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WO2005090563A1 - 核酸溶解用溶媒、核酸含有溶液および核酸保存方法 - Google Patents

核酸溶解用溶媒、核酸含有溶液および核酸保存方法 Download PDF

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WO2005090563A1
WO2005090563A1 PCT/JP2005/004773 JP2005004773W WO2005090563A1 WO 2005090563 A1 WO2005090563 A1 WO 2005090563A1 JP 2005004773 W JP2005004773 W JP 2005004773W WO 2005090563 A1 WO2005090563 A1 WO 2005090563A1
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WO
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nucleic acid
ionic liquid
dna
dissolving
solvent
Prior art date
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PCT/JP2005/004773
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroyuki Ohno
Yukinobu Fukaya
Gen Masuda
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Nisshinbo Holdings Inc
Original Assignee
Nisshinbo Industries Inc
Nisshin Spinning Co Ltd
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Publication date
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Priority to US10/593,898 priority patent/US20070196826A1/en
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Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid-dissolving solvent, a nucleic acid-containing solution and a method for storing nucleic acid, and more particularly, to a nucleic acid-dissolving solvent such as DNA or RNA composed of an ionic liquid, and a nucleic acid-containing solution using the solvent. And nucleic acid storage methods.
  • DNA and RNA are genetic information substances that govern inheritance. Attempts have been made to improve the function of species at the genetic level in various fields, using biotechnology techniques such as decoding the genomic information and recombining gene sequences.
  • DNAs and RNAs are not limited to the above-mentioned biotechnology fields, but are also applied as new diagnostics' treatment methods in the medical field, such as gene diagnosis, gene therapy, and elucidation of the causes of diseases, utilizing genetic information of DNA and RNA. Is also evolving rapidly.
  • nucleic acids are biological macromolecules that are always possessed by living organisms, and there are many points to be noted as materials, such as being naturally present in large quantities and being biodegradable.
  • DNA and RNA are materials that can be further enhanced by chemical methods. For this reason, research for using DNA and RNA as industrial materials is progressing!
  • DNA also has a nitrogen-containing heterocyclic base which is a derivative of purine or pyrimidine, that is, a deoxyribonucleotide monomer unit containing one molecule of nucleobase, one molecule of deoxyribose, and one molecule of phosphate. It is a chain polymer.
  • RNA also consists of a covalently bonded ribonucleotide monomer unit containing one molecule of nucleic acid base, one molecule of ribose, and one molecule of phosphate.
  • DNA and RNA are high molecular compounds having hydrophilic phosphate and sugar as main skeletons, they are extremely hydrophilic substances.
  • DNA and RNA have been handled only in a system using water as a solvent, because they are extremely high and have hydrophilicity.
  • water is a suitable solvent for dissolving nucleic acids
  • the usable temperature range is as narrow as about 0 to 100 ° C and it is not possible to cause reactions using reagents that cannot be handled in water.
  • conditions for applying nucleic acids industrially are limited. For this reason, there is a demand for a solvent that can hardly proceed in water, which can be used in a wide temperature range, or can perform a reaction that cannot be performed in water.
  • DNA and RNA are easily hydrolyzed in water by DNA degrading enzyme and RNA degrading enzyme, respectively. It must be dissolved in the water from which the enzyme has been removed.
  • DNA and RNA degrading enzymes are included in nucleic acid samples directly extracted from living organisms, or are present in the saliva of living organisms, or are present in the saliva of living organisms or adhere to the skin. If DNA or RNA enters the system from the outside, the DNA or RNA is easily degraded by the activity of the enzyme present or mixed in the system. It was impossible.
  • Non-Patent Document 1 P.J. von Hippel, J. Biol.
  • Non-patent document 1 P.J.von Hippel, J. Biol. Chem., 10, 3913 (1965)
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and a nucleic acid dissolving solvent capable of easily dissolving nucleic acids such as DNA and RNA and capable of preserving them for a long period of time.
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid-containing solution using a solvent and a method for storing nucleic acids. Means for solving the problem
  • the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, have found that a salt that is liquid at room temperature, that is, ionic liquid force DNA and RNA can be easily dissolved, It has been found that long-term storage is possible in a state in which is dissolved in an ionic liquid, and the present invention has been completed.
  • nucleic acid dissolving solvent comprising an ionic liquid capable of dissolving a nucleic acid
  • the cationic force constituting the ionic liquid, ammionic-cation, imidazolymcation and pyridium-ionic force which is at least one selected from the group consisting of:
  • nucleic acid dissolving solvent of 1 or 2 wherein the ion constituting the ionic liquid is a halide ion or a carboxylate ion having a total of 13 carbon atoms,
  • a solvent for nucleic acid dissolution according to any one of 1 to 4, characterized in that it is for storing nucleic acids or for nucleic acid reactions,
  • nucleic acid-containing solution wherein the nucleic acid is dissolved in an ionic liquid.
  • Nucleic acid storage method characterized by storing nucleic acid dissolved in ionic liquid
  • the nucleic acid-dissolving solvent of the present invention is a nucleic acid-soluble ionic liquid, and is not only capable of easily dissolving DNA and RNA, but also dissolving DNA and RNA in the ionic liquid. It can be stored for a long period of time.
  • the ionic liquid since the ionic liquid has a high ionic density and a high polarity like water, it can dissolve DNA, RNA, etc. having a large number of hydrophilic groups.
  • ionic liquids have extremely high ionic strength, and may be stable for a long time by dissolving DNA and RNA in ionic liquids, probably because nucleases are deactivated in this liquid. It becomes possible to save.
  • the ionic liquid does not evaporate even at high temperature and under reduced pressure because the ionic liquid has very low or no vapor pressure. Therefore, the basic performance of the ionic liquid can be maintained for a long period of time without devising a container or the like during storage, and this point is also optimal for long-term storage.
  • ionic liquids are substances that are liquid over a wide temperature range, so that when ionic liquids are used as nucleic acid reaction solvents, reactions can be performed over a wide temperature range, unlike conventional water. It is also possible to carry out a reaction using reagents that cannot be handled in water that can be handled simply.
  • FIG. 1 is a view showing visible ultraviolet absorption spectra of Examples 9 and 10.
  • FIG. 2 is a view showing visible ultraviolet absorption spectra of Examples 11 and 12.
  • FIG. 3 is a view showing a visible ultraviolet absorption spectrum of Example 13.
  • FIG. 4 is a view showing a CD spectrum of Example 13.
  • FIG. 5 is a view showing a visible ultraviolet absorption spectrum of Example 14.
  • FIG. 6 is a view showing a CD spectrum of Example 14.
  • FIG. 7 is a view showing an NMR chart of the ionic liquid EMIm-HCOO obtained in Synthesis Example 8. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the nucleic acid-dissolving solvent according to the present invention also has an ionic liquid power.
  • the ionic liquid is not particularly limited as long as it is capable of dissolving nucleic acid (soluble in nucleic acid). Further, in the present invention, a neutralized ionic liquid can also be used.
  • the neutralized ionic liquid is defined as an ionic liquid composed of a salt obtained by a neutralization reaction of an acid-base (the forefront and future of ionic liquid development, pp. 19-21, CMCS Inc.) Publication (2003)), and is characterized by having a cation to which a proton is added.
  • the ionic liquid is preferably at least one selected from the group consisting of a cationic force, an ammonium cation, an imidazolium cation, and a pyridi-dimethylcationic force.
  • a cationic force e.g., an ammonium cation, an imidazolium cation, and a pyridi-dimethylcationic force.
  • imidazolium cations are particularly preferable, since they are extremely excellent in nucleic acid solubility and can prepare a high-concentration nucleic acid-containing solution.
  • the term “dissolves nucleic acid (soluble in nucleic acid)” means that nucleic acid is added to a solvent in an amount of about 10% by mass or less, preferably about 5.0% by mass or less. After dissolving the nucleic acid by heating or the like to dissolve the nucleic acid into a homogeneous and transparent solution, it precipitates even when cooled to room temperature (about 20 ° C). , U.
  • the imidazolium cation is not particularly limited. Examples thereof include a monoalkyl imidazolium cation, a dialkyl imidazolium cation, and a trialkyl imidazolium cation.
  • Specific examples thereof include 1-ethyl-3-methyl imidazolium ion, 1-butyl-3-methylimidazolyme ion, 1 propyl 3-methylimidazolyme ion, 1- (1,2 or 3-hydroxypropyl) -3-methylimidazolyme ion, 1,2,3-trimethylimidazolyme ion, 1, 2 dimethyl-3-ethylimidazolium ion, 1,2-dimethinolay 3-propyl imidazolium ion, 1-butyl-2,3 dimethylimidazolidium ion, imidazolium ion, 1-methinolaymidazolium ion, 1-ethinolaymidazolium ion Ion, 1, 2- And dimethylimidazolidium ion.
  • Examples of the pyridi- cation include, but are not particularly limited to, N-propyl pyridi-dim ion, N-butyl pyridi-dim ion, 1-butyl-4 methyl pyridi-dim ion, 1-butyl 2,4-dimethyl pyridi-dim ion, 2-methyl pyridi-dim ion, Examples include 3-methylpyridinium ion and 4-methylpyridinium ion.
  • the ammonium cation is not particularly limited, but is preferably one having an aliphatic or alicyclic ammonium ion as a cation component.
  • the aliphatic and alicyclic ammonium ions are not particularly limited. Examples thereof include getyl ammonium ion, triethyl ammonium ion, methoxyethyl ammonium ion, getyl (2-methoxyethyl) ammonium ion, and trimethyl ion.
  • Various quaternary alkylammonium ions such as propylammonium ion, trimethylhexylammonium ion, tetrapentylammonium ion, getylmethyl (2-methoxyethyl) ammonium ion, N-methylpyrrolidium ion, N-butylN-methylpyrrolidium ion And the like.
  • Examples of the ions constituting the ionic liquid include BF-, PF-, AsF-, and SbF.
  • Cl—, Br—, and HCO— are preferable among halogen sulfide ions and carbonate ions having 13 to 13 carbon atoms.
  • the ionic liquid is preferably subjected to heating and vacuum dehydration, and preferably has a water content of about 1.0% by mass or less, preferably about 0.5% by mass or less.
  • the heating temperature and the degree of decompression during dehydration may be appropriately selected according to the type of the ionic liquid.
  • the water content is a value measured by a Karl Fischer moisture meter.
  • the nucleic acid-containing solution according to the present invention is obtained by dissolving a nucleic acid in the above-described solvent for dissolving a nucleic acid comprising the ionic liquid.
  • the content of the nucleic acid in the ionic liquid cannot be unconditionally specified because the solubility varies depending on the type of the ionic liquid to be used, but it is usually not more than 10% by mass, preferably 1.0 to 1.0% by mass. It is about 5.0% by mass.
  • the method for dissolving the nucleic acid in the ionic liquid is not particularly limited. After adding a predetermined amount of nucleic acid to the ionic liquid, a method of dissolving the nucleic acid by heating to about 70 to 120 ° C can be used. In this case, whether or not the nucleic acid has been dissolved in the S ionic liquid can be determined from the fact that the cloudy solution becomes uniform and transparent after heating when the nucleic acid is added.
  • the nucleic acid-containing solution using the nucleic acid-dissolving solvent of the present invention is heated once to dissolve the nucleic acid to a uniform and transparent state, and then cooled again to about 10 to 25 ° C to precipitate the nucleic acid. Does not appear cloudy.
  • nucleic acid-dissolving solvent and the nucleic acid-containing solution described above can be applied to all applications in which nucleic acids such as DNA and RNA need to be dissolved.
  • nucleic acids can be stored in an environment where nucleases are inactivated, which is extremely simple. This allows long-term stable storage of nucleic acids.
  • the storage temperature is not particularly limited, but it can be stored at a general environmental temperature of about 0 to 40 ° C, and can be stored for a long time at room temperature without special environment. Can be saved.
  • nucleic acid dissolving solvent for the nucleic acid reaction and performing a chemical modification reaction of DNA and RNA in this solvent, reactions using powerful reagents that cannot be handled in water, which is a conventional solvent, can be performed. In addition, a reaction that hardly proceeds in water can be performed without being restricted by a temperature range of 0 to 100 ° C.
  • the obtained liquid was dissolved in 300 ml of ethanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and 20 g of activated carbon powder (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added thereto, followed by stirring for 24 hours. Thereafter, the activated carbon powder was separated by filtration, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain an ionic liquid HO (CH 2) MIN-C1.
  • the mixture was dried in a hot vacuum, mixed with 10 mg of DNA (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.) in a nitrogen atmosphere, sealed, and the melting temperature of the DNA was recorded while heating. As a result, the temperature at which DNA10mg was completely dissolved in the ionic liquid HO (CH) MIN-C1lg was 70 ° C.
  • RNA manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • RNA manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • the dissolution temperature of the RNA was recorded while heating.
  • the temperature at which RNAIOmg was completely dissolved in the ionic liquid HO (CH) MIN-C1lg was 60 ° C.
  • DNAlOmg becomes ionic liquid HO (CH) MI
  • the temperature for complete dissolution in N-Brlg was 87 ° C.
  • RNAlOmg After drying under hot vacuum, mixing with RNAlOmg under a nitrogen atmosphere and sealing, the dissolution temperature of RNA was recorded while heating. As a result, RNAlOmg becomes ionic liquid HO (CH) MIN— The temperature for complete dissolution in Brlg was 82 ° C.
  • the ionic liquid PMIN-CIlg prepared in Synthesis Example 3 was heated and dried at 110 ° C for 24 hours under vacuum, mixed with DNAlOmg under a nitrogen atmosphere, sealed, and the melting temperature of DNA was recorded while heating. As a result, the temperature at which the DNA was completely dissolved in the DNA ionic liquid S ionic liquid PMIN-C1lg was 80 ° C.
  • the ionic liquid PMIN-CI lg prepared in Synthesis Example 3 was heated and vacuum dried at 110 ° C for 24 hours, mixed with RNAlOmg under a nitrogen atmosphere, sealed, and the dissolution temperature of RNA was recorded while heating. As a result, the temperature at which the RNA was completely dissolved in the RNA ionic liquid S ionic liquid PMIN-C1 lg was 70 ° C.
  • the ionic liquid PMIN-Brlg prepared in Synthesis Example 4 was heated and dried under vacuum at 110 ° C for 24 hours, mixed with DNAlOmg under a nitrogen atmosphere, sealed, and the melting temperature of DNA was recorded while heating. As a result, the temperature at which the DNA was completely dissolved in the DNA ionic liquid S-ionic liquid PMIN-Brlg was 90 ° C.
  • the ionic liquid PMIN-Brlg prepared in Synthesis Example 4 was heated and vacuum dried at 110 ° C for 24 hours, mixed with RNAlOmg under a nitrogen atmosphere, sealed, and the melting temperature of DNA was recorded while heating. As a result, the temperature at which the RNA was completely dissolved in the RNA ionic liquid S ionic liquid PMIN-Brlg was 82 ° C.
  • Table 1 shows the structure of the ionic liquid used in Examples 18 to 18 and the dissolution temperatures of DNA and RNA in each ionic liquid.
  • the obtained visible ultraviolet absorption spectrum shows that the absorption around 260 nm derived from the nucleic acid base changes according to the amount of DNA added to the DNA. Since the absorbance in the above wavelength range was zero, it can be understood that DNA was dissolved in the ionic liquid even at V at room temperature.
  • the obtained visible ultraviolet absorption spectrum shows that the absorption at around 260 nm derived from the nucleic acid base varies according to the amount of RNA added to the RNA, and that the absorption at 320 nm or less does not have absorption. Since the absorbance in the above wavelength range was zero, it can be seen that RNA was dissolved in the ionic liquid at room temperature even at V.
  • the precipitate was dissolved in 0.2 ml of distilled water, 10 mg of sodium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and then 2 ml of ethanol was added. The resulting solution was centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes, and the supernatant solution was removed. The precipitate was mixed with 2 ml of an 85% by mass aqueous ethanol solution, and centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes. The supernatant solution was removed, and the precipitate was mixed again with 2 ml of an 85% by mass aqueous ethanol solution, centrifuged at 3,000 rpm for 15 minutes, and then the supernatant solution was removed. And vacuum dried.
  • a solution prepared by dissolving 2 mg of white powdered DNA in 5 ml of distilled water was placed in a square quartz cell having an optical path length of 1 mm, and the CD spectrum was measured at room temperature (J720, manufactured by JASCO Corporation).
  • Fig. 4 shows the obtained spectrum.
  • Example 13 White as in Example 13 except that the RNA-containing solution obtained in Example 2 was used. Powdered RNA was isolated.
  • RNA manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • the mixture was air-dried, mixed with 5 mg of RNA (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) under a nitrogen atmosphere, sealed, and then heated to record the dissolution temperature of RNA.
  • the temperature at which 5 mg of RNA was completely dissolved in the ionic liquid EMIm-CCOOlg was 60 ° C.
  • the ionic liquid EMIm-HCOOlg prepared in Synthesis Example 8 was heated and vacuum-dried at 90 ° C for 36 hours, mixed with 5 mg of DNA under a nitrogen atmosphere, sealed, and the melting temperature of the DNA was recorded while heating. . As a result, the temperature at which 5 mg of DNA completely dissolved in the ionic liquid EMIm-HCOOlg was 60 ° C.
  • the ionic liquid EMIm-HCOOlg prepared in Synthesis Example 8 was heated and vacuum-dried at 90 ° C for 36 hours, mixed with 5 mg of RNA in a nitrogen atmosphere, sealed, and the melting temperature of RNA was recorded while heating. . As a result, the temperature at which 5 mg of RNA completely dissolved in the ionic liquid EMIm-HCOOlg was 48 ° C.
  • Table 2 shows the structures of the ionic liquids used in Examples 15 to 18 and the dissolution temperatures of DNA and RNA in each ionic liquid.
  • the ionic liquid MIm—CI lg prepared in Synthesis Example 9 was dried at 70 ° C for 16 hours under vacuum.
  • the melting temperature of the DNA was recorded. As a result, the temperature at which DNA10mg was completely dissolved in the ionic liquid Mlm-Cllg was 76 ° C.
  • the ionic liquid MIm-HCOOlg prepared in Synthesis Example 10 was heated and vacuum-dried at 70 ° C for 16 hours, mixed with DNA (manufactured by Nichiro Co., Ltd.) lOmg in a nitrogen atmosphere, sealed, and then heated to DN. The dissolution temperature of A was recorded. As a result, DNAlOmg was converted to ionic liquid Mlm-
  • the temperature for complete dissolution in HCOOlg was 85 ° C.
  • Table 3 shows the structure of the ionic liquid used in each of Examples 19 and 20 and the dissolution temperature of DNA in each ionic liquid.

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Abstract

　ＤＮＡ，ＲＮＡ等の核酸を溶解させる核酸溶解用溶媒として、例えば、アンモニウムカチオン、イミダゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン等を有するイオン性液体からなるものを用い、この溶媒に核酸を溶解させて保存する。これにより、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の核酸を容易に溶解できるとともに、それらの長期保存が可能となる。

Description

明 細 書
核酸溶解用溶媒、核酸含有溶液および核酸保存方法
技術分野
[0001] 本発明は、核酸溶解用溶媒、核酸含有溶液および核酸保存方法に関し、さらに詳 述すると、イオン性液体からなる DNA, RNA等の核酸溶解用溶媒、およびこの溶媒 を用いた核酸含有溶液、核酸保存方法に関する。
背景技術
[0002] DNAおよび RNAは、遺伝を司る遺伝情報物質である。そのゲノム情報を解読し、 遺伝子配列を組み換える等のバイオテクノロジー技術を用い、遺伝子レベルでの生 物種の機能改善が多方面で試みられて ヽる。
また、これら DNAおよび RNAの用途は、上記バイオテクノロジー分野に留まらず、 DNAや RNAの遺伝情報を活用した遺伝子診断、遺伝子治療、疾病原因の解明等 の医療分野における新規診断'治療法としての応用も急速に進展している。
[0003] 一方で、核酸は、生物であれば必ず持っている生体高分子であり、天然に大量に 存在することや、生分解性があることなど、材料として特筆すべき点が多い。し力も、 DNAや RNAは、化学的な手法により、さらなる高機能化が可能な材料でもある。こ のため、 DNAおよび RNAを工業的な材料として利用するための研究が進展して!/ヽ る。
[0004] ところで、 DNAは、プリンまたはピリミジンの誘導体である含窒素複素環式塩基、す なわち、核酸塩基を 1分子、デォキシリボースを 1分子、リン酸を 1分子含むデォキシ リボヌクレオチドモノマー単位力もなる鎖状の高分子である。一方、 RNAも、核酸塩 基を 1分子、リボースを 1分子、リン酸を 1分子含むリボヌクレオチドモノマー単位の共 有結合鎖からなる。
このように、 DNAおよび RNAは、親水性のリン酸および糖を主骨格として有する高 分子化合物であるため、極めて親水性が高 ヽ物質である。
[0005] DNAおよび RNAの取り扱いは、これらが極めて高!、親水性を有することから、従 来、水を溶媒とする系でのみ取り扱われていた。 水は、核酸を溶解するのに好適な溶媒ではあるものの、使用可能な温度範囲は 0 一 100°C程度と狭ぐまた水中では取り扱うことができない試薬などを用いた反応を 起こすことができないなど、核酸を工業的に応用する際の条件が限られてしまうという 問題があった。このため、使用可能な温度範囲が広ぐ水中では進行し難い、または 水中では不可能な反応を行うことのできる溶媒が求められている。
[0006] また、 DNA, RNAは、それぞれ DNA分解酵素、 RNA分解酵素により水中では容 易に加水分解を受けることが知られており、 DNAおよび RNAの保存に際しては、 D NA分解酵素や RNA分解酵素を除去した水中に溶存させる必要がある。
しかし、水は蒸発し易い溶媒であるため、保存容器に工夫が必要となる。し力も、生 体から直接抽出した核酸試料中に DNA, RNAの分解酵素が含まれて 、る場合や、 生物の唾液中に存在して 、る、または皮膚に付着して 、る核酸分解酵素が外部から 系内に混入した場合は、系内に存在または混入した酵素の活性により DNAまたは R NAが容易に分解されることから、水を溶媒として長期的に DNA、 RNAを保存する ことは不可能であった。
[0007] DNAおよび RNA分解酵素を失活させる試薬を利用して DNAおよび RNAの長期 保存を可能とする方法も知られているが、使用する試薬によっては、細胞毒性や癌 原性を有するものもあり、さらには、核酸塩基をィ匕学修飾する可能性もあるため、簡 便な保存法とまではなって ヽな ヽ。
一方、核酸を含む試料を凍結乾燥することにより、水の非存在下において、核酸を 保存することも可能であるが、この方法は、凍結乾燥機のある場所でなければ実施す ることができず、また乾燥後、 0°C以下で保存しなければならないことから、簡便な保 存法とはなり得ない。
[0008] DNAおよび RNA分解酵素は、高濃度の無機塩を含む水溶液中では高次構造が 壊れ、変性することが報告されている（非特許文献 1 : P.J. von Hippel, J. Biol.
Chem., 10, 3913(1965))。
この技術を応用し、 DNAおよび RNAを高塩濃度の水溶液に溶解させることが簡 便な長期保存法となり得ると考えられる。
しかし、溶媒として水を使用することに変わりはないため、その蒸発を防止する工夫 が必要であるのみならず、保存後に、 DNAおよび RNAを脱塩するための複雑な操 作が必要となることから、長期保存法として適当なものであるとはいえない。
このように、 DNAおよび RNAを簡便に長期間保存し得る手法の確立が求められて いる。
[0009] 非特許文献 1 : P.J. von Hippel, J. Biol. Chem., 10, 3913 (1965)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、 DNAおよび RNA等の核 酸を容易に溶解できるとともに、それらの長期保存が可能な核酸溶解用溶媒、およ びこの溶媒を用いた核酸含有溶液、核酸保存方法を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0011] 本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、室温で液状の塩 、すなわちイオン性液体力 DNA, RNAを容易に溶解し得ることを見出すとともに、 DNA, RNAをイオン性液体中に溶解させた状態で長期保存が可能となることを見 出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
1.核酸を溶解することのできるイオン性液体カゝらなることを特徴とする核酸溶解用溶 媒、
2.前記イオン性液体を構成するカチオン力 アンモ-ゥムカチオン、イミダゾリゥムカ チオンおよびピリジ-ゥムカチオン力も選ばれる少なくとも 1種であることを特徴とする 1の核酸溶解用溶媒、
3.前記イオン性液体を構成するァ-オンが、ハロゲンィ匕物イオンまたは総炭素数 1 一 3のカルボン酸イオンであることを特徴とする 1または 2の核酸溶解用溶媒、
4.前記イオン性液体が、中和型イオン性液体であることを特徴とする 1の核酸溶解 用溶媒、
5.核酸保存用または核酸反応用であることを特徴とする 1一 4のいずれかの核酸溶 解用溶媒、
6.核酸をイオン性液体に溶解させてなることを特徴とする核酸含有溶液、 7.核酸をイオン性液体中に溶解させた状態で保存することを特徴とする核酸保存方 法
を提供する。
発明の効果
[0012] 本発明の核酸溶解用溶媒は、核酸可溶のイオン性液体力 なるものであるため、 D NA, RNAを容易に溶解し得るだけでなぐ DNA, RNAをイオン性液体中に溶解さ せた状態で長期間保存することができる。
すなわち、イオン性液体は、高イオン密度であり、また水と同様に極性が高い液体 であるため、多数の親水性基を有する DNA, RNA等を溶解することができる。
また、イオン性液体は、極めて高いイオン強度を有しており、この液体中では核酸 分解酵素が失活するためか、 DNA, RNAをイオン性液体中に溶解させることで、長 期間安定的な保存が可能となる。し力も、イオン性液体は、蒸気圧が極めて低いか、 全く無いため、高温'減圧下でも蒸発しない。このため、保存に際して容器等に工夫 をこらさなくとも、長期に亘りイオン性液体の基本性能を維持することができ、この点 力 しても長期保存に最適である。
さらに、イオン性液体は、広い温度域で液状を示す物質であるため、核酸の反応溶 媒としてイオン性液体を使用した場合、従来の水と異なり、広い温度域での反応が可 能となるだけでなぐ水中で取り扱いが不可能な試薬を用いた反応を行うことも可能と なるものである。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]実施例 9, 10の可視紫外吸収スペクトルを示す図である。
[図 2]実施例 11, 12の可視紫外吸収スペクトルを示す図である。
[図 3]実施例 13の可視紫外吸収スペクトルを示す図である。
[図 4]実施例 13の CDスペクトルを示す図である。
[図 5]実施例 14の可視紫外吸収スペクトルを示す図である。
[図 6]実施例 14の CDスペクトルを示す図である。
[図 7]合成例 8で得られたイオン性液体 EMIm— HCOOの NMRチャートを示す図で ある。 発明を実施するための最良の形態
[0014] 以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
本発明に係る核酸溶解用溶媒は、イオン性液体力もなるものである。
イオン性液体としては、核酸を溶解することのできる（核酸可溶な)ものであれば、特 に限定されるものではない。また、本発明においては、中和型のイオン性液体も用い ることが可能である。
ここで、中和型のイオン性液体とは、酸一塩基の中和反応により得られる塩からなる イオン性液体 (イオン性液体 開発の最前線と未来一、 19一 21頁、（株)シーエムシ 一出版（2003)参照）であり、プロトンが付加してなるカチオンを有することを特徴とす る。
[0015] 上記イオン性液体の中では核酸の溶解性に優れているという点から、それを構成 するカチオン力 アンモ-ゥムカチオン、イミダゾリウムカチオンおよびピリジ-ゥムカ チオン力も選ばれる少なくとも 1種であることが好ましい。中でも核酸の溶解性に著し く優れ、高濃度の核酸含有溶液を調製できることから、特にイミダゾリウムカチオンで あることが好ましい。
なお、本発明において、「核酸を溶解することのできる (核酸可溶な）」とは、溶媒中 に核酸を 10質量％以下、好ましくは 5. 0質量％以下程度の量で添加してなる白濁 液を、加熱する等により核酸を溶解させて均一透明溶液とした後、室温 (20°C程度） まで冷却しても析出してこな 、性状を！、う。
[0016] イミダゾリウムカチオンとしては、特に限定はなぐ例えば、モノアルキルイミダゾリウ ムカチオン、ジアルキルイミダゾリウムカチオン、トリアルキルイミダゾリウムカチオン等 が挙げられ、具体例としては、 1ーェチルー 3—メチルイミダゾリゥムイオン、 1ーブチルー 3—メチルイミダゾリゥムイオン、 1 プロピル 3—メチルイミダゾリゥムイオン、 1ー（1, 2 または 3—ヒドロキシプロピル)— 3—メチルイミダゾリゥムイオン、 1, 2, 3—トリメチルイミ ダゾリゥムイオン、 1, 2 ジメチルー 3—ェチルイミダゾリゥムイオン、 1, 2—ジメチノレー 3— プロピルイミダゾリゥムイオン、 1ーブチルー 2, 3 ジメチルイミダゾリゥムイオン、イミダ ゾリゥムイオン、 1ーメチノレイミダゾリウムイオン、 1ーェチノレイミダゾリウムイオン、 1, 2- ジメチルイミダゾリゥムイオンなどが挙げられる。 ピリジ-ゥムカチオンとしては、特に限定されるものではなぐ例えば、 N プロピル ピリジ-ゥムイオン、 N ブチルピリジ-ゥムイオン、 1ーブチルー 4 メチルピリジ-ゥム イオン、 1ーブチルー 2, 4—ジメチルピリジ-ゥムイオン、 2 メチルピリジ-ゥムイオン、 3—メチルピリジ-ゥムイオン、 4 メチルピリジ-ゥムイオンなどが挙げられる。
[0017] アンモ-ゥムカチオンとしては、特に限定されるものではないが、脂肪族または脂環 式のアンモ-ゥムイオンをカチオン成分とするものであることが好ましい。
これらの脂肪族および脂環式のアンモニゥムイオンとしても、特に限定されるもので はなぐ例えば、ジェチルアンモ -ゥムイオン、トリェチルアンモ -ゥムイオン、メトキシ ェチルアンモ -ゥムイオン、ジェチル（2—メトキシェチル）アンモ-ゥムイオン、トリメチ ルプロピルアンモ-ゥムイオン、トリメチルへキシルアンモ -ゥムイオン、テトラペンチ ルアンモ -ゥムイオン、ジェチルメチル（2—メトキシェチル）アンモ-ゥムイオン等の種 々の 1一 4級アルキルアンモ-ゥムイオン、 N メチルピロリジ -ゥムイオン、 N ブチル N メチルピロリジ -ゥムイオンなどが挙げられる。
[0018] また、イオン性液体を構成するァ-オンとしては、例えば、 BF―、 PF―、 AsF―、 SbF
4 6 6
―、 A1C1―、 HSO―、 CIO―、 CH SO―、 CF SO―、 CF CO―、 (CF SO ) N―、 C H C
6 4 4 4 3 3 3 3 3 2 3 2 2 2 5
O―、 CH CO―、 HCO―、 Cl—、 Br―、 I—等の各種ァニオンを用いることができる力 核
2 3 2 2
酸の溶解性を高めるという点からハロゲンィ匕物イオンまたは総炭素数 1一 3のカルボ ン酸イオンが好ましぐ中でも Cl—、 Br―、 HCO—であることが好ましい。
2
[0019] イオン性液体は、加熱真空脱水されたものであることが好ましぐその含水量として は、 1. 0質量％以下、好ましくは 0. 5質量％以下程度であることが好ましい。なお、 脱水時の加熱温度、減圧度等はイオン性液体の種類に応じて適宜選定すればょ 、 。また、含水量は、カールフィッシャー水分計による測定値である。
[0020] 本発明に係る核酸含有溶液は、上述したイオン性液体からなる核酸溶解用溶媒に 核酸を溶解させてなるものである。
この場合、イオン性液体中における核酸含有量としては、使用するイオン性液体の 種類によって溶解度が変動するものであるため、一概には規定できないが、通常 10 質量％以下、好ましくは 1. 0-5. 0質量％程度である。
[0021] イオン性液体中に、核酸を溶解させる手法としては、特に限定されるものではない 力 イオン性液体中に所定量の核酸を添加した後、 70— 120°C程度に加熱して核 酸を溶解させる方法を用いることができる。この場合、核酸力 Sイオン性液体中に溶解 したか否かは、核酸を添加した時点では白濁状の溶液が、加熱後に均一透明になる ことから判断できる。
本発明の核酸溶解用溶媒を用いた核酸含有溶液は、これを一旦加熱して、核酸を 溶解させて均一透明状態とした後、再び 10— 25°C程度に冷却しても、核酸が析出 して白濁を呈することはない。
[0022] 以上で説明した核酸溶解用溶媒および核酸含有溶液は、 DNA, RNA等の核酸 を溶存させる必要がある全ての用途に適用可能である。
具体例としては、核酸溶解用溶媒を核酸の保存に用い、核酸含有溶液とした状態 で保存することで、核酸分解酵素が失活する環境下で核酸を保存することができ、極 めて簡便に核酸の長期安定保存が可能となる。この場合、保存温度としては特に限 定されるものではな 、が、一般的な環境温度である 0— 40°C程度での保存が可能で あり、特殊な環境下でなく室温にて長期間保存することができる。
また、核酸溶解用溶媒を核酸の反応に用い、この溶媒中で DNA, RNAの化学修 飾反応等を行うことで、従来溶媒である水中では取り扱うことのできな力つた試薬を用 いた反応や、水中では進行し難い反応を、 0— 100°Cの温度範囲の制限を受けるこ となく行うことができる。
実施例
[0023] 以下、合成例および実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明 は、下記の実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例におけるイオン性 液体の構造確認は、 NMR (Alpha— 500、日本電子 (株)製）を用いて行った。ま た、合成例 6— 8において、生成物中にハロゲン化物が混入していないことは 0. 1M 硝酸銀水溶液 (関東ィ匕学 (株)製)を添加した際にハロゲンィ匕銀の生成に伴う溶液の 白濁が起こらないことにより確認した。さらに、イオン性液体中に DNAおよび RNAが 溶解したことは、白濁状態力も均一透明溶液になることで判断した。
[0024] [合成例 1]
N—メチルイミダゾール（アルドリッチ社製） 10gと 3—クロ口— 1 プロパノール（東京化 成工業 (株)製） 12gとを混合し、窒素雰囲気下、 60°Cで還流しながら 7日間攪拌した 後、反応生成物をジェチルエーテル（関東ィ匕学 (株)製） 300ml中に滴下し、沈殿し た液体を回収した。沈殿物をメタノール (和光純薬工業 (株)製） 10mlに溶解させた 溶液を、ジェチルエーテル 300ml中に滴下し、沈殿した液体を回収した。得られた 液体をエタノール (和光純薬工業 (株)製) 300mlに溶解し、活性炭素粉末 (和光純 薬工業 (株)製) 20gを添加し、 24時間攪拌した。その後、活性炭素粉末を濾別し、 溶媒を減圧下にて留去することにより、イオン性液体 HO (CH ) MIN— C1を得た。
2 3
[0025] [合成例 2]
N—メチルイミダゾール 5gと 3—ブロモ—1—プロパノール（アルドリッチ社製） 8. 5gと を混合し、窒素雰囲気下、 60°Cで還流しながら 3日間攪拌した後、反応生成物をジ ェチルエーテル 250ml中に滴下し、沈殿した液体を回収した。沈殿物をメタノール 1 Omlに溶解させた溶液を、ジェチルエーテル 300ml中に滴下し、沈殿した液体を回 収した。得られた液体をメタノール 300mlに溶解し、活性炭素粉末 20gを添加し、 24 時間攪拌した。その後、活性炭素粉末を濾別し、溶媒を減圧下にて留去することによ り、イオン性液体 HO (CH ) MIN— Brを得た。
2 3
[0026] [合成例 3]
N-メチルイミダゾール 10gと 1-クロ口プロパン (東京化成工業 (株)製） 50gとを混合 し、窒素雰囲気下、 45°Cで還流しながら 7日間攪拌した後、未反応の 1 クロ口プロパ ンを留去し、反応生成物をジェチルエーテル 300ml中に滴下し、沈殿した液体を回 収した。沈殿物をメタノール 10mlに溶解させた溶液を、ジェチルエーテル 300ml中 に滴下し、沈殿した液体を回収した。得られた液体をァセトニトリル (和光純薬工業（ 株)製) 300mlに溶解し、活性炭素粉末 20gを添加し、 24時間攪拌した。その後、活 性炭素粉末を濾別し、溶媒を減圧下にて留去することにより、イオン性液体 PMIN - C1を得た。
[0027] [合成例 4]
N-メチルイミダゾール 10gと 1-ブロモプロパン（関東ィ匕学 (株)製） 50gとを混合し、 窒素雰囲気下、 50°Cで還流しながら 4日間攪拌した後、反応生成物をジェチルエー テル 300ml中に滴下し、沈殿した液体を回収した。沈殿物をメタノール 10mlに溶解 させた溶液を、ジェチルエーテル 300ml中に滴下し、沈殿した液体を回収した。得ら れた液体をァセトニトリル 300mlに溶解し、活性炭素粉末 20gを添加し、 24時間攪 拌した。その後、活性炭素粉末を濾別し、溶媒を減圧下にて留去することにより、ィォ ン性液体 PMIN— Brを得た。
[0028] [合成例 5]
N—メチルイミダゾール (アルドリッチ社製） 10gとプロモェタン（関東ィ匕学 (株)製） 20 mlとを混合し、窒素雰囲気下、 0°Cで 2日間反応させた後、反応生成物をジェチルェ 一テル (関東ィ匕学 (株)製) 300ml中に滴下し、沈殿した白色固体を回収した。沈殿 物にジェチルエーテル 300mlを添加して 2時間攪拌した後、沈殿した白色固体を回 収した。残存する溶媒を減圧下にて留去することにより、 EMIm— Brを得た。
[0029] [合成例 6]
合成例 5で得た EMIm— Br2gを脱イオン水 60mlに溶解した溶液を、陰イオン交換 榭脂アンバーライト IRA-400 (OH) (Sperco社製） 150mlを充填したカラムに通し 、 EMIm— OHの水溶液を得た。
[0030] [合成例 7]
合成例 6で得た EMIm— OH水溶液 60mlと、プロピオン酸（関東ィ匕学 (株)製) 0. 8 gとを混合し、 24時間氷浴中で攪拌した後、水を減圧下にて留去し、反応生成物を 得た。反応生成物をジェチルエーテル（関東ィ匕学 (株)製） 300ml中に滴下し、沈殿 した液体を回収した。沈殿物をメタノール (和光純薬工業 (株)製) 5mlに溶解させた 溶液を、ジェチルエーテル 300ml中に滴下し、沈殿した液体を回収した。減圧下、 回収した沈殿物カゝら残存溶媒を留去してイオン性液体 EMIm— C COOを得た。
2
[0031] [合成例 8]
合成例 6で得た EMIm— OH水溶液 60mlと、ぎ酸 (和光純薬工業 (株)製) 0. 5gと を混合し、 24時間氷浴中で攪拌した後、水を減圧下にて留去し、反応生成物を得た 。反応生成物をジェチルエーテル（関東ィ匕学 (株)製） 300ml中に滴下し、沈殿した 液体を回収した。沈殿物をメタノール (和光純薬工業 (株)製) 5mlに溶解させた溶液 を、ジェチルエーテル 300ml中に滴下し、沈殿した液体を回収した。減圧下、回収し た沈殿物カゝら残存溶媒を留去してイオン性液体 EMIm— HCOOを得た。 [0032] [合成例 9]
N—メチルイミダゾール (ACROS ORGANICS製） 5g (6 lmmol)と塩酸（和光純 薬工業 (株)製)を蒸留水にて 2molZlに希釈した塩酸水溶液 30. 5mlを混合し、 24 時間氷浴中で攪拌した。その後、凍結乾燥および減圧することで水を留去し、イオン 性液体 MIm— C1を得た。
[0033] [合成例 10]
N—メチルイミダゾール (ACROS ORGANICS製） 5g (6 lmmol)とギ酸（和光純 薬工業 (株)製) 2. 3ml (6 lmmol)を混合し、 24時間氷浴中で攪拌した。その後、水 を減圧下で留去し、イオン性液体 MIm - HCOOを得た。
[0034] [実施例 1]
合成例 1で作製したイオン性液体 HO (CH ) MIN-C1 lgを 110°Cで 24時間加
2 3
熱真空乾燥し、窒素雰囲気下で DNA (大和化成 (株)製) lOmgと混合し、密封した 後、加熱しながら DNAの溶解温度を記録した。その結果、 DNAlOmgがイオン性液 体 HO (CH ) MIN-C1 lgに完全に溶解する温度は 70°Cであった。
2 3
[0035] [実施例 2]
合成例 1で作製したイオン性液体 HO (CH ) MIN-C1 lgを 110°Cで 24時間加
2 3
熱真空乾燥し、窒素雰囲気下で RNA (東京化成工業 (株)製) lOmgと混合し、密封 した後、加熱しながら RNAの溶解温度を記録した。その結果、 RNAlOmgがイオン 性液体 HO (CH ) MIN-C1 lgに完全に溶解する温度は 60°Cであった。
2 3
[0036] [実施例 3]
合成例 2で作製したイオン性液体 HO (CH ) MIN-Br lgを 110°Cで 24時間加
2 3
熱真空乾燥し、窒素雰囲気下で DNAlOmgと混合し、密封した後、加熱しながら D NAの溶解温度を記録した。その結果、 DNAlOmgがイオン性液体 HO (CH ) MI
2 3
N— Br lgに完全に溶解する温度は 87°Cであった。
[0037] [実施例 4]
合成例 2で作製したイオン性液体 HO (CH ) MIN-Br lgを 110°Cで 24時間加
2 3
熱真空乾燥し、窒素雰囲気下で RNAlOmgと混合し、密封した後、加熱しながら RN Aの溶解温度を記録した。その結果、 RNAlOmgがイオン性液体 HO (CH ) MIN— Br lgに完全に溶解する温度は 82°Cであった。
[0038] [実施例 5]
合成例 3で作製したイオン性液体 PMIN— CI lgを 110°Cで 24時間加熱真空乾燥 し、窒素雰囲気下で DNAlOmgと混合し、密封した後、加熱しながら DNAの溶解温 度を記録した。その結果、 DNAlOmg力 Sイオン性液体 PMIN-C1 lgに完全に溶解 する温度は 80°Cであった。
[0039] [実施例 6]
合成例 3で作製したイオン性液体 PMIN— CI lgを 110°Cで 24時間加熱真空乾燥 し、窒素雰囲気下で RNAlOmgと混合し、密封した後、加熱しながら RNAの溶解温 度を記録した。その結果、 RNAlOmg力 Sイオン性液体 PMIN-C1 lgに完全に溶解 する温度は 70°Cであつた。
[0040] [実施例 7]
合成例 4で作製したイオン性液体 PMIN— Br lgを 110°Cで 24時間加熱真空乾燥 し、窒素雰囲気下で DNAlOmgと混合し、密封した後、加熱しながら DNAの溶解温 度を記録した。その結果、 DNAlOmg力 Sイオン性液体 PMIN-Br lgに完全に溶解 する温度は 90°Cであつた。
[0041] [実施例 8]
合成例 4で作製したイオン性液体 PMIN— Br lgを 110°Cで 24時間加熱真空乾燥 し、窒素雰囲気下で RNAlOmgと混合し、密封した後、加熱しながら DNAの溶解温 度を記録した。その結果、 RNAlOmg力 Sイオン性液体 PMIN— Br lgに完全に溶解 する温度は 82°Cであった。
[0042] 上記各実施例 1一 8において使用したイオン性液体の構造、 DNAおよび RNAの 各イオン性液体に対する溶解温度を表 1に示す。
[0043] [表 1]
Figure imgf000013_0001
[0044] [実施例 9, 10]
合成例 1で作製したイオン性液体 HO (CH ) MIN-C1 2. 5gを 110°Cで 24時間
2 3
加熱真空乾燥した。このイオン性液体 2. 5gと、 DNAlmg (実施例 9)、 1. 5mg (実 施例 10)とを混合し、それぞれ 84°Cで加熱溶解し、さらに常温で 48時間放置した。 得られた各 DNA含有溶液を、光路長 lmm角型石英セルに入れ、室温で可視紫 外吸収スペクトルを測定した (UV— 2500PC、（株）島津製作所製)。得られたスぺク トルを図 1に示す。
[0045] 図 1に示されるように、得られた可視紫外吸収スペクトルは、核酸塩基に由来する 2 60nm付近の吸収が DNAの添カ卩量に応じて変化し、また吸収を持たな 、320nm以 上の波長域での吸光度がゼロであったことから、イオン性液体中に DNAが常温にお V、ても溶存して 、ることがわかる。
[0046] [実施例 11, 12]
合成例 1で作製したイオン性液体 HO (CH ) MIN-C1 2. 5gを 110°Cで 24時間
2 3
加熱真空乾燥した。このイオン性液体 2. 5gと、 RNAlmg (実施例 11)、 1. 5mg (実 施例 12)とを混合し、それぞれ 74°Cで加熱溶解し、さらに常温で 48時間放置した。 得られた各 RNA含有溶液にっ 、て、実施例 9と同様にして可視紫外吸収スペクトル を測定した。得られたスペクトルを図 2に示す。
図 2に示されるように、得られた可視紫外吸収スペクトルは、核酸塩基に由来する 2 60nm付近の吸収が RNAの添カ卩量に応じて変化し、また吸収を持たな 、320nm以 上の波長域での吸光度がゼロであったことから、イオン性液体中に RNAが常温にお V、ても溶存して 、ることがわかる。
[0047] [実施例 13]
実施例 1で調製した DNA含有溶液を 120時間保存した後、これに 2—プロパノール (東京化成工業 (株)製) 3mlを混合した。この混合溶液を室温下、遠心分離器 (KA —1000、（株)久保田製作所製）により 3000rpmで 15分間遠心分離を行った後、上 澄み溶液を除去した。沈殿物にエタノール 3mlをカ卩え、さらに 3000rpmで 15分間遠 心分離を行った後、上澄み溶液を除去した。
沈殿物を 0. 2mlの蒸留水に溶解し、塩化ナトリウム (和光純薬工業 (株)製） lOmg を添カ卩した後、エタノール 2mlを添カ卩した。得られた溶液を、 3000rpmで 15分間遠 心分離を行い、上澄み溶液を除去した。沈殿物に、 85質量％エタノール水溶液 2ml を混合し、 3000rpmで 15分間の遠心分離を行った。上澄み溶液を除去し、沈殿物 に、再び 85質量％エタノール水溶液 2mlを混合して 3000rpmで 15分間の遠心分 離を行った後、上澄み溶液を除去し、最終的に得られた沈殿物を常温で真空乾燥し た。
[0048] 乾燥して得られた白色粉末状の DNA2mgを蒸留水 5mlに溶解し、実施例 9と同様 にして可視紫外吸収スペクトルを測定した。得られたスペクトルを図 3に示す。
図 3に示されるように、核酸塩基に由来する 260nmの吸収があり、対照 DNAと同 様の吸収スペクトルが得られたことから、保存後に単離した白色粉末は DNAであるこ とが確認された。
[0049] さらに白色粉末状の DNA2mgを蒸留水 5mlに溶解した溶液を光路長 lmmの角 形石英セルにしれ、室温下、 CDスペクトルを測定した (J 720、日本分光 (株)製)。 得られたスペクトルを図 4に示す。
図 4に示されるように、対照 DNAと同様のスペクトルが得られたことから、保存後に 単離した白色粉末は、天然 DNAと同様に右巻き 2重らせん構造を保持していること が確認された。
[0050] [実施例 14]
実施例 2で得られた RNA含有溶液を用いた以外は、実施例 13と同様にして白色 粉末状の RNAを単離した。
この白色粉末 RNAについて、実施例 13と同様にして可視紫外吸収スペクトルおよ び CDスペクトルを測定した。得られたスペクトルをそれぞれ図 5, 6に示す。
図 5に示されるように、核酸塩基に由来する 260nmの吸収があり、対照 RNAと同 様の吸収スペクトルが得られたことから、保存後に単離した白色粉末は RNAであるこ とが確認された。図 6に示されるように、対照 RNAと同様のスペクトルが得られたこと から、保存後に単離した白色粉末は、天然 RNAと同様に右巻き 2重らせん構造を保 持して 、ることが確認された。
[0051] [実施例 15]
合成例 7で作製したイオン性液体 EMIm— C COO lgを、 90°Cで 36時間加熱真
2
空乾燥し、窒素雰囲気下で DNA (大和化成 (株)製) 5mgと混合し、密封した後、加 熱しながら DNAの溶解温度を記録した。その結果、 DNA5mgがイオン性液体 EMI m-C COO lgに完全に溶解する温度は 70°Cであった。
2
[0052] [実施例 16]
合成例 7で作製したイオン性液体 EMIm— C COO lgを、 90°Cで 36時間加熱真
2
空乾燥し、窒素雰囲気下で RNA (東京化成工業 (株)製) 5mgと混合し、密封した後 、加熱しながら RNAの溶解温度を記録した。その結果、 RNA5mgがイオン性液体 E MIm-C COO lgに完全に溶解する温度は 60°Cであった。
2
[0053] [実施例 17]
合成例 8で作製したイオン性液体 EMIm— HCOO lgを、 90°Cで 36時間加熱真 空乾燥し、窒素雰囲気下で DNA5mgと混合し、密封した後、加熱しながら DNAの 溶解温度を記録した。その結果、 DNA5mgがイオン性液体 EMIm-HCOO lgに 完全に溶解する温度は 60°Cであった。
[0054] [実施例 18]
合成例 8で作製したイオン性液体 EMIm— HCOO lgを、 90°Cで 36時間加熱真 空乾燥し、窒素雰囲気下で RNA5mgと混合し、密封した後、加熱しながら RNAの 溶解温度を記録した。その結果、 RNA5mgがイオン性液体 EMIm— HCOO lgに 完全に溶解する温度は 48°Cであった。 上記実施例 15— 18にお 、て使用したイオン性液体の構造、 DNAおよび RNAの 各イオン性液体に対する溶解温度を表 2に示す。
[表 2]
Figure imgf000016_0001
[0056] [実施例 19]
合成例 9で作製したイオン性液体 MIm— CI lgを 70°Cで 16時間加熱真空乾燥し
、窒素雰囲気下で DNA ( (株) -チロ製） 10mgと混合し、密封した後、加熱しながら
DNAの溶解温度を記録した。その結果、 DNAlOmgがイオン性液体 Mlm-Cl lg に完全に溶解する温度は 76°Cであった。
[0057] [実施例 20]
合成例 10で作製したイオン性液体 MIm— HCOO lgを 70°Cで 16時間加熱真空 乾燥し、窒素雰囲気下で DNA ( (株)ニチロ製） lOmgと混合し、密封した後、加熱し ながら DN Aの溶解温度を記録した。その結果、 DNAlOmgがイオン性液体 Mlm-
HCOO lgに完全に溶解する温度は 85°Cであった。
[0058] 上記各実施例 19および 20において使用したイオン性液体の構造、 DNAの各ィォ ン性液体に対する溶解温度を表 3に示す。
[0059] [表 3] イオン性液体 核酸溶解温度
名称 構造式 (°C) 実施例 19 Mlm-Cl ^^ ，ソ' CI 76 実施例 20 MIm- HCOO V,■ノ 、 85

Claims

請求の範囲
[1] 核酸を溶解することのできるイオン性液体力 なることを特徴とする核酸溶解用溶 媒。
[2] 前記イオン性液体を構成するカチオン力 アンモ-ゥムカチオン、イミダゾリゥムカ チオンおよびピリジ-ゥムカチオン力も選ばれる少なくとも 1種であることを特徴とする 請求項 1記載の核酸溶解用溶媒。
[3] 前記イオン性液体を構成するァ-オンが、ハロゲンィ匕物イオンまたは総炭素数 1一
3のカルボン酸イオンであることを特徴とする請求項 1または 2記載の核酸溶解用溶 媒。
[4] 前記イオン性液体が、中和型イオン性液体であることを特徴とする請求項 1記載の 核酸溶解用溶媒。
[5] 核酸保存用または核酸反応用であることを特徴とする請求項 1一 4のいずれか 1項 に記載の核酸溶解用溶媒。
[6] 核酸をイオン性液体に溶解させてなることを特徴とする核酸含有溶液。
[7] 核酸をイオン性液体中に溶解させた状態で保存することを特徴とする核酸保存方 法。
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