WO2005095613A1

WO2005095613A1 - Rad51の発現抑制剤、該発現抑制剤を有効成分として含む医薬、及びその使用

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Abstract

特定の塩基配列を有する２本鎖RNAが、細胞増殖性疾患の治療に有用である。この２本鎖RNAは、Rad51遺伝子のsiRNAとして作用する。本発明における２本鎖RNAは、それ自身が細胞増殖を抑制する。また本発明の２本鎖RNAを化学療法剤とともに投与することによって、その薬理作用を更に増強する。核酸合成阻害作用、あるいは核酸障害作用を有する薬剤との併用は、特に効果的である。

Description

明細書

Rad51の発現抑制剤、該発現抑制剤を有効成分として含む医薬、及びその使用

技術分野

[0001] 本発明は、 Rad51の発現抑制剤、該発現抑制剤を有効成分として含む医薬、該医薬を調製する方法、あるいはがんまたは悪性腫瘍の治療方法に関する。

背景技術

[0002] ここ 10余年来、日本における死亡原因の第 1位はがんによって占められている。がん細胞は、細胞分裂の制御機構に異常を生じた細胞が、際限の無い分裂増殖を開始した状態と説明することができる。がん細胞の無秩序な増殖が正常な組織やその機能を障害する疾患が、がんである。

[0003] がんの治療には、物理科学的な治療、外科的な治療、および投薬による治療などが行われている。物理科学的な治療は、放射線や陽子線をがん病巣に照射し、その細胞障害作用によって、がん細胞を攻撃する。外科的な治療は、固形がんを手術によって取り除く治療方法である。投薬による治療は、がん細胞の生存あるいは増殖に対して阻害的に作用する薬剤の投与によって行われる。

[0004] 化学的に合成されたィ匕合物、あるいはヒト以外の生物力単離されたィ匕合物を有効成分として含有する薬剤の投与によってがんを治療する方法は、特に化学療法 (chemotherapy)と呼ばれている。化学療法に用いられる薬剤が、化学療法剤 (chemotherapeutic agent)である。更に化学療法剤は、その作用によって以下のように分類することができる。

[0005] 制がん剤 (carcinostatic agent) :がん細胞の増殖を抑制する作用を有する薬剤。がん細胞は、その無秩序な増殖が疾患の原因となっている。したがって、たとえがん細胞を死滅させることができなくても、増殖を抑制することが可能であれば、治療効果を期待できる。

抗がん剤 (anticancer agent) :制がん剤ががん細胞の増殖を抑制するのに対して、がん細胞に対して殺傷効果を有する薬剤を特に杭がん剤と言う。制がん剤ではがんの拡大は抑制される力縮退効果は小さい。これに対して抗がん剤においては、がんの縮退効果が期待できる。抗がん剤は制がん剤に含まれる概念である。

抗腫剤 (antitumor agentま 7こは antineoplastic agent) :帘 [J力ん剤めいは饥カん剤は、がん、すなわち悪性腫瘍に対する作用を有する薬剤を指す用語である。これに対して抗腫瘍剤は、良性腫瘍を含む腫瘍全般に対する作用を有する薬剤を言う。抗腫瘍剤は、増殖性細胞（proliferative cell)を抑制する薬剤と言うこともできる。

[0006] その他、宿主に抗腫瘍免疫を誘導する、 Vヽゎゆるがんワクチンや、免疫増強剤の投与も、投薬による治療に含まれる。更に、がんを傷害する抗体、あるいはがんに結合する抗体を細胞障害性化合物で標識した抗体の投与も、投薬による治療に含まれる。これらの治療方法は、がんの種類、進行状態、そして宿主の状態などを考慮して、適切な治療方法が選択される。また、一般にこれらの治療方法は、複数の治療方法が併用される。

[0007] 更に、がんの発生や増殖に関与する遺伝子の発現を調節によるがんの治療は、既に臨床応用が検討されている。たとえば以下の遺伝子の発現阻害による、がんの治療が公知である。遺伝子の発現阻害には、アンチセンスやリボザィムが利用された。 c-myc

H-ras

c- raf³^ナーゼ

[0008] その他に、がんが有する細胞の修復機構の阻害によって、がんの治療効果を高める試みも報告された。細胞は、電離放射線やある種の杭がん剤によっておこる DNA の損傷を修復する機構を備えている。たとえば、相同組換え修復機構、あるいは非相同組換え修復機構は、 DNA二本鎖の切断を修復する。相同組換え修復機構においては、 2本鎖切断時に相同染色体や姉妹染色体分体を铸型として組換えが行われ、切断部分が修復される。相同組換え修復に必要な酵素として次のような酵素が知られている。これらの酵素の中で、 Rad51の発現をアンチセンスオリゴヌクレオチドで抑制すると腫瘍の放射線感受性を増強できることが知られて、る (US

2003/0229004、 WO 03/13488)。更に RAD51の阻害によって p53の遺伝子治療効果が高まることも公知である（WO 02/58738)。 Rad51 Rad52 Rad54 Rad51B Rad51C Rad51D

XRCC2 XRCC3

[0009] 一方、遺伝子の発現制御技術として RNA干渉（RNA interference; RNAi)が注目されている。 RNAiは、 mRNAと同じ塩基配列を含む 2本鎖構造を有する RNAによって、その mRNAが切断される結果、蛋白質の発現が抑制される現象である (Nature, 1998 Feb 19; 391 (6669): 806-11; Nature, 2001 May 24; 411 (6836): 494-8)。同じ遺伝子の発現制御技術であるアンチセンスオリゴヌクレオチドによる発現抑制効果と比較して、その効果は 10³〜10⁷倍に及ぶと報告されている (Biochem. Biophys. Res.

Commun. 296: 1000-1004, 2002)。 RNAi効果を示す 2本鎖 RNAを、特に siRNA (small interfering RNA)と呼ぶ。たとえば、その変異ががんの原因となっていることが知られている以下のような遺伝子について、 siRNAによるがんの治療効果が明らかにされている。

k-ras (Nucleic Acids Res., 31: 700-707, 2003)

p53 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99: 14849-14854, 2002)

特許文献 1 : US 2003/0229004

特許文献 2 : WO 03/13488

特許文献 3 : WO 02/58738

非特許文献 l : Fire A. et al.， Nature, 1998 Feb 19; 391 (6669): 806-11

非特許文献 2 : Elbashir SM. et al.， Nature, 2001 May 24; 411 (6836): 494-8 非特許文献 3 : Biochem. Biophys. Res. Commun. 296: 1000-1004, 2002

非特許文献 4 : Nucleic Acids Res., 31: 700-707, 2003

非特許文献 5 : Martinez LA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99: 14849-14854, 2002

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0010] 本発明の課題は、細胞増殖性疾患の治療技術の提供である。より具体的には、本発明は、 Rad51の発現制御によるがんの治療技術の提供を課題とする。

課題を解決するための手段 [0011] Rad51は、大腸菌の RecAの哺乳類におけるホモログである。 Rad51をノックアウトしたマウスは、胎生致死となることが報告されている。これらの情報から、 Rad51が生体で極めて重要な機能を果たしていることが強く示唆されている。更に、 Rad51の発現をァンチセンスオリゴヌクレオチドで抑制すると、腫瘍の放射線感受性を増強できることが知られている。

[0012] 本発明者らは、 Rad51の siRNAによる発現抑制を実現すれば、腫瘍の治療に有用であると考え、効果的な siRNAの探索を重ねた。その結果、配列番号： 1に記載の塩基配列を含む 2本鎖 RNA力 Rad51の siRNAとして有効であることを見出した。更に、当該 siRNAと化学療法剤との併用によって著しい細胞増殖抑制作用が見られることを明らかにした。加えて本発明者は、 siRNAあるいは化学療法剤との組成物の投与に、ウィルスエンベロープベクターの利用が有利であることを見出した。すなわち本発明は、以下の医薬組成物、あるいは siRNAとして有用な 2本鎖 RNA、並びにそれらの使用に関する。

[0013] 〔1〕配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNAであって、センス鎖の長さが 100塩基以下である 2本鎖 RNA。

〔2〕配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNAであって、センス鎖の長さが 100塩基以下である 2本鎖 RNAを発現するベクター。

〔3〕〔1〕に記載の 2本鎖 RNA、または〔2〕に記載のベクターを有効成分として含有する、 Rad51遺伝子の発現抑制剤。

〔4〕Rad51遺伝子がヒト Rad51遺伝子である〔3〕に記載の Rad51遺伝子の発現抑制剤

〔5〕配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNA、またはそれを発現することができるベクターを有効成分として含有する医薬組成物。

〔6〕配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNA、またはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物。

〔7〕がんまたは悪性腫瘍の治療用である〔6〕に記載の医薬組成物。

〔8〕化学療法剤が、制がん剤 (carcinostatic agent),抗がん剤 (anticancer agent),および抗腫瘍剤 (antitumor agentまたは antineoplastic agent)からなる群から選択される〔6〕に記載の医薬組成物。

〔9〕化学療法剤が、核酸合成阻害作用、および核酸障害作用のいずれか、または両方を有する化学療法剤である〔6〕に記載の医薬組成物。

〔10〕化学療法剤が、ブレオマイシン類、アントラキノン系制がん剤、マイトマイシン類、ァクチノマイシン類、カンプトテシン類、シスプラチン類、ストレプトゾトシン、 5-フルォロウラシル (5-FU)およびその誘導体、ピラルビシン、およびそれらの薬理学的に許容される塩力もなる群力も選択されるいずれかの化合物の少なくとも 1つである、〔6〕に記載の医薬組成物。

〔11〕ブレオマイシン類力ブレオマイシン、およびべプロマイシンからなる群から選択されるいずれかの化合物である〔10〕に記載の医薬組成物。

〔12〕ブレオマイシン類の薬理学的に許容される塩力塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、および硫酸ぺプロマイシン力なる群力選択される、ずれかの化合物である、〔10〕に記載の医薬組成物。

〔13〕シスブラチン類力シスブラチン、ノラプラチン (Paraplatin)、およびブリブラチン (Briplatin)力もなる群力選択されるいずれかの化合物である、〔10〕に記載の医薬組成物。

〔14〕化学療法剤力 2本鎖 RNAとともにウィルスエンベロープベクターに封入されていることを特徴とする、〔6〕に記載の医薬組成物。

〔15〕ウィルスエンベロープベクター力レトロウイルス科、トガウィルス科、コロナウイルス科、フラビウィルス科、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ブニヤウィルス科、ラブドウイノレス科、ボックスウイノレス科、へノレぺスゥイノレス科、バキュロウイノレス科、およびへパドナウィルス科力なる群力選択される科に属するウィルスのェンベロープで構成されている、〔14〕に記載の医薬組成物。

〔16〕ウィルスエンベロープベクター力センダイウィルス、レトロウイルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルスまたはインフルエンザウイルスからなる群から選択されたいずれかのウィルスのェンべロープで構成されている、〔14〕に記載の医薬組成物。〔17〕（a)配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNAを有効成分として含有する医薬組成物、及び (b)化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物を含む、組み合わせ物。

〔18〕（a)配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNAを発現することができるベクターを有効成分として含有する医薬組成物、及び (b)化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物を含む、組み合わせ物。

〔19〕がんまたは悪性腫瘍の治療用である〔17〕または〔18〕のいずれか一項に記載の組み合わせ物。

〔20〕化学療法剤力制がん剤 (carcinostatic agent),抗がん剤 (anticancer agent), および抗腫瘍剤 (antitumor agentまたは antineoplastic agent)からなる群から選択される〔17〕〜〔19〕のいずれか一項に記載の組み合わせ物。

〔21〕化学療法剤が、核酸合成阻害作用、および核酸障害作用のいずれか、または両方を有する化学療法剤である〔17〕〜〔19〕のいずれか一項に記載の組み合わせ物。

〔22〕化学療法剤が、ブレオマイシン類、アントラキノン系制がん剤、マイトマイシン類、ァクチノマイシン類、カンプトテシン類、シスプラチン類、ストレプトゾトシン、 5-フルォロウラシル (5-FU)およびその誘導体、ピラルビシン、およびそれらの薬理学的に許容される塩力もなる群力も選択されるいずれかの化合物の少なくとも 1つである、 [17 〕〜〔19〕のいずれか一項に記載の組み合わせ物。

〔23〕ブレオマイシン類力ブレオマイシン、およびべプロマイシンからなる群から選択されるいずれかの化合物である〔22〕に記載の組み合わせ物。

〔24〕ブレオマイシン類の薬理学的に許容される塩力塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、および硫酸ぺプロマイシン力なる群力選択される、ずれかの化合物である、〔22〕に記載の組み合わせ物。

〔25〕シスプラチン類が、シスプラチン、パラプラチン (Paraplatin)、およびブリブラチン (Briplatin)力もなる群力も選択されるいずれかの化合物である、 [22]に記載の組み合わせ物。

〔26〕 2本鎖 RNA力ウィルスエンベロープベクターに封入されていることを特徴とする、〔17〕または〔18〕の、ずれか一項に記載の組み合わせ物。

〔27〕ウィルスエンベロープベクター力レトロウイルス科、トガウィルス科、コロナウイルス科、フラビウィルス科、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ブニヤウィルス科、ラブドウイノレス科、ボックスウイノレス科、へノレぺスゥイノレス科、バキュロウイノレス科、およびへパドナウィルス科力なる群力選択される科に属するウィルスのェンベロープで構成されている、〔26〕に記載の組み合わせ物。

〔28〕ウィルスエンベロープベクター力センダイウィルス、レトロウイルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルスまたはインフルエンザウイルスからなる群から選択されたいずれかのウィルスのェンべロープで構成されている、〔26〕に記載の組み合わせ物。

〔29〕〔1〕に記載の 2本鎖 RNA、または〔2〕に記載のベクターを細胞に投与する工程を含む、 Rad51の発現抑制方法。

〔30〕配列番号：1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNAまたはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を投与する工程を含む、がんまたは悪性腫瘍の治療方法。

〔31〕 2本鎖 RNAまたはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を投与する工程が、 2本鎖 RNAおよびィ匕学療法剤が封入されたウィルスエンベロープべクタ一を投与する工程である、〔30〕に記載の治療方法。

〔32〕 2本鎖 RNAまたはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を投与する工程が、 2本鎖 RNAまたはそれを発現することができるベクターを有効成分として含有する医薬組成物、及び化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物を別々に投与する工程である、〔30〕に記載の治療方法。

〔33〕がんまたは悪性腫瘍を治療するための医薬組成物の調製のための、〔1〕に記載の 2本鎖 RNA、または〔2〕に記載のベクターの使用。

〔34〕医薬組成物が化学療法剤を含む、〔1〕に記載の 2本鎖 RNA、または〔2〕に記載のベクターの使用。

〔35〕ブレオマイシンまたはその薬学的に許容される塩、および Rad51インヒビターを含む、医薬組成物。〔36〕シスプラチンまたはその薬学的に許容される塩、および Rad51インヒビターを含む、医薬組成物。

〔37〕 (a)ブレオマイシンまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物、および (b) Rad51インヒビターを有効成分として含有する医薬組成物を含む、組み合わせ物。

〔38〕 (a)シスブラチンまたはその薬学的に許容される塩有効成分として含有する医薬組成物、および (b) Rad51インヒビターを有効成分として含有する医薬組成物を含む、組み合わせ物。

〔39〕がんまたは悪性腫瘍の治療用である〔37〕または〔38〕の、ずれか一項に記載の組み合わせ物。

発明の効果

[0014] 本発明により、 Rad51の siRNAとして有用な 2本鎖 RNAが提供された。本発明の 2本鎖 RNAは、 Rad51の発現を効果的に抑制する。本発明の 2本鎖 RNAは、がん細胞の増殖抑制剤として有用である。あるいは放射線や陽子線の照射によるがんの治療方法において、その治療効果を高める効果を有する。 Rad51のアンチセンスががんの放射線に対する感受性を増強することが知られている。本発明の 2本鎖 RNAは、アンチセンスよりもはるかに強力に遺伝子発現を抑制する。したがって、放射線に対する感受性の増強効果もより強力であると予測される。

また本発明の 2本鎖 RNAは、化学療法剤との併用によって、更に顕著な制がん作用を示す。すなわち本発明によって、 2本鎖 RNAと化学療法剤を含む医薬組成物が提供された。本発明の医薬組成物は、がんの治療に有用である。

図面の簡単な説明

[0015] [図 1]5種類の Rad51 siRNAの標的部位を示した図である。 siRNA 321、 462、 989、 89 、及び 828は、それぞれ配列番号： 1、 2、 3、 4、及び 5に対応する。 siRNA 321 (配列番号： 1)のみで発現抑制効果が見られ、他の siRNAでは抑制効果は見られな力つた

[図 2]siRNAによる Rad51のノックダウンを示す写真である。 HVJエンベロープベクターにより Rad51 siRNA (ターゲット 321)を HeLa細胞に導入し、 Rad51蛋白の発現を経日的に調べた。対照として、スクランブル siRNA (配列番号: 6) を用いた。蛋白質量の内部標準として β -ァクチンを検出した。 Rad51 siRNA (321)は、長期にわたって Rad51蛋白の発現を抑制できることが示されている。

[図 3]アンチセンスオリゴ核酸に対する siRNAの優位性を示す写真である。 (A) Rad51 siRNA (321)、スクランブル配列（配列番号： 6)からなる siRNA (SC siRNA)、またはゥィルスべクタ一のみ (Empty HVJ-E)をそれぞれ導入した HeLa細胞のノーザンブロットを示す。（B)同様に、従来使われてきた Rad51のアンチセンスオリゴ核酸 (Rad51 AS#1または Rad51 AS#2)または Rad51のアンチセンスオリゴ核酸のスクランブル配列（ SC AS)をそれぞれ導入した HeLa細胞のノーザンブロットを示す。

[図 4]Rad51 siRNAとブレオマイシンとの併用による抗腫瘍効果を示す図である。 (A) 実験のスケジュールを示す。（B) Rad51 siRNA (ターゲット 321) (Rad51 siRNA)または対照のスクランブル siRNA (SC siRNA)を HVJエンベロープベクターによりそれぞれ導入したがん細胞における生存細胞数を示す。 Rad51 siRNA (321)の導入は、抗がん剤効果を約 2倍増強することが示されてヽる。

[図 5]Rad51 siRNAによるがん細胞のシスプラチン感受性の増強を示す図である。 (A) 実験のスケジュールを示す。（B) HVJエンベロープベクターにより、 Rad51 siRNA (タ一ゲット 321XHVJ- Rad51 siRNA)または対照のスクランブル siRNA (HVJ- SC siRNA) を HeLa細胞に導入し、経日的に細胞相対数の変化を調べた細胞増殖曲線を示す。 (C)また、シスブラチンを図示した濃度で添加し、相対コロニー数を調べたコロニー形成能を示す。 Rad51 siRNAとシスプラチンとの併用により、がん細胞のコロニー形成が有意に抑制されることが示されて、る。

[図 6]Rad51 siRNA (321)及びシスプラチン（CDDP)の併用による、各種ヒトがん細胞のシスブラチン感受性の増強を示す図および写真である。 (A)各種ヒトがん細胞として、 PANし- 1 (.pancreatic cancer) ^ AsPC- 1 (pancreatic cancer) ^ A549 (lung cancer) ^ DU145 (prostate cancer) ^ MCF7 (mammary carcinoma) ^及び HeLa S- 3 (cervical cancer)における蛋白レベルを示す。内部標準として用いた Ku70及び βァクチンはほぼ同レベルであるのに対し、 Rad51蛋白レベルは様々であることが示されている。 (B) siRNAに加えて CDDP (0.1 μ g/ml)を投与した場合の細胞の生存率を示す。対照のスクランブル siRNA (SC siRNA + 0.1 μ g/ml CDDP)の場合は 80%以上の細胞が生存したのに対し、 Rad51 siRNA (321) (Rad51 siRNA + 0.1 μ g/ml CDDP)の場合はどのがん細胞においても CDDP感受性が 30%以上増加した。

[図 7]Rad51 siRNA (321)を正常ヒト細胞またはがん細胞に導入したときの、シスプラチン（CDDP)感受性の変化を示す図である。 (A)Rad51 siRNA (321)を導入したヒト正常 2倍体繊維芽細胞 (Normal human diploid fibroblast, NHDF)または HeLa細胞におけるシスブラチン濃度依存性を示す。 NHDFでは、シスブラチン濃度の上昇に伴う感受性の変化は観察されず、約 90%の細胞が生存していたのに対し、 HeLa細胞では CDDPの濃度依存性に感受性が増強された。 (B)Rad51 siRNA (321)を導入した NHDFまたは HeLa細胞において、 CDDPの有無によるアポトーシスの率の相違を、ァネキシン V(AnnexinV)陽性細胞の割合として測定した。 CDDP非存在下（Rad51 siRNA + Medium)ではアポトーシス細胞の率は HeLa細胞（4.0士 1.1%)と NHDF (3.2 士 0.5%)とで変化がなかった。しかし CDDP存在下 (Rad51 siRNA + 0.1 μ g/ml CDDP)では、アポトーシス細胞の率は HeLa細胞で 15.0%に増加したのに対し、 NHDFではほとんど増加しなかった（4.9%)。

[図 8]Rad51 siRNA (321)とシスプラチンとの併用によるインビボにおける抗腫瘍効果を示す図である。マウスに HeLa細胞を移植して形成させた腫瘍塊に、 Rad51 siRNA ( ターゲット 321) ( Rad51 siRNA)、対照のスクランブル siRNA ( SC siRNA)を HVJェンベロープベクターにより導入し、さらにシスブラチン（CDDP)を腹腔内投与して腫瘍体積の変化を調べた。 Rad51 siRNA (321)とシスブラチンの併用により、腫瘍増殖が完全に抑制できることが示されて、る。

発明を実施するための最良の形態

本発明は、配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNAであって、センス鎖の長さが 100塩基以下である 2本鎖 RNAに関する。本発明の 2本鎖 RNAを構成するセンス鎖の長さは、少なくとも 19塩基 (配列番号： 1)、通常 19〜50 塩基、たとえば 19〜30塩基、好ましくは 19〜25塩基、あるいは 19〜23塩基である。本発明の 2本鎖 RNAを構成するセンス鎖の塩基配列には、 2本鎖 RNAが Rad51の発現を抑制する機能を有する限り、ヒト Rad51の mRNAを構成する塩基配列と完全に同一でない塩基配列が含まれる。たとえば、 1 5塩基の変異は許容される。より具体的には、配列番号： 1における 1塩基の変異は許容される。

[0017] 本発明の 2本鎖 RNAにおいて、センス鎖の塩基配列が配列番号： 1に記載の塩基配列よりも長い塩基配列で構成される場合には、配列番号： 1の塩基配列に対して任意の塩基配列が付加される。本発明において、配列番号： 1の塩基配列に付加される塩基配列は、好ましくは、ヒト Rad51の mRNAを構成する塩基配列から選択することができる。配列番号： 1に示した塩基配列は、ヒト Rad51の mRNAを構成する塩基配列中、 321〜339塩基に相当する領域の塩基配列である。したがって、当該領域を含む連続する塩基配列は、本発明における付加される塩基配列として好ま、。

[0018] 更に、本発明の 2本鎖 RNAを構成するアンチセンス鎖は、センス鎖に対して高度な相補性を有する塩基配列で構成される。本発明において高度な相補性とは、たとえば 90%以上、通常 95%以上、好ましくは 98%以上、より好ましくは 99%以上の相補性を言う。塩基配列の相補性は、 blastnなどの公知のアルゴリズムによって決定することができる。本発明の 2本鎖 RNAを構成するアンチセンス鎖の塩基配列には、 2本鎖 RNAが Rad51の発現を抑制する機能を有する限り、センス鎖に対して完全に相補的でない塩基配列が含まれる。たとえば、 1 5塩基の変異は許容される。より具体的には、アンチセンス鎖における 1塩基の変異は許容される。

[0019] 本発明にお、て、 2本鎖 RNAとは、塩基対結合によって相補鎖をともなった構造を有する RNAを言う。 2本鎖 RNAを構成するセンス鎖とアンチセンス鎖は、異なる分子であっても良いし、同一の分子であることもできる。同一の分子の場合には、互いに相補的な塩基配列が同一の RNA分子の上に配置される。通常、このような分子は、センス鎖とアンチセンス鎖の間の塩基対結合によって、ステムループ構造を構成する。すなわち本発明の 2本鎖 RNAには、 2本鎖 RNA構造を部分構造として含むステムループ RNAが含まれる。

[0020] 本発明の 2本鎖 RNAは、 RNAポリメラーゼを利用して酵素的に RNAを合成することによって得ることができる。 RNAの酵素的な合成方法は公知である。すなわち、 RNA ポリメラーゼの認識配列（プロモーター）の下流に目的とする RNAをコードする DNAを配置した铸型 DNAを合成する。 2本鎖 RNAのセンス鎖とアンチセンス鎖を異なる分子として発現させる場合には、それぞれをコードする DNAがプロモーターの制御下に発現するようにデザインする。センス鎖とアンチセンス鎖を同一のベクターに配置することもできるし、異なるベクターに組み込んで同一の細胞に共形質転換することもできる。あるいは、同一分子として両者を発現させるには、目的とするステムループを構成する RNAをコードする DNAをベクターに組み込めばよい。ステムループ構造を与える RNAにおいて、ループ部分を構成する塩基配列は任意である。一般には、 5— 20塩基程度の任意の塩基配列が利用される。たとえば、 5'-ugugcuguc-3' (9塩基)などの塩基配列は、効果的なステムループ構造の siRNAを与える。

铸型 DNAに、リボヌクレオチド基質の存在下、 RNAポリメラーゼを作用させれば、铸型 DNAの塩基配列が RNAに転写される。 RNAポリメラーゼは、細胞内、あるいは細胞外において、铸型 DNAに作用させることができる。 RNAの転写には、 T7RNAポリメラーゼなどを利用することができる。細胞外で転写されたセンス鎖とアンチセンス鎖は、ハイブリダィズさせることによって 2本鎖 RNAを構成する。

細胞内で目的とする RNAを合成するためには、通常、目的とする RNAをコードする DNAを組み込んだ発現ベクターが細胞に導入される。 siRNAを細胞内で発現させるためのベクターは公知である。たとえば、以下の報告においては、 PolIII転写系を利用した siRNAの発現ベクターとして、 U6プロモーター、あるいは HIプロモーターなどを含む発現ベクターが利用されている。 PolIII転写系によって転写された RNAは、転写産物の 3'末端に 4つの uが付加される。

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Yu et al.,: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 6047-6052, 2002

Tuschl et al.,: Nature BiotechnoL, 20: 446-448, 2002

McManus et al.,: Nature Rev. Genet., 3: 737—747, 2002 Dykxhoorn et al.,: Nature Rev. Mol. Cell Biol, 77: 7174-7181, 2003

[0022] PolIII転写系を利用した siRNA発現用ベクターとして、以下の巿販のベクター（宝バィォ製)を利用することもできる。 U6プロモーターを利用した siRNA発現ベクター： pBAsi-hU6 DNA: human U6 promoter (Accession X07425)

pBAsi-mU6 DNA： mouse U6 promoter (Accession X06980)

HIプロモーターを利用した siRNA発現ベクター：

pBAsi-hHl DNA: human HI promoter (Accession ¾68670)

[0023] 更に、次のようなウィルスベクターに siRNAコンストラクトを導入し、長期にわたって細胞中で siRNAを発現させる試みも知られている。これらのウィルスベクターも、本発明の 2本鎖 RNAを発現させるためのベクターとして利用することができる。

アデノウイルス (Zender et al.,: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 7797-7802, 2003; Xia. et al" Nature BiotechnoL, 20: 1006-1010, 2002)

レンチウィルス (Qin et al.,: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 183-188, 2003) レトロウイルス (Barton et al.,: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 14943—14945, 2002) アデノ随伴ウィルス (Nature Med., 9: 1539-1544, 2003)

その他、 RNAをィ匕学的に合成することもできる。 RNAをィ匕学的に合成する方法は公知である。

[0024] 本発明の 2本鎖 RNAは RNAi効果によって、 Rad51遺伝子を発現する細胞において、その発現を抑制する。すなわち本発明の 2本鎖 RNAは、 Rad51の発現を制御する siRNAとして有用である。すなわち本発明は、配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖（アンチセンス鎖）とで構成される 2本鎖 RNAであって、センス鎖の長さが 100塩基以下である 2本鎖 RNA、またはそれを発現するベクターを含有する、ヒト Rad51遺伝子の発現抑制剤を提供する。あるいは本発明は、配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNAであって、センス鎖の長さが 100塩基以下である 2本鎖 RNA、またはそれを発現するベクターを投与する工程を含む、 Rad51の発現抑制方法に関する。

[0025] がん細胞における Rad51の発現抑制力がん細胞の放射線感受性を増強することがアンチセンスヌクレオチドを用いた実験で明らかにされている。本発明の 2本鎖 RNAは、アンチセンスヌクレオチドよりも強力に Rad51の発現を抑制する。したがって本発明の 2本鎖 RNAは、 Rad51の発現抑制を通じて、細胞増殖性疾患の治療に利用することができる。すなわち本発明は、配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNA、またはそれを発現することができるベクターを有効成分として含有する医薬組成物に関する。

[0026] 更に本発明者は、本発明の 2本鎖 RNAが、化学療法剤の治療効果を増強することを確認した。すなわち本発明は、配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNA、またはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤の両方を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。

[0027] さらに本発明の医薬組成物は、配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNAまたはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤のそれぞれを有効成分として含有する別々の医薬組成物の組み合わせ物としても提供される。本発明の医薬組成物は、特に細胞増殖性疾患の治療に有用である。本発明における細胞増殖性疾患には、たとえばがんが含まれる。

[0028] 一方、本発明にお!/、て、化学療法剤は、制がん剤 (carcinostatic agent),抗がん剤 (.anticancer agent) ^および抗腫揚^ (J (antitumor agent, or antineoplastic agent) む。本発明における望ましい化学療法剤は、核酸合成阻害作用、および核酸障害作用のいずれか、または両方を有する化学療法剤である。本発明において、核酸合成阻害作用とは、 DNAあるいは RNAの合成を阻害することを言う。核酸障害作用には、核酸の修飾、あるいは切断などの作用が含まれる。具体的には、たとえば以下の化学療法剤を好まヽ化学療法剤として示すことができる。以下に示す化学療法剤の中で、ブレオマイシンとシスプラチンは、 2本鎖 RNAとの組み合わせによって、特にがん細胞に対する障害作用に優れる組成物とすることができる。すなわち、ブレオマイシンまたはシスブラチンは、本発明における化学療法剤として好ま U、。

[0029] ブレオマイシン類（Bleomycins)：

ブレオマイシン類は、 Streptomyces verticillusから得られた抗生物質群である。構造的には、水溶性塩基性の糖ペプチドィ匕合物である。ブレオマイシン A2、ブレオマイシン B2、並びにべプロマイシンなどが制がん剤として実用化されている。 DNA分子の切断作用、並びに ATP依存性 DNAリガーゼの阻害作用を有する。扁平上皮がんの治療などに用いられている。ブレオマイシン類の薬学的に許容される塩としては、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、および硫酸ぺプロマイシンなどを示すことができる。

[0030] アントラキノン系制がん剤：

Strepotomyces属の産物で、特に急性白血病に対して治療効果を持つものが多!ヽ。更にダウノシルビシンの構造をィ匕学的に修飾して得られたドキソルビシンが合成され、固形腫瘍にも強い薬理活性を持つことがゎカゝつた。アントラキノン系制がん剤の薬理作用には、多くのメカニズムが関与することが明らかにされている。具体的には、 DNA内への挿入、トポイソメラーゼ IIとの相互作用、フリーラジカルの産生、あるいは細胞膜への作用などが報告されている。ミトキサントロンは、骨髄性白血病や乳がんの治療に用いられる。イダルビシンは経口投与が可能である。

塩酸ミトキサントロン（mitoxantrone)

塩酸アクラルビシン（aciarubicin)

塩酸イダルビシン（idarubicin)

[0031] マイトマイシン類（mitomycins) :

Streptomyces caespitosusから単離された抗生物質、およびその誘導体である。分子構造中に、キノン、ウレタン、アジリジンという 3つの制がん作用を有する構造を持つ。 DNAのアルキルィ匕によって DNAの側鎖に結合し合成を阻害する。作用スぺタトルが広ぐ多様ながんに対する有効性が知られている。

[0032] ァクチノマイシン類（actinomysins) :

Streptomyces属の放線菌から単離された複数の化合物、並びにその誘導体が知られている。たとえば、 Streomyces paraullusから単離されたァクチノマイシン Dは、橙黄色発色団とペプチドが結合した構造を有する巨大分子である。 DNAの二重らせん構造のグァニンとァクチノマイシン Dが結合し、転写を阻害する。ウィルスムス腫瘍ゃホジキン病等の治療に用いられる。

[0033] カンプトテシン類：

クロタキカズラ科クサミズキ（Nothapodytes foetida)、ヌマミズキ科カンレンボタ (Camptotheca acuminata)などから抽出された植物アルカロイド、並びにその類縁ィ匕合物である。分子構造に、キノリン骨格を有する。イリノテカン（トポテシン）、ノギテ力ン、ェキサテカンは、植物カンプトテシンの誘導体である。

[0034] シスプラチン類（cisplatins) :

シスブラチンは、構造中に白金を含む錯体化合物で、がんの成長を抑制する働きがある。シスプラチン類に含まれる制がん剤として、カルポプラチン、およびネダプラチンなどが知られている。いずれの化合物も、 DNAのグァニンと結合することによって制がん作用をもたらすと考えられている。シスプラチン、パラプラチン（Paraplatin)、およびブリブラチン（Briplatin)などが知られている。

[0035] ストレプトゾトシン：

メチルニトロソゥレアとして脾島細胞に直接の毒性はあるものの、臨床的に杭がん剤として有用であることが確認された。ストレブトゾトシンは、脾のインスリノーマや消化管内分泌腫瘍の治療手段の一つとなりうる。

[0036] 5-フルォロウラシル (5- FU)およびその誘導体：

ピリミジン代謝拮抗物質（antipyrimidines)に分類される制がん剤には、以下のような化合物が知られて、る。これらの化合物は DNA合成にぉ、てピリミジンと拮抗し、 DNAポリメラーゼを阻害する。各種の固形がんや白血病に対する有効性が確認されている。

5-フルォロウラシル (5-FU)

5-フルォロデオキシゥリジン（FUDR)

テガフーノレ

シタラビン

アンシタビン

ァザゥリジン

[0037] ピラノレビシン：

心毒性の少な、新ヽアンスラサイクリン抗生物質を微生物 (放線菌）の培養液中力も探索し、 1975年にアクラルビシン（aclarubicin) (アクラシノマイシン A) が発見された。さらにアドリアマイシン誘導体の合成研究力も得られた心毒性の弱、ピラルビシン（pirarubicin)は、現在有用ながん化学療法剤として使用されている。

[0038] 本発明者らの知見によれば、化学療法剤であるブレオマイシンあるいはシスプラチンの抗がん作用が、 Rad51の発現を抑制することによって増強された。言い換えれば、 Rad51インヒビターは、ブレオマイシンあるいはシスプラチンの抗がん作用を増強する。すなわち本発明は、ブレオマイシンまたはその薬学的に許容される塩、若しくはシスブラチンまたはその薬学的に許容される塩と、 Rad51インヒビターを含む、医薬組成物を提供する。あるいは本発明は、ブレオマイシンまたはその薬学的に許容される塩、若しくはシスプラチンまたはその薬学的に許容される塩と、 Rad51インヒビターの、細胞増殖性疾患の治療のための医薬組成物の製造における使用に関する。また本発明は、ブレオマイシンまたはその薬学的に許容される塩、若しくはシスブラチンまたはその薬学的に許容される塩と、 Rad51インヒビターとを投与する工程を含む、細胞増殖性疾患の治療方法を提供する。本発明における好ま U、細胞増殖性疾患は、がんである。

[0039] 本発明において、 Rad51インヒビターとは、 Rad51の発現、および活性のいずれか、または両方を抑制することができる任意の化合物を含む。好ま、Rad51インヒビターは、 siRNAである。たとえば配列番号： 1に示す塩基配列をセンス鎖に含む 2本鎖 RNAは、 Rad51の発現を強力に抑制する。また、 Rad51の発現を抑制するアンチセンス核酸が公知である（US 2003/0229004)。

[0040] 本発明の 2本鎖 RNA、あるいは 2本鎖 RNAを発現することができる DNAは、がん細胞に導入することにより、がんの治療に利用することができる。がん細胞への導入には、任意の方法を利用することができる。たとえば、各種のトランスフエクシヨン用の試薬が公知である。あるいはリボソームやウィルスエンベロープベクターに封入し、がん細胞に導入することもできる。

また 2本鎖 RNAと化学療法剤とを含む本発明の医薬組成物も同様に、任意の方法によってがん細胞に導入し、その治療に利用することができる。たとえば、リボソームやウィルスエンベロープベクターは、 2本鎖 RNAと化学療法剤とを含む本発明の医薬組成物をがん細胞に導入するためのキャリアとして好ましい。

[0041] たとえば、リボソームをウィルス外膜と共に利用する in vivo遺伝子導入方法、あるヽは HVJ-リボソーム媒介遺伝子導入法が開発されている（Science, 243: 375-378 (1989) ; Anal. NY Acad. Sci. 772: 126-139 (1995))。既に、該方法を用いて肝臓、腎臓、血管壁、心臓及び脳を含む種々の組織への in vivoでの遺伝子導入が成功している（Gene Therapy 7: 417-427 (2000) ; Science 243: 375-378 (1989) ; Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 129—134 (1992) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:

8474-8478 (1993) ; Am. J. Physiol. 271 (Regulatory Integrative Comp. Physiol.40): R1212-R1220 (1996))。

[0042] ところが、 HVJ-リボソーム法にお!、ては、ウィルス及びリボソームと!/、う異なるビヒクルが必須であり、準備が複雑である。また、 HVJをリボソームと融合することによってゥィルス粒子よりも平均直径が 1.3倍大きくなる。その結果、細胞との融合活性が野生型ウィルスの 10%以下に減少すること、及び遺伝子導入が不可能な組織、または導入効率の悪い組織が存在することが知られている。そこで、より安全で高効率な遺伝子治療を可能にする方法として、ウィルスエンベロープベクターを用いた遺伝子導入法が開発されている（特開 2001-286282)。この方法では、ウィルス蛋白質を複製しない不活性ィ匕ウィルスをウィルスエンベロープとし、その中へ遺伝子などを封入することにより、培養細胞、生体組織等への遺伝子導入ベクターとして用いることができる。このようなウィルスエンベロープベクターを使用することにより、肝臓、骨格筋、子宫、脳、眼部、頸動脈、皮膚、血管、肺、心臓、腎臓、脾臓、がん組織、神経、 Bリンパ球、呼吸器官の組織、浮遊細胞等に安全、且つ高効率に遺伝子を導入できることが知られている。

[0043] ウィルスエンベロープは、精製されたウィルスに目的とする医薬組成物を界面活性剤存在下で混和するか、または、ウィルスと医薬組成物との混合液を凍結融解することにより調製することができる（特開 2001-286282)。ここで医薬組成物とは、 2本鎖 RNA、 2本鎖 RNAを発現する DNA、あるいは 2本鎖 RNAと化学療法剤を含む医薬組成物を用いることができる。

[0044] ウィルス-エンベロープ法において用いることができるウィルスとしては、例えば、レトロウィルス、トガウィルス、コロナウィルス、フラビウィルス、パラミクソウィルス、ォノレトミクソゥイノレス、ブ -ャゥイノレス、ラブドウイノレス、ボックスウイノレス、へノレぺスゥイノレス、ノキュロウィルス、へパドナウィルス等の科に属するウィルスを挙げることができる。より具体的には、センダイウィルス (HVJ)、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルスまたはインフルエンザゥィルスを用いることができる。ウィルスとしては、野生型及び組換え型のいずれのウイルスを用いることができる。特に HVJとしては、 Hasan M. K.ら（J. General Virol. 78: 2813-2820 (1997))、または、 Yonemitsu Y.ら（Nature Biotech. 18: 970-973 (2000》等により報告されて、る組換え型の HVJを用いることもできる。

[0045] 一般に、 HVJ -リボソーム法及び HVJ-エンベロープ法において用いる HVJとしては Z 株（ATCCより入手可能）が好ましいが、基本的には他の HVJ株（例えば ATCC VR— 907や ATCC VR— 105等）も用いることができる。また、ウィルスエンベロープの調製する際に、精製されたウィルスを UV照射等により不活性ィ匕した後に、所望の発現ベクターを混和しても良い。ウィルスと医薬組成物を混和する際に用いることができる界面活性剤としては、例えば、ォクチダルコシド、 Triton X-100、 CHAPS, NP-40等が挙げられる。このようにして調製されたウィルスエンベロープベクターは、注射等により治療または予防の標的となる組織に導入することができる。また、 -20°Cで凍結することにより、少なくとも 2〜3ヶ月保存することも可能である。

[0046] 本発明の医薬組成物を含むウィルスエンベロープベクターの患者への導入法としては、遺伝子治療剤を直接体内に導入する in vivo法及びヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻す ex vivo法が挙げられる（日経サイエンス、 1994年 4月号： 20-45頁；月刊薬事 36(1): 23-48 (1994);実験医学増刊 12 (15): (1994); 日本遺伝学治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、ェヌ 'ティ一'エス (1999))。本発明では、 in vivo法が特に好ましい。

[0047] 製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の公知の製剤形態 (例えば液剤等)をとり得る。例えば有効成分である 2本鎖 RNA、あるいは 2本鎖 RNAと化学療法剤を含有する注射剤として製剤する場合、このような注射剤は定法により調製することができ、例えば適切な溶剤 (PBS等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等)に溶解した後、必要に応じてフィルタ一等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。必要に応じて、注射剤には慣用の担体等を加えても良い。また、 HVJ-リボソーム等のリボソーム製剤としては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等の形態が挙げられる。

[0048] 本発明の医薬組成物は治療目的のがんの、症状等に応じた適当な投与方法及び投与部位が選択される。特に、非経口的な投与が好ましい。本発明における 2本鎖 RNAの投与量の範囲は、通常、 0. 5〜100mmol/腫瘍、たとえば l〜50mmol/腫瘍を例示することができる。また 2本鎖 RNAを発現する DNAとして投与される場合には、通常、 1〜： LOOO g/腫瘍、たとえば 10〜500 g/腫瘍を例示することができる。更に、化学療法剤を組み合わせる場合には、各化学療法剤において設定されている標準的な投与スケジュールを適用することができる。たとえばィ匕学療法剤としてブレォマイシンを組み合わせる場合、成人 1人 (体重 60kg)あたり、通常、 0. 1〜： LOOmg ( 力価) / day、たとえば l〜50mg (力価) / day、好ましくは 5〜30mg (力価) / dayを例示することができる。あるいはシスブラチンを組み合わせる場合、成人 1人 (体重 60kg) あたり、通常 1〜： LOOOmg/m² (体表面積）、たとえば 5〜500mg/m² (体表面積）、好ましくは 10〜： LOOmg/m² (体表面積)を例示することができる。

[0049] 更に本発明における投与スケジュールとしては、たとえば以下のようなスケジュールを示すことができる。すなわち、化学療法剤としてブレオマイシンを用いる場合には、 15〜30mg (静脈注射、筋肉内注射、あるいは皮下注射の場合）、あるいは 5〜15mg (動脈注射)を、 1週間 2回を原則として、 1日 1回投与することができる。投与回数は、経過を観察しながら、 1週間 1回〖こ調節することもできる。

[0050] またシスブラチンをィ匕学療法剤として用いる場合には、 15〜20 mg/m² (体表面積）を 5日投与（1日 1回））し、 2週間の休養の後、同じスケジュールの投与を繰り返す (反復投与)ことができる。反復投与のスケジュールは、適宜調節することができる。たとえば、 70— 90 mg/m² (体表面積)を 5日投与（1日 1回））し、 3週間の休養の後、同じスケジュールの投与を繰り返す (反復投与)こともできる。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0051] 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。 [実施例 1] Rad51 siRNAの作成と細胞への導入

ヒトの Rad51 (Accession number NM— 002875)の siRNAとして、米国 Dharmacon社に製造を依頼し、以下に示した 5種類の塩基配列からなるセンス鎖と、その相補配列からなるアンチセンス鎖で構成された siRNAを合成した（図 1)。

ターゲット 321 : GAGCUUGACAAACUACUUC (配列番号： 1)

ターゲット 462 : GGAAAGGCCAUGUACAUUG (配列番号： 2)

ターゲット 989 : UGCAGAUGGAGUGGGAGAU (配列番号： 3)

ターゲット 89 ： GUGUGGCAUAAAUGCCAAC (配列番号： 4)

ターゲット 828 : GCGAUGUUUGCUGCUGAUC (配列番号： 5)

これら 5種類の siRNAを、 HVJエンベロープベクターを用いて HeLa細胞（ATCC. CCL-2; Gey, G. 0. et al.， Cancer Res., 12: 264-265, 1952)に導入した。

[0052] Rad51 siRNAは以下の条件で導入した。 siRMAのトランスフエクシヨンの前日〖こ、 1 x 10⁵の HeLa細胞を 6ゥエルプレートに撒いた。

公知の方法 (Kaneda Y. et al.， Mol Ther. 2002 Aug;6(2):219- 26.)にしたがって、不活化 HVJを調製した。 6000 HAU (hemagglutinating units)の不活化 HVJを含むサンプルチューブに、 60 μ 1の 40 μ M Rad51 siRNA (配列番号： 1〜5のいずれかを含む )または対照のスクランブル配列（5' -gcgcgcuuuguaggauucg- 3')からなる siRNA (配列番号： 6) を加え、さらに 6 μ 1の 2% Triton X-100を加えた。 10000 x gで 10分間遠心した後、上清を除き、沈殿を 180 1の PBS (phosphate buffered saline) に懸濁した。 15 μ 1の 10 mg/ml硫酸プロタミンを加え（終濃度 50 μ g/ml)、 3 mlの DMEM

(Dulbecco's Modified Eagle Medium)をカロえた。この HVJエンベロープベクターおよび各 siRNAを含む溶液 500 μ 1 (1000 HAU)を、各ゥエル中の HeLa細胞に加え、 37°C で 30分間インキュベートした。その後、 HVJエンベロープベクター溶液を除去し、 37°C 、 5% CO で細胞を培養した。

2

[0053] 各 siRNA導入 1日後の Rad51 mRNAをノーザンブロットで調べた結果、 Rad51発現に対して抑制効果のあった siRNAは 1種類で、その配列はコドン 321からの 19塩基（+ 2 塩基のオーバーハング）を持つ GAGCUUGACAAACUACUUC (配列番号： 1)であつた（図 1 ;以後「321」とも称す)。その他の 4候補（配列番号 : 2〜5) は全く抑制効果がなかった。そこで、抑制効果のあった Rad51 siRNA (321、配列番号： 1)を用いて以降の実験を行った。

[0054] [実施例 2] siRNAによる Rad51蛋白の発現抑制

効果のあった 1種類（321、配列番号： 1)の Rad51 siRNAを、実施例 1のようにして HeLa細胞に導入し、 Rad51蛋白の発現抑制効果を経日的に調べた。対照として、スクランブル配列からなる siRNA (配列番号： 6)を同様に HeLa細胞に導入し、 Rad51蛋白の発現を経日的に調べた。 Rad51 siRNA (321)は、 4日間は完全に Rad51蛋白の発現を検出感度以下に抑制した。 5日目においてもその発現量は導入前の 10%以下であった（図 2)。

[0055] [実施例 3] siRNAまたはアンチセンス核酸による Rad51蛋白の発現抑制の比較

Rad51のアンチセンスオリゴ核酸として、文献（Ohnishi, T., Taki, T.， Hiraga, S.， Arita, N., Morita, T. In vitro and in vivo potentiation of radiosensitivity of malignant gliomas by antisense inhioition of the Rad51 gene. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1998; 245: 319-324.)に基づき、 15 bpからなる Rad51 AS#1 (5' ggcttcactaattcc 3，）及び Rad51 AS#2 (5， cgtatgacagatctg 3，）を作成した。 Rad51 AS#1は、 Rad51遺伝子の 368〜382番目の塩基に相当し、 Rad51 AS#2は、 Rad51遺伝子の 578〜592番目の塩基に相当する。

[0056] Rad51 siRNA (321)、 Rad51 AS#1、または Rad51 AS#2のそれぞれ約 80 pmoleを、実施例 1のようにして 10万個の HeLa細胞に導入した。対照として、スクランブル配列（配列番号： 6)からなる siRNA (SC siRNA)、ウィルスベクターのみ (Empty HVJ- E)、または Rad51のアンチセンスオリゴ核酸のスクランブル配列（SC AS、 5' tcgcgatcaccttat 3' )を同様に HeLa細胞に導入した。内部標準として、 G3PDH (ダリセルアルデヒド 3-リン酸ァ'ヒドログナ ~~で、 glyceralaehyde— 3— phosphate dehydrogenase)を用ヽた。

[0057] Rad51蛋白の発現抑制効果をノーザンブロットで調べたところ、 Rad51 siRNA (321) を導入した HeLa細胞においては、 1日後に Rad51の mRNAはノーザンブロットで完全に同定できない程度まで抑制された (図 3A)。これに対し、 Rad51のアンチセンスオリゴ核酸（Rad51 AS#1または Rad51 AS#2)は効果が低く（図 3B)、アンチセンスオリゴ核酸に対する siRNAの優位性が示された。 [0058] [実施例 4] ブレオマイシンとの併用による Rad51 siRNAの抗がん作用の増強

Rad51 siRNA (321)または対照のスクランブル siRNA (配列番号： 6)を、 HVJェンベロープベクターによりそれぞれ実施例 1のようにして HeLa細胞に導入し、 2日後に抗がん剤のブレオマイシン（BLM、 1 /z g/ml)で 18時間処理した（図 4A)。ブレオマイシン (BLM)で処理した場合、ブレオマイシン処理しなかったものと比較して、その杭がん剤効果は約 2倍増強された (図 4B)。

[0059] [実施例 5] シスプラチンとの併用による Rad51 siRNAの抗がん作用の増強

また、本発明者らは、 Rad51はシスプラチン（cis- diamminedichloroplatinum (II); CDDP) による二重鎖切断の修復にも関与していることを見出した。本発明者らは、 CDDPをがん細胞に添加すると Rad51が約 2倍増強されること、および Rad51遺伝子を強発現させると CDDPに耐性になることを突き止めた。したがって、 Rad51の発現を阻害することは、細胞の CDDPへの耐性を減少させると考えられる。そこで、 Rad51が強く発現しているがん細胞である HeLaに Rad51 siRNA (321)または対照のスクランプル配列 (配列番号： 6)を導入し、経日的に細胞相対数の変化を調べた。導入 2日後にシスブラチン (CDDP)で 3時間処理し、 9日後にコロニー数を計測した（図 5A)。 Rad51 siRNA (321)を導入した細胞は、対照と比較して、細胞増殖能がやや低下した（図 5B)。しかし図 5Cに示すように、 Rad51の siRNA (321)を導入し、 2日後に図示した濃度のシスブラチン (CDDP)で 3時間処理すると、対照のスクランブル配列と比較して、 Rad51 siRNA (321)導入群ではコロニー形成能が著明に低下し、がん細胞のコ口-一形成能が有意に抑制されることが示された。

[0060] [実施例 6] 各種ヒトがん細胞における Rad51 siRNAとシスプラチンとの併用による抗がん作用の増強

Rad51 siRNA (321)或いはスクランブル siRNA (配列番号： 6)を HVJエンベロープベクターを用いて各種ヒトがん細胞、 PANC- 1 (pancreatic cancer), AsPC- 1

(.pancreatic cancer), A549 (lung cancer), DU145 (prostate cancer), MCF7 (mammary carcinoma), HeLa S- 3 (cervical cancer)に導入しシスプラチン（CDDP)を同時投与して、 2日後に細胞増殖アツセィを行った。内部標準として、 Ku70及び βァクチンを用いた。各細胞の蛋白レベルを調べた結果、各種ヒトがん細胞の Ku70、 βァクチンはほぼ同レベルであった力 Rad51蛋白レベルは様々であった (図 6A)。シスブラチン（ CDDP、 0.1 μ g/ml)を同時投与すると、スクランブル siRNAを導入した場合には 80%以上の細胞が生存したのに対し、 Rad51 siRNA (321)を導入した場合はどのがん細胞にお、ても細胞の生存率が減少し、 CDDP感受性力 ¾0%以上増加したことが示された (図 6B)。したがって、 Rad51 siRNA (321)は多くのヒトがん細胞においても同様のシスブラチン感受性増強効果を発揮することが示された。

[0061] [実施例 7]正常ヒト細胞とがん細胞とのシスブラチン感受性の比較

Rad51 siRNA (321)を HVJエンベロープベクターを用いて正常ヒト細胞またはがん細胞に導入し、 CDDP感受性の相違を調べた。正常ヒト細胞として用いたヒト正常 2倍体繊維芽細胞（NHDFゝ Normal human diploid fibroblast)に Rad51 siRNA (321)を導入した場合、シスブラチンの濃度の上昇に伴う感受性の変化は観察されず、約 90%の細胞が生存していた。一方、がん細胞として用いた HeLa細胞では、 Rad51 siRNA ( 321)の導入後、シスブラチン濃度の上昇に伴って生存細胞が減少し、 CDDPの濃度に依存して感受性が増強されることが示された（図 7A)。そこで、 Rad51 siRNA (321) 導入後、 NHDFと HeLa細胞において 0.1 μ g/ml CDDPの有無によるアポトーシスの率を、ァネキシン V (AnnexinV)陽性細胞の割合で測定した (図 7B)。 CDDP非存在下では、アポトーシス細胞の率は HeLa細胞（4.0士 1.1%)と NHDF (3.2士 0.5%)とで変化がなかった。これに対し CDDP存在下では、アポトーシス率は HeLa細胞で 15.0% に増加したのに対し、 NHDFではほとんど増加しな力つた (4.9%)。以上のデータより、 Rad51 siRNA (321)による CDDPの感受性増強はがん細胞に選択的に見られる現象であり、治療法としての安全性は高いことが示された。

[0062] [実施例 8] Rad51 siRNAによるがん治療効果の増強

ヌードマウスに HeLa細胞を移植して腫瘍塊をつくらせた。まず Rad51 siRNA (321) を腫瘍塊に導入後、 2日後に腹腔内に CDDP 200 gを投与し、同時に siRNA (321) を腫瘍塊内に再注入した。さらにその 2日後にも Rad51 siRNA (321)を腫瘍塊に注入した。 Rad51 siRNA (321)注入のみでは腫瘍増殖抑制作用はかなり弱ぐさらにスクランブル siRNAおよび CDDPの併用ではその腫瘍の増殖は一部抑制されたのみであつたが、 Rad51 siRNA (321)と CDDPとの併用では腫瘍の増殖がほぼ完全に抑制され、顕著な制がん作用が示された（図 8)。なお Rad51 siRNAを HVJエンベロープベクタ一で投与したとき、その腫瘍塊に対する導入効率は 40-50%であった。

産業上の利用可能性

本発明の 2本鎖 RNA、あるいはそれを含む組成物は、 Rad51の発現制御に有用である。 Rad51の発現制御により、がん細胞の増殖抑制、あるいはがん細胞そのものの障害が可能である。また Rad51の発現抑制は、がん細胞の放射線に対する感受性の増強に有用である。更に、本発明の 2本鎖 RNAは化学療法剤との併用によって、強力な制がん作用を発揮することが明らかにされた。以上のように、本発明は、がんの治療に有用である。

Claims

請求の範囲

[I] 配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNAであって、センス鎖の長さが 100塩基以下である 2本鎖 RNA。

[2] 配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNAであって、センス鎖の長さが 100塩基以下である 2本鎖 RNAを発現するベクター。

[3] 請求項 1に記載の 2本鎖 RNA、または請求項 2に記載のベクターを有効成分として含有する、 Rad51遺伝子の発現抑制剤。

[4] Rad51遺伝子がヒト Rad51遺伝子である請求項 3に記載の Rad51遺伝子の発現抑制剤

[5] 配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNA、またはそれを発現することができるベクターを有効成分として含有する医薬組成物。

[6] 配列番号： 1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNA、またはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物。

[7] がんまたは悪性腫瘍の治療用である請求項 6に記載の医薬組成物。

[8] ィ匕学療法剤力制がん剤 (carcinostatic agent),抗がん剤 (anticancer agent),および f几腫場剤 (antitumor agentまたは antineoplastic agent)力らなる群力ら選択れる青永項 6に記載の医薬組成物。

[9] 化学療法剤が、核酸合成阻害作用、および核酸障害作用のいずれか、または両方を有する化学療法剤である請求項 6に記載の医薬組成物。

[10] 化学療法剤が、ブレオマイシン類、アントラキノン系制がん剤、マイトマイシン類、ァクチノマイシン類、カンプトテシン類、シスプラチン類、ストレプトゾトシン、 5-フルォロウラシル (5-FU)およびその誘導体、ピラルビシン、およびそれらの薬理学的に許容される塩力もなる群力も選択されるいずれかの化合物の少なくとも 1つである、請求項 6に記載の医薬組成物。

[I I] ブレオマイシン類が、ブレオマイシン、およびべプロマイシンからなる群から選択されるいずれかの化合物である請求項 10に記載の医薬組成物。

[12] ブレオマイシン類の薬理学的に許容される塩力塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、および硫酸ぺプロマイシン力なる群力選択される、ずれかの化合物である、請求項 10に記載の医薬組成物。

[13] シスブラチン類力シスブラチン、ノラプラチン (Paraplatin)、およびブリブラチン

(Briplatin)力もなる群力選択される、ずれかの化合物である、請求項 10に記載の医薬組成物。

[14] 化学療法剤が、 2本鎖 RNAとともにウィルスエンベロープベクターに封入されていることを特徴とする、請求項 6に記載の医薬組成物。

[15] ウイノレスエンベロープベクターが、レトロウイノレス科、トガウイノレス科、コロナウイノレス科、フラビウィルス科、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ブニヤウィルス科、ラブドウィルス科、ボックスウィルス科、ヘルぺスウィルス科、バキュロウィルス科、およびへパドナウィルス科からなる群力選択される科に属するウィルスのエンベロープで構成されてヽる、請求項 14に記載の医薬組成物。

[16] ウィルスエンベロープベクター力センダイウィルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルスまたはィンフルェンザウィルスからなる群から選択されたいずれかのウィルスのエンベロープで構成されてヽる、請求項 14に記載の医薬組成物。

[17] (a)配列番号：1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNAを有効成分として含有する医薬組成物、及び (b)化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物を含む、組み合わせ物。

[18] (a)配列番号：1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNAを発現することができるベクターを有効成分として含有する医薬組成物、及び (b)化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物を含む、組み合わせ物。

[19] がんまたは悪性腫瘍の治療用である請求項 17または 18のいずれか一項に記載の組み合わせ物。

[20] ィ匕学療法剤力制がん剤 (carcinostatic agent),抗がん剤 (anticancer agent),および f几腫場剤 (antitumor agentまたは antineoplastic agent)力らなる群力ら択される睛求項 17〜 19の!、ずれか一項に記載の組み合わせ物。

[21] 化学療法剤が、核酸合成阻害作用、および核酸障害作用のいずれか、または両方を有する化学療法剤である請求項 17〜 19のいずれか一項に記載の組み合わせ物

[22] 化学療法剤が、ブレオマイシン類、アントラキノン系制がん剤、マイトマイシン類、ァクチノマイシン類、カンプトテシン類、シスプラチン類、ストレプトゾトシン、 5-フルォロウラシル (5-FU)およびその誘導体、ピラルビシン、およびそれらの薬理学的に許容される塩力もなる群力も選択されるいずれかの化合物の少なくとも 1つである、請求項 17 〜 19のいずれか一項に記載の組み合わせ物。

[23] ブレオマイシン類が、ブレオマイシン、およびべプロマイシンからなる群から選択されるいずれかの化合物である請求項 22に記載の組み合わせ物。

[24] ブレオマイシン類の薬理学的に許容される塩力塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、および硫酸ぺプロマイシン力なる群力選択される、ずれかの化合物である、請求項 22に記載の組み合わせ物。

[25] シスプラチン類力シスプラチン、パラプラチン (Paraplatin)、およびブリブラチン

(Briplatin)力もなる群力選択される、ずれかの化合物である、請求項 22に記載の組み合わせ物。

[26] 2本鎖 RNA力ウィルスエンベロープベクターに封入されていることを特徴とする、請求項 17または 18のいずれか一項に記載の組み合わせ物。

[27] ウイノレスエンベロープベクター力レトロウイノレス科、トガウイノレス科、コロナウイノレス科、フラビウィルス科、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ブニヤウィルス科、ラブドウィルス科、ボックスウィルス科、ヘルぺスウィルス科、バキュロウィルス科、およびへパドナウィルス科からなる群力選択される科に属するウィルスのエンベロープで構成されて、る、請求項 26に記載の組み合わせ物。

[28] ウィルスエンベロープベクター力センダイウィルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルスまたはィンフルェンザウィルスからなる群から選択されたいずれかのウィルスのエンベロープで構成されて、る、請求項 26に記載の組み合わせ物。

[29] 請求項 1に記載の 2本鎖 RNA、または請求項 2に記載のベクターを細胞に投与する工程を含む、 Rad51の発現抑制方法。

[30] 配列番号：1を含むセンス鎖とその相補鎖とで構成される 2本鎖 RNAまたはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を投与する工程を含む、がんまたは悪性腫瘍の治療方法。

[31] 2本鎖 RNAまたはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を投与する工程が、 2本鎖 RNAおよびィ匕学療法剤が封入されたウィルスエンベロープベクターを投与する工程である、請求項 30に記載の治療方法。

[32] 2本鎖 RNAまたはそれを発現することができるベクター、および化学療法剤を投与する工程が、 2本鎖 RNAまたはそれを発現することができるベクターを有効成分として含有する医薬組成物、及び化学療法剤を有効成分として含有する医薬組成物を別々に投与する工程である、請求項 30に記載の治療方法。

[33] がんまたは悪性腫瘍を治療するための医薬組成物の調製のための、請求項 1に記載の 2本鎖 RNA、または請求項 2に記載のベクターの使用。

[34] 医薬組成物が化学療法剤を含む、請求項 1に記載の 2本鎖 RNA、または請求項 2〖こ記載のベクターの使用。

[35] ブレオマイシンまたはその薬学的に許容される塩、および Rad51インヒビターを含む、医薬組成物。

[36] シスプラチンまたはその薬学的に許容される塩、および Rad51インヒビターを含む、医薬組成物。

[37] (a)ブレオマイシンまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物、および (b) Rad51インヒビターを有効成分として含有する医薬組成物を含む、組み合わせ物。

[38] (a)シスブラチンまたはその薬学的に許容される塩有効成分として含有する医薬組成物、および (b) Rad51インヒビターを有効成分として含有する医薬糸且成物を含む、組み合わせ物。

[39] がんまたは悪性腫瘍の治療用である請求項 37または 38の、ずれか一項に記載の組み合わせ物。