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WO2005001090A1 - Method and composition for improving efficiency of transferring nucleic acid into cell - Google Patents

Method and composition for improving efficiency of transferring nucleic acid into cell Download PDF

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WO2005001090A1
WO2005001090A1 PCT/JP2004/009568 JP2004009568W WO2005001090A1 WO 2005001090 A1 WO2005001090 A1 WO 2005001090A1 JP 2004009568 W JP2004009568 W JP 2004009568W WO 2005001090 A1 WO2005001090 A1 WO 2005001090A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
composition
nucleic acid
cell adhesion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2004/009568
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
Masato Miyake
Eiichiro Uchimura
Tomoaki Yoshikawa
Jun Miyake
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Original Assignee
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to JP2005511153A priority Critical patent/JPWO2005001090A1/en
Publication of WO2005001090A1 publication Critical patent/WO2005001090A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric

Definitions

  • the present invention relates to a technique for introducing a nucleic acid such as DNA, and to the induction of cell differentiation. More specifically, the present invention relates to a technique for increasing the efficiency of introducing a nucleic acid into cells, and a technique for inducing cell differentiation after introducing a nucleic acid.
  • the introduction of target substances into cells including gene transfer technologies such as the introduction of proteins into cells, transfection, transformation, and transduction, is widely used in a wide range of fields such as cell biology, genetics, and molecular biology. ing.
  • Transfection is a technique used to transiently express genes in cells such as animal cells and observe their effects.In the post-genome era, the genes encoded by the genome are now in use. It is a technology that is frequently used to elucidate the function of the system.
  • transfusion efficiency is often insufficient with the use of conventional drugs alone.
  • primary culture cells and nerve cells are sufficiently introduced by conventional transfusion methods.
  • sufficient research has not been carried out. Therefore, there is a great need for such drugs or systems.
  • efficient introduction for example, transfection
  • target substances on solid phases such as microtiter plates and arrays has been studied.
  • the demand for the development of new technologies is only ever increasing.
  • transfusion system that is applicable to all cell lines.
  • the development of such a transfusion system is expected to be applied to various cell and experimental systems, for example, in large-scale high-throughput assays using microtiter plates, arrays, etc.
  • the demand is only increasing year by year.
  • Adherent mammalian cells recognize specific sequences in extracellular matrix proteins via the integrin receptor on the cell surface, and respond via signaling pathways linked to the receptor in a cell line-dependent manner It is known to do. In the case of cell culture, these responses appear to cause changes in cell morphology (eg, elongation of actin filaments and cell plaining) as well as other changes involved in adhesion. Research using keratinocytes (Jones JMetal. ⁇ ⁇ . Cell. Res., 280, 244-254, 2002) reported that the extracellular matrix had an effect on cell migration involved in wound healing.
  • fibronectin and collagen IV cause activation of plasminogen activator systems (eg, serine proteases and related molecules), while collagen types I and III suppress activation. It has been reported. D iMi llaeta 1. (D iMi llaetal. J. Cell. Biol. 122, 729-737, 1993) reported that in smooth muscle cells, the cell migration rate was determined depending on the surface density of fibronectin and collagen IV. Is finding that. Attachment (Toma selli KJ., J. Cell. Biol. 105, 2347-2358, 1987) found that PC12 cells spread when laminin and collagen type IV were used. However, spread was not observed with fipronectin.
  • plasminogen activator systems eg, serine proteases and related molecules
  • the present invention provides a method for introducing such a substance into cells into which it is difficult to introduce a nucleic acid such as DNA when immobilized on a support (in particular, transfection).
  • the task is to develop a method that can make the introduction possible or improve the introduction efficiency.
  • the present invention also provides Another object of the present invention is to develop a technology that can induce differentiation after introducing a nucleic acid into such cells.
  • the above problem was discovered by applying a combination of a cell adhesion molecule and a gene transfer reagent (for example, Lipofectamine) to cells, thereby achieving an unexpected effect of achieving a higher nucleic acid transfer efficiency than expected.
  • a gene transfer reagent for example, Lipofectamine
  • the present inventors have found that cell adhesion molecules (including extracellular matritas proteins (eg, fibronectin, collagen type I, collagen type IV, laminin, etc.)) have improved nucleic acid transduction efficiency including transfection efficiency. On the contrary, it was found that the effect was unexpected. These increases in nucleic acid transfer efficiency were unexpectedly found even on solid phases. In particular, it has been found that a system using a local transfection cell array is effective for any cells including nerve cells and primary cultured cells. The present inventors have unexpectedly discovered that this achieves a technique for efficiently introducing a nucleic acid based on a cell adhesion molecule (for example, collagen IV type).
  • a cell adhesion molecule for example, collagen IV type
  • the ability to introduce nucleic acids into nerve cells has made it possible to perform a variety of analyzes of menstrual cells, such as Parkinson's disease, Kreuzfeld-Jakob disease, nerve regeneration, neural stem cell differentiation, and neural development It became.
  • the easier genetic manipulation of primary cultured cells has made it possible to analyze the effects of genetic manipulation in environments closer to living organisms.
  • the present invention further provides for the application of a cell adhesion molecule in combination with a gene transfer reagent (eg, Lipofect amine) to a cell (eg, on a solid phase) so that the cell is appropriately stimulated (eg, nerve growth).
  • a gene transfer reagent eg, Lipofect amine
  • NEF nerve growth factor
  • composition for improving the efficiency of introducing nucleic acids into cells (1) a composition for improving the efficiency of introducing nucleic acids into cells
  • a composition comprising:
  • composition according to item 1 wherein the cell adhesion molecule contains extracellular matrix.
  • composition according to item 1 wherein the cell adhesion molecule includes at least one extracellular matrix, selected from the group consisting of collagen, laminin, and fibronectin.
  • composition according to item 1 wherein the cell adhesion molecule contains fiber-forming collagen or basement membrane collagen.
  • composition according to item 1 wherein the cell adhesion molecule includes fibril-forming collagen and basement membrane collagen.
  • composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I or IV.
  • composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule includes collagen type I and type IV.
  • composition according to item 1, wherein the gene transfer reagent contains at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine-based reagent, a polyimine-based reagent, and calcium phosphate. object.
  • composition according to item 1 further comprising a nucleic acid to be introduced.
  • composition according to item 1, wherein the nucleic acid is DNA.
  • composition according to item 10 wherein the nucleic acid includes a sequence encoding a gene.
  • composition according to item 1 wherein the composition is a solid.
  • composition according to item 1 wherein the composition is a liquid.
  • composition according to item 1 wherein the cell adhesion molecule is in a multimeric form.
  • composition according to item 1 wherein the cell adhesion molecule has a three-dimensional structure.
  • composition according to item 1 wherein the cells are cells of a nervous system.
  • composition according to item 1 wherein the cells are cells of a nervous system, and the cell adhesion molecule includes collagen.
  • composition according to item 1 wherein the nucleic acid is introduced in a state where the cells are arranged on a solid phase.
  • composition according to item 1 wherein the cells include primary cultured cells.
  • cell adhesion molecule is present at a concentration of 5 igZml to: LOO / ⁇ gZml.
  • composition according to item 1 wherein the cells are further induced to differentiate.
  • composition according to item 1 wherein the composition further comprises a differentiation inducing factor.
  • the differentiation inducing factor may be contained separately from the composition.
  • the differentiation-inducing factor is a humoral factor, it is particularly preferable that it is separately contained.
  • a device wherein the thread is fixed to a support.
  • the cell adhesion molecule includes at least one extracellular matrix selected from the group consisting of collagen, laminin, and buipronecin.
  • the cell adhesion molecule includes fiber-forming collagen or basement membrane collagen.
  • the gene introduction reagent includes at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine-based reagent, a polyimine-based reagent, and calcium phosphate.
  • nucleic acid includes a sequence encoding a gene.
  • the depiice according to item 24, wherein the cells include primary cultured cells.
  • the cell adhesion molecule is present at a concentration of 5 / xg / ml to: LOO / zgZml.
  • a composition for improving the nucleic acid introduction efficiency of a cell A composition for improving the nucleic acid introduction efficiency of a cell
  • composition to the cell together with the nucleic acid to be introduced;
  • the cell adhesion molecule comprises at least one extracellular matrix selected from the group consisting of collagen, laminin, and fibronectin. The method according to 50.
  • the gene introduction reagent includes at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine reagent, a polyimine reagent and calcium phosphate.
  • composition further comprises a differentiation inducing factor.
  • kit for introducing a nucleic acid into cells
  • a composition comprising:
  • a kit comprising: the above composition; and instructions describing a method for use with the nucleic acid.
  • a composition comprising: a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent. Use for gene transfer into cells.
  • composition further comprises a differentiation inducing factor.
  • a composition for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase, wherein the cell retains the ability to induce differentiation even after the introduction of the nucleic acid a composition comprising:
  • a composition comprising:
  • composition according to item 83 wherein the composition comprises a differentiation inducing factor.
  • composition according to item 84 wherein the cell is a nerve, and the differentiation inducing factor includes nerve growth factor (NGF).
  • NGF nerve growth factor
  • composition to the cell together with the nucleic acid to be introduced;
  • the cells retain the ability to induce differentiation even after the nucleic acid introduction
  • composition comprises a differentiation inducing factor.
  • a composition comprising:
  • composition comprising a gene transfer reagent
  • composition comprising a gene transfer reagent to the cells, together with a nucleic acid to be transferred;
  • the present effort also provides a technique that enables induction of differentiation after introducing a nucleic acid.
  • it is possible to freely set a test such as introducing an arbitrary nucleic acid and inducing an arbitrary differentiation. Since this technique is possible on a solid phase, there is an effect that it is possible to arbitrarily set a considerable condition required for a cell array.
  • FIG. 1 shows morphological changes of PC12 cells observed using a phase microscope (FIGS. 1A to 1D) and a confocal microscope (FIGS. 1E to 1F) in Examples.
  • FIG. 1A shows the effect of fibronectin.
  • FIG. 1B shows the effect of type I collagen.
  • FIG. 1C shows type IV collagen.
  • FIG. 1D shows the effect of laminin.
  • FIG. 1E shows the effect of fipronectin.
  • FIG. 1 F 1 shows type IV collagen.
  • FIG. 1F2 shows the results of observing the case where type IV collagen was used and the case where PLL was used over time (1 hour, 2 hours, 3 hours and 6 hours). This indicates that the nucleus gradually expands, and the nucleic acid is easily introduced.
  • Figure 1G shows the cell adhesion morphology when 3000-6000 cells were seeded at 3 mm x 3 mm on a transfection chip (slide glass, PLL coated).
  • FIG. 1G shows the cell adhesion morphology of PC12 cells.
  • FIG. 1H shows Neuro2a cells on a PLL coat slide coated with collagen type IV (0.005 mg / ml).
  • FIG. 2 shows the effect of exemplary type IV collagen (PC12 cells) shown in the examples.
  • FIG. 2A shows the adhesive properties of PC12 cells on various extracellular matrices.
  • FIG. 2B shows the effect of various extracellular matrices on Neuro2a cells.
  • FIG. 2C shows transfection efficiencies of various extracellular matrices in Neuro2a cells.
  • FIG. 3 shows the effect of the presence or absence of PLL coating on PC 12 cells in the examples.
  • FIG. 3A shows a phase microscope under various coating conditions and combinations with extracellular matrix.
  • Figure 3B is a photograph showing the transfer efficiency of various ECMs.
  • FIG. 3C shows the separation effect on plain and PLL coated slides, respectively.
  • Figure 3D shows the results of testing various combinations of ECM and various coatings.
  • Figure 3E shows a graph quantifying the intensity.
  • FIG. 3F shows the actual state of cell fixation of the one in FIG. 3D.
  • FIG. 3G shows the change over time of the effect of various ECMs depending on the type of slide surface treatment.
  • Figure 3H shows the time course of the effects of various ECMs depending on the type of slide surface treatment.
  • FIG. 4 shows the behavior of calcium ion release observed using the Fura 2 technique.
  • FIG. 5 shows a graph summarizing the effects of various cell adhesion factors on nucleic acid transfer efficiency.
  • FIG. 6 shows an application example of the present invention to an array technology.
  • FIG. 6A shows PC 12 cells.
  • FIG. 6B shows Neuro2a cells.
  • FIG. 6C shows He p G2.
  • FIG. 6D shows hMSC
  • FIG. 6E is a photograph showing the appearance of PC 12 cells in FIG. 6A.
  • FIG. 7 shows the outline of a solid-phase transfusion.
  • FIG. 8 shows that nucleic acid transfer efficiency does not depend on the type of gene transfer reagent.
  • a shows the state of nucleic acid transfer in various SECM proteins (fibronectin, collagen I, collagen ⁇ , and laminin). Those that stain green are the products of the introduced genes.
  • b shows that the effects of various ECM proteins do not depend on the type of gene transfer reagent.
  • the z-axis shows the transfection efficiency
  • the X-axis shows gene transfer reagents of various manufacturers
  • the y-axis shows various ECM proteins or conditions in the absence thereof. It was clarified that the trends in the transfection efficiency of PC12 cells did not change using the reagents of the manufacturer.
  • FIG. 9 shows the effect of siRNA when solid-phase transfection (PC 12) was performed on collagen IV coating.
  • Figure 9A shows the EGFP vector And PC 12 cells co-transfected with anti-EGFP siRNA. As shown, it was found that only He Red developed color and that the green signal derived from pEGFP-N1 was suppressed.
  • FIG. 9B shows an example using scrambled siRNA. As shown, green fluorescence was observed, confirming that the effect in FIG. 9A was the effect of RNAi.
  • FIG. 9C is a diagram showing the relative fluorescence intensities in FIGS. 9A and 9B. The y-axis is shown by relative luminance. It can be seen that the effect of EG FP is almost completely suppressed.
  • FIG. 9A shows the EGFP vector And PC 12 cells co-transfected with anti-EGFP siRNA. As shown, it was found that only He Red developed color and that the green signal derived from pEGFP-N1 was suppressed.
  • FIG. 10 shows that NGF induces differentiation of PC 12 cells even on an array.
  • FIG. 10A shows solid-phase transfection on an array coated with fibronectin, collagen type I, collagen type IV, and laminin.
  • FIG. 10A shows a scanned image of a glass slide.
  • Figure 10B shows a scan image of the differentiation in the transfusion array (left).
  • the middle part of FIG. 10B shows a micrograph of PC12 cells 3 days after transfection.
  • the right of FIG. 10B shows a photograph one day after NGF induction. Description of Sequence Listing
  • SEQ ID NO: 1 Nucleic acid sequence of mouse FVB / N collagen pro-type 1 type I chain (GENBANK accession number: U08020).
  • SEQ ID NO: 2 Sequence of a protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 1.
  • '' SEQ ID NO: 3 mouse procollagen type I ⁇ 2 (C ⁇ 1a2) (GENBAN
  • SEQ ID NO: 4 Sequence of the protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: 5 Nucleic acid sequence of mouse ⁇ 1 type IV collagen nucleic acid sequence (GENBANK registration number: M14042).
  • SEQ ID NO: 6 Sequence of a protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 5.
  • SEQ ID NO: 7 Nucleic acid sequence of mouse collagen ⁇ -2 (IV) chain (GENB No. accession number: X04647).
  • SEQ ID NO: 8 sequence of the protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 7.
  • SEQ ID NO: 9 murine procollagen type IV ⁇ ; 3 (Co14a3) (GENB ANK accession number: NM-007734)
  • SEQ ID NO: 10 Sequence of a protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 9
  • SEQ ID NO: 11 Nucleic acid sequence of mouse collagen IV type ⁇ 4 chain (GENBANK accession number: ⁇ 35167).
  • SEQ ID NO: 12 Sequence of a protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 11.
  • SEQ ID NO: 13 Nucleic acid sequence of mouse collagen IV type ⁇ 5 chain (GENBANK accession number: Z 35168).
  • SEQ ID NO: 14 Sequence of a protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 13.
  • SEQ ID NO: 15 Nucleic acid sequence of mouse procollagen type IV ⁇ 6 (Co14a6) (GENBANK accession number: NM-053185).
  • SEQ ID NO: 16 Sequence of a protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 15.
  • SEQ ID NO: 17 Laminin nucleic acid sequence (mouse a chain)
  • SEQ ID NO: 18 Amino acid sequence of laminin (mouse ⁇ -chain)
  • SEQ ID NO: 19 Nucleic acid sequence of laminin (mouse chain)
  • SEQ ID NO: 20 Amino acid sequence of laminin (mouse chain)
  • SEQ ID NO: 21 Laminin nucleic acid sequence (mouse ⁇ chain)
  • SEQ ID NO: 22 Amino acid sequence of laminin (mouse ⁇ chain)
  • SEQ ID NO: 23 Nucleic acid sequence of fipronectin (human)
  • SEQ ID NO: 24 Amino acid sequence of fibronectin (human)
  • SEQ ID NO: 25 Sequence of si RNA used in Example 9.
  • SEQ ID NO: 26 Sequence of scrambled RNA used in Example 9. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • protein As used herein, the terms "protein,” “polypeptide,” “oligopeptide,” and “peptide” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acids of any length. This polymer may be linear, branched, or cyclic. Amino acids may be natural or non-natural, and may be modified amino acids. The term may also include those assembled into a complex of multiple polypeptide chains. The term also includes naturally or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lysification, acetylation, phosphorylation, or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lysification, acetylation, phosphorylation, or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of an amino acid (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptide-like compounds (eg, peptoids), and others known in the art. Modifications are included. Gene products of extracellular matrix proteins, such as fibronectin, usually take the form of polypeptides.
  • polynucleotide As used herein, the terms “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to any length Refers to a polymer of nucleotides. The term also includes “derivative oligonucleotide”'or”derivativepolynucleotide”. “Derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide” refers to an oligonucleotide or a nucleotide that contains a derivative of a nucleotide or has an unusual linkage between nucleotides, and is used interchangeably.
  • oligonucleotides include, for example, 2,1-O-methyl-liponucleotide, a derivative oligonucleotide in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and an oligonucleotide.
  • oligonucleotide in which the phosphodiester bond in the product has been converted to an N 3 '-P 5' phosphoramidate bond, and derivative oligonucleotide in which the report and the phosphodiester bond in the oligonucleotide have been converted to a peptide nucleic acid bond
  • Derivative oligonucleotide in which peracyl in nucleotides and oligonucleotides is substituted with C-5propynylperacyl, derivative oligonucleotide in which peracyl in oligonucleotide is substituted with C_5thiazole peracyl, cytosine in oligonucleotide is C One 5-propynylcytosine Derivative oligonucleotide in which the cytosine in the oligonucleotide is substituted with phenoxazine-modified cytosine, Derivative oligonucleotide in which
  • nucleic acid sequence may also include conservatively modified variants (eg, degenerate codon substitutions) and comprehensible fragments, as well as explicitly stated sequences. It is contemplated to include the sequence. Specifically, degenerate codon substitutions are those in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 508 1 (1 991); Oh ts uka et al., J. Biol. Chem. 260: 260 5-2608 (1985); Rossolini et al., MoI. Cell. Probes 8: 91—98 ( 1 994)).
  • degenerate codon substitutions are those in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue.
  • nucleic acid molecule is also used interchangeably herein with nucleic acids, oligonucleotides, and polynucleotides, and includes cDNA, mRNA, genomic DNA, and the like.
  • nucleic acids and nucleic acid molecules may be included in the term "gene”.
  • Nucleic acid molecules encoding a gene sequence also include "splice variants.”
  • a particular protein encoded by a nucleic acid includes any protein encoded by a splice variant of the nucleic acid.
  • splice variants are the products of alternative splicing of a gene. After transcription, the initial nucleic acid transcript can be spliced such that different (alternate) nucleic acid splice products encode different polypeptides. The mechanism of production of splice variants varies, but involves alternative splicing of exons. Another polypeptide derived from the same nucleic acid by read-through transcription is also included in this definition. Any product of a splicing reaction, including recombinant forms of the splice product, is included in this definition. Thus, herein, useful extracellular matrix proteins, such as, for example, collagen, fibronectin, laminin, may also include splice variants thereof.
  • a gene refers to a factor that defines a genetic trait. Usually arranged in a certain order on the chromosome. Those that define the primary structure of a protein are called structural genes, and those that control its expression are called regulatory genes (for example, promoters). As used herein, a gene includes a structural gene and a regulatory gene unless otherwise specified. In addition, recent genetic sequencing has revealed that Attention has been focused on parts that are neither offspring nor regulatory genes, suggesting that they play a role in life. Thus, a gene is understood to include nucleic acids present in an organism and factors that determine the genetic traits defined by the nucleic acids. Therefore, a collagen gene usually includes both a collagen structural gene and a collagen promoter.
  • gene may refer to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” and / or “protein””polypeptide” oligopeptide “and” peptide ".
  • gene product also refers to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” expressed by a gene and / or “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and ⁇ Includes “peptide”. Those skilled in the art can understand what a gene product is, depending on the situation.
  • homology refers to the degree of identity between two or more gene sequences.
  • the higher the homology between two genes the higher the identity or similarity between their sequences.
  • Whether the two genes have homology can be determined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, by a hybridization method under stringent conditions.
  • the DNA sequences between the gene sequences are typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 8% identical.
  • 0%, 90%, 95%, 96%, 97 ° / 0 , 98% or 99% are identical, the genes have homology.
  • similarity refers to the homology of two or more gene sequences when conservative substitutions are regarded as positive (identical) in the above homology. Refers to the degree of identity to each other. Thus, if there are conservative substitutions, identity and similarity will vary depending on the presence of the conservative substitution. If there are no conservative substitutions, identity and similarity are the same Indicates a value.
  • the comparison of the similarity, identity and homology of the amino acid sequence and the base sequence is calculated using a default parameter in FASTA, a sequence analysis tool.
  • amino acid may be natural or non-natural as long as it satisfies the purpose of the present invention.
  • amino acid derivative or “amino acid analog” refers to one which is different from a naturally occurring amino acid but has the same function as the original amino acid. Such amino acid derivatives and amino acid analogs are well known in the field.
  • natural amino acid means the L-isomer of a natural amino acid.
  • Natural amino acids include glycine, alanine, palin, leucine, isoleucine, serine, methionine, threonine, pheninolealanine, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine Glutamic acid, arginine, ortin, and lysine.
  • all amino acids in the present specification are L-forms, but forms using D-form amino acids are also within the scope of the present invention.
  • unnatural amino acid refers to an amino acid that is not normally found in nature in proteins.
  • unnatural amino acids include D-form and L-form of norleucine, para-nitrophenylalanine, homopheny / lealanine, parafunoleolopheninoleanine, 3-amino-2-benzylpropionic acid, and homoarginine. Dilulanine.
  • amino acid analog refers to a molecule that is not an amino acid but has similar properties and / or functions to an amino acid.
  • Amino acid analogs include, for example, etyonin, canavanine, 2-methylglutamine, and the like.
  • Amino acid mimetics have a structure that differs from the general chemical structure of amino acids But a compound that functions in a manner similar to a naturally occurring amino acid.
  • nucleotide may be a natural or non-natural one, and includes a nucleotide derivative or a modified nucleotide as long as it can exhibit a desired function.
  • Nucleotide derivative or nucleotide analog refers to one that is different from a naturally occurring nucleotide but has the same machinery as the original nucleotide. Such nucleotide derivatives and nucleotide analogs are well-known in the art.
  • nucleotide derivatives or nucleotide analogs examples include phosphorothioate, phosphoramidate, methylphosphonate, chilanolemethylphosphonate, 2-O-methyl liponucleotide, and peptide-nucleic acid (PNA). However, it is not limited to these.
  • Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Comm ⁇ ss ⁇ on. .
  • Nucleotides may also be referred to by the generally recognized one-letter code. The character codes are as follows.
  • H H Histidine
  • G 1 glutamine or glutamic acid
  • the term “corresponding” amino acid or nucleic acid has the same action as a given amino acid or nucleic acid in a polypeptide molecule or polynucleotide as a reference in a certain polypeptide molecule or polynucleotide molecule.
  • an amino acid or nucleic acid predicted to have, especially in an enzyme molecule, which is located at a similar position in an active site (eg, a collagen adhesion site) and has a similar contribution to catalytic activity.
  • Amino acids or nucleic acids that encode them For example, if it is an antisense molecule, it may be a similar part in the ortholog corresponding to a particular part of the antisense molecule.
  • Such corresponding amino acids or nucleic acids can be identified using alignment techniques known in the art. Such alignment techniques include, but are not limited to, the techniques described in Needleman, SB and Wunsch, CD, J. Mo 1. Biol. 48, 443-453, 1970, for example. Not done.
  • a “corresponding” gene refers to a species that has the same effect as a given gene (eg, a polynucleotide or polypeptide) in a reference species for comparison.
  • the corresponding gene in an animal can be obtained by using the sequence of the gene (eg, mouse collagen or the like) that serves as a reference for the corresponding gene (eg, SEQ ID NOs: 1 to 24) as a query sequence. For example, it can be found by searching the sequence database of human, rat).
  • the sequence of the gene eg, mouse collagen or the like
  • SEQ ID NOs: 1 to 24 e.g, SEQ ID NOs: 1 to 24
  • fragment refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n ⁇ 1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n).
  • the length of the fragment can be appropriately changed according to its purpose.
  • the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 for polypeptides.
  • 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids and lengths represented by integers not specifically listed herein (eg, 1 1) may also be appropriate as a lower limit.
  • 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 25, 30, 40, 50, 75, 100, and more nucleotides may be used.
  • Lengths represented by integers not specifically listed here may also be suitable as lower limits.
  • the lengths of the polypeptide and the polynucleotide can be represented by the number of amino acids or nucleic acids, respectively, as described above. Alternatively, the above-mentioned number as an addition or subtraction is intended to include a few above and below the number (or, for example, 10% above and below). In order to express such an intention, in this specification, “about” may be used before the number. It should be understood, however, that the presence or absence of “about” does not affect the interpretation of that number.
  • the fragment has a certain size. (Eg, 5 kDa) or more. Without being bound by theory, it seems that some size is required to function as a cell adhesion molecule.
  • region is meant a physically continuous portion of the primary structure of a biomolecule.
  • a region is defined by a contiguous portion of the amino acid sequence of the protein.
  • domain is defined herein to refer to a structural portion of a biomolecule that contributes to a known or suspected function of the biomolecule.
  • a domain can be coextensive with a region or a portion thereof; a domain can also incorporate, in addition to all or a portion of the region, a portion of a biomolecule that is distinct from a particular region.
  • domains of the cell adhesion molecule of the present invention include, but are not limited to, a signal peptide, an extracellular (ie, N-terminal) domain, a leucine-rich repeat domain, an RGD portion, and other conserved regions.
  • polynucleotide that hybridizes under stringent conditions refers to well-known conditions commonly used in the art.
  • a colony hybridization method, a plaque hybridization method, or a Southern blot method is used as a probe with a polynucleotide selected from the polynucleotides used in the present invention (for example, those encoding collagen I).
  • a polynucleotide selected from the polynucleotides used in the present invention (for example, those encoding collagen I).
  • Such a polynucleotide can be obtained by using the hybridization method or the like.
  • hybridizable polynucleotide refers to a polynucleotide that can hybridize to another polynucleotide under the above hybridization conditions.
  • Specific examples of the polynucleotide capable of hybridizing include a polynucleotide having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence of the DNA encoding the polypeptide having the amino acid sequence specifically shown in the present invention.
  • Preferred are polynucleotides having a homology of 80% or more, more preferably polynucleotides having a homology of 95% or more.
  • “highly stringent conditions” allow for hybridization of DNA strands having a high degree of complementarity in nucleic acid sequences and exclude hybridization of DNA having significant mismatches.
  • a condition designed to be used. The stringency of the hybridization is determined primarily by the temperature, ionic strength, and conditions of denaturing agents such as formamide. Examples of “highly stringent conditions” for such hybridizations and washes are 0.0015M sodium chloride, 0.0015M sodium citrate, 65-68 ° C, or 0 ° C. 0.15M sodium chloride, 0.0015M sodium citrate, and 50% formamide at 42 ° C.
  • Hybridization experiments are usually performed at ⁇ 6.8-7.4; under typical ionic strength conditions, the rate of hybridization is almost ⁇ independent. See An dersoneta 1., Nuclear Acid Hybridization: a Practical Approach, Chapter 4, IRLP ress Limited (Ox ford, Eng 1 and).
  • Factors affecting the stability of a DNA duplex include base composition, length, and degree of base pair mismatch. Hybridization conditions can be adjusted by those skilled in the art, applying these variables, and allowing different sequence related DNAs to form hybrids. Perfectly matched DNA duplex Can be approximated by the following equation:
  • N is the length of the duplex formed
  • [Na +] is the molar concentration of sodium ions in the hybridization or washing solution
  • % G + C is the (guanine + Cytosine) Percentage of base.
  • the melting temperature decreases by about 1 ° C for each 1% mismatch.
  • moderately stringent conditions refers to conditions under which a DNA duplex having a higher degree of base pair mismatch than can occur under “highly stringent conditions” can form.
  • Typical “moderately stringent conditions” are: 0.015 M sodium chloride, 0.001 5 M sodium citrate, 50-65 ° C, or 0.015 M sodium chloride, 0.001 5 M Sodium acid, and 20% formamide, 37-50 ° C.
  • a “moderately stringent” condition of 50 ° C. in 0.015M sodium ion allows about 21% mismatch.
  • Tm (2 ° C per A—T base) + (4 ° C per G—C base pair) Provided by The sodium ion concentration in 6X sodium citrate (SSC) is 1 M (Suggs et al., Develo pmenta 1 Biology Using Purified Genes, p. 683, Brown and Fox ( (Ed.) (1981)).
  • Natural nucleic acids encoding the proteins used in the present invention include, for example, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 13, 15, 17, 19, 21, 23, etc. It is easily separated from a cDNA library having PCR primers and hybridization probes containing a portion of the nucleic acid sequence.
  • Nucleic acids have preferably present invention consists essentially of 1% ⁇ Shi serum albumin (BSA); 50 OmM-phosphate sodium (N a P0 4); 1 mM EDTA; 42 ⁇ at a temperature of ° C. /. Defined by hybridization buffer containing SDS, and essentially 2 XSSC (60 OmM NaC1; 60 mM sodium citrate); wash buffer containing 0.1% SDS at 50 ° C.
  • search refers to the use of a nucleobase sequence electronically, biologically, or by another method to search for another nucleobase sequence having a specific function and Z or property.
  • BLAST A 1 tschu 1 eta 1., J. Mo 1. Biol. 215: 403—410 (1 990)
  • FASTA Pearson & Lipra n, Proc. Na) Sci., USA 85: 2444—2448 (1988)
  • Sm ithand Wa te rman n method Sm ithand Wate rman, J. Mc? l. Biol.
  • Biological searches include stringent hybridization, macroarrays in which genomic DNA is attached to a nylon membrane or the like, microarrays (microarray assays) attached to a glass plate, PCR and in situ hybridization, and the like. But not limited to them. In the present specification, it is intended that Fnl should also include a corresponding gene identified by such electronic search and biological search.
  • introducing means that the substance enters the inside of a cell membrane. Whether it has been introduced into the substance is determined, for example, by labeling the substance itself (for example, using a fluorescent label, chemiluminescent label, phosphorescence, radioactivity, etc.) and detecting the label, or Induced intracellular changes (eg, gene expression, signal transduction, events due to binding to intracellular receptors, simplified changes, etc.) can be performed physically (eg, visually), chemically (measuring secretions), It can be determined by measuring chemically and biologically. Therefore, such “transduction” includes not only the transfer of substances such as proteins and nucleic acids into cells, but also transfection, transformation, Operations such as quality introduction are also included.
  • target substance refers to a substance that is intended to be introduced into cells.
  • the foreign substance contemplated by the present invention refers to a substance that is not introduced into a cell under normal conditions.
  • substances that can be introduced into cells under normal conditions by diffusion or hydrophobic interaction are not considered as important aspects of the invention.
  • Target substances that are not introduced into cells under normal conditions include, for example, proteins (polypeptides), RNA, DNA, sugars (especially polysaccharides), and complex molecules thereof (eg, glycoproteins, PNAs). Or complex molecules thereof with other molecules (eg, glycolipids), viral vectors, and other compounds, but are not limited thereto.
  • the term “interaction” when referring to two objects means that the two objects exert a force on each other.
  • Such interactions include, for example, covalent bonds, hydrogen bonds, van der Waals forces, ionic interactions, nonionic interactions, hydrophobic interactions, electrostatic interactions, and the like. It is not limited to.
  • the interaction may be a normal interaction that occurs in vivo, such as a hydrogen bond, a hydrophobic interaction, or the like.
  • treating refers to the fact that two substances (eg, a composition or a cell) are sufficiently close to interact with each other.
  • the cell adhesion molecule used in the present invention often takes the form of a gene product, it is understood that such a gene product may be a variant thereof as described above. Therefore, the present invention can also use a substance produced by the following genetic modification technique.
  • certain amino acids in the sequence are replaced by other amino acids in the protein structure, such as in the cationic region or the binding site of a substrate molecule, without appreciable loss or loss of interaction binding capacity. obtain. It is the protein's ability to interact and its properties that define the biological function of a protein.
  • certain amino acid substitutions can be made in the amino acid sequence, or at the level of the DNA coding sequence, resulting in a protein that retains its original properties after the substitution.
  • various modifications can be made in the peptide disclosed herein or the corresponding DNA encoding this peptide without any apparent loss of biological utility.
  • the hydropathic index of amino acids can be considered.
  • the importance of the hydrophobic amino acid index in conferring interactive biological functions on proteins is generally recognized in the art (Kyte. J and Doo 1 ittle, RF J. Mo 1 Biol. 157 (1): 105-132, 1982).
  • the hydrophobic nature of amino acids contributes to the secondary structure of the resulting protein, which in turn defines the interaction of that protein with other molecules (eg, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc.).
  • Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on the nature of its hydrophobicity or charge.
  • one amino acid can be replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index and still yield a protein having a similar biological function (eg, a protein equivalent in enzymatic activity). It is.
  • the hydrophobicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and further preferably within ⁇ 0.5. More preferred. It is understood in the art that such amino acid substitutions based on hydrophobicity are efficient. As described in US Pat. No.
  • hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid Glutamate (+ 3.0 ⁇ 1); Serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0) Threonine (10.4); Proline (10.5 ⁇ 1); Alanine (10.5); Histidine (10.5); Cystine (11.0); Methionine (1.1.3) Valine (1-1.5); lysine (1-1.8); isoleucine (1-1.8); tyrosine (1-2.3); feniralanine (1-1.5); and tributophane (1-3.5). Four).
  • an amino acid can be substituted for another that has a similar hydrophilicity index and still provide a bioisostere.
  • the hydrophilicity index is preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5. '.
  • “conservative substitution” refers to a substitution in which the amino acid substitution and the amino acid to be substituted have similar hydrophilicity indexes and / or hydrophobicity indexes as described above.
  • Examples of conservative substitutions include, for example, those having a hydrophilicity index or a hydrophobicity index of two or less within soil, preferably within ⁇ 1 and more preferably within ⁇ 0.5. But not limited to them.
  • conservative substitutions are well known to those skilled in the art and include, for example, substitutions within each of the following groups: arginine and lysine; glutamic and aspartic acids; serine and threonine; glutamine and asparagine; And varyin, leucine, and isoloicin, but are not limited thereto.
  • variant refers to a substance in which a substance such as an original polypeptide or a polynucleotide is partially modified. Such modifications Examples include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, and the like. Alleles are genetic variants that belong to the same locus and are distinct from each other. Therefore, “allelic variant” refers to a variant that has an allelic relationship to a certain gene. Such allelic variants usually have sequences that are identical or very similar to their corresponding alleles, usually have nearly the same biological activity, but rarely have different biological activities. May have activity.
  • a “species homolog or homolog” refers to homology (preferably at least 60% homology, more preferably 60% or greater, at the amino acid level or nucleotide level) of a certain gene within a certain species. 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more homology). A method for obtaining such a species homolog is apparent from the description of the present specification.
  • the term “ortholog” is also referred to as the orthologous gene and refers to a gene derived from speciation from a common ancestor with two genes.
  • orthologs are useful for estimating molecular phylogenetic trees. Orthologs of the present invention may also be useful in the present invention, as orthologs can usually perform the same function in another species as the original species.
  • Constant (modified) variants applies to both amino acid and nucleic acid sequences.
  • a conservatively modified variant refers to a nucleic acid that encodes the same or essentially the same amino acid sequence, and if the nucleic acid does not encode an amino acid sequence, To the same sequence.
  • a number of functionally identical nucleic acids encode any given protein.
  • the codons GCA, GCC, GCG, and GCU are all Encodes acid alanine. Thus, at every position where an alanine is specified by a codon, that codon can be changed to any of the corresponding codons described without altering the encoded polypeptide.
  • nucleic acid variation is a “silent modification (mutation)”, which is one type of conservatively modified mutation.
  • Every nucleic acid sequence herein which encodes a polypeptide also describes every possible silent variation of the nucleic acid.
  • each codon in the nucleic acid except AUG, which is usually the only codon for methionine, and TGG, which is usually the only codon for tryptophan
  • AUG which is usually the only codon for methionine
  • TGG which is usually the only codon for tryptophan
  • nucleotide sequence modification method examples include cleavage with a restriction enzyme or the like, ligation by a treatment with a DNA polymerase, a K 1 enow fragment, DNA ligase, or the like, site-specific base substitution using a synthetic oligonucleotide or the like. (Molecular site-directed mutagenesis; Mark Zollerand Michae 1 Smith, Methodsin Enzymology, 100, 468-500 (1983)). Modifications can also be made by methods used in the field.
  • amino acid additions, deletions, or modifications can also be made to produce functionally equivalent polypeptides.
  • Amino acid substitution refers to substitution of the original peptide with one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids.
  • the addition of amino acids refers to adding one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3, amino acids to the original peptide chain.
  • Amino acid deletion means one or more, for example, 1 to 10, It preferably refers to deleting 1 to 5 amino acids, more preferably 1 to 3 amino acids.
  • Amino acid modifications include, but are not limited to, amidation, hydroxylation, sulfation, halogenation, alkylation, glycosylation, phosphorylation, hydroxylation, acylation (eg, acetylation), and the like.
  • the amino acid to be substituted or added may be a natural amino acid, an unnatural amino acid, or an amino acid analog. Natural amino acids are preferred.
  • peptide analog refers to a compound that is different from a peptide, but that has at least one chemical or biological function equivalent to the peptide.
  • peptide analogs include those in which one or more amino acid analogs or amino acid derivatives have been added or substituted with the original peptide.
  • Peptide analogs have a function similar to that of the original peptide (e.g., a similar pKa value, similar functional groups, and a similar mode of binding to other molecules). Such additions or substitutions are substantially similar to those described above, for example, having similar water solubility.
  • Such peptide analogs can be made using techniques well known in the art.
  • a peptide analog can be a polymer comprising an amino acid analog.
  • polynucleotide analog and “nucleic acid analog” are compounds that are different from polynucleotide or nucleic acid, but have at least one chemical or biological function equivalent to polynucleotide or nucleic acid.
  • polynucleotide or nucleic acid analogs include those in which one or more nucleotide analogs or nucleotide derivatives have been added or replaced with the original peptide.
  • a nucleic acid molecule may have a deletion or other portion of its nucleic acid sequence, as described above, as long as the expressed polypeptide has substantially the same activity as the native polypeptide. Or may be replaced by another base A nucleic acid sequence may be partially inserted. Alternatively, another nucleic acid may be bound to the 5, terminus and / or the 3, terminus. Further, a nucleic acid molecule encoding a polypeptide having a function substantially the same as that of a polypeptide obtained by hybridizing a gene encoding a polypeptide under stringent conditions may be used. Such genes are known in the art and can be used in the present invention.
  • Such a nucleic acid can be obtained by the well-known PCR method, and can also be chemically synthesized. These methods may be combined with, for example, a site-specific displacement induction method, a hybridization method, and the like.
  • substitution, addition or deletion of a polypeptide or polynucleotide means amino acid or its substitute, or nucleotide or its substitute, respectively, with respect to the original polypeptide or polynucleotide.
  • a substitute is replaced, added, or removed.
  • Techniques for such substitution, addition or deletion are well known in the art, and examples of such techniques include site-directed mutagenesis techniques.
  • the number of substitutions, additions, or deletions may be any number as long as it is one or more, and such a number indicates a desired function (for example, hormone, Can be increased as long as the information transmission function is maintained.
  • a number can be one or several, and preferably is within 20%, 10% or less, 100 or less, 50 or less, 25 of the total length It may be as follows.
  • an “isolated” biological agent eg, a nucleic acid or protein
  • a nucleic acid or protein is another biological agent in the cells of an organism in which the biological agent occurs in nature.
  • a nucleic acid it is a nucleic acid containing a factor other than a nucleic acid and a nucleic acid sequence other than the target nucleic acid; when it is a protein, it is a protein containing a factor other than the protein and an amino acid sequence other than the target protein, etc.
  • Moss Qualitatively separated or purified when it is a nucleic acid, it is a nucleic acid containing a factor other than a nucleic acid and a nucleic acid sequence other than the target nucleic acid; when it is a protein, it is a protein containing a factor other than the protein and an amino acid sequence other than the target protein, etc.
  • Moss Qualitatively separated or purified “Isolated” nucleic acids and proteins include nucleic acids and proteins
  • a “purified” biological agent refers to a biological agent in which at least a part of a factor naturally associated with the biological agent has been removed.
  • the purity of the biological agent in the purified biological agent is higher (ie, more concentrated) than in the state in which the biological agent is normally present.
  • the terms “purified” and “isolated” preferably refer to at least 75% by weight, more preferably to at least 85% by weight, and even more preferably to at least 95% by weight. %, And most preferably at least 98% by weight of the same type of biological agent.
  • vector refers to a vector capable of transferring a target polynucleotide sequence into a target cell.
  • vectors include those capable of autonomous replication in host cells such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, animal individuals and plant individuals, or capable of integration into chromosomes, Those containing a promoter at a position suitable for polynucleotide transcription are exemplified.
  • cloning vectors those suitable for cloning are called “cloning vectors”.
  • Such cloning vectors usually contain multiple cloning sites which contain more than one restriction enzyme site.
  • expression vector refers to a nucleic acid sequence in which various regulatory elements in addition to a structural gene and a promoter that regulates its expression are operably linked in a host cell. Regulatory elements may preferably include terminators, selectable markers such as drug resistance genes, and enhancers. It is well known to those skilled in the art that the type of expression vector of an organism (eg, an animal) and the type of regulatory element used can vary depending on the host cell.
  • Recombinant vectors for prokaryotic cells include pcDNA3 (+), 'pB1uescript-SK (+ Z-), PGEM-T, pEF-BOS, pEGFP, pHAT, pUC18, pFT-DE ST TM 42 GATEWAY (Invitrogen) is an example.
  • Recombinant vectors for animal cells include pcDNAIZAmp, pcDNAI, pCDM8 (all commercially available from Funakoshi), AGE107 [Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 3-229 (Invitrogen), pAGE103 [J. , 101, 1307 (1987)], pAMo, AMoA [J. Biol. + Chem., 268, 22782-22787 (1993)], murine stem cell virus (Mu rine stem cell virus) (MS CV ), PEF-BOS, pEGFP and the like.
  • Recombinant vectors for plant cells include, but are not limited to, r> PCV ICEn 4HPT, pCGN1548, pCGN1549, pBI221, pBI121, and the like.
  • terminator is usually located downstream of the gene coding region of a gene, and is involved in the termination of transcription when DNA is transcribed into mRNA, and is involved in the attachment of a poly A sequence. Sequence. It is known that the terminator is involved in the stability of mRNA and affects the expression level of the gene.
  • promoter refers to a site where transcription of a gene is started. It also refers to a region on DNA that directly regulates its frequency, and is usually a base sequence to which RNA polymerase binds and starts transcription. Therefore, in the present specification, a portion of a certain gene that functions as a promoter is referred to as a “promoter portion”.
  • the promoter region is usually within about 2 kbp upstream of the first exon of the putative protein coding region. For example, the promoter region can be estimated.
  • the putative promoter region varies for each structural gene, but is usually located upstream of the structural gene, but is not limited thereto, and may be located downstream of the structural gene. Preferably, the putative promoter region is located within about 2 kbp upstream of the first exon translation initiation site.
  • enhancer refers to a sequence used to increase the expression efficiency of a target gene. Such enhancers are well known in the art. A plurality of enhancers can be used, but one or no enhancer may be used.
  • silencer refers to a sequence having a function of suppressing gene expression and quiescent.
  • any type of silencer may be used as long as it has the function, and a silencer may not be used.
  • operably linked refers to a transcription / translation regulatory sequence (eg, a promoter, enhancer, silencer, etc.) or translation regulatory sequence that has expression (activity) of a desired sequence. Refers to being placed under control.
  • a promoter to be operably linked to a gene, the promoter will usually be located immediately upstream of the gene, but need not be.
  • the technique for introducing a nucleic acid molecule into a cell may be any technique, for example, transformation, transduction, transfection, and the like. Techniques for introducing such nucleic acid molecules are well known and commonly used in the art, and are described, for example, in Ausube 1 F.A. et al. .
  • any of the above-described methods for introducing DNA into cells can be used, and examples thereof include transfection, transformation, and transformation (for example, calcium phosphate method, ribosome USA, DEA E dextran method, electroporation method, particle gun (gene gun) method, etc.), ribodextrin method, spheroplast method [Proc. N at 1. Ac ad. S ci. USA, 84, 1929 (1 978)], the lithium acetate method [J. Bacterio 1., 153, 163 (1 983)], Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 75, 1 929 (1 978).
  • transfection, transformation, and transformation for example, calcium phosphate method, ribosome USA, DEA E dextran method, electroporation method, particle gun (gene gun) method, etc.
  • ribodextrin method for example, calcium phosphate method, ribosome USA, DEA E dextran method, electroporation method, particle gun (gen
  • the term "foreign substance introduction reagent” refers to a substance used to promote the efficiency of introduction of a foreign substance.
  • a reagent include, but are not limited to, cationic polymers, cationic lipids, polyamine-based reagents, polyimine-based reagents, phosphate phosphate, and the like.
  • Such reagents usually include “gene transfer reagents” because they increase the efficiency of nucleic acid introduction.
  • the term “gene introduction reagent” refers to a reagent used to promote the efficiency of introduction of a nucleic acid (usually, not limited to one encoding a gene).
  • Such gene transfer reagents include, for example, cations Functional polymers, cationic lipids, polyamine-based reagents, polyimine-based reagents, phosphoric acid, and the like, but are not limited thereto.
  • Specific examples of reagents used in transfection include reagents commercially available from various sources, for example, Effectene Transaction Reagentcat.no.301425, Qiagen, CA) , TransFast TM Transfection Reagen (E 2431, Promega, Wl), Tfx TM -20 Reagent (E2391, Promega, WI), Super Fect Transanfection Reagent ( 301305, Q iagen, CA), Poly Fect Transfection Reagent (301 105, Q iagen, CA), Lipofect AM I NE 2000 Re agent (11668-019, Invitrogencorporation, CA), J et PE I ( X 4) con e. (101-30, Pol yp
  • the transfection efficiency or transfection efficiency is calculated based on the number of transfected (expressed) cells per unit area (eg, 1 mm 2 ) of the introduced foreign material (transgene) (eg, fluorescent protein GFP) or the total signal (fluorescent protein). In the case of (1), it can be calculated by measuring the amount of fluorescence.
  • transgene eg, fluorescent protein GFP
  • fluorescent protein GFP fluorescent protein GFP
  • transformant refers to all or a part (tissue or the like) of an organism such as a cell produced by transformation.
  • examples of the transformant include all or a part (organism or the like) of living organisms such as cells of prokaryotes, yeasts, animals, plants, insects and the like.
  • a transformant is also called a transformed cell, a transformed tissue, a transformed host, or the like, depending on the target.
  • the cells used in the present invention may be transformants.
  • Prokaryotic cells belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacteriu mj U, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc. such as Escherichiacoli XL 1 - B lue, E scherichiacoli XL 2- B lue s E scherichiacoli DH 1 is illustrated.
  • cells isolated from a natural product can also be used.
  • Animal cells that can be used in gene manipulation and the like herein include mouse myeloma cells, rat's myeloma cells, mouse 'hybridoma cells, Chinese' hamster cells such as CHO cells, BHK cells, and African green monkey kidneys. Cell, human leukemia cell, HBT5663 (JP-A-63-299), human colon cancer cell line, and the like.
  • Mouse / myeloma cells include ps20, NSO, etc.
  • Rat's myeloma cells include YB20, etc.
  • human fetal kidney cells include HEK293 (ATCC: CRL—1573), human BALL_1 etc.
  • COS-1 and COS-7 for leukemia cells
  • COS-1 and COS-7 for African green monkey kidney cells
  • HCT-15 for human colon cancer cell line
  • SK-N-SH for human neuroblastoma SK-N-SH-5Y
  • mouse neuroblastoma N euro 2A and the like Alternatively, in the present invention, primary cultured cells can also be used.
  • Plant cells that can be used in genetic manipulation and the like in the present specification include callus or a part thereof and suspension cultured cells, Solanaceae, Grassicaceae, Brassicaceae, Brassicaceae, Leguminosae, Laceae, Labiatae, Examples include, but are not limited to, cells of plants such as Lily, Acalypaceae and Apiaceae.
  • “detection” or “quantification” of gene expression can be achieved using an appropriate method including, for example, mRNA measurement and immunological measurement.
  • Molecular biological measurement methods For example, Northern blotting, dot blotting, or PCR is exemplified.
  • the immunological measurement method include, for example, an ELISA method using a microtiter plate, an RIA method, a fluorescent antibody method, a ⁇ ⁇ stamp lot method, and an immunohistological staining method.
  • Examples of the quantification method include the ELISA method and the RIA method. It can also be performed by a gene analysis method using an array (for example, a DNA array or a protein array).
  • DNA arrays are widely reviewed in (Shujunsha eds., Cell Engineering Separate Volume “DNA Microarrays and the Latest PCR Method”).
  • the protein array is described in detail in Nat Genet. 2002 Dec; 32 Sup pl: 526-32.
  • Methods for analyzing gene expression include, but are not limited to, RT_PCR, RACE, SSCP, immunoprecipitation, two-hybrid system, in vitro translation, and the like, in addition to those described above.
  • Such further analysis methods are described in, for example, Genome Analysis Experimental Method ⁇ Yusuke Nakamura Lab ⁇ Manual and Editing ⁇ Yusuke Nakamura Yodosha (2
  • expression of a gene product such as a gene, a polynucleotide, or a polypeptide means that the gene or the like undergoes a certain action in vivo and takes on another form.
  • it means that a gene, polynucleotide, etc. is transcribed and translated to form a polypeptide, but transcription and production of mRNA may also be a form of expression. More preferably, such polypeptide forms may be post-translationally processed.
  • “Expression level” refers to the level at which a polypeptide or mRNA is expressed in a target cell or the like. Such an expression level may be determined by any suitable method using the antibody of the present invention, including immunological measurement methods such as ELISA, RIA, fluorescent antibody, Western blotting, and immunostaining. Expression level at the protein level of the polypeptide of the present invention evaluated by the method, The expression level of the polypeptide of the present invention at the mRNA level, which is evaluated by any appropriate method including a molecular biological measurement method such as a mouthpiece method and a PCR method, may be mentioned.
  • “Change in expression level” refers to the expression level of the polypeptide of the present invention at the protein level or mRNA level, which is evaluated by any method including the immunological measurement method or the molecular biological measurement method described above. Means increase or decrease. Therefore, as used herein, “expression” or “reduction” of “expression” of a gene, a polynucleotide, a polypeptide, or the like refers to the amount of expression of the agent of the present invention compared to when it is not used. Is significantly reduced. Preferably, the decrease in expression includes a decrease in the expression level of the polypeptide.
  • expression or “increase in expression level” of a gene, polynucleotide, polypeptide, etc., refers to a factor associated with gene expression in a cell (for example, a gene to be expressed or a gene to be expressed). This means that the amount of expression is significantly increased when a (regulatory factor) is introduced, compared to when it is not used.
  • increasing expression includes increasing the expression of the polypeptide.
  • induction of expression of a gene refers to-an action of a factor on a certain cell to increase the expression level of the gene. This includes allowing the gene to be expressed if not found, and increasing the expression of the gene if the gene has already been seen.
  • specifically express a gene means that the gene is expressed at a particular site or stage of the plant at a different (preferably higher) level than at other sites or stages. Say. To be specifically expressed may be expressed only at a certain site (specific site), or may be expressed at other sites. Preferably, specifically expressed means to be expressed only at a certain site.
  • biological activity refers to an activity that a certain factor (for example, a polypeptide or a protein) can have in a living body. Activity (eg, transcription promoting activity) is included.
  • Activity eg, transcription promoting activity
  • a biological activity can be cell adhesion activity, heparin binding activity, collagen binding activity, and the like.
  • the cell adhesion activity can be measured by measuring the rate of adhesion of the cells to the solid phase after cell seeding and treating it as the adhesion activity.
  • the heparin binding activity can be measured by performing affinity chromatography such as a heparin-immobilized column and confirming that it binds thereto.
  • the collagen binding activity can be measured by performing affinity chromatography such as a collagen-immobilized column and confirming that it binds thereto.
  • a factor is an enzyme
  • its biological activity includes that enzyme activity.
  • an agent is a ligand
  • the ligand includes binding to the corresponding receptor.
  • biological activity can be measured by techniques well known in the art (see Mo ecu ar Cloning, Current Protocols (cited herein), etc.).
  • kit generally refers to a unit provided with a part to be provided (eg, reagents, particles, etc.) divided into two or more compartments.
  • This kit form is preferred when it is intended to provide a composition that should not be provided in a mixed form, but is preferably mixed and used immediately before use.
  • Such a kit will advantageously include instructions describing how to provide the provided parts (eg, reagents, particles, etc.).
  • the polypeptide used in the present invention is obtained by culturing a transformant derived from a microorganism, animal cell, or the like having a recombinant vector into which DNA encoding the polypeptide has been incorporated, according to a conventional culture method. Produces this polypeptide It can be produced by accumulating and collecting the polypeptide of the present invention from the culture.
  • the method for culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a medium for culturing a transformant obtained mainly from a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast a carbon source (for example, glucose, fructose, sucrose, etc.
  • carbohydrates such as starch or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid and propionic acid, alcohols such as ethanol and propanol, etc., nitrogen sources (eg, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate) , Ammonium salts of various inorganic or organic acids such as ammonium phosphate, and other nitrogen-containing substances, as well as peptone, meat extract, yeast extract, cornchee liqueur, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate , Various fermentation cells and their digests, etc.), inorganic salts (For example, potassium phosphate dibasic, potassium phosphate dibasic, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc.) Natural media and synthetic media (for example, RPM I 1640 medium [The Journal of American Medical Association,
  • the culture is preferably performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture, but is not limited thereto.
  • the culture temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culture time is usually 5 hours to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0. No pH adjustment This is performed using a machine or an organic acid, alkali solution, urea, calcium carbonate, ammonia, etc. If necessary, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • a conventional polypeptide commonly used in the art is used.
  • isolation or purification methods can be used.
  • the culture is treated by a method such as centrifugation, and the like. Obtain the soluble fraction.
  • the cells in the culture are collected by centrifuging the culture, and the cells are washed.
  • the cells are crushed using an ultrasonic crusher, French press, Mantongaulin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • the cells are similarly recovered, crushed, and then separated from the precipitate fraction obtained by centrifugation.
  • the insoluble form of the polypeptide is solubilized with a polypeptide denaturing agent.
  • the solubilized solution is diluted or dialyzed into a solution containing no polypeptide denaturant or diluted so that the concentration of the polypeptide denaturant does not alter the polypeptide, and the polypeptide of the present invention is normalized.
  • a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein can be purified according to a general protein purification method [for example, J. Evan. Sadler et al .: Methodsin Enzymology, 83, 458].
  • a general protein purification method for example, J. Evan. Sadler et al .: Methodsin Enzymology, 83, 458.
  • the polypeptide used in the present invention can be used even if it is produced as a fusion protein with another protein, it can be purified by affinity chromatography using a substance having an affinity for the fused protein. [Akio Yamakawa, Experimental Medicine (Ex peri mental Medicine), 13, 469-474 (1995)].
  • the method of Lowe et al. Proc. Natl. Acad.
  • polypeptide can be produced as a fusion protein with protein A, and purified by affinity chromatography using immunoglobulin G. it can. Further, the polypeptide used in the present invention is produced as a fusion protein with a FLAG peptide, Can be purified by affinity chromatography using
  • polypeptide of the present invention can be purified by affinity mouth chromatography using an antibody against itself.
  • the polypeptide of the present invention can be prepared by a known method [J. Biomolecular NMR, 6, 129-134, Science, 242, 1162-1164, J. Biochem., 110, 166- 168 (1991)]. It can be produced using a transcription / translation system.
  • the present invention can also be performed by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Can be produced. Also, Advanced ChemTecn, Ap1 ied B iosyst ems, Pharma cia Bi i otech, Protein T ec "hno 1 ogy Instrument ⁇ Syn thecel 1—Ve ga ⁇ Per Septive Chemical synthesis can also be performed using peptide synthesizers such as Shimadzu Corporation.
  • the term “differentiation” generally refers to the separation of one system into two or more qualitatively different systems, and when used for cells, tissues or organs, functions and / or It means that the form is specialized. With differentiation, pluripotency usually decreases or disappears. Depending on the differentiation, for example, epidermal cells, knee parenchymal cells, knee duct cells, hepatocytes, blood cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, osteoblasts, skeletal myoblasts, nerve cells, vascular endothelial cells, pigment cells, smooth The cells may be morphologically differentiated into different cells such as muscle cells, fat cells, bone cells, and chondrocytes, or dendrites may extend or proliferate like nerve cells. When used in the present invention, Differentiated cells that have been induced to differentiate can take the form of a population or a tissue.
  • differentiation induction and “differentiation promotion” are used interchangeably and, when referring to a cell, refer to inducing or promoting differentiation.
  • induction of differentiation includes increasing the rate of differentiation and directing cells that are in a staggered or dedifferentiating direction to differentiate.
  • differentiation factor As used herein, the term “differentiation factor”, “differentiation inducing factor” or “differentiation promoting factor” is used interchangeably and refers to a factor that promotes or induces differentiation into differentiated cells (eg, a chemical substance, temperature, etc.). Any factor may be used. Such factors include, for example, various environmental factors, such as, for example, temperature, humidity, pH, salt concentration, nutrition, metals, gases, organic solvents, pressure, and chemicals. (Eg, steroids, antibiotics, etc.) or any combination thereof. Representative differentiation factors include, but are not limited to, cell biologically active substances.
  • DNA demethylating agents eg, 5-azacitidine
  • histone deacetylating agents eg, trichostatin
  • nuclear receptor ligands eg, retinoic acid (ATRA)
  • s such as vitamin D 3, T3
  • cell growth factor ⁇ Kuchibin, insulin-like growth factor (I GF) - 1, fibroblast growth factor (FG F), platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor ( TG F)-/ 3, nerve growth factor (NGF), bone morphogenetic protein (BMP) 2Z4, etc.
  • cytokinin LIF, IL-2, IL-16, etc.
  • hexamethylene bisacetamide dimethyl Acetamide, dibutyl c AMP, dimethyl sulfoxide, oxydoxydiridine, hydroxyl urea, cytosine arabinoside, mitomycin C, sodium butyrate, affidicolin Full O b deoxy ⁇ lysine, Poripuren, although se
  • Vascular endothelium VEGF, FGF, angiopoietin (angiopoietin)
  • Kidney LIF, BMP, FGF, GDNF
  • HGF HGF, LIF, VEGF
  • HGF HGF, TGF—, IL-6, EGF, VEGF
  • Intestinal epithelium EGF, IGF-I, HGF, KGF, TGF-j3, IL- 11
  • Nerve Nerve growth factor (NGF), BDNF (brain-derived neurotrophic factor), GDNF (glial cell-derived neurotrophic factor), neurotrophin (neurotropophin), IL-6, TNF
  • Glial cells TGF-, TNF- ⁇ , EGF, LIF, IL-6.
  • K Peripheral neurons: bFGF, LIF, TGF-j3, IL-6, VEGF,
  • L Lung (alveolar epithelium): TGF_i3, IL-13, IL-1, KGF, HGF.
  • Adipocytes insulin, IGF, LIF
  • Muscle cells LIF, TNF- ⁇ , FGF.
  • any culture solution can be used as long as the cells are maintained or differentiated into desired differentiated cells.
  • a culture medium include DMEM, P199, MEM, HBSS, Ham's F12, BME, RPMI1640, MCDB104, MCDB153 (KGM) and a mixture thereof. Not limited to them.
  • Such cultures include adrenocortical steroids such as dexamethasone, insulin, glucose, indomethacin, isobutyl-methylxanthine (IBMX), ascorbate_2-phosphate, ascorbic acid and its derivatives, and glycemic acid.
  • the term “device” refers to a part that can constitute a part or the whole of an apparatus, and includes a support (preferably a solid support) and a target substance to be carried by the support. Be composed.
  • Such devices include, but are not limited to, chips, arrays, microtiter plates, cell culture plates, dishes, films, beads, and the like.
  • support refers to a material (materia1) that can immobilize a substance such as a biomolecule.
  • the material of the support may have the property of binding to a substance such as a biomolecule used in the present invention, either covalently or non-covalently, or a derivative having such property. Any solid material that can be ridden is included.
  • any material capable of forming a solid surface may be used, for example, glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal (alloy) ), Natural and synthetic polymers (eg, polystyrene, cellulose, chidsan, dextran, and nylon), and the like.
  • the support may be formed from a plurality of different material layers.
  • inorganic insulating materials such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon oxide, silicon carbide, and silicon nitride can be used.
  • Polyethylene ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polychlorinated vinyl, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, acryl resin, polyacrylonitrile, polystyrene , Acetal resin, polycarbonate, polyamide, phenolic resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene oxide, polysulfone, etc.
  • Organic materials can be used.
  • nitrocellulose membrane such as nylon membrane, A film used for blotting, such as a PVDF film, can also be used.
  • a solid support When the material constituting the support is a solid phase, it is referred to herein as a “solid support”. In the present specification, it can take the form of a plate, a microwell plate, a chip, a slide glass, a film, a bead, a metal (surface), and the like.
  • the support may be coated or uncoated.
  • liquid phase is used in the same meaning as usually used in the art, and usually means a state in a solution.
  • solid phase is used in the same meaning as used in the art, and usually means a solid state.
  • liquids and solids are sometimes collectively referred to as fluids.
  • contacting refers to the fact that two substances (eg, a composition and a cell) are close enough to interact with each other.
  • the term “interaction” when referring to two objects means that the two objects exert a force on each other.
  • Examples of such interactions include forces S such as covalent bonds, hydrogen bonds, van der Waals forces, ionic interactions, nonionic interactions, hydrophobic interactions, and electrostatic interactions. It is not limited to them.
  • the interaction may be a normal interaction that occurs in vivo, such as a hydrogen bond, a hydrophobic interaction, or the like.
  • plate refers to a planar support to which molecules such as antibodies can be immobilized.
  • the plate is preferably made of a glass substrate having a metal thin film containing plastic, gold, silver or aluminum on one side.
  • substrate refers to the material (preferably solid) from which the chip or array of the invention is constructed. Thus, the substrate is included in the concept of a plate.
  • the substrate material can be either covalent or non-covalent And any solid material that has the property of binding to the biomolecules used in the present invention, or can be derivatized to have such properties.
  • any material capable of forming a solid surface may be used, for example, glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal (alloy) ), Natural and synthetic polymers (eg, polystyrene, cellulose, chitosan, dextran, and nylon).
  • the substrate may be formed from multiple layers of different materials.
  • inorganic insulating materials such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon carbide, silicon oxide, and silicon nitride can be used.
  • a preferable material for the substrate varies depending on various parameters such as a measuring instrument, and a person skilled in the art can appropriately select an appropriate material from the various materials described above.
  • slide glass is preferred.
  • such a substrate can be coated.
  • coating when used on a solid support or substrate, refers to the formation of a film of a substance on the surface of the solid support or substrate and the formation of such a film.
  • Coating may be performed for a variety of purposes, for example, to improve the quality of the solid support and the substrate (for example, to increase the life, to improve the environmental resistance such as acid resistance), to be bonded to the solid support or the substrate. Improve material affinity It is often for the purpose.
  • coating agent such a material for coating is referred to as “coating agent”.
  • Various materials can be used as such a coating agent.
  • biological materials such as DNA, RNA, protein, and lipid, and polymers (For example, poly-L-lysine, MAS (available from Matsunami Glass, Kishiwada, Japan), hydrophobic fluororesin), silane (APS (for example, ⁇ -aminopropyl silane)), metal (for example, , Gold, etc.) may be used, but are not limited thereto.
  • poly-L-lysine, MAS available from Matsunami Glass, Kishiwada, Japan
  • hydrophobic fluororesin silane
  • APS for example, ⁇ -aminopropyl silane
  • metal for example, , Gold, etc.
  • such a coating comprises poly-L-lysine, silane, (eg, epoxy silane or mercapto silane, APS ( ⁇ -aminopropyl silane)), MA S, hydrophobic fluorine.
  • silane eg, epoxy silane or mercapto silane, APS ( ⁇ -aminopropyl silane)
  • MA S hydrophobic fluorine.
  • resins metals such as gold.
  • a substance it is preferable to use a substance compatible with cells or an object containing cells (for example, a living body, an organ, or the like). ⁇ ⁇
  • chip or “microchip” is used interchangeably, refers to a microminiature integrated circuit that has various functions and becomes part of a system. Examples of the chip include, but are not limited to, a DNA chip and a protein chip.
  • the term “array” refers to a pattern or a pattern in which threads (eg, DNA, protein, and transfect mixture) containing one or more (eg, 100 or more) target substances are arranged. It refers to the substrate (eg, chip) itself that has the pattern. Arrays that are patterned on a small substrate (eg, on a 10 ⁇ 10 mm) are referred to as microarrays, but microarrays and arrays are used interchangeably herein. Therefore, a substrate patterned larger than the above-mentioned substrate may be called a microarray. For example, the array is itself a solid phase surface or the desired transformer immobilized on a membrane. Consists of a set of effect mixtures.
  • Array preferably comprises at least 0 two identical or different that antibody, more preferably at least 1 0 3, and at least 0 4 preferably in the further, even more preferably at least 1 0 5 a.
  • These antibodies are preferably arranged with a surface on 125 X 8 O mn, more preferably 10 X 10 O mm.
  • a microtiter plate such as a 96-well microtiter plate, a 384-well microtiter plate, etc., and a size similar to a slide glass are contemplated.
  • the type of the target material containing the target substance to be immobilized may be one kind or plural kinds. The number of such types can be any number from 1 to the number of spots. For example, a composition containing about 100 kinds, about 100 kinds, about 500 kinds, about 100 kinds of target substances can be immobilized.
  • a solid phase surface or film such as a substrate
  • the size of the plate is preferably smaller.
  • the spot size of a composition containing a target substance can be as small as the size of a single biomolecule (which can be on the order of 1-2 nm) .
  • the minimum substrate area is in some cases determined by the number of biomolecules on the substrate.
  • the composition containing the target substance that is intended to be introduced into a cell is usually 0.01 lmn!
  • the sequence is fixed by covalent bond or physical interaction in the form of a spot of 11 O mm.
  • spots of biomolecules may be arranged.
  • spot refers to a certain set of compositions containing a target substance.
  • spotting refers to producing spots of a composition containing a certain target substance on a certain substrate or plate. Spotting can be performed in any manner, for example, by pipetting, or can be performed by an automated device, and such methods are well known in the art.
  • address refers to a unique location on a substrate that may be distinguishable from other unique locations.
  • the address is suitable for association with the spot with that address, and any entity in each of the adrez where the entity can be distinguished from the entity in the other address (eg, optically) It can take a shape.
  • the shape defining the dress may be, for example, circular, oval, square, rectangular, or irregular. Therefore, “address” indicates an abstract concept, and “spot” may be used to indicate a specific concept. However, when there is no need to distinguish between the two, in this specification “ “Address” and “spot” can be used interchangeably.
  • the size defining each address depends, among other things, on the size of the substrate, the number of addresses on a particular substrate, the amount of the composition containing the target substance and / or the available reagents, the size of the microparticles, etc. It depends on the degree of resolution required for any method in which the array is used.
  • the size can be, for example, in the range of 1-2 nm to several cm, but can be any size consistent with the application of the array.
  • the spatial configuration that defines the address is designed to suit the particular application for which the microarray will be used.
  • the addresses can be closely spaced and can be widely distributed or sub-grouped into desired patterns appropriate for a particular type of analyte.
  • Microarrays are widely reviewed in Genome Function Research Protocol (Experimental Medicine Separate Volume, Experimental Lecture in the Post-Genome Era1), Genome Medical Science and Future Genomic Medicine (Experimental Medical Science Extra Edition).
  • the present invention is useful in that, in the first aspect, it has been discovered that a surprising effect (in addition to immobilization, the transduction efficiency is dramatically increased) due to the combination of a cell adhesion molecule and a gene transfer reagent. There is.
  • cell adhesion molecule (Celladhesion mo 1 ecu 1 e) or “adhesion molecule” is used interchangeably and refers to two or more cells. Molecules that mediate the approach of each other (cell adhesion) or the adhesion between a substrate and cells. Generally, molecules involved in cell-cell adhesion (cell-cell adhesion) (eel 1-celladhesion molecule) and molecules involved in cell-extracellular matrix adhesion (cell-substrate adhesion) (cell-substratum adhesion) mo lecule). In the tissue piece of the present invention, any molecule is useful and can be used effectively.
  • the cell adhesion molecule includes a protein on the substrate side at the time of spleen-substrate adhesion, but in the present specification, a protein on the cell side (eg, integrin) is also included, and Other molecules are included in the concept of a cell adhesion molecule or a cell adhesion molecule in the present specification as long as they mediate cell adhesion.
  • Whether a molecule is a cell adhesion molecule is determined by biochemical quantification (SDS-PAG method, labeled collagen method), immunological quantification (enzyme antibody method, fluorescent antibody method, immunohistological examination) PDR method, hybridization
  • the determination can be made by determining a positive result in an assay such as the determination method.
  • Such cell adhesion molecules include collagen (SEQ ID NOS: 1-16), integrins, fibronectin (SEQ ID NOs: 23-24), laminin (SEQ ID NOs: 17-22), vitronectin, fibrinogen, immunoglobulin superfamily. (E.g., CD2, CD4, CD8, ICM1, ICAM2, VCAM1), selectins, dyadherins and the like.
  • the adhesion factor used in the tissue piece of the present invention transmits such a signal for activating cell activation into cells.
  • Cell activation can promote the proliferation of cells that have been applied thereto and / or cells in the tissue or organ after being applied as a piece of tissue to the site of injury in the tissue or organ. Whether such an auxiliary signal can be transmitted into cells is determined by biochemical quantification (SDS-PAG method, Labeled collagen method), immunological quantification (enzyme antibody method, fluorescent antibody method, immunohistological examination) The determination can be made by determining positive in the PDR method and the hybridization method. it can.
  • extracellular matrix is also referred to as “extracellular matrix” and refers to a substance that exists between somatic cells (somaticcell) regardless of epithelial cells or non-epithelial cells.
  • the extracellular matrix is involved not only in the support of tissues but also in the organization of the internal environment necessary for the survival of all somatic cells.
  • Extracellular matrices are generally produced by connective tissue cells, but some are also secreted by cells that themselves have a basement membrane, such as epithelial and endothelial cells. It is roughly divided into fibrous components and a matrix that fills the fibrous components.
  • the fibrous components include collagen fibers and elastic fibers.
  • the basic constituent of the substrate is glycosaminodalican (acid mucopolysaccharide), most of which binds to non-collagenous proteins to form macromolecules of proteoglycan (acid mucopolysaccharide-protein complex).
  • the substrate also includes glycoproteins such as laminin in the basement membrane, microfibrils around the elastic fibers (microfibri1), fibers, and fibronectin on the cell surface.
  • the basic structure is the same in specially differentiated tissues.For example, in chondroblasts, chondroblasts characteristically produce a large amount of cartilage matrix containing proteoglycan, and in bone, calcification occurs in osteoblasts. Substrate is produced.
  • extracellular matrix used in the present invention examples include, but are not limited to, collagen, elastin, proteodalican, glycosaminodalican, fibronectin, laminin, elastic fiber, collagen fiber and the like.
  • the extracellular matrix advantageously has the activity of attracting host autologous cells.
  • the term “cell adhesion protein” refers to a protein having a function of mediating cell adhesion as described above. Therefore, in the present specification, the cell adhesive protein includes a protein on the substrate side in cell-substrate adhesion, but also includes a protein on the cell side (eg, integrin) in the present specification. For example, when cultured cells are seeded under serum-free conditions on a substrate (glass or plastic) on which the protein on the substrate side is adsorbed, the receptor integrin recognizes the cell adhesive protein and the cells adhere to the substrate.
  • the active site of the cell adhesion protein has been elucidated at the amino acid level, and RGD, YIGSR, etc.
  • the protein contained in the tissue piece of the present invention may advantageously include an RGD sequence such as RGD, YIGSR.
  • RGD sequence such as RGD, YIGSR.
  • cell adhesive proteins are present in extracellular matrix, on the surface of cultured cells, plasma, serum, and various body fluids. Its functions in vivo include not only the adhesion of cells to the extracellular matrix, but also cell migration, proliferation, morphology control, and tissue construction. Apart from cell actions, some proteins exhibit a function of regulating blood coagulation and complement action, and proteins having such functions may also be useful in the present invention.
  • Such cell adhesion proteins include, but are not limited to, fibronectin, collagen, vitronectin, laminin, and the like.
  • RGD molecule refers to a protein molecule containing the amino acid sequence RGD (Ar g—G 1 y—Asp) or a functionally identical sequence thereof.
  • the RGD molecule is characterized by containing RGD which is an amino acid sequence useful as an amino acid sequence of a cell adhesion active site of a cell adhesion protein, or another functionally equivalent amino acid sequence.
  • the RGD sequence was discovered as a fibronectin cell adhesion site, and was subsequently released into a number of molecules with cell-adhesive activity, including type I collagen, laminin, vitronectin, fibrinogen, von Willebrand factor, and encectin.
  • the biomolecule in the present invention may be a chemically synthesized RGD molecule.
  • RGD molecules include, but are not limited to, for example, the GRGDS P peptide, in addition to the naturally occurring molecules described above.
  • the RGD sequence is an integrin that is a cell adhesion molecule (and also a receptor) (eg, For example, functionally equivalent molecules of RGD, as recognized by the fibronectin receptor, can be identified by examining interactions with such integrins.
  • collagen is a type of protein, a fibrogenic collagen, and is a generic term for a region in which three polypeptide chains are wound in a triple helix, and is a scaffold for cell engraftment and proliferation. And those that form the tissue skeleton.
  • Collagen is a major component of the extracellular matrix of animals.
  • Collagen is also known to have an RGD sequence and exhibit cell adhesion activity.
  • Collagen is present in about 20 to 30% of the total protein of animals, and is known to be contained in large amounts in skin, tendons, cartilage, and the like.
  • type I to type XIII are known. Usually, each molecule has a triple helix structure composed of three polypeptide chains, and each chain is often called an ⁇ chain.
  • one molecule may be composed of one type of ⁇ -chain, or may be composed of a plurality of types of ⁇ -chain encoded by different genes.
  • the ⁇ chain is usually referred to as ⁇ ⁇ , hi 2, hi 3, followed by a number after ⁇ - ⁇ , and collagen type, ⁇ 1 (I). Accordingly, in. This onset bright, for example, [ ⁇ ⁇ (I) 2 ⁇ 2 (I)]
  • ⁇ ⁇ (I) 2 ⁇ 2 (I) In addition to naturally occurring collagen molecules present as (I type collagen), trimeric combinations that do not occur in nature
  • the body can also be private.
  • Most of the primary structure of collagen is characterized by an amino acid sequence of [Gly-X-Pro (or hydroxyprolyl)] n (X is any amino acid residue).
  • Collagen usually contains hydroxylysine as a special amino acid.
  • Collagen is a glycoprotein that is linked to the hydroxyl group of hydroxylysine.
  • fibril-forming collagen or interstitial collagen that exists in a fibrous form and assembles into collagen fibers.
  • fibrogenic collagens include type I, type II, type III, type V, type XI collagen and are used in a preferred embodiment of the present invention.
  • Genbank accession numbers include, but are not limited to, 'p02454, p02464 (eg, those described in SEQ ID NOs: 1-4).
  • a functionally equivalent molecule of type I collagen can be identified by, for example, a method called an enzyme antibody method or an EIA method.
  • type IV collagen is a basement membrane collagen, and its molecule is composed of four domains of 7S, NC2, TH2, and NC1, and four molecules are formed at the N-terminal 7S.
  • a functionally equivalent molecule of type IV collagen can be identified by, for example, a method called an enzyme antibody method or an EIA method. (cell)
  • cell is defined in the same broadest sense as used in the art, and is a constituent unit of a multicellular organism's fibrous tissue, wrapped in a membrane structure that isolates the outside world. An organism that has self-renewal capability inside and has genetic information and its expression mechanism.
  • the cell used in the present specification may be a naturally occurring cell or an artificially modified cell (for example, a fused cell, a genetically modified cell).
  • the source of cells can be, for example, a single cell culture or from a normally grown transgenic animal embryo, blood, or body tissue, or from a normally grown cell line. Examples include, but are not limited to, cell mixtures such as cells.
  • Cells used in this effort may be cells from any organism (eg, unicellular organisms of any type (eg, bacteria, yeast) or multicellular organisms (eg, animals (eg, vertebrates, invertebrates), Plants (eg, monocotyledonous, dicotyledonous, etc.) may be 7.
  • organisms eg, unicellular organisms of any type (eg, bacteria, yeast) or multicellular organisms (eg, animals (eg, vertebrates, invertebrates), Plants (eg, monocotyledonous, dicotyledonous, etc.) may be 7.
  • vertebrates eg, eel, eel, cartilage, teleost, amphibians, reptiles, birds, mammals, etc.
  • mammals eg, monotremes, marsupials, rodents, skin wings, wing-hands, carnivores, carnivores, long-nosed creatures, odd-shaped snouts
  • Clovenoids tube rodents, squamata, squids, cetaceans, cetaceans, primates, rodents, odontoptera, etc.
  • cells from primates eg, chimpanzees, macaques, humans
  • cells from humans are used, but are not limited thereto.
  • stem cell refers to a cell that has self-renewal ability and has pluripotency (ie, pluripotency) (“pluripotency”).
  • stem cells can usually regenerate tissue when it is damaged.
  • a stem cell can be, but is not limited to, an embryonic stem (ES) cell or a tissue stem cell (also referred to as a tissue stem cell, a tissue-specific stem cell, or a somatic stem cell).
  • ES embryonic stem
  • tissue stem cell also referred to as a tissue stem cell, a tissue-specific stem cell, or a somatic stem cell.
  • artificially created cells for example, as used herein, The fused cells, reprogrammed cells, etc. described in
  • Embryonic stem cells refer to pluripotent stem cells derived from early embryos.
  • Embryonic stem cells were first established in 1981 and have been applied to knockout mouse production since 1989. Human embryonic stem cells were established in 1989 and are being used in regenerative medicine. Tissue stem cells, unlike embryonic stem cells, are cells in which the direction of differentiation is restricted, exist at specific locations in the tissue, and have an undifferentiated intracellular structure. Thus, fibroblast stem cells have a low level of pluripotency. Tissue stem cells have a high nuclear / cytoplasmic ratio and poor intracellular organelles. In general, fibroblast stem cells have pluripotency, have a slow cell cycle, and maintain their proliferative ability over the life of an individual. As used herein, a stem cell may be an embryonic stem cell or a tissue stem cell.
  • Tissue stem cells can be classified into, for example, the skin system, digestive system, myeloid system, and nervous system when classified according to the site of origin.
  • Skin tissue tissue stem cells include epidermal stem cells and hair follicle stem cells.
  • Tissue stem cells of the digestive system include Teng (common) stem cells and hepatic stem cells.
  • Examples of myeloid tissue stem cells include hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells.
  • Neural stem cells include neural stem cells and retinal stem cells.
  • somatic cell refers to a cell other than a germ cell such as an egg or sperm, and refers to any cell that does not directly transfer its DNA to the next generation. Somatic cells usually have limited or lost pluripotency.
  • the somatic cells used herein may be naturally occurring cells or genetically modified ones.
  • Cells can be classified according to their origin into ectoderm, mesoderm and endoderm-derived stem cells.
  • the cells derived from the ectoderm mainly exist in the brain, and include neural stem cells and the like.
  • Mesodermal-derived cells are mainly present in bone marrow, and include vascular stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and the like.
  • Endoderm-derived cells are mainly found in organs, hepatic stem cells, Xue stem cells are included.
  • somatic cells can be from any germ layer.
  • lymphocytes, spleen cells or testis-derived cells can be used.
  • isolated refers to a substance that is naturally associated with at least a reduced amount in a normal environment, and preferably is substantially free of the substance.
  • an isolated cell refers to a cell that is substantially free from other attendant materials (eg, other cells, proteins, nucleic acids, etc.) in the natural environment.
  • isolated means, for example, when substantially free of cellular material or culture medium when produced by recombinant DNA technology and when chemically synthesized.
  • the isolated nucleic acid is preferably a sequence naturally f1 anking in the organism from which the nucleic acid is derived (ie, a sequence located at the 5 'and 3' end of the nucleic acid). Not included.
  • an “established” or “established” cell is one that maintains a particular property (eg, pluripotency) and that can continue to proliferate stably under culture conditions. It becomes the state that became. Therefore, the established stem cells maintain pluripotency.
  • a particular property eg, pluripotency
  • the term “differentiated (differentiated) cell” refers to a cell whose function and morphology is specialized (for example, a muscle cell, a nerve cell, etc.). Unlike a stem cell, it does not have pluripotency or rare. Differentiated cells include, for example, epidermal cells, knee parenchymal cells, ductal cells, hepatocytes, blood cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, osteoblasts, skeletal myoblasts, nerve cells, vascular endothelial cells, pigment cells , Smooth muscle cells, fat cells, bone cells, chondrocytes and the like.
  • primary cultured cells refers to cells that have been cultured until the first passage, in which cells, tissues, or organs, etc., isolated from a living body are implanted. Say. Thus, it is strictly distinguished from the “passaged” cells that have inherited it. Usually, primary cells are difficult to remove, and it is extremely difficult to introduce foreign substances such as genetic manipulation (eg, transfection).
  • the term “neural cell” refers to a cell that constitutes a structural and functional unit of the nervous system including a cell body and a projection coming out of the cell body, or a variant or a functional equivalent thereof. Whether a cell is a nerve cell can be determined by checking whether nerve transmission occurs.
  • PC12 cell As a typical example of a nerve cell, PC12 cell can be used.
  • PC12 cells which are derived from adrenal medulla brown cells, are used as a representative cultured cell as a model of the nervous system because their morphology is similar to that of nerve cells.
  • the “instructions” in the present specification describe the method of introducing the substance of the present invention to a user (a researcher, an experimental assistant, or a physician, a patient, or the like who administers the treatment in treatment). is there.
  • This instruction includes-for example-a word indicating a method of using the composition or the like of the present invention.
  • the instructions shall be prepared in accordance with the format prescribed by the competent authority of the country in which the invention is implemented and shall clearly indicate that they have been approved by that competent authority.
  • the instructions are usually in the form of a so-called package insert for pharmaceuticals or in the form of manuals for laboratory reagents and are usually provided in paper form, but are not limited to, for example, It can also be provided in the form of electronic media (eg, homepages provided on the Internet, e-mail).
  • electronic media eg, homepages provided on the Internet, e-mail.
  • the present invention provides a composition for improving the nucleic acid introduction efficiency of a cell.
  • the composition is characterized by comprising: A) a cell adhesion molecule; and B) a gene transfer reagent.
  • gene transfer reagents such as gene transfer reagents have been used to introduce nucleic acids, the efficiency of transfer has increased due to the addition of external factors. It is not expected to increase, and it can be said that the effect of the cell adhesion molecule found by the present invention is surprising. In particular, it was not expected that the efficiency would change when cells were fixed, but rather that they would decrease.
  • the present invention has the effect that it has been found that when a gene transfer reagent and a cell adhesion molecule are combined and allowed to act on cells, the transfer of nucleic acid is unexpectedly improved.
  • the present invention it has become possible to easily perform transfection in a liquid phase or a solid phase on primary cultured cells, nerve cells, and the like, which has been difficult in the past.
  • the cell adhesion molecule and the gene introduction reagent may be present in a state where they can interact with each other. These substances may be configured to act on cells simultaneously, or may be configured separately.
  • the present invention provides a device for improving the nucleic acid introduction efficiency of a cell.
  • a composition comprising A) a cell adhesion molecule; and B) a gene transfer reagent is fixed to a support.
  • Such a device may include instructions in a preferred embodiment.
  • the cell adhesion molecule used in the present invention is preferably provided in a protein form, but is not limited thereto. This is because proteins are biomolecules and can be produced by genetic manipulation.
  • Preferred cell adhesion molecules include extracellular matrix. More preferably, the cell adhesion molecule comprises collagen, fibronectin or laminin, and preferred collagens include, but are not limited to, fibrogenic collagen, basement membrane collagen and the like. A plurality of these specific collagens may be present, and fibril-forming collagen and basement membrane collagen may be simultaneously contained.
  • the cell adhesion molecule used in the present invention comprises collagen type I or type IV. More preferably, the cell adhesion molecule comprises collagen type I and type IV. Collagen type I has only been known to function as a cell adhesion factor, and when used in combination with a gene transfer reagent, The synergistic increase in adoption efficiency is a special finding. Also, collagen
  • V-type increases the efficiency of nucleic acid transfer, which is a special effect.
  • combining these multiple collagens further increases the nucleic acid introduction efficiency. This is because as the type of collagen increases, the number of points that facilitate the introduction of nucleic acids increases.
  • the cell adhesion molecule used in the present invention preferably exists in a multimeric form. This is because it has been found that the presence of a multimeric form stabilizes the immobilization of cells and seems to dramatically increase the nucleic acid introduction efficiency.
  • the cell adhesion molecule used in the present invention has a three-dimensional structure.
  • the “three-dimensional structure” refers to a structure composed of at least two or more layers and having a spreading structure of molecules in a direction perpendicular to the plane in addition to a structure oriented in a plane. Therefore, by having such a three-dimensional structure, cells will exist in a state that is more "natural".
  • the gene transfer reagent used in the present invention comprises at least one reagent selected from the group consisting of a force-cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine-based reagent, a polyimine-based reagent, and calcium phosphate. In certain preferred embodiments, a plurality of these reagents may be used.
  • composition for improving the efficiency of nucleic acid introduction and immobilization of the cells of the present invention may simultaneously contain a foreign molecule to be introduced.
  • the composition of the invention may comprise a nucleic acid molecule encoding the gene to be introduced.
  • the composition of the present invention may be solid or liquid. Liquids are preferred. This is because the operation is easy, the arrangement on the solid phase is easy, and the effect in the liquid phase has been confirmed.
  • the cell targeted by the present invention may be any cell as long as it is a cell into which a nucleic acid is intended to be introduced.
  • Examples of the cell include, but are not limited to, PC12, Neuro2a, SH—SY5Y, NG108—15, HCN—1A, and the like.
  • Preferred cells include, but are not limited to, neural cells, primary cultured cells, and the like.
  • the source of the primary cultured cells may be any, but preferably includes, but is not limited to, mammalian brain (cerebral cortex, hippocampus, cerebellum).
  • Cell adhesion molecules for use in the present invention 5 J u gZm l ⁇ 1 0 0 / xg it is preferably present in a concentration range of ra 1, increase the efficiency of introduction also genes guide admissions agent comprising at less than this It can be understood that the introduction efficiency can be increased without any problem even if the upper limit is exceeded.
  • Examples of upper limits are, for example, lmg / ml, 7500 ⁇ g / m 1, 500 ⁇ g / m 1 s 400 ⁇ g / 1 200 ⁇ g / m 1, 250 ⁇ g / m 1, 200 ⁇ g / m 1, 150 ⁇ g / m 1 N 100 ⁇ g / m 90 ⁇ g Zm 1, 80 ⁇ g / m 170 ⁇ g / m 600 ⁇ m ml, 50 ⁇ g / m 1, 40 ⁇ g / m 1, 30 ⁇ g / m 1 and the like, but are not limited thereto.
  • Examples of lower limits include, for example, 75 g / m1, 50 ⁇ g / m 40 ⁇ g / m1 20 g / m1 s25 ⁇ g / m20 ⁇ g / ml, 15 ig / m 1 0 g / m 1 N S ii g / m ⁇ , 8 J ug / / ml, 7 ⁇ g / m Q ⁇ gy m I ⁇ 5 g / m 1 N 4 ⁇ g / m.1, 3 ⁇ g / m 12 ⁇ g / m K 1 ⁇ g / m 1 and the like, but are not limited thereto.
  • a more preferred range includes 20 / g / m1 to 60 ⁇ gZm1.
  • the invention takes advantage of the fact that it has enabled the introduction of nucleic acids into cells on a solid phase. It can be said that the present invention is particularly noteworthy in that the nucleic acid can be introduced into a cell to which gene transfer has conventionally been difficult on a solid phase (for example, cells of the nervous system such as PC12 cells).
  • the compositions of the invention can be used to transfect cells on a collagen-coated solid support.
  • the present invention is used for inducing differentiation after inducing nucleic acids. Therefore, preferably, the composition or kit of the present invention may contain a differentiation-inducing factor (for example, nerve growth factor or the like). It is also understood that the method of the present invention may further include a step of inducing desired differentiation after introducing the nucleic acid.
  • the cell adhesion molecule of the present invention is preferably coated on the support. More preferably, the cell adhesion molecule is coated on the support in multiple layers. Also, the support is preferably coated with poly-L-lysine, APS ( ⁇ -aminopropyl silane), and MAS.
  • the nucleic acid is arranged on the support, and it is more preferable that the nucleic acid (for example, DNA) is arranged on the support in an array.
  • the support By forming the support in such an array form, it can be used as a DNA chip or the like.
  • condition under which a nucleic acid is introduced includes any conditions under which a nucleic acid to be introduced is introduced and varies depending on the nucleic acid. And the situation such as cells.
  • the nucleic acid is DNA
  • such conditions include : pH : 6.0-8.0; Temperature: 30 to 40 ° C; salt concentration: 0.1 to 0.2 M (for example, 0.15 M), but is not limited thereto.
  • the method of the present invention can be performed in a solid or liquid phase.
  • a solid phase since the cell adhesion molecule fixes the cells, it is possible to introduce a solid phase nucleic acid such as a solid phase transfection.
  • nucleic acids such as neurons and primary cultured cells, into which nucleic acids such as transfection had not been able to be introduced has been made possible, enabling various analyzes to be performed.
  • the method for immobilizing the composition and the nucleic acid of the present invention on a support includes, but is not limited to, an ink jet method, a bubble jet (registered trademark) method, a manual method, and the like.
  • the present invention may include a step of inducing differentiation of the cell into which the nucleic acid has been introduced.
  • the present invention provides a kit for introducing a nucleic acid into a cell.
  • the kit comprises a composition comprising: A) a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent; and B) the composition and a nucleic acid encoding a desired gene (eg, Instructions to describe how to use it with DNA).
  • the cell adhesion molecule and the gene transfer reagent are as described above in the present specification and exemplified in Examples.
  • the instructions describe how to treat the nucleic acid and the composition of the present invention to achieve the introduction of the nucleic acid.
  • Such instructions may be in any form, as described herein above.
  • the present invention may include a differentiation inducing factor.
  • the invention in another aspect, relates to the use of a composition
  • a composition comprising: a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent, for introducing a nucleic acid into a cell.
  • a composition comprising: a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent, for introducing a nucleic acid into a cell.
  • a gene transfer reagent for introducing a nucleic acid into a cell.
  • the composition of the present invention may contain a differentiation-inducing factor.
  • composition composition, method and kit for inducing cell differentiation
  • the present invention provides a composition for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase, wherein the cell retains the ability to induce differentiation even after the introduction of the nucleic acid.
  • the composition of the present invention comprises: A) a cell adhesion molecule; and B) a gene transfer reagent. Cells transfected with such a composition retain the ability to induce differentiation even after transfection of nucleic acid. Such a phenomenon has not been achieved so far, and therefore, the present invention can be said to have effects that could not be predicted from the prior art.
  • the composition itself may contain the differentiation inducing factor, or may be provided separately.
  • the differentiation inducer is provided separately from the composition used to introduce the nucleic acid.
  • the differentiation inducing factor any factor can be used as long as the desired differentiation can be achieved, and examples thereof include a cell growth factor. If the cells are neural, the differentiation inducing factors used may include nerve growth factor (NGF) The
  • the present invention provides a method for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase.
  • the method comprises the steps of: providing a composition comprising: a) a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent, together with a nucleic acid intended to be transferred, to the cell; and B) conditions under which the nucleic acid is introduced. And exposing the cells to Here, the cells retain the ability to induce differentiation even after the introduction of the nucleic acid.
  • the composition used in the above method of the present invention may contain a differentiation inducing factor, or may be provided as a separate composition.
  • the differentiation inducing factors used include, but are not limited to, cell growth factors (eg, nerve growth factor (NGF) and the like). It is understood that such cell growth factors will vary depending on the cell used.
  • cell growth factors eg, nerve growth factor (NGF) and the like. It is understood that such cell growth factors will vary depending on the cell used.
  • the method of the present invention further comprises a step of inducing the cells to separate.
  • the present invention provides a composition for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase and for inducing differentiation of the cell.
  • the composition comprises A) a cell adhesion molecule; B) a gene transfer reagent; and C) a differentiation-inducing factor.
  • the present invention provides a kit for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase and inducing the cell to differentiate.
  • the kit comprises: A) a) a cell adhesion molecule; and b) a composition comprising a gene transfer reagent; and B) a differentiation-inducing factor. Descriptions of such components, nucleic acids, cells, etc. are provided above and it is understood that any preferred embodiments may be employed.
  • the differentiation-inducing factor is arranged separately from the above composition. Is done.
  • the kit of the present invention may be provided with instructions indicating procedures such as nucleic acid introduction and differentiation induction.
  • the present invention provides a method for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase and for inducing differentiation of the cell.
  • the method comprises providing a composition comprising A) a) a cell adhesion molecule; and) a gene transfer reagent, together with a nucleic acid intended to be transferred, to the cell; Exposing the cells to the conditions to be introduced; and C) inducing differentiation of the cells.
  • Descriptions of the composition, nucleic acids, cells, etc. of such compositions are provided above and it is understood that any preferred embodiments can be employed.
  • differentiation induction is performed independently of nucleic acid introduction.
  • compositions of the invention are administered for gene therapy purposes.
  • Gene therapy refers to therapy performed by the administration of an expressed or expressible nucleic acid to a subject.
  • the nucleic acids produce their encoded protein, which protein mediates a therapeutic effect.
  • the present invention when used as a medicament, such a medicament can be administered orally or parenterally. Alternatively, such a medicament may be administered intravenously or subcutaneously.
  • the medicament used in the present invention may be in the form of a pyrogen-free, pharmaceutically acceptable aqueous solution.
  • the preparation of such pharmaceutically acceptable compositions can be readily made by those skilled in the art by considering; H, isotonicity, stability, and the like.
  • the administration method includes oral administration, parenteral administration (for example, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, mucosal administration, rectal administration, vaginal administration, topical administration to the affected area). Administration, dermal administration, etc.).
  • Formulations for such administration may be provided in any formulation.
  • Such preparation forms include, for example, liquid preparations, injections, and sustained-release preparations.
  • the medicament of the present invention may contain a physiologically acceptable carrier, excipient or stabilizer (Japanese Pharmacopoeia 14th edition or its latest edition, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1). 8 tn E d ⁇ tlon, AR Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990, etc.) and a composition having a desired degree of purity. Prepared in the form of a cake or aqueous solution Can be saved.
  • PC I 2 cells (rat pheochromocytoma cells) (ATCC, CRL-1721) is, 37 ° C, 5% C0 2 below, containing 10% ⁇ shea serum and antibiotics (penicillin and streptomycin)
  • the cells were cultured in DMEM (Dulbeccos moderated Eag 1 e me di um) 14246-25, Nacalai Tesque, JPN).
  • N euro 2a cells were cultured at 37 ° C and 5% CO 2 in 10% FBS (fetal bovine serum) (29-167-54, Lot No. 2025F, Dainippon Pharmaceutical CO., LTD., JPN) and DMEM containing antibiotics.
  • FBS fetal bovine serum
  • transfection reagent for each cell line was determined by several transfection assays.
  • a reagent containing Lipofectamine 2000 (11668-019, Invitrogencorporation, CA) was selected as the transfusion reagent.
  • 1.51 pEGFP was diluted in 19 ⁇ l of DMEM. After gently diluting the pDNA, 4.5 ⁇ l of Lipofectamine 2000 was added, and the resulting mixture was allowed to stand at room temperature to form a lipid DNA complex.
  • J et— ⁇ I NP 5 101-30, Polyplus—transfection, France
  • collagen-IV (BD Biosciences, CA, 354233) (550 ⁇ g / ml) was diluted in 0.15 M acetic acid (final concentration 100 gZm1). This solution was then added at 400 / z 1 onto a glass slide to cover the eight square sections. After incubating at room temperature for 1 hour, the solution was removed and the squares were then washed once with PBS.
  • the cell culture medium was completely removed, and the cells were then fixed with 5% PFA. This cell,? Washing was performed once with 83, and background fluorescence due to the medium components was removed. Then, use an array scanner (Gene TA C UC4 X4, Genomic Solutions Inc., MI) or a confocal microscope (LSM510, Carr-ZVTs s' Co., t., Germany). And used to observe fluorescence. Furthermore, the fluorescence intensity was evaluated using a program (Image Quuan tver 5.2, Molecular Dynamics Inc., CA, USA).
  • FIG. 1F2 shows the results of observations over time (1 hour, 2 hours, 3 hours, 6 hours) using type IV collagen and using PLL. This indicates that the nucleus gradually expands and the nucleic acid is easily introduced.
  • Figure 1 F3 shows the results of phase microscopy of PC12 cells using collagen IV type fibronectin (1 hour and 2 hours-(a)), as well as collagen type IV, fibronectin, and collagen.
  • nucleic acid introduction efficiency is increased by adopting one having a relative area of preferably, for example, more than 0.1.
  • Fig. 1G shows the cell adhesion form when 3000-6000 cells were seeded at 3mm x 3mm on a transfection chip (slide glass, PLL coated).
  • FIG. 1H shows Neuro 2a cells on a PLL-coated slide coated with collagen type IV (0.005 mg / m 1). As shown, significant variation in morphology Is shown.
  • Transgenic gene expression of the CMV promoter EGFP construction vector was measured by fluorescent cells using confocal microscopy.
  • PLL PC12 cells, FIG. 3; N euro 2a cells, ( Figure 2C).
  • PLL pre-coated slides type IV collagen increased transfection to about 100-fold compared to the case of PLL coating alone. The same degree of adhesion was observed, but the transfection efficiency was lower (500 times) .
  • the adhesion to type I collagen was weaker than that of type IV collagen and laminin. Increased transfection efficiency is the case with type IV collagen Was about the same.
  • FIGS. 3A, 3B and 3D show the effect of the coating on transfection.
  • the results are shown in FIGS. 3A, 3B and 3D. It was found that transfusion efficiency was increased for collagen (types I and IV) and laminin. The effect of collagen is high in PLL and plain.
  • Figure 3E shows a graph quantifying the intensity. It is clear that the effect of collagen is remarkable.
  • Figure 3F shows the actual cell fixation of the thing in Figure 3D JP2004 / 009568
  • FIG. 3G shows the change over time of the effect of various ECMs depending on the type of slide surface treatment.
  • Example 6 Local Transfection Array for PC 12 Cells
  • the present inventors have applied the previous knowledge obtained in solution phase transfection to our LT transfection array system. Applying it, we explored the possibility of high-density chip-based gene expression screening for neuronal cell lines.
  • the transcription is localized in the area where the transcription mixture was spotted.
  • PC12 cells grown on different ECMs show the same trends as observed in the solution phase method. ⁇ Up to 40 transfected cells in grids coated with type I and type IV collagen. A transfectant was observed in the area spotted with 30 ⁇ 1 of the transfection complex (containing about 1111 pEGFP). More cells remained adherent throughout the transfection process as compared to the solution method.
  • human mesenchymal stem cells h MSC, PT-2501, Camrex Biosciences Wakersvi 11 e, Inc., MD
  • human embryos Sex renal cells HE K293 (RGB 1 637, RI KEN Cell Bank, J PN), N IH3T3-3 (RC B 0150 N RI KEN Cell BB, J PN), He La (RCB 0 007) , RIKEN Cell Bank, JPN :), PC12 cells (CRL-1721, ATCC) and Hep G2 (RCB1648, RIKEN Cell Bank, JPN) Please teach).
  • a human MSC cell In the case of a human MSC cell, this cell is transferred to a commercially available human mesenchymal cell basal medium (MSCGMBu11 etKit PT-3001, CambreBioScience Wa1kersvi11e, In) c., MD).
  • MSCGMBu11 etKit PT-3001 CambreBioScience Wa1kersvi11e, In
  • ⁇ 2-9-3 cells ⁇ 3-T3-3 cells, ⁇ e La cells and He ⁇ G 2 cells
  • these cells are replaced with 10% fetal serum (FBS, 29-167-54, Lot No. 202 5F, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, L-glutamine and sodium pyruvate, high glucose (4'.5 g) / L); 14246-125, maintained in Nacalai Tesque, JPN). 37 for all cell lines.
  • C 5% C_ ⁇ were cultured in 2 incubator one that is controlled. In experiments involving hMSCs, we used
  • plasmid DNA was amplified using the Escherichiaco 1 i, XL 1—blue strain (200249, Stratagene, TX) and the En do Free Plasmid Kit '1 236 2, QI AGEN, CA). In all cases, plasmid DNA was dissolved in water free of DNase and RNase. Transfection reagent was obtained as follows: Effect Fran Transfection Reagent (catalog no.
  • the printing solution consists of plasmid DNA and cell adhesion molecules (collagen type I, collagen type IV, laminin, collagen, dissolved in ultrapure water at a concentration of 4 mgZmL).
  • Plasma fibronectin (catalog No. 16-42- 4-—, -N-a ⁇ a-1 ai Tesque, JPN)
  • the above solution was applied to an inkjet printer (syn QUADTM, Cartesian).
  • the printed slide glass was applied to the surface of the slide using either a technologies, Inc., CA) or manually using a 0.5-10 ⁇ L tip.
  • transfection reagents Trans FastTM TfxTM-20, SuperFect, PolyFect, Lipofect AM I NE 2000, Jet PE I (X4) con e. Or ExGe In case n
  • plasmid DNA plasmid DNA
  • collagen type I collagen type IV
  • laminin or fibronectin plasmid DNA
  • transfection reagent 1.5 ⁇ l of micropigmentation reagent according to the ratio indicated in the instructions distributed by the manufacturer. Mix well in tube and incubate for 15 minutes at room temperature before printing on the chip.
  • the printing solution was applied on the surface of the glass slide using an inkjet printer or a 0.5 to 10 chip.
  • the printed slides were allowed to dry completely for 10 minutes at room temperature inside a safety cabinet.
  • a low-array scanner (GeneTAC UC4X4GenomicsSoIutiosInc., MI) was used. After measuring the total fluorescence intensity (arbitrary unit), the fluorescence intensity per surface area was calculated.
  • the transfection array chip was constructed by microprinting a cell culture solution containing cell adhesion factors such as slide gene type IV and laminin coated with PLL.
  • the transfusion efficiency using the method of the present invention is In particular, efficient transfection of tissue stem cells, such as HepG2 and hMSC, and nervous system cells, such as PC12 cells, which were difficult to transfat. It is particularly important that the hMSC increases efficiency by more than 40 times compared to the conventional method, and the high integration required for high-density arrays.
  • Solid-phase transfection technology enables the technical achievement of a transfection patch that can be used for in vivo gene delivery and a solid-phase system for high-throughput gene function studies in neural cells such as PC12 cells It has been found that a transfusion array (SPTA) is possible.
  • SPTA transfusion array
  • a mixture comprising the selected genetic material, the transfection reagent and the appropriate cell adhesion molecules, and salts can be immobilized on a solid support.
  • Cell culture on a support on which the mixture was immobilized allowed the incorporation of the genes in the mixture into the cultured cells.
  • Transfection efficiency The transfection efficiency was determined as the total fluorescence intensity per unit area. Depending on the cell line used, optimal liquid phase results were obtained with different transfusion reagents. These efficient transfusion reagents were then used to optimize a solid phase protocol. Several trends could be observed. By using optimized conditions for SPTA methodology in the case of PC12 cells where it is difficult to transfect the cells, the present investigators can achieve tens to several transfection efficiencies while maintaining cell characteristics. It was observed that it had increased by a factor of 100. For PC12 cells, best conditions include the use of Lipofectai ine2000 reagent.
  • N nitrogen atoms
  • P phosphate residues
  • phase-contamination was significant and transfection efficiency was significantly lower. This indicates that the percentage of adherent cells and the relative percentage of plasmid DNA that diffuses away from the support surface are important factors for both high transfection efficiency and high mutual contamination. Prove the hypothesis that there is.
  • a further cause of cross contamination may be the mobility of transfected cells on a solid support.
  • the small amount of reagent and DNA and the ability to automate the entire process increase the usefulness of the above methods.
  • the present inventors have successfully realized a transfection array in a system using a cell adhesion molecule and a gene transfer reagent. This will enable high-throughput research in various studies using solid-phase transfection, such as elucidation of the genetic mechanism that controls the differentiation of nerve cells.
  • the detailed mechanism of solid-phase transfer and the methodology related to the use of this technique for high-throughput real-time gene expression monitoring have been shown to be applicable to a variety of purposes.
  • ECM protein used to coat culture dishes in vitro retains significant effects on morphology, cell distribution, adhesion, and gene expression .
  • the present inventors have developed various cell lines HEK293, HEK293T, HeLa, NIH3T3, CHO,. HepG2, localized transfection (LT) cells for human mesenchymal stem cells (hMSCs).
  • hMSCs human mesenchymal stem cells
  • the ECM component appears to be a suitable substrate for chip-based cell arrays that will be useful for evaluating unknown gene networks. This study revealed that the function of fibronectin goes beyond the role of adhesion.
  • Integrin-mediated cell dispersion on a fibronectin matrix causes nuclear planarization, and this shape change has been shown to be accompanied by a transient increase in nuclear Ca2 + .
  • the activity of transcription factors regulated by Ca 2+ was then enhanced in dispersed cells.
  • nucleic acid introduction efficiency of the nucleic acid introduction according to the present invention does not depend on the type of the gene introduction reagent.
  • Table 1 Amounts of gene transfer reagents and plasmid DNA.
  • the reagents used are respectively as follows: Transfectin (170-3350; BI O-RAD, USA, CA); Lipofeet AM INE 2000 Re agent (1 668-019, I nvitrogencorporation, CA), Su FECTOR (E M-101-001, B—Bridge, USA, CA) ⁇ J et PE I (X 4) con e. (101—30, Poly Tu ⁇ s "— trans — Fection, France), Super Fect Transfection Reagent (301305, Qiagen, CA) and Trans IT (MIR 2304; Mirus Co., USA, WI).
  • Figure 8 shows the results.
  • a shows the appearance of nucleic acid transfer in various SECM proteins (fibronectin, collagen I, collagen IV, and laminin). Those that stain green are the products of the introduced genes.
  • b shows that the effects of various ECM proteins do not depend on the type of gene transfer reagent.
  • the z-axis is the transfection efficiency
  • the x-axis shows the gene transfer reagents of various manufacturers
  • the y-axis is the condition under which various ECM proteins or their absence exist. Indicates.
  • PC12 was transfected on an array coated with collagen IV under the conditions described in Example 7 and the like. The following conditions were used in place of the genes used in Example 7.
  • FIG. 9A in the case of PC12 cells cotransfected with the EGFP vector and the anti-EGFP siRNA, only He Red develops a color and a green signal derived from pEGFP-Nl is generated. It was found that it had been suppressed.
  • FIG. 9B in the case of scrambled siRNA, green fluorescence was observed, and it was confirmed that the effect in FIG. 9A was the effect of RNAi.
  • FIG. 9C shows the relative intensity of the fluorescence in FIGS. 9A and 9B. The y-axis is shown by relative luminance. It can be seen that the effect of EGFP is almost completely suppressed.
  • ECM proteins used included fibronectin, collagen type I, collagen type IV, and laminin. As shown in Fig. 1OA, it can be seen that the nucleic acid was introduced to a greater or lesser degree by coating with these ECM proteins.
  • FIG. 10B shows the results of scanning imaging of the differentiation in the transfection array (left).
  • the middle part of FIG. 9B does not show a micrograph of PC12 cells 3 days after transfection.
  • the right side of Fig. 1B-B shows the photograph one day after NGF induction. As shown, it became clear that PC 12 cells were differentiated in a nerve-like manner.
  • an arbitrary test for introducing an arbitrary nucleic acid and inducing an arbitrary differentiation can be performed. 04 009568
  • Test settings Since this technology can be used on a solid phase, it is possible to arbitrarily set the necessary conditions for cell arrays, and is useful in any cell-related industry (eg, pharmaceutical industry, agriculture, etc.) .

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Abstract

It is intended to develop a method whereby, in the case of transferring (in particular, transfecting) a nucleic acid (for example, DNA) into a cell into which such a nucleic acid can be hardly transferred in a state of being immobilized on a support, the transfer can be practiced or the transfer efficiency can be improved. This object can be established by applying a combination of a cell adhesion molecule (for example, IV type collagen) with a gene transfer reagent (for example, Lipofectamine) to a cell. Thus, a nucleic acid can be transferred at an unexpectedly high efficiency. It is also found out that the cell into which the nucleic acid has been transferred is still available in the induction of differentiation.

Description

明細書  Specification

細胞の核酸導入効率を改善する方法および組成物 技術分野  FIELD OF THE INVENTION Methods and compositions for improving nucleic acid transfer efficiency in cells

本発明は、 D NAのような核酸を導入する技術おょぴ細胞の分化誘導に関す る。 より詳細には、 細胞に核酸を導入する効率を上昇させる技術おょぴ核酸を 導入した後細胞を分化誘導させる技術に関する。 背景技術  The present invention relates to a technique for introducing a nucleic acid such as DNA, and to the induction of cell differentiation. More specifically, the present invention relates to a technique for increasing the efficiency of introducing a nucleic acid into cells, and a technique for inducing cell differentiation after introducing a nucleic acid. Background art

タンパク質の細胞への導入、 トランスフエクシヨン、 形質転換、 形質導入な どの遺伝子導入技術を含む標的物質の細胞への導入は、 細胞生物学、 遺伝子ェ 学、 分子生物学など広い分野において広く使用されている。  The introduction of target substances into cells, including gene transfer technologies such as the introduction of proteins into cells, transfection, transformation, and transduction, is widely used in a wide range of fields such as cell biology, genetics, and molecular biology. ing.

トランスフエクションは、 動物細胞などの細胞において一過的に遺伝子を発 現させ、 その影響を観察するためなどに利用される技術であり、 ポストゲノム 時代を迎えた現在、 そのゲノムがコードする遺伝子の機能を解明するために頻 繁に利用される技術となっている。  Transfection is a technique used to transiently express genes in cells such as animal cells and observe their effects.In the post-genome era, the genes encoded by the genome are now in use. It is a technology that is frequently used to elucidate the function of the system.

トランスフエクションを達成するために種々の技術が開発されており、 その ために利用される薬剤が種々開発されている。 そのような技術として、 カチォ オン性の物質であるカチオン性ポリマー、 カチオン性脂質などを利用する技術 があり、 広く使用されている。  Various technologies have been developed to achieve transfection, and various drugs used for that purpose have been developed. As such a technique, there is a technique utilizing a cationic polymer, a cationic lipid, or the like, which is a cationic substance, and is widely used.

しかし、 従来の薬剤を使用するのみでは、 トランスフヱクシヨン効率が十分 ではないことが頻繁に起こっており、 特に、 初代培養細胞、 神経細胞などは従 来のトランスフエクシヨン方法では、 充分に導入が起こらず、 充分な研究がな されていないのが現状である。 従って、 そのような薬剤またはシステムに対す る需要は多大に存在する。 また、 マイクロタイタープレート、 アレイなどの固 相上での標的物質の導入 （例えば、 トランスフエクシヨン） を効率的に行うた めの技術の開発に対する需要はますます高まるばかりである。 特に、 支持体へ 細胞を固定した上で物質 （例えば、 核酸） を導入する技術への需要は多い。 However, transfusion efficiency is often insufficient with the use of conventional drugs alone. In particular, primary culture cells and nerve cells are sufficiently introduced by conventional transfusion methods. At present, sufficient research has not been carried out. Therefore, there is a great need for such drugs or systems. In addition, efficient introduction (for example, transfection) of target substances on solid phases such as microtiter plates and arrays has been studied. The demand for the development of new technologies is only ever increasing. In particular, there is a great demand for a technique for immobilizing cells on a support and then introducing a substance (eg, nucleic acid).

細胞を固相上に固定する技術もまた、 かなり以前から開発されており、 現在 では、 かなりの細胞が、 固相上に固定されることができるようになつている。 しかし、 固相上に細胞を固定した上で、 核酸などの外来物質をその細胞へと導 入する試みはほとんどなされておらず、 その導入効率の改善についてはまった く取り組まれていない。  Techniques for immobilizing cells on solid phases have also been developed for quite some time now, and now a significant number of cells can be immobilized on solid phases. However, almost no attempt has been made to introduce foreign substances such as nucleic acids into cells after immobilizing the cells on a solid phase, and no attempt has been made to improve the transduction efficiency.

このように、当該分野に:^いて、すべての系おょぴ細胞において適用可能な、 トランスフエクシヨン系の開発が望まれている。 そのようなトランスフエクシ ヨン系の開発は、 例えば、 マイクロタイタープレート、 アレイなどを用いた大 規模ハイスループットアツセィにおいて、 種々の細胞おょぴ実験系に適用する ことへの応用が期待されること ら、 その需要は年々高まるばかりである。  Thus, there is a need in the art for the development of a transfusion system that is applicable to all cell lines. The development of such a transfusion system is expected to be applied to various cell and experimental systems, for example, in large-scale high-throughput assays using microtiter plates, arrays, etc. The demand is only increasing year by year.

細胞外マトリクス （E CMともいう） に細胞を接着することが、 正常な細胞 機能 （増殖、 分化および生存） の維持に重要な役割を果たしていることが広く 認知されてレヽる (C i a n c o t t i F G, e t a 1. S c i e n c e 2 85， 1028— 1032， 1999 )。 細胞外マトリクスタンパク質への限局 的かつ繊維性の接着が培養細胞において観察されているが、 細胞培養の研究は、 インビボでの細胞外マトリタスの架橋相互作用の働きを完全に解明するにはい たっていない。  It has been widely recognized that adhesion of cells to the extracellular matrix (also called ECM) plays an important role in maintaining normal cell functions (proliferation, differentiation and survival) (Ciancotti FG, eta 1. Science 285, 1028-1032, 1999). Localized and fibrous adhesion to extracellular matrix proteins has been observed in cultured cells, but cell culture studies have not been able to fully elucidate the role of extracellular matrix interactions in vivo. .

接着性の哺乳動物細胞は、 細胞外マトリクスタンパク質において細胞表面上 のィンテグリンレセプターを介して特定の配列を認識し、 細胞株に依存した様 式でレセプターに連結したシグナル伝達経路を介して応答することが知られる。 細胞培養の場合、 これらの応答は、 細胞形態の変化 （例えば、 ァクチン線維の 伸長および細胞プレーン化） を引き起こすだけなく、 接着に関与するこれら以 外の変化をも引き起こすようである。 ケラチノサイトを用いた研究 （J o n e s JM e t a l . Εχ υ. C e l l . Re s., 280, 244-254, 2002) では、 創傷治癒に関与する細胞移動において細胞外マトリクスが影 響を与えることが報告されている。 ここでは、 フイブロネクチンおょぴコラー ゲン I Vがプラスミノゲンァクチベータ一系 （例えば、 セリンプロテアーゼぉ よび関連分子） の活性化を引き起こし、 他方で、 コラーゲン I型、 I I I型な どは活性化を抑制することが報告されている。 D iMi l l a e t a 1. (D iMi l l a e t a l . J. C e l l . B i o l . 122, 729- 737, 1993) は、 平滑筋細胞では、 フイブロネクチンおよびコラーゲン I Vの表面密度に依存して細胞移動速度が決定されることを見出している。 接 着アツセィ （Toma s e l l i KJ.， J. Ce l l . B i o l. 105， 2347-2358, 1987) では、 P C 12細胞がラミニンおよびコラー ゲン I V型を用いた場合に広がることが見出されているが、 フィプロネクチン では広がることは観察されなかつた。 Adherent mammalian cells recognize specific sequences in extracellular matrix proteins via the integrin receptor on the cell surface, and respond via signaling pathways linked to the receptor in a cell line-dependent manner It is known to do. In the case of cell culture, these responses appear to cause changes in cell morphology (eg, elongation of actin filaments and cell plaining) as well as other changes involved in adhesion. Research using keratinocytes (Jones JMetal. Εχ υ. Cell. Res., 280, 244-254, 2002) reported that the extracellular matrix had an effect on cell migration involved in wound healing. Here, fibronectin and collagen IV cause activation of plasminogen activator systems (eg, serine proteases and related molecules), while collagen types I and III suppress activation. It has been reported. D iMi llaeta 1. (D iMi llaetal. J. Cell. Biol. 122, 729-737, 1993) reported that in smooth muscle cells, the cell migration rate was determined depending on the surface density of fibronectin and collagen IV. Is finding that. Attachment (Toma selli KJ., J. Cell. Biol. 105, 2347-2358, 1987) found that PC12 cells spread when laminin and collagen type IV were used. However, spread was not observed with fipronectin.

しかし、 これら細胞接着分子の外来物質の取り込みに対する効果については これまで試験されておらず、 その働きは未知のままである。  However, the effects of these cell adhesion molecules on the uptake of foreign substances have not been tested so far, and their functions remain unknown.

また、 P C 12細胞を含む神経系の細胞のような固相上で核酸を導入するこ とが困難な細胞が存在する。 これまでは、 このような細胞に核酸を導入するこ とは困難であり、 そのような細胞を形質転換するために核酸を導入する必要性 が当該分野において存在する。  In addition, there are cells in which it is difficult to introduce nucleic acids on a solid phase, such as cells of the nervous system including PC12 cells. Heretofore, it has been difficult to introduce nucleic acids into such cells, and there is a need in the art to introduce nucleic acids to transform such cells.

さらに、 細胞に核酸を導入した （例えば、 固相上で） 後、 分化誘導をさせる ことが必要な状況がしばしば存在する。 しかし、 そのような状況において、 核 酸を導入した後に分化誘導することができる技術は存在しない。 そのような細 胞の分化誘導技術に対する必要性が当該分野において存在する。  In addition, there are often situations where it is necessary to induce differentiation after introducing a nucleic acid into a cell (eg, on a solid phase). However, in such a situation, there is no technique capable of inducing differentiation after introducing nucleic acid. There is a need in the art for techniques for inducing the differentiation of such cells.

以上にかんがみて、 本発明は、 支持体上に固定された状態では、 DNAのよ うな核酸を導入することが難しい細胞に、 そのような物質を導入する （特に、 トランスフエクシヨン） 際に、 その導入を可能とするかまたは導入効率を改善 することができる方法を開発することを課題とする。 本発明はまた、 上記のよ うな細胞に核酸を導入した後に、 さらに、 分化誘導をかけることができる技術 を開発することを課題とする。 発明の要旨 In view of the above, the present invention provides a method for introducing such a substance into cells into which it is difficult to introduce a nucleic acid such as DNA when immobilized on a support (in particular, transfection). The task is to develop a method that can make the introduction possible or improve the introduction efficiency. The present invention also provides Another object of the present invention is to develop a technology that can induce differentiation after introducing a nucleic acid into such cells. Summary of the Invention

上記課題は、 細胞接着分子と、 遺伝子導入試薬 （例えば、 Lipofectamine) とを組み合わせて細胞に適用することによって、 予測されていたよりも高い核 酸導入効率が達成されたという予想外の効果を発見したことによつて解決され た。 - .  The above problem was discovered by applying a combination of a cell adhesion molecule and a gene transfer reagent (for example, Lipofectamine) to cells, thereby achieving an unexpected effect of achieving a higher nucleic acid transfer efficiency than expected. The problem was solved. -.

本発明では、本発明者らは、細胞接着分子 （細胞外マトリタスタンパク質（例 えば、 フイブロネクチン、 コラーゲン I型、 コラーゲン I V型、 ラミニンなど） を含む） がトランスフエクション効率を含む核酸導入効率に対して予想外に効 果があったことを見出した。 これらの核酸導入効率の上昇は、 予想外に固相上 においても見出された。 特に、 局所トランスフエクシヨン細胞アレイを用いた 系において、 神経細胞、 初代培養細胞を含む任意の細胞において効果があるこ とを見出した。 本発明者らは、 これにより、 細胞接着分子 （例えば、 コラーゲ ン I V型など） に基づいて効率よく核酸を導入する技術が達成されることを予 想外に発見した。 特に、 神経細胞での核酸導入が可能になったことにより、 祌 経細胞の種々の解析が可能になり、 パーキンソン病、 クロイツフェルトヤコブ 病、 神経再生、 神経幹細胞分化、 神経発達などの解析も可能となった。 また、 初代培養細胞の遺伝子操作も容易になったことによって、 より生体に近い環境 における遺伝子操作の影響も分析できるようになつた。  In the present invention, the present inventors have found that cell adhesion molecules (including extracellular matritas proteins (eg, fibronectin, collagen type I, collagen type IV, laminin, etc.)) have improved nucleic acid transduction efficiency including transfection efficiency. On the contrary, it was found that the effect was unexpected. These increases in nucleic acid transfer efficiency were unexpectedly found even on solid phases. In particular, it has been found that a system using a local transfection cell array is effective for any cells including nerve cells and primary cultured cells. The present inventors have unexpectedly discovered that this achieves a technique for efficiently introducing a nucleic acid based on a cell adhesion molecule (for example, collagen IV type). In particular, the ability to introduce nucleic acids into nerve cells has made it possible to perform a variety of analyzes of menstrual cells, such as Parkinson's disease, Kreuzfeld-Jakob disease, nerve regeneration, neural stem cell differentiation, and neural development It became. In addition, the easier genetic manipulation of primary cultured cells has made it possible to analyze the effects of genetic manipulation in environments closer to living organisms.

本発明はさらに、細胞接着分子と、遺伝子導入試薬 (例えば、 Lipofect amine) とを組み合わせて （例えば、 固相上で） 細胞に適用することによって、 その細 胞が適切な刺激 （例えば、 神経成長因子 （N G F ) のような細胞増殖因子の付 加） により分化誘導することができることを見出したことによって上記課題を 解決した。 したがって、 本発明は以下を提供する。 The present invention further provides for the application of a cell adhesion molecule in combination with a gene transfer reagent (eg, Lipofect amine) to a cell (eg, on a solid phase) so that the cell is appropriately stimulated (eg, nerve growth). The above problem was solved by finding that differentiation can be induced by the addition of a cell growth factor such as a factor (NGF). Therefore, the present invention provides the following.

( 1 ) 細胞への核酸の導入効率を改善するための組成物であって、  (1) a composition for improving the efficiency of introducing nucleic acids into cells,

A) 細胞接着分子；および  A) cell adhesion molecules; and

B) 遺伝子導入試薬、  B) gene transfer reagent,

を含む、 組成物。 A composition comprising:

( 2 ) 上記細胞接着分子は、 細胞外マトリタスを含む、 項目 1に記載の組成 物。  (2) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule contains extracellular matrix.

(3) 上記細胞接着分子は、 コラーゲン、 ラミニンおよぴフイブロネクチン からなる群より選択される少なくとも 1つの細胞外マトリタスを含む、 項目 1 に記載の組成物。  (3) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule includes at least one extracellular matrix, selected from the group consisting of collagen, laminin, and fibronectin.

(4) 上記細胞接着分子は、 繊維形成コラーゲンまたは基底膜コラーゲンを 含む、 項目 1に記載の組成物。  (4) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule contains fiber-forming collagen or basement membrane collagen.

(5) 上記細胞接着分子は、 繊維形成コラーゲンおよび基底膜コラーゲンを 含む、 項目 1に記載の組成物。  (5) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule includes fibril-forming collagen and basement membrane collagen.

(6) 上記細胞接着分子は、 コラーゲン I型または I V型を含む、 項目 1に 記載の組成物。  (6) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I or IV.

(7) 上記細胞接着分子は、 コラーゲン I型および I V型を含む、 項目 1に 記載の組成物。  (7) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule includes collagen type I and type IV.

(8) 上記遺伝子導入試薬は、 カチオン性高分子、 カチオン性脂質、 ポリア ミン系試薬、 ポリイミン系試薬おょぴリン酸カルシウムからなる群より選択さ れる少なくとも 1つの試薬を含む、 項目 1に記載の組成物。  (8) The composition according to item 1, wherein the gene transfer reagent contains at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine-based reagent, a polyimine-based reagent, and calcium phosphate. object.

(9) さらに、 導入が企図される核酸を含む、 項目 1に記載の組成物。  (9) The composition according to item 1, further comprising a nucleic acid to be introduced.

(10) 上記核酸は DNAである、 項目 1に記載の糸且成物。  (10) The composition according to item 1, wherein the nucleic acid is DNA.

(1 1) 上記核酸は、 遺伝子をコードする配列を含む、 項目 10に記載の組 成物。  (11) The composition according to item 10, wherein the nucleic acid includes a sequence encoding a gene.

(12) 上記組成物は固体である、 項目 1に記載の組成物。 (13) 上記組成物は液体である、 項目 1に記載の組成物。 (12) The composition according to item 1, wherein the composition is a solid. (13) The composition according to item 1, wherein the composition is a liquid.

(14) 上記細胞接着分子は多量体形態である、 項目 1に記載の組成物。 (14) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule is in a multimeric form.

(15) 上記細胞接着分子は、 三次元構造をとる、 項目 1に記載の組成物。(15) The composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule has a three-dimensional structure.

(16) 上記細胞は、 固相上での遺伝子導入が困難である細胞である、 項目 1に記載の'組成物。 (16) The 'composition according to item 1, wherein the cells are cells in which gene transfer on a solid phase is difficult.

(17) 上記細胞は、 神経系の細胞である、 項目 1に記載の組成物。  (17) The composition according to item 1, wherein the cells are cells of a nervous system.

(18) 上記細胞は、 神経系の細胞であり、 上記細胞接着分子はコラーゲン を含む、 項目 1に記載の組成物。  (18) The composition according to item 1, wherein the cells are cells of a nervous system, and the cell adhesion molecule includes collagen.

(19) 上記核酸の導入は、上記細胞が固相上に配置された状態で行われる、 項目 1に記載の組成物。  (19) The composition according to item 1, wherein the nucleic acid is introduced in a state where the cells are arranged on a solid phase.

(20) 上記細胞は、 初代培養細胞を包含する、 項目 1に記載の組成物。 (21) '上記細胞接着分子は、 5 i gZm l〜： L O O /^ gZm lの濃度で存 在する、 項目 1に記載の糸且成物。  (20) The composition according to item 1, wherein the cells include primary cultured cells. (21) The fibrous composition according to item 1, wherein the cell adhesion molecule is present at a concentration of 5 igZml to: LOO / ^ gZml.

(22) 上記細胞は、 さらに、 分化誘導される、 項目 1に記載の組成物。 (23) 上記組成物は、分化誘導因子をさらに含む、項目 1に記載の組成物。 ここで、 分化誘導因子は、 上記組成物とは別個に含まれていてもよい。 分化誘 導因子が液性因子である場合は、 特に、 別個に含まれることが好ましい。  (22) The composition according to item 1, wherein the cells are further induced to differentiate. (23) The composition according to item 1, wherein the composition further comprises a differentiation inducing factor. Here, the differentiation inducing factor may be contained separately from the composition. When the differentiation-inducing factor is a humoral factor, it is particularly preferable that it is separately contained.

(24) 細胞の核酸導入効率を改善するためのデバイスであって、  (24) A device for improving the nucleic acid introduction efficiency of a cell,

A) 細胞接着分子；および  A) cell adhesion molecules; and

B) 遺伝子導入試薬、  B) gene transfer reagent,

を含む、 糸且成物が支持体に固定される、 デバイス。 A device, wherein the thread is fixed to a support.

(25) 上記細胞接着分子は、 細胞外マトリクスを含む、 項目 24に記載の デバイス。  (25) The device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule includes an extracellular matrix.

(26) 上記細胞接着分子は、 コラーゲン、 ラミニンおよびブイプロネクチ ンからなる群より選択される少なくとも 1つの細胞外マトリクスを含む、 項目 24に記載のデバイス。 (27) 上記細胞接着分子は、 繊維形成コラーゲンまたは基底膜コラーゲン を含む、 項目 24に記載のデバイス。 (26) The device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule includes at least one extracellular matrix selected from the group consisting of collagen, laminin, and buipronecin. (27) The device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule includes fiber-forming collagen or basement membrane collagen.

(28) 上記細胞接着分子は、 繊維形成コラーゲンおよび基底膜コラーゲン を含む、 項目 24に記載のデパイス。  (28) The depiice according to item 24, wherein the cell adhesion molecule includes fibril-forming collagen and basement membrane collagen.

(29) 上記細胞接着分子は、 コラーゲン I型または I V型を含む、 項目 2 4に記載のデパイス。  (29) The depiice according to item 24, wherein the cell adhesion molecule includes collagen type I or type IV.

(30) 上記細胞接着分子は、 コラーゲン I型および I V型を含む、 項目 2 4に記載のデパイス。  (30) The depiice according to item 24, wherein the cell adhesion molecule includes collagen type I and type IV.

(31) 上記遺伝子導入試薬は、 カチオン性高分子、 カチオン性脂質、 ポリ アミン系試薬、 ポリイミン系試薬およびリン酸カルシウムからなる群より選択 される少なくとも 1つの試薬を含む、 項目 24に記載のデバイス。  (31) The device according to item 24, wherein the gene introduction reagent includes at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine-based reagent, a polyimine-based reagent, and calcium phosphate.

(32) さらに、導入が意図される核酸を含む、 目 24に記載のデバイス。 (32) The device according to Item 24, further comprising a nucleic acid intended to be introduced.

(33) 上記核酸は DNAである、 項目 24に記載のデバイス。 (33) The device according to item 24, wherein the nucleic acid is DNA.

(34) 上記核酸は遺伝子をコードする配列を含む、 項目 33に記載のデバ イス。  (34) The device according to item 33, wherein the nucleic acid includes a sequence encoding a gene.

(35) 上記支持体は固体である、 項目 24に記載のデバイス。  (35) The device according to item 24, wherein the support is a solid.

(36) 上記支持体は液体である、 項目 24に記載のデバイス。  (36) The device according to item 24, wherein the support is a liquid.

(37) 上記細胞接着分子は多量体形態である、項目 24に記載のデバイス。 (38) 上記細胞接着分子は、 三次元構造をとる、 項目 24に記載のデバィ ス。  (37) The device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule is in a multimeric form. (38) The device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule has a three-dimensional structure.

(39) 上記細胞は、 固相上での遺伝子導入が困難である細胞である、 項目 24に記載のデバイス。  (39) The device according to item 24, wherein the cell is a cell in which gene transfer on a solid phase is difficult.

(40) 上記細胞は、 神経系の細胞である、 項目 24に記載のデバイス。 (41) 上記細胞は、 神経系の細胞であり、 上記細胞接着分子はコラーゲン を含む、 項目 24に記載のデバイス。  (40) The device according to item 24, wherein the cell is a cell of a nervous system. (41) The device according to item 24, wherein the cell is a cell of a nervous system, and the cell adhesion molecule includes collagen.

(42) 上記核酸の導入は、上記細胞が固相上に配置された状態で行われる、 項目 24に記載のデバイス。 (42) the introduction of the nucleic acid is performed in a state where the cells are arranged on a solid phase, The device according to item 24.

(43) 上記細胞は、初代培養細胞を包含する、項目 24に記載のデパイス。 (44) 上記細胞接着分子は、 5 /x g/m l〜： L O O /z gZm lの濃度で存 在する、 項目 24に記載のデバイス。 (43) The depiice according to item 24, wherein the cells include primary cultured cells. (44) The device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule is present at a concentration of 5 / xg / ml to: LOO / zgZml.

(45) 上記細胞接着分子は、 上記支持体にコーティングされる、 項目 24 に記載のデパイス。  (45) The depiice according to item 24, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support.

(46) 上記細胞接着分子は、 多層で上記支持体にコーティングされる、 項 目 24に記載のデバイス。  (46) The device according to item 24, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support in multiple layers.

(47) 上記核酸は、 アレイ状で上記支持体に配置される、 項目 32に記载 のデノ イス。  (47) The device according to item 32, wherein the nucleic acids are arranged on the support in an array.

(48) 上記細胞は、 さらに、分化誘導される、項目 24に記載のデバイス。 (49) 上記組成物は、 分化誘導因子をさらに含む、 項目 24に記載のデバ イス。  (48) The device according to item 24, wherein the cells are further induced to differentiate. (49) The device according to item 24, wherein the composition further comprises a differentiation inducing factor.

(50) 細胞の核酸導入効率を上昇させる方法であって、  (50) A method for increasing the nucleic acid introduction efficiency of a cell,

A) 細胞の核酸導入効率を改善するための組成物であって、  A) A composition for improving the nucleic acid introduction efficiency of a cell,

a) 細胞接着分子；および a) cell adhesion molecules; and

b) 遺伝子導入試薬、 b) gene transfer reagent,

を含む、組成物を、導入が意図される核酸とともに、上記細胞に提供する工程； ならびに Providing the composition to the cell together with the nucleic acid to be introduced; and

B) 核酸が導入される条件に上記細胞をさらす工程、  B) exposing the cells to conditions under which the nucleic acid is introduced,

を包含する、 方法。 The method.

(51) 上記細胞接着分子は、 細胞外マトリタスを含む、 項目 50に記載の 方法。  (51) The method according to item 50, wherein the cell adhesion molecule includes extracellular matrix.

(52) 上記細胞接着分子は、 コラーゲン、 ラミニンおよぴフイブロネクチ ンからなる群より選択される少なくとも 1つの細胞外マトリクスを含む、 項目 50に記載の方法。 (52) The cell adhesion molecule comprises at least one extracellular matrix selected from the group consisting of collagen, laminin, and fibronectin. The method according to 50.

(53) 上記細胞接着分子は、 繊維形成コラーゲンまたは基底膜コラーゲン を含む、 項目 50に記載の方法。  (53) The method according to Item 50, wherein the cell adhesion molecule includes fibril-forming collagen or basement membrane collagen.

(54) 上記細胞接着分子は、 繊維形成コラーゲンおよび基底膜コラーゲン を含む、 項目 50に記載の方法。  (54) The method according to Item 50, wherein the cell adhesion molecule includes fibril-forming collagen and basement membrane collagen.

(55) 上記細胞接着分子は、 コラーゲン I型または IV型を含む、 項目 5 0に記載の方法。  (55) The method according to item 50, wherein the cell adhesion molecule includes collagen type I or type IV.

(56) 上記細胞接着分子は、 コラーゲン I型おょぴ I V型を含む、 項目 5 0に記載の方法。  (56) The method according to item 50, wherein the cell adhesion molecule includes collagen type I and type IV.

(57) 上記遺伝子導入試薬は、 カチオン性高分子、 カチオン性脂質、 ポリ ァミン系試薬、 ポリイミン系試薬およびリン酸カルシウムからなる群より選択 される少なくとも 1つの試薬を含む、 項目 50に記載の方法。  (57) The method according to item 50, wherein the gene introduction reagent includes at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine reagent, a polyimine reagent and calcium phosphate.

(58) 上記組成物は固体である、 項目 50に記載の方法。  (58) A method according to item 50, wherein the composition is a solid.

(59) 上記組成物は液体である、 項目 50に記載の方法。  (59) A method according to item 50, wherein the composition is a liquid.

(60) 上記細胞接着分子は多量体形態である、 項目 50に記載の方法。 (60) The method according to Item 50, wherein the cell adhesion molecule is in a multimeric form.

(61) 上記細胞接着分子は、 三次元構造をとる、 項目 50に記載の方法。 (62) 上記細胞は、 固相上での遺伝子導入が困難である細胞である、 項目 50に記載の方法。 (61) The method according to Item 50, wherein the cell adhesion molecule has a three-dimensional structure. (62) The method according to item 50, wherein the cell is a cell in which gene transfer on a solid phase is difficult.

(63) 上記細胞は、 神経系の細胞である、 項目 50に記載の方法。  (63) The method according to item 50, wherein the cells are cells of a nervous system.

(64) 上記細胞は、 神経系の細胞であり、 上記細胞接着分子はコラーゲン を含む、 項目 50に記載の方法。  (64) The method according to item 50, wherein the cell is a cell of a nervous system, and the cell adhesion molecule includes collagen.

(65) 上記核酸の導入は、上記細胞が固相上に配置された状態で行われる、 項目 50に記載の方法。  (65) The method according to Item 50, wherein the introduction of the nucleic acid is performed in a state where the cells are arranged on a solid phase.

(66) 上記細胞は、 初代培養細胞を包含する、 項目 50に記載の方法。 (67) 上記核酸は DNAを含む、 項目 50に記載の方法。  (66) The method according to item 50, wherein the cells include primary cultured cells. (67) The method according to item 50, wherein the nucleic acid includes DNA.

(68) 上記核酸は、 遺伝子をコードする配列を含む、 項目 50に記載の方 法。 (68) The nucleic acid according to Item 50, wherein the nucleic acid comprises a sequence encoding a gene. Law.

(69) 上記組成物おょぴ上記核酸は、 支持体に固定される、 項目 50に記 載の方法。  (69) The method according to item 50, wherein the composition and the nucleic acid are fixed to a support.

(70) 上記支持体は、 固体である、 項目 69に記載の方法。  (70) The method according to item 69, wherein the support is a solid.

(71) 上記支持体は、 液体である、 項目 69に記載の方法。  (71) The method according to item 69, wherein the support is a liquid.

(72) 上記組成物おょぴ上記核酸を上記支持体に固定する工程をさらに包 含する、 項目 69に記載の方法。  (72) The method according to Item 69, further comprising a step of fixing the composition and the nucleic acid to the support.

(73) 上記固定は、インクジヱット方式でされる、項目 69に記載の方法。 (74) 上記細胞接着分子は、 上記支持体にコーティングされる、 項目 69 に記載の方法。  (73) The method according to item 69, wherein the fixing is performed by an ink jet method. (74) The method according to Item 69, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support.

(75) 上記細胞接着分子は、 多層で上記支持体にコーティングされる、 項 目 69に記載の方法。  (75) The method according to item 69, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support in multiple layers.

(76) 上記核酸は、 アレイ状で上記支持体に配置される、 項目 69に記載 の方法。  (76) The method according to item 69, wherein the nucleic acids are arranged on the support in an array.

(77) 上記細胞を分化誘導する工程をさらに包含する、 項目 50に記載の 方法。  (77) The method according to item 50, further comprising a step of inducing differentiation of the cell.

(78) 上記組成物は、分化誘導因子をさらに含む、項目 50に記載の方法。 (79) 細胞に核酸を導入するためのキットであって、  (78) The method according to item 50, wherein the composition further comprises a differentiation inducing factor. (79) a kit for introducing a nucleic acid into cells,

A)  A)

a) 細胞接着分子；および a) cell adhesion molecules; and

b) 遺伝子導入試薬、 b) gene transfer reagent,

を含む、 組成物；ならびに A composition comprising:

B) 上記組成物と、 核酸とともに使用する方法を記載した指示書、 とを備える、 キット。  B) A kit comprising: the above composition; and instructions describing a method for use with the nucleic acid.

(80) 分化誘導因子をさらに備える、 項目 79に記載のキット。  (80) The kit according to Item 79, further comprising a differentiation inducing factor.

(81) a) 細胞接着分子；および b) 遺伝子導入試薬、 を含む、組成物の、 細胞に遺伝子導入するための使用。 ノ (81) a composition comprising: a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent. Use for gene transfer into cells. No

(82) 上記組成物は、分化誘導因子をさらに含む、項目 81に記載の使用。  (82) The use according to item 81, wherein the composition further comprises a differentiation inducing factor.

(83) 固相上で細胞に核酸を導入するための ,钽成物であって、上記細胞は、 核酸導入後も分化誘導する能力が保持される、 組成物であって、  (83) A composition for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase, wherein the cell retains the ability to induce differentiation even after the introduction of the nucleic acid, a composition comprising:

A) 細胞接着分子；および  A) cell adhesion molecules; and

B) 遺伝子導入試薬、  B) gene transfer reagent,

を含む、 組成物。 A composition comprising:

(84) 上記組成物は、 分化誘導因子を含む、 項目 83に記載の組成物。  (84) The composition according to item 83, wherein the composition comprises a differentiation inducing factor.

(85) 上記分化誘導因子は、 細胞増殖因子を含む、 項目 84に記載の組成 物。  (85) The composition according to item 84, wherein the differentiation inducing factor includes a cell growth factor.

(86) 上記細胞は神経であり、 そして上記分化誘導因子は、 神経成長因子 (NGF) を含む、 項目 84に記載の組成物。  (86) The composition according to item 84, wherein the cell is a nerve, and the differentiation inducing factor includes nerve growth factor (NGF).

(87) 固相上で細胞に核酸を導入するための方法であって、  (87) A method for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase,

A)  A)

a) 細胞接着分子；および  a) cell adhesion molecules; and

b) 遺伝子導入試薬、  b) gene transfer reagent,

を含む、組成物を、導入が意図される核酸とともに、上記細胞に提供する工程； ならびに Providing the composition to the cell together with the nucleic acid to be introduced; and

B) 核酸が導入される条件に上記細胞をさらす工程、  B) exposing the cells to conditions under which the nucleic acid is introduced,

を包含し、 ,

上記細胞は、 上記核酸導入後も分化誘導する能力が保持される、 The cells retain the ability to induce differentiation even after the nucleic acid introduction,

方法。 Method.

(88) 上記組成物は、 分化誘導因子を含む、 項目 87に記載の方法。  (88) The method according to Item 87, wherein the composition comprises a differentiation inducing factor.

(89) 上記分化誘導因子は、細胞増殖因子を含む、項目 88に記載の方法。  (89) The method according to item 88, wherein the differentiation inducing factor includes a cell growth factor.

(90) 上記細胞は神経であり、 そして上記分化誘導因子は、 神経成長因子 (NGF) を含む、 項目 88に記載の方法。 (91) 上記細胞を分化誘導させる工程をさらに包含する、 項目 87に記载 の方法。 (90) The method according to Item 88, wherein the cell is a nerve, and the differentiation inducing factor includes nerve growth factor (NGF). (91) The method according to item 87, further comprising a step of inducing differentiation of the cell.

(92) 固相上で細胞に核酸を導入し、 かつ、 上記細胞を分化誘導させるた めの組成物であって、  (92) a composition for introducing a nucleic acid into cells on a solid phase, and for inducing differentiation of the cells,

A) 細胞接着分子；  A) cell adhesion molecules;

B ) 遺伝子導入試薬；および  B) a gene transfer reagent; and

C) 分化誘導因子  C) Differentiation inducing factor

を含む、 組成物。 A composition comprising:

(93) 固相上で細胞に核酸を導入し、 かつ、 上記細胞を分化誘導させるた めのキットであって、  (93) A kit for introducing a nucleic acid into cells on a solid phase and for inducing differentiation of the cells,

A)  A)

a) 細胞接着分子；および  a) cell adhesion molecules; and

b) 遺伝子導入試薬を含む、 組成物；ならびに  b) a composition comprising a gene transfer reagent;

B) 分化誘導因子  B) Differentiation inducing factor

を備える、 キット。 Comprising a kit.

(94) 固相上で細胞に核酸を導入し、 かつ、 上記細胞を分化誘導させる方 法であって、 ，  (94) A method for introducing a nucleic acid into cells on a solid phase and inducing differentiation of the cells,

A)  A)

a) 細胞接着分子；および  a) cell adhesion molecules; and

b) 遺伝子導入試薬を含む、 組成物を、 導入が意図される核酸とともに、 上記細胞に提供する工程；ならびに  b) providing a composition comprising a gene transfer reagent to the cells, together with a nucleic acid to be transferred;

B) 核酸が導入される条件に上記細胞をさらす工程；および  B) exposing said cells to conditions under which nucleic acid is introduced; and

C) 上記細胞を分化誘導する工程、  C) a step of inducing differentiation of the cells,

を包含する、 方法。 The method.

本発明の上述の目的， その他の目的， 特徴および利点は、 図面を参照して行 う以下の発明の実施の形態の詳細な説明から一層明らかとなる。 本発明により、 固相でも液相でも実施することができる、 トランスフエクシ ョンの効率上昇が達成された。 このようなトランスフエクション効率上昇試薬 は、 特に固相で細胞を固定しつつトランスフエクション効率を上昇させるため に有用である。 The above and other objects, features and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of embodiments of the present invention with reference to the drawings. According to the present invention, an increase in efficiency of transfection, which can be carried out in a solid phase or a liquid phase, has been achieved. Such a transfection efficiency increasing reagent is particularly useful for increasing transfection efficiency while fixing cells in a solid phase.

本努明はまた、核酸を導入した後に、分化誘導を可能にする技術を提供する。 本発明により、 任意の核酸を導入し、 任意の分化誘導を行うといった自在な試 験設定を可能にする。 この技術は、 固相上で可能なことから、 細胞アレイで必 要なかなりの条件を任意に設定することができるという効果を奏する。  The present effort also provides a technique that enables induction of differentiation after introducing a nucleic acid. According to the present invention, it is possible to freely set a test such as introducing an arbitrary nucleic acid and inducing an arbitrary differentiation. Since this technique is possible on a solid phase, there is an effect that it is possible to arbitrarily set a considerable condition required for a cell array.

以下に、 本宪明の好ましい実施形態を示すが、 当業者は本発明の説明および 当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することがで き、 本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきで ある。 図面の簡単な説明  Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described. However, those skilled in the art can appropriately implement the embodiments and the like based on the description of the present invention and well-known conventional techniques in the art, and demonstrate the functions and effects of the present invention. It should be appreciated that it is easy to understand. Brief Description of Drawings

図 1は、 実施例における位相顕微鏡 （図 1 A〜D) およぴ共焦点顕微鏡 （図 1 E〜F) を用いて観察された P C 1 2細胞の形態変化。  FIG. 1 shows morphological changes of PC12 cells observed using a phase microscope (FIGS. 1A to 1D) and a confocal microscope (FIGS. 1E to 1F) in Examples.

図 1 Aは、 フイブロネクチンの効果を示す。  FIG. 1A shows the effect of fibronectin.

図 1 Bは、 I型コラーゲンの効果を示す。  FIG. 1B shows the effect of type I collagen.

図 1 Cは、 I V型コラーゲンを示す。  FIG. 1C shows type IV collagen.

図 1 Dは、 ラミニンの効果を示す。  FIG. 1D shows the effect of laminin.

図 1 Eは、 フィプロネクチンの効果を示す。  FIG. 1E shows the effect of fipronectin.

図 1 F 1は、 I V型コラーゲンを示す。  FIG. 1 F 1 shows type IV collagen.

図 1 F 2は、 I V型コラーゲンを用いた場合と、 P L Lを用いた場合とを、 経時的に （1時間、 2時間、 3時間、 6時間） 観察した結果を示す。 徐々に核 が拡張し、 核酸が導入されやすい形態となっていることが示される。  FIG. 1F2 shows the results of observing the case where type IV collagen was used and the case where PLL was used over time (1 hour, 2 hours, 3 hours and 6 hours). This indicates that the nucleus gradually expands, and the nucleic acid is easily introduced.

図 1 F 3は、 コラーゲン I V型およびフィプロネクチンを用いた場合の位相 顕微鏡による観察結果 （1時間および 2時間 = (a))、 ならびに、 コラーゲン I V型、 フイブロネクチン、 コラーゲン I型およぴラミニンについて観察した 結果 （3時間 = (b)) を示す。 これをもとに、 核の相対面積をグラフ化したも のを図 1 F 3 (c) に示す。 Figure 1 F3 shows the phase using collagen type IV and fipronectin The results of observation with a microscope (1 hour and 2 hours = (a)) and the results of observation of collagen type IV, fibronectin, collagen type I and laminin (3 hours = (b)) are shown. Based on this, a graph of the relative area of the nucleus is shown in Figure 1F3 (c).

図 1 Gは、 トランスフエクシヨンチップ （スライドガラス、 P LLコート） 上に 3 mm X 3 mmに 3000— 6000個の細胞を播種したときの細胞接着 形態を示す。 図 1 Gは、 P C 12細胞の細胞接着形態を示す。  Figure 1G shows the cell adhesion morphology when 3000-6000 cells were seeded at 3 mm x 3 mm on a transfection chip (slide glass, PLL coated). FIG. 1G shows the cell adhesion morphology of PC12 cells.

図 1Hは、 コラーゲン I V型 （0. 005mg/ml) をコーティングした PLLコートスライ ドにおける Ne u r o 2 a細胞を示す。  FIG. 1H shows Neuro2a cells on a PLL coat slide coated with collagen type IV (0.005 mg / ml).

図 2は、 実施例において示される例示的な I V型コラーゲンの効果 （PC 1 2細胞） を示す。  FIG. 2 shows the effect of exemplary type IV collagen (PC12 cells) shown in the examples.

図 2Aは、 PC 12細胞における各種細胞外マトリックス上での接着特性を 示す。  FIG. 2A shows the adhesive properties of PC12 cells on various extracellular matrices.

図 2Bは、 Ne u r o 2 a細胞における各種細胞外マトリタスの効果を示す。 図 2Cは、 N e u r o 2 a細胞における各種細胞外マトリクスのトランスフ ェクション効率を示す。  FIG. 2B shows the effect of various extracellular matrices on Neuro2a cells. FIG. 2C shows transfection efficiencies of various extracellular matrices in Neuro2a cells.

図 3は、 実施例における PC 12細胞に対する P LLコーティングの有無の 効果を示す。 図 3 Aは、 各種コート条件および細胞外マトリックスとの組み合 わせにおける位相顕微鏡を示す。  FIG. 3 shows the effect of the presence or absence of PLL coating on PC 12 cells in the examples. FIG. 3A shows a phase microscope under various coating conditions and combinations with extracellular matrix.

図 3Bは、 各種 E CMのトランスフエクシヨン効率を示す写真である。  Figure 3B is a photograph showing the transfer efficiency of various ECMs.

図 3 Cは、 それぞれプレーンおよび PL Lコーティングスライドにおける隔 離効果を示す。  FIG. 3C shows the separation effect on plain and PLL coated slides, respectively.

図 3Dは、 各種 E CMと各種コーティングとの組み合わせを試験した結果を 示す。  Figure 3D shows the results of testing various combinations of ECM and various coatings.

図 3Eには、 その強度を数値化したグラフを示す。  Figure 3E shows a graph quantifying the intensity.

図 3 Fは、 図 3Dのものの実際の細胞固定の様子を示す。 図 3Gは、 スライド表面処理の種類による各種 E CMの効果の経時変化を示 す。 FIG. 3F shows the actual state of cell fixation of the one in FIG. 3D. FIG. 3G shows the change over time of the effect of various ECMs depending on the type of slide surface treatment.

図 3Hは、 スライド表面処理の種類による各種 E CMの効果の経時変化を示 す。  Figure 3H shows the time course of the effects of various ECMs depending on the type of slide surface treatment.

図 4は、 Fu r a 2技術を用いて観察されたカルシウムイオン放出の挙動を 示す。  FIG. 4 shows the behavior of calcium ion release observed using the Fura 2 technique.

図 5は、 種々の細胞接着因子の核酸導入効率への効果をまとめたグラフを示 す。  FIG. 5 shows a graph summarizing the effects of various cell adhesion factors on nucleic acid transfer efficiency.

図 6は、 本発明のアレイ技術への応用例を示す。  FIG. 6 shows an application example of the present invention to an array technology.

図 6 Aは、 PC 12細胞を示す。  FIG. 6A shows PC 12 cells.

図 6Bは、 Ne u r o 2 a細胞を示す。  FIG. 6B shows Neuro2a cells.

図 6 Cは He p G2を示す。  FIG. 6C shows He p G2.

図 6Dは、 hMSCを示す。  FIG. 6D shows hMSC.

図 6Eは、 図 6 Aにおける PC 12細胞の様子を示した写真である。  FIG. 6E is a photograph showing the appearance of PC 12 cells in FIG. 6A.

図 7は、 固相系トランスフヱクシヨンの概略を示す。  FIG. 7 shows the outline of a solid-phase transfusion.

図 8は、 核酸導入効率は遺伝子導入試薬の種類に依存しないことを示す。 a は、 各種 SECMタンパク質 （フイブロネクチン、 コラーゲン I、 コラーゲン ίνおよびラミニン） における、核酸導入の様子を示す。緑色に染まるものが、 導入された遺伝子の産物になる。 bは、 各種 E CMタンパク質の効果が、 遺伝 子導入試薬の種類に依存しないことを示す。 z軸は、 トランスフエクシヨン効 率であり、 X軸には各種メーカーの遺伝子導入試薬を示し、 y軸には各種 EC Mタンパク質またはその非存在下である条件を示す。 メーカーの試薬を用いて も PC12 細胞のトランスフエクシヨン効率の傾向は変化しないことが明らかに なった。  FIG. 8 shows that nucleic acid transfer efficiency does not depend on the type of gene transfer reagent. a shows the state of nucleic acid transfer in various SECM proteins (fibronectin, collagen I, collagen ίν, and laminin). Those that stain green are the products of the introduced genes. b shows that the effects of various ECM proteins do not depend on the type of gene transfer reagent. The z-axis shows the transfection efficiency, the X-axis shows gene transfer reagents of various manufacturers, and the y-axis shows various ECM proteins or conditions in the absence thereof. It was clarified that the trends in the transfection efficiency of PC12 cells did not change using the reagents of the manufacturer.

図 9は、 固相トランスフエクシヨン （PC 12) をコラーゲン I Vコーティ ング上で行った場合の s i RNAの効果を示す。 図 9 Aは、 EGFPベクター および抗 EGFP s i RNAを共トランスフエクションした PC 12細胞を 示す。 示されるように、 He R e dのみが発色し、 p EGFP— N1に由来す る緑色信号が抑制されていたことが判明した。 他方、 図 9Bは、 スクランブル s i RNAを用いた例を示す。 示されるように、 緑色の蛍光が観察され、 図 9 Aにおける効果は、 RNA iの効果であることが確認された。 図 9 Aおよび図 9 Bにおける蛍光の強度を相対的に示した図を図 9 Cに示す。 y軸は相対輝度 により示す。 E G F.Pによる効果は、ほぼ完全に抑えられていることが分かる。 図 10は、 NGFにより PC 12細胞がアレイ上においても分化誘導するこ とを示す。 図 10 Aは、 フイブロネクチン、 コラーゲン I型、 コラーゲン I V 型、 およびラミニンをコーティングしたアレイ上での固相トランスフエクショ ンを示す。 図 10Aは、 ガラススライドのスキャン画像を示す。 FIG. 9 shows the effect of siRNA when solid-phase transfection (PC 12) was performed on collagen IV coating. Figure 9A shows the EGFP vector And PC 12 cells co-transfected with anti-EGFP siRNA. As shown, it was found that only He Red developed color and that the green signal derived from pEGFP-N1 was suppressed. On the other hand, FIG. 9B shows an example using scrambled siRNA. As shown, green fluorescence was observed, confirming that the effect in FIG. 9A was the effect of RNAi. FIG. 9C is a diagram showing the relative fluorescence intensities in FIGS. 9A and 9B. The y-axis is shown by relative luminance. It can be seen that the effect of EG FP is almost completely suppressed. FIG. 10 shows that NGF induces differentiation of PC 12 cells even on an array. FIG. 10A shows solid-phase transfection on an array coated with fibronectin, collagen type I, collagen type IV, and laminin. FIG. 10A shows a scanned image of a glass slide.

図 10 Bは、 トランスフエクシヨンアレイにおける分化の様子をスキャン造 影したものを示す （左）。 図 10Bの真ん中は、 P C 12細胞のトランスフエク シヨン後 3日目の顕微鏡写真を示す。 図 10 Bの右は、 NGF誘導後 1日後の 写真を示す。 配列表の説明  Figure 10B shows a scan image of the differentiation in the transfusion array (left). The middle part of FIG. 10B shows a micrograph of PC12 cells 3 days after transfection. The right of FIG. 10B shows a photograph one day after NGF induction. Description of Sequence Listing

配列番号 1 ：マウスの FVB/Nコラーゲン p r o—ひ一 1型 I鎖の核酸配列 (GENBANK登録番号： U08020)。 SEQ ID NO: 1: Nucleic acid sequence of mouse FVB / N collagen pro-type 1 type I chain (GENBANK accession number: U08020).

配列番号 2 ：配列番号 1の核酸にコードされるタンパク質の配列。 ' 配列番号 3 ：マウスのプロコラーゲン I型 α 2 (C ο 1 1 a 2) (GENBANSEQ ID NO: 2: Sequence of a protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 1. '' SEQ ID NO: 3: mouse procollagen type I α2 (Cο1a2) (GENBAN

K登録番号： NM—007743) の核酸配列。 K accession number: NM-007743).

配列番号 4 ：配列番号 3の核酸にコードされるタンパク質の配列。 SEQ ID NO: 4: Sequence of the protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 3.

配列番号 5 ：マウスの α 1型一 I Vコラーゲンの核酸配列 （GENBANK登 録番号： M 14042 ) の核酸配列。 SEQ ID NO: 5: Nucleic acid sequence of mouse α1 type IV collagen nucleic acid sequence (GENBANK registration number: M14042).

配列番号 6 ：配列番号 5の核酸にコードされるタンパク質の配列。 配列番号 7：マウスのコラーゲン α— 2 (IV) 鎖 （GENB ΑΝΚ登録番号： X 04647) の核酸配列。 SEQ ID NO: 6: Sequence of a protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 7: Nucleic acid sequence of mouse collagen α -2 (IV) chain (GENB No. accession number: X04647).

配列番号 8 ：配列番号 7の核酸にコードされるタンパク質の配列。 SEQ ID NO: 8: sequence of the protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 7.

配列番号 9 ：マウスのプロコラーゲン I V型 ο; 3 (Co 14 a 3) (GENB A NK登録番号： NM一 007734)。 SEQ ID NO: 9: murine procollagen type IV ο; 3 (Co14a3) (GENB ANK accession number: NM-007734)

配列番号 10 ：配列番号 9の核酸にコードされるタンパク質の配列。 SEQ ID NO: 10: Sequence of a protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 9

配列番号 11 ：マウスのコラーゲン I V型 α 4鎖の核酸配列 （GENBANK 登録番号： Ζ 35167 )。 SEQ ID NO: 11: Nucleic acid sequence of mouse collagen IV type α4 chain (GENBANK accession number: Ζ35167).

配列番号 12 ：配列番号 11の核酸にコードされるタンパク質の配列。 SEQ ID NO: 12: Sequence of a protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 11.

配列番号 13 ：マウスのコラーゲン I V型 α 5鎖の核酸配列 （GENBANK 登録番号： Z 35168)。 SEQ ID NO: 13: Nucleic acid sequence of mouse collagen IV type α5 chain (GENBANK accession number: Z 35168).

配列番号 14 ：配列番号 13の核酸にコードされるタンパク質の配列。 SEQ ID NO: 14: Sequence of a protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 13.

配列番号 15 ：マウスのプロコラーゲン I V型 α 6 (Co 14 a 6) の核酸配 列 （GENBANK登録番号： NM—053185)。 SEQ ID NO: 15: Nucleic acid sequence of mouse procollagen type IV α6 (Co14a6) (GENBANK accession number: NM-053185).

配列番号 16 ：配列番号 15の核酸にコードされるタンパク質の配列。 . 配列番号 17 ：ラミニンの核酸配列 （マウス a鎖） SEQ ID NO: 16: Sequence of a protein encoded by the nucleic acid of SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO: 17: Laminin nucleic acid sequence (mouse a chain)

配列番号 18 ：ラミニンのァミノ酸配列 （マウス α鎖） SEQ ID NO: 18: Amino acid sequence of laminin (mouse α-chain)

配列番号 19 ：ラミニンの核酸配列 （マウス 鎖） SEQ ID NO: 19: Nucleic acid sequence of laminin (mouse chain)

配列番号 20 ：ラミニンのアミノ酸配列 （マウス 鎖） SEQ ID NO: 20: Amino acid sequence of laminin (mouse chain)

配列番号 21 ：ラミニンの核酸配列 （マウス γ鎖） SEQ ID NO: 21: Laminin nucleic acid sequence (mouse γ chain)

配列番号 22 ：ラミニンのアミノ酸配列 （マウス γ鎖） SEQ ID NO: 22: Amino acid sequence of laminin (mouse γ chain)

配列番号 23 ：フィプロネクチンの核酸配列 （ヒト） SEQ ID NO: 23: Nucleic acid sequence of fipronectin (human)

配列番号 24 ：フイブロネクチンのアミノ酸配列 （ヒト） SEQ ID NO: 24: Amino acid sequence of fibronectin (human)

配列番号 25 ：実施例 9で使用した s i RNAの配列。 SEQ ID NO: 25: Sequence of si RNA used in Example 9.

配列番号 26 ：実施例 9で使用したスクランブル R N Aの配列。 発明を実施するための最良の形態 SEQ ID NO: 26: Sequence of scrambled RNA used in Example 9. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

以下、 本発明を説明する。 本明細書の全体にわたり、 単数形の表現は、 特に 言及しない限り、 その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。 ま た、 本明細書において使用される用語は、 特に言及しない限り、 当該分野で通 常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。 したがって、 他 に定義されない限り、 本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術 用語は、 本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意 味を有する。 矛盾する場合、 本明細書 （定義を含めて） が優先する。  Hereinafter, the present invention will be described. It should be understood that throughout this specification, the use of the singular includes the plural concept unless specifically stated otherwise. It should also be understood that the terms used in this specification are used in a meaning commonly used in the art unless otherwise specified. Thus, unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

(一般技術）  (General technology)

本明細書において用いられる分子生物学的手法、 生化学的手法、 微生物学的 手法は、 当該分野において周知であり慣用されるものであり、 例えば、 S am b r o o k J. e t a l . (1 989). Mo l e c u l a r C l o n i n g :A L a b o r a t o r y Ma nu a l , Co l d S p r i n g H a r b o rおよびその 3 r d Ed. (200 l) ;Au s ub e l , F. M. (1 98 7). Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y, G r e e n e Pub. A s s o c i a t e s a n d W i l e y— I n t e r s c i e n c e ; Au s ub e l， F. M. (1989). Sh o r t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o 1 o g y ： A C omp e n d i um o f Me t h o d s f r om C u r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y, Gr e e n e Pu b. As s o c i a t e s a n d " i 1 e y— I n t e r s c i e n c e ; I nn i s， M. A. (1990). PCR P r o t o c o l s ： A Gu i d e t o Me t h o d s a n d Ap p l i c a t i o n s, Ac a d em i c P r e s s ; Au s u b e l , F. M. 9 92). Sh o r t P r o t o c o l s i n Mo l e c l a r B i o 1 o g v ： A Comp e n d i um o f Me t h o d s f r om C u r r e n t P r o t o c o l s i n Mo 1 e c u 1 a r B i o 1 o g y , G r e e n e Pu . As s o c i a t e s ; Au s b e 1 ， F.The molecular biological, biochemical, and microbiological techniques used herein are well known and commonly used in the art, for example, Sambrook J. et al. (1 989). Mo lecular C loning: AL aboratory Manu al, Cold Spring Harbor and its 3rd Ed. (200 l); Ausubel, FM (1 98 7). reene Pub. A ssociatesand W iley—Interscience; Ausubel, FM (1989). eene Pu b. As sociates and "i 1 ey— Interscience; Innis, MA (1990). Sh ort P rotocolsin Moleclar B io 1 ogv: A Compendi um of Me thodsfr om C urrent P rotocolsin Mo 1 ecu 1 ar Bio 1 ogy, Greene Pu. As sociates; Au sbe 1, F.

M. (1 995). Sh o r t P r o t o c o l s i n Mo 1 e c u 1 a r B i o l o g y : A Comp e n d i um o f Me t h o d s f r om Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u 1 a rM. (1 995) .Sh o r t P r o t o c o l s in Mo 1 e c u 1 a r B i o l o g y: A Comp e n d i u m o f Me t h o d s f r om Cu r r e n t P r o t o c o l s in Mo l e c u 1 a r

B i o l o g y, Gr e e n e Pub. As s o c i a t e s ; ! n n i s ,B i o l o g y, Gle en Pub. As soc i a t e s;! N n i s,

M. A. e t a 1. (1 995). PCR S t r a t e g i e s A c a d em i c P r e s s ； Au s ub e 1, F. M. (1 999). S h o r t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y : A C o m p e n d i um o f Me t h o d s f r om Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y, Wi 1 e y , n d a nnu a 1 up d a t e s ； Sn i n s k y, J. J. e t a 1.MA eta 1. (1 995) .PCR Strategies AcademiaPress; Ausube 1, FM (1999) .Short Protocolsin Mo lecular Biology: AC ompendi um of Methodsfr omCu rrent P rotocolsin Molecular Biology, Wi 1 ey, nda nnu a 1 up dates; Sn insky, JJ eta 1.

(1999). PCR Ap p l i c a t i o n s ： P r o t o c o 1 s f o r Fun c t i o n a l Ge n om i c s, Ac a d em i c P r e s s、 別冊実験医学 「外来物質導入 &発現解析実験法」 羊土社、 19 97などに 記載されており、 これらは本明細書において関連する部分 （全部であり得る） が参考として援用される。 (1999). PCR Applications: Protoco1 sfor Func- tional Graphics, Acidic Press, Separate Experimental Medicine, “Exogenous Substance Introduction & Expression Analysis Experiments”, Yodosha, 1997 And the relevant portions (which may be all) are incorporated herein by reference.

人工的に合成した遺伝子を作製するための D N A合成技術およぴ核酸化学に ついては、 例えば、 Ga i t， M. J. (1 985). O l i g o nu c l e o t i d e S yn t h e s i s : A P r a c t i c a l Ap p r o a c h, I RLP r e s s ; Ga i t， M. J . (1 990). O l i g o nu c l e o t i d e Syn t h e s i s ： A P r a c t i c a l Ap p r o a c h, I RL P r e s s ; E c k s t e i n， F. (1 991). O l i g o nu c l e o t i d e s a n d An a l o g u e s ： A P r a c t i c a l A p p r o a c , I R L P r e s s ; Ad ams， R. L. e t a 1. (1 992). Th e B i o c h em i s t r y o f t e Nu c l e i c Ac i d s, Ch a pma n&Ha l 1 ； S h a b a r o v a, Z. e t a 1. (1994). Adv a n c e d Or g a n i c Ch em i s t r y o f Nu c l e i c Ac i d s, We i nh e i m J B l a c k b u r n,For DNA synthesis techniques and nucleic acid chemistry for producing artificially synthesized genes, see, for example, Gait, MJ (1985). (1990). Oligo nu cleotide Synthesis: AP ractical Ap proach, I RL Press; Eckstein, F. (1 991). Oligo nu cleotidesand An alogues: AP ractical Approac. , IRLP ress; Ad ams, RL eta 1. (1 992). Th e B ioch em istryofte Nu cleic Ac ids, Ch a pma n & Ha l 1; S habarova, Z. eta 1. (1994). Advanced Or ganic Chem istryof Nu cleic Ac ids, We inh eim JB lackburn,

G. M. e t a l . (1 996). Nu c l e i c Ac i d s i n C h em i s t r y a n d B i o l o g y, Ox f o r d Un i v e r s i t y P r e s s ； He rma n s o n, G. T. (I 996). B i o c o n j u g a t e T e c hn i qu e s, Ac a d em i c P r e s sなどに 記載されており、 これらは本明細書において関連する部分が参考として援用さ れる。 GM etal. (1 996). Nucleic Ac idsin Chemistry and Biology, Ox ford Un iversity Press; Hermanson, GT (I 996). B ioconjugate T ec hn iqu es, Ac ad em ic P and the like, and the relevant portions are incorporated herein by reference.

(一般生化学）  (General biochemistry)

本明細書において使用される用語 「タンパク質」、 「ポリペプチド」、 「オリゴ ペプチド」 および 「ペプチド」 は、 本明細書において同じ意味で使用され、 任 意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。 このポリマーは、 直鎖であっても分岐 していてもよく、 環状であってもよい。 アミノ酸は、 天然のものであっても非 天然のものであってもよく、 改変されたアミノ酸であってもよい。 この用語は また、 複数のポリぺプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。 この用語はまた、 天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。 そのような改変としては、 例えば、 ジスルフイド結合形成、 グリコシル化、 脂 質化、 ァセチル化、 リン酸化または任意の他の操作もしくは改変 （例えば、 標 識成分との結合体化)。 この定義にはまた、 例えば、 アミノ酸の 1または 2以上 のアナログを含むポリペプチド （例えば、 非天然のアミノ酸などを含む）、 ぺプ チド様化合物 （例えば、 ぺプトイド） および当該分野において公知の他の改変 が包含される。 フイブロネクチンのような細胞外マトリクスタンパク質の遺伝 子産物は、 通常ポリペプチド形態をとる。  As used herein, the terms "protein," "polypeptide," "oligopeptide," and "peptide" are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acids of any length. This polymer may be linear, branched, or cyclic. Amino acids may be natural or non-natural, and may be modified amino acids. The term may also include those assembled into a complex of multiple polypeptide chains. The term also includes naturally or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lysification, acetylation, phosphorylation, or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component). This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of an amino acid (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptide-like compounds (eg, peptoids), and others known in the art. Modifications are included. Gene products of extracellular matrix proteins, such as fibronectin, usually take the form of polypeptides.

本明細書において使用される用語 「ポリヌクレオチド」、 「オリゴヌクレオチ ド」 および 「核酸」 は、 本明細書において同じ意味で使用され、 任意の長さの ヌクレオチドのポリマーをいう。 この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」 ' または 「誘導体ポリヌクレオチド」 を含む。 「誘導体オリゴヌクレオチド」 また は 「誘導体ポリヌクレオチド」 とは、 ヌクレオチドの誘導体を含むか、 または ヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレ ォチドをいい、 互換的に使用される。 そのようなオリゴヌクレオチドとして具 体的には、 例えば、 2， 一O—メチルーリポヌクレオチド、 オリゴヌクレオチ ド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合に変換された誘導体ォ リゴヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N 3' — P 5' ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、 オリ ゴヌクレオチド中のリポースとリン酸ジエステル結合とがぺプチド核酸結合に 変換された誘導体オリゴヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C — 5プロピニルゥラシルで置換された誘導体ォリゴヌクレオチド、 オリゴヌク レオチド中のゥラシルが C _ 5チアゾールゥラシルで置換された誘導体ォリゴ ヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド中のシトシンが C一 5プロピニルシトシン で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド中のシトシンが フエノキサジン修飾シトシン (p h e n o x a z i n e—mo d i f i e d c y t o s i n e) で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、 DNA中のリボ ースが 2， 一 O—プロピルリボースで置換された誘導体ォリゴヌクレオチドぉ ょぴオリゴヌクレオチド中のリボースが 2， ーメ トキシェトキシリポースで置 換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。 他にそうではないと示 されなければ、 特定の核酸配列はまた、 明示的に示された配列と同様に、 その 保存的に改変された改変体 （例えば、 縮重コドン置換体） および相捕配列を包 含することが企図される。 具体的には、 縮重コドン置換体は、 1またはそれ以 上の選択された （または、 すべての） コドンの 3番目の位置が混合塩基おょぴ /またはデォキシィノシン残基で置換された配列を作成することにより達成さ れ得る （B a t z e rら、 Nu c l e i c Ac i d Re s. 1 9 : 508 1 (1 991) ; Oh t s uk aら、 J. B i o l . C h e m. 260 : 260 5-2608 (1985) ; Ro s s o l i n iら、 Mo l . Ce l l. P r o b e s 8 : 91— 98 (1 994))。 フイブロネクチンのような細胞外マト リクスタンパク質などの遺伝子は、 通常、 このポリヌクレオチド形態をとる。 また、 トランスフエクシヨンの対象となる分子もこのポリヌクレオチドである。 用語 「核酸分子」 もまた、 本明細書において、 核酸、 オリゴヌクレオチド、 およびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、 cDNA、 mRNA、 ゲノム DNAなどを含む。 本明細書では、 核酸および核酸分子は、 用語 「遺伝子」 の 概念に含まれ得る。 ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、 「スプライス 変異体 （改変体)」 を包含する。 同様に、 核酸によりコードされた特定のタンパ ク質は、 その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を 包含する。 その名が示唆するように 「スプライス変異体」 は、 遺伝子のオルタ ナティブスプライシングの産物である。 転写後、 最初の核酸転写物は、 異なる (別の） 核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプラ イスされ得る。 スプライス変異体の産生機構は変化するが、 ェキソンのオルタ ナティブスプライシングを含む。 読み過し転写により同じ核酸に由来する別の ポリペプチドもまた、 この定義に包含される。 スプライシング反応の任意の産 物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。 したがって、 本明細書では、 たとえば、 コラーゲン、 フイブロネクチン、 ラミニンなどの有 用な細胞外マトリクスタンパク質には、 そのスプライス変異体もまた包含され 得る。 As used herein, the terms "polynucleotide", "oligonucleotide" and "nucleic acid" are used interchangeably herein and refer to any length Refers to a polymer of nucleotides. The term also includes "derivative oligonucleotide"'or"derivativepolynucleotide". “Derivative oligonucleotide” or “derivative polynucleotide” refers to an oligonucleotide or a nucleotide that contains a derivative of a nucleotide or has an unusual linkage between nucleotides, and is used interchangeably. Specific examples of such oligonucleotides include, for example, 2,1-O-methyl-liponucleotide, a derivative oligonucleotide in which a phosphodiester bond in an oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and an oligonucleotide. Derivative oligonucleotide in which the phosphodiester bond in the product has been converted to an N 3 '-P 5' phosphoramidate bond, and derivative oligonucleotide in which the report and the phosphodiester bond in the oligonucleotide have been converted to a peptide nucleic acid bond Derivative oligonucleotide in which peracyl in nucleotides and oligonucleotides is substituted with C-5propynylperacyl, derivative oligonucleotide in which peracyl in oligonucleotide is substituted with C_5thiazole peracyl, cytosine in oligonucleotide is C One 5-propynylcytosine Derivative oligonucleotide in which the cytosine in the oligonucleotide is substituted with phenoxazine-modified cytosine, Derivative oligonucleotide in which the ribose in the DNA is substituted with 2,1-O-propylribose Oligonucleotides and derivative oligonucleotides in which ribose in the oligonucleotide is replaced with 2, -methoxetoxylipose are exemplified. Unless otherwise indicated, a particular nucleic acid sequence may also include conservatively modified variants (eg, degenerate codon substitutions) and comprehensible fragments, as well as explicitly stated sequences. It is contemplated to include the sequence. Specifically, degenerate codon substitutions are those in which the third position of one or more selected (or all) codons is replaced with a mixed base and / or deoxyinosine residue. (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 508 1 (1 991); Oh ts uka et al., J. Biol. Chem. 260: 260 5-2608 (1985); Rossolini et al., MoI. Cell. Probes 8: 91—98 ( 1 994)). Genes such as extracellular matrix proteins such as fibronectin usually take this polynucleotide form. The molecule to be subjected to transfection is also this polynucleotide. The term “nucleic acid molecule” is also used interchangeably herein with nucleic acids, oligonucleotides, and polynucleotides, and includes cDNA, mRNA, genomic DNA, and the like. As used herein, nucleic acids and nucleic acid molecules may be included in the term "gene". Nucleic acid molecules encoding a gene sequence also include "splice variants." Similarly, a particular protein encoded by a nucleic acid includes any protein encoded by a splice variant of the nucleic acid. As the name suggests, "splice variants" are the products of alternative splicing of a gene. After transcription, the initial nucleic acid transcript can be spliced such that different (alternate) nucleic acid splice products encode different polypeptides. The mechanism of production of splice variants varies, but involves alternative splicing of exons. Another polypeptide derived from the same nucleic acid by read-through transcription is also included in this definition. Any product of a splicing reaction, including recombinant forms of the splice product, is included in this definition. Thus, herein, useful extracellular matrix proteins, such as, for example, collagen, fibronectin, laminin, may also include splice variants thereof.

本明細書において、 「遺伝子」 とは、 遺伝形質を規定する因子をいう。 通常染 色体上に一定の順序に配列している。 タンパク質の一次構造を規定するものを 構造遺伝子といい、 その発現を左右するものを調節遺伝子 （たとえば、 プロモ 一ター) という。 本明細書では、 遺伝子は、 特に言及しない限り、 構造遺伝子 および調節遺伝子を包含する。 また、 最近のゲノム配列解読により、 構造遺伝 子でも調節遺伝子でもない部分が注目されており生命において役割を果たして いることが示唆されている。 したがって、 遺伝子とは、 生命体に存在する核酸 およびその核酸によって規定される遺伝形質を決定する因子を包含することが 理解される。 したがって、 コラーゲン遺伝子というときは、 通常、 コラーゲン の構造遺伝子およびコラーゲンのプロモーターの両方を包含する。 本明細書で は、 「遺伝子」 は、 「ポリヌクレオチド」、 「オリゴヌクレオチド」 および 「核酸」 ならびに/または「タンパク質」 「ポリペプチド 「オリゴペプチド」および「ぺ プチド」 を指すことがある。 本明細書においてはまた、 「遺伝子産物」 は、 遺伝 子によって発現された「ポリヌクレオチド」、 「オリゴヌクレオチド」および「核 酸」 ならびに/または 「タンパク質」 「ポリペプチド」、 「オリゴペプチド」 およ ぴ 「ペプチド」 を包含する。 当業者であれば、 遺伝子産物が何たるかはその状 況に応じて理解することができる。 As used herein, “gene” refers to a factor that defines a genetic trait. Usually arranged in a certain order on the chromosome. Those that define the primary structure of a protein are called structural genes, and those that control its expression are called regulatory genes (for example, promoters). As used herein, a gene includes a structural gene and a regulatory gene unless otherwise specified. In addition, recent genetic sequencing has revealed that Attention has been focused on parts that are neither offspring nor regulatory genes, suggesting that they play a role in life. Thus, a gene is understood to include nucleic acids present in an organism and factors that determine the genetic traits defined by the nucleic acids. Therefore, a collagen gene usually includes both a collagen structural gene and a collagen promoter. As used herein, "gene" may refer to "polynucleotide", "oligonucleotide" and "nucleic acid" and / or "protein""polypeptide" oligopeptide "and" peptide ". As used herein, “gene product” also refers to “polynucleotide”, “oligonucleotide” and “nucleic acid” expressed by a gene and / or “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” andを Includes “peptide”. Those skilled in the art can understand what a gene product is, depending on the situation.

本明細書において配列 （例えば、 核酸配列、 アミノ酸配列など） の 「相同性」 とは、 2以上の遺伝子配列の、 互いに対する同一性の程度をいう。 従って、 あ る 2つの遺伝子の相同性が高いほど、 それらの配列の同一性または類似性は高 い。 2種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、 配列の直接の比較、 または核 酸の場合ストリンジヱントな条件下でのハイプリダイゼーション法によって調 ベられ得る。 2つの遺伝子配列を直接比較する場合、 その遺伝子配列間で D N A配列が、 代表的には少なくとも 5 0 %同一である場合、 好ましくは少なくと も 7 0 %同一である場合、 より好ましくは少なくとも 8 0 %、 9 0 %、 9 5 %、 9 6 %、 9 7 °/0、 9 8 %または 9 9 %同一である場合、 それらの遺伝子は相同 性を有する。 本明細書において、 配列 （例えば、 核酸配列、 アミノ酸配列など） の 「類似性」 とは、 上記相同性において、 保存的置換をポジティブ （同一） と みなした場合の、 2以上の遺伝子配列の、 互いに対する同一性の程度をいう。 従って、 保存的置換がある場合は、 その保存的置換の存在に応じて同一性と類 似性とは異なる。 また、 保存的置換がない場合は、 同一性と類似性とは同じ数 値を示す。 As used herein, “homology” of a sequence (eg, nucleic acid sequence, amino acid sequence, etc.) refers to the degree of identity between two or more gene sequences. Thus, the higher the homology between two genes, the higher the identity or similarity between their sequences. Whether the two genes have homology can be determined by direct sequence comparison or, in the case of nucleic acids, by a hybridization method under stringent conditions. When two gene sequences are compared directly, the DNA sequences between the gene sequences are typically at least 50% identical, preferably at least 70% identical, more preferably at least 8% identical. When 0%, 90%, 95%, 96%, 97 ° / 0 , 98% or 99% are identical, the genes have homology. As used herein, the term “similarity” of a sequence (eg, a nucleic acid sequence, an amino acid sequence, etc.) refers to the homology of two or more gene sequences when conservative substitutions are regarded as positive (identical) in the above homology. Refers to the degree of identity to each other. Thus, if there are conservative substitutions, identity and similarity will vary depending on the presence of the conservative substitution. If there are no conservative substitutions, identity and similarity are the same Indicates a value.

本明細書では、 アミノ酸配列おょぴ塩基配列の類似性、 同一性および相同性 の比較は、 配列分析用ツールである F A S T Aにおいてデフオルトパラメータ を用いて算出される。  In the present specification, the comparison of the similarity, identity and homology of the amino acid sequence and the base sequence is calculated using a default parameter in FASTA, a sequence analysis tool.

本明細書において、 「アミノ酸」 は、 本発明の目的を満たす限り、 天然のもの でも非天然のものでもよい。 「アミノ酸誘導体」 または 「アミノ酸アナログ」 と は、 天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有す るものをいう。 そのようなアミノ酸誘導体おょぴアミノ酸アナログは、 当該分 野において周知である。  As used herein, "amino acid" may be natural or non-natural as long as it satisfies the purpose of the present invention. "Amino acid derivative" or "amino acid analog" refers to one which is different from a naturally occurring amino acid but has the same function as the original amino acid. Such amino acid derivatives and amino acid analogs are well known in the field.

本明細書において 「天然のアミノ酸」 とは、 天然のアミノ酸の L一異性体を 意味する。 天然のアミノ酸は、 グリシン、 ァラニン、 パリン、 ロイシン、 イソ ロイシン、 セリン、 メチォニン、 トレオニン、 フエニノレアラニン、 チロシン、 トリプトファン、 システィン、 プロリン、 ヒスチジン、 ァスパラギン酸、 ァス パラギン、 グルタミン酸、 グルタミン、 γ—カルボキシグルタミン酸、 アルギ ニン、 オル-チン、 およびリジンである。 特に示されない限り、 本明細書でい う全てのアミノ酸は L体であるが、 D体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明 の範囲内にある。  As used herein, “natural amino acid” means the L-isomer of a natural amino acid. Natural amino acids include glycine, alanine, palin, leucine, isoleucine, serine, methionine, threonine, pheninolealanine, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine Glutamic acid, arginine, ortin, and lysine. Unless otherwise indicated, all amino acids in the present specification are L-forms, but forms using D-form amino acids are also within the scope of the present invention.

本明細書において 「非天然アミノ酸」 とは、 タンパク質中で通常は天然に見 出されないアミノ酸を意味する。 非天然アミノ酸の例として、 ノルロイシン、 パラ一ニトロフエ二 ァラニン、 ホモフエ二/レアラニン、 パラーフノレオロフェ ニノレアラニン、 3—アミノー 2—ベンジルプロピオン酸、 ホモアルギニンの D 体または L体おょぴ D—フエ二ルァラニンが挙げられる。  As used herein, "unnatural amino acid" refers to an amino acid that is not normally found in nature in proteins. Examples of unnatural amino acids include D-form and L-form of norleucine, para-nitrophenylalanine, homopheny / lealanine, parafunoleolopheninoleanine, 3-amino-2-benzylpropionic acid, and homoarginine. Dilulanine.

本明細書において 「アミノ酸アナログ」 とは、 アミノ酸ではないが、 ァミノ 酸の物性および/または機能に類似する分子をいう。 アミノ酸アナログとして は、 例えば、 ェチォニン、 カナバニン、 2—メチルグルタミンなどが挙げられ る。 アミノ酸模倣物とは、 アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有す るが、 天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。 As used herein, the term “amino acid analog” refers to a molecule that is not an amino acid but has similar properties and / or functions to an amino acid. Amino acid analogs include, for example, etyonin, canavanine, 2-methylglutamine, and the like. Amino acid mimetics have a structure that differs from the general chemical structure of amino acids But a compound that functions in a manner similar to a naturally occurring amino acid.

本明細書において 「ヌクレオチド」 は、 天然のものでも非天然のものでもよ く、 目的とする機能を発揮することができる限りヌクレオチド誘導体またはヌ クレオチド改変体をも包含する。 「ヌクレオチド誘導体」 または 「ヌクレオチド アナログ」 とは、 天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチ ドと同様の機 を有するものをいう。 そのようなヌクレオチド誘導体およびヌ クレオチドアナログは、 当該分野において周知である。 そのようなヌクレオチ ド誘導体おょぴヌクレオチドアナログの例としては、 ホスホロチォエート、 ホ スホルアミデート、 メチルホスホネート、 キラノレメチルホスホネート、 2— O ーメチルリポヌクレオチド、 ペプチド一核酸 （PNA) が含まれるが、 これら に限定されない。  As used herein, the term “nucleotide” may be a natural or non-natural one, and includes a nucleotide derivative or a modified nucleotide as long as it can exhibit a desired function. “Nucleotide derivative” or “nucleotide analog” refers to one that is different from a naturally occurring nucleotide but has the same machinery as the original nucleotide. Such nucleotide derivatives and nucleotide analogs are well-known in the art. Examples of such nucleotide derivatives or nucleotide analogs include phosphorothioate, phosphoramidate, methylphosphonate, chilanolemethylphosphonate, 2-O-methyl liponucleotide, and peptide-nucleic acid (PNA). However, it is not limited to these.

アミノ酸は、その一般に公知の 3文字記号か、または IUPAC— IUB B i o c h em i c a l Nome n c l a t u r e C o mm ι s s ι o nこ より推奨される 1文字記号のいずれかにより、 本明細書中で言及され得る。 ヌ クレオチドも同様に、 一般に認知された 1文字コードにより言及され得る。 その文字コードは以下のとおりである。  Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Comm ι ss ι on. . Nucleotides may also be referred to by the generally recognized one-letter code. The character codes are as follows.

アミノ酸 Amino acids

3文字記号 1文字記号 意味  3-letter symbol 1-letter symbol Meaning

A 1 a A ァラニン  A 1 a A Aranin

C y s C システィン  Cys C Sistine

As D ァスパラギン酸  As D Aspartic acid

G 1 u E グノレタミン酸  G 1 u E Gunoletamic acid

Ph e F フエ二ルァラニン  Ph e F

G 1 y G グリシン  G 1 y G Glycine

H i s H ヒスチジン  H is H Histidine

I 1 e I イソロイシン L y s K リジン I 1 e I Isoleucine L ys K lysine

Le u L πイシン  Le u L π isin

Me t M メチォニン  Me t M Methionin

A s n N ァスノ ラギン  A s n N Asuno Lagin

P r o P プロリン  ProP proline

G 1 n Q グノレタミン  G 1 n Q Gunoletamine

A r g R アルギニン  A r g R Arginine

S e r S セリン  S e r S Serine

Th r T トレ才ニン  Th r T Torayinin

Va 1 V バリン  Va 1 V Valine

T r p W トリブトファン  T r p W Tribute fan

T y r Y チロシン  T y r Y tyrosine

A s x ァスパラギンまたはァスパラギン酸 A s x asparagine or aspartic acid

G 1 x グルタミンまたはグルタミン酸G 1 x glutamine or glutamic acid

X a a 不明または他のアミノ酸。 X a a Unknown or other amino acid.

塩基  Base

記号 意味 Symbol Meaning

a アデ.ニン  a Adeinin

g グァ.ニン  g Guan Nin

c シトシン  c cytosine

t チミン  t thymine

u ゥラシル  u Perilla

r グァ,ニンまたはアデニンプリン  r Gua, nin or adenine pudding

y チミン /ゥラシルま ：たはシトシンピリミジン  y Thymine / peracil: or cytosine pyrimidine

m アデ.ニンまたはシトシンアミノ基 m adenine or cytosine amino group

k グァ,ニンまたはチミ .ンノウラシルケト基 s グァユンまたはシトシン k Gua, Nin or Thyme. s guayun or cytosine

W アデユンまたはチミン/ゥラシノレ W Adeyun or thymine / ゥ lasinore

b グァニンまたはシドシンまたはチミン zゥラシル b Guanine or Sidosine or Thymine z ゥ racil

d アデニンまたはグァニンまたはチミン zゥラシル d Adenine or guanine or thymine z ゥ racil

h アデニンまたはシトシンまたはチミン/ゥラシル h Adenine or cytosine or thymine / peracil

V アデニンまたはグァニンまたはシトシン V adenine or guanine or cytosine

n アデニンまたはグァニンまたはシトシンまたはチミン Zゥラシル、 不明、 または他の塩基。 n Adenine or guanine or cytosine or thymine Z ゥ racil, unknown, or other base.

本明細書において、 「対応する」 アミノ酸または核酸とは、 あるポリペプチド 分子またはポリヌクレオチド分子において、 比較の基準となるポリペプチド分 子またはポリヌクレオチドにおける所定のァミノ酸または核酸と同様の作用を 有するか、 または有することが予測されるアミノ酸または核酸をいい、 特に酵 素分子にあっては、 活性部位 （例えば、 コラーゲンの接着部位など） 中の同様 の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸またはそれをコードする 核酸をいう。 例えば、 アンチセンス分子であれば、 そのアンチセンス分子の特 定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。 このような対 応するアミノ酸または核酸は、 当該分野において公知のァラインメント技術を 用いて同定することができる。 そのようなアラインメント技術としては、 例え ば、 Ne e d l ema n, SB a n d Wu n s c h, CD, J. Mo 1. B i o l . 48， 443-453, 1970に記載される技術が挙げられ るがそれに限定されない。  As used herein, the term “corresponding” amino acid or nucleic acid has the same action as a given amino acid or nucleic acid in a polypeptide molecule or polynucleotide as a reference in a certain polypeptide molecule or polynucleotide molecule. Or an amino acid or nucleic acid predicted to have, especially in an enzyme molecule, which is located at a similar position in an active site (eg, a collagen adhesion site) and has a similar contribution to catalytic activity. Amino acids or nucleic acids that encode them. For example, if it is an antisense molecule, it may be a similar part in the ortholog corresponding to a particular part of the antisense molecule. Such corresponding amino acids or nucleic acids can be identified using alignment techniques known in the art. Such alignment techniques include, but are not limited to, the techniques described in Needleman, SB and Wunsch, CD, J. Mo 1. Biol. 48, 443-453, 1970, for example. Not done.

本明細書において 「対応する」 遺伝子 （例えば、 ポリヌクレオチドまたはポ リペプチド） とは、 ある種において、 比較の基準となる種における所定の遺伝 子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド） と同様の作用を有する力、 または有することが予測される遺伝子をいい、 そのような作用を有する遺伝子 が複数存在する場合、 進化学的に同じ起源を有するものをいう。 従って、 ある 遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。 したがって、 マウスコラーゲン遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（ヒト、 ラット、 ブタ、 ゥシなど） においても見出すことができる。 そのような対応する遺伝子は、 当 該分野において周知の技術を用いて同定することができる。 したがって、 例え ば、 ある動物における対応する遺伝子は、 対応する遺伝子の基準となる遺伝子 (例えば、 マウスコラーゲンなど） の配列 （例えば、 配列番号 1〜2 4 ) をク エリ配列として用いてその動物 （例えばヒト、 ラット） の配列データベースを 検索することによって見出すことができる。 As used herein, a “corresponding” gene (eg, a polynucleotide or polypeptide) refers to a species that has the same effect as a given gene (eg, a polynucleotide or polypeptide) in a reference species for comparison. A gene that is expected to have, or has, a plurality of genes that have such an effect, and has the same evolutionary origin. Therefore, there is The corresponding gene for a gene can be an ortholog of that gene. Therefore, genes corresponding to the mouse collagen gene can be found in other animals (humans, rats, pigs, mice, etc.). Such corresponding genes can be identified using techniques well known in the art. Therefore, for example, the corresponding gene in an animal can be obtained by using the sequence of the gene (eg, mouse collagen or the like) that serves as a reference for the corresponding gene (eg, SEQ ID NOs: 1 to 24) as a query sequence. For example, it can be found by searching the sequence database of human, rat).

本明細書において 「フラグメント」 とは、 全長のポリペプチドまたはポリヌ クレオチド （長さが n ) に対して、 l〜n—lまでの配列長さを有するポリべ プチドまたはポリヌクレオチドをいう。 フラグメントの長さは、 その目的に応 じて、 適宜変更することができ、 例えば、 その長さの下限としては、 ポリぺプ チドの場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 1 5， 2 0、 2 5、 3 0、 4 0、 5 0およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、 ここの具体的に列挙してい ない整数で表される長さ （例えば、 1 1など） もまた、 下限として適切であり 得る。 また、 ポリヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 1 5， 2 0、 2 5、 3 0、 4 0、 5 0、 7 5、 1 0 0およびそれ以上のヌクレオチドが 挙げられ、 ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ （例えば、 1 1 など） もまた、 下限として適切であり得る。 本明細書において、 ポリペプチド およびポリヌクレオチドの長さは、 上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸 の個数で表すことができるが、 上述の個数は絶対的なものではなく、 同じ機能 を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（ま たは例えば上下 1 0 %) のものも含むことが意図される。 そのような意図を表 現するために、本明細書では、個数の前に「約」 を付けて表現することがある。 し力 し、 本明細書では、 「約」 のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないこ とが理解されるべきである。 本発明では、 フラグメントは、 ある一定の大きさ (例えば、 5 kD a) 以上の大きさを有することが好ましい。 理論に束縛され ないが、 細胞接着分子として機能するためにはある程度の大きさが必要である ようであるからである。 As used herein, the term “fragment” refers to a polypeptide or polynucleotide having a sequence length of 1 to n−1 with respect to a full-length polypeptide or polynucleotide (length is n). The length of the fragment can be appropriately changed according to its purpose. For example, the lower limit of the length is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 for polypeptides. , 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 and more amino acids and lengths represented by integers not specifically listed herein (eg, 1 1) may also be appropriate as a lower limit. In the case of a polynucleotide, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 25, 30, 40, 50, 75, 100, and more nucleotides may be used. Lengths represented by integers not specifically listed here (eg, 11 and the like) may also be suitable as lower limits. In the present specification, the lengths of the polypeptide and the polynucleotide can be represented by the number of amino acids or nucleic acids, respectively, as described above. Alternatively, the above-mentioned number as an addition or subtraction is intended to include a few above and below the number (or, for example, 10% above and below). In order to express such an intention, in this specification, “about” may be used before the number. It should be understood, however, that the presence or absence of “about” does not affect the interpretation of that number. In the present invention, the fragment has a certain size. (Eg, 5 kDa) or more. Without being bound by theory, it seems that some size is required to function as a cell adhesion molecule.

本明細書において使用される用語 「領域」 によって、 生体分子の一次構造の 物理的に連続した部分を意味する。 タンパク質の場合、 領域は、 そのタンパク 質のアミノ酸配列の連続した部分によって定義される。 用語 「ドメイン」 は、 本明細書中で、 生体分子の既知の機能または推測されている機能に寄与する、 その生体分子の構造部分をいうものとして定義される。 ドメインは、 領域また はその部分と同じ広がりを有し得； ドメインはまた、 その領域の全てまたは一 部に加えて、 特定の領域と区別される生体分子の一部を組み込み得る。 本発明 の細胞接着分子のドメインの例としては、 シグナルペプチド、 細胞外 （すなわ ち、 N末端） ドメイン、 ロイシンリッチ反復ドメイン、 RGD部分、 他の保存 領域が挙げられるが、 これらに限定されない。  By the term "region" as used herein is meant a physically continuous portion of the primary structure of a biomolecule. In the case of a protein, a region is defined by a contiguous portion of the amino acid sequence of the protein. The term "domain" is defined herein to refer to a structural portion of a biomolecule that contributes to a known or suspected function of the biomolecule. A domain can be coextensive with a region or a portion thereof; a domain can also incorporate, in addition to all or a portion of the region, a portion of a biomolecule that is distinct from a particular region. Examples of domains of the cell adhesion molecule of the present invention include, but are not limited to, a signal peptide, an extracellular (ie, N-terminal) domain, a leucine-rich repeat domain, an RGD portion, and other conserved regions.

本明細書において、 「ストリンジェントな条件でハイブリダィズするポリヌク レオチド」 とは、 当該分野で慣用される周知の条件をいう。 本発明において使 用されるポリヌクレオチド （例えば、 コラーゲン Iをコードするもの） の中か ら選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、 コロニー ·ハイブリダィゼ ーション法、 プラーク ·ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロットハ ィプリダイゼーション法等を用いることにより、 そのようなポリヌクレオチド を得ることができる。 具体的には、 コロニーあるいはプラーク由来の DNAを 固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. OMのNa C l存在下、 65°C でハイプリダイゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の33 (s a l i n e - s o d i urn c i t r a t e)溶液（ 1倍濃度の S S C溶液の組成は、 15 OmM 塩化ナトリウム、 15 mM クェン酸ナトリウムである）を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチド を意味する。 ハイブリダィゼーションは、 Mo l e c u l a r C l o n i n g 2 d e d., Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u 1 a r B i o l o g y, S u p l eme n t 1〜38、 DNA C 1 o n i n g l : C o r e T e c h n i q u e s , A P r a c t i c a l Ap p r o a c h, S e c o n d E d i t i o n, Ox f o r d U n i v e r s i t y P r e s s (1 9 95) 等の実験書に記載されている方法に準 じて行うことができる。 ここで、 ストリンジェントな条件下でハイブリダィズ する配列からは、 好ましくは、 A配列のみまたは T配列のみを含む配列が除外 される。 「ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチド」 とは、 上記ハイブリダィズ 条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダィズすることができるポリヌクレ ォチドをいう。 ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、 本 発明で具体的に示されるァミノ酸配列を有するポリぺプチドをコ一ドする D N Aの塩基配列と少なくとも 60 %以上の相同性を有するポリヌクレオチド、 好 ましくは 8 0 %以上の相同性を有するポリヌクレオチド、 さらに好ましくは 9 5 %以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。 As used herein, the term "polynucleotide that hybridizes under stringent conditions" refers to well-known conditions commonly used in the art. A colony hybridization method, a plaque hybridization method, or a Southern blot method is used as a probe with a polynucleotide selected from the polynucleotides used in the present invention (for example, those encoding collagen I). Such a polynucleotide can be obtained by using the hybridization method or the like. Specifically, after performing hybridization at 65 ° C in the presence of 0.7 to 1.OM NaCl using a filter on which DNA derived from colonies or plaques has been immobilized, 0.1 Wash the filter at 65 ° C using ~ 2x concentration of 33 (saline-sodi urn citrate) solution (1x concentration of SSC solution is 15OmM sodium chloride and 15mM sodium citrate) Means a polynucleotide that can be identified by performing Hybridization is Mo lecular C lonin g 2 de d., Cu rrent P rotocolsin Mo lecu 1 ar Biology, S upl ement 1-38, DNA C 1 oningl: Core T echniques, AP ractical Ap proach, S econd Edition, Ox ford U niversity P The method can be performed according to a method described in an experiment book such as ress (1995). Here, sequences containing only the A sequence or only the T sequence are preferably excluded from the sequences that hybridize under stringent conditions. "Hybridizable polynucleotide" refers to a polynucleotide that can hybridize to another polynucleotide under the above hybridization conditions. Specific examples of the polynucleotide capable of hybridizing include a polynucleotide having at least 60% or more homology with the nucleotide sequence of the DNA encoding the polypeptide having the amino acid sequence specifically shown in the present invention. Preferred are polynucleotides having a homology of 80% or more, more preferably polynucleotides having a homology of 95% or more.

本明細書において 「高度にストリンジェントな条件」 は、 核酸配列において 高度の相補性を有する DN A鎖のハイブリダィゼーションを可能にし、 そして ミスマッチを有意に有する DNAのハイブリダィゼーシヨンを除外するように 設計された条件をいう。 ハイプリダイゼーシヨンのストリンジエンシーは、 主 に、 温度、 イオン強度、 およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決 定される。 このようなハイプリダイゼーシヨンおよび洗浄に関する 「高度にス トリンジェントな条件」 の例は、 0. 00 1 5M 塩化ナトリウム、 0. 00 1 5M クェン酸ナトリウム、 6 5〜6 8°C、 または 0. 0 1 5M 塩化ナト リウム、 0. 00 1 5M クェン酸ナトリウム、および 50% ホルムアミド、 42°Cである。 このような高度にストリンジェントな条件については、 S am b r o o k e t a l ., Mo l e c u l a r C l o n i n g : A L a b o r a t o r y Ma n u a l、 第 2版、 C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y (Co l d S p r i n g Ha r b o r, N, Y. 1 989)；および An d e r s o n e t a 1. , Nu c l e i c A c i d Hy b r i d i z a t i o n ^ a P r a c t i c a l a p p r o a c h I V、 I R L P r e s s L i m i t e d (O f o r d, En g l a n d). L i m i t e d, Ox f o r d, E n g 1 a n dを参照のこと。 必 要により、 よりストリンジェントな条件 （例えば、 より高い温度、 より低いィ オン強度、 より高いホルムアミド、 または他の変性剤） を、 使用してもよい。 他の薬剤が、 非特異的なハイプリダイゼーシヨンおよび/またはバッググラウ ンドのハイプリダイゼーションを減少する目的で、 ハイプリダイゼーション緩 衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。 そのような他の薬剤の例としては、 0. 1 %ゥシ血清アルブミン、 0. 1 %ポリビ二/レビ口リ ドン、 0. 10 /。ピロリン 酸ナトリウム、 0· 1%ドデシル硫酸ナトリウム （NaDo d S04または SD S)、 F i c o l K D e nh a r d t溶液、 超音波処理されたサケ精子 DNA (または別の非相補的 DNA) および硫酸デキス トランであるが、 他の適切な 薬剤もまた、 使用され得る。 これらの添加物の濃度および型は、 ハイブリダィ ゼーシヨン条件のストリンジヱンシ一に実質的に影響を与えることなく変更さ れ得る。 ハイブリダィゼーシヨン実験は、 通常、 ρΗ6. 8〜7· 4で実施さ れるが；代表的なイオン強度条件において、ハイプリダイゼーションの速度は、 ほとんど ρ Η独立である。 An d e r s o n e t a 1. , Nu c l e i c Ac i d Hy b r i d i z a t i o n : a P r a c t i c a l A p p r o a c h、 第 4章、 I R L P r e s s L i m i t e d (Ox f o r d, E n g 1 a n d) を参照のこと。 As used herein, “highly stringent conditions” allow for hybridization of DNA strands having a high degree of complementarity in nucleic acid sequences and exclude hybridization of DNA having significant mismatches. A condition designed to be used. The stringency of the hybridization is determined primarily by the temperature, ionic strength, and conditions of denaturing agents such as formamide. Examples of "highly stringent conditions" for such hybridizations and washes are 0.0015M sodium chloride, 0.0015M sodium citrate, 65-68 ° C, or 0 ° C. 0.15M sodium chloride, 0.0015M sodium citrate, and 50% formamide at 42 ° C. For such highly stringent conditions, see Sam brooketal., Molecular Cloning: AL aboratory Manual, 2nd ed., Old Spring Harb. or L aboratory (Cold Spring Spring, N, Y. 1 989); and Andersoneta 1., Nucleic A cid Hy bridization ^ a Practical approach IV, IRLP ress L imited (O ford, England). L See imited, Ox ford, Eng 1 and. If necessary, more stringent conditions (eg, higher temperatures, lower ionic strength, higher formamide, or other denaturing agents) may be used. Other agents may be included in the hybridization buffer and wash buffer in order to reduce nonspecific hybridization and / or background hybridization. Examples of such other drugs, 0.1% © shea serum albumin, 0.1% polyvinyl two / Levi port Li pyrrolidone, 0.1 0 /. Sodium pyrophosphate, 0 - 1% sodium dodecyl sulfate (NaDo d S0 4 or SD S), F icol KD e nh ardt solution, sonicated salmon sperm DNA (or another non-complementary DNA) and sulfuric acid dextran However, other suitable agents may also be used. The concentration and type of these additives can be varied without substantially affecting the stringency of the hybridization conditions. Hybridization experiments are usually performed at ρΗ6.8-7.4; under typical ionic strength conditions, the rate of hybridization is almost ρΗ independent. See An dersoneta 1., Nuclear Acid Hybridization: a Practical Approach, Chapter 4, IRLP ress Limited (Ox ford, Eng 1 and).

DNA二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、 塩基の組成、 長さおよ び塩基対不一致の程度が挙げられる。 ハイプリダイゼーシヨン条件は、 当業者 によって調整され得、 これらの変数を適用させ、 そして異なる配列関連性の D NAがハイプリッドを形成するのを可能にする。 完全に一致した DNA二重鎖 の融解温度は、 以下め式によって概算され得る。 Factors affecting the stability of a DNA duplex include base composition, length, and degree of base pair mismatch. Hybridization conditions can be adjusted by those skilled in the art, applying these variables, and allowing different sequence related DNAs to form hybrids. Perfectly matched DNA duplex Can be approximated by the following equation:

Tm (°C) =81. 5 + 16. 6 (l o g [Na+]) +0. 41 (%G+C) -600/N- 0. 72 (%ホルムアミド） Tm (° C) = 81.5 + 16.6 (log [Na + ]) + 0.41 (% G + C) -600 / N- 0.72 (% formamide)

ここで、 Nは、 形成される二重鎖の長さであり、 [Na+] は、 ハイプリダイ ゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリゥムイオンのモル濃度であり、 ％G + Cは、 ハイブリッド中の （グァニン +シトシン） 塩基のパーセンテージであ る。 不完全に一致したハイブリッドに関して、 融解温度は、 各 1%不一致 （ミ スマッチ） に対して約 1°Cずつ減少する。  Where N is the length of the duplex formed, [Na +] is the molar concentration of sodium ions in the hybridization or washing solution, and% G + C is the (guanine + Cytosine) Percentage of base. For incompletely matched hybrids, the melting temperature decreases by about 1 ° C for each 1% mismatch.

本明細書において 「中程度にス トリンジェントな条件」 とは、 「高度にストリ ンジヱントな条件」 下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有する DN A二重鎖が、 形成し得る条件をいう。 代表的な 「中程度にス トリンジヱントな 条件」 の例は、 0. 01 5M 塩化ナトリウム、 0. 001 5M クェン酸ナ トリウム、 50〜65°C、 または 0. 015M 塩化ナトリウム、 0. 001 5M タエン酸ナトリゥム、および 20%ホルムアミド、 37〜50°Cである。 例として、 0. 01 5M ナトリウムイオン中、 50°Cの 「中程度にストリン ジェントな」 条件は、 約 21%の不一致を許容する。  As used herein, "moderately stringent conditions" refers to conditions under which a DNA duplex having a higher degree of base pair mismatch than can occur under "highly stringent conditions" can form. Say. Typical "moderately stringent conditions" are: 0.015 M sodium chloride, 0.001 5 M sodium citrate, 50-65 ° C, or 0.015 M sodium chloride, 0.001 5 M Sodium acid, and 20% formamide, 37-50 ° C. As an example, a “moderately stringent” condition of 50 ° C. in 0.015M sodium ion allows about 21% mismatch.

本明細書において 「高度」 にストリンジェントな条件と 「中程度」 にストリ ンジヱントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、 当 業者によって理解される。 例えば、 0. 015M ナトリウムイオン （ホルム アミドなし） において、 完全に一致した長い DNAの融解温度は、 約 71°Cで ある。 65°C (同じイオン強度） での洗浄において、 これは、 約 6%不一致を 許容にする。 より離れた関連する配列を捕獲するために、 当業者は、 単に温度 を低下させ得る力 またはイオン強度を上昇し得る。  It will be understood by those skilled in the art that there may not be a complete distinction between "highly" stringent conditions and "moderate" stringent conditions herein. For example, at 0.015M sodium ion (without formamide), the melting temperature of a perfectly matched long DNA is about 71 ° C. For a wash at 65 ° C (same ionic strength), this allows about a 6% mismatch. To capture more distantly related sequences, those skilled in the art can simply increase the force or ionic strength which can lower the temperature.

約 20 n tまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、 1M Na C lに おける融解温度の適切な概算は、  For oligonucleotide probes up to about 20 nt, a reasonable estimate of the melting temperature in 1 M NaCl is

Tm= (1つの A— T塩基につき 2°C) + (1つの G— C塩基対につき 4°C) によって提供される。 なお、 6 Xクェン酸ナトリウム塩 （S SC) におけるナ トリゥムイオン濃度は、 1Mである （S u g g sら、 D e v e l o pme n t a 1 B i o l o g y U s i n g Pu r i f i e d Ge n e s、 683 頁、 B r ownおよび F o x (編） （1981) を参照のこと）。 Tm = (2 ° C per A—T base) + (4 ° C per G—C base pair) Provided by The sodium ion concentration in 6X sodium citrate (SSC) is 1 M (Suggs et al., Develo pmenta 1 Biology Using Purified Genes, p. 683, Brown and Fox ( (Ed.) (1981)).

本発明において使用されるタンパク質をコードする天然の核酸は、 例えば、 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 15、 1 7、 19、 21、 23な どに示される核酸配列の一部を含む PCRプライマーおよぴハイブリダイゼー シヨンプローブを有する c DNAライブラリーから容易に分離される。 好まし い本発明の核酸は、本質的に 1%ゥシ血清アルブミン（BSA)； 50 OmM リ ン酸ナトリウム （N a P04) ； 1 mM E D T A； 42 °Cの温度で Ί。/。 S D S を含むハイブリダイゼーション緩衝液、 およぴ本質的に 2 X S S C (6 0 OmM N a C 1 ； 60 mM クェン酸ナトリウム）； 50°Cの 0. 1% S DSを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、 さらに 好ましくは本質的に 50 °Cの温度での 1 %ゥシ血清アルブミン （B S A) ； 50 OmM リン酸ナトリウム （N a P04) ； 15%ホルムアミド； ImM ED T A； 7% SD S を含むハイブリダイゼーション緩衝液、 および本質的 に 50°Cの 1 XS SC (30 OmM N a C 1 ； 3 OmM クェン酸ナトリウ ム）； 1% SDSを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジヱント条 件下、 最も好ましくは本質的に 50°Cの温度での 1%ゥシ血清アルブミン （B S A) ； 200 mM リン酸ナトリウム （N a P 04) ； 15 %ホノレムアミド； 1 mM EDTA ; 7 % S D Sを含むハイプリダイゼーション緩衝液、 およぴ本 質的に 65°〇の0. 5 X S S C (15 OmM N a C 1 ； 15 mM クェン酸 ナトリウム）； 0. 1% SDSを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリ ンジヱント条件下に配列番号配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 1 7、 1 9、 21、 23などに示す配列の 1つまたはその一部とハイプリダイ ズし得る。 本明細書において、 「検索」 とは、 電子的にまたは生物学的あるいは他の方法 により、 ある核酸塩基配列を利用して、 特定の機能および Zまたは性質を有す る他の核酸塩基配列を見出すことをいう。 電子的な検索としては、 BLAST (A 1 t s c h u 1 e t a 1., J . Mo 1. B i o l . 215 : 403— 410 (1 990))、 FASTA (P e a r s o n & L i praa n, P r o c . Na t l . Ac a d. S c i ., USA 85 : 2444— 2448 (1 988))、 Sm i t h a n d Wa t e rma n法（Sm i t h a n d W a t e rma n, J. Mc? l . B i o l . 147 ; 195— 197 (1981))、 ぉょぴ Ne e d 1 ema n a n d Wu n s c h法 (Ne e d l e m a n a n d Wu n s c h, J . Mo 1. B i o l . 48 ： 443-453 (1 9 70)) などが挙げられるがそれらに限定されない。 生物学的な検索としては、 ストリンジェントハイブリダィゼーション、 ゲノム DN Aをナイロンメンブレ ン等に貼り付けたマクロァレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ (マイクロアレイアツセィ）、 PCRおよび i n s i t uハイブリダィゼー シヨンなどが挙げられるがそれらに限定されない。 本明細書において、 Fn l には、 このような電子的検索、 生物学的検索によって同定された対応遺伝子も 含まれるべきであることが意図される。 Natural nucleic acids encoding the proteins used in the present invention include, for example, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 13, 15, 17, 19, 21, 23, etc. It is easily separated from a cDNA library having PCR primers and hybridization probes containing a portion of the nucleic acid sequence. Nucleic acids have preferably present invention consists essentially of 1% © Shi serum albumin (BSA); 50 OmM-phosphate sodium (N a P0 4); 1 mM EDTA; 42 Ί at a temperature of ° C. /. Defined by hybridization buffer containing SDS, and essentially 2 XSSC (60 OmM NaC1; 60 mM sodium citrate); wash buffer containing 0.1% SDS at 50 ° C. 7% serum serum albumin (BSA); 50 OmM sodium phosphate (NaP04); 15% formamide; ImM EDTA; Low defined by hybridization buffer containing 1% SDS and essentially 1XSSC at 50 ° C (30 OmM NaC1; 3 OmM sodium citrate); 1% SDS Sutorinjiwento conditions under, and most preferably 1% © Shi serum albumin (BSA) at a temperature of essentially 50 ° C; 200 mM sodium phosphate (N a P 0 4); 15% Honoremuamido; 1 mM EDTA; 7 % Hybridization buffer containing SDS, and essentially 0.5X at 65 ° SSC (15 OmM NaC1; 15 mM sodium citrate); SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, under low stringent conditions defined by a wash buffer containing 0.1% SDS. It can hybridize with one or a part of the sequences shown in 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 and the like. As used herein, the term "search" refers to the use of a nucleobase sequence electronically, biologically, or by another method to search for another nucleobase sequence having a specific function and Z or property. To find. As electronic searches, BLAST (A 1 tschu 1 eta 1., J. Mo 1. Biol. 215: 403—410 (1 990)), FASTA (Pearson & Lipra n, Proc. Na) Sci., USA 85: 2444—2448 (1988)), Sm ithand Wa te rman n method (Sm ithand Wate rman, J. Mc? l. Biol. 147; 195—) 197 (1981)), and the Need 1 ema nand Wunsch method (Ne edlemanand Wunsch, J. Mo 1. Biol. 48: 443-453 (1970)). Not done. Biological searches include stringent hybridization, macroarrays in which genomic DNA is attached to a nylon membrane or the like, microarrays (microarray assays) attached to a glass plate, PCR and in situ hybridization, and the like. But not limited to them. In the present specification, it is intended that Fnl should also include a corresponding gene identified by such electronic search and biological search.

本明細書において物質の細胞への 「導入」 とは、 その物質が、 細胞膜の内部 へ進入することをいう。 内部に導入されたかどうかは、 例えば、 その物質その ものを標識 （例えば、 蛍光標識、 化学発光標識、 燐光、 放射能などを利用する） しその標識を検出することによるか、 あるいは、 その物質に起因する細胞内の 変化 （例えば、 遺伝子発現、 シグナル伝達、 細胞内レセプターへの結合による 事象、 代簡す変化など） を物理学的 （例えば、 目視)、 化学的 （分泌物の測定)、 生化学的、 生物学的に測定することによって判定することができる。 従って、 そのような 「導入」 には、 単なるタンパク質、 核酸などの物質の細胞内への移 入の他、 通常遺伝子操作とも呼ばれる、 トランスフヱクシヨン、 形質転換、 形 質導入などの操作も包含される。 As used herein, “introducing” a substance into a cell means that the substance enters the inside of a cell membrane. Whether it has been introduced into the substance is determined, for example, by labeling the substance itself (for example, using a fluorescent label, chemiluminescent label, phosphorescence, radioactivity, etc.) and detecting the label, or Induced intracellular changes (eg, gene expression, signal transduction, events due to binding to intracellular receptors, simplified changes, etc.) can be performed physically (eg, visually), chemically (measuring secretions), It can be determined by measuring chemically and biologically. Therefore, such “transduction” includes not only the transfer of substances such as proteins and nucleic acids into cells, but also transfection, transformation, Operations such as quality introduction are also included.

本明細書において 「外来物質」 とは、 細胞内への導入が企図される物質をい う。 本発明が企図する外来物質は、 通常の条件下では、 細胞内に導入されない 物質をいう。 従って、 拡散または疎水性相互作用によって通常の条件下で細胞 に導入されることができるような物質は、 本発明の重要な局面では対象外とな る。 通常の条件下で細胞内に導入されない標的物質としては、 例えば、 タンパ ク質 （ポリペプチド）、 R N A、 D NA、 糖 （特に多糖）、 およびそれら同士の 複合分子 （例えば、 糖タンパク質、 P NAなど） またはそれらと別の分子との 複合分子 （例えば、 糖脂質）、 ウィルスベクター、 他の化合物が挙げられるがそ れらに限定されない。  As used herein, “foreign substance” refers to a substance that is intended to be introduced into cells. The foreign substance contemplated by the present invention refers to a substance that is not introduced into a cell under normal conditions. Thus, substances that can be introduced into cells under normal conditions by diffusion or hydrophobic interaction are not considered as important aspects of the invention. Target substances that are not introduced into cells under normal conditions include, for example, proteins (polypeptides), RNA, DNA, sugars (especially polysaccharides), and complex molecules thereof (eg, glycoproteins, PNAs). Or complex molecules thereof with other molecules (eg, glycolipids), viral vectors, and other compounds, but are not limited thereto.

本明細書において 「相互作用」 とは、 2つの物体について言及するとき、 そ の 2つの物体が相互に力を及ぼしあうことをいう。 そのような相互作用として は、例えば、 共有結合、水素結合、 ファンデルワールス力、イオン性相互作用、 非イオン性相互作用、 疎水性相互作用、 静電的相互作用などが挙げられるがそ れらに限定されない。 好ましくは、 相互作用は、 水素結合、 疎水性相互作用な どの生体内で生じる通常の相互作用であり得る。  As used herein, the term “interaction” when referring to two objects means that the two objects exert a force on each other. Such interactions include, for example, covalent bonds, hydrogen bonds, van der Waals forces, ionic interactions, nonionic interactions, hydrophobic interactions, electrostatic interactions, and the like. It is not limited to. Preferably, the interaction may be a normal interaction that occurs in vivo, such as a hydrogen bond, a hydrophobic interaction, or the like.

本明細書において 「接蝕」 とは、 2つの物質 （例えば、 組成物おょぴ細胞） が互いに相互作用するに十分に至近距離に存在することをいう。  As used herein, "eating" refers to the fact that two substances (eg, a composition or a cell) are sufficiently close to interact with each other.

(遺伝子の改変）  (Gene modification)

本発明において使用される細胞接着分子は遺伝子産物の形態をとることが多 いが、 そのような遺伝子産物は、 上述のようにその改変体であってもよいこと が理解される。 従って、 本発明は、 以下のような遺伝子改変の技術で生産され た物質も使用することができる。  Although the cell adhesion molecule used in the present invention often takes the form of a gene product, it is understood that such a gene product may be a variant thereof as described above. Therefore, the present invention can also use a substance produced by the following genetic modification technique.

あるタンパク質分子において、 配列に含まれるあるアミノ酸は、 相互作用結 合能力の明らかな低下または消失なしに、 例えば、 カチオン性領域または基質 分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。 あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、 タンパク質の相互作用能力お よび性質である。 従って、 特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、 ま たはその DN Aコード配列のレベルにおいて行われ得、 置換後もなお、 もとの 性質を維持するタンパク質が生じ得る。 従って、 生物学的有用性の明らかな損 失なしに、 種々の改変が、 本明細書において開示されたペプチドまたはこのべ プチドをコ一ドする対応する DN Aにおいて行われ得る。 In certain protein molecules, certain amino acids in the sequence are replaced by other amino acids in the protein structure, such as in the cationic region or the binding site of a substrate molecule, without appreciable loss or loss of interaction binding capacity. obtain. It is the protein's ability to interact and its properties that define the biological function of a protein. Thus, certain amino acid substitutions can be made in the amino acid sequence, or at the level of the DNA coding sequence, resulting in a protein that retains its original properties after the substitution. Thus, various modifications can be made in the peptide disclosed herein or the corresponding DNA encoding this peptide without any apparent loss of biological utility.

上記のような改変を設計する際に、 アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。 タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性ァミノ酸指 数の重要性は、 一般に当該分野で認められている （Ky t e. Jおよび D o o 1 i t t l e, R. F. J . Mo 1. B i o l. 157 (1) ： 105-132, 1982)。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、 次いでそのタンパク質と他の分子 （例えば、酵素、基質、 レセプター、 DNA、 抗体、 抗原など） との相互作用を規定する。 各アミノ酸は、 それらの疎水性お ょぴ電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。 それらは：イソ口イシ ン （+4. 5) ;バリン （+4. 2) ;ロイシン （+3. 8) ； フエニノレアラニン (+2. 8)； システィン/シスチン （+2. 5) ;メチォニン （+1. 9) ;ァ ラニン （+1. 8) ;グリシン （一 0. 4) ;スレオニン （一 0. 7) ;セリン （一 0. 8) ; トリプトファン （一0. 9)；チロシン （一1. 3)；プロリン （一1. 6) ;ヒスチジン （一3. 2) ；グノレタミン酸 （一 3. 5) ；グノレタミン （一 3. 5) ；ァスパラギン酸 （一 3. 5) ；ァスパラギン （一 3. 5) ； リジン （一 3. 9) ;およびアルギニン （一 4. 5)) である。  In designing such modifications, the hydropathic index of amino acids can be considered. The importance of the hydrophobic amino acid index in conferring interactive biological functions on proteins is generally recognized in the art (Kyte. J and Doo 1 ittle, RF J. Mo 1 Biol. 157 (1): 105-132, 1982). The hydrophobic nature of amino acids contributes to the secondary structure of the resulting protein, which in turn defines the interaction of that protein with other molecules (eg, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc.). Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on the nature of its hydrophobicity or charge. They are: iso-mouth isine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); pheninolealanine (+2.8); cysteine / cystine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (10.4); Threonine (10.7); Serine (10.8); Tryptophan (10.9); Tyrosine (1-1.3); Proline (1-1.6); Histidine (1.3.2); Gunoretamic acid (1.3.5); Gunoletamine (1.3.5); Aspartic acid (1.3.5); Asparagine (1.3.5); lysine (1.3.9); and arginine (1.4.5).

あるアミノ酸を、 同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、 そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質 （例えば、 酵素活性 において等価なタンパク質） を生じさせ得ることが当該分野で周知である。 こ のようなアミノ酸置換において、 疎水性指数が ±2以内であることが好ましく、 ±1以内であることがより好ましく、 および ±0. 5以内であることがさらに より好ましい。 疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であること が当該分野において理解される。 米国特許第 4， 554， 101号に記載され るように、 以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている ：アルギニ ン （+3. 0) ; リジン （+3. 0) ;ァスパラギン酸 (+3. 0± 1) ； グルタ ミン酸 （+3. 0±1) ；セリン （+0. 3) ；ァスパラギン （+0. 2) ； グル タミン （+0. 2)；グリシン （0)；スレオニン （一 0. 4) ；プロリン （一 0. 5 ± 1) ； ァラニン （一 0. 5) ； ヒスチジン （一 0. 5) ;システィン （一 1. 0) ;メチォニン （一 1. 3) ;バリン （一1. 5) ; ロィシン （一1. 8) ;ィ ソロイシン （一1. 8) ;チロシン （一 2. 3)；フエ二ルァラニン （一 2. 5) ； およびトリブトファン （一3. 4)。 アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依 然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。 このようなァミノ酸置換において、 親水性指数が ±2以内であることが好まし く、 ±1以内であることがより好ましく、 および ±0. 5以内であることがさ らにより好ましい。 ' . It is well known in the art that one amino acid can be replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index and still yield a protein having a similar biological function (eg, a protein equivalent in enzymatic activity). It is. In such an amino acid substitution, the hydrophobicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and further preferably within ± 0.5. More preferred. It is understood in the art that such amino acid substitutions based on hydrophobicity are efficient. As described in US Pat. No. 4,554,101, the following hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid Glutamate (+ 3.0 ± 1); Serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0) Threonine (10.4); Proline (10.5 ± 1); Alanine (10.5); Histidine (10.5); Cystine (11.0); Methionine (1.1.3) Valine (1-1.5); lysine (1-1.8); isoleucine (1-1.8); tyrosine (1-2.3); feniralanine (1-1.5); and tributophane (1-3.5). Four). It is understood that an amino acid can be substituted for another that has a similar hydrophilicity index and still provide a bioisostere. In such amino acid substitution, the hydrophilicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and even more preferably within ± 0.5. '.

本発明において、 「保存的置換」 とは、 アミノ酸置換において、 元のアミノ酸 と置換されるアミノ酸との親水性指数または/および疎水性指数が上記のよう に類似している置換をいう。 保存的置換の例としては、 例えば、 親水性指数ま たは疎水性指数が、 土 2以内のもの同士、 好ましくは ± 1以内のもの同士、 よ り好ましくは ±0. 5以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定され ない。 従って、 保存的置換の例は、 当業者に周知であり、 例えば、 次の各グル ープ内での置換：アルギニンおよびリジン； グルタミン酸およぴァスパラギン 酸；セリンおよぴスレオニン；グルタミンおよびァスパラギン；ならびにバリ ン、 ロイシン、 およぴィソロイシン、 などが挙げられるがこれらに限定されな い。  In the present invention, “conservative substitution” refers to a substitution in which the amino acid substitution and the amino acid to be substituted have similar hydrophilicity indexes and / or hydrophobicity indexes as described above. Examples of conservative substitutions include, for example, those having a hydrophilicity index or a hydrophobicity index of two or less within soil, preferably within ± 1 and more preferably within ± 0.5. But not limited to them. Thus, examples of conservative substitutions are well known to those skilled in the art and include, for example, substitutions within each of the following groups: arginine and lysine; glutamic and aspartic acids; serine and threonine; glutamine and asparagine; And varyin, leucine, and isoloicin, but are not limited thereto.

本明細書において、 「改変体」 とは、 もとのポリペプチドまたはポリヌクレオ チドなどの物質に対して、 一部が変更されているものをいう。 そのような改変 体としては、 置換改変体、 付加改変体、 欠失改変体、 短縮 （ t r u n c a t e d) 改変体、 対立遺伝子変異体などが挙げられる。 対立遺伝子 （a l l e l e) とは、 同一遺伝子座に属し、 互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。 従 つて、 「対立遺伝子変異体」 とは、 ある遺伝子に対して、 対立遺伝子の関係にあ る改変体をいう。 そのような対立遺伝子変異体は、 通常その対応する対立遺伝 子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、 通常はほぼ同一の生物学的活 性を有するが、 まれに異なる生物学的活性を有することもある。 「種相同体また はホモログ （h omo l o g)」 とは、 ある種の中で、 ある遺伝子とアミノ酸レ ベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、 60 %以上の相同性、 より好ましくは、 80 %以上、 85 %以上、 90 %以上、 95 %以上の相同性） を有するものをいう。 そのような種相同体を取得する方法は、 本明細書の記載 から明らかである。 「オルソログ （o r t h o 1 o g)」 とは、 オルソロガス遺 伝子 (o r t h o l o g o u s g e n e) ともいい、 二つの遺伝子がある共 通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。 例えば、 多重遺伝子構造をもつ ヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、 ヒ トおよびマウスの αへモグロ ビン遺伝子はオルソログであるが， ヒトの αヘモグロビン遺伝子おょぴ へモ グロビン遺伝子はパラログ （遺伝子重複で生じた遺伝子） である。 オルソログ は、 分子系統樹の推定に有用である。 オルソログは、 通常別の種においてもと の種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、 本発明のオルソロ グもまた、 本発明において有用であり得る。 As used herein, the term “variant” refers to a substance in which a substance such as an original polypeptide or a polynucleotide is partially modified. Such modifications Examples include substitutional variants, addition variants, deletion variants, truncated variants, allelic variants, and the like. Alleles are genetic variants that belong to the same locus and are distinct from each other. Therefore, “allelic variant” refers to a variant that has an allelic relationship to a certain gene. Such allelic variants usually have sequences that are identical or very similar to their corresponding alleles, usually have nearly the same biological activity, but rarely have different biological activities. May have activity. A "species homolog or homolog" refers to homology (preferably at least 60% homology, more preferably 60% or greater, at the amino acid level or nucleotide level) of a certain gene within a certain species. 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more homology). A method for obtaining such a species homolog is apparent from the description of the present specification. The term “ortholog” is also referred to as the orthologous gene and refers to a gene derived from speciation from a common ancestor with two genes. For example, taking the hemoglobin gene family having a multigene structure as an example, human and mouse α-hemoglobin genes are orthologs, whereas human α-hemoglobin genes and hemoglobin genes are paralogs (gene duplication). The resulting gene). Orthologs are useful for estimating molecular phylogenetic trees. Orthologs of the present invention may also be useful in the present invention, as orthologs can usually perform the same function in another species as the original species.

「保存的 （に改変された） 改変体」 は、 アミノ酸配列および核酸配列の両方 に適用される。 特定の核酸配列に関して、 保存的に改変された改変体とは、 同 一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、 核酸がアミ ノ酸配列をコードしない場合には、 本質的に同一な配列をいう。 遺伝コードの 縮重のため、 多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードす る。 例えば、 コドン GCA、 GCC、 GCG、 および GCUはすべて、 ァミノ 酸ァラニンをコードする。 したがって、 ァラニンがコドンにより特定される全 ての位置で、 そのコドンは、 コードされたポリペプチドを変更することなく、 記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。 このような核酸の変 動は、 保存的に改変された変異の 1つの種である 「サイレント改変 （変異）」 で ある。 ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、 その 核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。 当該分野において、 核酸中 の各コドン （通常メチォニンのための唯一のコドンである AUG、 および通常 トリプトファンのための唯一のコドンである TGGを除く） 1 機能的に同一 な分子を産生するために改変され得ることが理解される。 したがって、 ポリぺ プチドをコ一ドする核酸の各サイレント変異は、 記載された各配列において暗 黙に含まれる。 好ましくは、 そのような改変は、 ポリペプチドの高次構造に多 大な影響を与えるアミノ酸であるシスティンの置換を回避するようになされ得 る。 このような塩基配列の改変法としては、 制限酵素などによる切断、 DNA ポリメラーゼ、 K 1 e n owフラグメント、 D N Aリガーゼなどによる処理等 による連結等の処理、 合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置 換法 （特定部位指向突然変異法； Ma r k Z o l l e r a n d Mi c h a e 1 Sm i t h, Me t h o d s i n En z ymo l o g y, 100, 468-500 (1983)) が挙げられるが、 この他にも通常分子生物学の分 野で用いられる方法によつて改変を行うこともできる。 “Conservative (modified) variants” applies to both amino acid and nucleic acid sequences. With respect to a particular nucleic acid sequence, a conservatively modified variant refers to a nucleic acid that encodes the same or essentially the same amino acid sequence, and if the nucleic acid does not encode an amino acid sequence, To the same sequence. Due to the degeneracy of the genetic code, a number of functionally identical nucleic acids encode any given protein. For example, the codons GCA, GCC, GCG, and GCU are all Encodes acid alanine. Thus, at every position where an alanine is specified by a codon, that codon can be changed to any of the corresponding codons described without altering the encoded polypeptide. Such a nucleic acid variation is a “silent modification (mutation)”, which is one type of conservatively modified mutation. Every nucleic acid sequence herein which encodes a polypeptide also describes every possible silent variation of the nucleic acid. In the art, each codon in the nucleic acid (except AUG, which is usually the only codon for methionine, and TGG, which is usually the only codon for tryptophan) 1 Modified to produce functionally identical molecules It is understood that this can be done. Thus, each silent variation of a nucleic acid which encodes a polypeptide is implicit in each described sequence. Preferably, such modifications can be made to avoid substitution of cysteine, an amino acid that has a significant effect on the conformation of the polypeptide. Examples of such a nucleotide sequence modification method include cleavage with a restriction enzyme or the like, ligation by a treatment with a DNA polymerase, a K 1 enow fragment, DNA ligase, or the like, site-specific base substitution using a synthetic oligonucleotide or the like. (Molecular site-directed mutagenesis; Mark Zollerand Michae 1 Smith, Methodsin Enzymology, 100, 468-500 (1983)). Modifications can also be made by methods used in the field.

本明細書中において、 機能的に等価なポリペプチドを作製するために、 アミ ノ酸の置換のほかに、 アミノ酸の付加、 欠失、 または修飾もまた行うことがで きる。 アミノ酸の置換とは、 もとのペプチドを 1つ以上、例えば、 1〜10個、 好ましくは 1〜5個、 より好ましくは 1〜3個のアミノ酸で置換することをい う。 アミノ酸の付加とは、 もとのペプチド鎖に 1つ以上、例えば、 1〜10個、 好ましくは 1〜5個、 より好ましくは 1〜3個のアミノ酸を付加することをい う。 アミノ酸の欠失とは、 もとのペプチドから 1つ以上、例えば、 1〜10個、 好ましくは 1〜5個、 より好ましくは 1〜3個のアミノ酸を欠失させることを いう。 アミノ酸修飾は、 アミド化、 力ルポキシル化、 硫酸化、 ハロゲン化、 ァ ルキル化、 グリコシル化、 リン酸化、 水酸化、 ァシル化 （例えば、 ァセチル化） などを含むが、 これらに限定されない。 置換、 または付加されるアミノ酸は、 天然のアミノ酸であってもよく、 非天然のアミノ酸、 またはアミノ酸アナログ でもよい。 天然のアミノ酸が好ましい。 Herein, in addition to amino acid substitutions, amino acid additions, deletions, or modifications can also be made to produce functionally equivalent polypeptides. Amino acid substitution refers to substitution of the original peptide with one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids. The addition of amino acids refers to adding one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3, amino acids to the original peptide chain. Amino acid deletion means one or more, for example, 1 to 10, It preferably refers to deleting 1 to 5 amino acids, more preferably 1 to 3 amino acids. Amino acid modifications include, but are not limited to, amidation, hydroxylation, sulfation, halogenation, alkylation, glycosylation, phosphorylation, hydroxylation, acylation (eg, acetylation), and the like. The amino acid to be substituted or added may be a natural amino acid, an unnatural amino acid, or an amino acid analog. Natural amino acids are preferred.

本明細書において使用される用語 「ペプチドアナログ」 または 「ペプチド誘 導体」 とは、 ペプチドとは異なる化合物であるが、 ペプチドと少なくとも 1つ の化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。 したがって、 ぺプ チドアナログには、 もとのペプチドに対して、 1つ以上のアミノ酸アナログま たはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。 ペプチドァ ナログは、 その機能が、 もとのペプチドの機能 （例えば、 p K a値が類似して いること、 官能基が類似していること、 他の分子との結合様式が類似している こと、 水溶性が類似していることなど） と実質的に同様であるように、 このよ うな付加または置換がされている。 そのようなペプチドアナログは、 当該分野 において周知の技術を用いて作製することができる。 したがって、 ペプチドァ ナログは、 アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。  As used herein, the term “peptide analog” or “peptide derivative” refers to a compound that is different from a peptide, but that has at least one chemical or biological function equivalent to the peptide. Say. Accordingly, peptide analogs include those in which one or more amino acid analogs or amino acid derivatives have been added or substituted with the original peptide. Peptide analogs have a function similar to that of the original peptide (e.g., a similar pKa value, similar functional groups, and a similar mode of binding to other molecules). Such additions or substitutions are substantially similar to those described above, for example, having similar water solubility. Such peptide analogs can be made using techniques well known in the art. Thus, a peptide analog can be a polymer comprising an amino acid analog.

本明細書において 「ポリヌクレオチドアナログ」、 「核酸アナログ」 は、 ポリ ヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、 ポリヌクレオチドまたは 核酸と少なくとも 1つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをい う。 したがって、 ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、 もとの ペプチドに対して、 1つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導 体が付加または置換されているものが含まれる。  As used herein, “polynucleotide analog” and “nucleic acid analog” are compounds that are different from polynucleotide or nucleic acid, but have at least one chemical or biological function equivalent to polynucleotide or nucleic acid. Say. Thus, polynucleotide or nucleic acid analogs include those in which one or more nucleotide analogs or nucleotide derivatives have been added or replaced with the original peptide.

本明細書において使用される核酸分子は、 発現されるポリぺプチドが天然型 のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、 上述のようにその核酸の 配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、 あるいは他の 核酸配列が一部挿入されていてもよい。 あるいは、 5， 末端および/または 3， 末端に他の核酸が結合していてもよい。 また、 ポリペプチドをコードする遺伝 子をストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 そのポリべプチドと実質 的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。 このよ うな遺伝子は、 当該分野において公知であり、 本発明において利用することが できる。 As used herein, a nucleic acid molecule may have a deletion or other portion of its nucleic acid sequence, as described above, as long as the expressed polypeptide has substantially the same activity as the native polypeptide. Or may be replaced by another base A nucleic acid sequence may be partially inserted. Alternatively, another nucleic acid may be bound to the 5, terminus and / or the 3, terminus. Further, a nucleic acid molecule encoding a polypeptide having a function substantially the same as that of a polypeptide obtained by hybridizing a gene encoding a polypeptide under stringent conditions may be used. Such genes are known in the art and can be used in the present invention.

このような核酸は、 周知の P C R法により得ることができ、 化学的に合成す ることもできる。 これらの方法に、 例えば、 部位特異的変位誘発法、 ハイプリ ダイゼーション法などを組み合わせてもよい。  Such a nucleic acid can be obtained by the well-known PCR method, and can also be chemically synthesized. These methods may be combined with, for example, a site-specific displacement induction method, a hybridization method, and the like.

本明細書において、 ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの 「置換、 付加ま たは欠失」 とは、 もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、 それ ぞれァミノ酸もしくはその代替物、 またはヌクレオチドもしくはその代替物が、 置き換わること、 付け加わることまたは取り除かれることをいう。 このような 置換、 付加または欠失の技術は、 当該分野において周知であり、 そのような技 術の例としては、 部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。 置換、 付加また は欠失は、 1つ以上であれば任意の数でよく、 そのような数は、 その置換、 付 加または欠失を有する改変体において目的とする機能 （例えば、 ホルモン、 サ イト力インの情報伝達機能など） が保持される限り、 多くすることができる。 例えば、 そのような数は、 1または数個であり得、 そして好ましくは、 全体の 長さの 2 0 %以内、 1 0 %以内、 または 1 0 0個以下、 5 0個以下、 2 5個以 下などであり得る。  As used herein, the term "substitution, addition or deletion" of a polypeptide or polynucleotide means amino acid or its substitute, or nucleotide or its substitute, respectively, with respect to the original polypeptide or polynucleotide. A substitute is replaced, added, or removed. Techniques for such substitution, addition or deletion are well known in the art, and examples of such techniques include site-directed mutagenesis techniques. The number of substitutions, additions, or deletions may be any number as long as it is one or more, and such a number indicates a desired function (for example, hormone, Can be increased as long as the information transmission function is maintained. For example, such a number can be one or several, and preferably is within 20%, 10% or less, 100 or less, 50 or less, 25 of the total length It may be as follows.

本明細書において 「単離された」 生物学的因子 （例えば、 核酸またはタンパ ク質など） とは、 その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生 物学的因子 （例えば、 核酸である場合、 核酸以外の因子および目的とする核酸 以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、 タンパク質以外の因子お よび目的とするタンパク質以外のァミノ酸配列を含むタンパク質など） カ ら実 質的に分離または精製されたものをいう。 「単離された」 核酸おょぴタンパク質 には、 標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。 したがって、 単離された核酸およびタンパク質は、 化学的に合成した核酸およ ぴタンパク質を包含する。 As used herein, an “isolated” biological agent (eg, a nucleic acid or protein) is another biological agent in the cells of an organism in which the biological agent occurs in nature. (For example, when it is a nucleic acid, it is a nucleic acid containing a factor other than a nucleic acid and a nucleic acid sequence other than the target nucleic acid; when it is a protein, it is a protein containing a factor other than the protein and an amino acid sequence other than the target protein, etc.) Moss Qualitatively separated or purified. "Isolated" nucleic acids and proteins include nucleic acids and proteins that have been purified by standard purification methods. Thus, isolated nucleic acids and proteins include chemically synthesized nucleic acids and proteins.

本明細書において 「精製された」 生物学的因子 （例えば、 核酸またはタンパ ク質など） とは、 その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が 除去されたものをいう。 したがって、 通常、 精製された生物学的因子における その生物学的因子の純度は、 その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い (すなわち濃縮されている）。  As used herein, a “purified” biological agent (eg, nucleic acid or protein) refers to a biological agent in which at least a part of a factor naturally associated with the biological agent has been removed. Thus, typically, the purity of the biological agent in the purified biological agent is higher (ie, more concentrated) than in the state in which the biological agent is normally present.

本明細書中で使用される用語 「精製された」 および 「単離された」 は、 好ま しくは少なくとも 7 5重量％、 より好ましくは少なくとも 8 5重量％、 よりさ らに好ましくは少なくとも 9 5重量％、 そして最も好ましくは少なくとも 9 8 重量％の、 同型の生物学的因子が存在することを意味する。  As used herein, the terms “purified” and “isolated” preferably refer to at least 75% by weight, more preferably to at least 85% by weight, and even more preferably to at least 95% by weight. %, And most preferably at least 98% by weight of the same type of biological agent.

(遺伝子操作）  (Genetic manipulation)

本明細書において遺伝子操作について言及する場合、 「ベクター」 または 「組 み換えベクター」 とは、 目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入さ せることができるベクターをいう。 そのようなベクターとしては、 原核細胞、 酵母、 動物細胞、 植物細胞、 昆虫細胞、 動物個体および植物個体などの宿主細 胞において自立複製が可能、 または染色体中への組込みが可能で、 本発明のポ リヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示 される。 ベクターのうち、 クローニングに適したベクターを 「クローニングべ クタ一」 という。 そのようなクローニングベクターは通常、 制限酵素部位を複 数含むマルチプルクローニング部位を含む。 そのような制限酵素部位おょぴマ ルチプルクローニング部位は、 当該分野において周知であり、 当業者は、 目的 に合わせて適宜選択して使用することができる。 そのような技術は、 本明細書 に記載される文献 （例えば、 S a m b r o o kら、 前出） に記載されている。 本明細書において 「発現ベクター」 とは、 構造遺伝子およびその発現を調節 するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る 状態で連結されている核酸配列をいう。 調節エレメントは、 好ましくは、 ター ミネ一ター、 薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、 ェンハンサーを含 み得る。 生物 （例えば、 動物） の発現ベクターのタイプおよび使用される調節 エレメントの種類が、 宿主細胞に応じて変わり得ることは、 当業者に周知の事 項である。 When referring to genetic manipulation herein, "vector" or "recombinant vector" refers to a vector capable of transferring a target polynucleotide sequence into a target cell. Such vectors include those capable of autonomous replication in host cells such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, animal individuals and plant individuals, or capable of integration into chromosomes, Those containing a promoter at a position suitable for polynucleotide transcription are exemplified. Of the vectors, those suitable for cloning are called “cloning vectors”. Such cloning vectors usually contain multiple cloning sites which contain more than one restriction enzyme site. Such restriction enzyme sites and multiple cloning sites are well known in the art, and those skilled in the art can appropriately select and use them according to the purpose. Such techniques are described in the literature described herein (eg, Sambrook et al., Supra). As used herein, the term "expression vector" refers to a nucleic acid sequence in which various regulatory elements in addition to a structural gene and a promoter that regulates its expression are operably linked in a host cell. Regulatory elements may preferably include terminators, selectable markers such as drug resistance genes, and enhancers. It is well known to those skilled in the art that the type of expression vector of an organism (eg, an animal) and the type of regulatory element used can vary depending on the host cell.

原核細胞に対する組換えベクターとしては、 p cDNA3 ( + )、' p B 1 u e s c r i p t -SK (+Z―)、 P GEM—T、 pEF— BOS、 p EGF P, pHAT、 pUC 18、 p FT-DE ST™42 GATEWAY ( I n v i t r o g e n) などが例示される。  Recombinant vectors for prokaryotic cells include pcDNA3 (+), 'pB1uescript-SK (+ Z-), PGEM-T, pEF-BOS, pEGFP, pHAT, pUC18, pFT-DE ST ™ 42 GATEWAY (Invitrogen) is an example.

動物細胞に対する組換えベクターとしては、 p cDNAlZAmp、 p cD NAI、 p CDM8 (いずれもフナコシより市販）、 AGE 107 [特開平 3 -229 (I nv i t r o g e n), p AGE 103 [J. B i o c h e m. , 101， 1307 (1987)]、 pAMo、 AMoA [J. B i o l .+ Ch em., 268, 22782-22787 ( 1993)]、 マウス幹細胞ウィルス (Mu r i n e S t em Ce l l V i r u s) (MS CV) に基づいたレ トロウィルス型発現ベクター、 p EF— BOS、 p EGFPなどが例示される。 植物細胞に対する組換えベクターとしては、 r> P CV I CEn 4HPT、 p CGN1548、 p CGN 1549, pB I 221、 pB I 121などが挙げ られるがそれらに限定されない。  Recombinant vectors for animal cells include pcDNAIZAmp, pcDNAI, pCDM8 (all commercially available from Funakoshi), AGE107 [Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 3-229 (Invitrogen), pAGE103 [J. , 101, 1307 (1987)], pAMo, AMoA [J. Biol. + Chem., 268, 22782-22787 (1993)], murine stem cell virus (Mu rine stem cell virus) (MS CV ), PEF-BOS, pEGFP and the like. Recombinant vectors for plant cells include, but are not limited to, r> PCV ICEn 4HPT, pCGN1548, pCGN1549, pBI221, pBI121, and the like.

本明細書において 「ターミネータ一」 とは、 通常遺伝子のタンパク質をコー ドする領域の下流に位置し、 DN Aが mRN Aに転写される際の転写の終結、 ポリ A配列の付カ卩に関与する配列をいう。 ターミネータ一は、 mRNAの安定 性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。  As used herein, the term "terminator" is usually located downstream of the gene coding region of a gene, and is involved in the termination of transcription when DNA is transcribed into mRNA, and is involved in the attachment of a poly A sequence. Sequence. It is known that the terminator is involved in the stability of mRNA and affects the expression level of the gene.

本明細書において「プロモーター」 とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、 またその頻度を直接的に調節する D NA上の領域をいい、 通常 R NAポリメラ ーゼが結合して転写を始める塩基配列である。 したがって、 本明細書において ある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。 プロモーターの領域は、 通常、 推定タンパク質コード領域の第 1ェキソンの上 流約 2 k b p以内の領域であることが多いので、 D NA解析用ソフトウェアを 用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、 プロモータ領 域を推定することはできる。 推定プロモーター領域は、 構造遺伝子ごとに変動 するが、 通常構造遺伝子の上流にあるが、，これらに限定されず、 構造遺伝子の 下流にもあり得る。 好ましくは、 推定プロモーター領域は、 第一ェキソン翻訳 開始点から上流約 2 k b p以内に存在する。 As used herein, the term "promoter" refers to a site where transcription of a gene is started. It also refers to a region on DNA that directly regulates its frequency, and is usually a base sequence to which RNA polymerase binds and starts transcription. Therefore, in the present specification, a portion of a certain gene that functions as a promoter is referred to as a “promoter portion”. The promoter region is usually within about 2 kbp upstream of the first exon of the putative protein coding region. For example, the promoter region can be estimated. The putative promoter region varies for each structural gene, but is usually located upstream of the structural gene, but is not limited thereto, and may be located downstream of the structural gene. Preferably, the putative promoter region is located within about 2 kbp upstream of the first exon translation initiation site.

本明細書において 「ェンハンサー」 とは、 目的遺伝子の発現効率を高めるた めに用いられる配列をいう。 そのようなェンハンサ一は当該分野において周知 である。 ェンハンサ一は複数個用いられ得るが 1個用いられてもよいし、 用い なくともよい。  As used herein, the term "enhancer" refers to a sequence used to increase the expression efficiency of a target gene. Such enhancers are well known in the art. A plurality of enhancers can be used, but one or no enhancer may be used.

本明細書において 「サイレンサー」 とは、 遺伝子発現を抑制し静止する機能 を有する配列をいう。 本発明では、 サイレンサーとしてはその機能を有する限 り、 どのようなものを用いてもよく、 サイレンサーを用いなくてもよい。  As used herein, the term “silencer” refers to a sequence having a function of suppressing gene expression and quiescent. In the present invention, any type of silencer may be used as long as it has the function, and a silencer may not be used.

本明細書において「作動可能に連結された（る）」 とは、所望の配列の発現（作 動） がある転写翻訳調節配列 （例えば、 プロモーター、 ェンハンサー、 サイレ ンサ一など） または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。 プロモー ターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、 通常、 その遺伝子のすぐ上流 にプロモーターが配置されるが、 必ずしも隣接して配置される必要はない。 本明細書において、 核酸分子を細胞に導入する技術は、 どのような技術でも よく、例えば、形質転換、形質導入、 トランスフエクシヨンなどが挙げられる。 そのような核酸分子の導入技術は、 当該分野において周知であり、 かつ、 慣用 されるものであり、 例えば、 A u s u b e 1 F . A. ら編 （1 9 8 8 )、 C u r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y , W i 1 e y s New Yo r k, NY； S amb r o o k Jら （198 7) Mo l e c u l a r C l o n i n g : A L a b o r a t o r y Ma n u a 1 , 2 n d E d. およびその第三版， Co l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s, Co l d S p r i n g H a r b o r, NY、 別冊実験医学 「遺伝子導入 &発現解析実験法」 羊土社、 1 997などに記載される。 遺伝子の導入は、 ノーザンプロット、 ウェスタンブ 口ット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用い て確認することができる。 As used herein, “operably linked” refers to a transcription / translation regulatory sequence (eg, a promoter, enhancer, silencer, etc.) or translation regulatory sequence that has expression (activity) of a desired sequence. Refers to being placed under control. For a promoter to be operably linked to a gene, the promoter will usually be located immediately upstream of the gene, but need not be. In the present specification, the technique for introducing a nucleic acid molecule into a cell may be any technique, for example, transformation, transduction, transfection, and the like. Techniques for introducing such nucleic acid molecules are well known and commonly used in the art, and are described, for example, in Ausube 1 F.A. et al. . rrent P rotocolsin Mo lecular B iology , W i 1 ey s New Yo rk, NY; S amb rook J et al (198 7) Mo lecular C loning : AL aboratory Ma nua 1, 2 nd E d and its third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Experimental Medicine for Separate Volume “Gene Transfer & Expression Analysis Experimental Method”, Yodosha, 1997, etc. Introduction of the gene can be confirmed using the methods described herein, such as Northern blot, Western blot analysis, or other well-known conventional techniques.

また、 ベクターの導入方法としては、 細胞に DNAを導入する上述のような 方法であればいずれも用いることができ、 例えば、 トランスフエクシヨン、 形 質導入、 形質転換など （例えば、 リン酸カルシウム法、 リボソーム法、 DEA Eデキストラン法、 エレクトロポレーシヨン法、 パーティクルガン (遺伝子銃） を用いる方法など）、 リボフヱクシヨン法、 スフエロプラスト法 [P r o c. N a t 1. Ac a d. S c i . USA, 84， 1 929 (1 978)]、 酢酸リチ ゥム法 [J. B a c t e r i o 1., 153, 163 (1 983)]、 P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA, 75， 1 929 (1 978) 記載の方 法が挙げられる。  As a method for introducing a vector, any of the above-described methods for introducing DNA into cells can be used, and examples thereof include transfection, transformation, and transformation (for example, calcium phosphate method, ribosome USA, DEA E dextran method, electroporation method, particle gun (gene gun) method, etc.), ribodextrin method, spheroplast method [Proc. N at 1. Ac ad. S ci. USA, 84, 1929 (1 978)], the lithium acetate method [J. Bacterio 1., 153, 163 (1 983)], Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 75, 1 929 (1 978).

本明細書において 「外来物質導入試薬」 とは、 外来物質の導入効率を促進す るために使用されている物質をいう。 そのような試薬としては、 例えば、 カチ オン性高分子、 カチオン性脂質、 ポリアミン系試薬、 ポリイミン系試薬、 リン 酸力ルシゥムなどが挙げられるがそれらに限定されない。 このような試薬は、 通常、 核酸の導入効率を上昇させることから、 「遺伝子導入試薬」 を包含する。 本明細書において 「遺伝子導入試薬」 とは、 核酸 （通常遺伝子をコードする 1 それに限定されない） の導入方法において、 導入効率を促進するために用 いられる試薬をいう。 そのような遺伝子導入試薬としては、 例えば、 カチオン 性高分子、 カチオン性脂質、 ポリアミン系試薬、 ポリイミン系試薬、 リン酸力 ルシゥムなどが挙げられるがそれらに限定されない。 トランスフエクシヨンの 際に利用される試薬の具体例としては、 種々なソースから市販されている試薬 力 S挙げられ、 例えば、 E f f e c t e n e T r a n s f e c t i o n Re a g e n t c a t. n o. 301425, Q i a g e n, C A), Tr a n s F a s t™ T r a n s f e c t i o n Re a g e n (E 2431 , P r ome g a, Wl), T f x™- 20 Re a g e n t (E 2391, P r om e g a , W I ) , Sup e r F e c t Tr a n s f e c t i o n R e a g e n t (301305， Q i a g e n, CA), P o l yF e c t Tr a n s f e c t i o n Re a g e n t (301 105, Q i a g e n, C A), L i p o f e c t AM I NE 2000 Re a g e n t (11668-019, I n v i t r o g e n c o r p o r a t i o n, C A), J e t PE I (X 4 ) c o n e. (101-30, P o l yp l u s-t r a n s f e e t i o n, F r a n c e ) およひ Έ x G e n 500 (R051 1, F e rme n t a s I n c.， MD) などが挙げられるがそれらに限定されない。 As used herein, the term "foreign substance introduction reagent" refers to a substance used to promote the efficiency of introduction of a foreign substance. Examples of such a reagent include, but are not limited to, cationic polymers, cationic lipids, polyamine-based reagents, polyimine-based reagents, phosphate phosphate, and the like. Such reagents usually include “gene transfer reagents” because they increase the efficiency of nucleic acid introduction. As used herein, the term “gene introduction reagent” refers to a reagent used to promote the efficiency of introduction of a nucleic acid (usually, not limited to one encoding a gene). Such gene transfer reagents include, for example, cations Functional polymers, cationic lipids, polyamine-based reagents, polyimine-based reagents, phosphoric acid, and the like, but are not limited thereto. Specific examples of reagents used in transfection include reagents commercially available from various sources, for example, Effectene Transaction Reagentcat.no.301425, Qiagen, CA) , TransFast ™ Transfection Reagen (E 2431, Promega, Wl), Tfx ™ -20 Reagent (E2391, Promega, WI), Super Fect Transanfection Reagent ( 301305, Q iagen, CA), Poly Fect Transfection Reagent (301 105, Q iagen, CA), Lipofect AM I NE 2000 Re agent (11668-019, Invitrogencorporation, CA), J et PE I ( X 4) con e. (101-30, Pol yp lust ransfeetion, France) and Έ x Gen 500 (R051 1, Fermentas Inc., MD). It is not limited to.

外来物質導入効率または遺伝子導入効率は、単位面積（例えば、 1mm2など） あたりの導入外来物質 （導入遺伝子） （例えば、 蛍光タンパク質 GFPなど） の 導入 （発現） 細胞数、 または総信号 （蛍光タンパク質の場合は、 蛍光） 量を測 定することによって算定することができる。 The transfection efficiency or transfection efficiency is calculated based on the number of transfected (expressed) cells per unit area (eg, 1 mm 2 ) of the introduced foreign material (transgene) (eg, fluorescent protein GFP) or the total signal (fluorescent protein). In the case of (1), it can be calculated by measuring the amount of fluorescence.

本明細書において 「形質転換体」 とは、 形質転換によって作製された細胞な どの生命体の全部または一部 （組織など） をいう。 形質転換体としては、 原核 生物、 酵母、 動物、 植物、 昆虫などの細胞などの生命体の全部または一部 （組 織など） が例示される。 形質転換体は、 その対象に依存して、 形質転換細胞、 形質転換組織、 形質転換宿主などともいわれる。 本発明において用いられる細 胞は、 形質転換体であってもよい。  As used herein, the term “transformant” refers to all or a part (tissue or the like) of an organism such as a cell produced by transformation. Examples of the transformant include all or a part (organism or the like) of living organisms such as cells of prokaryotes, yeasts, animals, plants, insects and the like. A transformant is also called a transformed cell, a transformed tissue, a transformed host, or the like, depending on the target. The cells used in the present invention may be transformants.

本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、 原 核生物細胞としては、 E s c h e r i c h i a属、 S e r r a t i a属、 B a c i l l u s属、 B r e v i b a c t e r i u mj禹、 C o r y n e b a c t e r i u m属、 M i c r o b a c t e r i u m属、 P s e u d o mo n a s属な どに属する原核生物細胞、 例えば、 E s c h e r i c h i a c o l i X L 1— B l u e、 E s c h e r i c h i a c o l i X L 2— B l u e s E s c h e r i c h i a c o l i DH 1が例示される。あるいは、本発明では、 天然物から分離した細胞も使用することができる。 When prokaryotic cells are used in genetic engineering and the like in the present invention, Prokaryotic cells belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacteriu mj U, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc., such as Escherichiacoli XL 1 - B lue, E scherichiacoli XL 2- B lue s E scherichiacoli DH 1 is illustrated. Alternatively, in the present invention, cells isolated from a natural product can also be used.

本明細書において遺伝子操作などにおいて使用され得る動物細胞としては、 マウス . ミエローマ細胞、 ラット ' ミエローマ細胞、 マウス 'ハイブリ ドーマ 細胞、 チャイニーズ 'ハムスターの細胞である CHO細胞、 BHK細胞、 ァフ リカミドリザル腎臓細胞、 ヒト白血病細胞、 HB T 5 6 3 7 (特開昭 6 3— 2 9 9)、 ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。 マウス ·ミエローマ細胞 としては、 p s 2 0、 NSOなど、 ラット 'ミエローマ細胞としては YB 2 0など、 ヒ ト胎児腎臓細胞としては HEK 2 9 3 (ATCC： CR L— 1 5 7 3 ) など、 ヒト白血病細胞としては B A L L _ 1など、 アフリカミドリザル腎 臓細胞としては CO S— 1、 CO S— 7、 ヒ ト結腸癌細胞株としては HCT— 1 5、 ヒ ト神経芽細胞腫 SK— N— SH、 S K— N— SH— 5 Y、 マウス神経 芽細胞腫 N e u r o 2 Aなどが例示される。 あるいは、 本発明では、 初代培養 細胞も使用することができる。  Animal cells that can be used in gene manipulation and the like herein include mouse myeloma cells, rat's myeloma cells, mouse 'hybridoma cells, Chinese' hamster cells such as CHO cells, BHK cells, and African green monkey kidneys. Cell, human leukemia cell, HBT5663 (JP-A-63-299), human colon cancer cell line, and the like. Mouse / myeloma cells include ps20, NSO, etc. Rat's myeloma cells include YB20, etc., and human fetal kidney cells include HEK293 (ATCC: CRL—1573), human BALL_1 etc. for leukemia cells, COS-1 and COS-7 for African green monkey kidney cells, HCT-15 for human colon cancer cell line, SK-N-SH for human neuroblastoma SK-N-SH-5Y, mouse neuroblastoma N euro 2A and the like. Alternatively, in the present invention, primary cultured cells can also be used.

本明細書において遺伝子操作などにおいて使用され得る植物細胞としては、 カルスまたはその一部および懸濁培養細胞、 ナス科、 イネ科、 アブラナ科、 バ ラ科、 マメ科、 ゥリ科、 シソ科、 ユリ科、 ァカザ科、 セリ科などの植物の細胞 が挙げられるがそれらに限定されない。  Plant cells that can be used in genetic manipulation and the like in the present specification include callus or a part thereof and suspension cultured cells, Solanaceae, Grassicaceae, Brassicaceae, Brassicaceae, Leguminosae, Laceae, Labiatae, Examples include, but are not limited to, cells of plants such as Lily, Acalypaceae and Apiaceae.

本明細書において遺伝子発現 （たとえば、 mRNA発現、 ポリペプチド発現） の 「検出」 または 「定量」 は、 例えば、 mRNAの測定および免疫学的測定方 法を含む適切な方法を用いて達成され得る。 分子生物学的測定方法どしては、 例えば、 ノ一ザンブロット法、 ドットブロット法または P C R法などが例示さ れる。 免疫学的測定方法としては、 例えば、 方法としては、 マイクロタイター プレートを用いる EL I S A法、 R IA法、 蛍光抗体法、 ゥヱスタンプロット 法、 免疫組織染色法などが例示される。 また、 定量方法としては、 EL I SA 法または R I A法などが例示される。 アレイ （例えば、 DNAアレイ、 プロテ インアレイ） を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。 DNAアレイに ついては、 （秀潤社編、 細胞工学別冊 「DNAマイクロアレイと最新 PCR法」） に広く概説されている。 プロテインアレイについては、 Na t Ge n e t. 2002 De c ； 32 Sup p l : 526-32に詳述されている。 遺伝 子発現の分析法としては、 上述に加えて、 RT_PCR、 RACE法、 S SC P法、 免疫沈降法、 two— hyb r i dシステム、 インビトロ翻訳などが挙 げられるがそれらに限定されない。 そのようなさらなる分析方法は、 例えば、 ゲノム解析実験法 ·中村祐輔ラボ ·マニュアル、 編集 ·中村祐輔 羊土社 （2As used herein, “detection” or “quantification” of gene expression (eg, mRNA expression, polypeptide expression) can be achieved using an appropriate method including, for example, mRNA measurement and immunological measurement. Molecular biological measurement methods For example, Northern blotting, dot blotting, or PCR is exemplified. Examples of the immunological measurement method include, for example, an ELISA method using a microtiter plate, an RIA method, a fluorescent antibody method, a ゥ ヱ stamp lot method, and an immunohistological staining method. Examples of the quantification method include the ELISA method and the RIA method. It can also be performed by a gene analysis method using an array (for example, a DNA array or a protein array). DNA arrays are widely reviewed in (Shujunsha eds., Cell Engineering Separate Volume “DNA Microarrays and the Latest PCR Method”). The protein array is described in detail in Nat Genet. 2002 Dec; 32 Sup pl: 526-32. Methods for analyzing gene expression include, but are not limited to, RT_PCR, RACE, SSCP, immunoprecipitation, two-hybrid system, in vitro translation, and the like, in addition to those described above. Such further analysis methods are described in, for example, Genome Analysis Experimental Method · Yusuke Nakamura Lab · Manual and Editing · Yusuke Nakamura Yodosha (2

002.) などに記載されており、 本明細書においてそれらの記載はすべて参考 として援用される。 002.), and the like, all of which are incorporated herein by reference.

本明細書において遺伝子、 ポリヌクレオチド、 ポリぺプチドなど遺伝子産物 の 「発現」 とは、 その遺伝子などがインビポで一定の作用を受けて、 別の形態 になることをいう。 好ましくは、 遺伝子、 ポリヌクレオチドなどが、 転写およ ぴ翻訳されて、 ポリペプチドの形態になることをいうが、 転写されて mRNA が作製されることもまた発現の一形態であり得る。 より好ましくは、 そのよう なポリぺプチドの形態は、 翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。  As used herein, “expression” of a gene product such as a gene, a polynucleotide, or a polypeptide means that the gene or the like undergoes a certain action in vivo and takes on another form. Preferably, it means that a gene, polynucleotide, etc. is transcribed and translated to form a polypeptide, but transcription and production of mRNA may also be a form of expression. More preferably, such polypeptide forms may be post-translationally processed.

「発現量」 とは、 目的の細胞などにおいて、 ポリペプチドまたは mRNAが 発現される量をいう。 そのような発現量としては、 本発明の抗体を用いて EL I S A法、 R IA法、 蛍光抗体法、 ウェスタンプロット法、 免疫糸且織染色法な どの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリぺ プチドのタンパク質レベルでの発現量、 またはノーザンブロット法、 ドットブ 口ット法、 P C R法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法によ り評価される本発明のポリペプチドの m R N Aレベルでの発現量が挙げられる。 「発現量の変化」 とは、 上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を 含む任意の璋切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レ ベルまたは mR N Aレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。 従って、 本明細書において遺伝子、 ポリヌクレオチド、 ポリペプチドなどの 「発現」 または 「発現量」 の 「減少」 とは、本発明の因子を作用させたときに、 作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、 発現の減少は、ポリぺプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、 ポリヌクレオチド、 ポリペプチドなどの 「発現」 または 「発現量」 の 「増加」 とは、 細胞内に遺伝子発現に関連する因子 （例えば、 発現されるべき遺伝子ま たはそれを調節する因子） を導入したときに、 作用させないときよりも、 発現 の量が有意に増加することをいう。 好ましくは、 発現の増加は、 ポリペプチド 一の発現量の増加を含む。 本明細書において遺伝子の 「発現 の 「誘導： とは、 - ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。 したがって、 発現の誘導は、 まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合 にその遺伝子が発現するようにすること、 およびすでにその遺伝子の発現が見 られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。 “Expression level” refers to the level at which a polypeptide or mRNA is expressed in a target cell or the like. Such an expression level may be determined by any suitable method using the antibody of the present invention, including immunological measurement methods such as ELISA, RIA, fluorescent antibody, Western blotting, and immunostaining. Expression level at the protein level of the polypeptide of the present invention evaluated by the method, The expression level of the polypeptide of the present invention at the mRNA level, which is evaluated by any appropriate method including a molecular biological measurement method such as a mouthpiece method and a PCR method, may be mentioned. "Change in expression level" refers to the expression level of the polypeptide of the present invention at the protein level or mRNA level, which is evaluated by any method including the immunological measurement method or the molecular biological measurement method described above. Means increase or decrease. Therefore, as used herein, “expression” or “reduction” of “expression” of a gene, a polynucleotide, a polypeptide, or the like refers to the amount of expression of the agent of the present invention compared to when it is not used. Is significantly reduced. Preferably, the decrease in expression includes a decrease in the expression level of the polypeptide. As used herein, “expression” or “increase in expression level” of a gene, polynucleotide, polypeptide, etc., refers to a factor associated with gene expression in a cell (for example, a gene to be expressed or a gene to be expressed). This means that the amount of expression is significantly increased when a (regulatory factor) is introduced, compared to when it is not used. Preferably, increasing expression includes increasing the expression of the polypeptide. As used herein, the term “induction of expression” of a gene refers to-an action of a factor on a certain cell to increase the expression level of the gene. This includes allowing the gene to be expressed if not found, and increasing the expression of the gene if the gene has already been seen.

本明細書において、 遺伝子が 「特異的に発現する」 とは、 その遺伝子が、 植 物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる （好ましく は高い） レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、 ある部位（特 異的部位） にのみ発現してもよく、 それ以外の部位においても発現していても よい。 好ましくは特異的に発現するとは、 ある部位においてのみ発現すること をいう。  As used herein, "specifically express" a gene means that the gene is expressed at a particular site or stage of the plant at a different (preferably higher) level than at other sites or stages. Say. To be specifically expressed may be expressed only at a certain site (specific site), or may be expressed at other sites. Preferably, specifically expressed means to be expressed only at a certain site.

本明細書において 「生物学的活性」 とは、 ある因子 （例えば、 ポリペプチド またはタンパク質） 力 生体内において有し得る活性のことをいい、 種々の機 能 （例えば、 転写促進活性） を発揮する活性が包含される。 例えば、 コラーゲ ンがそのリガンドと相互作用する場合、 その生物学的活性は、 結合体の形成ま たは他の生物学的変化を包含する。 別の好ましい実施形態では、 そのような生 物学的活性は、 細胞接着活性、 へパリン結合活性、 コラーゲン結合活性などで あり得る。 細胞接着活性は、 細胞播種後に細胞の固相への接着速度を測定し、 接着活性として取り扱うことによつて測定することができる。 へパリン結合活 性は、 へパリン固定化カラム等のァフィ二ティークロマトグラフィーを行い、 これに結合するものとして確認できるものによって測定することができる。 コ ラーゲン結合活性は、 コラーゲン固定化カラム等のァフィ二ティークロマトグ ラフィーを行い、 これに結合するものとして確認できるものによって測定する ことができる。 例えば、 ある因子が酵素である場合、 その生物学的活性は、 そ の酵素活性を包含する。 別の例では、 ある因子がリガンドである場合、 そのリ ガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。 そのような生物学的活性は、 当該分野において周知の技術によって測定することができる (Mo 1 e c u 1 a r C l o n i n g、 Cu r r e n t P r o t o c o l s (本明細書にお いて引用） などを参照)。 As used herein, the term “biological activity” refers to an activity that a certain factor (for example, a polypeptide or a protein) can have in a living body. Activity (eg, transcription promoting activity) is included. For example, when a collagen interacts with its ligand, its biological activity includes conjugate formation or other biological changes. In another preferred embodiment, such a biological activity can be cell adhesion activity, heparin binding activity, collagen binding activity, and the like. The cell adhesion activity can be measured by measuring the rate of adhesion of the cells to the solid phase after cell seeding and treating it as the adhesion activity. The heparin binding activity can be measured by performing affinity chromatography such as a heparin-immobilized column and confirming that it binds thereto. The collagen binding activity can be measured by performing affinity chromatography such as a collagen-immobilized column and confirming that it binds thereto. For example, if a factor is an enzyme, its biological activity includes that enzyme activity. In another example, when an agent is a ligand, the ligand includes binding to the corresponding receptor. Such biological activity can be measured by techniques well known in the art (see Mo ecu ar Cloning, Current Protocols (cited herein), etc.).

本明細書において 「キット」 とは、 通常 2つ以上の区画に分けて、 提供され るべき部分 （例えば、 試薬、 粒子など） が提供されるユニットをいう。 混合さ れて提供されるべきでなく、 使用直前に混合して使用することが好ましいよう な組成物の提供を目的とするときに、 このキットの形態は好ましい。 そのよう なキットは、 好ましくは、 提供される部分 （例えば、 試薬、 粒子など） をどの ように処理すベきかを記載する説明書を備えていることが有利である。  As used herein, the term “kit” generally refers to a unit provided with a part to be provided (eg, reagents, particles, etc.) divided into two or more compartments. This kit form is preferred when it is intended to provide a composition that should not be provided in a mixed form, but is preferably mixed and used immediately before use. Such a kit will advantageously include instructions describing how to provide the provided parts (eg, reagents, particles, etc.).

(ポリペプチドの製造方法）  (Method for producing polypeptide)

本発明において使用されるポリぺプチドは、 そのポリぺプチドをコードする DN Aを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、 動物細胞などに由来 する形質転換体を、 通常の培養方法に従って培養し、 このポリペプチドを生成 蓄積させ、 その培養物よりその本発明のポリぺプチドを採取することにより、 製造することができる。 The polypeptide used in the present invention is obtained by culturing a transformant derived from a microorganism, animal cell, or the like having a recombinant vector into which DNA encoding the polypeptide has been incorporated, according to a conventional culture method. Produces this polypeptide It can be produced by accumulating and collecting the polypeptide of the present invention from the culture.

形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常の方法に 従って行うことができる。 大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿 主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 本発明の生物が資化し 得る炭素源 （例えば、 グルコース、 フラクトース、 スクロース、 これらを含有 する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピ オン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノール等のアルコール類など）、 窒素源 (例えば、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アンモニ ゥム、 リン酸アンモニゥム等の各種無機酸または有機酸のアンモニゥム塩、 そ の他含窒素物質、 ならびに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチー プリカ一、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵菌 体およびその消化物等など）、 無機塩類 （例えば、 リン酸第一カリウム、 リン酸 第二力リヴム、 リン酸マグネシゥム、 硫酸マグネシゥム、 塩化ナトリウム、 硫 酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等など） 等を含有し、 形質 転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地 （例えば、 R PM I 1640培地 [Th e J o u r n a l o f t h e Ame r i c a n Me d i c a l As s o c i a t i o n, 199, 519 (1 967)]S E a g l eの MEM培地 [S c i e n c e, 122， 501 (1 952)]、 D MEM培地 [V i r o l o g y, 8， 396 (1959)]、 199培地 [P r o c e e d i n g s o f t h e S o c i e t y f o r t h e B i o 1 o g i c a 1 Me d i c i n e, 73, 1 ( 1950 )] またはこれら培 地にゥシ胎児血清等を添加した培地等） のいずれを用いてもよい。 培養は、 振 盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましいがそれ に限定されない。 培養温度は 1 5〜40°Cがよく、 培養時間は、 通常 5時間〜 7日間である。 培養中 pHは、 3. 0〜9. 0に保持する。 pHの調整は、 無 機あるいは有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニア等を 用いて行う。 また培養中必要に応じて、 アンピシリンまたはテトラサイクリン 等の抗生物質を培地に添加してもよい。 The method for culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host. As a medium for culturing a transformant obtained mainly from a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast, a carbon source (for example, glucose, fructose, sucrose, etc. Molasses, carbohydrates such as starch or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid and propionic acid, alcohols such as ethanol and propanol, etc., nitrogen sources (eg, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate) , Ammonium salts of various inorganic or organic acids such as ammonium phosphate, and other nitrogen-containing substances, as well as peptone, meat extract, yeast extract, cornchee liqueur, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate , Various fermentation cells and their digests, etc.), inorganic salts (For example, potassium phosphate dibasic, potassium phosphate dibasic, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc.) Natural media and synthetic media (for example, RPM I 1640 medium [The Journal of American Medical Association, 199, 519 (1 967)] MEM from S Eagle Medium [Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proceedings of Society for the Bio 1 ogica 1 Medicine, 73, 1 (1950)] ] Or a culture medium obtained by adding fetal serum or the like to these culture media). The culture is preferably performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture, but is not limited thereto. The culture temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culture time is usually 5 hours to 7 days. During the cultivation, the pH is maintained at 3.0 to 9.0. No pH adjustment This is performed using a machine or an organic acid, alkali solution, urea, calcium carbonate, ammonia, etc. If necessary, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.

本発明において使用されるポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換さ れた形質転換体の培養物から、 そのポリペプチドを単離または精製するために は、 当該分野で周知慣用の通常のポリペプチド （例えば、 酵素） の単離または 精製法を用いることができる。 例えば、 本発明のポリペプチドが本発明のポリ ぺプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明のポリぺプチドが分泌される場合 には、 その培養物を遠心分離等の手法により処理し、 可溶性画分を取得する。 その可溶性画分から、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法脱塩法、 有機溶媒によ る沈澱法、 ジェチルアミノエチル （DEAE) -S e p h a r o s e (P h a r ma c i a), D I A I ON HP A— 75 (三菱化成） 等樹脂を用いた陰ィ オン交換クロマトグラフィー法、 S— S e p h a r o s e F F (P h a r m a c i a) 等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、 Bu t y l — S e p h a r o s e、 Ph e ny l— S e p h a r o s e等の樹脂を用いた 疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二ティーク 口マトグラフィ一法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電気泳 動法等の手法を用い、 精製標品を得ることができる。  In order to isolate or purify the polypeptide from a culture of a transformant transformed with the nucleic acid sequence encoding the polypeptide used in the present invention, a conventional polypeptide commonly used in the art is used. (Eg, enzymes) isolation or purification methods can be used. For example, when the polypeptide of the present invention secretes the polypeptide of the present invention outside the cells of the transformant for producing the polypeptide of the present invention, the culture is treated by a method such as centrifugation, and the like. Obtain the soluble fraction. From the soluble fraction, solvent extraction, salting out using ammonium sulfate, etc., precipitation using an organic solvent, getylaminoethyl (DEAE) -Sepharose (Pharmacia), DIAI ON HP A—75 (Mitsubishi Kasei) Anion exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia), Cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia), Butyl—Sepharose, Phenyl Hydrophobic chromatography using resin such as Sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity mouth chromatography, chromatofocusing, and electrophoresis such as isoelectric focusing A purified sample can be obtained.

本発明において使用されるポリぺプチドが形質転換体の細胞内に溶解状態で 蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、 その細胞を洗浄した後に、 超音波破碎機、 フレンチプレス、 マントンガウリン ホモジナイザー、 ダイノミル等により細胞を破砕し、 無細胞抽出液を得る。 そ の無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、 溶媒抽出法、 硫 安等による塩析法脱塩法、 有機溶媒による沈澱法、 ジェチルアミノエチル （D EAE) -S e p h a r o s e, D I A I ON H P A— 75等樹脂を用いた 陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S— S e p h a r o s e FF等の樹脂 を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、 B u t y l— S e p h a r o s e、 P h e n y l -S e p h a r o s e等の樹脂を用いた疎水性クロマトダラ ブイ一法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィ二ティークロマトグラフィー法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いる ことによって、 精製標品を得ることができる。 When the polypeptide used in the present invention accumulates in a lysed state in the cells of the transformant, the cells in the culture are collected by centrifuging the culture, and the cells are washed. The cells are crushed using an ultrasonic crusher, French press, Mantongaulin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, and getylaminoethyl (DEAE) -S Anion exchange chromatography using epharose, DIAI ON HPA-75 and other resins, S-Sepharose FF and other resins Chromatography using cation-exchange chromatography using Butyl-Sepharose, Phenyl-Sepharose, etc., gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatography A purified sample can be obtained by using a technique such as a focusing method or an electrophoresis method such as isoelectric focusing.

本発明において使用されるポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現し た場合は、 同様に細胞を回収後破砕し、 遠心分離を行うことにより得られた沈 澱画分より、 通常の方法により本発明のポリペプチドを回収後、 そのポリぺプ チドの不溶体をポリぺプチド変性剤で可溶化する。 この可溶化液を、 ポリぺプ チド変性剤を含まないあるいはポリべプチド変性剤の濃度がポリべプチドが変 性しない程度に希薄な溶液に希釈、 あるいは透析し、 本発明のポリペプチドを 正常な立体構造に構成させた後、 上記と同様の単離精製法により精製標品を得 ることができる。  When the polypeptide used in the present invention is expressed by forming an insoluble substance in the cells, the cells are similarly recovered, crushed, and then separated from the precipitate fraction obtained by centrifugation. After recovering the polypeptide of the present invention by the method, the insoluble form of the polypeptide is solubilized with a polypeptide denaturing agent. The solubilized solution is diluted or dialyzed into a solution containing no polypeptide denaturant or diluted so that the concentration of the polypeptide denaturant does not alter the polypeptide, and the polypeptide of the present invention is normalized. After having a three-dimensional structure, a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.

また、 通常のタンパク質の精製方法 [例えば、 J . E v a n. S a d l e r ら： Me t h o d s i n En z ymo l o g y, 8 3， 4 58] に準じて 精製できる。 また、 本発明において使用されるポリペプチドが他のタンパク質 との融合タンパク質として生産しても使用され得る場合、 融合したタンパク質 に親和性をもつ物質を用いたァフイエティーク口マトグラフィ一を利用して精 製することもできる [山川彰夫， 実験医学 （Ex p e r i me n t a l Me d i c i n e), 1 3， 46 9-474 (1 9 9 5)]。 あるいは、 L oweらの 方法 [P r o c. Na t l . Ac a d. S c i ., USA, 8 6, 8 22 7— 8 23 1 (1 9 8 9)、 G e n e s D e v e l o p., 4, 1 288 (1 9 90)] に記載の方法に準じて、 そのようなポリぺプチドをプロテイン Aとの融合タン パク質として生産し、 ィムノグロプリン Gを用いるァフィ二ティークロマトグ ラフィーにより精製することができる。 また、 本発明において使用されるポリ ペプチドを FLAGペプチドとの融合タンパク質として生産し、 抗 FLAG抗 体を用いるアブイ二ティークロマトグラフィーにより精製することができるFurther, the protein can be purified according to a general protein purification method [for example, J. Evan. Sadler et al .: Methodsin Enzymology, 83, 458]. When the polypeptide used in the present invention can be used even if it is produced as a fusion protein with another protein, it can be purified by affinity chromatography using a substance having an affinity for the fused protein. [Akio Yamakawa, Experimental Medicine (Ex peri mental Medicine), 13, 469-474 (1995)]. Alternatively, the method of Lowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 822 7—8 231 (1 89 9), Genes D evelo p., 4 , 1288 (1990)], such a polypeptide can be produced as a fusion protein with protein A, and purified by affinity chromatography using immunoglobulin G. it can. Further, the polypeptide used in the present invention is produced as a fusion protein with a FLAG peptide, Can be purified by affinity chromatography using

[P r o c . Na t l . Ac a d. S c i .， USA, 86， 8227 (1 98 9), Ge n e s D e v e l o p., 4， 1288 (1 990)]。 Sad., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)].

さらに、 本発明のポリペプチド自身に対する抗体を用いたァフィ二ティーク 口マトグラフィ一で精製することもできる。 本発明のポリペプチドは、 公知の 方法 [J. B i omo l e c u l a r NMR， 6， 1 29— 134、 S c i e n c e， 242, 1 162—1 164、 J . B i o c h e m. , 1 10， 16 6— 168 (1991)] に準じて、 i n v i t r。転写 ·翻訳系を用いてを 生産することができる。  Furthermore, the polypeptide of the present invention can be purified by affinity mouth chromatography using an antibody against itself. The polypeptide of the present invention can be prepared by a known method [J. Biomolecular NMR, 6, 129-134, Science, 242, 1162-1164, J. Biochem., 110, 166- 168 (1991)]. It can be produced using a transcription / translation system.

上記で取得されたポリペプチドのアミノ酸情報を基に、 Fmo c法 （フルォ レニルメチルォキシカルボニル法）、 t B o c法 ( t—プチルォキシカルボニル 法） 等の化学合成法によっても本発明のポリぺプチドを製造することができる。 また、 Ad v a n c e d Ch emTe c n、 A p 1 i e d B i o s y s t ems、 Ph a rma c i a B i一 o t e c h、 P r o t e i n T e c"h n o 1 o g y I n s t r ume n t^ S yn t h e c e l 1— Ve g a^ P e r S e p t i v e, 島津製作所等のぺプチド合成機を利用し化学合成するこ ともできる。  Based on the amino acid information of the polypeptide obtained above, the present invention can also be performed by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Can be produced. Also, Advanced ChemTecn, Ap1 ied B iosyst ems, Pharma cia Bi i otech, Protein T ec "hno 1 ogy Instrument ^ Syn thecel 1—Ve ga ^ Per Septive Chemical synthesis can also be performed using peptide synthesizers such as Shimadzu Corporation.

(細胞の分化誘導）  (Induction of cell differentiation)

本明細書において 「分化」 とは、 一般的には、 1 つの系が 2 つ以上の質的に 異なる系に分離することをいい、 細胞、 組織または臓器について用いられると き、 機能および/または形態が特殊化することをいう。 分化に伴い、 通常、 多 能性は減少または消失する。 分化によって、 例えば、 表皮細胞、 膝実質細胞、 膝管細胞、 肝細胞、 血液細胞、 心筋細胞、 骨格筋細胞、 骨芽細胞、 骨格筋芽細 胞、 神経細胞、 血管内皮細胞、 色素細胞、 平滑筋細胞、 脂肪細胞、 骨細胞、 軟 骨細胞などの形態学的に別の細胞に分化するか、 あるいは、 神経細胞のように 樹状突起などが伸展または増殖してもよい。 本発明において用いられる場合、 分化誘導された分化細胞は、 集団または組織の形態を採り得る。 As used herein, the term “differentiation” generally refers to the separation of one system into two or more qualitatively different systems, and when used for cells, tissues or organs, functions and / or It means that the form is specialized. With differentiation, pluripotency usually decreases or disappears. Depending on the differentiation, for example, epidermal cells, knee parenchymal cells, knee duct cells, hepatocytes, blood cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, osteoblasts, skeletal myoblasts, nerve cells, vascular endothelial cells, pigment cells, smooth The cells may be morphologically differentiated into different cells such as muscle cells, fat cells, bone cells, and chondrocytes, or dendrites may extend or proliferate like nerve cells. When used in the present invention, Differentiated cells that have been induced to differentiate can take the form of a population or a tissue.

本明細書において 「分化誘導」 および 「分化促進」 は、 交換可能に用いられ、 細胞について言及される場合、 分化を誘導または促進することをいう。 従って、 分化誘導は、 分化の速度が上昇することおよび分化がとまっていたり脱分化の 方向にある細胞を分化の方向に向けることも含まれる。  As used herein, “differentiation induction” and “differentiation promotion” are used interchangeably and, when referring to a cell, refer to inducing or promoting differentiation. Thus, induction of differentiation includes increasing the rate of differentiation and directing cells that are in a staggered or dedifferentiating direction to differentiate.

本明細書において 「分化因子」、 「分化誘導因子」 または 「分化促進因子」 は、 交換可能に用いられ、分化細胞への分化を促進または誘導させる因子（例えば、 化学物質、 温度など） であれば、 どのような因子であってもよい。 そのような 因子としては、 例えば、 種々の環境要因を挙げることができ、 そのような因子 としては、 例えば、 温度、 湿度、 pH、塩濃度、 栄養、 金属、 ガス、 有機溶媒、 圧力、 化学物質 （例えば、 ステロイ ド、 抗生物質など） などまたはそれらの任 意の組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。 代表的な分化因子とし ては、 細胞生理活性物質が挙げられるがそれらに限定されない。 そのような因 子のうち代表的なものとしては、 DNA脱メチル化剤（5—ァザシチジンなど）、 ヒストン脱ァセチル化剤 （トリコスタチンなど）、 核内レセプターリガンド （例 えば、 レチノイン酸 (ATRA)s ビタミン D 3、 T3など）、 細胞増殖因子 （ァ クチビン、 インスリン様増殖因子 （I GF) — 1、 線維芽細胞増殖因子 （FG F)、 血小板由来増殖因子 （PDGF)、 トランスフォーミング増殖因子 （TG F) ー/3、 神経成長因子 （NGF)、骨形成タンパク質 （BMP) 2Z4など）、 サイト力イン （L I F、 I L— 2、 I L一 6など）、 へキサメチレンビスァセト アミ ド、 ジメチルァセトァミド、 ジブチル c AMP、 ジメチォルスルホキシド、 ョ一ドデォキシゥリジン、 ヒドロキシル尿素、 シトシンァラビノシド、 マイト マイシン C、酪酸ナトリゥム、 ァフィディコリン、 フルォロデオキシゥリジン、 ポリプレン、 セレンなどが挙げられるがそれらに限定されない。 As used herein, the term “differentiation factor”, “differentiation inducing factor” or “differentiation promoting factor” is used interchangeably and refers to a factor that promotes or induces differentiation into differentiated cells (eg, a chemical substance, temperature, etc.). Any factor may be used. Such factors include, for example, various environmental factors, such as, for example, temperature, humidity, pH, salt concentration, nutrition, metals, gases, organic solvents, pressure, and chemicals. (Eg, steroids, antibiotics, etc.) or any combination thereof. Representative differentiation factors include, but are not limited to, cell biologically active substances. Representative of such factors are DNA demethylating agents (eg, 5-azacitidine), histone deacetylating agents (eg, trichostatin), nuclear receptor ligands (eg, retinoic acid (ATRA)) s such as vitamin D 3, T3), cell growth factor (§ Kuchibin, insulin-like growth factor (I GF) - 1, fibroblast growth factor (FG F), platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor ( TG F)-/ 3, nerve growth factor (NGF), bone morphogenetic protein (BMP) 2Z4, etc., cytokinin (LIF, IL-2, IL-16, etc.), hexamethylene bisacetamide, dimethyl Acetamide, dibutyl c AMP, dimethyl sulfoxide, oxydoxydiridine, hydroxyl urea, cytosine arabinoside, mitomycin C, sodium butyrate, affidicolin Full O b deoxy © lysine, Poripuren, although selenium include, but are not limited to.

具体的な分化因子としては、 以下が挙げられる。 これらの分化因子は、 単独 でまたは組み合わせて用 ヽられ得る。 A) 角膜：上皮増殖因子 （EGF) ； Specific differentiation factors include the following. These differentiation factors can be used alone or in combination. A) Cornea: epidermal growth factor (EGF);

B) 皮膚 （ケラチノサイト） ： TGF— ) 3、 FGF- 7 (KGF： k e r a t i n o c y t e g r o t h f a c t o rノ、 EGF  B) Skin (keratinocytes): TGF—) 3, FGF-7 (KGF: keratatinocyteegrotfafactora, EGF

C) 血管内皮： VEGF、 FGF、 アンギオポェチン （a n g i o p o i e t i n)  C) Vascular endothelium: VEGF, FGF, angiopoietin (angiopoietin)

D) 腎臓： L I F、 BMP, FGF、 GDNF  D) Kidney: LIF, BMP, FGF, GDNF

E) 心臓： HGF、 L I F、 VEGF  E) Heart: HGF, LIF, VEGF

F) 肝臓： HGF、 TGF— 、 I L—6、 EGF、 VEGF  F) Liver: HGF, TGF—, IL-6, EGF, VEGF

G) 臍帯内皮： VEGF  G) Umbilical cord endothelium: VEGF

H) 腸管上皮： EGF、 I GF— I、 HGF、 KGF、 TGF— j3、 I L— 11  H) Intestinal epithelium: EGF, IGF-I, HGF, KGF, TGF-j3, IL- 11

I) 神経：神経成長因子 （NGF)、 BDNF (脳由来神経栄養因子）、 GD NF (グリア細胞由来神経栄養因子）、 ニューロトロフィン （n e u r o t r o p h i n), I L— 6、 TNF  I) Nerve: Nerve growth factor (NGF), BDNF (brain-derived neurotrophic factor), GDNF (glial cell-derived neurotrophic factor), neurotrophin (neurotropophin), IL-6, TNF

J) グリア細胞： TGF— 、 TNF— α、 EGF、 L I F、 I L—6. J) Glial cells: TGF-, TNF-α, EGF, LIF, IL-6.

K) 末梢神経細胞： b FGF、 L I F、 TGF— j3、 I L— 6、 VEGF,K) Peripheral neurons: bFGF, LIF, TGF-j3, IL-6, VEGF,

L) 肺 （肺胞上皮） ： TGF_i3、 I L一 13、 I L— 1 、 KGF, HGF . M) 胎盤：成長ホルモン （GH)、 I GF、 プロラクチン、 L I F、 I L— 1、 ァクチビン A、 EGF L) Lung (alveolar epithelium): TGF_i3, IL-13, IL-1, KGF, HGF. M) Placenta: Growth hormone (GH), IGF, prolactin, LIF, IL-1, activin A, EGF

N) 勝臓上皮：成長ホルモン、 プロラクチン  N) Splenic epithelium: growth hormone, prolactin

O) 膝臓ランゲルハンス氏島細胞： TGF— j3、 I GF、 PDGF、 EGF、 TGF— ]3、 TRH (t hy r o r o p i )  O) Langerhans islet cells of the knee: TGF-j3, IGF, PDGF, EGF, TGF-] 3, TRH (thyroropi)

P) 関節滑膜上皮： FGF、 TGF— j3  P) Joint synovial epithelium: FGF, TGF- j3

Q) 骨芽細胞： BMP、 FGF  Q) Osteoblasts: BMP, FGF

R) 軟骨芽細胞： FGF、 TGF— 3、 BMP, TNF-α  R) Chondroblasts: FGF, TGF-3, BMP, TNF-α

S) 網膜細胞： FGF、 CNTF (絨毛神経栄養因子 =c i 1 1 i a r y n e u r o t r o p h i c f a c t o r) S) Retinal cells: FGF, CNTF (villus neurotrophic factor = ci 1 1 iaryn eurotrophicfactor)

T) 脂肪細胞：インスリン、 I GF、 L I F  T) Adipocytes: insulin, IGF, LIF

U) 筋肉細胞： L I F、 TNF-α, FGF。  U) Muscle cells: LIF, TNF-α, FGF.

本発明の細胞は、 細胞の維持または所望の分化細胞へ分化する限り、 任意の 培養液を用いることができる。そのような培養液としては、例えば、 DMEM、 P 199、 MEM、 HB S S, Ham' s F 12、 BME、 RPM I 164 0、 MCDB 104、 MCDB 153 (KGM) およびそれらの混合物などが 挙げられるがそれらに限定されない。 このような培養液には、 デキサメタゾン などの副腎皮質ステロイ ド、 インスリン、 グルコース、 インドメタシン、 イソ ブチルーメチルキサンチン （I BMX)、 ァスコルべート _ 2—ホスフェート、 ァスコルビン酸おょぴその誘導体、 グリセ口ホスフェート、 エストロゲンおよ ぴその誘導体、 プロゲステロンおよぴその誘導体、 アンドロゲンおよぴその誘 導体、 a FGF、 bFGF、 EGF、 I GF、 TGF β , ECGF、 BMP, PDGFなどの増殖因子、 下垂体エキス、 松果体エキス、 レチノイン酸、： ビタ ミン D、 甲状腺ホルモン、 ゥシ胎仔血清、 ゥマ血清、 ヒ ト血清、 へパリン、 炭 酸水素ナトリウム、 HEPES、 アルプミン、 トランスフェリン、 セレン酸 （亜 セレン酸ナトリウムなど）、 リノレン酸、 3—イソプチルー 1ーメチルキサンチ ン、 5—ァザンシチジンなどの脱メチル化剤、 トリコスタチンなどのヒストン 脱ァセチル化剤、 ァクチビン、 L I F · I L— 2 · I L— 6などのサイトカイ ン、 へキサメチレンビスァセトアミ ド （HMBA)、 ジメチルァセトアミド （D MA)、ジブチル c AMP (d b c AMP),ジメチルスルホキシド（DM S 0)、 ョードデォキシゥリジン （I dU)、 ヒドロキシゥレア （HU)、 シトシンァラ ピノシド （Ar a C)s マイトマイシン C (MMC)、 酪酸ナトリゥム （N a B u)、 ポリプレン、 セレニウム、 コレラトキシンなどを 1つまたはその組み合わ せとして含ませておいてもよい。 As the cells of the present invention, any culture solution can be used as long as the cells are maintained or differentiated into desired differentiated cells. Examples of such a culture medium include DMEM, P199, MEM, HBSS, Ham's F12, BME, RPMI1640, MCDB104, MCDB153 (KGM) and a mixture thereof. Not limited to them. Such cultures include adrenocortical steroids such as dexamethasone, insulin, glucose, indomethacin, isobutyl-methylxanthine (IBMX), ascorbate_2-phosphate, ascorbic acid and its derivatives, and glycemic acid. Oral phosphate, estrogen and its derivatives, progesterone and its derivatives, androgen and its derivatives, a FGF, bFGF, EGF, IGF, TGFβ, growth factors such as ECGF, BMP, PDGF, pituitary gland Extract, pineal extract, retinoic acid,: vitamin D, thyroid hormone, male fetal serum, male serum, human serum, heparin, sodium bicarbonate, HEPES, albumin, transferrin, selenite (selenium) Sodium), linolenic acid, 3-isobutyl-1-methylxanthine, 5-azansi Demethylating agents such as gin; Histone deacetylating agents such as trichostatin; activin; cytokins such as LIF · IL-2 / IL-6; hexamethylene bisacetamide (HMBA); dimethylacetate Amide (DMA), dibutyl c AMP (dbc AMP), dimethyl sulfoxide (DM S 0), eododexperidine (I dU), hydroxyperea (HU), cytosine ara pinoside (Ar a C) s Mitomycin C (MMC), sodium butyrate (NaBu), polypropylene, selenium, cholera toxin, etc. may be included as one or a combination thereof.

(デバイス） 本明細書において 「デバイス」 とは、 装置の一部または全部を構成すること ができる部分をいい、 支持体 （好ましくは固相支持体） およびその支持体に担 持されるべき標的物質などから構成される。 そのようなデバイスとしては、 チ ップ、 アレイ、 マイクロタイタープレート、 細胞培養プレート、 シャーレ、 フ イルム、 ビーズなどが挙げられるがそれらに限定されない。 (device) As used herein, the term “device” refers to a part that can constitute a part or the whole of an apparatus, and includes a support (preferably a solid support) and a target substance to be carried by the support. Be composed. Such devices include, but are not limited to, chips, arrays, microtiter plates, cell culture plates, dishes, films, beads, and the like.

本明細書において使用される 「支持体」 は、 生体分子のような物質を固定す ることができる材料 （m a t e r i a 1 ) をいう。 支持体の材料としては、 共 有結合かまたは非共有結合のいずれかで、 本発明において使用される生体分子 のような物質に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように 誘導体ィ匕され得る、 任意の固体材料が挙げられる。  As used herein, “support” refers to a material (materia1) that can immobilize a substance such as a biomolecule. The material of the support may have the property of binding to a substance such as a biomolecule used in the present invention, either covalently or non-covalently, or a derivative having such property. Any solid material that can be ridden is included.

支持体として使用するためのそのような材料としては、 固体表面を形成し得 る任意の材料が使用され得るが、 例えば、 ガラス、 シリカ、 シリコン、 セラミ ック、 二酸化珪素、 プラスチック、 金属 （合金も含まれる）、 天然および合成の ポリマー （例えば、 ポリ.スチレン、 セルロース、 キドサン、 デキストラン、 お よびナイロン） などが挙げられるがそれらに限定されない。 支持体は、 複数の 異なる材料の層から形成されていてもよい。 例えば、 ガラス、 石英ガラス、 ァ ルミナ、 サファイア、 フオルステライ ト、 酸化珪素、 炭化珪素、 窒化珪素など の無機絶縁材料を使用することができる。 ポリエチレン、 エチレン、 ポリプロ ピレン、 ポリイソブチレン、 ポリエチレンテレフタレート、 不飽和ポリエステ ル、 含フッ素樹脂、 ポリ塩化ビュル、 ポリ塩化ビニリデン、 ポリ酢酸ビュル、 ポリビニルアルコール、 ポリビュルァセタール、 ァクリル樹脂、 ポリアクリロ 二トリル、 ポリスチレン、 ァセタール樹脂、 ポリカーボネート、 ポリアミ ド、 フエノール樹脂、 ユリア樹脂、 エポキシ樹脂、 メラミン樹脂、 スチレン 'ァク リロ二トリル共重合体、 アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、 シリ コーン樹脂、 ポリフエ二レンオキサイド、 ポリスルホンなどの有機材料を用い ることができる。 本宪明においてはまた、 ニトロセルロース膜、 ナイロン膜、 P V D F膜など、 ブロッテイングに使用される膜を用いることもできる。 支持 体を構成する材料が固相である場合、 本明細書において特に 「固相支持体」 と レヽう。 本明細書において、 プレート、 マイクロウェルプレート、 チップ、 スラ イドグラス、 フィルム、 ビーズ、 金属 （表面） などの形態をとり得る。 支持体 はコーティングされていてもよく、 コーティングされていなくてもよい。 For such a material for use as a support, any material capable of forming a solid surface may be used, for example, glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal (alloy) ), Natural and synthetic polymers (eg, polystyrene, cellulose, chidsan, dextran, and nylon), and the like. The support may be formed from a plurality of different material layers. For example, inorganic insulating materials such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon oxide, silicon carbide, and silicon nitride can be used. Polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polychlorinated vinyl, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, acryl resin, polyacrylonitrile, polystyrene , Acetal resin, polycarbonate, polyamide, phenolic resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene oxide, polysulfone, etc. Organic materials can be used. In the present description, nitrocellulose membrane, nylon membrane, A film used for blotting, such as a PVDF film, can also be used. When the material constituting the support is a solid phase, it is referred to herein as a “solid support”. In the present specification, it can take the form of a plate, a microwell plate, a chip, a slide glass, a film, a bead, a metal (surface), and the like. The support may be coated or uncoated.

本明細書において 「液相」 とは、 当該分野において通常用いられる意味と同 じ意味で用いられ、 通常、 溶液中での状態をいう。  In the present specification, the “liquid phase” is used in the same meaning as usually used in the art, and usually means a state in a solution.

本明細書において 「固相」 とは、 当該分野において用いられる意味と同じ意 味で用いられ、 通常、 固体の状態をいう。 本明細書において液体おょぴ固体を 総合して流体ということがある。  As used herein, the term “solid phase” is used in the same meaning as used in the art, and usually means a solid state. In this specification, liquids and solids are sometimes collectively referred to as fluids.

本明細書において 「接触」 とは、 2つの物質 （例えば、 組成物おょぴ細胞） が互いに相互作用するに十分に至近距離に存在することをいう。  As used herein, “contacting” refers to the fact that two substances (eg, a composition and a cell) are close enough to interact with each other.

本明細書において 「相互作用」 とは、 2つの物体について言及するとき、 そ の 2つの物体が相互に力を及ぼしあうことをいう。 そのような相互作用として は、例えば、 共有結合、 水素結合、 ファンデルワールス力、 イオン性相互作用、 非イオン性相互作用、 疎水性相互作用、 静電的相互作用など力 S挙げられるがそ れらに限定されない。 好ましくは、 相互作用は、 水素結合、 疎水性相互作用な どの生体内で生じる通常の相互作用であり得る。  As used herein, the term “interaction” when referring to two objects means that the two objects exert a force on each other. Examples of such interactions include forces S such as covalent bonds, hydrogen bonds, van der Waals forces, ionic interactions, nonionic interactions, hydrophobic interactions, and electrostatic interactions. It is not limited to them. Preferably, the interaction may be a normal interaction that occurs in vivo, such as a hydrogen bond, a hydrophobic interaction, or the like.

(基板/プレート /チップ /Ύレイ）  (Substrate / plate / chip / lay)

本明細書において使用される 「プレート」 とは、 抗体のような分子が固定さ れ得る平面状の支持体をいう。 本発明では、 プレートは、 プラスチック、 金、 銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面にもつガラス基板を基材とするこ とが好ましい。  As used herein, “plate” refers to a planar support to which molecules such as antibodies can be immobilized. In the present invention, the plate is preferably made of a glass substrate having a metal thin film containing plastic, gold, silver or aluminum on one side.

本明細書において使用される 「基板」 とは、 本発明のチップまたはアレイが 構築される材料 （好ましくは固体） をいう。 したがって、 基板はプレートの概 念に包含される。 基板の材料としては、 共有結合かまたは非共有結合のいずれ かで、 本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそ のような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。 プレートおよび基板として使用するためのそのような材料としては、 固体表 面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、 例えば、 ガラス、 シリカ、 シリ コン、 セラミック、 二酸化珪素、 プラスチック、 金属 （合金も含まれる）、 天然 および合成のポリマー （例えば、 ポリスチレン、 セルロース、 キトサン、 デキ ストラン、 およびナイロン） が挙げられるがそれらに限定されない。 基板は、 複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。 例えば、 ガラス、 石英ガラ ス、 アルミナ、 サファイア、 フオルステライト、 炭化珪素、 酸化珪素、 窒化珪 素などの無機絶縁材料を使用できる。 また、 ポリエチレン、 エチレン、 ポリプ ロピレン、 ポリイソブチレン、 ポリエチレンテレフタレート、 不飽和ポリエス テル、含フッ素樹脂、 ポリ塩化ビュル、 ポリ塩化ビニリデン、 ポリ酢酸ビニル、 ポリビニルアルコール、 ポリビニルァセタール、 ァクリル樹脂、 ポリアクリロ 二トリル、 ポリスチレン、 ァセタール樹脂、 ポリカーボネ ト、 ポリアミ ド、 フエノール樹脂、 ユリア樹脂、 エポキシ樹脂、 メラミン樹脂、 スチレン · ァク リロ-トリノレ共重合体、 アクリロニトリ^/ブタジエンスチレン共重合体、 シリ コーン樹脂、 ポリフエ二レンオキサイド、 ポリスルホン等の有機材料を用いる ことができる。 基板として好ましい材質は、 測定機器などの種々のパラメータ によって変動し、 当業者は、 上述のような種々の材料から適切なものを適宜選 択することができる。 トランスフヱクシヨンアレイのためには、 スライドグラ スが好ましい。 好ましくは、 そのような基材は、 コーティングされ得る。 As used herein, "substrate" refers to the material (preferably solid) from which the chip or array of the invention is constructed. Thus, the substrate is included in the concept of a plate. The substrate material can be either covalent or non-covalent And any solid material that has the property of binding to the biomolecules used in the present invention, or can be derivatized to have such properties. For such materials for use as plates and substrates, any material capable of forming a solid surface may be used, for example, glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, metal (alloy) ), Natural and synthetic polymers (eg, polystyrene, cellulose, chitosan, dextran, and nylon). The substrate may be formed from multiple layers of different materials. For example, inorganic insulating materials such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon carbide, silicon oxide, and silicon nitride can be used. In addition, polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylyl resin, polyacrylonitrile, Polystyrene, acetal resin, polycarbonate, polyamide, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene-acrylo-trinole copolymer, acrylonitrile / butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene Organic materials such as oxide and polysulfone can be used. A preferable material for the substrate varies depending on various parameters such as a measuring instrument, and a person skilled in the art can appropriately select an appropriate material from the various materials described above. For transfusion arrays, slide glass is preferred. Preferably, such a substrate can be coated.

本明細書において 「コーティング」 とは、 固相支持体または基板について用 いられるとき、 その固相支持体または基板の表面上にある物質の膜を形成させ ることおよぴそのような膜をいう。 コーティングは種々の目的で行われ、 例え ば、 固相支持体および基板の品質向上 （例えば、 寿命の向上、 耐酸性などの耐 環境性の向上）、 固相支持体または基板に結合されるべき物質の親和性の向上な どを目的とすることが多い。 本明細書において、 そのようなコーティングのた めの物質は、 「コーティング剤」 と呼ばれる。 そのようなコーティング剤として は、 種々の物質が用いられ得、 上述の固相支持体おょぴ基板自体に使用される 物質のほか、 D NA、 R NA、 タンパク質、脂質などの生体物質、 ポリマー （例 えば、 ポリ一 L—リジン、 MA S (松浪硝子、 岸和田、 日本から入手可能）、 疎 水性フッ素樹脂）、 シラン （A P S (例えば、 γ—ァミノプロビルシラン））、 金 属 （例えば、 金など） が使用され得るがそれらに限定されない。 そのような物 質の選択は当業者の技術範囲内にあり、 当該分野において周知の技術を用いて 場合ごとに選択することができる。 一つの好ましい実施形態では、 そのような コーティングは、 ポリ一 L—リジン、 シラン、 （例えば、 エポキシシランまたは メルカプトシラン、 A P S ( γ—ァミノプロビルシラン））、 MA S , 疎水性フ ッ素樹脂、金のような金属を用いることが有利であり得る。このような物質は、 細胞または細胞を含む物体 （例えば、 生体、 臓器など） に適合する物質を用い ることが好ましい。 ― ― As used herein, "coating", when used on a solid support or substrate, refers to the formation of a film of a substance on the surface of the solid support or substrate and the formation of such a film. Say. Coating may be performed for a variety of purposes, for example, to improve the quality of the solid support and the substrate (for example, to increase the life, to improve the environmental resistance such as acid resistance), to be bonded to the solid support or the substrate. Improve material affinity It is often for the purpose. In the present specification, such a material for coating is referred to as “coating agent”. Various materials can be used as such a coating agent. In addition to the above-mentioned materials used for the solid support and the substrate itself, biological materials such as DNA, RNA, protein, and lipid, and polymers (For example, poly-L-lysine, MAS (available from Matsunami Glass, Kishiwada, Japan), hydrophobic fluororesin), silane (APS (for example, γ-aminopropyl silane)), metal (for example, , Gold, etc.) may be used, but are not limited thereto. The selection of such materials is within the skill of the artisan and can be selected on a case-by-case basis using techniques well known in the art. In one preferred embodiment, such a coating comprises poly-L-lysine, silane, (eg, epoxy silane or mercapto silane, APS (γ-aminopropyl silane)), MA S, hydrophobic fluorine. It may be advantageous to use resins, metals such as gold. As such a substance, it is preferable to use a substance compatible with cells or an object containing cells (for example, a living body, an organ, or the like). ― ―

本明細書において 「チップ」 または 「マイクロチップ」 は、 互換可能に用い られ、 多様の機能をもち、 システムの一部となる超小型集積回路をいう。 チッ プとしては、 例えば、 D N Aチップ、 プロテインチップなどが挙げられるがそ れらに限定されない。  As used herein, “chip” or “microchip” is used interchangeably, refers to a microminiature integrated circuit that has various functions and becomes part of a system. Examples of the chip include, but are not limited to, a DNA chip and a protein chip.

本明細書において 「アレイ」 とは、 1以上 （例えば、 1 0 0 0以上） の標的 物質を含む糸且成物 （例えば、 D N A、 タンパク質、 トランスフエクト混合物） が整列されて配置されたパターンまたはパターンを有する基板 （例えば、 チッ プ） そのものをいう。 アレイの中で、 小さな基板 （例えば、 1 0 X 1 O mm上 など） 上にパターン化されているものはマイクロアレイというが、 本明細書で は、 マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。 従って、 上述の基板 より大きなものにパターン化されたものでもマイクロアレイと呼ぶことがある。 例えば、 アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望のトランス フエクト混合物のセットで構成される。 アレイは好ましくは同一のまたは異な る抗体を少なくとも 1 0 2個、 より好ましくは少なくとも 1 0 3個、 およびさら に好ましくは少なくとも 1 0 4個、 さらにより好ましくは少なくとも 1 0 5個を 含む。 これらの抗体は、 好ましくは表面が 1 2 5 X 8 O mn より好ましくは 1 0 X 1 O mm上に配置される。 形式としては、 9 6ウェルマイクロタイタ一 プレート、 3 8 4ウエノレマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープ レートの大きさのものから、 スライドグラス程度の大きさのものが企図される。 固定される標的物質を含む糸且成物は、 1種類であっても複数種類であってもよ レ、。 そのような種類の数は、 1個〜スポット数までの任意の数であり得る。 例 えば、 約 1 0種類、 約 1 0 0種類、 約 5 0 0種類、 約 1 0 0 0種類の標的物質 を含む組成物が固定され得る。 As used herein, the term “array” refers to a pattern or a pattern in which threads (eg, DNA, protein, and transfect mixture) containing one or more (eg, 100 or more) target substances are arranged. It refers to the substrate (eg, chip) itself that has the pattern. Arrays that are patterned on a small substrate (eg, on a 10 × 10 mm) are referred to as microarrays, but microarrays and arrays are used interchangeably herein. Therefore, a substrate patterned larger than the above-mentioned substrate may be called a microarray. For example, the array is itself a solid phase surface or the desired transformer immobilized on a membrane. Consists of a set of effect mixtures. Array preferably comprises at least 0 two identical or different that antibody, more preferably at least 1 0 3, and at least 0 4 preferably in the further, even more preferably at least 1 0 5 a. These antibodies are preferably arranged with a surface on 125 X 8 O mn, more preferably 10 X 10 O mm. As the format, a microtiter plate such as a 96-well microtiter plate, a 384-well microtiter plate, etc., and a size similar to a slide glass are contemplated. The type of the target material containing the target substance to be immobilized may be one kind or plural kinds. The number of such types can be any number from 1 to the number of spots. For example, a composition containing about 100 kinds, about 100 kinds, about 500 kinds, about 100 kinds of target substances can be immobilized.

基板のような固相表面または膜には、 上述のように任意の数の標的物質 （例 えば、 抗体のようなタンパク質） が配置され得るが、 通常、 基板 1つあたり、 1 0 8個の生体分子まで、他の実施形態において 1 0 7個の生体分子まで、 1 0 6 個の生体分子まで、 1 0 5個の生体分子まで、 1 0 4個の生体分子まで、 1 0 3 個の生体分子まで、 または 1 0 2個の生体分子までの個の生体分子が配置され得 るが、 1 0 8個の生体分子を超える標的物質を含む糸且成物が配置されていてもよ い。 これらの場合において、 ¾板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、 標的物質を含む組成物 （例えば、 抗体のようなタンパク質） のスポットの大き さは、 単一の生体分子のサイズと同じ小さくあり得る （これは、 1一 2 n mの 桁であり得る）。 最小限の基板の面積は、 いくつかの場合において基板上の生体 分子の数によって決定される。 本発明では、 細胞への導入が企図される標的物 質を含む組成物は、 通常、 0 . 0 l mn！〜 1 O mmのスポット状に共有結合あ るいは物理的相互作用によって配列固定されている。 On a solid phase surface or film, such as a substrate, (if example embodiment, proteins such as antibodies) any number of target substances as described above but may be arranged, usually per one substrate 1, 1 0 8 to biomolecules, up to 1 0 7 biological molecules in another embodiment, 1 0 6 biological molecules, up to 1 0 5 biological molecules, up to 1 0 4 biomolecules, 1 0 3 to biological molecules, or 1 0 two but number of biomolecules to biomolecules that could be arranged, but it may also be yarns且成product has been arranged which includes a target substance more than 1 0 8 biological molecules . In these cases, the size of the plate is preferably smaller. In particular, the spot size of a composition containing a target substance (eg, a protein such as an antibody) can be as small as the size of a single biomolecule (which can be on the order of 1-2 nm) . The minimum substrate area is in some cases determined by the number of biomolecules on the substrate. In the present invention, the composition containing the target substance that is intended to be introduced into a cell is usually 0.01 lmn! The sequence is fixed by covalent bond or physical interaction in the form of a spot of 11 O mm.

アレイ上には、 生体分子の 「スポット」 が配置され得る。 本明細書において 「スポット」 とは、 標的物質を含む組成物の一定の集合をいう。 本明細書にお いて 「スポッティング」 とは、 ある標的物質を含む組成物のスポットをある基 板またはプレートに作製することをいう。 スポッティングはどのような方法で も行うことができ、 例えば、 ピペッティングなどによって達成され得、 あるい は自動装置で行うこともでき、 そのような方法は当該分野において周知である。 本明細書において使用される用語 「アドレス」 とは、 基板上のユニークな位 置をいい、 他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。 アドレス は、 そのアドレスを伴うスポッ トとの関連づけに適切であり、 そしてすぺての 各々のァドレズにおけ 存在物が他のァドレスにおける存在物から識別され得 る （例えば、光学的）、任意の形状を採り得る。了ドレスを定める形は、例えば、 円状、 楕円状、 正方形、 長方形であり得るか、 または不規則な形であり得る。 したがって、 「アドレス」 は、 抽象的な概念を示し、 「スポット」 は具体的な概 念を示すために使用され得るが、 両者を区別する必要がない場合、 本明細書に おいては、 「アドレス」 と 「スポット」 とは互換的に使用され得る。 On the array, "spots" of biomolecules may be arranged. As used herein, “spot” refers to a certain set of compositions containing a target substance. In this specification The term “spotting” refers to producing spots of a composition containing a certain target substance on a certain substrate or plate. Spotting can be performed in any manner, for example, by pipetting, or can be performed by an automated device, and such methods are well known in the art. As used herein, the term “address” refers to a unique location on a substrate that may be distinguishable from other unique locations. The address is suitable for association with the spot with that address, and any entity in each of the adrez where the entity can be distinguished from the entity in the other address (eg, optically) It can take a shape. The shape defining the dress may be, for example, circular, oval, square, rectangular, or irregular. Therefore, “address” indicates an abstract concept, and “spot” may be used to indicate a specific concept. However, when there is no need to distinguish between the two, in this specification “ "Address" and "spot" can be used interchangeably.

各々のアドレスを定めるサイズは、 とりわけ、 その基板の大きさ、 特定の基一 板上のアドレスの数、 標的物質を含む組成物の量および Ζまたは利用可能な試 薬、 微粒子のサイズぉょぴそのアレイが使用される任意の方法のために必要な 解像度の程度に依存する。 大きさは、 例えば、 1一 2 n mから数 c mの範囲で あり得るが、 そのアレイの適用に一致した任意の大きさが可能である。  The size defining each address depends, among other things, on the size of the substrate, the number of addresses on a particular substrate, the amount of the composition containing the target substance and / or the available reagents, the size of the microparticles, etc. It depends on the degree of resolution required for any method in which the array is used. The size can be, for example, in the range of 1-2 nm to several cm, but can be any size consistent with the application of the array.

' アドレスを定める空間配置おょぴ形状は、 そのマイクロアレイが使用される 特定の適用に適合するように設計される。 アドレスは、 密に配置され得、 広汎 に分散され得る力 \ または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブ グループ化され得る。 'The spatial configuration that defines the address is designed to suit the particular application for which the microarray will be used. The addresses can be closely spaced and can be widely distributed or sub-grouped into desired patterns appropriate for a particular type of analyte.

マイクロアレイについては、ゲノム機能研究プロトコール（実験医学別冊 ポ ストゲノム時代の実験講座 1 )、 ゲノム医科学とこれからのゲノム医療 （実験医 学増刊） などに広く概説されている。  Microarrays are widely reviewed in Genome Function Research Protocol (Experimental Medicine Separate Volume, Experimental Lecture in the Post-Genome Era1), Genome Medical Science and Future Genomic Medicine (Experimental Medical Science Extra Edition).

マイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、 クローンとスポ ットとの対応の管理、 データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウエアが 重要である。 そのようなソフトウェアとしては、 各種検出システムに付属のソ フトウエアが利用可能である （E rmo l a e v a Oら （1998) Na t. Ge n e t. 20 : 1 9— 23)。また、データベースのフォーマツトとしては、 例えば、 A f f yme t r i Xが提唱している GATC (g e n e t i c a n a 1 y s i s t e c hn o l o g y c o n s o r t i um) と呼 fまれる 形式が挙げられる。 Due to the vast amount of data available from microarrays, clones and sport It is important to have data analysis software to manage the correspondence with data sets and analyze data. As such software, software attached to various detection systems is available (Ermo laeva O et al. (1998) Nat. Genet. 20: 19-23). Examples of the format of the database include a format called GATC (geneticana 1 ysistec hnologyconsortium) proposed by Affyme triX.

微細加工については、 例えば、 C amp b e l l , S. A. (1 996). T h e S c i e n c e a n d E n g i n e e r i n g o f M i c r o e For microfabrication, see, for example, C amp b e l l, S.A. (1 996). T e S c i e n c e a n d E n g i n e e r i n g o f M i c r o e

1 e c t r o n i c F a r i e a t i o n, Ox f o r d Un i v e r s i t y P r e s s ； Z a u t , P • V. (1996). Mi c r om i c r o a r r a y F a b r i c a t i o n ： a P r a c t i c a l G u i d e t o S em i c o n d u c t o r P r o c e s s i n g, S em i c o n d u c t o r S e r v i c e s M a d o u , M. J · ( 1 997). F u n d a m e n t a 1 s o f Mi c r o f a b r i c a t i o n, CRC1 ectronic F arieation, Ox ford Un iversity Press; Zaut, P • V. (1996). Microm icroarray F abrication: a Practical G uideto S em iconductor P rocessing, S em iconductor S ervices M adou, M J · (1 997). F undamenta 1 sof Mi crofabrication, CRC

1 5 P r e s s ； R a i -C h o u d h r y , P. (1 997). Ha n d b o o k o f M i c r o l i t h o g r a p h y , Mi c r o m a c h i n i n g， & M i c r o f a b r i c a t i o n : Mi c r o l i t h o g r a P h yなどに記載されており 、 れらは本明細書において関連する部分 が参考として援用される。 Rais-Choudhry, P. (1997). Handbook of Microlithography, Micromachining, & Microfabrication: Microlithogra Phy, etc., which are related in this specification. Portions are incorporated for reference.

(細胞接着分子）  (Cell adhesion molecule)

本発明は、 1つめ局面では、 細胞接着分子と、 遺伝子導入試薬との組み合わ せによる驚くべき効果 （固定に加えて、 導入効率が飛躍的に上昇する） ことが 見出されたことに有用性がある。  The present invention is useful in that, in the first aspect, it has been discovered that a surprising effect (in addition to immobilization, the transduction efficiency is dramatically increased) due to the combination of a cell adhesion molecule and a gene transfer reagent. There is.

本明細書において 「細胞接着分子」 （C e l l a d h e s i o n mo 1 e c u 1 e) または 「接着分子」 とは、 互換可能に使用され、 2つ以上の細胞 の互いの接近 （細胞接着） または基質と細胞との間の接着を媒介する分子をい う。 一般には、 細胞と細胞の接着 （細胞間接着） に関する分子 （e e l 1 - c e l l a d h e s i o n mo l e c u l e) と， 細胞と細胞外マトリック スとの接着 （細胞一基質接着） に関与する分子 （c e l l— s ub s t r a t e a d h e s i o n mo l e c u l e) に分けられる。 本発明の組織片で は、 いずれの分子も有用であり、 有効に使用することができる。 従って、 本明 細書において細胞接着分子は、 細脾一基質接着の際の基質側のタンパク質を包 含するが、 本明細書では、 細胞側のタンパグ質 （例えば、 インテグリンなど） も包含され、 タンパク質以外の分子であっても、 細胞接着を媒介する限り、 本 明細書における細胞接着分子または細胞接着分子の.概念に入る。 As used herein, “cell adhesion molecule” (Celladhesion mo 1 ecu 1 e) or “adhesion molecule” is used interchangeably and refers to two or more cells. Molecules that mediate the approach of each other (cell adhesion) or the adhesion between a substrate and cells. Generally, molecules involved in cell-cell adhesion (cell-cell adhesion) (eel 1-celladhesion molecule) and molecules involved in cell-extracellular matrix adhesion (cell-substrate adhesion) (cell-substratum adhesion) mo lecule). In the tissue piece of the present invention, any molecule is useful and can be used effectively. Therefore, in the present specification, the cell adhesion molecule includes a protein on the substrate side at the time of spleen-substrate adhesion, but in the present specification, a protein on the cell side (eg, integrin) is also included, and Other molecules are included in the concept of a cell adhesion molecule or a cell adhesion molecule in the present specification as long as they mediate cell adhesion.

ある分子が細胞接着分子であるかどうかは、 生化学的定量 （SDS— PAG 法、 標識コラーゲン法） 、 免疫学的定量 （酵素抗体法、 蛍光抗体法、 免疫組織 学的検討） PDR法、 ハイブリダィゼイシヨン法などのようなアツセィにおい て陽性となることを決定することにより判定するこどができる。 このような細 胞接着分子としては、 コラーゲン （配列番号 1— 16) 、 インテグリン、 フィ ブロネクチン （配列番号 23— 24) 、 ラミニン （配列番号 1 7— 22) 、 ビ トロネクチン、フイブリノゲン、免疫グロプリンスーパーフアミリー（例えば、 CD 2, CD4、 CD8、 I CM1、 I CAM2、 VCAM1) 、 セレクチン、 力ドへリンなどが挙げられるがそれに限定されない。 このような細胞接着分子 の多くは、 細胞への接着と同時に細胞間相互作用による細胞活性化の捕助シグ ナルを細胞内に伝達する。 従って、 本発明の組織片において用いられる接着因 子としては、 そのような細胞活性化の捕助シグナルを細胞内に伝達するものが 好ましい。 細胞活性化により、 組織片としてある組織または臓器における損傷 部位に適用された後に、 そこに集合した細胞および/または組織もしくは臓器 にある細胞の増殖を促すことができるからである。 そのような補助シグナルを 細胞内に伝達することができるかどうかは、生化学的定量（ S D S— P A G法、 標識コラーゲン法） 、 免疫学的定量 （酵素抗体法、 蛍光抗体法、 免疫組織学的 検討） P D R法、 ハイブリダィゼイシヨン法というアツセィにおいて陽性とな ることを決定することにより判定することができる。 Whether a molecule is a cell adhesion molecule is determined by biochemical quantification (SDS-PAG method, labeled collagen method), immunological quantification (enzyme antibody method, fluorescent antibody method, immunohistological examination) PDR method, hybridization The determination can be made by determining a positive result in an assay such as the determination method. Such cell adhesion molecules include collagen (SEQ ID NOS: 1-16), integrins, fibronectin (SEQ ID NOs: 23-24), laminin (SEQ ID NOs: 17-22), vitronectin, fibrinogen, immunoglobulin superfamily. (E.g., CD2, CD4, CD8, ICM1, ICAM2, VCAM1), selectins, dyadherins and the like. Many of these cell adhesion molecules simultaneously transmit to the cell a signal for trapping cell activation through cell-cell interaction. Therefore, it is preferable that the adhesion factor used in the tissue piece of the present invention transmits such a signal for activating cell activation into cells. Cell activation can promote the proliferation of cells that have been applied thereto and / or cells in the tissue or organ after being applied as a piece of tissue to the site of injury in the tissue or organ. Whether such an auxiliary signal can be transmitted into cells is determined by biochemical quantification (SDS-PAG method, Labeled collagen method), immunological quantification (enzyme antibody method, fluorescent antibody method, immunohistological examination) The determination can be made by determining positive in the PDR method and the hybridization method. it can.

本明細書において 「細 ^外マトリクス」 （E CM) とは 「細胞外基質」 とも 呼ばれ、 上皮細胞、 非上皮細胞を問わず体細胞 （s o m a t i c c e l l ) の間に存在する物質をいう。 細胞外マトリクスは、 組織の支持だけでなく、 す ベての体細胞の生存に必要な内部環境の構成に関与する。 細胞外マトリタスは 一般に、 結合組織細胞から産生されるが、 一部は上皮細胞や内皮細胞のような 基底膜を保有する細胞自身からも分泌される。 線維成分とその間を満たす基質 とに大別され、 線維成分としては膠原線維および弾性線維がある。 基質の基本 構成成分はグリコサミノダリカン （酸性ムコ多糖） であり、 その大部分は非コ ラーゲン性タンパクと結合してプロテオグリカン （酸性ムコ多糖一タンパク複 合体） の高分子を形成する。 このほかに、 基底膜のラミニン、 弾性線維周囲の ミクロフイブリル—（m i c r o f i b r i 1 ) 、 線維、 細胞表面のフイブロネ- クチンなどの糖タンパクも基質に含まれる。 特殊に分化した組織でも基本構造 は同一で、 例えば硝子軟骨では軟骨芽細胞によつて特徴的に大量のプロテオグ リカンを含む軟骨基質が産生され、 骨では骨芽細胞によつて石灰沈着が起こる 骨基質が産生される。 本発明において用いられる細胞外マトリクスとしては、 例えば、 コラーゲン、エラスチン、 プロテオダリカン、 グリコサミノダリカン、 フイブロネクチン、 ラミニン、 弾性繊維、 膠原繊維などが挙げられるがそれに 限定されない。 本発明において用いられる場合、 細胞外マトリクスは、 好まし くは、 宿主の自己細胞を呼び寄せる活性を持っていることが有利である。  As used herein, the term “extracellular matrix” (ECM) is also referred to as “extracellular matrix” and refers to a substance that exists between somatic cells (somaticcell) regardless of epithelial cells or non-epithelial cells. The extracellular matrix is involved not only in the support of tissues but also in the organization of the internal environment necessary for the survival of all somatic cells. Extracellular matrices are generally produced by connective tissue cells, but some are also secreted by cells that themselves have a basement membrane, such as epithelial and endothelial cells. It is roughly divided into fibrous components and a matrix that fills the fibrous components. The fibrous components include collagen fibers and elastic fibers. The basic constituent of the substrate is glycosaminodalican (acid mucopolysaccharide), most of which binds to non-collagenous proteins to form macromolecules of proteoglycan (acid mucopolysaccharide-protein complex). In addition, the substrate also includes glycoproteins such as laminin in the basement membrane, microfibrils around the elastic fibers (microfibri1), fibers, and fibronectin on the cell surface. The basic structure is the same in specially differentiated tissues.For example, in chondroblasts, chondroblasts characteristically produce a large amount of cartilage matrix containing proteoglycan, and in bone, calcification occurs in osteoblasts. Substrate is produced. Examples of the extracellular matrix used in the present invention include, but are not limited to, collagen, elastin, proteodalican, glycosaminodalican, fibronectin, laminin, elastic fiber, collagen fiber and the like. As used in the present invention, the extracellular matrix advantageously has the activity of attracting host autologous cells.

本明細書において 「細胞接着性タンパク質」 とは、 上述のような細胞接着を 媒介する機能を有するタンパク質をいう。 従って、 本明細書において細胞接着 性タンパク質は、 細胞一基質接着の際の基質側のタンパク質を包含するが、 本 明細書では、細胞側のタンパク質（例えば、 インテグリンなど） をも包含する。 例えば、 基質側のタンパク質を吸着した基質 (ガラスやプラスチック) の上に 無血清条件下で培養細胞を播種すると， レセプターであるインテグリンが細胞 接着性タンパク質を認識し、 細胞はその基質に接着する。 細胞接着性蛋白質の 活性部位はアミノ酸レベルで解明されており、 RGD， Y I GSRなどが知ら れている （これらを、 総合して RGD配列とも呼ぶ） 。 従って、 1つの好まし い実施形態において、 本発明の組織片に含まれるタンパク質は、 RGD、 YI GSRなどの RGD配列を含むことが有利であり得る。 通常、 細胞接着性タン パク質は、 細胞外マトリッタス、 培養細胞表面、 血漿 '血清 ·各種体液に存在 する。 その生体内での機能としては， 細胞の細胞外マトリックスへの接着だけ でなく， 細胞の移動 ·増殖 ·形態調節 ·組織構築などが知られている。 細胞作 用とは別に， 血液凝固 ·補体作用の調節機能を示すタンパク質もあり、 本発明 では、 そのような機能を有するタンパク質もまた有用であり得る。 そのような 細胞接着性タンパク質としては、 例えば、 フイブロネクチン， コラーゲン， ビ トロネクチン， ラミニンなどが挙げられるがそれらに限定されない。 As used herein, the term “cell adhesion protein” refers to a protein having a function of mediating cell adhesion as described above. Therefore, in the present specification, the cell adhesive protein includes a protein on the substrate side in cell-substrate adhesion, but also includes a protein on the cell side (eg, integrin) in the present specification. For example, when cultured cells are seeded under serum-free conditions on a substrate (glass or plastic) on which the protein on the substrate side is adsorbed, the receptor integrin recognizes the cell adhesive protein and the cells adhere to the substrate. The active site of the cell adhesion protein has been elucidated at the amino acid level, and RGD, YIGSR, etc. are known (these are also collectively referred to as the RGD sequence). Thus, in one preferred embodiment, the protein contained in the tissue piece of the present invention may advantageously include an RGD sequence such as RGD, YIGSR. Normally, cell adhesive proteins are present in extracellular matrix, on the surface of cultured cells, plasma, serum, and various body fluids. Its functions in vivo include not only the adhesion of cells to the extracellular matrix, but also cell migration, proliferation, morphology control, and tissue construction. Apart from cell actions, some proteins exhibit a function of regulating blood coagulation and complement action, and proteins having such functions may also be useful in the present invention. Such cell adhesion proteins include, but are not limited to, fibronectin, collagen, vitronectin, laminin, and the like.

本明細書において 「RGD分子」 とは、 アミノ酸配列 RGD (Ar g— G 1 y— As p) またはその機能的に同一な配列を含むタンパク質分子をいう。 R GD分子は、 細胞接着性蛋白質の細胞接着活性部位のアミノ酸配列として有用 なアミノ酸配列である R G Dまたは機能的に等価な別のアミノ酸配列を含むこ とを特徴とする。 RGD配列は、 フィプロネクチンの細胞接着部位として発見 され、 その後， I型コラーゲン、 ラミニン， ビトロネクチン， フイブリノゲン， フォンヴィルブランド因子， エンククチンなど多くの細胞接着性の活性を示す 分子に E出された。 化学合成した RGDぺプチドを固相化すると細胞接着活性 を示すことから、 本発明における生体分子は、 化学合成した RGD分子であつ てもよい。 そのような RGD分子としては、 上述の天然に存在する分子のほか に、 例えば、 GRGDS Pペプチドが挙げられるがそれに限定されない。 RG D配列は細胞接着分子 （かつ、 レセプターでもある） であるインテグリン （例 えば、 フイブロネクチンのレセプター） によって認識されることから、 R G D の機能的に等価な分子は、 そのようなインテグリンを用いて相互作用を調べる ことによって同定することができる。 As used herein, the term “RGD molecule” refers to a protein molecule containing the amino acid sequence RGD (Ar g—G 1 y—Asp) or a functionally identical sequence thereof. The RGD molecule is characterized by containing RGD which is an amino acid sequence useful as an amino acid sequence of a cell adhesion active site of a cell adhesion protein, or another functionally equivalent amino acid sequence. The RGD sequence was discovered as a fibronectin cell adhesion site, and was subsequently released into a number of molecules with cell-adhesive activity, including type I collagen, laminin, vitronectin, fibrinogen, von Willebrand factor, and encectin. Since the chemically synthesized RGD peptide exhibits cell adhesion activity when immobilized, the biomolecule in the present invention may be a chemically synthesized RGD molecule. Such RGD molecules include, but are not limited to, for example, the GRGDS P peptide, in addition to the naturally occurring molecules described above. The RGD sequence is an integrin that is a cell adhesion molecule (and also a receptor) (eg, For example, functionally equivalent molecules of RGD, as recognized by the fibronectin receptor, can be identified by examining interactions with such integrins.

本明細書において 「コラーゲン」 とは、 タンパク質の一種で、 線維形成コラ 一ゲンであり 3本のポリぺプチド鎖が 3重螺旋を卷いた領域の総称であり、 細 胞生着、 増殖の足場であり、 組織骨格を形成するものをいう。 コラーゲンは、 動物の細胞外マトリクスの主成分である。 コラーゲンもまた、 R G D配列をも ち、 細胞接着活性を示すことが知られている。 コラーゲンは、 動物の全タンパ ク質中の約 2 0〜 3 0 %も含まれ、 皮膚、 腱、 軟骨などに多量に含まれること が知られている。コラーゲン分子としては、 I型〜 X I I I型が知られている。 通常、 分子一つが 3本のポリペプチド鎖からなる三重らせん構造を採り、 各鎖 は α鎖と呼ばれることが多い。 コラーゲン分子では、 1分子は 1種類の α鎖か らなっていてもよく、 別々の遺伝子にコードされた複数種の α鎖からなってい てもよい。 α鎖は、 通常、 α ΐ , ひ 2， ひ 3のように αの後に数字をつけてよ- ぴ， さらにコラーゲンの型をつけて， α 1 ( I ) などと称する。 従って、.本発 明では、 例えば、 [ α ΐ ( I ) 2 α 2 ( I ) ] ( I型コラーゲン） のような天然 に存在するコラーゲン分子のほか、 天然に存在しないような組み合わせの三量 体もまた私用され得る。 コラーゲンの一次構造の大部分は、 [G l y—X— P r o (またはヒドロキシプロリル） ] n (Xは任意のアミノ酸残基） のアミノ酸 配列からなる特徴をもつ。この構造は、 3残基周期の左卷きらせん構造をとる。 コラーゲンは通常、 特殊なアミノ酸としてヒドロキシリジンを含む。 コラーゲ ンは、糖タンパク質である力 糖はヒドロキシリジンの水酸基に結合している。 コラーゲンには、 線維状で存在し集まって膠原線維をなす線維形成コラーゲ ンまたは間質型コラーゲンという種類がある。 そのような線維形成コラーゲン には、 I型、 I I型、 I I I型、 V型、 X I型コラーゲンがあり、 本発明の好 ましい実施形態において使用される。 コラーゲンとしては、 このほかに、 短鎖 コラーゲン （V I I I型、 X型など） 、 基底膜コラーゲン （I V型など） 、 F AC I Tコラーゲン（I X型、 X I I型、 X I V型、 XV I型、 X I X型など）、 mu 1 t i p l e x i n sコラーゲン （XV型、 XV I I I型など） 、 ミクロ フィブリルコラーゲン （V I型など） 、 長鎖コラーゲン （VI I型など） 、 膜 結合型コラーゲン （X I I I型， XV I I型など） などが挙げられ、 これらは すべて本発明において使用され得る。 本明細書において 「基底膜コラーゲン」 とは、 基底膜を構成する主要なコラーゲンをいう。 In this specification, “collagen” is a type of protein, a fibrogenic collagen, and is a generic term for a region in which three polypeptide chains are wound in a triple helix, and is a scaffold for cell engraftment and proliferation. And those that form the tissue skeleton. Collagen is a major component of the extracellular matrix of animals. Collagen is also known to have an RGD sequence and exhibit cell adhesion activity. Collagen is present in about 20 to 30% of the total protein of animals, and is known to be contained in large amounts in skin, tendons, cartilage, and the like. As collagen molecules, type I to type XIII are known. Usually, each molecule has a triple helix structure composed of three polypeptide chains, and each chain is often called an α chain. In a collagen molecule, one molecule may be composed of one type of α-chain, or may be composed of a plurality of types of α-chain encoded by different genes. The α chain is usually referred to as α ひ, hi 2, hi 3, followed by a number after α-ぴ, and collagen type, α 1 (I). Accordingly, in. This onset bright, for example, [α ΐ (I) 2 α 2 (I)] In addition to naturally occurring collagen molecules present as (I type collagen), trimeric combinations that do not occur in nature The body can also be private. Most of the primary structure of collagen is characterized by an amino acid sequence of [Gly-X-Pro (or hydroxyprolyl)] n (X is any amino acid residue). This structure has a left-handed helical structure with three residues. Collagen usually contains hydroxylysine as a special amino acid. Collagen is a glycoprotein that is linked to the hydroxyl group of hydroxylysine. There is a type of collagen called fibril-forming collagen or interstitial collagen that exists in a fibrous form and assembles into collagen fibers. Such fibrogenic collagens include type I, type II, type III, type V, type XI collagen and are used in a preferred embodiment of the present invention. In addition to collagen, short chains Collagen (VIII, X, etc.), basement membrane collagen (IV, etc.), FACIT collagen (IX, XII, XIV, XVI, XIX, etc.), mu1 tiplexins collagen (XV, XV type III, microfibril collagen (type VI, etc.), long chain collagen (type VI, etc.), membrane-bound collagen (type XIII, XV type II, etc.), all of which are used in the present invention. Can be done. In the present specification, “basement membrane collagen” refers to the main collagen constituting the basement membrane.

本明細書において 「I型コラーゲン」 とは、 [α 1 (I) 2α 2 (I) ] とい う構造を有するコラーゲンであり、 α 1 (I) 鎖 2本おょぴ ο; 2 (I) 鎖のポ リペプチド鎖のへテロ 3本鎖からなり、 生体内のあらゆる糸且織に存在する組織 骨格おょぴその機能的に等価な分子をいい、 そのようなポリぺプチドのァミノ 酸配列としては、 代表的には、 G e n b a n kのァクセッション番号では、' p 02454、 p 02464が挙げられるがそれに限定されない （例えば、 配列 番号 1〜4に記載のものなど） 。 本明細書において、 I型コラーゲンの機能的 に等価な分子は、 例えば、 酵素抗体法、 E I A法という方法により同定するこ とができる。 The "type I collagen" as used herein, it is a collagen having [α 1 (I) 2 α 2 (I)] had been Let structure, alpha 1 (I) 2-chain Contact Yopi o; 2 (I ) A hetero-chain consisting of three polypeptide chains, which is present in every fibrous body in the living body. It refers to a functionally equivalent molecule of the skeleton, and the amino acid sequence of such a polypeptide. Typically, Genbank accession numbers include, but are not limited to, 'p02454, p02464 (eg, those described in SEQ ID NOs: 1-4). In the present specification, a functionally equivalent molecule of type I collagen can be identified by, for example, a method called an enzyme antibody method or an EIA method.

本明細書において 「I V型コラーゲン」 とは、 基底膜コラーゲンであり、 そ の分子は、 7 S、 NC2、 TH2、 NC 1の 4つのドメインからなっており、 N末端の 7 Sで 4分子が重合し、 C末端の NC 1で 2分子が重合することによ り、 網目状のネットワークを形成しているコラーゲンまたはその機能的に等価 な分子をいい、そのようなポリペプチドのアミノ酸配列としては、代表的には、 Ge nb a nkのァクセッション番号 p 02462、 p 08572、 U 025 20、 D 17391、 P 29400、 U04845が挙げられるがそれに限定 されない （例えば、配列番号 5〜16に記載のものなど）。本明細書において、 I V型コラーゲンの機能的に等価な分子は、 例えば、 酵素抗体法、 E IA法と いう方法により同定することができる。 (細胞） In the present specification, “type IV collagen” is a basement membrane collagen, and its molecule is composed of four domains of 7S, NC2, TH2, and NC1, and four molecules are formed at the N-terminal 7S. Collagen or a functionally equivalent molecule that forms a reticulated network by polymerizing and polymerizing two molecules at the C-terminal NC 1; the amino acid sequence of such a polypeptide is Representatively, accession numbers p02462, p08572, U02520, D17391, P29400, and U04845 of Genbank, but are not limited thereto (for example, SEQ ID NOS: 5 to 16). Stuff). In the present specification, a functionally equivalent molecule of type IV collagen can be identified by, for example, a method called an enzyme antibody method or an EIA method. (cell)

本明細書において使用される 「細胞」 は、 当該分野において用いられる最も 広義の意味と同様に定義され、 多細胞生物の糸且織の構成単位であって、 外界を 隔離する膜構造に包まれ、 内部に自己再生能を備え、 遺伝情報およびその発現 機構を有する生命体をいう。 本明細書において使用される細胞は、 天然に存在 する細胞であっても、 人工的に改変された細胞 （例えば、 融合細胞、 遺伝子改 変細胞） であってもよい。 細胞の供給源としては、 例えば、 単一の細胞培養物 であり得、 あるいは、 正常に成長したトランスジエニック動物の胚、 血液、 ま たは体 a織、 または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙 げられるがそれらに限定されない。  As used herein, “cell” is defined in the same broadest sense as used in the art, and is a constituent unit of a multicellular organism's fibrous tissue, wrapped in a membrane structure that isolates the outside world. An organism that has self-renewal capability inside and has genetic information and its expression mechanism. The cell used in the present specification may be a naturally occurring cell or an artificially modified cell (for example, a fused cell, a genetically modified cell). The source of cells can be, for example, a single cell culture or from a normally grown transgenic animal embryo, blood, or body tissue, or from a normally grown cell line. Examples include, but are not limited to, cell mixtures such as cells.

本努明で用いられる細胞は、 どの生物由来の細胞 （たとえば、 任意の種類の 単細胞生物 （例えば、 細菌、 酵母） または多細胞生物 （例えば、 動物 （たとえ ば、 脊椎動物、 無脊椎動物)、 植物 （たとえば、 単子葉植物、 双子葉植物など） など) 7 でもよい。 例えば、 脊椎動物 （たとえば、 メクラウナギ類、 ャッメゥナ ギ類、 軟骨魚類、 硬骨魚類、 両生類、 爬虫類、 鳥類、 哺乳動物など） 由来の細 胞が用いられ、 より詳細には、 哺乳動物 （例えば、 単孔類、 有袋類、 貧歯類、 皮翼類、 翼手類、 食肉類、 食虫類、長鼻類、 奇蹄類、 偶蹄類、 管歯類、 有鱗類、 海牛類、 クジラ目、 霊長類、齧歯類、 ゥサギ目など） 由来の細胞が用いられる。  Cells used in this effort may be cells from any organism (eg, unicellular organisms of any type (eg, bacteria, yeast) or multicellular organisms (eg, animals (eg, vertebrates, invertebrates), Plants (eg, monocotyledonous, dicotyledonous, etc.) may be 7. For example, from vertebrates (eg, eel, eel, cartilage, teleost, amphibians, reptiles, birds, mammals, etc.) Cells, and more particularly, mammals (eg, monotremes, marsupials, rodents, skin wings, wing-hands, carnivores, carnivores, long-nosed creatures, odd-shaped snouts) , Clovenoids, tube rodents, squamata, squids, cetaceans, cetaceans, primates, rodents, odontoptera, etc.).

1つの実施形態では、 霊長類 （たとえば、 チンパンジー、 二ホンザル、 ヒト） 由来の細胞、 特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。  In one embodiment, cells from primates (eg, chimpanzees, macaques, humans), particularly cells from humans, are used, but are not limited thereto.

本明細書において 「幹細胞」 とは、 自己複製能を有し、 多分化能 （すなわち 多能性） （「p l u r i p o t e n c y」） を有する細胞をいう。 幹細胞は通常、 組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。 本明細書では幹 細胞は、 胚性幹 （E S ) 細胞または組織幹細胞 （組織性幹細胞、 組織特異的幹 細胞または体性幹細胞ともいう） であり得るがそれらに限定されない。 また、 上述の能力を有している限り、 人工的に作製した細胞 （たとえば、 本明細書に おいて記載される融合細胞、 再プログラム化された細胞など） もまた、 幹細胞 であり得る。 胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。 胚性幹細 胞は、 1 9 8 1年に初めて樹立され、 1 9 8 9年以降ノックアウトマウス作製 にも応用されている。 1 9 9 8年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、 再生 .医学にも利用されつつある。 組織幹細胞は、 胚性幹細胞とは異なり、 分化の方 向が限定されている細胞であり、 組織中の特定の位置に存在し、 未分化な細胞 内構造をしている。 従って、 糸且織幹細胞は多能性のレベルが低い。 組織幹細胞 は、 核/細胞質比が高く、 細胞内小器官が乏しい。 糸且織幹細胞は、 概して、 多 分化能を有し、 細胞周期が遅く、 個体の一生以上に增殖能を維持する。 本明細 書において使用される場合は、 幹細胞は胚性幹細胞であっても、 組織幹細胞で あってもよい。 As used herein, the term “stem cell” refers to a cell that has self-renewal ability and has pluripotency (ie, pluripotency) (“pluripotency”). Stem cells can usually regenerate tissue when it is damaged. As used herein, a stem cell can be, but is not limited to, an embryonic stem (ES) cell or a tissue stem cell (also referred to as a tissue stem cell, a tissue-specific stem cell, or a somatic stem cell). In addition, artificially created cells (for example, as used herein, The fused cells, reprogrammed cells, etc. described in) may also be stem cells. Embryonic stem cells refer to pluripotent stem cells derived from early embryos. Embryonic stem cells were first established in 1981 and have been applied to knockout mouse production since 1989. Human embryonic stem cells were established in 1989 and are being used in regenerative medicine. Tissue stem cells, unlike embryonic stem cells, are cells in which the direction of differentiation is restricted, exist at specific locations in the tissue, and have an undifferentiated intracellular structure. Thus, fibroblast stem cells have a low level of pluripotency. Tissue stem cells have a high nuclear / cytoplasmic ratio and poor intracellular organelles. In general, fibroblast stem cells have pluripotency, have a slow cell cycle, and maintain their proliferative ability over the life of an individual. As used herein, a stem cell may be an embryonic stem cell or a tissue stem cell.

由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、 骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、 毛嚢幹細胞などが挙げられる。 消化器系の組織幹細胞どしては、 滕 （共通） 幹 細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、 間葉系幹細胞などが挙げられる。 神経系の糸且織幹細胞としては、 神経幹細胞、 網膜幹細胞などが挙げられる。  Tissue stem cells can be classified into, for example, the skin system, digestive system, myeloid system, and nervous system when classified according to the site of origin. Skin tissue tissue stem cells include epidermal stem cells and hair follicle stem cells. Tissue stem cells of the digestive system include Teng (common) stem cells and hepatic stem cells. Examples of myeloid tissue stem cells include hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells. Neural stem cells include neural stem cells and retinal stem cells.

本明細書において 「体細胞」 とは、 卵子、 精子などの生殖細胞以外の細胞で あり、 その D N Aを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。 体細胞は通 常、 多能性が限定されているかまたは消失している。 本明細書において使用さ れる体細胞は、 天然に存在するものであってもよく、 遺伝子改変されたもので あってもよレヽ。  As used herein, the term "somatic cell" refers to a cell other than a germ cell such as an egg or sperm, and refers to any cell that does not directly transfer its DNA to the next generation. Somatic cells usually have limited or lost pluripotency. The somatic cells used herein may be naturally occurring cells or genetically modified ones.

細胞は、 由来により、 外胚葉、 中胚葉および内胚葉に由来する幹細胞に分類 され得る。外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。 中胚葉由来の細胞は、 主に骨髄に存在し、 血管幹細胞、 造血幹細胞および間葉 系幹細胞などが含まれる。 内胚葉由来の細胞は主に臓器に存在し、 肝幹細胞、 薛幹細胞などが含まれる。 本明細書では、 体細胞はどのような胚葉由来でもよ い。 好ましくは、 体細胞は、 リンパ球、 脾臓細胞または精巣由来の細胞が使用 され得る。 Cells can be classified according to their origin into ectoderm, mesoderm and endoderm-derived stem cells. The cells derived from the ectoderm mainly exist in the brain, and include neural stem cells and the like. Mesodermal-derived cells are mainly present in bone marrow, and include vascular stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and the like. Endoderm-derived cells are mainly found in organs, hepatic stem cells, Xue stem cells are included. As used herein, somatic cells can be from any germ layer. Preferably, as the somatic cells, lymphocytes, spleen cells or testis-derived cells can be used.

本明細書において 「単離された」 とは、 通常の環境において天然に付随する 物質が少なくとも低減されていること、 好ましくは実質的に含まないをいう。 従って、 単離された細胞とは、 天然の環境において付随する他の物質 （たとえ ば、 他の細胞、 タンパク質、 核酸など） を実質的に含まない細胞をいう。 核酸 またはポリペプチドについていう場合、 「単離された」 とは、 たとえば、 糸且換え D NA技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含ま ず、 化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的 に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、 その核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接している （f 1 a n k i n g ) 配列 （即ち、 該核酸の 5 ' 末端および 3 ' 末端に位置する配列） を含ま ない。 "  As used herein, “isolated” refers to a substance that is naturally associated with at least a reduced amount in a normal environment, and preferably is substantially free of the substance. Thus, an isolated cell refers to a cell that is substantially free from other attendant materials (eg, other cells, proteins, nucleic acids, etc.) in the natural environment. When referring to nucleic acids or polypeptides, "isolated" means, for example, when substantially free of cellular material or culture medium when produced by recombinant DNA technology and when chemically synthesized. Refers to a nucleic acid or polypeptide that is substantially free of precursor or other chemicals. The isolated nucleic acid is preferably a sequence naturally f1 anking in the organism from which the nucleic acid is derived (ie, a sequence located at the 5 'and 3' end of the nucleic acid). Not included. "

本明細書において、 「樹立された」 または 「確立された」 細胞とは、 特定の性 質 （例えば、 多分化能） を維持し、 かつ、 細胞が培養条件下で安定に増殖し続 けるようになった状態をいう。 したがって、 樹立された幹細胞は、 多分化能を 維持する。  As used herein, an “established” or “established” cell is one that maintains a particular property (eg, pluripotency) and that can continue to proliferate stably under culture conditions. It becomes the state that became. Therefore, the established stem cells maintain pluripotency.

本明細書において 「分化 （した） 細胞」 とは、 機能おょぴ形態が特殊化した 細胞 （例えば、 筋細胞、 神経細胞など） をいい、 幹細胞とは異なり、 多能性は ないか、 またはほとんどない。 分化した細胞としては、 例えば、 表皮細胞、 膝 実質細胞、 瞵管細胞、 肝細胞、 血液細胞、 心筋細胞、 骨格筋細胞、 骨芽細胞、 骨格筋芽細胞、 神経細胞、 血管内皮細胞、 色素細胞、 平滑筋細胞、 脂肪細胞、 骨細胞、 軟骨細胞などが挙げられる。  As used herein, the term “differentiated (differentiated) cell” refers to a cell whose function and morphology is specialized (for example, a muscle cell, a nerve cell, etc.). Unlike a stem cell, it does not have pluripotency or rare. Differentiated cells include, for example, epidermal cells, knee parenchymal cells, ductal cells, hepatocytes, blood cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, osteoblasts, skeletal myoblasts, nerve cells, vascular endothelial cells, pigment cells , Smooth muscle cells, fat cells, bone cells, chondrocytes and the like.

本明細書において 「初代培養細胞」 とは、 生体から分離した細胞、 組織また は器官などを植え込み、 第 1回目の継代を行うまでの培養の状態にある細胞を いう。 したがって、それを植え継いだ「継代培養」細胞とは厳密に区別される。 通常、 初代培養細胞は、 抜いが難しく、 遺伝子操作 （例えば、 トランスフエク ション） のような外来物質の導入などを行うことがかなり困難とされている。 本明細書において 「神経細胞」 とは、 細胞体とそれから出る突起とをあわせ た神経系の構造的および機能的単位を構成する細胞またはその改変体もしくは 機能的等価物をいう。 神経細胞であるかどうかは、 神経伝達が起こるかどうか を確認することによつて判定することができる。 そのような神経細胞の機能は、 例えば、 パツチクランプ法などにより確認することができる。 神経細胞の代表 的な例として、 P C 1 2細胞が使用され得る。 P C 1 2細胞は、 副腎髄質褐色 細胞由来の細胞であるが、 その形態が神経細胞に類似することから、 神経系の モデルとして代表的な培養細胞として使用されている。 As used herein, “primary cultured cells” refers to cells that have been cultured until the first passage, in which cells, tissues, or organs, etc., isolated from a living body are implanted. Say. Thus, it is strictly distinguished from the “passaged” cells that have inherited it. Usually, primary cells are difficult to remove, and it is extremely difficult to introduce foreign substances such as genetic manipulation (eg, transfection). As used herein, the term “neural cell” refers to a cell that constitutes a structural and functional unit of the nervous system including a cell body and a projection coming out of the cell body, or a variant or a functional equivalent thereof. Whether a cell is a nerve cell can be determined by checking whether nerve transmission occurs. The function of such nerve cells can be confirmed by, for example, a patch clamp method. As a typical example of a nerve cell, PC12 cell can be used. PC12 cells, which are derived from adrenal medulla brown cells, are used as a representative cultured cell as a model of the nervous system because their morphology is similar to that of nerve cells.

本明細書「指示書」 とは、本発明の物質導入方法などを、 ユーザー （研究者、 実験捕助者、 または治療においては医師、 患者など投与を行う人など） に対し て記載したものである。 この指示書は、 -本発明の組成物などを例えば、-使用す る方法を指示する文言が記載されている。 この指示書は、 本発明が実施される 国の監督官庁が規定した様式に従って作成され、 その監督官庁により承認を受 けた旨が明記される。 指示書は、 医薬の場合通常いわゆる添付文書 （p a c k a g e i n s e r t ) の形態をとり、 または実験用試薬の形態の場合マニュ アルの形態をとり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、 電子媒体 （例えば、 インターネットで提供されるホームページ、 電子メール） のような形態でも提供され得る。  The “instructions” in the present specification describe the method of introducing the substance of the present invention to a user (a researcher, an experimental assistant, or a physician, a patient, or the like who administers the treatment in treatment). is there. This instruction includes-for example-a word indicating a method of using the composition or the like of the present invention. The instructions shall be prepared in accordance with the format prescribed by the competent authority of the country in which the invention is implemented and shall clearly indicate that they have been approved by that competent authority. The instructions are usually in the form of a so-called package insert for pharmaceuticals or in the form of manuals for laboratory reagents and are usually provided in paper form, but are not limited to, for example, It can also be provided in the form of electronic media (eg, homepages provided on the Internet, e-mail).

(好ましい実施形態の説明）  (Description of a preferred embodiment)

1つの局面において、 本発明は、 細胞の核酸導入効率を改善するための組成 物を提供する。 ここで、 組成物は、 A) 細胞接着分子；および B ) 遺伝子導入 試薬、 を含むことを特徴とする。 核酸を導入するためには、 遺伝子導入試薬の ような遺伝子導入試薬を使用してきたが、 外的因子の付加により導入効率が上 昇することは予測されておらず、 本発明により見出された細胞接着分子の効果 は驚くべきものであるといえる。 特に、 細胞を固定したときにその効率が変わ るとは予測されておらず、 むしろ、 減るとさえ考えられていた。 本発明は、 遣 伝子導入試薬と、 細胞接着分子とを組み合わせて細胞に作用させると、 核酸の 導入が予想外に向上することが判明したという効果を持つ。 本発明によって、 従来困難とされていた、 初代培養細胞、 神経細胞などで液相または固相でトラ ンスフエクションを容易に行うことが可能になった。ここで、細胞接着分子と、 遺伝子導入試薬とは、相互作用し得る状態で存在すればよい。これらの物質は、 細胞に対して同時に作用させるように構成されていても、 別々に構成されてい てもよい。 In one aspect, the present invention provides a composition for improving the nucleic acid introduction efficiency of a cell. Here, the composition is characterized by comprising: A) a cell adhesion molecule; and B) a gene transfer reagent. Although gene transfer reagents such as gene transfer reagents have been used to introduce nucleic acids, the efficiency of transfer has increased due to the addition of external factors. It is not expected to increase, and it can be said that the effect of the cell adhesion molecule found by the present invention is surprising. In particular, it was not expected that the efficiency would change when cells were fixed, but rather that they would decrease. The present invention has the effect that it has been found that when a gene transfer reagent and a cell adhesion molecule are combined and allowed to act on cells, the transfer of nucleic acid is unexpectedly improved. According to the present invention, it has become possible to easily perform transfection in a liquid phase or a solid phase on primary cultured cells, nerve cells, and the like, which has been difficult in the past. Here, the cell adhesion molecule and the gene introduction reagent may be present in a state where they can interact with each other. These substances may be configured to act on cells simultaneously, or may be configured separately.

別の局面において、 細胞の核酸導入効率を改善するためのデバイスを提供す る。 このデバイスは、 A) 細胞接着分子；および B ) 遺伝子導入試薬、 を含む、 組成物が支持体に固定されている。 このようなデバイスは、 好ましい実施形態 では、 指示書を備え得る。 ' ― - ―— 一 本発明において使用される細胞接着分子は、 好ましくは、 タンパク質形態で 提供されるが、 それに限定されない。 タンパク質は、 生体分子であり、 遺伝子 操作により製造可能であるからである。 好ましい細胞接着分子には、 細胞外マ トリタスが含まれる。 より好ましくは、 細胞接着分子は、 コラーゲン、 フイブ ロネクチンまたはラミニンを含み、 好ましいコラーゲンとしては、 繊維形成コ ラーゲン、 基底膜コラーゲンなどが挙げられるがそれに限定されない。 これら の特定のコラーゲンは複数存在してもよく、 繊維形成コラーゲンと基底膜コラ 一ゲンとが同時に含まれていてもよい。  In another aspect, the present invention provides a device for improving the nucleic acid introduction efficiency of a cell. In this device, a composition comprising A) a cell adhesion molecule; and B) a gene transfer reagent is fixed to a support. Such a device may include instructions in a preferred embodiment. '-----The cell adhesion molecule used in the present invention is preferably provided in a protein form, but is not limited thereto. This is because proteins are biomolecules and can be produced by genetic manipulation. Preferred cell adhesion molecules include extracellular matrix. More preferably, the cell adhesion molecule comprises collagen, fibronectin or laminin, and preferred collagens include, but are not limited to, fibrogenic collagen, basement membrane collagen and the like. A plurality of these specific collagens may be present, and fibril-forming collagen and basement membrane collagen may be simultaneously contained.

好ましい実施形態では、 本発明において使用される細胞接着分子は、 コラー ゲン I型または I V型を含む。 より好ましくは、 細胞接着分子は、 コラーゲン I型おょぴ I V型を含む。 コラーゲン I型は、 従来細胞接着因子としての作用 のみが知られており、 遺伝子導入試薬と組み合わせて使用したときに、 核酸の 導入効率が相乗的に上昇したことは、 格別な発見である。 また、 コラーゲンェIn a preferred embodiment, the cell adhesion molecule used in the present invention comprises collagen type I or type IV. More preferably, the cell adhesion molecule comprises collagen type I and type IV. Collagen type I has only been known to function as a cell adhesion factor, and when used in combination with a gene transfer reagent, The synergistic increase in adoption efficiency is a special finding. Also, collagen

V型が核酸導入効率を上昇させることは知られておらず、 格別な効果といえる。 また、 これらの複数のコラーゲンを組み合わせることで核酸の導入効率はさら に上昇する。 コラーゲンの種類が増加すると、 核酸の導入を容易にするポイン トが増大するからである。 It is not known that V-type increases the efficiency of nucleic acid transfer, which is a special effect. In addition, combining these multiple collagens further increases the nucleic acid introduction efficiency. This is because as the type of collagen increases, the number of points that facilitate the introduction of nucleic acids increases.

本発明において使用される細胞接着分子は、 多量体形態で存在することが好 ましい。 多量体形態で存在することによって、 細胞の固定化が安定化されるか らであり、 核酸の導入効率を飛躍的に上げるようであることが判明したからで ある。  The cell adhesion molecule used in the present invention preferably exists in a multimeric form. This is because it has been found that the presence of a multimeric form stabilizes the immobilization of cells and seems to dramatically increase the nucleic acid introduction efficiency.

好ましい実施形態において、 本発明において使用される細胞接着分子は、 三 次元構造をとる。 ここで、 「三次元構造」 とは、 少なくとも 2層以上から構成さ れ、 平面向きの構造以外にその平面とは垂直方向の分子の広がりを持つ構造を いう。 したがって、 そのような三次元構造を有することによって、 細胞は、 よ " り天然の状況に近い状態で存在することになる。 ―…  In a preferred embodiment, the cell adhesion molecule used in the present invention has a three-dimensional structure. Here, the “three-dimensional structure” refers to a structure composed of at least two or more layers and having a spreading structure of molecules in a direction perpendicular to the plane in addition to a structure oriented in a plane. Therefore, by having such a three-dimensional structure, cells will exist in a state that is more "natural".

1つの実施形態において、 本発明において使用される遺伝子導入試薬は、 力 チオン性高分子、 カチオン性脂質、 ポリアミン系試薬、 ポリイミン系試薬およ ぴリン酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも 1つの試薬を含み、 ある好ましい実施形態では、 これらの試薬は複数用いられてもよい。  In one embodiment, the gene transfer reagent used in the present invention comprises at least one reagent selected from the group consisting of a force-cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine-based reagent, a polyimine-based reagent, and calcium phosphate. In certain preferred embodiments, a plurality of these reagents may be used.

本癸明の細胞の核酸導入効率および固定化を改善するための組成物は、 導入 しょうとする外来分子を同時に含んでいてもよい。 好ましくは、 本発明の組成 物は、 導入が企図される遺伝子をコードする核酸分子を含んでいてもよい。 本発明の組成物は、 固体であっても液体であってもよい。 液体が好ましい。 操作が容易であり、 固相上への配置も容易であるからであり、 液相での効果も 確認されているからである。  The composition for improving the efficiency of nucleic acid introduction and immobilization of the cells of the present invention may simultaneously contain a foreign molecule to be introduced. Preferably, the composition of the invention may comprise a nucleic acid molecule encoding the gene to be introduced. The composition of the present invention may be solid or liquid. Liquids are preferred. This is because the operation is easy, the arrangement on the solid phase is easy, and the effect in the liquid phase has been confirmed.

本発明が対象とする細胞は、 核酸の導入が企図される細胞であれば、 どのよ うな細胞であってもよく、 通常遺伝子導入が可能な細胞であって、 そのような 細胞としては、 例えば、 P C 1 2， N e u r o 2 a , SH— SY 5 Y， NG 1 0 8— 1 5， HCN— 1 Aなどが挙げられるがそれらに限定されない。 好まし い細胞としては、 例えば、 神経細胞、 初代培養細胞などが挙げられるがそれら に限定されない。 初代培養細胞の原料はどのようなものでもかまわないが、 好 ましくは、 哺乳動物の脳 （大脳皮質、 海馬、 小脳） が挙げられるがそれらに限 定されない。 The cell targeted by the present invention may be any cell as long as it is a cell into which a nucleic acid is intended to be introduced. Examples of the cell include, but are not limited to, PC12, Neuro2a, SH—SY5Y, NG108—15, HCN—1A, and the like. Preferred cells include, but are not limited to, neural cells, primary cultured cells, and the like. The source of the primary cultured cells may be any, but preferably includes, but is not limited to, mammalian brain (cerebral cortex, hippocampus, cerebellum).

本発明において使用される細胞接着分子は、 5 Ju gZm l〜1 0 0 /x g ra 1の濃度範囲で存在することが好ましいが、 これ以下であっても遺伝子導入試 薬の導入効率を上昇させることができ、 この上限以上であっても特に問題なく 導入効率が上昇することが理解される。 上限の例示としては、 例えば、 lmg /ml、 7 5 0 μ g/m 1 , 5 0 0 μ g/m 1 s 4 0 0 μ g/ 1 200 μ g/m 1 , 2 5 0 μ g/m 1 , 2 0 0 μ g/m 1 , 1 5 0 μ g/m 1 N 1 0 0 μ g /m 9 0 μ g Zm 1、 8 0 μ g /m 1 70 μ g/m 6 0 μ ml、 5 0 μ g/m 1 , 4 0 μ g/m 1 , 30 μ g/m 1などが挙げられるが それらに限定されない。 下限の例示としては、 例えば、 7 5 g/m 1、 5 0 μ g / m 40 μ g /m 1 20 g / m 1 s 2 5 μ g /m 2 0 μ g/ ml、 1 5 i g /m 1 0 g /m 1 N S ii g/m丄、 8 Ju g//m l、 7 μ g /m Q μ gy m I ^ 5 g /m 1 N 4 μ g / m.1、 3 μ g /m 1 2 μ g/m K 1 μ g/m 1などが挙げられるがそれらに限定されない。 より好ま しい範囲としては、 20 / g/m 1〜60 μ gZm 1が挙げられる。 Cell adhesion molecules for use in the present invention, 5 J u gZm l~1 0 0 / xg it is preferably present in a concentration range of ra 1, increase the efficiency of introduction also genes guide admissions agent comprising at less than this It can be understood that the introduction efficiency can be increased without any problem even if the upper limit is exceeded. Examples of upper limits are, for example, lmg / ml, 7500 μg / m 1, 500 μg / m 1 s 400 μg / 1 200 μg / m 1, 250 μg / m 1, 200 μg / m 1, 150 μg / m 1 N 100 μg / m 90 μg Zm 1, 80 μg / m 170 μg / m 600 μm ml, 50 μg / m 1, 40 μg / m 1, 30 μg / m 1 and the like, but are not limited thereto. Examples of lower limits include, for example, 75 g / m1, 50 μg / m 40 μg / m1 20 g / m1 s25 μg / m20 μg / ml, 15 ig / m 1 0 g / m 1 N S ii g / m 丄, 8 J ug / / ml, 7 μ g / m Q μ gy m I ^ 5 g / m 1 N 4 μ g / m.1, 3 μ g / m 12 μg / m K 1 μg / m 1 and the like, but are not limited thereto. A more preferred range includes 20 / g / m1 to 60 μgZm1.

1つの実施形態では、 本発明は、 固相上での細胞への核酸導入を可能にした 点を利用する。 従来固相上遺伝子導入が困難である細胞 （たとえば、 P C 1 2 細胞などの神経系の細胞） の核酸導入を可能にしたという点で本発明は、 特筆 すべきであるといえる。 特に好ましい実施形態では、、 コラーゲンをコーティン グした固相支持体の上で細胞を核酸導入するのに本発明の組成物は使用され得 る。 別の実施形態では、 本発明は、 核酸を誘導した後、 分化誘導されるために使 用される。 従って、 好ましくは、 本発明の組成物またはキットは、 分化誘導因 子 （例えば、 神経成長因子など） を含み得る。 また、 本発明の方法は、 核酸を 導入した後に、 所望の分化を誘導する工程をさらに包含し得ることが理解され る。 In one embodiment, the invention takes advantage of the fact that it has enabled the introduction of nucleic acids into cells on a solid phase. It can be said that the present invention is particularly noteworthy in that the nucleic acid can be introduced into a cell to which gene transfer has conventionally been difficult on a solid phase (for example, cells of the nervous system such as PC12 cells). In a particularly preferred embodiment, the compositions of the invention can be used to transfect cells on a collagen-coated solid support. In another embodiment, the present invention is used for inducing differentiation after inducing nucleic acids. Therefore, preferably, the composition or kit of the present invention may contain a differentiation-inducing factor (for example, nerve growth factor or the like). It is also understood that the method of the present invention may further include a step of inducing desired differentiation after introducing the nucleic acid.

本発明において支持体が使用される場合、 本発明の細胞接着分子は支持体に コーティングされることが好ましい。 より好ましくは、 細胞接着分子は、 多層 で前記支持体にコーティングされる。 また、 支持体は、 ポリ一L—リジン、 A P S ( γ—ァミノプロビルシラン）、 MA Sでコーティングされることが好まし い。  When a support is used in the present invention, the cell adhesion molecule of the present invention is preferably coated on the support. More preferably, the cell adhesion molecule is coated on the support in multiple layers. Also, the support is preferably coated with poly-L-lysine, APS (γ-aminopropyl silane), and MAS.

本発明において支持体が使用される場合、 支持体には核酸が配置されること が好ましく、 さらに支持体に核酸 （例えば、 D NA) がアレイ状で配置される ことがより好ましい。 このようなアレイ状で支持体が構成されることによって、 ― D N Aチップなどとして使用することがでぎる。一  When a support is used in the present invention, it is preferable that the nucleic acid is arranged on the support, and it is more preferable that the nucleic acid (for example, DNA) is arranged on the support in an array. By forming the support in such an array form, it can be used as a DNA chip or the like. One

別の局面において、 本発明は、 細胞へ核酸を導入する方法を提供する。. この 方法は、 A) 細胞の遺伝子導入効率を改善するための組成物であって、 a ) 細 胞接着分子；および b ) 遺伝子導入試薬、 を含む、 組成物を、 導入が意図され る遺伝子をコードする核酸分子とともに、 該細胞に提供する工程；ならびに B ) 核酸が導入される条件に該細胞をさらす工程、 を包含する。 ここで、 本発明の 方法において使用される組成物は、 本明細書において記載されている。 このよ うな組成物を細胞に提供する方法は、 当該分野において周知の技術を用いて達 成され得る。  In another aspect, the present invention provides a method for introducing a nucleic acid into a cell. The method comprises: A) a composition for improving the efficiency of gene transfer in a cell, the composition comprising: a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent. And B) exposing the cell to conditions under which the nucleic acid is introduced. Here, the compositions used in the methods of the invention are described herein. Methods of providing such compositions to cells can be accomplished using techniques well known in the art.

本明細書において 「核酸が導入される条件」 は、 導入が意図される核酸が導 入される任意の条件を包含し、 その核酸によって変動するが、 当業者は、 その ような条件を、 核酸および細胞などの状況を考慮して決定することができる。 例えば、 核酸が D NAである場合、 そのような条件は、 p H : 6 . 0〜8 . 0 ； 温度： 3 0〜4 0 °C；塩濃度： 0 . 1〜0 . 2 M (例えば、 0 . 1 5 M) など が挙げられるがそれらに限定されない。 As used herein, the term “conditions under which a nucleic acid is introduced” includes any conditions under which a nucleic acid to be introduced is introduced and varies depending on the nucleic acid. And the situation such as cells. For example, if the nucleic acid is DNA, such conditions include : pH : 6.0-8.0; Temperature: 30 to 40 ° C; salt concentration: 0.1 to 0.2 M (for example, 0.15 M), but is not limited thereto.

1つの好ましい実施形態において、 本発明の方法は、 固相または液相で行う ことができる。 固相の場合、 細胞接着分子が細胞への固定を行うので、 固相ト ランスフエクシヨンなどの核酸固相導入が可能になる。 特に、 神経細胞、 初代 培養細胞などの従来トランスフエクシヨンなどの核酸の導入が不可能であった 細胞でも導入が可能になったことにより、 種々の分析ができるようになつた。  In one preferred embodiment, the method of the present invention can be performed in a solid or liquid phase. In the case of a solid phase, since the cell adhesion molecule fixes the cells, it is possible to introduce a solid phase nucleic acid such as a solid phase transfection. In particular, the introduction of nucleic acids, such as neurons and primary cultured cells, into which nucleic acids such as transfection had not been able to be introduced has been made possible, enabling various analyzes to be performed.

このような分析は、 従来不可能であった。 また、 液相の場合でも、 本発明の方 法は、 核酸導入効率を上昇させることがわかった。 液相の場合でも細胞接着分 子が効果を有するということは知られておらず、 その効果は驚くべきものであ つた。 Such an analysis has been impossible in the past. It was also found that the method of the present invention increases the nucleic acid introduction efficiency even in a liquid phase. It was not known that cell adhesion molecules had an effect even in the liquid phase, and the effect was surprising.

好ましい実施形態において、 本発明の方法は、 本発明の組成物と核酸 （例え ば、 D NA) とが支持体に固定されていることが好ましい。 支持体は、 どのよ うな材料であってもよいが、 好ましくは細胞と適合性である。 そのような細胞 - に適合性の材料は、 上述したとおりである。 固定されることによって、 チップ を用いた種々の因子の分析を行うことが可能となった。  In a preferred embodiment, in the method of the present invention, the composition of the present invention and a nucleic acid (for example, DNA) are preferably immobilized on a support. The support can be of any material, but is preferably compatible with the cells. Such cell-compatible materials are as described above. By being fixed, it became possible to analyze various factors using the chip.

別の実施形態において、本発明の方法はまた、本発明の組成物おょぴ核酸（例 えば、 D NA) を支持体に固定する工程をさらに包含する。  In another embodiment, the method of the present invention also further comprises the step of immobilizing the composition of the present invention and the nucleic acid (eg, DNA) to a support.

' 好ましい実施形態において、 本発明の組成物および核酸を支持体に固定する 方法としては、 例えば、 インクジェット方式、 バブルジェット （登録商標） 方 式、 手動方式などが挙げられるがそれらに限定されない。 'In a preferred embodiment, the method for immobilizing the composition and the nucleic acid of the present invention on a support includes, but is not limited to, an ink jet method, a bubble jet (registered trademark) method, a manual method, and the like.

好ましい実施形態では、 本発明は、 核酸が導入された細胞を分化誘導させる 工程を含んでいてもよい。  In a preferred embodiment, the present invention may include a step of inducing differentiation of the cell into which the nucleic acid has been introduced.

別の局面において、 本発明は、 細胞に核酸を導入するためのキットを提供す る。 このキットは、 A) a ) 細胞接着分子；および b ) 遺伝子導入試薬、 を含 む、 糸且成物；ならびに B ) 該組成物と、 所望の遺伝子をコードする核酸 （例え ば、 D N A) とともに使用する方法を記載した指示書、 とを備える。 ここで、 細胞接着分子および遺伝子導入試薬は、 本明細書において上記され、 実施例に おいて例示されるようなものである。 指示書は、 核酸と、 本発明の組成物とを どのように処理して、 核酸を導入することが実現されるかを記載している。 そ のような指示書は、 本明細書において上記されるとおり、 どのよ.うな形態であ つてもよい。 好ましい実施形態では、 本発明は、 分化誘導因子を含んでいても よい。 In another aspect, the present invention provides a kit for introducing a nucleic acid into a cell. The kit comprises a composition comprising: A) a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent; and B) the composition and a nucleic acid encoding a desired gene (eg, Instructions to describe how to use it with DNA). Here, the cell adhesion molecule and the gene transfer reagent are as described above in the present specification and exemplified in Examples. The instructions describe how to treat the nucleic acid and the composition of the present invention to achieve the introduction of the nucleic acid. Such instructions may be in any form, as described herein above. In a preferred embodiment, the present invention may include a differentiation inducing factor.

別の局面において、 a ) 細胞接着分子；および b ) 遺伝子導入試薬、 を含む、 組成物の、 細胞に核酸を導入するための使用に関する。 そのような組成物の組 成、 核酸、 細胞などの説明は上記されている。 好ましい実施形態では、 本発明 の組成物は、 分化誘導因子を含んでいてもよい。  In another aspect, the invention relates to the use of a composition comprising: a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent, for introducing a nucleic acid into a cell. Descriptions of the composition of such compositions, nucleic acids, cells, etc. are provided above. In a preferred embodiment, the composition of the present invention may contain a differentiation-inducing factor.

(細胞の分化誘導のための組成物、 方法およびキット）  (Composition, method and kit for inducing cell differentiation)

1つの局面において、 本発明は、 固相上で細胞に核酸を導入するための組成 物であって、 上記細胞は、 核酸導入後も分化誘導する能力が保持される、 組成 物を提供する。 ここで、 本発明の組成物は、 A) 細胞接着分子；および B ) 遺 伝子導入試薬、 を含む。 このような組成物を用いて核酸導入された細胞は、 核 酸導入後も分化誘導する能力を保持していた。 このような現象はこれまでに達 成されておらず、'従って、 本 明は、 従来技術から予測できなかった効果を奏 するといえる。  In one aspect, the present invention provides a composition for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase, wherein the cell retains the ability to induce differentiation even after the introduction of the nucleic acid. Here, the composition of the present invention comprises: A) a cell adhesion molecule; and B) a gene transfer reagent. Cells transfected with such a composition retain the ability to induce differentiation even after transfection of nucleic acid. Such a phenomenon has not been achieved so far, and therefore, the present invention can be said to have effects that could not be predicted from the prior art.

好ましい実施形態では、組成物自体が分化誘導因子を含んでいてもよく、別々 に提供されていてもよレ、。 分化誘導を制御する必要がある場合、 好ましくは、 分化誘導因子は、 核酸を導入するために用いられる組成物とは別々に提供され る。  In a preferred embodiment, the composition itself may contain the differentiation inducing factor, or may be provided separately. When it is necessary to control differentiation induction, preferably, the differentiation inducer is provided separately from the composition used to introduce the nucleic acid.

分化誘導因子は、 所望される分化を達成することができる限りどのような因 子を用いてもよいが、 例えば、 細胞増殖因子を挙げることができる。 細胞が神 経である場合、 用いられる分化誘導因子は、 神経成長因子 （N G F ) を含み得 る。 As the differentiation inducing factor, any factor can be used as long as the desired differentiation can be achieved, and examples thereof include a cell growth factor. If the cells are neural, the differentiation inducing factors used may include nerve growth factor (NGF) The

別の局面において、 本発明は、 固相上で細胞に核酸を導入するための方法を 提供する。 この方法は、 A) a ) 細胞接着分子；および b ) 遺伝子導入試薬、 を含む、組成物を、導入が意図される核酸とともに、上記細胞に提供する工程； ならびに B ) 核酸が導入される条件に上記細胞をさらす工程を包含する。 ここ で、 上記細胞は、 上記核酸導入後も分化誘導する能力が保持される。  In another aspect, the present invention provides a method for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase. The method comprises the steps of: providing a composition comprising: a) a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent, together with a nucleic acid intended to be transferred, to the cell; and B) conditions under which the nucleic acid is introduced. And exposing the cells to Here, the cells retain the ability to induce differentiation even after the introduction of the nucleic acid.

1つの実施形態において、 本発明の上記方法において用いられる組成物は、 分化誘導因子を含んでいてもよいし、 別々の組成物として提供されていてもよ い。  In one embodiment, the composition used in the above method of the present invention may contain a differentiation inducing factor, or may be provided as a separate composition.

好ましい実施形態において、 使用される分化誘導因子と.しては、 細胞増殖因 子 （例えば、 神経成長因子 （N G F) など） を挙げることができるがそれらに 限定されない。 このような細胞増殖因子は、 使用する細胞により変動すること が理解される。  In a preferred embodiment, the differentiation inducing factors used include, but are not limited to, cell growth factors (eg, nerve growth factor (NGF) and the like). It is understood that such cell growth factors will vary depending on the cell used.

…別め実施形態において、 本発明の方法、 上記細胞を分ィ匕誘導させる工程をさ 一一一 らに包含する。  ... In another embodiment, the method of the present invention further comprises a step of inducing the cells to separate.

別の局面において、 本発明は、 固相上で細胞に核酸を導入し、 かつ、 上記細 胞を分化誘導させるための組成物を提供する。 ここで、 この組成物は、 A) 細 胞接着分子； B ) 遺伝子導入試薬；および C) 分化誘導因子を含む。 そのよう な組成物の組成、 核酸、 細胞などの説明は上記されており、 任意に好ましい実 施形態を採用することができることが理解される。  In another aspect, the present invention provides a composition for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase and for inducing differentiation of the cell. Here, the composition comprises A) a cell adhesion molecule; B) a gene transfer reagent; and C) a differentiation-inducing factor. The description of the composition of such compositions, nucleic acids, cells, etc., is provided above and it is understood that any preferred embodiments can be employed.

別の局面において、本発明は、 固相上で細胞に核酸を導入し、 かつ、 上記細胞 を分化誘導させるためのキットを提供する。 このキットは、 A) a ) 細胞接着 分子；および b ) 遺伝子導入試薬を含む、 組成物、 ならびに B ) 分化誘導因子 を備える。そのような ,祖成物の &成、核酸、細胞などの説明は上記されており、 任意に好ましい実施形態を採用することができることが理解される。 ここで、好 ましくは、 このキットにおいて、 分化誘導因子は、 上記組成物とは別個に配置 される。 In another aspect, the present invention provides a kit for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase and inducing the cell to differentiate. The kit comprises: A) a) a cell adhesion molecule; and b) a composition comprising a gene transfer reagent; and B) a differentiation-inducing factor. Descriptions of such components, nucleic acids, cells, etc. are provided above and it is understood that any preferred embodiments may be employed. Here, preferably, in this kit, the differentiation-inducing factor is arranged separately from the above composition. Is done.

好ましい実施形態では、 本発明のキットは、 核酸導入、 分化誘導などの手順 を示した指示書を備えていてもよい。 別の局面において、本発明は、 固相上で細胞に核酸を導入し、 かつ、 上記細胞 を分化誘導させる方法を提供する。 この方法は、 A) a) 細胞接着分子；およ び ） 遺伝子導入試薬を含む、 組成物を、 導入が意図される核酸とともに、 上 記細胞に提供する;]:程；ならびに B) 核酸が導入される条件に上記細胞をさら す工程；および C) 上記細胞を分化誘導する工程、 を包含する。 そのような組 成物の組成、 核酸、 細胞などの説明は上記されており、 任意に好ましい実施形 態を採用することができることが理解される。 ここで、好ましくは、 この方法に おいて、 分化誘導は、 核酸導入とは独立して行われる。  In a preferred embodiment, the kit of the present invention may be provided with instructions indicating procedures such as nucleic acid introduction and differentiation induction. In another aspect, the present invention provides a method for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase and for inducing differentiation of the cell. The method comprises providing a composition comprising A) a) a cell adhesion molecule; and) a gene transfer reagent, together with a nucleic acid intended to be transferred, to the cell; Exposing the cells to the conditions to be introduced; and C) inducing differentiation of the cells. Descriptions of the composition, nucleic acids, cells, etc. of such compositions are provided above and it is understood that any preferred embodiments can be employed. Here, preferably, in this method, differentiation induction is performed independently of nucleic acid introduction.

(遺伝子治療）  (Gene therapy)

特定の'実施形態において、 本発明において組成物が核酸を含む場合、 その核— -' 酸に関連するポリペプチドの異常な発現および/または活性に関連した疾患ま たは障害を処置、 阻害または予防するために、 本発明の組成物が遺伝子治療の 目的で投与される。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、 被験体への投与により行われる治療をいう。 本発明のこの実施形態において、 核酸は、 それらのコードされたタンパク質を産生し、 そのタンパク質は治療効 果を媒介する。  In certain 'embodiments, where the composition comprises a nucleic acid according to the present invention, treats, inhibits or inhibits a disease or disorder associated with aberrant expression and / or activity of a polypeptide associated with its nucleic acid. To prevent this, the compositions of the invention are administered for gene therapy purposes. Gene therapy refers to therapy performed by the administration of an expressed or expressible nucleic acid to a subject. In this embodiment of the invention, the nucleic acids produce their encoded protein, which protein mediates a therapeutic effect.

当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、 本発明に従って使 用され得る。 例示的な方法は、 以下のとおりである。  Any method for gene therapy available in the art can be used according to the present invention. An exemplary method is as follows.

遺伝子治療の方法の一般的な概説については、 Go l d s p i e lら， C I i n i c a l Ph a rma c y 12 : 488— 505 (1 993) ;Wuお よび Wu， B i o t h e r a p y 3 : 87— 95 (1991) ; To l s t o s h e v , Ann. Re v. Ph a rma c o l . To x i c o l . 32 : 5 73-596 (1993)； Mu 1 1 i g a n, S c i e n c e 260 : 92 6-932 ( 1993) ；ならびに Mo r έ a nおよび An d e r s o n， An n. Re v. B i o c h em. 62 ： 191-217 (1993) ； Ma y, T I BTECH 1 1 (5) : 155— 215 (1993) を参照のこと。 遺伝子 治療において使用される一般的に公知の組換え DN A技術は、 Au s u b e 1 ら (編)， Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y, J o hn Wi l e y & S o n s， N Y ( 1993 ) ；お よぴ K r i e g l e r, Ge n e Tr a n s f e r a n d Ex p r e s s i o n, A L a b o r a t o r y Ma nu a l , S t o c k t o n P r e s s , NY (1990) に記載される。 For a general review of gene therapy methods, see Goldspiel et al., CI in Pharmaceuticals 12: 488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev , Ann. Rev. Ph a rma col. To xicol. 32: 5 73-596 (1993); Mu 11 igan, Science 260: 926-6-932 (1993); and Morέan and Anderson, Ann. Rev. Bioch em. 62: 191-217 (1993). May, TI BTECH 11 (5): 155-215 (1993). Commonly known recombinant DNA techniques used in gene therapy are described in Au sube 1 et al. (Eds.), Currrent Protocols Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, AL aboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).

本発明が医薬として使用される場合、 そのような医薬は経口的または非経口 的に投与され得る。 あるいは、 そのような医薬は、 静脈内または皮下で投与さ れ得る。 全身投与されるとき、 本発明において使用される医薬は、 発熱物質を 含まない、 薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。 そのような薬学的に 受容可能な組成物の調製は、 ； H、等張性、安定性などを考慮することにより、 当業者は、 容易に行うことができる。 本明細書において、 投与方法は、 経口投 与、 非経口投与 （例えば、 静脈内投与、 筋肉内投与、 皮下投与、 皮内投与、 粘 膜投与、 直腸内投与、 膣内投与、 患部への局所投与、 皮膚投与など） であり得 る。 そのような投与のための処方物は、 任意の製剤形態で提供され得る。 その ような製剤形態としては、 例えば、 液剤、 注射剤、 徐放剤が挙げられる。  When the present invention is used as a medicament, such a medicament can be administered orally or parenterally. Alternatively, such a medicament may be administered intravenously or subcutaneously. When administered systemically, the medicament used in the present invention may be in the form of a pyrogen-free, pharmaceutically acceptable aqueous solution. The preparation of such pharmaceutically acceptable compositions can be readily made by those skilled in the art by considering; H, isotonicity, stability, and the like. In the present specification, the administration method includes oral administration, parenteral administration (for example, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, mucosal administration, rectal administration, vaginal administration, topical administration to the affected area). Administration, dermal administration, etc.). Formulations for such administration may be provided in any formulation. Such preparation forms include, for example, liquid preparations, injections, and sustained-release preparations.

本発明の医薬は、 必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、 賦型剤また は安定化剤 （日本薬局方第 14版またはその最新版、 Rem i n g t o n' s Ph a rma c e u t i c a l S c i e n c e s, 1 8 t n E d ι t l o n, A. R. Ge nn a r o, e d . , Ma c k Pu b l i s h i n g Co mp a n y, 1 990などを参照） と、 所望の程度の純度を有する組成物とを 混合することによって、 凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され 保存され得る。 If necessary, the medicament of the present invention may contain a physiologically acceptable carrier, excipient or stabilizer (Japanese Pharmacopoeia 14th edition or its latest edition, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1). 8 tn E d ι tlon, AR Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990, etc.) and a composition having a desired degree of purity. Prepared in the form of a cake or aqueous solution Can be saved.

本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種 類、 重篤度など）、 患者の年齢、 体重、 性別、 既往歴、—細胞の形態または種類な どを考慮して、 当業者が容易に決定することができる。 本発明の処置方法を被 検体 （または患者） に対して施す頻度もまた、 使用目的、 対象疾患 （種類、 重 篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、 当業者が容易に決定することができる。 頻度としては、 例えば、 毎日一数ケ月 に 1回 （例えば、 1週間に 1回一 1ヶ月に 1回） の投与が挙げられる。 1週間 一 1ヶ月に 1回の投与を、 経過を見ながら施すことが好ましい。  The amount of the composition used in the treatment method of the present invention depends on the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.), the patient's age, weight, sex, medical history, cell morphology or type, etc. One of ordinary skill in the art can easily determine this in consideration of the above. The frequency of applying the treatment method of the present invention to a subject (or patient) also depends on the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.), the age, weight, sex, medical history, and course of treatment of the patient. One of ordinary skill in the art can easily determine this in consideration of the above. The frequency may be, for example, once every few months (eg, once a week, once a month). It is preferable to administer once a week and once a month while observing the progress.

本発明が化粧品、 食品、 農薬など別の用途で使用されるときもまた、 当局の 規定する規制を遵守しながら化粧品などを調製することができる。  When the present invention is used for other purposes such as cosmetics, foods, pesticides and the like, cosmetics and the like can be prepared while complying with the regulations prescribed by the authorities.

本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、 その全体が、 各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考と して援用される。 一  The references cited in the present specification, such as scientific literature, patents, and patent applications, are incorporated herein by reference in their entirety to the same extent as if each was specifically described. One

以上、 本発明を、 理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明レてき た。 以下に、 実施例に基づいて本発明を説明するが、 上述の説明おょぴ以下の 実施例は、 例示の目的のみに提供され、 本発明を限定する目的で提供したので はない。 従って、 本発明の範囲は、 本明細書に具体的に記載された実施形態に も実施例にも限定されず、 特許請求の範囲によってのみ限定される。 実施例  The present invention has been described with reference to preferred embodiments for easy understanding. Hereinafter, the present invention will be described based on examples. However, the following examples are provided for illustrative purposes only, and are not provided for the purpose of limiting the present invention. Accordingly, the scope of the present invention is not limited to the embodiments or examples specifically described herein, but only by the claims. Example

以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、 この発明は以下の 例に限定されるものではない。 以下の実施例において用いられる試薬、 支持体 などは、 例外を除き、 S i g m a ( S t . L o u i s , U S A, 和光純薬 （大 阪、 日本）、 松浪硝子 （岸和田、 日本） などから市販されるものを用いた。  Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples. Reagents and supports used in the following examples are commercially available from Sigma (St. Louis, USA, Wako Pure Chemical (Osaka, Japan), Matsunami Glass (Kishiwada, Japan)) and the like, with exceptions. Was used.

(実験方法） (物質および方法） (experimental method) (Substances and methods)

PC I 2細胞（ラット褐色細胞腫細胞） （ATCC、 CRL-1721)は、 37°C、 5% C02下で、 10%ゥシ血清および抗生物質 （ぺニシリンおよびストレプトマイ シン） を含有する DMEM (Du l b e c c o s mo d i f i e d E a g 1 e me d i um) 14246— 25、 Na k a l a i Te s qu e, J P N) 中で培養した。 N e u r o 2 a細胞は、 37 °C、 5 % C O 2下で、 10 % FBS (胎仔ゥシ血清） （29— 167— 54、 L o t No. 2025 F、 D a i n i p p o n Ph a rma c e u t i c a l CO., LTD., J P N) およぴ抗生物質を含有する D M E M中で培養した。 PC I 2 cells (rat pheochromocytoma cells) (ATCC, CRL-1721) is, 37 ° C, 5% C0 2 below, containing 10% © shea serum and antibiotics (penicillin and streptomycin) The cells were cultured in DMEM (Dulbeccos moderated Eag 1 e me di um) 14246-25, Nacalai Tesque, JPN). N euro 2a cells were cultured at 37 ° C and 5% CO 2 in 10% FBS (fetal bovine serum) (29-167-54, Lot No. 2025F, Dainippon Pharmaceutical CO., LTD., JPN) and DMEM containing antibiotics.

(局所トランスフエクシヨン （LT) 細胞アレイのための細胞播種） チップ （Ma t s un am i G l a s s I n d.， LTD., J PN) の 9 mm2グリッド毎に、上記細胞を含む 15 μ 1滴の培養培地を播種し、 37°C、 5 %C〇2下でインキュベートしてこの細胞を基板に接着させ、 その後、 培養培 地を添加してさらに 48時間インキュベートした。 PC— 1 2細胞おょぴ Ne u- r o 2 a細胞の細胞増殖を考慮して、 それぞれ、 4500個おょぴ 3750個 の細胞を各グリッドに播種した。 (Cell seeding for topical transflector Ekushi Yung (LT) cell array) chip (Ma ts un am i G lass I n d., LTD., J PN) for each 9 mm 2 grids, 15 including the cells μ One drop of the culture medium was inoculated and incubated at 37 ° C. under 5% C を2 to allow the cells to adhere to the substrate. Thereafter, the culture medium was added and incubated for another 48 hours. In consideration of cell proliferation of PC-12 cells and Neuro-2a cells, 4500 cells and 3750 cells were seeded on each grid, respectively.

(局所トランスフエクションのためのプロ トコル）  (Protocol for local transfection)

各細胞株に適したトランスフエクション試薬を、 いくつかのトランスフエク シヨンアツセィによって決定した。 PC 12細胞については、 トランスフエク シヨン試薬として、 リポフエクタミン 2000 (1 1 668— 019、 I n v i t r o g e n c o r p o r a t i o n、 C A)を含有する試薬を選択した。 1. 5 1の pEGFPを、 1 9 μ 1の DMEMで希釈した。 pDNAを穏ゃ かに希釈した後、 4. 5 μ 1のリポフエクタミン 2000を添カ卩し、 得られた 混合物を室温にて静置して脂質 DNA複合体を形成させた。 J e t— ΡΕ I NP 5 (101— 30、 P o l y p l u s— t r a n s f e c t i o n、 F r a n c e) については、 1. 5 μ 1の p EGFPを、 10. 5 μ 1の DMEM 2004/009568 The appropriate transfection reagent for each cell line was determined by several transfection assays. For PC12 cells, a reagent containing Lipofectamine 2000 (11668-019, Invitrogencorporation, CA) was selected as the transfusion reagent. 1.51 pEGFP was diluted in 19 μl of DMEM. After gently diluting the pDNA, 4.5 μl of Lipofectamine 2000 was added, and the resulting mixture was allowed to stand at room temperature to form a lipid DNA complex. For J et— ΡΕ I NP 5 (101-30, Polyplus—transfection, France), 1.5 μl pEGFP and 10.5 μl DMEM 2004/009568

で希釈した。 3 μ 1の 7. 5 mM J e t— P E Iポリマー （101— 30、 P o l yp l u s— t r a n s f e c t i o n^ F r a n c e) を添カロし、 得 られた混合物を室温にて静置してポリマー ZpDNA複合体を形成させた。 1 0 μ 1用ピぺットチップを用いて、 30 η 1のトランスフエクション複合体を 各ダリッドに 5回スポットし、 これをクリーンベンチで乾燥させた。 細胞を含 む 15 μ 1滴を各グリッドに播種し、 37°C、 5% C〇2下でインキュベート した後、 培養培地を添加した。 37°C、 5% C02下で細胞をさらに 48時間 インキュベートし、 その後、 蛍光を観察した。 Diluted. 3 μl of 7.5 mM Jet-PEI polymer (101-30, Polyplus-transfection ^ France) was added to the mixture, and the resulting mixture was allowed to stand at room temperature to form a polymer ZpDNA complex. Formed. Using a 10 μl pipette tip, 30 η1 of the transfection complex was spotted five times on each dalid and dried on a clean bench. Cells were seeded including 15 mu 1 drop of each grid, after incubation 37 ° C, 5% C_〇 2 below, was added the culture medium. The 37 ° C, 5% C0 2 cells under further incubated for 48 hours, followed by observing fluorescence.

(溶液相トランスフエクシヨンのためのプロトコル）  (Protocol for solution phase transfer)

P C 12細胞の溶液相トランスフエクシヨンは、 I n v i t r o g e nのリ ポフエクタミン 2000 トランスフエクション用プロトコルを用いて実施した。 トランスフヱクション溶液の表面積およぴ量を制限するために、 ガラススライ ド上に、 シリコンガスケット （表面積 10 cm2) を置いた。 次いで、 トランス フエクシヨン試薬の量を、 販売元のマニュアルに基づき計算—した。 - (ECMタンパク質によるガラススライドのコーティング） Solution phase transfection of PC 12 cells was performed using Invitrogen's protocol for Lipofectamine 2000 transfection. A silicon gasket (10 cm 2 surface area) was placed on the glass slide to limit the surface area and volume of the transfection solution. Next, the amount of the transfusion reagent was calculated based on the manual of the vendor. -(Coating of glass slide with ECM protein)

培養皿として、 TEFLON (登録商標） の薄層によって隔てられた 48個 の正方形区画 （9 mm2表面積） を有するプレーンなガラススライドおよび PL Lプレコ一トガラススライドを使用した。 フイブロネクチンのコーティングの ために、 フィプロネクチン （FN) (16042— 41、 Na k a l a i T e s q u e, J PN) ( 1 m g /m 1 ) 溶液を水で希釈した （終濃度 0. As culture dishes, plain glass slides and PLL pre-coated glass slides with 48 square sections (9 mm 2 surface area) separated by a thin layer of TEFLON® were used. For fibronectin coating, a solution of fipronectin (FN) (16042-41, Nakalai Tesque, JPN) (1 mg / m1) was diluted with water (final concentration 0.

m 1 )o 次いで、 この溶液 400 1を、 8つの正方形区画の領域を覆うよう、 ガラススライドに添加した。 室温にて 1時間インキュベートした後、 この溶液 を取り除き、 次いで、 超純水でこれらの正方形区画を 1度洗浄した。 I型コラ 一ゲンのコーティングのために、 コラーゲン一 1 (Type l- C、 新田ゼラチン株 式会社生物科学研究所） （3mgZral) を、 0. 15 M酢酸で希釈した （終濃 度 100μ §/πι1)。 次いで、 8つの正方形区画を覆うよう、 ガラススライド 上にこの溶液 400 μ Iを添加した。 室温にて 1時間ィンキュベートした後、 この溶液を取り除き、 次いで、 PB Sでこれらの正方形区画を 1度洗浄した。 I V型コラーゲンのコーティングのために、 コラーゲン一 I V (BD B i o s c i e n c e s、 CA、 354233) (550 ^ g/m 1 ) を、 0. 15M酢 酸中に希釈した （終濃度 100 μ gZm 1)。 次いで、 8つの正方形区画を覆う よう、 ガラススライド上にこの溶液 400 /z 1を添加した。 室温にて 1時間ィ ンキュペートした後、 この溶液を取り除き、 次いで、 PB Sでこれらの正方形 区画を 1度洗浄した。 m 1) o This solution 4001 was then added to a glass slide to cover the area of the eight square sections. After one hour incubation at room temperature, the solution was removed and the squares were then washed once with ultrapure water. Collagen-1 (Type 1-C, Nitta Gelatin Co., Ltd., Biological Science Research Laboratories) (3 mg Zral) was diluted with 0.15 M acetic acid for the coating of type I collagen 100μ § / πι1). Then, slide the glass slide over the eight square sections 400 μl of this solution was added above. After incubating at room temperature for 1 hour, the solution was removed and the squares were then washed once with PBS. For coating of type IV collagen, collagen-IV (BD Biosciences, CA, 354233) (550 ^ g / ml) was diluted in 0.15 M acetic acid (final concentration 100 gZm1). This solution was then added at 400 / z 1 onto a glass slide to cover the eight square sections. After incubating at room temperature for 1 hour, the solution was removed and the squares were then washed once with PBS.

(蛍光イメージング）  (Fluorescence imaging)

蛍光イメージングのために、 細胞培地を完全に取り除き、 次いで、 5%PF Aを用いて細胞を固定した。 この細胞を、 ？83で1度洗浄し、 培地成分によ るバックグラウンドの蛍光を除いた。 次いで、 アレイスキャナ （Ge n e TA C UC4 X4、 Gen om i c S o l u t i o n s I n c., MI) また は共焦点顕微鏡 （LSM510, C a r l ― ZVTs s ' Co., t ., G e r ma n y) を用いて蛍光を観察した。 さらに、 プログラム （ I ma g e Q u a n t v e r 5. 2, Mo l e c u l a r Dyn am i c s I n c., CA， USA) を用いて蛍光強度を評価した。  For fluorescence imaging, the cell culture medium was completely removed, and the cells were then fixed with 5% PFA. This cell,? Washing was performed once with 83, and background fluorescence due to the medium components was removed. Then, use an array scanner (Gene TA C UC4 X4, Genomic Solutions Inc., MI) or a confocal microscope (LSM510, Carr-ZVTs s' Co., t., Germany). And used to observe fluorescence. Furthermore, the fluorescence intensity was evaluated using a program (Image Quuan tver 5.2, Molecular Dynamics Inc., CA, USA).

(実施例 1 ：細胞形態の変化）  (Example 1: Changes in cell morphology)

細胞外マトリクス （ECM) タンパク質 （フイブロネクチン、 コラーゲン I V型、. コラーゲン I型、 ラミニン） でコーティングした培養皿において 2時間 インキュベートした後、 位相顕微鏡 （図 1A〜D) およぴ共焦点顕微鏡 （図 1 E、 F) を用いて PCI 2細胞の形態変化を観察した。観察前に、 SYTO (M o l e c u l a r P r o b e , Inc. , Eugene, OR, USA) 染色により核を 可視化した。 図 1 A〜Dに示されるように、 使用した E CMコーティングによ つて、 細胞の分布、 大きさ、 および形状は、 顕著に異なっていた。 コラーゲン I V上で培養した細胞は、 細胞の接着おょぴ伸展による扁平化に関して最も大 きな増加を示した。 核の細胞分布、 大きさ、 および形状もまた、 使用した EC Mコーティングによって顕著に異なっていた （図 1E、 図 1 F 1)。 接着した細 胞は、 周囲の形態を星形状に変化させた。 これは、 ァクチン線維の伸長おょぴ 投射領域の増大に起因する。 他の E CMタンパク質上での細胞増殖によっては、 周囲の形状はほとんど変化せず、 IV型コラーゲンの場合のような投射領域の 増大を示さなかった。 I型コラーゲン上でのみ、同様の星形状が観察されたが、 I V型コラーゲンに匹敵するほど投射領域の増加を示さなかった。 図 1 F 2は、 I V型コラーゲンを用いた場合と、 PLLを用いた場合とを、 経時的に （1時 間、 2時間、 3時間、 6時間） 観察した結果を示す。 徐々に核が拡張し、 核酸 が導入されやすい形態となっていることが示される。 After incubation for 2 hours in culture dishes coated with extracellular matrix (ECM) proteins (fibronectin, collagen type IV, collagen type I, laminin), phase microscopy (Figures 1A-D) and confocal microscopy (Figure 1) E, F) were used to observe the morphological changes of PCI 2 cells. Prior to observation, nuclei were visualized by SYTO (Molecular Probe, Inc., Eugene, OR, USA) staining. As shown in FIGS. 1A-D, the distribution, size, and shape of the cells was significantly different depending on the ECM coating used. Cells cultured on collagen IV have the greatest flattening due to cell adhesion and extension. Showed a dramatic increase. Nuclear cell distribution, size, and shape also differed significantly depending on the ECM coating used (FIGS. 1E, 1F1). The adhered cells changed the surrounding morphology into a star shape. This is due to the fact that the actin fiber elongates and the projection area increases. Cell growth on other ECM proteins showed little change in surrounding shape and did not show the increased projection area as in type IV collagen. A similar star shape was observed only on type I collagen, but did not show an increase in projected area comparable to type IV collagen. FIG. 1F2 shows the results of observations over time (1 hour, 2 hours, 3 hours, 6 hours) using type IV collagen and using PLL. This indicates that the nucleus gradually expands and the nucleic acid is easily introduced.

図 1 F 3は、 PC 12細胞について、 コラーゲン I V型おょぴフイブロネク チンを用いた場合の位相顕微鏡による観察結果（1時間および 2時間- (a))、 ならびに、 コラーゲン I V型、 フイブロネクチン、 コラーゲン I型およぴラミ ' —ニンについて観察した結果 （3時間 = (b)) を示す Γこれをもとに、 核の相対 面積をグラフ化したものを図 1 F 3 (c) に示す。 相対面積は、 全体の面積中 の核の占める面積を相対比として示した。  Figure 1 F3 shows the results of phase microscopy of PC12 cells using collagen IV type fibronectin (1 hour and 2 hours-(a)), as well as collagen type IV, fibronectin, and collagen. Figure 1F3 (c) shows the results of observations of type I and lami'-nin (3 hours = (b)). Based on this, the relative area of the nucleus is graphed. The relative area indicates the area occupied by nuclei in the total area as a relative ratio.

図 1 F 3から明らかなように、 核の相対面積が広がるほど、 トランスフエク シヨン効率が高くなることが示された。 従って、 他の E CMタンパク質を用い る場合でも、 各の相対面積が例えば、 好ましくは 0. 1を超えるものを採用す ることによって、 核酸の導入効率が上昇することが理解される。  As is clear from Fig. 1 F3, it was shown that the larger the relative area of the nucleus, the higher the transfusion efficiency. Therefore, even when other ECM proteins are used, it is understood that the nucleic acid introduction efficiency is increased by adopting one having a relative area of preferably, for example, more than 0.1.

また、 図 1Gとして、 トランスフエクシヨンチップ （スライドガラス、 PL Lコート） 上に 3mmX3mmに 3000-6000個の細胞を播種したとき の細胞接着形態を示す。  Fig. 1G shows the cell adhesion form when 3000-6000 cells were seeded at 3mm x 3mm on a transfection chip (slide glass, PLL coated).

Ne u r o 2 a細胞もまた、 同様の結果を示す。 図 1Hとして、 コラーゲン IV型 （0. 005mg/m 1 ) をコーティングした P L Lコートスライドに おける Ne u r o 2 a細胞を示す。 示されるように、 形態において顕著な変動 が示される。 Neuro 2a cells show similar results. FIG. 1H shows Neuro 2a cells on a PLL-coated slide coated with collagen type IV (0.005 mg / m 1). As shown, significant variation in morphology Is shown.

(実施例 2 ：細胞接着の経時的変化）  (Example 2: Changes over time in cell adhesion)

各々の E CM上に対する P C 1 2細胞の接着の経時変化は、 位相顕微鏡によ り得られた知見を支持するものであった。 図 2に示される通り、 最も早く、 最 も安定な接着は、 I V型コラーゲンを用いた場合に観察された。 細胞は、 3 0 分後にはすでに十分に接着しており、 観察した時間全体を通して強い接着を維 持していたようである。 I型コラーゲンに対する細胞接着は、 それよりも遅か つたが、 ほぼ同程度の安定な接着を示した。 フイブロネクチンおょぴラミニン に対する P C 1 2細胞の接着は、 時間と共に接着率が増加する傾向を示した力 コラーゲン基質の場合よりも有意に低い接着率であった。  The time course of the adhesion of PC12 cells to each ECM supported the findings obtained by phase microscopy. As shown in FIG. 2, the fastest and most stable adhesion was observed with type IV collagen. The cells were already well attached after 30 minutes and seemed to maintain strong attachment throughout the time period observed. Cell adhesion to type I collagen was slower, but showed approximately the same stable adhesion. The adhesion of PC12 cells to fibronectin hop laminin was significantly lower than that of the force collagen matrix, which showed a tendency to increase the adhesion over time.

次に、 N e u r o 2 a細胞における経時的変化を見た。 図 2 Bにおけるよう に、 細胞の固定効果は通常予想されるとおりに示された。  Next, the time-dependent changes in Neuro 2a cells were observed. As in FIG. 2B, the fixation effect of the cells was shown as normally expected.

(実施例 3 ：細胞におけるトランスフヱクション効率に対する E CMタンパ ク質の影響） — — 一 一 - · …一一  (Example 3: Effect of ECM protein on transfection efficiency in cells)

CMVプロモーター E G F P構築ベクターのトランスジエニック遺伝子発現 を、 共焦点顕微鏡を用いて蛍光細胞によって測定した。 本発明者らは、 プレー ンなガラススライドの E CMタンパク質によるコーティングの効果を、 P L L でプレコーティングした場合としなかった場合とで調査した （P C 1 2細胞、 図 3 ； N e u r o 2 a細胞、 図 2 C)。 本発明者らは、 E CMタンパク質および プレコーティングに基づく トランスフエクシヨン効果の違いを試験した。 P L Lプレコートスライドにおいて、 I V型コラ"ゲンは、 トランスフエクシヨン を、 P L Lコーティングのみの場合と比較して約 1 0 0 0倍まで増大させた。 P L Lコートスライド上でのラミニンは、 I V型コラーゲンの場合と同程度の 接着を示したが、 トランスフエクション効率はそれよりも低かった（5 0 0倍)。 I型コラーゲンに対する接着は、 I V型コラーゲンおよぴラミニンの場合より も弱かったが、 トランスフエクシヨン効率の増大は、 I V型コラーゲンの場合 と同程度であった。 フイブロネクチンに対する P C 1 2細胞接着は弱かったの で、 トランスフエクシヨンプロセス中に、 トランスフエクシヨン試薬によるダ メージによって有意な剥離を引き起した。 フイブロネクチン上になおも残存し ていた細胞は、 P L Lのみを用いた場合よりも高効率のトランスフエクシヨン を示したが、 それは無視できる程度であった。 非コーティングガラススライド 上での E CMタンパク質の効果は、 P L Lでプレコーティングした場合に観察 される効果とわずかに異なるパターンを示した。 I型コラーゲンに対する接着 およびトランスフエクション効率は、 P L Lプレコーティングの場合と比較し て増大した。 フイブロネクチン、 ラミニン、 および I V型コラーゲンは、 プレ ーンなスライド上でのトランスフエクシヨン効率に対する効果が、 P L Lプレ コーティングの場合よりも劣っていた。 このような効果は、 P L Lプレコート スライドと比較した場合、 プレーンなスライド上での、 I V型コラーゲンにつ いてはより低い接着、 I型コラーゲンについてはより高い接着により説明されTransgenic gene expression of the CMV promoter EGFP construction vector was measured by fluorescent cells using confocal microscopy. We investigated the effect of coating ECM proteins on plain glass slides with and without pre-coating with PLL (PC12 cells, FIG. 3; N euro 2a cells, (Figure 2C). We tested differences in transfusion effects based on ECM protein and pre-coating. In PLL pre-coated slides, type IV collagen increased transfection to about 100-fold compared to the case of PLL coating alone. The same degree of adhesion was observed, but the transfection efficiency was lower (500 times) .The adhesion to type I collagen was weaker than that of type IV collagen and laminin. Increased transfection efficiency is the case with type IV collagen Was about the same. Since PC12 cell adhesion to fibronectin was weak, damage by the transfection reagent caused significant detachment during the transfection process. Cells still remaining on fibronectin showed more efficient transfection than with PLL alone, but to a negligible extent. The effect of the ECM protein on uncoated glass slides showed a slightly different pattern than the effect observed when pre-coated with PLL. The adhesion and transfection efficiency to type I collagen was increased compared to the case of PLL pre-coating. Fibronectin, laminin, and type IV collagen were less effective on transfection efficiency on plain slides than with PLL pre-coating. This effect is explained by a lower adhesion for type IV collagen and a higher adhesion for type I collagen on plain slides when compared to PLL precoated slides.

—ネ辱る。' ¾調的な効果もまた考えられ得る。 ―一 一 —一-一一― - また、 図 2 Cに示されるように、 N e u r o 2 a細胞でも、 同様に、 コラー ゲン I V型および I型のトランスフエクシヨン効率の上昇効果が確認された。 次に、 コラーゲン I V型の P L Lコートおよびプレーンなスライドにおける 隔離効果を検証した。 図 3 Cに示されるように、 P L Lコーティングを行った ところ、 トランスフエクシヨンの隔離効果 （固定による効果） が顕著であった 1 プレーンなスライドでもこの効果は確認された。 —I hate you. 'A positive effect can also be considered. -1-1-1---In addition, as shown in Fig. 2C, the effect of increasing the transfection efficiency of collagen type IV and type I was also confirmed in N euro 2a cells. . Next, the sequestration effect of collagen IV on PLL-coated and plain slides was examined. As shown in Fig. 3C, when PLL coating was applied, this effect was confirmed even on 1-plane slides in which the isolation effect of transfection (effect by fixation) was remarkable.

次に、 各種 E CMを用いてコーティングのトランスフエクションに対する効 果を確認した。 その結果を図 3 A、 3 Bおよび 3 Dに示す。 コラーゲン（I型、 I V型） およぴラミニンでトランスフエクシヨン効率が上昇したことがわかつ た。 コラーゲンによる効果が P L Lおよぴプレーンで高いことが示される。 図 3 Eには、 その強度を数値化したグラフを示す。 コラーゲンの効果が顕著であ ることがより鮮明にわかる。 図 3 Fは、 図 3 Dのものの実際の細胞固定の様子 JP2004/009568 Next, the effect of the coating on transfection was confirmed using various ECMs. The results are shown in FIGS. 3A, 3B and 3D. It was found that transfusion efficiency was increased for collagen (types I and IV) and laminin. The effect of collagen is high in PLL and plain. Figure 3E shows a graph quantifying the intensity. It is clear that the effect of collagen is remarkable. Figure 3F shows the actual cell fixation of the thing in Figure 3D JP2004 / 009568

を示す。 フイブロネクチンは、 固定効果が薄いが、 コラーゲンおよびラミニン は比較的固定効果がある上に、 トランスフエクション効率上昇効果があること がわかる。 図 3Gは、 スライド表面処理の種類による各種 E CMの効果の経時 変化を示す。 このように、 コラーゲンの効果が顕著であるがどの E CMも多か れ少なかれ接着効果を有することがわかる。 Indicates. It can be seen that fibronectin has a low fixing effect, but collagen and laminin have a relatively fixing effect and an effect of increasing transfection efficiency. FIG. 3G shows the change over time of the effect of various ECMs depending on the type of slide surface treatment. Thus, it can be seen that the effect of collagen is remarkable, but all ECMs have more or less adhesive effect.

(実施例 4 ： C a 2+媒介遺伝子発現に対する E CMタンパク質の効果） C a 2 +の媒介する遺伝子発現に対する ECMタンパク質の影響に関する情報 を得るために、 PLL、 フイブロネクチン、 I型コラーゲン、 I V型コラーゲ ン上で増殖させた PC 12細胞における核周囲空間からの C a 2 +放出の変化を、 F u r a 2技術を用いて観察した （図 4)。 培養液にて 5 μ Mに希釈した Fura2-AM 中にて細胞を 37°Cにて 15分間接触させた後、 培地にて洗浄。 こ の方法により Fura2-AMを細胞内に導入した。 予備実験からのデータは、 フィ ブロネクチンコーティングした皿と比較して、 I V型コラーゲン培養皿で増殖 させた細胞において有意な C a 2+濃度の增加—を示した。 この結果は、' E CMを- 認識する細胞表面インテグリンレセプターにより誘導された、 分子変化の可能 性を示す。 これは、 細胞接着の効果を凌ぐものである。 Ca 2 +に依存する遺伝 子発現は有意に変化したが、 トランスフエクションの効果に対する適切な影響 もまた影響を与えることが考えられ得る。 To obtain information on the effect of ECM proteins on: (Example 4 C a 2+ effect of E CM protein to mediate gene expression) C a 2 + mediated gene expression, PLL, fibronectin, I collagen, IV type the change in C a 2 + release from the perinuclear space in PC 12 cells grown on collagen, was observed using an F ura 2 technology (Fig. 4). After contacting the cells at 37 ° C for 15 minutes in Fura2-AM diluted to 5 μM with the culture solution, wash with medium. Fura2-AM was introduced into cells by this method. Data from preliminary experiments showed a significant increase in Ca 2+ concentration in cells grown in collagen type IV culture dishes as compared to fibronectin coated dishes. This result indicates the potential for molecular changes induced by the cell surface integrin receptor that recognizes ECM. This goes beyond the effects of cell adhesion. Although Ca 2+ -dependent gene expression was significantly altered, appropriate effects on transfection effects could also be affected.

(実施例 5 ：種々の細胞株に対する E CMタンパク質の効果）  (Example 5: Effect of ECM protein on various cell lines)

異なる種類の細胞株における細胞接着おょぴトランスフエクシヨン効率に影 響を及ぼすたった 1つの E CMタンパク質が存在するか否か、 または各タイプ (またはクラス） の細胞に特異的な E CMタンパク質が存在するか否かを調査 するために、 本発明者らは、 種々の細胞株 （hMSC、 3T3、 He pG2、 PC 12、 N e u r o 2 a (hMS C： C a mb r e x B i o S c i e n c e Wa l k e r s v i l l e, I n c., MD, PT-2501 ； N IH3T 3-3 ： R I KEN Ce l l B a nk, J PN RCB 0150 ； He p G 2 ： R I KEN Ce l l B a nk, J P N、 R C B 1648 ; P C 12 : ATCC, CRL-1721； N e U r o 2 a ： ATCC、 CCL-131) に対するフイブロネク チン、 I型コラーゲン、 I V型コラーゲン、ラミニンの効果を試験した（図 5)。 hMSC (PT- 2501, Camb r e x B i o s c i e n c e Wa 1 k e r s v i l l e, I n c .， MD) の場合、 フイブロネクチンは、 最も安定 な E CMタンパク質であることが示された。 他の E CMは、 PLLコーティン グしたスライドと比較してトランスフエクションを増大しなかった。 Whether there is only one ECM protein that affects cell adhesion and transfection efficiency in different cell types, or whether ECM proteins specific to each type (or class) of cells are present. In order to investigate the presence or absence, we examined various cell lines (hMSC, 3T3, HepG2, PC12, N euro2a (hMSC: Cambrex BioScience Walkersville). , Inc., MD, PT-2501; N IH3T 3-3: RI KEN Cell Bank, J PN RCB 0150; He p G 2: RIKEN Cell Bank, JPN, RCB 1648; PC 12: ATCC, CRL-1721; NeUro 2a: ATCC, CCL-131), fibronectin, type I collagen, type IV collagen, The effect of laminin was tested (Figure 5). In the case of hMSC (PT-2501, Cambrex Bioscience Wa 1 kersville, Inc., MD), fibronectin was shown to be the most stable ECM protein. Other ECMs did not increase transfection compared to PLL-coated slides.

(実施例 6 ： PC 12細胞のための、 局所トランスフエクシヨンアレイ） 本発明者らは、 溶液相トランスフエクションにおいて得たこれまでの知見を、 本発明者らの LTトランスフエクシヨンアレイシステムに適用し、 神経細胞株 についての高密度チップに基づく遺伝子発現スクリーニングの可能性を模索し た。 一般的に、 トランスフエクシヨンは、 トランスフエクシヨン混合物がスポ ットされた領域に局在化される。 異なる E CM上で増殖させた PC 12細胞は、 溶液相方法において観察されたものと同じ傾向を示 だ Γ Ί型コラーゲンおよ ぴ I V型コラーゲンでコーティングしたグリッドにおいて、 最大 40個のトラ ンスフエクション体が、 30η 1のトランスフエクション複合体 （約 1111の pEGFPを含む） をスポットした領域で観察された。 溶液法と比較して、 よ り多くの細胞が、 トランスフエクションプロセスを通して接着状態を維持した。 この効果は、 未処理 （プレーンともいう） スライドガラス基板、 フイブロネク チン、 PLL、 P LL +フイブロネクチンの場合にはっきりと確認でき、 溶液 法と対照的に、 最大 10個のトランスフエクシヨン体が、 1つのスポット上に 観察された。 これらの発見は、 本発明者らの局所トランスフエクシヨン法によ り、 トランスフエクシヨンプロセス時の細胞への損傷が減少し、 それによつて 細胞の生存性およびゆがみが增大することを示唆する。  Example 6: Local Transfection Array for PC 12 Cells The present inventors have applied the previous knowledge obtained in solution phase transfection to our LT transfection array system. Applying it, we explored the possibility of high-density chip-based gene expression screening for neuronal cell lines. Generally, the transcription is localized in the area where the transcription mixture was spotted. PC12 cells grown on different ECMs show the same trends as observed in the solution phase method. 最大 Up to 40 transfected cells in grids coated with type I and type IV collagen. A transfectant was observed in the area spotted with 30η1 of the transfection complex (containing about 1111 pEGFP). More cells remained adherent throughout the transfection process as compared to the solution method. This effect is clearly seen in the case of untreated (also called plain) glass slides, fibronectin, PLL, PLL + fibronectin. In contrast to the solution method, up to 10 transfection bodies can be obtained. Observed on three spots. These findings suggest that our topical transfusion method reduces cell damage during the transfection process, thereby increasing cell viability and distortion. .

· (実施例 7 ：バイオアレイへの応用） · (Example 7: Application to bioarray)

次に、 上述の本発明の効果がアレイを用いた場合でも実証されるかどうかを 確認するために規模拡大して実験を行つた。 Next, it was asked whether the effects of the present invention described above were demonstrated even when an array was used. Experiments were performed on a larger scale to confirm.

(実験プロトコル）  (Experimental protocol)

(細胞供給源、 培養培地、 および培養条件）  (Cell source, culture medium, and culture conditions)

この実施例では、 5種類の異なる細胞株を使用した： ヒト間葉系幹細胞 （h MSC、 PT— 2501、 C amb r e x B i o s c i e n c e Wa l k e r s v i 1 1 e , I n c., MD)、 ヒ ト胚性腎細胞 HE K 293 (RGB 1 637, R I KEN Ce l l B a nk, J PN)、 N IH3T3— 3 (RC B 0150N R I KEN Ce l l B a k, J PN)、 He L a (RCB 0 007、R IKEN Ce l l B a n k , J P N：)、 P C 12細胞（CRL- 1721、 ATCC)および H e p G 2 (RCB 1648、 R I KEN Ce l l B a nk, J PN) (例示細胞として妥当かどうかご教示ください）。 ヒ ト MSC細胞の場 合、 この細胞を、 市販のヒト間葉細胞基底培地 （MSCGM B u 1 1 e t K i t PT— 3001， C a mb r e B i o S c i e n c e Wa 1 k e r s v i 1 1 e, I n c., MD) 中で維持した。 ΗΈΚ2—9-3細胞、 ΝΓΗ3— T3— 3細胞、 Η e L a細胞おょぴ He ρ G 2細胞の場合、 これらの細胞を、 10% ゥシ胎仔血清 （FBS、 29— 167— 54、 Lo t No. 202 5F、 Da i n i p p o n Ph a rma c e u t i c a l C . , LTD., J PN) を有するダルベッコ改変イーグル培地 （DMEM、 L—グルタミンお ょぴピルビン酸ナトリウムを有する高グルコース （4'. 5 g/L) ； 14246 一 25、 Na k a l a i T e s q u e, J P N) 中で維持した。 全ての細胞 株を、 37。C、 5% C〇2に制御されたインキュベータ一中で培養した。 hM SCを含む実験において、 本発明者らは、 表現型の変化を回避するために、 5 継代未満の hM S Cを使用した。 In this example, five different cell lines were used: human mesenchymal stem cells (h MSC, PT-2501, Camrex Biosciences Wakersvi 11 e, Inc., MD), human embryos Sex renal cells HE K293 (RGB 1 637, RI KEN Cell Bank, J PN), N IH3T3-3 (RC B 0150 N RI KEN Cell BB, J PN), He La (RCB 0 007) , RIKEN Cell Bank, JPN :), PC12 cells (CRL-1721, ATCC) and Hep G2 (RCB1648, RIKEN Cell Bank, JPN) Please teach). In the case of a human MSC cell, this cell is transferred to a commercially available human mesenchymal cell basal medium (MSCGMBu11 etKit PT-3001, CambreBioScience Wa1kersvi11e, In) c., MD). For ΗΈΚ2-9-3 cells, ΝΓΗ3-T3-3 cells, Ηe La cells and He ρ G 2 cells, these cells are replaced with 10% fetal serum (FBS, 29-167-54, Lot No. 202 5F, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, L-glutamine and sodium pyruvate, high glucose (4'.5 g) / L); 14246-125, maintained in Nacalai Tesque, JPN). 37 for all cell lines. C, 5% C_〇 were cultured in 2 incubator one that is controlled. In experiments involving hMSCs, we used hMSCs of less than 5 passages to avoid phenotypic changes.

(プラスミ ドおよびトランスフエクシヨン試薬）  (Plasmid and transfusion reagents)

トランスフエクシヨンの効率を評価するために、 pEGFP— N1ベクター および p.D s R e d 2— N1ベクター （カタログ番号 6085— 1、 6973 9568 To evaluate the efficiency of transfection, pEGFP—N1 vector and pDsRed2—N1 vector (Cat. # 6085-1, 6973) 9568

— 1、 BD B i o s c i e n c e s C l o n t e c , CA) を使用した。 共に遺伝子発現は、 サイトメガロウィルス （CMV) プロモーターの制御下で あった。 トランスフエクトされた細胞は、 それぞれ、 連続的に EGFPまたは D s R e d 2を発現した。 プラスミド DNAを、 E s c h e r i c h i a c o 1 i、 XL 1— b l u e株 （20024 9， S t r a t a g e n e, TX) を使用して増幅し、 そして En d o F r e e P l a s m i d K i t (En d o F r e e P l a s m i d Ma x i K i t ' 1 236 2, Q I AGE N、 CA) によって精製した。 全ての場合において、 プラスミド DNAを、 D N a s eおよび RN a s eを含まない水に溶解した。 トランスフエクシヨン試 薬は以下のようにして得た： E f f e c t e n e T r a n s f e c t i o n R e a g e n t (カタ口グ番号 301425、 Q i a g e n、 CA)、 T r a n s F a s t TM T r a n s f e c t i o n R e a g e n t (E 243 1、 P r ome g a, WI), T f x TM- 20 R e a g e n t (E 239 1、 P r ome g a、 WI)、 S u p e r F e c t T r a n s f e e t i o n R e a g e n t (30 1 30 5、 Q i a g e n N C A)、 P o l yF e c t T r a n s f e c t i o n R e a g e n t (30 1 1 0 5、 Q i a g e n、 C A)、 L i p o f e c t AM I NE 2000 R e a g e n t (1 1 6 6 8 -0 1 9、 I n v i t r o g e n c o r p o r a t i o n、 CA)、 J e t PE I (X 4) c o n e. (1 0 1— 30、 P o 1 y 1 u s— t r a n s f e c t i o n、 F r a n c e), およひ、ExG e n 500 (R05 1 1, F e r me n t a s I n c., MD)。 — 1, BD Biosciences Clontec, CA) was used. In both cases, gene expression was under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter. The transfected cells continuously expressed EGFP or DsRed2, respectively. Plasmid DNA was amplified using the Escherichiaco 1 i, XL 1—blue strain (200249, Stratagene, TX) and the En do Free Plasmid Kit '1 236 2, QI AGEN, CA). In all cases, plasmid DNA was dissolved in water free of DNase and RNase. Transfection reagent was obtained as follows: Effect Fran Transfection Reagent (catalog no. 301425, Qiagen, CA), Tran Fast Fran Transfection Reagent (E 2431, Prome) ga, WI), T fx TM- 20 R eagent (E 239 1, P r ome ga, WI), S uper F ect T ransfeetion R eagent (30 1 30 5, Q iagen N CA), P ol yF ect T ransfection R eagent (30 11 05, Qiagen, CA), Lipofect AM I NE 2000 R eagent (1 16 6 8 -0 19, Invitrogencorporation, CA), J et PE I (X 4) con e. (10 1-30, Po 1 y 1 us—transfection, France), and ExGen 500 (R05 1 1, Fermentas Inc., MD).

(固相系トランスフエクシヨンアレイ （S PTA) 生成）  (Formation of solid phase transfer array (SPTA))

プロトコルの詳細は、 ウェブサイト h t t p ： // s t a f f a. w i . m i t . e d M/ s a b a t i n i一 u b 1 i c/r e v e r s e一 t r a n s f e c t i o n. h t m の 「R e v e r s e T r a n s f e c t i o n Home p a g eJ に記載されていた。 本発明者らの固相系トランスフヱ クシヨン （SPTA方法） において、 疎水性フッ素樹脂コーティングによって 分離した 48平方パターン （3mmX3mm) を有する 3つの型のスライ ドガ ラス （シラン処理したスライドガラス； AP Sスライド、 およびポリ一 Lーリ ジンでコーティングしたスライドガラス； PLLスライド、 および MASでコ 一ティングしたスライド； Ma t s u n a m i G l a s s I n d., LTD., J PN) を研究した。 Details of the protocol were described on the website http: // staff a. Wi. Mit. Ed M / sabatini-ub 1 ic / reverse-transfection n. Htm "Reverse Transcription Home page eJ. Solid phase transfer Three types of slide glass (silanized glass slides; APS slides and poly-L-resin) with 48 square patterns (3mm x 3mm) separated by a hydrophobic fluoropolymer coating in xylon (SPTA method) Glass slides; PLL slides; and slides coated with MAS;

(プラスミド DNAプリンティング溶液の調製）  (Preparation of plasmid DNA printing solution)

S PTAを生成するための 2つの異なる方法を開発した。 その主な違いは、 プラスミ ド DNAプリンティング溶液の調製にある。  Two different methods for generating SPTA have been developed. The main difference lies in the preparation of the plasmid DNA printing solution.

(方法 A)  (Method A)

E f f e c t e n e Tr a n s f e c t i o n Re a g e n tを使用す る場合、 プリンティング溶液は、 プラスミ ド DN Aおよび細胞接着分子 （4m gZmLの濃度で超純水に溶解したコラーゲン I型、 コラーゲン I V型、 ラミ 二ン、 ゥシ血漿フイブロネクチン （カタ-口グ番号 16ひ 42一 4— Ϊ、 - N—a Έ a― 1 a i Te s qu e、 J PN) を含んだ。 上記の溶液を、 インクジェットプ リンタ （ s y n QUADTM, C a r t e s i a n Te c hn o l o g i e s， I n c., C A) を用いてか、 または手動で 0. 5〜10 μ Lチップを用い て、 スライドの表面に適用した。 このプリントしたスライ ドガラスを安全キヤ ビネットの内側で室温にて 15分間かけて乾燥させた。 トランスフエクシヨン の前に、 総 Ε ί ί e c t e n e試薬を、 DNAプリントしたスライドガラス上 に静かに注ぎ、 そして室温にて 15分間インキュベートした。 過剰の E f f e c t e n e溶液を、 吸引ァスピレーターを用いてスライドガラスから除去し、 そして安全キャビネットの内側で室温にて 15分間かけて乾燥させた。 得られ た DNAプリントしたスライドガラスを、 10 Omm培養ディッシュの底に置 き、 そして約 25 m Lの細胞懸濁液 （ 2〜4 X 104細胞 ZmL) を、 このディ ッシュに静かに注いだ。 次いで、 このディッシュを 37°C、 5% C〇2のイン キュベータ一に移し、 2〜 3日間インキュベートした。 When using the Effectene Transfection Reagent, the printing solution consists of plasmid DNA and cell adhesion molecules (collagen type I, collagen type IV, laminin, collagen, dissolved in ultrapure water at a concentration of 4 mgZmL). Plasma fibronectin (catalog No. 16-42- 4-—, -N-aΈ a-1 ai Tesque, JPN) The above solution was applied to an inkjet printer (syn QUADTM, Cartesian). The printed slide glass was applied to the surface of the slide using either a technologies, Inc., CA) or manually using a 0.5-10 μL tip. Dry at room temperature for 15 minutes prior to transfection, gently pour the total ect ί ectene reagent onto DNA-printed glass slides and incubate at room temperature for 15 minutes. ffectene solution, The slides were removed from the slides using a vacuum aspirator and dried for 15 minutes at room temperature inside a safety cabinet.The resulting DNA-printed slides were placed on the bottom of a 10 Omm culture dish, and the cell suspension 25 m L (2~4 X 10 4 cells ZML), but gently poured into the di Mesh. then, in the dish 37 ° C, 5% C_〇 2 They were transferred to a cuvette and incubated for 2-3 days.

(方法 B)  (Method B)

他のトランスフエクション試薬 (T r a n s F a s t TM T f x TM- 2 0、 Sup e r F e c t、 P o l yF e c t、 L i p o f e c t AM I NE 2 000、 J e t PE I (X 4) c o n e. または ExGe n) の場合、 プラス ミ ド DNA； コラーゲン I型、 コラーゲン I V型、 ラミニンまたはフイブロネ クチン；およびトランスフ: πクシヨン試薬を、 製造業業者が配布する指示書に 示される比率に従って 1. 5 mLのマイクロチューブ中で均一に混合し、 そし てチップ上にプリンティングする前に室温にて 15分間インキュベートした。 プリンティング溶液を、 インクジェットプリンターまたは 0. 5~10 しチ ップを用いてスライドガラスの表面上に適用した。 このプリントしたスライド ガラスを、 安全キャビネットの内側で室温にて 10分間かけて完全に乾燥させ た。 プリントしたスライドガラスを 100mm培養ディッシュの底に置き、 そ して約 3 mLの細胞懸濁液 （2~4X 1 O EW ZmL)—を添加し、 安全キヤビー ネットの内側で室温にて 15分間にわたってインキュベートした。 インキュべ ーシヨン後、 新鮮な培地をこのディッシュに静かに注いだ。 次いで、 このディ ッシュを 37°C、 5% CO2のインキュベーターに移し、 2〜3日間インキュ ペートした。 インキュベーション後、本発明者らは、蛍光顕微鏡 （I X— 71、 O l ymp u s PROMARKET I NG, INC., J PN) を用いて、 増 強された蛍光タンパク質 （EFP、 EGFP、 および D s Re d 2) の発現に 基づいてトランスフヱクト体を観察した。 位相差画像を同じ顕微鏡を用いて撮 つた。 両プロトコルにおいて、 細胞をパラホルムアルデヒ ド （PFA) 固定方 法 （PBS中の 4% PFA、 処理時間は、 室温にて 10分間） を用いること によって固定した。 Other transfection reagents (Trans FastTM TfxTM-20, SuperFect, PolyFect, Lipofect AM I NE 2000, Jet PE I (X4) con e. Or ExGe In case n), plasmid DNA; collagen type I, collagen type IV, laminin or fibronectin; and transfection reagent: 1.5 μl of micropigmentation reagent according to the ratio indicated in the instructions distributed by the manufacturer. Mix well in tube and incubate for 15 minutes at room temperature before printing on the chip. The printing solution was applied on the surface of the glass slide using an inkjet printer or a 0.5 to 10 chip. The printed slides were allowed to dry completely for 10 minutes at room temperature inside a safety cabinet. Place the printed glass slide on the bottom of a 100 mm culture dish, add about 3 mL of cell suspension (2-4 X 1 O EW ZmL) —and inside a safety cabinet for 15 minutes at room temperature. Incubated. After incubation, fresh medium was gently poured into the dish. The dishes were then transferred to a 37 ° C., 5% CO 2 incubator and incubated for 2-3 days. After incubation, we used fluorescence microscopy (IX-71, Olympus PROMARKET NG, INC., JPN) to enhance the enhanced fluorescent proteins (EFP, EGFP, and DsRed). Transfectants were observed based on the expression of 2). Phase contrast images were taken using the same microscope. In both protocols, cells were fixed using the paraformaldehyde (PFA) fixation method (4% PFA in PBS, treatment time at room temperature for 10 minutes).

(レーザー走査および蛍光強度定量）  (Laser scanning and fluorescence intensity determination)

トランスフヱクシヨン効率を定量するために、 本発明者らは、 DNAマイク T/JP2004/009568 To quantify transfusion efficiency, we used a DNA microphone. T / JP2004 / 009568

ロアレイスキャナ （G e n e TAC UC 4 X4 Ge n omi c S o 1 u t i o n s I n c., MI) を使用した。 総蛍光強度 （任意の単位） を測定し た後、 表面積あたりの蛍光強度を計算した。 A low-array scanner (GeneTAC UC4X4GenomicsSoIutiosInc., MI) was used. After measuring the total fluorescence intensity (arbitrary unit), the fluorescence intensity per surface area was calculated.

(結果）  (Result)

(局所的トランスフエクシヨン）  (Local transfusion)

トランスフエクシヨンアレイチップは、 P LLコーティングされたスライ ド ゲン I V型、 ラミニンなどの細胞接着因子を含む細胞培養液をマイクロプリン トすることによって構築した。  The transfection array chip was constructed by microprinting a cell culture solution containing cell adhesion factors such as slide gene type IV and laminin coated with PLL.

種々の細胞をこの実施例において用いた。 これらの細胞は、 通常使用される 培養条件で培養した。 これらの細胞はスライドガラスに付着することから、 細 胞は、 効率よく取り込まれ、 そしてアレイ上に与えられた位置でプリントされ た DNAに対応する遺伝子を発現した。 通常のトランスフヱクシヨン方法 （例 えば、 力チ矛ン性脂質ま ほ—ガチオン性高分子媒介 'ドラ、ノスフエクシ ン と 比較すると、 本発明の方法を用いた場合のトランスフヱクシヨン効率は、 いず れも顕著に高かった。 特に、 トランスフエタトすることが困難とされていた H e pG2、 hMSCなどのような組織幹細胞、 P C 12細胞のような神経系の 細胞でも、 効率よく トランスフエタトされることが見出されたことは、 特に重 要である。 ； hMSCの場合には、 従来方法の約 40倍以上の効率上昇が見られ た。 また、 高密度アレイに必要な高い集積度も達成された （すなわち、 アレイ 上で隣接するスポット同士の間の夾雑が顕著に減っていた）。 これは、 EGFP および D s一 REDのチェック状パターンのアレイを生成することによって確 認した。 ヒト MS Cをこのアレイにおいて培養し、 実質的にすべての空間解像 度が示されるように対応する蛍光タンパク質を発現させた。 その結果ほとんど 夾雑していないことが明らかになった。 プリント混合物の個々の成分の役割に 関するこの研究に基づいて、 種々の細胞に関して、 トランスフエクシヨン効率 の最適化を行うことができる。 Various cells were used in this example. These cells were cultured under commonly used culture conditions. As these cells attached to the glass slide, the cells were efficiently taken up and expressed the gene corresponding to the printed DNA at a given location on the array. Compared with conventional transfusion methods (for example, lipophilic lipids or cation-mediated polymers), the transfusion efficiency using the method of the present invention is In particular, efficient transfection of tissue stem cells, such as HepG2 and hMSC, and nervous system cells, such as PC12 cells, which were difficult to transfat. It is particularly important that the hMSC increases efficiency by more than 40 times compared to the conventional method, and the high integration required for high-density arrays. (Ie, contaminants between adjacent spots on the array were significantly reduced), as confirmed by generating an array of checkered patterns of EGFP and Ds-RED. . The MSCs were cultured in this array and the corresponding fluorescent proteins were expressed to show virtually all spatial resolution, revealing that they were almost free of contaminants. Based on this study of the role of the individual components, the transfusion efficiency for various cells Can be optimized.

(コラーゲン I型、 コラーゲン I V型、 ラミニンなどの細胞接着因子による 局所的トランスフエクションにおける効率化）  (Efficient local transfection with cell adhesion factors such as collagen type I, collagen type IV, and laminin)

本発明者らの上述してきたデータを総合すると、 コラーゲン I型、 コラーゲ ン I V型、 ラミニンなどの細胞接着因子は、 遺伝子導入試薬の導入効率を格段 の上昇させることが明らかになった。 そのような活性としては、 種々の細胞に よって異なるが、 これらの活性は、 トランスフヱクシヨン効率の上昇に関与し ていることがわかる。 なぜなら、 液相でも固相でも同様にか、 むしろ液相の方 がトランスフエクション効率をより上昇させたからである。  When the data described above by the present inventors are combined, it has been revealed that cell adhesion factors such as collagen type I, collagen type IV, and laminin significantly increase the transfection efficiency of the gene transfer reagent. Although such activities differ depending on various cells, it is clear that these activities are involved in increasing transfusion efficiency. This is because the liquid phase increased the transfection efficiency in the liquid phase as well as in the solid phase.

(神経細胞の固相系トランスフエクシヨンアレイ）  (Solid-phase transfer array of nerve cells)

ネットワークを構築する神経細胞の能力は、 神経ネットワークを標的とする 研究にとって特に興味深いものになっている。 特に、 これらの細胞の形質転換 についての遺伝子解析は、 P C 1 2細胞などの神経細胞の多能性を制御する因 字を解明する上で、 関心力—高まっている。 ―… 一 · これを達成するために、 従来の方法は、 ウィルスベクターまたはエレクト口 ポレーションのいずれかの技術を含む。 本 明者らが開発した複合体一塩とい う系を用いることにより、 種々の細胞株 （P C 1 2細胞を含む） に対して高い トランスフエクション効率ならびに密集したァレイ中での空間的な局在の獲得 を可能にする固相系トランスフエクションが達成された。 固相系トランスフエ クシヨンの概略を、 図 7に示す。  The ability of neurons to build networks is of particular interest for research targeting neural networks. In particular, genetic analysis of the transformation of these cells is of increasing interest in elucidating the factors that control pluripotency of neurons such as PC12 cells. -To achieve this, conventional methods include either viral vector or electoporation techniques. By using the complex monosalt system developed by the present inventors, high transfection efficiency and spatial localization in dense arrays can be achieved for various cell lines (including PC12 cells). Solid-phase transfection has been achieved that allows for the acquisition of a position. Figure 7 shows an outline of the solid-phase transfection.

固相系トランスフエクシヨンにより、 インビポ遺伝子送達のために使用され 得る 「トランスフエクシヨンパッチ」 の技術的な達成ならびに P C 1 2細胞な どの神経細胞における高スループットの遺伝子機能研究のための固相系トラン スフエクシヨンアレイ （S P T A) が可能になることが判明した。  Solid-phase transfection technology enables the technical achievement of a transfection patch that can be used for in vivo gene delivery and a solid-phase system for high-throughput gene function studies in neural cells such as PC12 cells It has been found that a transfusion array (SPTA) is possible.

哺乳動物細胞をトランスフエクトするための多数の標準的な方法が存在する 1 遺伝物質の P C 1 2細胞、 初代培養細胞への導入については、 H E K 2 9 3、 H e L aなどの細胞株を比較して不便かつ困難であることが知られている。 従来使用されるウィルスベクター送達またはエレクトロポレーションのいずれ も重要であるが、 潜在的な毒性 （ウィルス方法)、 ゲノムスケールでの高スルー プット分析を受けにくいこと、 およびインビボ研究に対して制限された適用性 (エレクト口ポレーシヨンに関して） のような不便さが存在する。 There are a number of standard methods for transfecting mammalian cells. 1 For the introduction of genetic material into PC12 cells, primary cells, see HEK29. 3. It is known that cell lines such as HeLa are inconvenient and difficult to compare. Either traditionally used viral vector delivery or electroporation is important, but potential toxicity (viral method), low susceptibility to high-throughput analysis at the genomic scale, and limitations for in vivo studies There are inconveniences such as applicability (in terms of electorifice portation).

固相支持体に簡便に固定することができ、 かつ徐放性および細胞親和性を保 持した固相支持体固定系が開発されたことにより、 これらの欠点のほとんど克 服することができた。  Most of these shortcomings could be overcome by the development of a solid support fixation system that can be easily fixed to a solid support and that has sustained release and cell affinity. .

マイクロプリンティング技術を使用する本発明者らの技術を用いて、 選択さ れた遺伝物質、 トランスフエクシヨン試薬および適切な細胞接着分子、 ならび に塩を含む混合物を、 固体支持体上に固定化し得た。 混合物を固定化した支持 体の上での細胞培養は、 その培養細胞に対する、 混合物中の遺伝子の取り込み を可能にした。 その結果、 支持体一接着細胞における、 空間的に分離した D N Aの取り込みを可能にした。 したがって、 これにより、 ほぼ均 な条件下で細 胞を培養しつつ大量に核酸を取り込ませることができる実験形態を作製するこ とが可能となった。  Using our technique using microprinting technology, a mixture comprising the selected genetic material, the transfection reagent and the appropriate cell adhesion molecules, and salts can be immobilized on a solid support. Was. Cell culture on a support on which the mixture was immobilized allowed the incorporation of the genes in the mixture into the cultured cells. As a result, it was possible to take up the spatially separated DNA in the support-adherent cells. Accordingly, this has made it possible to produce an experimental form that allows a large amount of nucleic acid to be taken in while culturing cells under almost uniform conditions.

本実施例の結果、 いくつかの重要な効果が達成された：高いトランスフエク シヨン効率 （その結果、 統計学的に有意な細胞集団が研究され得る）、 異なる D N A分子を支持する領域間の低い相互夾雑（その結果、個々の遺伝子の効果が、 別々に研究され得る）、 トランスフエタト細胞の長期生存、 高スループットの互 換性のある形式および簡便な検出方法。 S P T Aは、 これらの基準を全て満た すことは、 さらなる研究のための適切な基盤となることになる。  As a result of this example, several important effects were achieved: high transfection efficiency (so that statistically significant cell populations could be studied), low translocation between regions supporting different DNA molecules. Mutual contamination (so that the effects of individual genes can be studied separately), long-term survival of transfetate cells, a high-throughput compatible format, and simple detection methods. SPTA's meeting all of these criteria will provide a suitable basis for further research.

これらの目的の達成を明確に確立するために、 上述のように本発明者らは、 P C 1 2細胞を、 本発明者らの方法論 （固相系でのトランスフエクシヨン） お ょぴ従来の液相系トランスフエクションの両方を用いて一連のトランスフヱク シヨン条件下で研究した。 S P T Aの場合、 相互夾雑を評価するために、 本発 明者らは、 チェック模様のパターンでガラス支持体上にプリントした赤色蛍光 タンパク質 （RFP) および緑色蛍光タンパク質 （GFP) を使用し、 一方、 従来の液相系トランスフヱクシヨンを含む実験の場合 （ここで、 本来、 トラン スフェクト細胞の自発的な空間的分離は達成され得ない）、 本発明者らは、 GF Pを使用した。 いくつかのトランスフエクシヨン試薬を評価した： 4つの液体 トランスフエクション試薬 （E f f e c t e n e、 T r a n s F a s t TM、 T f χ ΤΜ— 20、 L ο ρ ο f e c t AM I NE 2000), 2つのポリアミ ン （Sup e r Fe c t、 P o l yFe c t)、 ならびに 2つの型のポリイミン (J e t PE I (X 4) および ExGe n 500)。 In order to clearly establish the achievement of these objectives, as described above, we used PC12 cells in our methodology (transfection in solid phase system). A series of transfusion conditions were studied using both liquid phase transfection. In the case of SPTA, to evaluate mutual contamination The authors used red fluorescent protein (RFP) and green fluorescent protein (GFP) printed on a glass support in a checkerboard pattern, while using experiments involving conventional liquid-phase transfection. (Here, naturally, spontaneous spatial separation of transfected cells cannot be achieved.) We used GFP. Several transfection reagents were evaluated: four liquid transfection reagents (Effectene, Trans Fast ™, Tfχ-20, Lοροfect AM INE 2000), and two polyamines. (Super Fect, PolyFect), and two types of polyimines (J et PE I (X4) and ExGen 500).

トランスフエクシヨン効率： トランスフエクシヨン効率を、 単位面積あたり の総蛍光強度として決定した。使用した細胞株に従って、最適な液相の結果を、 異なるトランスフヱクシヨン試薬を用いて得た。 次いで、 これらの効率的なト ランスフヱクシヨン試薬を、 固相系プロトコルの最適化に使用した。 いくつか の傾向が観察きれた。 細胞をトランズフエクトするのが困難な PC12細胞の 場合において S PTA方法論に最適化した条件を用いることによって、 本努明 者らは、 細胞の特徴を維持しながら、 トランスフエクシヨン効率が数十〜数百 倍まで増加したことを観察した。 P C 1 2細胞の場合、 最良条件は、 Lipofectai ine2000試薬の使用を含ん 、。 予想したよう Iこ、 高 ヽトランスフ ェクシヨン効率を実現するための重要な因子は、 試薬組成中の窒素原子 （N) の数とプラスミ ド DNA內のリン酸残基 （P) の数との間の電荷バランス （N /P比率)、 ならびに DNA濃度である。 一般的に、 N/P比率および濃度にお ける増大は、 トランスフエクシヨン効率の増大を生じる。  Transfection efficiency: The transfection efficiency was determined as the total fluorescence intensity per unit area. Depending on the cell line used, optimal liquid phase results were obtained with different transfusion reagents. These efficient transfusion reagents were then used to optimize a solid phase protocol. Several trends could be observed. By using optimized conditions for SPTA methodology in the case of PC12 cells where it is difficult to transfect the cells, the present investigators can achieve tens to several transfection efficiencies while maintaining cell characteristics. It was observed that it had increased by a factor of 100. For PC12 cells, best conditions include the use of Lipofectai ine2000 reagent. As expected, an important factor in achieving high transfection efficiency is the number of nitrogen atoms (N) in the reagent composition and the number of phosphate residues (P) in plasmid DNA II. Charge balance (N / P ratio), as well as DNA concentration. Generally, increases in N / P ratio and concentration result in increased transfusion efficiency.

チップ上での高いトランスフエクション効率の達成のための重要な点は、 使 用されるガラスコーティングである。 PL が、 トランスフエクシヨン効率お ょぴ相互夾雑の両方に関して、 最良の結果を提供することを発見した （下記に 考察する）。 フイブロネクチンコーティングしない場合、 少数のトランスフエク P T/JP2004/009568 A key to achieving high transfection efficiency on a chip is the glass coating used. We have found that PL provides the best results for both transfer efficiency and cross-contamination (discussed below). Without fibronectin coating, a small number of transfection PT / JP2004 / 009568

ト体を観察した （他のすべての実験条件は一定に保った）。 完全に確立したわけ ではないが、 コラーゲンなどの細胞接着分子の役割はおそらく、 細胞接着プロ セスを加速し、 ゆえに、 表面を離れた D NA拡散が可能になる時間を制限する ということである。 The body was observed (all other experimental conditions were kept constant). Although not completely established, the role of cell adhesion molecules, such as collagen, is likely to accelerate the cell adhesion process, and thus limit the amount of time DNA can diffuse off the surface.

低い相互夾雑： S P T Aプロ トコルで観察されたより高いトランスフエクシ ヨン効率は別として、 本技術の重要な利点は、 別個に分離された細胞アレイの 実現であり、 その各位置では、 選択した遺伝子が発現する。 本発明者らは、 フ イブロネクチンでコーティングしたガラス表面上に、 J e t P E I (製造業者 が提供する 「実験プロ トコル」 を参照のこと） およびフイブロネクチンと混合 した 2つの異なるレポーター遺伝子 （1 ？ぉょぴ& ？） をプリントした。 得られたトランスフエクションチップを適切な細胞培養に提供した。 最良であ ると見出された実験条件下において、 発現された G F Pおよび R F Pは、 それ ぞれの c D NAがスポットされた領域に局在した。 相互夾雑はほとんど観察さ れなかった。 しかし、 フィプロネクチンまたは P L Lの非存在下において、 相- 互夾雑は重要であり、 そしてトランスフエクシヨン効率は、 有意に低かった。 このことは、 接着した細胞の割合と、 支持体表面から離れて拡散するプラスミ ド D N Aとの相対的な割合が、 高いトランスフヱクション効率おょぴ高い相互 夾雑の両方に対して重要な因子であるという仮説を立証する。 Low cross-contamination: Apart from the higher transfection efficiencies observed with the SPTA protocol, a key advantage of the technology is the realization of a separate cell array, at each position where the selected gene is expressed. I do. The present inventors have, on the surface of the glass coated with full Iburonekuchin, J e t PEI (see "Experimental Protocol" provided by the manufacturer) and two different reporter genes mixed with fibronectin (1? Per cent Hey &?) Was printed. The resulting transfection chip was provided for appropriate cell culture. Under the experimental conditions that were found to be the best, the expressed GFP and RFP localized in the region where the respective cDNA was spotted. Mutual contamination was hardly observed. However, in the absence of fipronectin or PLL, phase-contamination was significant and transfection efficiency was significantly lower. This indicates that the percentage of adherent cells and the relative percentage of plasmid DNA that diffuses away from the support surface are important factors for both high transfection efficiency and high mutual contamination. Prove the hypothesis that there is.

相互夾雑のさらなる原因は、 固体支持体上のトランスフエクション細胞の移 動性であり得る。 本発明者らは、 数個の支持体上での細胞接着速度およぴプラ スミド D N Aの拡散速度の両方を測定した。 その結果は、 最適条件下において D N A拡散はほとんど生じないが、 高い相互夾雑条件下において、 表面からの プラスミド D NAの涸渴は、 細胞接着が完了する時間までに相当な量であるこ と ^示し 。  A further cause of cross contamination may be the mobility of transfected cells on a solid support. We measured both the rate of cell adhesion on several supports and the rate of diffusion of plasmid DNA. The results show that under optimal conditions little DNA diffusion occurs, but under high cross-contamination conditions, plasmid DNA depletion from the surface is substantial by the time cell adhesion is completed. .

この確立された技術は、 経済的な高スループッ トの遺伝子機能スクリーニン グの状況において特に重要である。 実際に、 必要とされるトランスフヱクショ 9568 This established technology is particularly important in the context of economical, high-throughput gene function screening. In fact, the required transduction 9568

ン試薬おょぴ DNAの量が少量であること、 ならびに全プロセス （プラスミド の単離から検出まで） を自動化が可能であることは、 上記の方法の有用性を増 大する。 The small amount of reagent and DNA and the ability to automate the entire process (from plasmid isolation to detection) increase the usefulness of the above methods.

結論として、本発明者らは、細胞接着分子と遺伝子導入試薬とを用いた系で、 トランスフヱクシヨンアレイを好首尾に実現した。 このことは、 神経細胞の分 化を制御する遺伝子機構の解明など、 固相系トランスフエクションを利用した 種々の研究における高スループット研究を可能にすることになる。 固相系トラ ンスフエクシヨンの詳細な機構ならびに高スループットのリアルタイム遺伝子 発現モニタリングに対するこの技術の使用に関する方法論は種々の目的に応用 可能であることが明らかになった。  In conclusion, the present inventors have successfully realized a transfection array in a system using a cell adhesion molecule and a gene transfer reagent. This will enable high-throughput research in various studies using solid-phase transfection, such as elucidation of the genetic mechanism that controls the differentiation of nerve cells. The detailed mechanism of solid-phase transfer and the methodology related to the use of this technique for high-throughput real-time gene expression monitoring have been shown to be applicable to a variety of purposes.

δ  δ

細胞培養およびトランスフエクション実験は、 インビトロでの培養皿のコ一 ティングに使用した E CMタンパク質が、 形態、 細胞分布、 接着、 および遺伝 子発現に対して重要な効果を保持することを示した。 本発明者らは、 種々の細 胞株 HEK293、 HEK293 T, He L a、 NIH3T3、 CHO、. He pG2、 ヒト間葉幹細胞 （hMSC) のための局在化されたトランスフエクシ ヨン （LT) 細胞アレイを用いて報告したように、 E CM成分は、 未知の遺伝 子ネットワークの評価のために有用であることを試験するチップベースの細胞 アレイに適した基板であるようだ。 この研究は、 フイブロネクチンの機能が、 接着の役割を凌ぐものであることを明らかにした。 インテグリンにより媒介さ れるフイブロネクチンマトリックス上での細胞の分散が、 核のプレーン化を引 き起こし、 この形状変化は、 核 C a 2+の一過性の上昇を伴うことが判明してい る。 これらの調查は、 C a 2 +の核周囲空間からの放出および核への侵入を担う 核膜における透過チャネル由来の活性化された C a 2 +の存在を示した。次いで、 C a 2+により調節された転写因子の活性は、分散した細胞において増強された。 本発明者らの最近の報告において、 本発明者らはまた、 トランスフエクシヨン JP2004/009568 Cell culture and transfection experiments show that the ECM protein used to coat culture dishes in vitro retains significant effects on morphology, cell distribution, adhesion, and gene expression . The present inventors have developed various cell lines HEK293, HEK293T, HeLa, NIH3T3, CHO,. HepG2, localized transfection (LT) cells for human mesenchymal stem cells (hMSCs). As reported using the array, the ECM component appears to be a suitable substrate for chip-based cell arrays that will be useful for evaluating unknown gene networks. This study revealed that the function of fibronectin goes beyond the role of adhesion. Integrin-mediated cell dispersion on a fibronectin matrix causes nuclear planarization, and this shape change has been shown to be accompanied by a transient increase in nuclear Ca2 + . These modulations indicated the presence of activated Ca2 + from the permeation channel in the nuclear membrane responsible for the release of Ca2 + from the perinuclear space and entry into the nucleus. The activity of transcription factors regulated by Ca 2+ was then enhanced in dispersed cells. In our recent report, we also found that transfusion JP2004 / 009568

効率がフイブロネクチンの存在により劇的に増大するという非常に関連する知 見を示した。 類似の細胞接着プロフィールが、 フイブロネクチン （+ ) および フイブロネクチン （一） 条件で観察されたが、 接着細胞の形状は、 顕著に異な つていた。 Tクチンフィラメントの方向の時間依存的な観察と合わせて、 この ことは、 表面に堆積したフイブロネクチンなどの細胞接着分子により誘導され るァクチンブイラメントのオリエンテーションが、 トランスフエクション効率 の増大において重要な役割を果たすことを示唆する。 表面に堆積したフィブロ ネクチンの存在下で、 ァクチンフィラメントは、 迅速に再配置され、 そして細 胞拡大のプロセスにおいて核の下に位置する細胞質空間から見えなくなった。 さらに、 核の表面領域は、 フイブロネクチン （+ ) 条件において有意に増大し た。 このことは、 恐らく、 機械的ストレスを通して DN A粒子の核通過を容易 にしたからだと考えられる。 さらに、 遺伝子発現と核の形状との間の相関がマ イク口パターンにおいて変化することを観察した C a r s o nらの報告 （C a r s o n H. Th oma sら、 PNAS (2002) Vo l . 9.9、 - N o - 4、 p l 972-1977) と緊密に相関する。 この報告において、 本発明者 らは、 神経細胞株 （特に、 神経細胞様 PC 12細胞） の培養皿またはガラスス ライド上での接着およびトランスフエクシヨンに適した基板として、 I V型コ ラーゲンを提案する。 ラミニンまたはコラーゲン基板で増殖された PC 12細 胞は、 その細胞骨格と共にその α 1 i31インテグリンレセプターの 50%を保 持することが知られている。 α 1 i31インテグリンへテロダイマーが、 神経細 胞においてラミニン コラーゲン二重レセプターとして作用するという証拠 (Taw i lら、 B i o c h emi s t r y 1990) は、 PC 12のそれ らの E CM成分への同様の接着においてはっきりと見られた。 これらの知見は、 ラミニンおよび I V型コラーゲン上での PC 12細胞の類似の接着についての 十分な説明を与えるが、 それらの基板上で獲得されたトランスフエクシヨン体 が有意に異なる理由は定かではない。 しかし、 本発明者らの研究を含め、 多く の研究から、 細胞のィンテグリンに基づく結合およぴ局所的な幾何学的制御は、 細胞の微小環境内での増殖おょぴ生存の調節のための基礎的なメカニズムを示 すことが予想される （Na t u r e Vo l 392、 730— 733、 16 A r i l 1998 ; S c i e n c e VOL. 276、 30、 1425— 1428 MAY 1997 ; K u b a t oら、 JBC 1992)。 A very relevant finding was that the efficiency was dramatically increased by the presence of fibronectin. Similar cell adhesion profiles were observed under fibronectin (+) and fibronectin (1) conditions, but the shape of the adherent cells was significantly different. Together with the time-dependent observation of the direction of T-actin filaments, this indicates that the orientation of actin filaments induced by cell adhesion molecules such as fibronectin deposited on the surface is important in increasing transfection efficiency. Suggest to play a role. In the presence of fibronectin deposited on the surface, actin filaments were rapidly rearranged and disappeared from the cytoplasmic space located below the nucleus in the process of cell expansion. Furthermore, the nuclear surface area was significantly increased in fibronectin (+) conditions. This is probably due to the facilitated passage of DNA particles through the nucleus through mechanical stress. Furthermore, Carson et al. (Carson H. Thomas et al., PNAS (2002) Vol. 9.9,-observed that the correlation between gene expression and nuclear shape was altered in the micromouth pattern. No-4, pl 972-1977). In this report, we propose type IV collagen as a suitable substrate for the attachment and transfection of neuronal cell lines (especially neuronal-like PC12 cells) on culture dishes or glass slides. . PC12 cells grown on laminin or collagen substrates are known to retain 50% of their α1i31 integrin receptor with their cytoskeleton. Evidence that the α1 i31 integrin heterodimer acts as a laminin collagen dual receptor in neuronal cells (Tawil et al., Biochemistry 1990) suggests that PC12 similarly adheres to their ECM components. It was clearly seen. These findings provide a good explanation for the similar adhesion of PC12 cells on laminin and type IV collagen, but it is unclear why the transfection bodies acquired on these substrates are significantly different . However, many studies, including our research, Research suggests that integrin-based binding and local geometric control of cells may provide a fundamental mechanism for regulating cell growth and survival in the microenvironment. (Nature Vol 392, 730-733, 16 Aril 1998; Science VOL. 276, 30, 1425-1428 MAY 1997; Kubato et al., JBC 1992).

本発明者らの研究の 1つの例示的な目的は、 局所トランスフエクション細胞 ァレイに、 神経細胞のような従来外来物質'を導入することが困難とされていた 細胞を適用するために、 トラ スフエクション効率おょぴ Zまたは細胞接着を 増大することである。 本発明者らは、 上記発見に対する本発明者らのアブロー チについての技術的ストラテジーを基礎とし、 I V型コラーゲンコーティング に基づく神経細胞株のためのチップベースの L T細胞ァレイの可能性を探索し た （図 6)。 この技術は、 パラレルな cDN A遺伝子発現研究のバリデーシヨン のための重要なハイスループットツールであることが証明された。 さらに、 こ の細胞アレイは、 単一遣伝子の過剰発現により、 形態変化、 細胞増殖、 または 代替の観察のための微小スケールの過剰発現アレイとして使用され得る。 .  One exemplary purpose of our work is to apply a transfusion to a local transfection cell array with cells that have traditionally been difficult to introduce foreign substances, such as nerve cells. The sfection efficiency is to increase Z or cell adhesion. We have explored the potential of chip-based LT cell arrays for neuronal cell lines based on type IV collagen coating, based on our technological strategy of approach to the above findings. (Figure 6). This technique has proven to be an important high-throughput tool for validation of parallel cDNA gene expression studies. In addition, this cell array can be used as a microscale overexpression array for observation of morphological changes, cell proliferation, or surrogates due to overexpression of a single gene. .

(実施例 8 ：核酸導入効率は遺伝子導入試薬の種類に依存しない）  (Example 8: Nucleic acid introduction efficiency does not depend on the type of gene introduction reagent)

次に、 本発明に従う核酸導入の核酸導入効率は遺伝子導入試薬の種類に依存 しないことを本実施例で実証した。  Next, the present example demonstrated that the nucleic acid introduction efficiency of the nucleic acid introduction according to the present invention does not depend on the type of the gene introduction reagent.

以下の表に示すような量で混合した組成物を調製した。 Mixing compositions were prepared in the amounts shown in the table below.

【表 1】 【table 1】

表 1：遺伝子導入試薬およびプラスミド DNAの量 .  Table 1: Amounts of gene transfer reagents and plasmid DNA.

Transfectin Lipofectamine sureFactor Jet-PEI SuperFect TranslT Transfectin Lipofectamine sureFactor Jet-PEI SuperFect TranslT

_ 2000 _ ._ 2000 _.

DIWEM (無血清） （μΙ) 484 476 452 444 452 460 プラスミド DNA(1mg/mL) 4 4 8 8 8 8 遺伝子導入試薬 (μΙ) 12 20 40 48 40 32 最終容量 （ 500 500 500 500 500 500 DIWEM (serum free) (μΙ) 484 476 452 444 452 460 460 Plasmid DNA (1 mg / mL) 4 4 8 8 8 8 Gene transfer reagent (μΙ) 12 20 40 48 40 32 Final volume (500 500 500 500 500 500

ここで、 使用した試薬は、 それぞれ、 以下の通りである： T r a n s f e c t i n (1 70-3350 ； B I O-RAD, USA, CA) ； L i p o f e e t AM I NE 2000 Re a g e n t (1 1 668— 019， I n v i t r o g e n c o r p o r a t i o n， CA)、 Su r e FECTOR (E M- 101-001, B— B r i d g e, USA, CA)ゝ J e t PE I (X 4 ) c o n e. (101— 30， P o l y Tu^s"— t r a n s— f e c t i o n， F r a n c e)、 Su p e r F e c t Tr a n s f e c t i o n Re a g e n t (301305， Q i a g e n, CA) および T r a n s I T (M I R 2304 ； M i r u s Co., USA, WI)。 Here, the reagents used are respectively as follows: Transfectin (170-3350; BI O-RAD, USA, CA); Lipofeet AM INE 2000 Re agent (1 668-019, I nvitrogencorporation, CA), Su FECTOR (E M-101-001, B—Bridge, USA, CA) ゝ J et PE I (X 4) con e. (101—30, Poly Tu ^ s "— trans — Fection, France), Super Fect Transfection Reagent (301305, Qiagen, CA) and Trans IT (MIR 2304; Mirus Co., USA, WI).

この試薬を用いて、 実施例 4および 5に示されるような実験条件を用いて P C 1 2細胞に対する各種 E CMタンパク質の効果が、 遺伝子導入試薬の種類に 依存しないことを示した。  Using this reagent, it was shown that the effects of various ECM proteins on PC12 cells were independent of the type of gene transfer reagent using the experimental conditions as shown in Examples 4 and 5.

その結果を、 図 8に示す。 aは、 各種 SE CMタンパク質 （フイブロネクチ ン、 コラーゲン I、 コラーゲン I Vおよぴラミニン） における、 核酸導入の様 子を示す。 緑色に染まるものが、 導入された遺伝子の産物になる。 bは、 各種 E CMタンパク質の効果が、 遺伝子導入試薬の種類に依存しないことを示す。 z軸は、 トランスフエクシヨン効率であり、 X軸には各種メーカーの遺伝子導 入試薬を示し、 y軸には各種 E CMタンパク質またはその非存在下である条件 を示す。 Figure 8 shows the results. a shows the appearance of nucleic acid transfer in various SECM proteins (fibronectin, collagen I, collagen IV, and laminin). Those that stain green are the products of the introduced genes. b shows that the effects of various ECM proteins do not depend on the type of gene transfer reagent. The z-axis is the transfection efficiency, the x-axis shows the gene transfer reagents of various manufacturers, and the y-axis is the condition under which various ECM proteins or their absence exist. Indicates.

(実施例 9 ： コラーゲン I Vコートチップ上における P C 12細胞のトランス フエクシヨンマイクロアレイの s i RNAを用いた応用例）  (Example 9: Application example using si RNA of transfection microarray of PC12 cells on collagen IV coated chip)

次に、 siRNAを用いた遺伝子発現抑制実験を本実施例において行った。本実施 例では、 EGFPに対する siRNAが特異的に EGFPの発現を抑制できるかどうかを指 標に本発明が機能するかどうかを評価した。  Next, a gene expression suppression experiment using siRNA was performed in this example. In this example, whether or not the present invention functions was evaluated based on whether or not siRNA for EGFP can specifically suppress the expression of EGFP.

実施例 7などに記載されるような条件を用いて、 コラーゲン I Vをコーティ ングしたアレイ上で PC 12のトランスフエクションを行った。 実施例 7にお いて使用される遺伝子に代えて、 以下の条件を使用した。  PC12 was transfected on an array coated with collagen IV under the conditions described in Example 7 and the like. The following conditions were used in place of the genes used in Example 7.

0. 75 n gの発現ベクター （pEGFP— Nl)、 HcRe d (BD B i o s c i e n c e s C l o n t e c h, C A) をそれぞれァレイ上の 1ス ポットにスポッティングした。 この後、 16. 5 n gの s i RNA (Dh a r ma c o nより購入。 標的配列： 5' — GGC TAC GTC CAG GAG CGC ACC 一 3， （配列番号 25 )' = a") またはスグテンブル s i RNA (Dh a rma c o nより購入。 標的配列： 5 '— gCg C g C TTT g TA g g A TTC g —3 (配列番号 26) =b) をこのス ポットに適用した。  0.75 ng of the expression vector (pEGFP—Nl) and HcRed (BD Bios ce n c e s C lon t e ech, C A) were each spotted in one spot on the array. After this, 16.5 ng of siRNA (purchased from Dharma con. Target sequence: 5 '— GGC TAC GTC CAG GAG CGC ACC 1-3, (SEQ ID NO: 25)' = a ") or Sugtensible siRNA (Dh Target sequence: 5'-gCgCgCTTTTgTAggATTCg-3 (SEQ ID NO: 26) = b) was applied to this spot.

結果を図 9に示す。 図 9 Aに示されるように、 EGF Pベクターおよぴ抗 E GFP s i RN Aを共トランスフエクシヨンした PC 12細胞の場合、 He Re dのみが発色し、 pEGFP—Nlに由来する緑色信号が抑制されていた ことが判明した。 他方、 図 9 Bに示されるように、 スクランブル s i RNAの 場合は、 緑色の蛍光が観察され、 図 9 Aにおける効果は、 RNA iの効果であ ることが確認された。 図 9 Aおよぴ図 9 Bにおける蛍光の強度を相対的に示し た図を図 9Cに示す。 y軸は相対輝度により示す。 EGFPによる効果は、 ほ ぼ完全に抑えられていることが分かる。  The results are shown in FIG. As shown in FIG. 9A, in the case of PC12 cells cotransfected with the EGFP vector and the anti-EGFP siRNA, only He Red develops a color and a green signal derived from pEGFP-Nl is generated. It was found that it had been suppressed. On the other hand, as shown in FIG. 9B, in the case of scrambled siRNA, green fluorescence was observed, and it was confirmed that the effect in FIG. 9A was the effect of RNAi. FIG. 9C shows the relative intensity of the fluorescence in FIGS. 9A and 9B. The y-axis is shown by relative luminance. It can be seen that the effect of EGFP is almost completely suppressed.

(実施例 10 ： NGFにより核酸導入された P C 12細胞はァレイ上で分化 する） (Example 10: PC12 cells transfected with NGF are differentiated on an array Do)

次に、 固相支持体の上で核酸が導入された細胞が、 分化誘導因子の存在下で 分化が実際に核酸導入後も誘導される力 どうかを実証した。  Next, we demonstrated whether cells into which nucleic acid had been introduced on a solid support were capable of inducing differentiation in the presence of a differentiation inducing factor even after nucleic acid introduction.

アレイの調製などは、 実施例 7に記載される条件に従った。 使用した E CM タンパク質としては、 フイブロネクチン、 コラーゲン I型、 コラーゲン I V型、 およぴラミニンが含まれた。 図 1 OAに示されるように、 これらの ECMタン パク質によるコーティングによって、 程度の差はあれ、 核酸が導入されていた ことが分かる。  The preparation of the array and the like followed the conditions described in Example 7. ECM proteins used included fibronectin, collagen type I, collagen type IV, and laminin. As shown in Fig. 1OA, it can be seen that the nucleic acid was introduced to a greater or lesser degree by coating with these ECM proteins.

次に、 トランスフエクシヨン後 3日間アレイ上で細胞を培養した後、 神経成 長因子（NGF) (Ch em i c o n I n t. USA, C A) を 0.1 g/ml) の存在下で分化誘導させた。 その結果を図 10Bに示す。 図 10B (左から倍 率は、 50倍、 200倍を示す。） は、 トランスフエクシヨンアレイにおける分化の 様子をスキャン造影したものを示す （左)。 図 9Bの真ん中は、 PC12細胞の トランスフエクシヨン後 3日目の顕微鏡写真を示ず。 図 1ひ B—の右は NGF 一 誘導後 1日後の写真を示す。 示されるように、 PC 12細胞が、 神経様に分化 している様子が明らかになった。  Next, after culturing the cells on the array for 3 days after transfection, differentiation was induced in the presence of nerve growth factor (NGF) (Chem icon Int. USA, CA) in the presence of 0.1 g / ml). Was. The result is shown in FIG. 10B. Figure 10B (from the left, the magnification is 50x and 200x) shows the results of scanning imaging of the differentiation in the transfection array (left). The middle part of FIG. 9B does not show a micrograph of PC12 cells 3 days after transfection. The right side of Fig. 1B-B shows the photograph one day after NGF induction. As shown, it became clear that PC 12 cells were differentiated in a nerve-like manner.

以上のように、本努明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、 本発明は、 特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであること が理解される。 本明細書において引用した特許、 特許出願おょぴ文献は、 その 内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書 に対する参考として援用されるべきであることが理解される。 産業上の利用可能性 本発明はまた、核酸を導入した後に、分化誘導を可能にする技術を提供する。  As described above, the present invention has been exemplified by using the preferred embodiments of the present invention. However, it is understood that the scope of the present invention should be interpreted only by the appended claims. The contents of the patents, patent applications, and references cited in this specification should be incorporated by reference into this specification as if the content itself were specifically described in this specification. It is understood that. Industrial Applicability The present invention also provides a technique that enables induction of differentiation after introducing a nucleic acid.

本発明により、 任意の核酸を導入し、 任意の分化誘導を行うといった自在な試 04 009568 According to the present invention, an arbitrary test for introducing an arbitrary nucleic acid and inducing an arbitrary differentiation can be performed. 04 009568

験設定を可能にする。 この技術は、 固相上で可能なことから、 細胞アレイで必 要なかなりの条件を任意に設定することができ、細胞に関連する任意の産業（製 薬業、 農業など） において有用である。 Test settings. Since this technology can be used on a solid phase, it is possible to arbitrarily set the necessary conditions for cell arrays, and is useful in any cell-related industry (eg, pharmaceutical industry, agriculture, etc.) .

Claims

請求の範囲 The scope of the claims 1 . 細胞への核酸の導入効率を改善するための組成物であって、 1. A composition for improving the efficiency of introducing nucleic acids into cells, A) 細胞接着分子；および  A) cell adhesion molecules; and B ) 遺伝子導入試薬、  B) gene transfer reagent, を含む、 組成物。 A composition comprising: 2 . 前記細胞接着分子は、 細胞外マトリクスを含む、 請求項 1に記載の組成 物。  2. The composition of claim 1, wherein said cell adhesion molecule comprises an extracellular matrix. 3 . 前記細胞接着分子は、 コラーゲン、 ラミニンおよぴフイブロネクチンか らなる群より選択される少なくとも 1つの細胞外マトリクスを含む、 請求項 1 に記載の組成物。  3. The composition according to claim 1, wherein the cell adhesion molecule comprises at least one extracellular matrix selected from the group consisting of collagen, laminin and fibronectin. 4 . 前記細胞接着分子は、 繊維形成コラーゲンまたは基底膜コラーゲンを含 む、 請求項 1に記載の組成物。  4. The composition of claim 1, wherein the cell adhesion molecule comprises fibril forming collagen or basement membrane collagen. 5 . 前記細胞接着分子は、 繊維形成コラーゲンおよび基底膜コラ^-ゲンを含 む、 請求項 1に記載の組成物。  5. The composition of claim 1, wherein the cell adhesion molecule comprises fibril forming collagen and basement membrane collagen. 6 . 前記細胞接着分子は、 コラーゲン I型または I V型を含む、 請求項 1に 記載の組成物。  6. The composition of claim 1, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I or type IV. 7 . 前記細胞接着分子は、 コラーゲン I型および I V型を含む、 請求項 1に 記載の組成物。  7. The composition of claim 1, wherein the cell adhesion molecules include collagen types I and IV. 8 . 前記遺伝子導入試薬は、 カチオン性高分子、 カチオン性脂質、 ポリアミ ン系試薬、 ポリイミン系試薬おょぴリン酸カルシウムからなる群より選択され る少なくとも 1つの試薬を含む、 請求項 1に記載の組成物。 8. The composition according to claim 1, wherein the gene introduction reagent includes at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine-based reagent, a polyimine-based reagent, and calcium phosphate. object. 9 . さらに、 導入が企図される核酸を含む、 請求項 1に記載の組成物。  9. The composition of claim 1, further comprising a nucleic acid to be introduced. 1 0 . 前記核酸は D N Aである、 請求項 1に記載の組成物。  10. The composition of claim 1, wherein the nucleic acid is DNA. 1 1 . 前記核酸は、 遺伝子をコードする配列を含む、 請求項 1 0に記載の組 成物。 11. The composition of claim 10, wherein the nucleic acid comprises a sequence encoding a gene. 12. 前記組成物は固体である、 請求項 1に記載の組成物。 12. The composition according to claim 1, wherein said composition is a solid. 13. 前記組成物は液体である、 請求項 1に記載の組成物。  13. The composition according to claim 1, wherein said composition is a liquid. 14. 前記細胞接着分子は多量体形態である、 請求項 1に記載の組成物。  14. The composition of claim 1, wherein the cell adhesion molecule is in a multimeric form. 15. 前記細胞接着分子は、 三次元構造をとる、 請求項 1に記載の組成物。 15. The composition according to claim 1, wherein the cell adhesion molecule has a three-dimensional structure. 16. 前記細胞は、 固相上での遺伝子導入が困難である細胞である、 請求項 1に記載の組成物。 16. The composition according to claim 1, wherein the cell is a cell in which gene transfer on a solid phase is difficult. 17. 前記細胞は、 神経系の細胞である、 請求項 1に記載の組成物。  17. The composition of claim 1, wherein said cells are cells of the nervous system. 18. 前記細胞は、 神経系の細胞であり、 前記細胞接着分子はコラーゲンを 含む、 請求項 1に記載の組成物。  18. The composition of claim 1, wherein the cells are cells of the nervous system, and wherein the cell adhesion molecule comprises collagen. 19. 前記核酸の導入は、 前記細胞が固相上に配置された状態で行われる、 請求項 1に記載の組成物。 19. The composition according to claim 1, wherein the nucleic acid is introduced in a state where the cells are arranged on a solid phase. 20. 前記細胞は、 初代培養細胞を包含する、 請求項 1に記載の組成物。 20. The composition of claim 1, wherein said cells include primary cultured cells. 21. 前記細胞接着分子は、 S gZml l O O/ gZmlの濃度で存在 する、 請求項 1に記載の組成物。 一 -一―一 一 一21. The composition of claim 1, wherein the cell adhesion molecule is present at a concentration of SgZmlIOO / gZml. One-one-one-one-one 22. 前記細胞は、 さらに、 分化誘導される、 請求項 1に記載の組成物。22. The composition of claim 1, wherein the cells are further induced to differentiate. 23. 前記組成物は、分化誘導因子をさらに含む、請求項 1に記載の組成物。 23. The composition of claim 1, wherein the composition further comprises a differentiation inducing factor. 24. 細胞の核酸導入効率を改善するためのデバイスであって、 24. A device for improving the nucleic acid introduction efficiency of a cell, A) 細胞接着分子；および  A) cell adhesion molecules; and B) 遺伝子導入試薬、  B) gene transfer reagent, を含む、 組成物が支持体に固定される、 デバイス。 A device, wherein the composition is fixed to a support. 25. 前記細胞接着分子は、 細胞外マトリタスを含む、 請求項 24に記載の デバイス。  25. The device of claim 24, wherein said cell adhesion molecule comprises extracellular matrix. 26. 前記細胞接着分子は、 コラーゲン、 ラミニンおよぴフイブロネクチン からなる群より選択される少なくとも 1つの細胞外マトリクスを含む、 請求項 24に記載のデバイス。  26. The device of claim 24, wherein said cell adhesion molecule comprises at least one extracellular matrix selected from the group consisting of collagen, laminin and fibronectin. 27. 前記細胞接着分子は、 繊維形成コラーゲンまたは基底膜コラーゲンを 含む、 請求項 2 4に記載のデバイス。 27. The cell adhesion molecule is capable of converting fiber-forming collagen or basement membrane collagen. The device of claim 24, comprising: 2 8 . 前記細胞接着分子は、 繊維形成コラーゲンおよび基底膜コラーゲンを 含む、 請求項 2 4に記載のデパイス。  28. The depis according to claim 24, wherein said cell adhesion molecules include fibril forming collagen and basement membrane collagen. 2 9 . 前記細胞接着分子は、 コラーゲン I型または I V型を含む、 請求項 2 4に記載のデバイス。  29. The device according to claim 24, wherein said cell adhesion molecule comprises collagen type I or IV. 3 0 . 前記細胞接着分子は、 コラーゲン I型おょぴ I V型を含む、 請求項 2 4に記載のデバイス。  30. The device of claim 24, wherein said cell adhesion molecule comprises collagen type I and type IV. 3 1 . 前記遺伝子導入試薬は、 カチオン性高分子、 カチオン性脂質、 ポリア ミン系試薬、 ポリイミン系試薬おょぴリン酸カルシゥムからなる群より選択さ れる少なくとも 1つの試薬を含む、 請求項 2 4に記載のデパイス。  31. The gene transfer reagent according to claim 24, wherein the gene transfer reagent includes at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine-based reagent, a polyimine-based reagent, and calcium phosphate. Depis described in. 3 2 . さらに、導入が意図される核酸を含む、請求項 2 4に記載のデバイス。  32. The device of claim 24, further comprising a nucleic acid intended to be introduced. 3 3 . 前記核酸は D N Aである、 請求項 2 4に記載のデバイス。 33. The device according to claim 24, wherein said nucleic acid is DNA. 3 4 . 前記核酸は遺伝子をコードする配列を含む、 請求項 3 3に記載のデバ イス。 一 ― 一 ― -一 - 34. The device of claim 33, wherein said nucleic acid comprises a sequence encoding a gene. One-one--one- 3 5 . 前記支持体は固体である、 請求項 2 4に記載のデバイス。 35. The device according to claim 24, wherein said support is a solid. 3 6 . 前記支持体は液体である、 請求項 2 4に記載のデバイス。 36. The device according to claim 24, wherein said support is a liquid. 3 7 . 前記細胞接着分子は多量体形態である、請求項 2 4に記載のデパイス。37. The depiice of claim 24, wherein said cell adhesion molecule is in a multimeric form. 3 8 . 前記細胞接着分子は、 三次元構造をとる、 請求項 2 4に記載のデパイ ス。 38. The device according to claim 24, wherein the cell adhesion molecule has a three-dimensional structure. 3 9 . 前記細胞は、 固相上での遺伝子導入が困難である細胞である、 請求項 2 4に記載のデパイス。 39. The depise according to claim 24, wherein the cell is a cell in which gene transfer on a solid phase is difficult. 4 0 . 前記細胞は、 神経系の細胞である、 請求項 2 4に記載のデパイス。  40. The device according to claim 24, wherein said cells are cells of the nervous system. 4 1 . 前記細胞は、 神経系の細胞であり、 前記細胞接着分子はコラーゲンを 含む、 請求項 2 4に記載のデバィス。 41. The device of claim 24, wherein the cells are cells of the nervous system, and wherein the cell adhesion molecule comprises collagen. 4 2 . 前記核酸の導入は、 前記細胞が固相上に配置された状態で行われる、 請求項 2 4に記載のデパイス。 · 42. The depayce according to claim 24, wherein the nucleic acid is introduced in a state where the cells are arranged on a solid phase. · 43. 前記細胞は、初代培養細胞を包含する、請求項 24に記載のデバィス。 43. The device of claim 24, wherein said cells include primary cultured cells. 44. 前記細胞接着分子は、 5 /ζ §Ζπι1〜100μ §Ζιη1の濃度で存在 する、 請求項 24に記載のデバィス。 44. The cell adhesion molecules is present at a concentration of 5 / ζ § Ζπι1~100 μ § Ζιη1 , Debaisu of claim 24. 45. 前記細胞接着分子は、 前記支持体にコーティングされる、 請求項 24 に記載のデパイス。 45. The depay according to claim 24, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support. 46. 前記細胞接着分子は、 多層で前記支持体にコーティングされる、 請求 項 24に記載のデバイス。 ' 46. The device of claim 24, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support in multiple layers. ' 47. 前記核酸は、 アレイ状で前記支持体に配置される、 請求項 32に記載 のデバイス。 47. The device according to claim 32, wherein the nucleic acids are arranged on the support in an array. 48. 前記細胞は、 さらに、分化誘導される、請求項 24に記載のデバイス。 48. The device of claim 24, wherein said cells are further induced to differentiate. 49. 前記組成物は、 分化誘導因子をさらに含む、 請求項 24に記載のデバ イス。 49. The device of claim 24, wherein said composition further comprises a differentiation inducing factor. 50. 細胞の核酸導入効率を上昇させる方法であうて、— ―一  50. A method to increase the efficiency of nucleic acid introduction into cells. Α) 細胞の核酸導入効率を改善するための組成物であって、  Ii) a composition for improving the nucleic acid introduction efficiency of a cell, a) 細胞接着分子；および a) cell adhesion molecules; and b) 遺伝子導入試薬、 b) gene transfer reagent, を含む、 組成物を、 導入が意図される核酸とともに、 該細胞に提供する工程； ならびに Providing the composition to the cell together with the nucleic acid to be introduced; and B) 核酸が導入される条件に該細胞をさらす工程、  B) exposing the cells to conditions under which the nucleic acid is introduced, を包含する、 方法。 The method. 51. 前記細胞接着分子は、 細胞外マトリクスを含む、 請求項 50に記載の 方法。  51. The method of claim 50, wherein said cell adhesion molecule comprises an extracellular matrix. 52. 前記細胞接着分子は、 コラーゲン、 ラミニンおよびフイブロネクチン からなる群より選択される少なくとも 1つの細胞外マトリクスを含む、 請求項 50に記載の方法。 52. The method of claim 50, wherein said cell adhesion molecule comprises at least one extracellular matrix selected from the group consisting of collagen, laminin and fibronectin. 5 3 . 前記細胞接着分子は、 繊維形成コラーゲンまたは基底膜コラーゲンを 含む、 請求項 5 0に記載の方法。 53. The method of claim 50, wherein said cell adhesion molecule comprises fibril forming collagen or basement membrane collagen. 5 4 . 前記細胞接着分子は、 繊維形成コラーゲンおよび基底膜コラーゲンを 含む、 請求項 5 0に記載の方法。  54. The method of claim 50, wherein the cell adhesion molecules include fibril forming collagen and basement membrane collagen. 5 5 . 前記細胞接着分子は、 コラーゲン I型または I V型を含む、 請求項 5 0に記載の方法。 55. The method of claim 50, wherein the cell adhesion molecule comprises collagen type I or IV. 5 6 . 前記細胞接着分子は、 コラーゲン I型および I V型を含む、 請求項 5 0に記載の方法。  56. The method of claim 50, wherein said cell adhesion molecules include collagen types I and IV. 5 7 . 前記遺伝子導入試薬は、 カチオン性高分子、 カチオン性脂質、 ポリア ミン系試薬、 ポリイミン系試薬おょぴリン酸カルシウムからなる群より選択さ れる少なくとも 1つの試薬を含む、 請求項 5 0に記載の方法。  57. The gene transfer reagent according to claim 50, wherein the gene introduction reagent includes at least one reagent selected from the group consisting of a cationic polymer, a cationic lipid, a polyamine-based reagent, a polyimine-based reagent, and calcium phosphate. the method of. 5 8. 前記組成物は固体である、 請求項 5 0に記載の方法。  58. The method of claim 50, wherein said composition is a solid. 5 9 . 前記組成物は液体である、 請求項 5 0に記載の方法。  59. The method of claim 50, wherein said composition is a liquid. 6 0 . 前記細胞接着分子は多量体形態である、 請求項 5 0に記載の方法。  60. The method of claim 50, wherein said cell adhesion molecule is in a multimeric form. 6 1 . 前記細胞接着分子は、 三次元構造をとる、 請求項 5 0に記載の方法。61. The method according to claim 50, wherein the cell adhesion molecule has a three-dimensional structure. 6 2 . 前記細胞は、 固相上での遺伝子導入が困難である細胞である、 請求項62. The cell is a cell for which gene transfer on a solid phase is difficult. 5 0に記載の方法。 50. The method of 50. 6 3 . 前記細胞は、 神経系の細胞である、 請求項 5 0に記載の方法。  63. The method of claim 50, wherein said cells are cells of the nervous system. 6 4 . 前記細胞は、 神経系の細胞であり、 前記細胞接着分子はコラーゲンを 含む、 請求項 5 0に記載の方法。  64. The method of claim 50, wherein said cells are cells of the nervous system, and wherein said cell adhesion molecule comprises collagen. 6 5 . 前記核酸の導入は、 前記細胞が固相上に配置された状態で行われる、 請求項 5 0に記載の方法。  65. The method according to claim 50, wherein the introduction of the nucleic acid is performed in a state where the cells are arranged on a solid phase. 6 6 . 前記細胞は、 初代培養細胞を包含する、 請求項 5 0に記載の方法。  66. The method of claim 50, wherein said cells include primary cultured cells. 6 7 . 前記核酸は D N Aを含む、 請求項 5 0に記載の方法。 67. The method of claim 50, wherein said nucleic acid comprises DNA. 6 8 . 前記核酸は、 遺伝子をコードする配列を含む、 請求項 5 0に記載の方 法。 68. The method of claim 50, wherein said nucleic acid comprises a sequence encoding a gene. 69. 前記組成物および前記核酸は、 支持体に固定される、 請求項 50に記 載の方法。 69. The method of claim 50, wherein said composition and said nucleic acid are immobilized on a support. 70. 前記支持体は、 固体である、 請求項 69に記載の方法。  70. The method of claim 69, wherein said support is a solid. 71. 前記支持体は、 液体である、 請求項 69に記載の方法。  71. The method of claim 69, wherein said support is a liquid. 72. 前記組成物および前記核酸を前記支持体に固定する工程をさらに包含 する、 請求項 69に記載の方法。  72. The method of claim 69, further comprising immobilizing the composition and the nucleic acid to the support. 73. 前記固定は、ィンクジェット方式でされる、請求項 69に記載の方法。  73. The method of claim 69, wherein said securing is done in an ink jet fashion. 74. 前記細胞接着分子は、 前記支持体にコーティングされる、 請求項 69 に記載の方法。74. The method of claim 69, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support. 0 75. 前記細胞接着分子は、 多層で前記支持体にコーティングされる、 請求 項 69に記載の方法。 75. The method of claim 69, wherein the cell adhesion molecule is coated on the support in multiple layers. 76. 前記核酸は、 アレイ状で前記支持体に配置される、 請求項 69に記載 の方法。  76. The method of claim 69, wherein the nucleic acids are arranged on the support in an array. ― 77. —前記細胞を分化誘導する工程をさらに包含する、…請求項— 50に記載の5 方法。  50. The method according to claim 50, further comprising a step of inducing differentiation of said cells. 78. 前記組成物は、分化誘導因子をさらに含む、請求項 50に記載の方法。 78. The method of claim 50, wherein the composition further comprises a differentiation inducing factor. 79. 細胞に核酸を導入するためのキットであって、 79. A kit for introducing a nucleic acid into a cell, A)  A) a) 細胞接着分子；および a) cell adhesion molecules; and 0 b) 遺伝子導入試薬、 0 b) gene transfer reagent, を含む、 糸且成物；ならびに  A yarn composition; and B) 該組成物と、 核酸とともに使用する方法を記載した指示書、  B) the composition and instructions describing the method of use with the nucleic acid; とを備える、 キット。  A kit comprising: 80. 分化誘導因子をさらに備える、 請求項 79に記載のキット。 80. The kit of claim 79, further comprising a differentiation inducing factor. 5 81. a) 細胞接着分子；および b) 遺伝子導入試薬、 を含む、 組成物の、 細胞に遺伝子導入するための使用。 5 81. Use of a composition for transfecting a cell, comprising: a) a cell adhesion molecule; and b) a gene transfer reagent. 82. 前記組成物は、分化誘導因子をさらに含む、請求項 81に記載の使用。 82. The use of claim 81, wherein the composition further comprises a differentiation inducing factor. 83. 固相上で細胞に核酸を導入するための組成物であって、 該細胞は、 核 酸導入後も分化誘導する能力が保持される、 組成物であって、 83. A composition for introducing a nucleic acid into a cell on a solid phase, wherein the cell retains the ability to induce differentiation even after introduction of a nucleic acid, A) 細胞接着分子；および  A) cell adhesion molecules; and B) 遺伝子導入試薬、  B) gene transfer reagent, を含む、 組成物。 A composition comprising: 84. 前記糸且成物は、 分化誘導因子を含む、 請求項 83に記載の組成物。  84. The composition of claim 83, wherein the fibrous composition comprises a differentiation inducing factor. 85. 前記分化誘導因子は、 細胞増殖因子を含む、 請求項 84に記載の組 成物。 85. The composition of claim 84, wherein the differentiation inducing factor comprises a cell growth factor. 86. 前記細胞は神経であり、 そして前記分化誘導因子は、 神経成長因子 (NGF) を含む、 請求項 84に記載の組成物。 86. The composition of claim 84, wherein the cells are nerves, and wherein the differentiation inducing factor comprises nerve growth factor (NGF). 87. 固相上で細胞に核酸を導入するための方法であって、 87. A method for introducing nucleic acids into cells on a solid phase, comprising: A)  A) a) 細胞接着分子；および - — ' — ' 一 - 一 一— b) 遺伝子導入試薬、  a) cell adhesion molecule; and -—'— 'one-one-one-b) gene transfer reagent, を含む、 組成物を、 導入が意図される核酸とどもに、 該細胞に提供する工程； ならびに Providing the composition to the cell together with the nucleic acid intended to be introduced; and B) 核酸が導入される条件に該細胞をさらす工程、  B) exposing the cells to conditions under which the nucleic acid is introduced, を包含し、 該細胞は、 該核酸導入後も分化誘導する能力が保持される、 方法。 The method, wherein the cell retains its ability to induce differentiation even after the introduction of the nucleic acid. 88. 前記組成物は、 分化誘導因子を含む、 請求項 87に記載の方法。 88. The method of claim 87, wherein the composition comprises a differentiation inducing factor. 89. 前記分化誘導因子は、 細胞増殖因子を含む、 請求項 88に記載の方 法。 89. The method of claim 88, wherein said differentiation inducing factor comprises a cell growth factor. 90. 前記細胞は神経であり、 そして前記分化誘導因子は、 神経成長因子 (NGF) を含む、 請求項 88に記載の方法。  90. The method of claim 88, wherein the cells are nerves, and wherein the differentiation inducing factor comprises nerve growth factor (NGF). 91. 前記細胞を分化誘導させる工程をさらに包含する、 請求項 87に記 载の方法。 91. The method of claim 87, further comprising the step of inducing the cells to differentiate. 方法 way. 9 2 . 固相上で細胞に核酸を導入し、 かつ、 該細胞を分化誘導させるため の組成物であって、 .  9 2.A composition for introducing a nucleic acid into cells on a solid phase and for inducing differentiation of the cells, A) 細胞接着分子；  A) cell adhesion molecules; B) 遺伝子導入試薬；および  B) a gene transfer reagent; and C) 分化誘導因子  C) Differentiation inducing factor を含む、 組成物。 A composition comprising: 9 3 . 固相上で細胞に核酸を導入し、 かつ、 該細胞を分化誘導させるため のキットであって、  93. A kit for introducing a nucleic acid into cells on a solid phase and inducing the cells to differentiate, A)  A) a ) 細胞接着夯子；および  a) cell adhesion molecules; and b ) 遺伝子導入試薬を含む、 組成物；ならびに  b) a composition comprising a gene transfer reagent; B ) 分化誘導因子  B) Differentiation inducing factor を備える、 キット。 Comprising a kit. 9 4. 固相上で細胞に核酸を導入し、 かつ、 該細胞を分化誘導させる方法 であって、  9 4. A method for introducing nucleic acid into cells on a solid phase and inducing the cells to differentiate, A)  A) a ) 細胞接着分子；および  a) cell adhesion molecules; and b ) 遺伝子導入試薬を含む、 組成物を、 導入が意図される核酸とともに、 該細胞に提供する工程；ならびに  b) providing to the cell a composition comprising a gene transfer reagent, together with the nucleic acid to be transferred; B ) 核酸が導入される条件に該細胞をさらす工程；および  B) exposing said cells to conditions under which the nucleic acid is introduced; and C) 該細胞を分化誘導する工程、  C) a step of inducing differentiation of the cells, を包含する、 方法。 The method.
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