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WO2005097985A1 - 1,3-特異性リパーゼ粉末、その製造方法及びその使用 - Google Patents

1,3-特異性リパーゼ粉末、その製造方法及びその使用 Download PDF

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WO2005097985A1
WO2005097985A1 PCT/JP2005/006909 JP2005006909W WO2005097985A1 WO 2005097985 A1 WO2005097985 A1 WO 2005097985A1 JP 2005006909 W JP2005006909 W JP 2005006909W WO 2005097985 A1 WO2005097985 A1 WO 2005097985A1
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WO
WIPO (PCT)
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lipase
powder
aqueous solution
lipase powder
mass
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PCT/JP2005/006909
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English (en)
French (fr)
Inventor
Junko Suzuki
Satoshi Negishi
Yuri Arai
Chika Sakurai
Tadashiro Hirose
Hidetaka Uehara
Shin Arimoto
Tomomi Suganuma
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nisshin Oillio Group Ltd
Original Assignee
Nisshin Oillio Group Ltd
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Publication date
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Priority to EP05728498A priority patent/EP1734115A4/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6458—Glycerides by transesterification, e.g. interesterification, ester interchange, alcoholysis or acidolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats

Definitions

  • the present invention relates to a 1,3-specific lipase powder which can be suitably used for transesterification of various fats and oils, a method for producing the same, and a method for immersing or infiltrating a 1,3-specific lipase powder in fat or oil.
  • the present invention relates to a lipase composition, a method for transesterifying fats and oils using the lipase powder, and the like.
  • Lipases are widely used in esterification reactions between various carboxylic acids such as fatty acids and alcohols such as monoalcohols and polyhydric alcohols, and transesterification reactions between a plurality of carboxylic acid esters. Of these, transesterification is an important technology for the production of esters, sugar esters and steroids of various fatty acids, including the modification of animal and vegetable fats and oils. If lipase, which is a fat and oil hydrolase, is used as a catalyst for these reactions, transesterification can be carried out under mild conditions at room temperature to about 70 ° C. The lipase as a catalyst is a natural product, and its safety is also high. In addition, the target product can be efficiently produced due to its substrate specificity and positional specificity.
  • lipase has conventionally been used as a carrier such as an anion exchange resin (Patent Document 1), a phenol-adsorbed resin (Patent Document 2), a hydrophobic carrier (Patent Document 3), and a cation exchange resin (Patent Document 1). 4), immobilized on chelating resins (Patent Document 5) and the like, and used for esterification and ester exchange reactions.
  • a carrier such as an anion exchange resin (Patent Document 1), a phenol-adsorbed resin (Patent Document 2), a hydrophobic carrier (Patent Document 3), and a cation exchange resin (Patent Document 1). 4), immobilized on chelating resins (Patent Document 5) and the like, and used for esterification and ester exchange reactions.
  • lipase is immobilized and used for the transesterification reaction.
  • a powerful immobilized lipase is not only accompanied by loss of the original lipase activity due to the immobilization process, but also has a porous structure.
  • an acidic carrier was used, the pores were clogged with raw materials and products, resulting in a decrease in the transesterification rate.
  • water retained by the carrier is brought into the reaction system, so that a side reaction, for example, It was difficult to avoid the production of diglyceride / monoglyceride in the transesterification of oils and fats.
  • a lipase is added to the ester-containing raw material so that 90% or more of the dispersed lipase powder particles are maintained at a particle size in the range of 1 to 100 ⁇ m during the transesterification reaction.
  • a method of performing a transesterification reaction by dispersing a powder has been proposed (Patent Document 6). It has also been proposed to use an enzyme powder obtained by drying an enzyme solution containing a phospholipid and a fat-soluble vitamin (Patent Document 7).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. Sho 60-98984
  • Patent Document 2 JP-A-61-202688
  • Patent document 3 JP-A-2-138986
  • Patent Document 4 JP-A-3-61485
  • Patent Document 5 JP-A-1-2622795
  • Patent Document 6 Patent No. 2668187
  • Patent Document 7 JP-A-2000-106873
  • An object of the present invention is to provide a lipase powder in which 1,3-selectivity of a 1,3-specific lipase is improved.
  • Another object of the present invention is to provide a lipase composition obtained by immersing or infiltrating the lipase powder in fat or oil.
  • the 1,3-specific lipase derived from Rhizomucor miehei is a lipase with extremely high 1,3 selectivity and is used by being immobilized on an anion exchange resin.
  • the present invention has been made based on the finding that a spherical powder having a water content of 10% by mass or less, without using it, further improves the 1,3 selectivity!
  • the present invention provides a 1,3-specific lipase derived from Rhizomucor miehe oil, which is spherical and has a water content of 10% by mass or less.
  • the present invention also provides a lipase composition wherein the lipase powder is immersed or infiltrated in fat or oil.
  • the present invention also provides a method for producing the lipase powder, which comprises spray-drying a lipase-containing aqueous solution whose pH has been adjusted to 6 to 7.5.
  • the present invention also provides a transesterification lipase containing the lipase powder.
  • the present invention also provides a method for ester exchange of fats and oils, which comprises using the above-mentioned lipase for transesterification.
  • the 1,3-specific lipase targeted in the present invention is a 1,3-specific lipase derived from Rhizomucor miehei belonging to the genus Rhizomucor sp. Conventionally, Rhizomucor miehei; is sometimes treated as a genus Mucor sp.
  • this lipase is used as a powder having a spherical shape and a water content of 10% by mass or less.
  • the water content is preferably from 6.5 to 8.5% by weight to a force of not more than 10% by weight.
  • the particle size of the lipase powder of the present invention can be arbitrarily set, it is preferable that 90% by mass or more of the lipase powder has a particle size of 1 to 100 ⁇ m.
  • the average particle size is preferably from 20 to 80 ⁇ m, more preferably from 20 to 50 ⁇ m.
  • the particle size of the lipase powder can be measured, for example, using a particle size distribution analyzer (LA-500) manufactured by HORIBA.
  • LA-500 particle size distribution analyzer manufactured by HORIBA.
  • Such a lipase powder can be easily prepared by, for example, spray-drying (spray drying) an aqueous solution containing a lipase.
  • the lipase-containing aqueous solution includes a lipase culture solution from which cells have been removed, a purified culture solution, a solution obtained by dissolving and dispersing a lipase powder obtained from these in water, and a commercially available lipase solution.
  • examples thereof include those in which the powder is dissolved and dispersed again in water, commercially available liquid lipase, and the like.
  • those from which low-molecular components such as salts are removed to further enhance lipase activity are preferable, and those from which low-molecular components such as sugar are removed to further improve powder properties are more preferable.
  • Lipase cultures include, for example, soy flour, peptone, corn 'Stap' liquor, KH
  • Aqueous solution containing PO, (NH) SO, MgSO containing PO, (NH) SO, MgSO.
  • soy flour 0.1 to 20 wt% preferably from 1.0 to 10 wt%, peptone 0.1 to 30 mass 0/0, preferably from 0.5 to 10 weight 0/0, corn ' Suthep 'liquor from 0.1 to 30 weight 0/0, preferably rather is from 0.5 to 10 weight 0/0, ⁇ ⁇ 0. 01 ⁇ 20 mass 0/0, preferably from 0.1 to 5 mass 0/0
  • soy flour 0.1 to 20 wt% preferably from 1.0 to 10 wt%, peptone 0.1 to 30 mass 0/0, preferably from 0.5 to 10 weight 0/0, corn ' Suthep 'liquor from 0.1 to 30 weight 0/0, preferably rather is from 0.5 to 10 weight 0/0, ⁇ ⁇ 0. 01 ⁇ 20 mass 0/0, preferably from 0.1 to 5 mass 0/0
  • peptone 0.1 to 30 mass 0/0 preferably from 0.5 to 10 weight 0/0
  • ⁇ is 0.01 to 20% by mass, preferably 0.05 to 5% by mass.
  • Culture conditions are culture temperature
  • Isolation of the cells is preferably performed by centrifugation, membrane filtration, or the like. Further, removal of low molecular components such as salts and sugars can be performed by UF membrane treatment. Specifically, after performing UF membrane treatment, concentrating the aqueous solution containing lipase to a volume of 1Z2, and then adding the same amount of phosphate buffer as the concentrated solution, it is repeated 1 to 5 times. A lipase-containing aqueous solution from which low molecular components have been removed can be obtained.
  • the centrifugation is preferably controlled at 200 to 20,000 X g, and the membrane filtration is preferably controlled at a pressure of 3.0 kg / m2 or less using an MF membrane, a filter press or the like.
  • the stirring speed of the homogenizer is 500 to 30,000 rpm, preferably ⁇ 1,000 to 15,000 rpm, and the rotating speed of the worst blender is 500 to 10,000, rpm, preferably ⁇ 1,000 to 5, OOOrpm. is there.
  • the stirring time is 0.5 to 10 minutes, preferably 1 to 5 minutes.
  • the ultrasonic crushing is preferably performed under the conditions of 1 to 50 KHz, preferably 10 to 20 KHz. It is better to use glass balls having a diameter of about 0.1 to 0.5 mm for the ball mill. In the present invention, it is preferable to use an aqueous solution containing 5 to 30% by mass as a solid content as the lipase-containing aqueous solution.
  • the solid content concentration in the lipase-containing aqueous solution can be determined as Brix.
  • the pH of the lipase-containing aqueous solution is preferably adjusted to 6 to 7.5.
  • pH adjustment may be performed in any step before the drying step such as spray drying (spray drying) so that the pH of the lipase-containing aqueous solution is adjusted in advance so that the pH immediately before the drying step is within the above range. It may be adjusted.
  • an alkali metal hydroxide such as sodium hydroxide which can use various alkali agents and acids.
  • the lipase-containing aqueous solution may be concentrated in a middle step before the drying step.
  • the method of concentration is not particularly limited, but evaporator, flash evaporator, UF membrane concentration, MF membrane concentration, salting out with inorganic salts, precipitation method with a solvent, adsorption method with ion exchange cellulose, etc., water absorbing gel Water absorption method.
  • UF membrane concentration and evaporator are used.
  • Spray drying is preferably performed using a spray dryer such as a nozzle countercurrent type, a disk countercurrent type, a nozzle cocurrent type, and a disk cocurrent type.
  • a spray dryer such as a nozzle countercurrent type, a disk countercurrent type, a nozzle cocurrent type, and a disk cocurrent type.
  • Preferably may Disk parallel flow force s, atomizer revolution number 4, 000 ⁇ 20, OOOrpm, Caro heat population temperature 100 to 20 0 ° C, outlet temperature 40 - control to spray drying in L00 ° C ( Spray drying).
  • the lipase powder thus prepared can be used as it is. It is handled as a lipase composition immersed or infiltrated in fats and oils.
  • the mass of the fat or oil in the lipase composition is preferably 0.1 to 20 times, more preferably 1 to 20 times, the lipase powder.
  • the lipase composition is prepared by adding oil to a lipase powder produced by spray drying (spray drying) or the like, and uniformly stirring the mixture with a stirrer, a three-one motor or the like.
  • the fats and oils can be easily obtained by adding fats and oils to the powder recovery section of the laser dryer in advance, stirring uniformly after recovery, and removing excess fats and oils by filtration.
  • oils and fats to be impregnated or infiltrated into the lipase powder are not particularly limited, and vegetable oils such as rapeseed oil, soybean oil, grapefruit oil, olive oil, olive oil, safflower oil, corn oil, coconut oil, sesame oil, etc.
  • vegetable oils such as rapeseed oil, soybean oil, grapefruit oil, olive oil, olive oil, safflower oil, corn oil, coconut oil, sesame oil, etc.
  • triacylglycerols such as triolein (glycerin trioleate), tricaprylin (glycerin trioctanoate), triacetin (glycerin triacetate), triptyline (glycerin triptylate), fatty acid esters, and sterol esters.
  • Triacylglycerols such as triolein (glycerin trioleate), tricaprylin (glycerin trioctanoate), triacetin (glycerin triacetate), tripty
  • the 1,3 selectivity of 1,3 specific lipase is improved in each step, and the fatty acid residue at position 2 of the starting triglyceride can be retained in the transesterified product at a very high ratio. it can.
  • a lipase (product name: Palatase 20000L) derived from Rhizomucor miehei manufactured by Novozyms Japan Ltd. in a form in which lipase is dissolved and dispersed in an aqueous solution is used by using a UF module (Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd. SIP-0013). A low-molecular component was removed to obtain a lipase-containing aqueous solution (solid content: 10.6% by mass).
  • liquid lipase (paratase 20000 L) was treated with a UF membrane under ice-cooling, concentrated to a volume of 1Z2, and then 0.01 M phosphate buffer of pH 7 was added in the same amount as the concentrated solution. The same operation of adding the phosphate buffer to the UF membrane after treatment of the obtained solution was repeated three times to obtain a lipase-containing aqueous solution (lipase concentrated solution: buffer at a volume ratio of 1: 1).
  • the pH of the lipase-containing aqueous solution was adjusted to pH 6.8 to 6.9 using an aqueous sodium hydroxide solution.
  • This liquid is sprayed using a spray dryer (SD-1000: manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) under the conditions of an inlet temperature of 130 ° C, a dry air volume of 0.7 to 1. lmVmin, and a spray pressure of ll to 12 kpa. Then Pase powder was obtained.
  • the shape of the lipase powder particles was spherical, and 90% by mass or more of the lipase powder was in the range of particle size 1 to LOO ⁇ m, and the average particle size was 8.2 ⁇ m.
  • the particle size was measured using a particle size distribution analyzer (LA-500) manufactured by HORIBA. The water content measured by the method of drying at 105 ° C for 1 hour and heat was 7.9% by mass.
  • the solid content concentration in the lipase-containing aqueous solution was determined as Brix.% Using a saccharimeter (BRX-242, manufactured by CIS Co., Ltd.).
  • Lipozyme RMIM manufactured by Novozims Japan KK in which lipase derived from Rhizomucor miehei was immobilized on an anion exchange resin was used as Comparative Example 1.
  • a lipase powder was obtained in the same manner as in Example 1, except that freeze drying was performed instead of spray drying (spray drying).
  • freeze-drying a lipase-containing aqueous solution whose pH has been adjusted to 6.8 to 6.9 is placed in an eggplant-shaped flask, frozen with dry ice methanol, and then freeze-dried by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd. (FDU-830). And freeze-dried at 0.15 Torr for 1 day. After drying, the mixture was lightly ground in a mortar to obtain a lipase powder.
  • the shape of the obtained lipase powder was amorphous, and the water content was 11.3% by mass.
  • Example 1,3-selectivity of the lipase powders of Comparative Example 1 and Comparative Example 2 was measured by the following method.
  • Table 1 shows the measurement results of 1,3-selectivity of Example 1 and Comparative Example 1.
  • the lipase powder obtained in Comparative Example 2 had a strong transesterification activity.
  • reaction substrates Using lmol of GRYCERYL-1,3-PALMITATE-2-OLEATE (POP) and 3mol of OCTANOIC ETHYL (C8Et) as reaction substrates, and adding lipase powder to be 0.5 to 5% by weight of the substrate, depending on the enzyme activity, The reaction was performed at 60 ° C, sampled over time, and diluted with hexane. This sample was analyzed by GC, and the reaction rates at the 1st and 3rd positions (C16: 0Et) and 2nd position (C18: 1Et) were determined by the following formula.
  • the value of the final reaction rate at this time is variable.
  • the reactivity of the 1,3-positions when the reactivity of the 2-position was set to 1 was determined.
  • Carrier gas helium
  • a 5-fold amount of rapeseed oil was added to the lipase powder obtained in Example 1, the lipase powder was impregnated with the rapeseed oil, and the oil and fat was removed by filtration.
  • the weight of lipase powder / rapeseed oil was 55/45. Was prepared.

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Abstract

　Rhizomucor miehei由来の1,3-特異性リパーゼであって、球状で、水分含量が１０質量％以下であるリパーゼ粉末、該リパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸潤されているリパーゼ組成物、及びｐＨが６～７.５に調整されてなるリパーゼ含有水溶液を噴霧乾燥することを含むリパーゼ粉末の製造方法。本発明により1,3-選択性が向上したリパーゼ粉末が提供される。

Description

明 細 書
1，3-特異性リパーゼ粉末、その製造方法及びその使用
技術分野
[0001] 本発明は、各種油脂のエステル交換反応などに好適に使用することができる 1,3- 特異性リパーゼ粉末、その製造方法、 1,3-特異性リパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸 潤されてなるリパーゼ組成物、該リパーゼ粉末を用いる油脂のエステル交換方法な どに関するものである。
[0002] (発明の背景）
リパーゼは、脂肪酸などの各種カルボン酸とモノアルコールや多価アルコールなど のアルコール類とのエステル化反応、複数のカルボン酸エステル間のエステル交換 反応などに幅広く使用されている。このうち、エステル交換反応は動植物油脂類の改 質をはじめ、各種脂肪酸のエステル、糖エステルやステロイドの製造法として重要な 技術である。これらの反応の触媒として、油脂加水分解酵素であるリパーゼを用いる と、室温ないし約 70°C程度の温和な条件下でエステル交換反応を行うことができ、従 来の化学反応に比べ、副反応の抑制やエネルギーコストが低減ィヒされるだけでなぐ 触媒としてのリパーゼが天然物であることから安全性も高い。また、その基質特異性 や位置特異性により目的物を効率良く生産することができる。ところが、リパーゼ粉末 をそのままエステル交換反応に用いても活性が十分に発現しないばかりか、元来が 水溶性のリパーゼを油性原料中に均一に分散させることは困難であり、その回収も困 難である。このため、従来はリパーゼを何らかの担体、たとえば陰イオン交換榭脂 (特 許文献 1)、フエノール吸着榭脂 (特許文献 2)、疎水性担体 (特許文献 3)、陽イオン 交換榭脂 (特許文献 4)、キレート榭脂 (特許文献 5)等に固定化してエステルイ匕ゃェ ステル交換反応などに用いることが一般的である。
[0003] このように、従来はリパーゼを固定ィ匕してエステル交換反応に用いて 、たが、力か る固定化リパーゼは固定ィ匕処理による本来のリパーゼ活性の損失を伴うだけでなぐ 多孔性担体を用いた場合は細孔に原料や生成物が詰まり、結果としてエステル交換 率の低下を招いていた。さらに、従来の固定化リパーゼを用いたエステル交換反応 においては、担体が保持する水分が反応系に持ち込まれるため、副反応、たとえば 油脂類のエステル交換反応におけるジグリセリドゃモノグリセリドの生成等を避けるこ とは困難であった。
このような状況に鑑み、リパーゼ粉末を用いる各種技術が開発されている。例えば 、不活性有機溶媒の存在下または非存在下、エステル交換反応時に分散リパーゼ 粉末粒子の 90%以上を 1〜100 μ mの範囲の粒径に保つように、エステルを含有す る原料にリパーゼ粉末を分散させてエステル交換反応を行う方法が提案されて ヽる ( 特許文献 6)。又、リン脂質および脂溶性ビタミンを含む酵素溶液を乾燥して得た酵 素粉末を用いることが提案されて 、る (特許文献 7)。
し力しながら、さらに 1 ,3-特異性リパーゼの 1 ,3-選択性が向上したリパーゼ粉末が 求められている。
[0004] 特許文献 1 :特開昭 60— 98984号公報
特許文献 2：特開昭 61 - 202688号公報
特許文献 3 :特開平 2— 138986号公報
特許文献 4：特開平 3 - 61485号公報
特許文献 5：特開平 1― 262795号公報
特許文献 6 :特許第 2668187号公報
特許文献 7：特開 2000— 106873号公報
発明の開示
[0005] 本発明は、 1,3-特異性リパーゼの 1,3-選択性が向上したリパーゼ粉末を提供するこ とを目的とする。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を油脂に浸漬又は浸潤されてなるリパーゼ組成 物を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末の製造方法を提供することを目的とする。 本発明は、又、上記リパーゼ粉末を用いる油脂のエステル交換方法を提供すること を目的とする。
本発明のこれらの目的及び他の目的は、以下の記載から明ら力となるであろう。
[0006] Rhizomucor miehei由来の 1,3-特異性リパーゼは極めて 1,3選択性が高いリパーゼ であり、陰イオン交換樹脂に固定化されて用いられているが、これを、固定用担体を 用いずに、球状で、水分含量が 10質量％以下の粉末状にすると、その 1,3選択性が さらに向上するとの知見に基づ!/、て本発明はなされたのである。
すなわち、本発明は、 Rhizomucor miehe油来の 1,3-特異性リパーゼであって、球 状で、水分含量が 10質量％以下であることを特徴とするリパーゼ粉末を提供する。 本発明は、又、上記リパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸潤されているリパーゼ組成 物を提供する。
本発明は、又、 pHが 6〜7. 5に調整されてなるリパーゼ含有水溶液を噴霧乾燥す ることを特徴とする、上記リパーゼ粉末の製造方法を提供する。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を含有するエステル交換用リパーゼを提供する。 本発明は、又、上記エステル交換用リパーゼを用いることを特徴とする油脂のエス テル交換方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明で対象とする 1,3特異性リパーゼは、リゾムコール属（Rhizomucor sp.)に属 するリゾムコール ミーヘイ（Rhizomucor miehei)由来の 1,3-特異性リパーゼである。 尚、従来、リゾムコーノレ ^一ヘイ (Rhizomucor miehei;は、ムコーノレ属 (Mucor sp.)と して扱われて 、た場合もある。
本発明では、このリパーゼを、形状が球状であって、水分含量が 10質量％以下で ある粉末として使用する。
水分含量は 10質量％以下とする力 6.5〜8.5質量％であるのが好ましい。
本発明のリパーゼ粉末の粒径は任意とすることができるが、リパーゼ粉末の 90質量 %以上が粒径 1〜100 μ mであるのが好ましい。又、平均粒径は 20〜80 μ mが好まし く、より好ましくは 20〜50 μ mである。
リパーゼ粉末の粒径は、例えば、 HORIBA社の粒度分布測定装置 (LA— 500)を 用いて測定することができる。
このようなリパーゼ粉末は、例えば、リパーゼ含有水溶液を噴霧乾燥 (スプレードラ ィ)することによって容易に調製することができる。
ここで、リパーゼ含有水溶液としては、菌体を除去したリパーゼ培養液、精製培養 液、これらから得たリパーゼ粉末を再度水に溶解 ·分散させたもの、市販のリパーゼ 粉末を再度水に溶解'分散させたもの、市販の液状リパーゼ等が挙げられる。さらに 、リパーゼ活性をより高めるために塩類等の低分子成分を除去したものがより好ましく 、また、粉末性状をより高めるために糖等の低分子成分を除去したものがより好まし い。
リパーゼ培養液としては、例えば、大豆粉、ペプトン、コーン'ステープ'リカー、 K H
2
PO、 (NH ) SO、 MgSO · 7Η Ο等含有する水溶液があげられる。これらの濃度と
4 4 2 4 4 2
しては、大豆粉 0. 1〜20質量％、好ましくは 1. 0〜10質量％、ペプトン 0. 1〜30質 量0 /0、好ましくは 0. 5〜10質量0 /0、コーン 'ステープ'リカー 0. 1〜30質量0 /0、好まし くは 0. 5〜10質量0 /0、 Κ ΗΡΟ 0. 01〜20質量0 /0、好ましくは 0. 1〜5質量0 /0であ
2 4
る。又、 (NH ) SO ίま 0. 01〜20質量0 /0、好ましく ίま 0. 05〜5質量0 /0、 MgSO · 7
4 2 4 4
Η Οは 0. 01〜20質量％、好ましくは 0. 05〜5質量％である。培養条件は、培養温
2
度 ίま 10〜40°C、好ましく ίま 20〜35°C、通気量 ίま 0. 1〜2. 0WM、好ましく ίま 0. 1 〜1. 5WM、攪拌回転数は 100〜800rpm、好ましくは 200〜400rpm、 ρΗは 3. 0 〜10. 0、好ましく ίま 4. 0〜9. 5に帘1』御するの力よ!/、。
菌体の分離は、遠心分離、膜濾過などで行うのが好ま 、。また、塩類や糖等の低 分子成分の除去は、 UF膜処理により行うことができる。具体的には、 UF膜処理を行 い、リパーゼを含有する水溶液を 1Z2量の体積に濃縮後、濃縮液と同量のリン酸バ ッファーを添加するという操作を 1〜5回繰り返すことにより、低分子成分を除去したリ パーゼ含有水溶液を得ることができる。
遠心分離は 200〜20, 000 X g、膜濾過は MF膜、フィルタープレスなどで圧力を 3 . 0kg/m2以下にコントロールするのが好ましい。菌体内酵素の場合は、ホモジナイザ 一、ワーリンダブレンダー、超音波破砕、フレンチプレス、ボールミル等で細胞破砕し 、遠心分離、膜濾過などで細胞残さを除去することが好ましい。ホモジナイザーの攪 拌回転数は 500〜30, 000rpm、好まし <は 1, 000〜15, 000rpm、ワージングブレ ンダ一の回転数は 500〜10, 000rpm、好まし <は 1, 000〜5, OOOrpmである。攪拌 時間は 0. 5〜10分、好ましくは 1〜5分がよい。超音波破砕は l〜50KHz、好ましく は 10〜20KHzの条件で行うのが良い。ボールミルは直径 0. 1〜0. 5mm程度のガラ ス製小球を用いるのがよ 、。 本発明では、リパーゼ含有水溶液としては、固形分として 5〜30質量％含むものを 用いるのが好ましい。
ここで、リパーゼ含有水溶液中の固形分濃度は、例えば、糖度計（(株)シ一'アイ' エス社製 BRX-242)を用いて Brix.%として求めることができる。
[0009] 噴霧乾燥 (スプレードライ)などの乾燥工程の直前に、リパーゼ含有水溶液の pHを 6〜7.5に調整するのが好ましい。特に pHを 7.0以下に、さらに pHを 6.5〜7.0の範 囲となるように調整するのが好ましい。 pH調整は、噴霧乾燥 (スプレードライ)などの 乾燥工程の前のいずれかの工程において行ってもよぐ乾燥工程の直前の pHが上 記範囲内となるように、予めリパーゼ含有水溶液の pHを調整しておいてもよい。 pH 調整には、各種アルカリ剤や酸を用いることができる力 水酸ィ匕ナトリウムなどのアル カリ金属水酸ィ匕物を用いるのが好まし 、。
又、乾燥工程前の途中の工程において、リパーゼ含有水溶液を濃縮してもよい。濃 縮方法は、特に限定されるものではないが、エバポレーター、フラッシュエバポレータ 一、 UF膜濃縮、 MF膜濃縮、無機塩類による塩析、溶剤による沈殿法、イオン交換 セルロース等による吸着法、吸水性ゲルによる吸水法等があげられる。好ましくは UF 膜濃縮、エバポレーターがよい。 UF膜濃縮用モジュールとしては、分画分子量 3, 0 00〜風 000、好まし <は 6, 000〜50, 000の平膜または中空糸膜、材質はポジ アクリル-トリル系、ポリスルフォン系などが好ましい。
[0010] 噴霧乾燥 (スプレードライ）は、例えば、ノズル向流式、ディスク向流式、ノズル並流 式、ディスク並流式等の噴霧乾燥機を用いて行うのがよい。好ましくはディスク並流 式力 s良く、アトマイザ一回転数は 4, 000〜20, OOOrpm、カロ熱は人口温度 100〜20 0°C、出口温度 40〜： L00°Cで制御して噴霧乾燥 (スプレードライ)するのが好ま 、。 このようにして調製されたリパーゼ粉末はそのまま使用することができる力 油脂に 浸漬又は浸潤させたリパーゼ組成物として用いるのが取り扱 、性の点力 好まし 、。 ここで、リパーゼ組成物中の油脂の質量は、リパーゼ粉末に対し 0. 1〜20倍である のが好ましぐ 1〜20倍であるのがより好ましい。
[0011] このリパーゼ組成物は、噴霧乾燥 (スプレードライ)などにより製造されたリパーゼ粉 末に油脂を添加し、スターラーゃスリーワンモーター等で均一に攪拌する方法ゃスプ レードライヤーの粉末回収部に予め油脂を添加しておき、回収後に均一に攪拌し、 濾過により過剰の油脂を除去する方法により容易に得ることができる。
リパーゼ粉末に含浸又は浸潤させる油脂としては、特に限定されず、菜種油、大豆 油、ノ、ィォレイツクヒマヮリ油、ォリーブ油、サフラワー油、コーン油、ヤシ油、ゴマ油な どの植物油、トリオレイン (グリセリン トリオレエート）、トリカプリリン (グリセリン トリオク タノエート）、トリァセチン (グリセリン トリアセテート）、トリプチリン (グリセリン トリプチ レート）などのトリァシルグリセロール、脂肪酸エステル、ステロールエステルなどの 1 種又は 2種以上の混合物があげられる。
このリパーゼ粉末を用い、常法により、油脂などのエステル交換反応を効率的に行 うことができる。
本発明によれば、 1,3特異性リパーゼの 1,3選択性が各段に向上し、原料トリグリセリ ド 2位の脂肪酸残基を極めて高 ヽ割合で、エステル交換製品中に保持することがで きる。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例
実施例 1
水溶液にリパーゼが溶解'分散した形態にあるノボザィムズ ジャパン (株)社製の Rhizomucor miehei由来のリパーゼ（商品名 Palatase 20000L)を、 UFモジュール（旭 化成工業 (株)社製 SIP-0013)を用いて低分子成分を除去してリパーゼ含有水溶液 ( 固形分濃度 10. 6質量％)を得た。詳しくは、液状リパーゼ (パラターゼ 20000L))を氷 冷下で UF膜処理を行い、 1Z2量の体積に濃縮後、濃縮液と同量の pH7の 0. 01M リン酸バッファーを添加した。得られた溶液について、同じように UF膜処理後リン酸 ノ ッファーを添加する操作を 3回繰り返し、リパーゼ含有水溶液 (リパーゼ濃縮液:バ ッファーの体積比は 1： 1)を得た。
このリパーゼ含有水溶液の pHを水酸化ナトリウム水溶液を用いて pH6. 8〜6. 9に 調整した。
この液を、スプレードライヤー（SD- 1000型:東京理化器械 (株)社製)を用い、入口 温度 130°C、乾燥空気量 0. 7〜1. lmVmin,噴霧圧力 l l〜12kpaの条件下噴霧し、リ パーゼ粉末を得た。リパーゼ粉末粒子の形状は球状で、リパーゼ粉末の 90質量％ 以上が粒径 1〜： LOO μ mの範囲内にあり、平均粒径は 8. 2 μ mであった。粒径は、 HORIBA社の粒度分布測定装置 (LA— 500)を用いて測定した。 105°C、 1時間の乾 熱乾燥の方法により測定した水分含量は 7. 9質量％であった。
尚、リパーゼ含有水溶液中の固形分濃度は、糖度計（(株)シー ·アイ 'エス社製 BRX-242)を用いて Brix. %として求めた。
[0013] 比較例 1
Rhizomucor miehei由来のリパーゼが陰イオン交換樹脂に固定化されてなるノボザ ィムズ ジャパン (株)社製のリポザィム RM IMを比較例 1として用いた。
[0014] 比較例 2
噴霧乾燥 (スプレードライ)を行う代わりに、フリーズドライを行った以外は、実施例 1 と同様にしてリパーゼ粉末を得た。フリーズドライは、 pHが 6. 8〜6. 9に調整されたリ パーゼ含有水溶液をナスフラスコに入れ、ドライアイスメタノールで凍結後、東京理化 器械 (株)社製のフリーズドライヤー（FDU- 830)を用い、 0. 15Torrで 1日凍結乾燥を 行った。乾燥後、乳鉢で軽く粉砕しリパーゼ粉末を得た。得られたリパーゼ粉末の形 状は無定形で、水分含量は 11. 3質量％であった。
実施例 比較例 1、及び比較例 2のリパーゼ粉末の 1,3-選択性を以下の方法で測 定した。実施例 1及び比較例 1の 1,3-選択性の測定結果を表 1に示す。なお、比較例 2で得られたリパーゼ粉末は、エステル交換活性が全くな力つた。
[0015] 1,3-選択性の測定方法
反応基質として GRYCERYL- 1,3- PALMITATE- 2- OLEATE(POP)lmol及び OCTANOIC ETHYL(C8Et) 3molを用い、酵素活性に応じて、基質の 0.5〜5w%と なるようにリパーゼ粉末を添加し、 60°Cで反応を行い、経時的にサンプリングしへキ サンで希釈した。このサンプルを GC分析し以下の式により 1 · 3位（C16:0Et)と 2位 (C18:lEt)の反応率を求めた。
C16:0Et(%)={C16:0Et aria/(C16Et+C18:lEt area+C8Et area)} X 100
C18:lEt(%)={C18:lEt area/(C16Et+C18:lEt area+C8Et area)} X 100
各時間における各々の反応率力 解析ソフト (orijin ver.6.1)により反応速度定数 K を求めた。この時の最終反応率の値は可変とする。 2位の反応性を 1とした時の 1,3位 の反応'性を求めた。
く GC条件〉
カラム ： DB-lht 5m
注入量 ： 1 1
キャリアガス：ヘリウム
気化室温度: 360°C
検出器温度: 370°C
カラム温度：初期 50°C、昇温 15°C/min、最終 370°C
[0016] 表 1
条件 1,3-選択性 （向上率％)
比較例 1 (固定化リパーゼ） 11. 1
実施例 1 (噴霧乾燥） 20. 8 ( Δ 87%)
表— 1の結果から、本発明によると 1,3-特異性リパーゼの 1,3-選択性が 87%も向上 することがわかった。
[0017] 実施例 2
実施例 1で得られたリパーゼ粉末に、 5倍量の菜種油を加えて、菜種油にリパーゼ 粉末を含浸'浸潤させ、濾過により過剰の油脂を除去し、リパーゼ粉末/菜種油の重 量が 55/45であるリパーゼ組成物を調製した。

Claims

請求の範囲
[I] Rhizomucor miehei由来の 1,3-特異性リパーゼであって、球状で、水分含量が 10質 量％以下であることを特徴とするリパーゼ粉末。
[2] pHが 6〜7.5に調整されてなるリパーゼ含有水溶液が噴霧乾燥されて製造された ものである請求項 1記載のリパーゼ粉末。
[3] pHが 6.5〜7に調整されてなるリパーゼ含有水溶液が噴霧乾燥されて製造された ものである請求項 2記載のリパーゼ粉末。
[4] リパーゼ含有水溶液が、菌体を除去したリパーゼ培養液またはその精製培養液で ある請求項 2又は 3項に記載のリパーゼ粉末。
[5] リパーゼ含有水溶液が、 UF膜処理されたものである請求項 2〜4のいずれか 1項 記載のリパーゼ粉末。
[6] リパーゼ粉末の 90質量％以上が粒径 1〜100 μ mである請求項 1〜5のいずれか 1 項記載のリパーゼ粉末。
[7] 水分含量が 6.5〜8.5質量％である請求項 1〜6のいずれか 1項記載のリパーゼ粉 末。
[8] 請求項 1〜7のいずれか 1項記載のリパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸潤されてい るリパーゼ組成物。
[9] 前記リパーゼ組成物中の油脂の質量が、リパーゼ粉末に対し 0.1〜20倍である請 求項 8記載のリパーゼ組成物。
[10] pHが 6〜7.5に調整されてなるリパーゼ含有水溶液を噴霧乾燥することを特徴とす る、請求項 1〜7のいずれか 1項記載のリパーゼ粉末の製造方法。
[II] 請求項 1〜7のいずれか 1項記載のリパーゼ粉末を含有するエステル交換用リパー ゼ。
[12] 請求項 11記載のエステル交換用リパーゼを用いることを特徴とする油脂のエステ ル交換方法。
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