体、 あるいは抗 CD3 抗体において用いられている蛍光色素とは異なるものを用いる必要がある。 具体
:0 的には、 例免ば PE標識した HLAテトラマー、 FITC標識した抗 CD8モノクロ一ナル抗 体、 Per標識した抗 CD3モノクローナル抗体を用いる場合は、 ECD標識マウス抗ヒ ト CD4SRAモノクローナル抗体およぴ PC5標識マウス抗ヒト CD27モノクロ一ナル抗 体を用いるというように、 蛍光色素を区別する必要がある。 これら標識抗体等は、 Beckman Coulter等から購入することができる。
5 当該前駆田胞の具体的な測定法等については、 前述の CTL前駆細胞の存在頻度 や量を指標とした選択方法と同様にして行うことができる。
以上のような訂 1ヮクチン応答性が高い患者の選択方法はまた、 癌の診断にも 適応することができる。 すなわち本発明においては、 造血器悪性腫瘍や肺癌患者 等の患者において、 健常人に比して WT1特異的 CTL前駆細胞の頻度が高いことを見 出した。 従って WT1特異的 CTL前駆細胞の頻度、 または WT1特異的なエフェクター 型 CTL前駆細胞の頻度を指標として、 癌の診断を行うことができる。 ここで診断 可能な癌としては、 白血病、 骨髄異形成症候群、 多発性骨髄腫、 悪性リンノ、。腫な どの血液性の癌や、 胃癌、 大腸癌、 肺癌、 ？ L癌、 胚細胞癌、 肝癌、 皮膚癌、 膀胱 癌、 前立腺癌、 子宮癌、 子宮頸癌、 卵巣癌等の固形癌が挙げられる。 好ましくは 白血病、 骨髄異形成症候群および肺癌が挙げられる。
本発明はまた、 以下の工程 (a) - (d) ：
(a) C T L前駆細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
(b) 前記 （ a) の生体試料に複数の WT 1ワクチンの標的分子をそれぞれ適用 し、
(c) 前記 （b) の生体試料中それぞれに存在する WT 1特異的な CTL前駆細 胞の存在頻度または量を測定し、 それぞれ比較する工程、
(d) 前記 （ c) の測定結果に基づいて、 その患者に有効な WT1ワクチンの標 的分子を同定する工程、
を含む、 患者固有の WT 1ワクチン標的分子の同定方法を提供する。
本発明においては、 ワクチン投与前の癌患者において、 従架にない高い頻度で
WT1特異的な CTL前駆細胞が存在していることを見出した。 従って WT1特異的な CTL 前駆細胞の量 頻度を指標として、 患者固有の WT1ワクチンの標的分子 （治療用 の標的分子） の同定を行うことができる。
すなわち前言己標的分子の同定方法は、 WT1ワクチン応答性が高いと判断された 患者に対して治療上最適の標的分子 （抗原ペプチド） を同定するために、 有効に 用いられる。
具体的には、 前記 WT1ワクチン応答性が高い患者の選択方法と同様に、 HLAモノ マー法、 HLAタ、、イマ一法、 HLAテトラマー法、 HLAペンタマ一fe、 エリスポット法、 リアルタィム RT— PCR法または限界希釈法等により、 WT1特異的な CTL前駆細胞の 存在頻度またま量を測定することにより行われる。 好ましくは HLAモノマー法、 HLAダイマーfe、 HLAテトラマー法、 HLAペンタマ一法が用いられる。 以下 HLAテト ラマー法を例にとり具体的に説明する。
HLAテトラマー法は、 以下の工程 (a) 、 (b) 、 (c) および （d) ： ( a ) C T L前駆細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
( b ) WT 1由来の複数の癌抗原ペプチドを含有する複数の H L Aテトラマーと、 前記 （a ) の生体試料とをそれぞれ接触させる工程、
( c ) HE L Aテトラマーに結合した WT 1特異的な C T L前駆細胞の存在頻度ま たは量をそれぞれ測定し、 比較する工程、
( d ) 前記 ( c ) の測定結果に基づいて、 その患者に有効な WT 1由来の癌抗原 ペプチドを同定する工程、
を含んで行われる。
具体的にはまず、 候補となる 1由来癌抗原ペプチドを含有する HLAテトラマー を複数ィ 1≡製する。 そして、 それぞれの HLAテトラマーと被險患者より単離した生 体試料とを接触させ、 HLAテトラマーに結合した訂1特異的な CTL前駆細胞の存在 頻度または量を測定する。 各 HLAテトラマーについての測定結果を比較し、 最も 高い値を示した HLAテトラマーが含有する癌抗原ペプチド （すなわち、 最も CTLに 認識されやすい癌抗原ペプチド） を、 その患者に対する WT1ワクチン治療のため の標的分子、 即ち患者固有の標的分子として同定する。
ここで用いる癌抗原ぺプチドは、 WT1に由来する癌抗原ぺプチドであれば如何 なるものであっても良いが、 例えば配列番号： 2〜 18に記載の癌抗原べプチドが 挙げられる。 好ましくは配列番号： 2〜5のいずれかに記載の癌抗原べプチドが挙 げられる。
なお、 各工程の具体的な手法や成分の調製法などについては、 前述の WT1ワク チン応答性が高い患者の選択方法の項を参照されたい。
本発明の WT 1ワクチン標的分子の同定方法によれば、 患者固有の癌を処置で きる標的分子が同定される。 よって、 本発明は別の態様として、 本発明の同定方 法により同定された患者固有の WT 1ワクチン標的分子を含有する、 患者固有の 癌を処置するための当該患者用の医薬組成物、 および該同定方法により同定され た標的分子を投与する、 患者固有の癌を処置する方法を提供する。 本発明の医薬 組成物には癌ワクチンが含まれ、 当業者に周知のアジュバント等を含有すること ができる。
本発明はまた、 WT1由来の癌抗原ペプチドを含有する HLAモノマー、 HLAダイマ 一、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一を成分とする、 TOワクチン応答性が高 い患者の選択のための臨床検査薬を提供する。 以下 HLAテトラマーを例にとり本 発明の臨床検査薬につき説明する。
本発明の臨床検査薬の成分となる HLAテトラマーは、 前述のように HLA抗原の 鎖と 2ミクログロプリンを WT1由来の癌抗原ペプチドと会合させた複合体 （HLA モノマー） をピオチン化し、 アビジンに結合させることにより 4量体化したもの を指す （Science 279： 2103-2106 (1998)、 Science 274： 94-96 (1996) ) 0 ここで用いる癌抗原べプチドは、 WT1に由来する癌抗原ぺプチドであれば如何 なるものであっても良いが、 例えば配列番号： 2〜18に記戴の癌抗原ペプチドが 挙げられる。 好ましくは配列番号： 2〜5のいずれかに記載の癌抗原ぺプチドが挙 げられる。
当該 HIAテトラマーの各成分の調製法や HLAテトラマーの作製法については、 前 述の WT1ワクチン応答性が高い患者の選択方法の項こ記載したとおりである。 本発明の臨床検査薬は、 WT1ワクチン応答性が高い患者の選択のためのキット の 1成分とすることができる。 当該キットは、 前記本 月の臨床検査薬のみから なるキットであっても、 また本発明の臨床検査薬と他の成分とを含むキットであ つても良レ、。 当該キット中の他の成分としては、 蛍光標識ストレプトアビジン、 蛍光標識マウス抗ヒト CD8モノクローナル抗体、 蛍光標識マウス抗ヒト CD3モノク ローナル抗体などが挙げられる。 またエフェクター細胞を検出する場合は、 蛍光 標識マウス抗ヒト CD4SRAモノクローナル抗体、 蛍光標識マウス抗ヒト CD27モノク ローナル抗体を含むこともできる。
ここで 光色素としては、 フィコエリスリン （PE) 、 フルォレセインイソチォ シァネート （FITC) 、 ペリジニンクロロフィルプロテイン (PerCP) 、 ァロフィ コシァニン (APC) 、 フィコエリスリン一テキサスレッド（ECDとも称する） 、 フ ィコエリスリンーシァニン 5. 1 (PC5とも称する） などが拳げられる。
本発明の臨床検査薬およびキットは、 WT1ワクチン応答 t生が高い患者の選択に 使用できる他、 WT1ワクチンの標的分子 （治療用の標的分子） の選択にも使用す ることができる。 また同様の成分にて癌の診断薬として使用することもできる。 本発明 ίままた、 以下の工程 （a ) — ( c ) ： ( a ) CTLを含む生体試料を WT1ヮクチン投与後の患者より単離する工程、
( b ) 前記 ( a ) の生体試料中に存在する WT1特異的な CTLの存在頻度または量を 測定する工程、
( c ) 前記 （b ) の測定結果を WT 1ワクチン投与前のそれと比較して高いか否 力を判定し、 WT 1ワクチンによる治療の適合性を判断する工程、
を含む、 該患者における該 WT 1ワクチンの適合性を判定する方法、 および該判 定方法こより適合性ありと判定された患者を、 WT 1または WT 1由来の癌抗原 ぺプチドにより処置する、 該患者における癌を処置する方法を提供する。
後述の実施例に示したように、 WT1由来の癌抗原ペプチド （WT1ワクチン） によ る治療を実施中の患者における訂1特異的 CTLの頻度を測定したところ、 ぺプチド 投与前に対する投与後の CTL頻度の増加と治療効果とが相関していることを見出 した。 すなわち、 WT1ペプチド投与後の WT1特異的 CTLの頻度が、 ペプチド投与前 の CTL頻度に比して 1. 5倍以上増加した場合を 「免疫反応陽' 14」 と定義し、 この免 疫反応性と治療効果との関連性について評価した。 その結果、 免疫反応性と治療 効果の間には正の相関関係が認められた。 この結果から、 前記免疫反応性 （CTL の頻度や量の増加） を指標として、 対象患者において打1ワクチンによる治療が 適してレ、るかどうかを判断できることが明らかとなつ广こ。
すなわち本発明の判定方法は、 WT1ワクチン投与を実施中の患者において、 ぺ プチド投与による治療を続行するか否かといつた治療の適合性を判定するために、 有効に用いられる。
本発 ø月の判定方法における工程 ( a ) および （b ) の具体的な操作については、 前記 「訂 1ワクチン応答性が高い患者の選択方法」 の項に記載した通りであり、 具体的 (こは、 HLAモノマー法、 HLAダイマー法、 HLAテトラマー法、 HLAペンタマ一 法、 エリスポット法、 リアルタィム RT-PCR法または限界希釈法等により、 WT1特 異的な CTLの存在頻度または量を測定することにより行われる。
工程 （c ) における WT1ワクチンによる治療が適しているか否かの判断は、 WT1 ワクチン投与後の患者における WT1特異的な CTLの存在鎮度または量 （以下、 投与 後値とレヽう） を、 WT1ワクチン投与前のそれ （以下、 投与前値という） と比較し、 両者の蘧 、を判定することによって行うことができる。 ここで 「ワクチン投与後」 とは、 WT1ワクチンを 1回 上投与した後のどのタイ ミンク、'であっても良いが、 2週間間隔でのペプチド投与スケジュールの場合、 1回 目〜 5回目の WT1ヮクチン投与後、 より好ましくは 1回目〜3回目のぺプチド投与後 のタイミングが挙げられる。
WT1ワクチンによる治療が適している力否かの判断は、 WT1ワクチン投与後値が 投与前値に比して 1. 5倍以上高いことを指標として行うことができる。 すなわち、 投与後値が投与前値と.比較して 1. 5倍以上高ければ、 WHヮクチンによる治療が適 していると判断する。 この知見に基づき、 本発明は、 患者における該 WT 1ワク チンの適合性を判定する本発明方法により適合性ありと判定された患者を、 WT 1または WT 1由来の癌抗原ぺプチドにより処置する、 該患者における癌を処置 する方法をも提供する。
前記 CTLの測定法のうち、 手法の容易さおよび精度 O観点から最も好ましいの は HIAモノマ一法、 HLAダイマ一法、 HLAテトラマー法、 HLAぺンタマ一法である。 以下 HLAテトラマー法を例にとり説明する。
HIAテトラマー法は、 以下の工程（a ) 、 ( b ) 、 ( c ) および （d ) ：
( a ) CTLを含む生体試料を WT 1ワクチン投与後の息者より単離する工程、 ( b ) WT1由来の癌抗原ペプチドを含有する HLAテトラマーと、 前記 ( a ) の生体 試料とを接触させる工程、
( c ) HLAテトラマーに結合した WT1特異的な CTLの存在頻度または量を測定する 工程、
( d ) 前記 ( c ) の測定結果を WT 1ワクチン投与前のそれと比較して高い力否 力を判定し、 WT 1ワクチンによる治療の適合性を判断する工程、
を含んで行われる。
ここで HLAテトラマ一の成分とされる HLA抗原として〖 、 HLA-A24抗原または HLA - A2抗原が挙げられる。 また HLAテトラマーの成分とされる癌抗原ぺプチドと して【ま、 例えば Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 2 ) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3 ) 、 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配列番号： 4 )または Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配 列番^： 5 ) が挙げられる。 これら配列番号 2〜 5に IE載のぺプチドは全て HLA - A24結合性のぺプチドであるため、 前記本発明の判定法において用いられる HLAテ トラマーとしては、 配列番号： 2〜 5に記載のいず かのぺプチドと HLA- A24抗 原とを含有する HLAテトラマーが挙げられる。 さらに酉己列番号： 2および 4に記 載のペプチドは HLA- A2抗原に結合性のペプチドでも るため、 配列番号： 2また は 4記載のぺプチドと HLA - A2抗原とを含有する HLAテトラマーも挙げることがで さる。
前記本発明の判定方法および処置方法においては、 治療に用いたぺプチドと同 じぺプチド、 若しくは治療に用いたぺプチドにより餱導される CTLが交差反応性 を示すぺプチド、 を含有する HLAテトラマーを用いることが好ましい。 例えば患 者の治療において配列番号： 3に記載のペプチドを用いた場合は、 配列番号： 2 または 3に記載のぺプチドと HLA - A24抗原とを含有する HLAテトラマーが有効に用 いられる。
本発明の HLAテトラマーを用いた判定方法および処置方法における工程 ( a ) 〜 （c ) の具体的な操作については、 前記 「WT1ワクチン応答性が高い患者の選 択方法」 の項に記載した通りである。 また工程 （d ) については前述のように投 与前値と投与後値との比較に基づ!/、て判断される。
以下、 本発明の定方法および処置方法の具体例を示す。
まず、 WT1由来の癌抗原ペプチド投与前の癌患者から血液を採取し、 PBMCを分 離する （投与前試料） 。 次に、 ペプチド投与による洽療を実施した患者の血液を 採取して PBMCを分離する （投与後試料） 。 これら投与前試料、 投与後試料に対し て HLAテトラマーを添加し、 前記 「WT1ワクチン応答性が高い患者の選択方法」 の 項および実施例 3に記載の解析手法を用いてぺプチド、特異的 CTLの頻度を測定 · 算出する。 投与前試料における CTL頻度に比して、 投与後試料における CTL頻度が 1. 5倍以上高い場合に、 WT1ワクチンによる治療が適している （WT1ワクチンによ る治療効果があがると期待される） と判断する。
本発明はまた、 WT1由来の癌抗原ペプチドを含有する HLAモノマー、 HLAダイマ 一、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一を成分とする、 WT1ワクチンの適合性の 判定のための臨床検査薬、 および当該臨床検査薬を含有するキットを提供する。 当該臨床検査薬およぴキットの成分については前記 「WT1ワクチン応答性が高い 患者の選択のための臨床検査薬」 の項に記述した通りである。
以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に よりなんら限定されるものではない。 実施例 1
末梢血単核球の調製
HLA-A* 2402陽性の癌患者と HLA- A* 2402P易性の健常人からィンフォームドコンセ ントを取得した後、 採血をおこなった。 造血器悪性腫瘍患者は 18名で、 その内訳 は急性骨髄性白血病 (AML) 患者 11名、 急性リンパ性白血病 (ALL) 患者 2名、 慢 性骨髄性白血病 (CML) 患者 1名、 骨髄異形成定候群 (MDS)患者 4名であった。 肺癌 患者は 7名、 HLA-A* 2402陽性の健常人は 10名であつた。
造血器悪性腫瘍患者は、 診断時または治療経過において、 骨髄および末梢血検 体について WT1遺伝子の有意な高発現力 S1回以上碓認されている。 また肺癌患者は、 生体検体または摘出標本で WT1遺伝子の高発現が確認されている。
採取した血液から Ficoll- Hypaqueの密度勾配遠心法により末梢血単核球
(PBMC) を分離し、 液体窒素中で凍結保存した。 実施例 2
HLAテトラマーの調製
WT1タンパク質の 235番目から 243番目の 9アミノ酸から成るペプチド （配列番 号： 2 ) を用い、 文献 （Int. J. Cancer: 100, 565-570, 2002) に記載の方法に より蛍光色素 Phycoerythrin (PE)で標識した HIA - A* 2402のテトラマーを作製した。 まず、 組換え可溶性 HLA- A* 2402の c D N Aを： t#幅するため、 下記正プライマ 一： 5，- CCATGGGCAGCCATTCTATGCGCTATTTTTCTACCTCCGT- 3， （配列番号： 19)および逆 向きプラィマー： 5'-GGATCCTGGCTCCCATCTCAGGGrGAGGGGCTTGGGCAGACCCTC- 3， （配列 番号： 20)を用いて、 HLA- A* 2402 (GenBank Acc. No. M64740) 発現プラスミドを铸 型とし、 P C Rを行った。 逆向きプライマーは、 C末端でフレームが一致するよ うに B i r A認識配列をコードしている。 増幅した断片を制限酵素 Ncolおよび BamHlで切断し、 pETlldベクター （Novagen社） にクローニングした。 次に、 糸且換えヒト j3 2ミクログロブリンの c D N Aを増幅するため、 下記正プ ライマー： 5，- CATATGATCCAGCGTACCCCGAAAATTCAG- 3， （配列番号： 21)および逆向き プライマー： 5'- GGATCCTTACATGTCTCGATCCCACTrAAC - 3' (配列番号： 22)を用いて、 ヒト /3 2ミクログロブリン （GenBank Acc. No. AB021288)発現プラスミドを铸型 とし、 P C Rを行った。 増幅した断片を制限酵素 Ndelおよび BaraHlで切断し、 pETllaベクター （Novagen社） にクロー-ングした。
前記 2種類のベクターを大腸菌 B L 2 1で努現させ、 インクルージョンボディ 一の不溶画分として回収した。 それぞれのィンクルージョンポディ一は 8M尿素溶 液で溶解後、 リフォールデイングバッファーで希釈し、 更にペプチド （配列番 号： 2 ) を添加して可溶性の HLA-ペプチド複合体を形成させた。 次に HLA -ぺプチ ド複合体の C末端部位の配列を Bir A酵素により ピオチン化し、 ゲルろ過法でピオ チン化された HLA-ぺプチド複合体を精製した。 ビォチン化された HLA -ぺプチド複 合体と Ρβ標識されたアビジン （Molecular Probe社） を 4： 1のモル比で混合して、 HLAテトラマーを調製した。 実施例 3
WT1特異的 CTL前駆細胞の HLAテトラマーによる角军析
実施例 1の凍結した PBMCを解凍した直後に 0. 5%ゥシ胎児血清 （FCS) を含むリ ン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に I X 106個/ mlで再浮遊し、 実施例 2で調製したテト ラマー溶液 (500 ^ g/ /i l) 2 i lを加え、 37°Cで 30分間インキュベートした。 陰性 対照として、 テトラマーの代わりに PE標識したストレプトアビジン （Becton Dickinson社） を添加し、 同様に処理をした検体も用意した。 その後氷中で急冷 し、 FITC標識マウス抗ヒト CD8モノクローナル抗体 （BD Pharmigen社） 及ひ erCP 標識マウス抗ヒト CD3抗体 （BD Pharmigen社） を各 15 添加して、 4°Cで 30分間 ィンキュベートした。 染色した細胞は、 0. 5°/oFCSを含む PBSで 2回遠心洗浄した後、 フローサイトメーター FACSort (Becton Dickinson社） で解析した。 CD3陽性及び CD8陽性の細胞 （CD3+CD8+)を選択し、 その選択した細胞中のテトラマー陽性細胞 (CD3+ CD8+ tetraraer+ )の割合 （頻度） から陰性 照の PE標識ストレプトアビジン 陽性細胞 （CD3+ CD8+ avidin+ ) の割合を差し引レヽた数値を WT1抗原ぺプチド特異的 CTL前駆細胞の割合とした：
WT1抗原ペプチド特異的 CTL前駆細胞 （％) =
[ (CD3+CD8+ tetramer+細胞数 ZCD3+ CD8+細胞数） 一
(CD3+ CD8+ avidin+細胞数 ZCD3+ CD8+細胞数） ] X 100 癌患者と健常人 PBMCを解析した結果を表 2に示す。 また、 この結果を疾患別に プロットしたものを図 1に示す。 この結果から、 CD3/CD8陽性細胞中の訂1抗原べ プチド特異的 CTL前駆細胞の割合は、 健常人では 0. 47〜1. 30%で平均が 0. 82%で あつたが、 造血器悪性腫瘍患者では、 1. 04〜29. 45%で平均が 5. 24%、 肺癌患者 では 0. 33-5. 97%で平均が 2. 44%であり、 統計解析により健常人に比べて造血器 悪性腫瘍患者及ぴ肺癌患者では有意に増加していることが明らかとなった （pく 0. 05) 。
表 2
検体名 CTLプリカーサ一頻度 (%) 急性骨髄性白血病 （AML) 患者 1 8. 26
急性骨髄性白血病 (AML) 患者 2 8. 01
急性骨髄性白血病 (AML) 患者 3 5. 12
急性骨髄性白血病 （AML) 患者 4 3. 84
急性骨髄性白血病 （AML) 患者 5 4. 51
急性骨髄性白血病 (AML) 患者 6 3. 27
急性骨髄性白血病 （AML) 患者 7 2. 68
急生骨髄性白血病 （AML) 患者 8 2. 60
急性骨髄性白血病 (AML) 患者 9 1. 77
急个生骨髄性白血病 （AML) 患者 10 1. 04
急性骨髄性白血病 （AML) 患者 11 1. 49
急性リンパ性白血病 (ALL) 者 1 7. 32
急性リンパ性白血病 (ALL) 息者 2 1. 78
慢性骨髄性白血病 (CML) 患者 2. 46
骨髄異形成症候群 ( DS)患营 1 29. 45
骨髄異形成症候群 (MDS)患营 2 2. 99
骨髄異形成症候群 (MDS)患营 3 2. 81
骨髄異形成症候群 (MDS)患营 4 2. 08
肺癌患者 1 5. 97 肺癌患者 2 3. 83 肺癌患者 3 2. 63 肺癌患者 4 1. 89 肺癌患者 5 1. 69 肺癌患者 6 0. 72 肺癌患者 7 0. 33
健常人 1 1. 30
健常人 2 1. 05
健常人 3 1. 08
健常人 4 0. 85
健常人 5 0. 81
健常人 6 0. 79
健常人 7 0. 61
健常人 8 0. 64
健常人 9 0. 57
健常人 10 0. 47 実施例 4
ぺプチド投与における訂1特異的 CTLの頻度解析
以下の試験は、 大阪大学医学部の倫理委員会の承認を受け、 癌患者のインフォ ームドコンセントを得た上で実施された。
WT1の 235番目から 243番目までの配列のペプチド （配列番号： 2 ) または、 こ のぺプチドの N末端から 2番目のメチォユンをチロシンに置換した改変ぺプチド
(配列番号： 3 ) を癌患者に 1回当たり、 0. 3mg、 lragまたは 3tng投与した。 投与 するぺプチドは Montanide ISA51 (SEPPIC社）を用いてエマ/レション化して、 1回若 しくは 2週間間隔で複数回皮内投与した。 者としては、 HLA- A*2402陽性および
WT1陽性である肺癌、 乳癌、 または白血病の患者を対象とした。
投与べプチドに対する免疫反応は、 実施例 3と同様の HLAテトラマー法でぺプ チド特異的 CTL頻度を測定して評価した。 ぺプチド投与後のいずれかの段階での ぺプチド特異的 CTL頻度がぺプチド投与前の 1. 5倍以上増加した場合を 「免疫反応 陽性」 と定義した。 また、 ペプチド投与後に B重瘍マーカー値の低下、 腫瘍細胞や 腫瘍容積の減少が認められた場合を 「治療効果有り」 と判定した。 ペプチド投与 による免疫反応と治療効果がともに評価可能であつた 19名の癌患者について、 免 疫反応と治療効果の相関をカイ 2乗検定により評価した。 その結果、 治療効果が 認められた 11名の患者の内、 8名 (73%) で免疫反応陽性であつたが、 治療効果 の認められなかった 8名の内、 免疫反応陽ィ生であつたのはわずか 2名 （25%) の みであり、 治療効果と免疫反応には有意な正の相関 （P=0. 0397) が認められた。 この結果より、 投与ぺプチド特異的な CTLの誘導は、 治療効果にとって重要なフ ァクターであることが示された。 またべプチド投与による治療が順調に進んでレ、 ることの確認や、 ぺプチド投与による治療を続行する力否かの判断において、 前 記免疫反応性が 1つの指標となることが示された。 実施例 5
WT1特異的 CTLの機能解析
HLAテトラマー染色陽性おょぴ CD8陽性の抗原ぺプチド特異的 CTLは、 更に抗 CD45M抗体と抗 CD27抗体で染色することにより、 機能的に細分類できることが報 告されている （J. Exp. Med. , 186, pl407, 1997) 。 CD45RA陽性かつ CD27陽性 f ナイーブ型、 CD45RA陰性かつ CD27陽性、 および CD45RA陰性かつ CD27陰性はメモリ 一型、 そして CD45RA陽性かつ CD27陰性はエフェクター型に分類される。 エフェク ター型が、 強い CTL活性を示す細胞集団である。
実施例 4の臨床研究に参加した HLA-A*2— 402陽性の癌患者 24名 （血液癌 14名、 固 形癌 10名） のぺプチド投与前の PBMC及びィンフォームドコンセントを取得して採 取した HLA_A*2402陽性の健常人の PBMCを用いて、 HLAテトラマー染色陽性および
CD8陽性の WT1ぺプチド特異的 CTL前駆細胞の機能分析を行つた。 フ口一サイトメ 一ター解析用に実施例 3と同様な方法で細胞を HLAテトラマー、 抗 CD8抗体、 抗 CD45RA抗体、 抗 CD27抗体で染色した。 HLAテトラマー陽性かつ CD8陽性の細胞集 団における、 CD45RA陽性/ CD27昜性のナイーブ型、 CM5RA陰性のメモリー型、 CD45RA陽性/ CD27陰性のエフェクター型の割合 （％) を、 それぞれ算出した。 ナ ィーブ型、 メモリー型、 エフェクター型の比率はそれぞれ、 癌患者で 23. 7°ん 45. 5%、 30. 8%であった。 一方健常人ではそれぞれ、 35. 9%、 53. 8% 8. 9%であった。 癌患者と健常人で比較すると、 ュフエクタ一型については、 癌患者で有意に比率 が高かったが （pく 0. 05) 、 ナイーブ型、 メモリー型については有意な差は認め られなかった。 実施例 3で癌患者では WT1特異的 CTL前駆細胞が増加していること を示したが、 それらの内で癌患者ではエフェクター型の機能を持った CTLの割合 が増加していることが明らかとなった。 この結果より、 エフェクター型の CTL前 駆細胞の存在頻度を 1つの指標として癌患者を診断できることが示された。 産業上の利用可能性
本発明により、 WT 1特異的 C T L前駆細胞の頻度を指標とした、 WT 1 ワク チン応答性が高い患者の選択方¾およびそれを利用する癌の処置方法や、 その選 択のための臨床検査薬などが提供される。 本発明の選択方法により、 より WT1ヮ クチン療法による効果の期待される患者を選択することができ、 癌に対する 切 な処置を施すことが可能となる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 以下の工程 （a) 、 (b) および （c) ：
(a) CT L前駆細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
(b) 前記 （a) の生体試料中に存在する WT 1特異的な CTL前駆細胞の存在 頻度または量を測定する工程、.
(c) 前記 （b) の測定結果を健常人のそれと比較して高い力否かを判定し、 W T 1ワクチン応答性を判断する工程、
を含む、 WT 1ワクチン応答性が高い患者の選択方法。
2. WT 1特異的な CTL前駆細胞の存在頻度または量を、 HLAモノマー 法、 HL Aダイマー法、 Aテトラマー法、 HL Aペンタマ一法、 エリスポッ ト法、 リアルタィム R T— P C R法および限界希釈法のいずれかの方法により測 定する、 請求項 1記載の選択方法。
3. H L Aテトラマー法により測定する、 請求項 2記載の選択方去。
4. 以下の工程 (a) 、 (b) 、 (c) および （d) ：
(a) CT L前駆細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
(b) WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する H LAテトラマーと、 前記 (a) の生体試料とを接触させる工程、
(c) HLAテトラマーに結合した WT 1特異的な CT L前駆細胞の存在頻度ま たは量を測定する工程、
(d) 前記 （c) の測定結果を健常人のそれと比較して高いか否かを判定し、 W T 1ワクチン応答性を判断する工程、
を含む、 請求項3記載の選択方法。
5. 請求項 4に記載の工程 (c) 力 CD 8陽性または CD 8/CD 3陽性 の C T L前駆細胞中での H L Aテトラマー結合細胞の割合を測定すること こより 行われる、 請求項 4記載の選択方法。
6. HL Aテトラマーの構成成分である HL A抗原が HLA— A 24抗原ま たは H LA-A2抗原である、 請求項 4または 5記載の選択方法。
7. WT 1由来の癌抗原ぺプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 2 ) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配歹 U番号： 3 ) 、 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (酉己歹 Ij番号： 4)および Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (酉己列番号： 5) より選択される、 請求項 4〜 6いずれか 記載の選択方法。
8. フローサイトメ トリーを用いて行われる請求項 1〜 7いずれか記載の選 択方法。
9. WT 1特異的な C T L前駆細胞の存在頻度または量が、 健常人の値と比 較して 1. 5倍以上高いことを指標として WT 1ワクチン応答性を判断する、 請 求項 1〜 8いずれか記載の選択方法。
10. CTL前駆糸田胞がエフェクター型 CTL前駆細胞である、 請求項 1記 載の選択方法。
1 1. WT 1特異的なエフェクタ一型 C T L前駆細胞の存在頻度または量の 測定に、 HL Aモノマー法、 HL Aダイマー法、 HL Aテトラマー法、 HLAぺ ンタマ一法、 エリスポント法、 リアルタイム RT— PC R法および限界希釈法の いずれかの方法を利用する、 請求項 10記載の選択方法。
12. H L Aテトラマー法を利用する、 請求項 11記載の選択方法。
13. 以下の工程 (a) 、 (b) 、 (c) および （d) ：
(a) CT L前駆細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
(b) WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する HLAテトラマー、 抗 CD 8抗体、 抗 CD 45 RA抗体お び抗 CD 27抗体と、 前記 (a) の生体試料とを接触さ せる工程、
(c) CD 8陽性また【ま CD 8 ZCD 3陽性であり、 かつ HL Aテトラマー結合 陽性の C T L前駆細胞 での、 C D 45 R A陽性かつ C D 27陰性のェフエクタ 一型 C T L前駆細胞の割合を測定する工程、
(d) 前記 (c) の測定結果を健常人のそれと比較して高い力否かを判定し、 W
T 1ワクチン応答性を半 IJ断する工程、
を含む、 請求項 12記载の選択方法。
14. 11し テトラマーの構成成分でぁる^11^ 抗原が^1し ー 24抗原 または HL A— A 2抗原である、 請求項 13記載の選択方法。
15. WT 1由来の癌抗原べプチドが、 Cys Met Thr Γ ρ Asn Gin Met Asn Leu (配歹 U番号： 2) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3 ) 、 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (酉己歹 I墦号： 4)お び Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 5) より選択される、 請求項 13または 14
5 記載の選択方法。
16. フローサイトメトリーを用いて行われる請求項 L 0〜15いずれか記 載の選択方法。
17. 以下の工程 （a) 、 （b) および （c) ：
(a) CT L前駆細胞を含む生体試料を被験者より単離する工程、
L0 (b) 前記 （a) の生体試料中に存在する WT 1特異的な C TL前駆細胞の存在 頻度または量を測定する工程、
(c) 前記 (b) の測定結果を健常人のそれと比較して高い力否かを判定し、 癌 の罹患を判断する工程、
を含む、 癌の診断方法。
.5 18. WT 1特異的な CTL前駆細胞の存在頻度または量を、 HLAモノマ 一法、 FiLAダイマー法、 HL Aテトラマー法、 HL Aペンタマ一法、 エリスポ ット法、 リアルタイム RT— PCR法および限界希釈法のいずれかの方法により 測定する、 請求項 17記載の診断方法。
19. H L Aテトラマー法により測定する、 請求項 18記載の診断方法。 0 20. 以下の工程 （a) 、 (b) 、 (c) および （d) ：
(a) C T L前駆細胞を含む生体試料を被験者より単離する工程、
(b) WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する H LAテトラマーと、 前記 （a) の生体^:料とを接角虫させる工程、
(c) H L Aテトラマーに結合した WT 1特異的な C T L前馬区細胞の存在頻度ま 5 たは量を測定する工程、
(d) 前記 （c) の測定結果を健常人のそれと比較して高いか否かを判定し、 癌 の罹患を判断する工程、
を含む、 請求項 19記載の診断方法。
21. 請求項 20に記載の工程 （ c ) 力 CD 8陽性または CD8ZCD3 陽性の C T L前駆細胞中での H LAテトラマー結合細胞の割合を測定することに より行われる、 請求項 20記載の診断方法。
22. HL Aテトラマーの構成成分である: HL A抗原が HL A— A 24抗原 または HLA— A2抗原である、 請求項 20または 21記載の診断方法。
23. WT 1由来の癌抗原べプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn
Leu (配列番号： 2) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3) 、 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配歹' J番号： 4)および Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 5) より選択される、 請求項 20〜22いず れか記載の診断方法。
24. フローサイトメトリーを用いて行われる請求項 1 7〜 23いずれ力、記 載の診断方法。
25. WT 1特異的な CTL前駆細胞の存在頻度または量が、 健常人の値と 比較して 1.5倍以上高いことを指標として癌の罹患を判断する、 請求項 17〜 24いずれ力記載の診断方法。
26. CT L前駆細胞がエフェクター型 C T L前駆細胞である、 請求項 17 記載の診断方法。
27. WT 1特異的なエフェクター型 CT L前駆細胞の存在頻度または量の 測定に、 HLAモノマー法、 HLAダイマー法、 HLAテトラマー法、 HLAぺ ンタマ一法、 エリスポット法、 リアルタイム RTT— PC R法および限界希釈法の いずれかの方法を利用する、 請求項 26記載の言多断方法。
28. HL Aテトラマー法を利用する、 請求項 27記載の診断方法。
29. 以下の工程 （a) 、 (b) 、 (c) および （d) ：
(a) CTL前駆細胞を含む生体試料を被験者より単離する工程、
(b) WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する； HLAテトラマー、 抗 CD 8抗体、 抗 CD 45 RA抗体および抗 CD 27抗体と、 記 （a) の生体試料とを接触さ せる工程、
(c) CD 8陽性または CD 8ZCD 3陽性であり、 かつ HLAテトラマー結合 陽性の C T L前駆細胞中での、 C D 45 R A陽个生かつ C D 27陰†生のエフェクタ 一型 C T L前駆細胞の割合を測定する工程、 (a) 前記 (c) の測定結果を健常人のそれと比較して高い力否かを判定し、 の罹患を判断する工程、
を含む、 請求項 28記載の診断方法。
30. HLAテトラマーの構成成分である HLA抗原が HLA— A24抗原 または HLA— A2抗原である、 請求項 29記載の診断方法。
31. WT 1由来の癌抗原ぺプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 2) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3) - Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配列番号： 4)および Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番 ： 5) より選択される、 請求項 29または 30 記載の診断方法。
32. フローサイトメトリーを用いて行われる請求項 26~31いずれか記 載の診断方法。
33. 以下の工程 (a) - (d) ：
(a) CT L前駆細胞を含む生体試料を被験患者より単離する工程、
(b) 前記 （a) の生体試料に複数の WT 1ワクチンの標的分子をそれぞれ適用 し、
(c) 前記 (b) の生体試料中それぞれに存在する WT1特異的な CTL前駆細 胞の存在頻度または量を測定し、 それぞれ比較する工程、
(d) 前記 (c) の測定結果に基づいて、 その患者に有効な WT1ワクチンの標 的分子を同定する工程、
を含む、 患者固有の WT 1ワクチン標的分子の同定方法。
34. WT 1特異的な C T L前駆細胞の存在頻度または量を、 H L Aモノマ 一法、 HL Aダイマー法、 HL Aテトラマー法、 HL Aペンタマ一法、 エリスポ ット法、 リアルタィム R T— P C R法および限界希釈法のいずれかの方法により 測定する、 請求項 33記載の同定方法。
35. H L Aテトラマー法【こより測定する、 請求項 34記載の同定方法。
36. 以下の工程 （a) — （d) ：
(a) CT L前駆細胞を含む生^ ^料を被験患者より単離する工程、
(b) WT 1由来の複数の癌抗原ペプチドを含有する複数の HLAテトラマーと、 前記 (a) の生体試料とをそれぞれ接触させる工程、
(c) HLAテトラマーに結合した WT 1特異的な CTL前駆細胞の存在頻度ま たは量をそれぞれ測定し、 比較する工程、
(d) 前記 (c ) の測定結果に基づいて、 その患者に有効な^^ T 1由来の癌抗原 ペプチドを同定する工程、
を含む、 請求項 35記載の同定方法。
37. 請お項 36に記載の工程 （ c ) 力 CD8陽性または CD8ノ CD3 陽性の C T L前駆細胞中での H L Aテトラマー結合細胞の割合を測定することに より行われる、 請求項 36記載の同定方法。
38. HL Aテトラマーの構成成分である HLA抗原が H!LA— A24抗原 または HLA— A 2抗原である、 請求項 36または 37記載の同定方法。
39. W 1由来の癌抗原ぺプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (酉己列番号： 2 ) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3 ) 、 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配列番号： 4)および Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 5) より選択される、 請求項 36〜 38いず れか記載の同定方法。
40. フローサイトメ トリーにより行われる請求項 33〜39いずれか記載 の同定方法。
41. WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する HL Aモノマー、 HLAダイ マー、 HLAテトラマーまたは HL Aペンタマ一を成分とする、 WT 1ワクチン 応答性が高レヽ患者の選択のための臨床検查薬。
42. HLAモノマー、 HLAダイマー、 H L Aテトラマーまたは H L Aぺ ンタマーの構成成分である HL A抗原が HLA— A 24抗原または HLA— A2 抗原である、 請求項 41記載の臨床検査薬。
43. WT 1由来の癌抗原ぺプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn
Leu (配列番号： 2 ) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3 ) 、
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配列番号： 4)および Arg Tyr Pro Ser
Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 5) より選択される、 請求項 41または 42 に記載の臨床検査薬。
4 4. 請求項 4 1〜 43いずれか記載の臨床検査薬を含有するキット。
4 5. 請求項 3 3〜 40 、ずれか記載の患者固有の WT 1ヮクチン標的分子 の同定方法により同定された標的分子を含有する、 患者固有の癌を処置するため の当該患者用の医薬組成物。
5 4 6. WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する HL Aモノマー、 HL Aダイ マー、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一を成分とする、 癌の診断薬。
4 7. HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAぺ ンタマーの構成成分である HL A抗原が HL A— A 24抗原または HL A— A 2 抗原である、 請求項 46記載の診断薬。
10 4 8. WT 1由来の癌抗原ぺプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn
Leu (酉己列番号： 2) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3 ) 、 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配歹幡号： 4)および Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 5) より選択される、 請求項 46または 47 に記載の診断薬。
L5 4 9. 請求項 46〜48いずれ力記載の診断薬を含有するキット。
5 O. 以下の工程 （a) 、 (b) および （c) ：
(a) CTLを含む生体試料を WT 1ワクチン投与後の患者より単離する工程、
(b) 前記 （a) の生体試料中に存在する WT 1特異的な CTLの存在頻度また は量を測定する工程、
]0 (c) 前記 （b) の測定結果を WT 1ワクチン投与前 (^それと比較して高いか否 かを判定し、 WT 1ワクチンによる治療の適合性を判断する工程、
を含む、 該患者における該 WT 1ワクチンの適合性を ¾J定する方法。
5 1. WT 1特異的な CTLの存在頻度または量を、 HLAモノマー法、 H LAタ、、イマ一法、 HLAテトラマー法、 HLAペンタ 一法、 エリスポット法、 15 リァズレタィム R T— P C R法おょぴ限界希釈法のいず かの方法により測定する、 請求項 50記載の判定方法。
5 2. H L Aテトラマー法により測定する、 請求項 5 1記載の判定方法。 5 3. 以下の工程 （a) 、 （b) 、 （c) および （d) ：
(a) CTLを含む生体試料を WT 1ワクチン投与後の患者より単離する工程、 (b) WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する Hし Aテトラマーと、 前記 （a) の生体試料とを接触させる工程、
(c) H LAテトラマーに結合した WT 1特異的 feC TLの存在頻度または量を 測定する工程、
(d) 前記 （c) の測定結果を WT 1ワクチン投 前のそれと比較して高いか否 かを判定し、 WT 1ワクチンによる治療の適合性 判断する工程、
を含む、 請求項 52記載の判定方法。
54. 請求項 53に記載の工程 （c) 力 CD 8陽性または CD 8ZCD 3 陽性の C T L中での H L Aテトラマー結合細胞の W合を測定することにより行わ れる、 請求項 53記載の判定方法。
55. HL Aテトラマーの構成成分である Hし A抗原が HLA— A 24抗原 または HLA— A2抗原である、 請求項 53また ίま 54記載の判定方法。
56. WT 1由来の癌抗原ぺプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 2) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3 ) 、 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (酉己歹 !j番号 ： 4)および Arg Tyr Pro Ser
Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 5) より選択される、 請求項 53〜55レ、ず れか記載の判定方法。
57. フローサイトメトリーを用いて行われる請求項 50〜56いずれ力記 載の判定方法。
58. WT 1特異的な CTLの存在頻度またぼ量が、 WT 1ワクチン投与前 の値と比較して 1.5倍以上高いことを指標として1 WT 1ワクチンによる治療が 適しているか否かを判断する、 請求項 50〜57いずれ力記載の判定方法。
59. WT 1由来の癌抗原ペプチドを含有する HL Aモノマー、 HLAダイ マー、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一 成分とする、 WT 1ワクチン の適合性の判定のための臨床検査薬。
60. HLAモノマー、 HLAダイマー、 Hし Aテトラマーまたは H L Aぺ ンタマーの構成成分である HL A抗原が HL A— 24抗原または HL A— A 2 抗原である、 請求項 59記載の臨床検查薬。
61. WT 1由来の癌抗原ぺプチドが、 Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 2) 、 Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3) 、 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (配列番号： 4)およぴ Arg Tyr Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe (配列番号： 5) より選択される、 請求項 59または 60 に記載の臨床検査薬。
62. 請求項 59〜61いずれ力記載の臨床検査薬を含有するキット。
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CN2004800245592A CN1842603B (zh) 2003-06-27 2004-06-25 选择适于wt1疫苗患者的方法
KR1020117006813A KR101431312B1 (ko) 2003-06-27 2004-06-25 Ｗｔ1 백신 적응 환자의 선택 방법
KR1020057024941A KR101292971B1 (ko) 2003-06-27 2004-06-25 Ｗｔ1 백신 적응 환자의 선택 방법
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2009072610A1 (ja) * 2007-12-05 2011-04-28 株式会社癌免疫研究所 癌ワクチン組成物
JP2012149101A (ja) * 2005-02-04 2012-08-09 Survac Aps サバイビンペプチドワクチン
EP2561759A1 (en) 2011-08-26 2013-02-27 Bayer Cropscience AG Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth
WO2013037955A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of acylsulfonamides for improving plant yield
WO2013037956A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of 5-phenyl- or 5-benzyl-2 isoxazoline-3 carboxylates for improving plant yield
WO2013037958A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of phenylpyrazolin-3-carboxylates for improving plant yield
US9949485B2 (en) 2013-03-05 2018-04-24 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Use of acylsulfonamides for improving plant yield
US9963431B2 (en) 2013-03-05 2018-05-08 Bayer Cropscience Ag Use of quinoline derivatives for improving plant yield
EP3318135A1 (en) 2016-11-03 2018-05-09 Perfetti Van Melle S.p.A. Effervescent candy material, a process for its preparation and products made therefrom
WO2021230247A1 (ja) * 2020-05-12 2021-11-18 大日本住友製薬株式会社 癌を処置するための医薬組成物

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100767554B1 (ko) * 1998-07-31 2007-10-17 인터내셔널 인스티튜트 오브 캔서 이무놀로지 인코퍼레이티드 암 억제 유전자 더블유티1의 생산물에 기초한 암항원
EP1371664B1 (en) 2001-03-22 2008-01-09 International Institute of Cancer Immunology, Inc. Wti modified peptide
JP4611022B2 (ja) * 2002-09-12 2011-01-12 株式会社癌免疫研究所 癌抗原ペプチド製剤
ES2478446T3 (es) 2003-06-27 2014-07-22 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Método de selección de pacientes candidatos para la vacuna contra WT1
ES2378264T3 (es) 2003-11-05 2012-04-10 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Péptido antigénico de unión a HLA-DR derivado de WT1
ATE462003T1 (de) * 2004-03-31 2010-04-15 Int Inst Cancer Immunology Inc Aus wt1 stammende krebsantigenpeptide
AU2006304573B2 (en) 2005-10-17 2012-05-24 Sloan Kettering Institute For Cancer Research WT1 HLA class II-binding peptides and compositions and methods comprising same
WO2007063903A1 (ja) * 2005-11-30 2007-06-07 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. 新規ペプチド化合物
PL2010209T3 (pl) 2006-04-10 2017-04-28 Sloan Kettering Inst For Cancer Res Immunogeniczne peptydy WT-1 i sposoby ich użycia
EP2032719A2 (en) * 2006-06-02 2009-03-11 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Method for identifying whether a patient will be responder or not to immunotherapy
NZ578721A (en) 2007-02-27 2012-04-27 Int Inst Cancer Immunology Inc Method for activation of helper t cell and composition for use in the method
CN101668853B (zh) * 2007-03-05 2013-07-31 株式会社癌免疫研究所 癌抗原特异性t细胞受体基因、由该基因编码的肽及其使用
BR112013008230A2 (pt) 2010-10-05 2016-06-14 Int Inst Cancer Immunology Inc método para ativar célula t auxiliar
EP3447140A3 (en) 2011-06-28 2019-05-29 International Institute of Cancer Immunology, Inc. Receptor gene for peptide cancer antigen-specific t cell
EP2802347B1 (en) 2012-01-13 2019-01-09 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immunogenic wt-1 peptides and methods of use thereof
JP6273290B2 (ja) 2012-10-23 2018-01-31 ユビバック エルエルシー 疾患の処置のための同種異系のオートファゴソーム強化組成物
EP2933261B1 (en) 2012-12-17 2020-06-10 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method for activating helper t cell
CA2898099C (en) * 2013-01-15 2025-09-16 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immunogenic wt-1 peptides and methods of use thereof
US10815273B2 (en) 2013-01-15 2020-10-27 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immunogenic WT-1 peptides and methods of use thereof
JP6469074B2 (ja) * 2013-03-28 2019-02-13 サントル オスピタリエ ユニヴェルシテール ド モンペリエ 放射線感受性を判定するための方法
AU2014266396A1 (en) 2013-05-13 2015-12-03 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Method for predicting clinical effect of immunotherapy
AU2016356708B2 (en) 2015-11-20 2022-02-03 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods and compositions for treating cancer
AU2018390881A1 (en) 2017-12-21 2020-07-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to HLA-A2/WT1

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002028414A1 (en) * 2000-10-06 2002-04-11 Corixa Corporation Compositions and methods for wt1 specific immunotherapy
JP2002525099A (ja) * 1998-09-30 2002-08-13 コリクサ コーポレイション Ｗｔ１特異的免疫療法のための組成物および方法
JP2003500004A (ja) * 1998-11-02 2003-01-07 インペリアル・カレッジ・イノベイションズ・リミテッド Ｗｔ−１とｇａｔａ−１のエピトープを用いた免疫治療方法
WO2003002142A1 (fr) * 2001-06-29 2003-01-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Vaccin anticarcinogene contenant un antigene tumoral base sur un produit de gene wt1 suppresseur de tumeur et des liposomes cationiques
WO2003028757A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-10 Haruo Sugiyama Novel method of inducing antigen-specific t cells

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4923799A (en) 1984-02-06 1990-05-08 The Ontario Cancer Institute T cell specific cDNA clone
US6582908B2 (en) 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
JPH07504399A (ja) 1991-08-28 1995-05-18 ザ・ウィスター・インスティチュート Ｔ細胞リセプターに基づいた慢性間接リウマチの治療法
US5364787A (en) 1992-03-23 1994-11-15 Idaho Research Foundation Genes and enzymes involved in the microbial degradation of pentachlorophenol
ES2242221T3 (es) * 1996-04-16 2005-11-01 Kishimoto, Tadamitsu Procedimiento para la deteccion de celulas de cancer solido y de heterotipia histologica y procedimiento para el examen de tejidos destinados a trasplantes de medula osea y al trasplante de celulas madre sanguineas perifericas.
GB9710820D0 (en) 1997-05-27 1997-07-23 Univ Dundee Immunological method
US6013444A (en) 1997-09-18 2000-01-11 Oligotrail, Llc DNA bracketing locus compatible standards for electrophoresis
WO1999027957A1 (en) 1997-12-03 1999-06-10 The Immune Response Corporation Vaccination and methods against multiple sclerosis using specific tcr vbeta peptides
WO1999060120A2 (en) 1998-05-19 1999-11-25 Avidex Limited Soluble t cell receptor
KR100767554B1 (ko) 1998-07-31 2007-10-17 인터내셔널 인스티튜트 오브 캔서 이무놀로지 인코퍼레이티드 암 억제 유전자 더블유티1의 생산물에 기초한 암항원
US20030235557A1 (en) * 1998-09-30 2003-12-25 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
AU774952B2 (en) 1999-02-23 2004-07-15 Baylor College Of Medicine T cell receptor Vbeta-Dbeta-Jbeta sequence and methods for its detection
WO2001094944A2 (en) * 2000-06-02 2001-12-13 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Artificial antigen presenting cells and methods of use thereof
AU2002222610A1 (en) 2000-12-13 2002-06-24 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Transgenic animal expressing hla-a24 and utilization thereof
EP1371664B1 (en) 2001-03-22 2008-01-09 International Institute of Cancer Immunology, Inc. Wti modified peptide
EP2192407A3 (en) 2001-09-18 2011-04-27 Green Peptide Co., Ltd. Method of detecting cellular immunity and application thereof to drugs
US20050002951A1 (en) 2001-09-28 2005-01-06 Haruo Sugiyama Novel method of inducing antigen-specific t cells
AU2003207528A1 (en) 2002-01-09 2003-07-30 Maxx Genetech Co. Ltd Method of detecting t-cell proliferation for diagnosis of diseases by gene array
AU2003242305A1 (en) 2002-06-12 2003-12-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Hla-a24-restricted cancer antigen peptide
JP4611022B2 (ja) * 2002-09-12 2011-01-12 株式会社癌免疫研究所 癌抗原ペプチド製剤
WO2004063706A2 (en) 2003-01-08 2004-07-29 Maxx Genetech Co., Ltd. Method of detecting over-expression of t-cell receptor genes by real-time pcr
ES2478446T3 (es) 2003-06-27 2014-07-22 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Método de selección de pacientes candidatos para la vacuna contra WT1
ES2378264T3 (es) * 2003-11-05 2012-04-10 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Péptido antigénico de unión a HLA-DR derivado de WT1
US20070238099A1 (en) 2003-12-08 2007-10-11 Cohen Irun R Antigen Receptor Variable Region Typing
US7576183B2 (en) 2003-12-24 2009-08-18 Los Alamos National Security, Llc Structure-based receptor MIMICS targeted against bacterial superantigen toxins
ATE462003T1 (de) * 2004-03-31 2010-04-15 Int Inst Cancer Immunology Inc Aus wt1 stammende krebsantigenpeptide
GB0411771D0 (en) 2004-05-26 2004-06-30 Avidex Ltd Nucleoproteins displaying native T cell receptor libraries
GB0427585D0 (en) 2004-12-16 2005-01-19 Avidex Ltd Assay
WO2008026927A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Academisch Medisch Centrum Process for displaying t- and b-cell receptor repertoires
CN101668853B (zh) 2007-03-05 2013-07-31 株式会社癌免疫研究所 癌抗原特异性t细胞受体基因、由该基因编码的肽及其使用
JP2009278927A (ja) 2008-05-23 2009-12-03 Tohoku Univ Ｔ細胞受容体を模倣する抗体断片及びその製造方法
EP3447140A3 (en) 2011-06-28 2019-05-29 International Institute of Cancer Immunology, Inc. Receptor gene for peptide cancer antigen-specific t cell

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002525099A (ja) * 1998-09-30 2002-08-13 コリクサ コーポレイション Ｗｔ１特異的免疫療法のための組成物および方法
JP2003500004A (ja) * 1998-11-02 2003-01-07 インペリアル・カレッジ・イノベイションズ・リミテッド Ｗｔ−１とｇａｔａ−１のエピトープを用いた免疫治療方法
WO2002028414A1 (en) * 2000-10-06 2002-04-11 Corixa Corporation Compositions and methods for wt1 specific immunotherapy
WO2003002142A1 (fr) * 2001-06-29 2003-01-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Vaccin anticarcinogene contenant un antigene tumoral base sur un produit de gene wt1 suppresseur de tumeur et des liposomes cationiques
WO2003028757A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-10 Haruo Sugiyama Novel method of inducing antigen-specific t cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALTMAN J.D. ET AL.: "Phenotypic Analysis of Antigen-Specific T Lymphocytes", SCIENCE, vol. 274, no. 5284, 4 October 1996 (1996-10-04), pages 94 - 96, XP002135711 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012149101A (ja) * 2005-02-04 2012-08-09 Survac Aps サバイビンペプチドワクチン
JPWO2009072610A1 (ja) * 2007-12-05 2011-04-28 株式会社癌免疫研究所 癌ワクチン組成物
EP2561759A1 (en) 2011-08-26 2013-02-27 Bayer Cropscience AG Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth
US10301257B2 (en) 2011-09-16 2019-05-28 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of acylsulfonamides for improving plant yield
WO2013037955A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of acylsulfonamides for improving plant yield
WO2013037956A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of 5-phenyl- or 5-benzyl-2 isoxazoline-3 carboxylates for improving plant yield
WO2013037958A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of phenylpyrazolin-3-carboxylates for improving plant yield
US9949485B2 (en) 2013-03-05 2018-04-24 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Use of acylsulfonamides for improving plant yield
US9963431B2 (en) 2013-03-05 2018-05-08 Bayer Cropscience Ag Use of quinoline derivatives for improving plant yield
EP3318135A1 (en) 2016-11-03 2018-05-09 Perfetti Van Melle S.p.A. Effervescent candy material, a process for its preparation and products made therefrom
WO2018083057A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Perfetti Van Melle S.P.A. Effervescent candy material, a process for its preparation and products made therefrom
WO2021230247A1 (ja) * 2020-05-12 2021-11-18 大日本住友製薬株式会社 癌を処置するための医薬組成物
JPWO2021230247A1 (ja) * 2020-05-12 2021-11-18
JP7153287B2 (ja) 2020-05-12 2022-10-14 住友ファーマ株式会社 癌を処置するための医薬組成物

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