WO2005087267A1

WO2005087267A1 - 前立腺肥大症治療剤

Info

Publication number: WO2005087267A1
Application number: PCT/JP2005/004084
Authority: WO
Inventors: Yoshinobu Kubota; Hiroji Uemura
Original assignee: Yokohama TLO Co Ltd
Current assignee: Yokohama TLO Co Ltd
Priority date: 2004-03-12
Filing date: 2005-03-09
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2006-09-12
Also published as: US20070197562A1; EP1731169A4; EP1731169A1; JPWO2005087267A1

Abstract

　前立腺における正常細胞の過度の増殖を抑制することができ、上皮細胞の増殖による肥大及び間質細胞の増殖による肥大のいずれにも有効であり、副作用が少なく、単独で又は従来の薬物療法に使用される薬物との組合せで使用することができる、新規な前立腺肥大症の予防及び／又は治療剤及び前立腺の正常細胞の増殖阻害剤、ならびにそれらの使用方法を提供する。　アンギオテンシンII受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩、又はそのプロドラッグを有効成分とする、前立腺肥大症の治療及び／又は予防剤。

Description

明細書

前立腺肥大症治療剤

技術分野

[oooi] 本発明は、前立腺肥大症の治療及び Z又は予防のための化合物及び組成物、前立腺細胞の増殖阻害のための化合物及び組成物、及びそれらの使用方法に関する

。本発明は、より一般的には、前立腺正常細胞における MAPキナーゼ (MAPK)リン酸ィ匕阻害のための化合物及び組成物、及びそれらの使用方法に関する。

背景技術

[0002] 前立腺肥大症は、早い人では 40歳代後半力も起こり、 60歳代までにはほとんどの人に起こる疾患である。前立腺の肥大は、前立腺を構成する間質細胞及び Z又は上皮細胞の一部が増大することによって起こる。しかし、がんとは異なり、一定のところで増殖が止まるように制御されている。そのため、前立腺肥大症は良性であり、それ自体によって死に至る性質の疾患ではないが、排尿障害等の症状によって患者の生活の質 (QOL)には大きく影響する。

[0003] 前立腺肥大症の治療法としては、従来は開腹手術、経尿道的前立腺切除術 (TU R— P)等の手術が主流であった力 1990年代以降、 α 1受容体遮断薬、抗男性ホルモン薬、生薬 '漢方薬等の薬物による治療法が一般的になってきている。

[0004] a 1受容体遮断薬は、前立腺肥大症による排尿障害を、尿道等の筋肉の緊張を緩和することによって改善させる効果を有し、副作用も少ないため、よく利用されている力前立腺の肥大した腺腫を縮小させることはできない。一方、抗男性ホルモン薬は、肥大した腺上皮を退縮させることによって症状を改善するが、服用を中止すると腺腫がもとの大きさに戻るため、薬を飲み続ける必要がある。さらに、抗男性ホルモン作用による勃起能の低下を起こす。また、生薬 '漢方薬は、比較的軽症の場合や他の薬物療法では改善しない場合等に使用を検討される力作用メカニズムはよくわかつておらず、偽薬効果の可能性もある。

[0005] アンギオテンシン IIは、 ATI受容体を介して血管収縮等の生理作用を発現するので、アンギオテンシン II受容体拮抗剤、特に ATI受容体拮抗剤は、降圧剤、心臓疾患等の循環器系疾患治療剤として使用されている。最近、アンギオテンシン II受容体拮抗剤が前立腺がん細胞に対して増殖抑制効果を有することが見出された (非特許文献 1： Uemura, H. et al., Angiotensin II receptor blocker shows antipronrerative activity in prostate cancer cells: A possibility of tyrosine kinase inhibitor of growth factor," Mol. Cancer Ther., 2003;2:1139-1147; 特許文献 1：特開 2004— 2282)。しかし、これらの文献には、アンギオテンシン II受容体拮抗剤力がん化していない正常な前立腺の細胞の増殖、又は前立腺肥大症の治療及び Z又は予防に関して効果を有するかどうかにつ、ては記載がな、。

特許文献 1：特開 2004-2282

非特干文献 1： Uemura, H. et al., Angiotensin II receptor blocker snows antiproliferative activity in prostate cancer cells: A possibility of tyrosine kinase inhibitor of growth factor," Mol. Cancer Ther., 2003;2: 1139-1147

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明は、前立腺における正常細胞の過度の増殖を抑制することができ、上皮細胞の増殖による肥大及び間質細胞の増殖による肥大のいずれにも有効であり、副作用が少なぐ単独で又は従来の薬物療法に使用される薬物との組合せで使用することができる、新規な前立腺肥大症の予防及び Z又は治療剤及び前立腺の正常細胞の増殖阻害剤、より一般的には前立腺正常細胞における MAPKリン酸ィ匕阻害のための化合物及び組成物、ならびにそれらの使用方法を提供することを目的とする。課題を解決するための手段

[0007] 本発明者は、アンギオテンシン II受容体拮抗作用を有する化合物が、がん化していない前立腺の細胞の増殖を抑制することを見出し、本発明を完成した。

[0008] すなわち、本発明は、

(1) アンギオテンシン II受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩、又はそのプロドラッグを有効成分とする、前立腺肥大症の治療及び Z又は予防剤；

(2) 前記アンギオテンシン II受容体拮抗作用を有する化合物力非ペプチド型のァンギオテンシン π受容体拮抗剤化合物である、前記（1)記載の治療及び Z又は予防剤；

(3) 前記アンギオテンシン II受容体拮抗作用を有する化合物力イミダゾール系、ベンズイミダゾール系、イミダゾピリジン系、トリアゾール系、ピリジン系、メトキシピリジン系、ピラゾール系、ピロール系、ァザインデン系、ピリミドン系、キナゾリン系、キサンチン系、縮合イミダゾール系、ピリミジンジオン系又はチェノビリドン系のいずれかのィミダゾール骨格又はイミダゾール類縁骨格を有する化合物である、前記（1)又は（2) 記載の治療及び Z又は予防剤；

(4) 前記アンギオテンシン II受容体拮抗作用を有する化合物力口サルタン、ロサルタンカリウム、カンデサルタン、カンデサルタンシレキセチル、バルサルタン、ェプロサルタン、ゾラサルタン、テルミサルタン、ィルベサルタン、タソサルタン、オルメサルタンメドキソミル、及びオルメサルタン力なる群力選択される 1以上の化合物である、前記（1)一 (3)の、ずれか 1記載の治療及び Z又は予防剤；

(5) a 1遮断薬、抗男性ホルモン薬、植物性エキス又は漢方薬、抗コリン薬、及びアミノ酸製剤からなる群から選択される 1以上の有効成分を含む前立腺肥大症治療及び Z又は予防剤と、前記（1)一 (4) 、ずれか 1記載の治療及び Z又は予防剤との組合せ力なる医薬；

(6) アンギオテンシン II受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩、又はそのプロドラッグを有効成分とする、前立腺正常細胞の増殖阻害剤；

(7) 前記前立腺正常細胞が、間質細胞及び Z又は上皮細胞である、前記（6)記載の増殖阻害剤；

(8) アンギオテンシン II受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩、又はそのプロドラッグを有効成分とする、前立腺正常細胞における MAPKリン酸化阻害剤；

(9) 前記前立腺正常細胞が、間質細胞及び Z又は上皮細胞である、前記（8)記載の MAPKリン酸化阻害剤；

(10) 前記 MAPKリン酸化が、アンギオテンシン IIあるいは成長因子又はサイトカインによるものである、前記（8)又は（9)記載の MAPKリン酸化阻害剤、を提供する。 [0009] なお、本発明に関して「正常」細胞とは、がん化していない細胞を指し、その細胞がその他の点にお、て正常でな!ヽ点を全く含まな、ことを意味しな!、。

[0010] 本発明は、さら〖こ、前記の薬剤の使用方法を提供する。

発明の効果

[ooii] 本発明の前立腺肥大症の治療及び Z又は予防剤、前立腺の細胞の増殖阻害剤、及び Z又は前立腺正常細胞における MAPKリン酸ィヒ阻害のための化合物及び組成物は、前立腺における正常細胞の過度の増殖を抑制することができ、上皮細胞の増殖による肥大及び間質細胞の増殖による肥大のいずれにも有効であり、副作用が少なぐ単独で又は従来の薬物療法に使用される薬物との組合せで使用することができる。

[0012] したがって、本発明の前立腺肥大症の治療及び Z又は予防剤、前立腺の細胞の増殖阻害剤、及び Z又は前立腺正常細胞における MAPKリン酸ィヒ阻害のための化合物及び組成物を使用することにより、従来の薬物療法に存在する副作用の問題等を回避しつつ、外科手術によらずに安全に肥大を縮小させることができる。それによつて、前立腺肥大症に伴う不快な症状を、その原因を除去することによって改善させ、患者の QOLを向上させることができる。

図面の簡単な説明

[0013] [図 1]は、正常ヒト前立腺間質細胞由来細胞株 PrSC細胞の増殖に対するアンギオテンシン II及びカンデサルタンシレキセチル (CV11974；以下「CV」又は「カンデサルタン」と略称することがある）の効果を示す図である。

[図 2]は、 PrSC細胞の増殖に対する TGF β及び CVの効果を示す図である。

[図 3]は、 PrSC細胞の増殖に対する EGF及び CVの効果を示す図である。

[図 4]は、 PrSC細胞による IL 6分泌に対する TGF |8、 TNF α及び CVの効果を示す図である。

[図 5]は、 PrSC細胞による IL 6分泌に対する EGFの濃度依存的効果及び CVの効果を示す図である。

[図 6]は、初代培養 F-1細胞による IL-6分泌に対するアンギオテンシン IIの濃度依存的効果及び CVの効果を示す図である。 [図 7]は、初代培養 FT— FB細胞による IL 6分泌に対する TNF a及び CVの効果を示す図である。

[図 8]は、マウスに移植された PC— 3腫瘍片に対するインビボでの CVの効果を示す図である。

[図 9]は、マウスに移植された PC— 3細胞及び PrSC細胞の混合腫瘍片に対するインビボでの CVの効果を示す図である。

[図 10]は、オルメサルタン及び TNF o;による PrSC細胞の増殖抑制効果を示す図である。

[図 11]は、テルミサルタン及び EGF又は TNF o;による PrSC細胞の増殖抑制効果を示す図である。

[図 12]は、種々の濃度の口サルタンによる濃度依存的な PrSC細胞の増殖抑制効果を示す図である。

[図 13]は、口サルタンによる TNF aで刺激された PrSC細胞の増殖抑制効果を示す図である。

[図 14]は、 AIIRブロッカー（カンデサルタン、口サルタン）による PrSC細胞からのパラクリン因子の分泌抑制効果及び PC— 3細胞における MAPKのリン酸ィ匕の抑制効果を示す図である。パネル（A)は pMAPK、パネル）は MAPKのウェスタン'ブロットの結果をそれぞれ示す。

[図 15]は、 AIIRブロッカー（カンデサルタン、口サルタン）による PrSC細胞における M APKのリン酸化の抑制効果を示す図である。パネル (A)は pMAPK、パネル）は MAPKのウェスタン 'ブロットの結果をそれぞれ示す。

発明を実施するための最良の形態

[0014] 本発明に関して、「アンギオテンシン II受容体拮抗作用」とは、アンギオテンシン II受容体、特に ATI受容体に対するアンギオテンシン IIの結合に干渉することにより、ァンギオテンシン IIの生理作用の発現を阻害する性質をいう。

[0015] アンギオテンシン II受容体拮抗作用を有する化合物（以下、「アンギオテンシン II受容体拮抗剤」ということがある）としては、代表的には以下に説明するものが挙げられる。 [0016] アンギオテンシン II受容体拮抗剤は、一般にペプチド型及び非ペプチド型に大別され、また、血管のアンギオテンシン II収縮に対する抑制に関して競合型及び非競合型に分類されるが、本発明において使用されるアンギオテンシン Π受容体拮抗作用を有する化合物は、それらのいずれであってもよい。

[0017] たとえば、非ペプチド型アンギオテンシン II受容体拮抗剤としては、ビフエ-ルテトラゾール系、非ビフエ-ルテトラゾール系の化合物があり、それぞれの中で、イミダゾール骨格を有するものとイミダゾール類縁骨格を有するものが存在する。

[0018] 具体的には、イミダゾール系、ベンズイミダゾール系、イミダゾピリジン系、トリァゾール系、ピリジン系、メトキシピリジン系、ピラゾール系、ピロール系、ァザインデン系、ピリミドン系、キナゾリン系、キサンチン系、縮合イミダゾール系、ピリミジンジオン系、チエノピリドン系等の各種ィ匕合物が公知である。

[0019] さらに具体的には、口サルタン（Dup753)、口サルタンカリウム（ィ匕学名 2—ブチル

4 クロ口— 1— [2， (テトラゾールー 5 ィル）ビフエ-ルー 4 ィルメチル]—1H イミダゾールー 5—メタノールカリウム塩）、カンデサルタン、カンデサルタンシレキセチル（ TCV— 116；化学名 1— (シクロへキシルォキシカルボ-ルォキシ）ェチル 2 ェトキシ— 1— [ [2，—（1H—テトラゾールー 5 ィル）ビフエ-ルー 4 ィル]メチル ]— 1H ベンズイミダゾールー 7—カルボキシラート）、バルサルタン（CGP—48933 ;化学名 N— {4— [2— (1H—テトラゾールー 5 ィル）フエ-ル]ベンジル }—N バレリルパリン）、ェプロサルタン（SK&F108566)、ゾラサルタン（GR— 117289)、テルミサルタン（BIBR2 77；化学名 4，一 { [4一メチル—6— ( 1ーメチルー 2—ベンズイミダゾリル)—2 プロピル一 1 —ベンズイミダゾリル]メチル }— 2 ビフエ-ルカルボン酸）、ィルベサルタン（SR4743 6)、タソサルタン (ANA— 736)、オルメサルタンメドキソミル（CS— 866；ィ匕学名 2, 3 —ジヒドロキシー 2—ブテュル 4— ( 1—ヒドロキシ— 1ーメチルェチル) 2—プロピル 1— [ p— (o—lH—テトラゾールー 5—ィルフエ-ル）ベンジル]イミダゾールー 5—カルボキシラート，サイクリック 2, 3—力一ボナート）等が挙げられる。

[0020] 上記のような化合物の「薬学的に許容されうる塩」としては、ナトリウム、カリウム、力ルシゥム、マグネシウム等の金属の塩；トリェチルァミン、トリメチルァミン、エタノールァミン、ジエタノールァミン、トリエタノールァミン、ジシクロへキシルァミン、 N, N，ージベンジルエチレンジァミン、ピリジン、ピコリン等のアミン類；リジン、アルギニン、オル二チン等の塩基性アミノ酸との塩、等が挙げられる。

[0021] 本発明に関して、アンギオテンシン II受容体拮抗剤のプロドラッグは、生体内で、活性代謝物 (アンギオテンシン Π受容体拮抗剤）に変換される化合物である。たとえば、ァミノ基のァシル化、アルキル化、リン酸化、エイコサノィル化、ァラニル化、ペンチルァミノカルボ-ル化、（ 5—メチルー 2 ォキソ 1, 3—ジォキソレン 4 ィル)メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラ-ル化、ピロリジルメチル化、ビバロイルォキシメチル化、 tert -ブチル化等；水酸基のァシル化、アルキル化、リン酸化、ホウ酸化、ァセチル化、ノルミトイル化、プロパノィル化、ビバロイル化、サクシ-ル化、フマリル化、ァラ-ルィ匕、ジメチルァミノメチルカルボ-ル化等；カルボキシル基のエステル化、ェチルエステルィ匕、フエ-ルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメチルアミノメチルェステル化、ピバロィルォキシメチルエステル化、エトキシカルボ-ルォキシェチルエステル化、フタリジルエステル化、（5—メチルー 2 ォキソ 1, 3 ジォキソレン 4 ィル）メチルエステル化、シクロへキシルォキシカルボ-ルォキシェチルエステル化、メチルアミド化等によって修飾された誘導体等が挙げられる。

[0022] 上記のとおり、本発明に係るアンギオテンシン II受容体拮抗剤は、塩やエステルの形態であってもよい。以下において、アンギオテンシン II受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩、及びそのプロドラッグを、総称して「AIIRブロッカー」と呼ぶことがある。

[0023] 本発明の治療及び Z又は予防剤は、いずれか 1種又は 2種以上の AIIRブロッカー単独からなるものであってもよいが、 AIIRブロッカーに加えて他の成分を含む医薬組成物の形態であってもよい。これらの付加的な成分としては、たとえば、製剤の技術分野で公知の、薬学的に許容されうる各種の担体、賦形剤、希釈剤、安定剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、緩衝剤、懸濁剤、乳化剤、防腐剤、香料、甘味料、着色料等が挙げられる。これらの成分は、予定される投与経路、剤型等にしたがって、当業者が適宜選択することができる。

[0024] 投与経路としては、経口又は非経口のいずれでもよぐたとえば経口、経鼻、経皮、経直腸、皮下、皮内、筋内、腹腔内、静脈内等の投与経路が挙げられる。 [0025] 剤型としては、たとえば経口投与のための錠剤、粉末、顆粒、糖衣錠、カプセル剤、シロップ、懸濁液、乳化液等；注射、デポ剤、点滴、点鼻等のための液体;外用のための軟膏、ゲル、液体、坐剤、貼付剤等が挙げられる。これらの各種製剤の製造方法は、当業者には公知である。たとえば、本発明の治療及び Z又は予防剤は、降圧剤、心臓疾患等の循環器系疾患治療剤として製造又は使用されている各種のアンギォテンシン II受容体拮抗剤含有製剤及び特許文献 1に記載されて!ヽる各種の製剤と同様にして製造することができる。

[0026] また、本発明に係る AIIRブロッカーは、前立腺肥大を抑制するため又は前立腺肥大症の症状を軽減させるための他の薬剤、又はその他の薬剤と組み合わせてもよい

。本発明の治療及び Z又は予防剤にはこれらの成分を含有させてもよぐあるいは、別個の薬剤として同時に又は逐次的に同一患者に投与してもよい。組合せることができる薬剤としては、塩酸ブラゾシン、塩酸タムスロシン、ゥラピジル等の (X 1遮断薬；酢酸クロルマジノン、ァリルエストレノール等の抗男性ホルモン薬；ェビプロスタツト等の植物性製剤及びそれらの成分である植物エキス、セル-チン花粉エキス、猪苓湯等の植物性エキス又は漢方薬;その他、前立腺肥大に伴う症状の緩和に用いられる抗コリン薬、アミノ酸製剤等の薬剤が挙げられる。

[0027] 本発明の治療及び Z又は予防剤は、 AIIRブロッカーを、その医学的な目的を達成するのに有効な量 (薬学的有効量)で含む。具体的な量は、適当な動物モデル等を使用して公知の方法によって決定される力有効成分である AIIRブロッカーの量として、経口投与の場合、通常、 0. 01 μ gZkg体重一 lOmgZkg体重、好ましくは 1 μ g Zkg体重一 5mgZkg体重を 1一 3回 Z日程度である。

[0028] 正確な用量及び投与スケジュールは、投与対象の個体の状況 (たとえば、年齢、体重、性別、感染又は疾患の程度等）、投与経路、組み合わせて投与される他の薬剤又は治療法、特定の製剤の体内持続時間等に応じて、個別に決定される。

実施例

[0029] 製剤例 ί :鋅剤の製诰

カンデサノレタンシレキセチノレ 50mg

ラタ卜ース 35mg コーンスターチ 130mg

微結晶セルロース 30mg

ステアリン酸マグネシウム 5mg

合計 250mg

上記の処方の粉末を混合し、打錠機を用いて打錠して、 1錠あたり 250mgの錠剤とする。

[0030] 例 1 :アンギオテンシン IIによる前立腺間皙細胞のに針する抑制効果

正常ヒト前立腺間質細胞由来の細胞株（PrSC細胞）は、 Sanko Junyaku Co. Ltd.より購入し (Normal Human Prostate Stromal Cells,カタログ番号 CC— 2508)、フエノールレッドフリー RPMI培地中で 5%CO、 37°Cの条件下で継代培養して維持した。

2

[0031] この PrSC細胞（10⁴個）を、 12ゥエルディッシュに入れ、 0. 1% (W/V) BSAを添加したフエノールレッド無含有培養液中で、 5%CO、 37°Cの条件下で数日間培養

2

した後、アンギオテンシン 11 (1 μ Μ又は Μ)を添カ卩した。一部のゥエルについては、アンギオテンシン IIを添加する 4時間前に、 AIIRブロッカーである CVを加えた（1 0 Μ ;以下、特に示した場合を除き、この濃度で使用した)。各群は、 η=4とした。 5 %CO、 37°Cで 5日間培養した後、各ゥエル内の全細胞数をカウントした。

2

[0032] 結果を図 1に示す。アンギオテンシン IIを添カ卩しなかった対照群（「Control」 )と比較して、アンギオテンシン IIで刺激した群 (「ΑΠ ( 1 Μ)」及び「ΑΠ ( 10 Μ)」）では濃度依存的に細胞数の増加が見られた。これに対し、アンギオテンシン II刺激の前に CVを添カ卩した群（「ΑΠ (1 μ Μ) +CV」及び「AΠ (10 _iu M) +CV」）では、細胞数の増加が対照群と同程度まで抑制され、「ΑΠ (1 μ Μ)」と「八11 (1 μ M) +CV」との間及び「ΑΠ (10 μ Μ)」と「八11 (10 μ M) +CV」との間では、いずれも高い有意差が認められた（Pく 0. 01)。

[0033] ί列 2 :TGF βによる Ιΐίϊ£ ¾ ^田のにする

アンギオテンシン IIの代わりに lOngZmLの TGF βを用いて刺激したこと以外は例 1と同様にして、 AIIRブロッカーの効果を調べた。

[0034] 結果を図 2に示す。 TGF βを添カ卩しなかった対照群（「Control」 )と比較して、 TG F βで刺激した群 (「TGF β」）では細胞数が 2倍以上に増加した。これに対し、 TGF β刺激の前に CV (10 μ Μ)を添カ卩した群 (「TGF β +CVJ )では、「TGF β」と比較して細胞数の増加が有意に抑制された (Ρ< 0. 05)。

[0035] ί列 3 :EGFによる Ιΐίϊ£ 糸田の ¾tにする

アンギオテンシン IIの代わりに 10ng/mLの EGFを用いて刺激したこと以外は例 1 と同様にして、 AIIRブロッカーの効果を調べた。

[0036] 結果を図 3に示す。 EGFを添カ卩しなかった対照群（「Control」）と比較して、 EGF で刺激した群（「EGF」）では細胞数の有意な増加が見られた。これに対し、 EGF刺激の前に CVを添カ卩した群 (「EGF + CV」）では、「EGF」と比較して細胞数の増加が有意に抑制され (Pく 0. 05)、対照群と同程度にまで抑えられた。

[0037] 例 4： tff 細qの TL 6分泌に針する ¾制効菜

前立腺肥大症患者由来の初代培養間質細胞 (F - 1細胞）は、以下のようにして調製した。

[0038] 患者から採取した組織を、 20mLの培地（RPMI1640 (GIBCO 11835— 030)に 10% (V/V) FBS (filtron)及び mgZmLペニシリン Zストレプトマイシン（GIBCO 15140-122)を添カ卩したもの）を分注しておいた 50mL遠心管に入れ、 4°Cで 1時間以上静置した。その後、組織を 10cmディッシュに取って鋏で lmm角程度の大きさに切った (血管等は除去した)。この際、血液が多い場合は、 20mLの培地をカロえて lOOOrpmで 5分間遠心し、上清を吸引除去して洗浄した。

[0039] 得られた組織片を 5mLのコラゲナーゼ溶液 (上記と同じ組成の培地中、 lmgZmL コラゲナーゼタイプ II (SIGMA C— 6885)；ただし、 RPMI1640は GIBCO 318 00— 022を使用）を分注しておいた遠心管に移し、 20mLの培地をカ卩え、 1. 5— 3時間、 37°Cで攪拌した。

[0040] 次に、 lOOOrpmで 5分間の遠心後、上清を吸引除去した後、同様の操作を 2— 3 回繰り返してペレットを培地で洗浄した。この際、浮遊物が多い場合はろ過した。

[0041] 得られた細胞を 10cmディッシュに播き、 1一 2週間後、増殖してきた段階で初代培養として使用した。

[0042] 別の前立腺肥大症患者の間質細胞由来の初代細胞 (FT - FB細胞)も、上記と基本的に同じ方法で調製した。 [0043] 例 1と同様に用意した PrSC細胞又は上記のように調製した F— 1もしくは FT— FB細胞を、 6ゥエルディッシュに 10⁵個/ゥエルずつ入れて 5%CO、 37°Cで 1日（24時間

2

)培養し、 TGF jS (IngZmL)ゝ TNF a (Ing/mL) , EGF (2. 5又は lOngZmL) 又はアンギオテンシン 11 (1 μ Μ又は 10 Μ)を添カ卩して刺激した (η= 3)。一部のゥエルについては、各試薬を添加する 4時間前に、 AIIRブロッカーである CVをカ卩えた。各試薬添加後 24時間の時点で培養液を回収し、 CLEIA法で IL 6濃度を測定した。

[0044] 結果を図 4一 7に示す。図 4は、 PrSC細胞を TGF β又は TNF aで刺激した場合である。 TGF β又は TNF aを添カ卩しなかった対照群（「Control」 )と比較して、 TGF β又は TNF aで刺激した群（それぞれ「TGF β (lng/mL)」及び「TNF a (lng/ mL)」）では IL 6の分泌が有意に促進された。しかし、刺激の前に CVを添加した群 (「TGF j8 +CV」及び「TNF a +CV」）では、「TGF j8 (IngZmL)」及び「TNF α ( lng/mL)」とそれぞれ比較して IL-6の分泌が有意に抑制された (それぞれ Pく 0. 04及び Pく 0. 01)。

[0045] 図 5は、 PrSC細胞を EGFで刺激した場合である。 EGFを添カ卩しな力つた対照群（「 ControlJ )と比較して、 EGF (「EGF (2. 5ng/mL)」、「EGF (lOngZmL)」）で刺激すると、用量依存的に IL 6分泌が増加した。しかし、刺激の前に CVを添加した群 (「EGF (10) +CV (10)」）では、「EGF (10ngZmL)」と比較して IL 6の分泌が有意に抑制された（P< 0. 05)。

[0046] 図 6は、 F—1細胞をアンギオテンシン IIで刺激した場合である。アンギオテンシン IIを添加しなカゝつた対照群（「Control」 )と比較して、アンギオテンシン IIで刺激した群 (「 AlKl ^ M)」及び「ΑΠ (10 μ Μ)」）では濃度依存的に IL-6分泌の有意な増加が見られた。し力し、刺激の前にCVを添カ卩した群（「AΠ (10 _iu M)」+CV」）では、「ΑΠ (1 0 Μ)」と比較して IL 6の分泌が有意に抑制された (Ρ< 0. 03)。

[0047] 図 7は、 FT— FB細胞を TNF aで刺激した場合である。 TNF aを添カ卩しなかった対照群（「Control」 )と比較して、 TNF aで刺激した群（「TNF a (lng/mL)」）では I L 6分泌が約 12— 15培程度に増加した。しかし、刺激の前に CVを添加した群（「T NF a +CV」）では、「TNF a (IngZmL)」と比較して IL—6の分泌が有意に抑制された（P = 0. 051)。

[0048] 以上の各例の結果から、前立腺間質細胞は、細胞成長因子による刺激の結果、 IL —6を分泌する力 AIIRブロッカーはこの IL— 6の分泌を抑制することができ、その結果、 IL 6によって引き起こされる前立腺上皮細胞の増殖を抑制することができることが明らかとなった。

[0049] したがって、 AIIRブロッカーは、前立腺の正常な間質細胞及び上皮細胞の両方の増殖を抑制することができる。

[0050] 例 5：牛.体内での前立腺細胞のに針する制効果

ATI受容体の発現が少ないヒト前立腺がん細胞 PC— 3 (American Type Culture

Collection, Rockville, MD, USAより入手）及び PrSC細胞を用いて、生体内での AIIR ブロッカーの効果を調べた。

[0051] 生後 4週の雄ヌードマウスの背部皮下に、 PC 3細胞（5 X 10⁶個）又は PC 3細胞と PrSC細胞との混合細胞 (各 2. 5 X 10⁶；合計 5 X 10⁶個）のいずれかを注入し、腫瘍を形成させた。 1週間後には、径約 5mmの腫瘍が形成された。

[0052] 上記のマウスを、 CV(5mgZkgZ日）投与群、 CV(10mgZkgZ日）投与群、投与なし (Control)の 3群に分け (各群 n=4)、投与群には、腫瘍注射 1週間後から 5 週間まで毎日、それぞれ所定の用量の CVを摂取できるように飲料水に溶力して経口投与した。各マウスの腫瘍 (異種移植片)の大きさを毎週測定し、長径 X短径 X短径 ÷ 2の計算式を用いて体積を算出した。この体積を、第 1週の体積を 1とした相対比として表した。結果を図 8 (PC— 3細胞を移植)及び 9 (PC— 3細胞及び PrSC細胞の混合物を移植）に示す。

[0053] PC— 3細胞は、他の前立腺がん細胞（DU145、 LNCaP)と比較して発現して!/、る ATI受容体が少な、ため、 AIIRブロッカーによる増殖抑制効果は低、と予想される。図 8によれば、この予想のとおり、「Control」と比較して CV投与群では増殖抑制が見られたものの、その効果はさほど顕著ではなカゝつた。一方、 PC— 3と PrSCとの混合細胞を移植した場合（図 9)には、「Control」と比較して投与群では用量依存的な増殖抑制が観察され、 rcontroljと「CV: 10mgZkgZday」との間で第 4週及び第 5 週においてそれぞれ P< 0. 04 (「*」及び P< 0. 03 (「* *」）の有意差が認められた。

[0054] したがって、生体内においても AIIRブロッカーは間質細胞の増殖を抑制することが明らかになった。さらに、 AIIRブロッカーは、前立腺がん細胞の増殖を直接抑制するほかに、間質細胞に対する増殖因子、サイト力イン等の分泌抑制などの影響を通じても前立腺がんの増殖を抑制することが示された。

[0055] 例 6 :オルヌサルタンによる tft 纏の

PrSC細胞を、 20, 000個 Zゥエルで 12ゥエルディッシュに播き、 0. 1 % (W/V) B SAを添カ卩したフエノールレッド無含有 F12培養液に、 TNF a (Ing/mL)を単独で又はオルメサルタン（1 μ Μ)と同時に、それぞれ添加して、 5日間培養した後、細胞数を測定した。何も添加しない群を対照群とした。各群は、 η=4とした。

[0056] 結果を図 10に示す。対照群（「Control」と比較して、 TNF aで刺激した群（「TNF a (1)」）は、有意な細胞数の増加を示した（Pく 0. 01)。これに対し、オルメサルタンを同時に加えた群（「TNF _a (1) +01m (l)」）では、細胞数の増加が有意に抑制された（P< 0. 04)。

[0057] ί列 7 :テルミサルタンによる tffVn 糸田の

PrSC細胞を、 25, 000個 Zゥエルで 12ゥエルディッシュに播き、 0. 1 % (W/V) B SAを添カ卩したフエノールレッド無含有 F12培養液に、 EGF (10ng/mL)又は TNF a (IngZmL)を、それぞれ単独で又はテルミサルタン（50 M)と同時に、添加して、 5日間培養した後、細胞数を測定した。何も添加しない群を対照群とした。各群は、 n=4とした。

[0058] 結果を図 11に示す。対照群（「Control」と比較して、 EGF又は TNF aで刺激した群 (それぞれ「EGF (10)」又は「TNF a (1)」）は、有意な細胞数の増加を示した (P < 0. 01)。これに対し、テルミサルタンを同時にカ卩えた群（「EGF ( 10) +Tel」及び「 TNF a (1) +Tel」）では、細胞数の増加が有意に抑制された（P< 0. 01)。

[0059] 例 8：口サルタンによる ^ 耐纏の ¾1 (1)

PrSC細胞を、 20, 000個 Zゥエルで 12ゥエルディッシュに播き、 10% (VZV) FC Sを添カ卩したフエノールレッド無含有 F12培養液に、口サルタンを種々の濃度（0、 0. 1、 1. 0、 M)で添加し、 5日間培養した後、細胞数を測定した。何も添加しない群を対照群とした。各群は、 n=4とした。

[0060] 結果を図 12に示す。対照群（口サルタン「一」 )と比較して、口サルタンを添加した群（ 0. 1、 1. 0、 10 M)では用量依存的に細胞増殖が抑制され、 10/zMの口サルタンを添加した群では対照群と比較して有意差が認められた (Pく 0. 05)。

[0061] ί列 9：口サルタンによる ^ 耐纏の (2)

PrSC細胞を、 25, 000個 Zゥエルで 12ゥエルディッシュに播き、 0. 1%(W/V)B SAを添カ卩したフエノールレッド無含有 F12培養液に、 TNFa (Ing/mL)及びロサルタン（10 M)を、それぞれ単独で又は両方同時に、添加して、 5日間培養した後、細胞数を測定した。何も添加しない群を対照群とした。各群は、 n=4とした。

[0062] 結果を図 13に示す。対照群 (TNFaZ口サルタン「一 Z—」）と比較して、 TNFaで刺激した群 (TNFaZ口サルタン「1.0Z—」）は、有意な細胞数の増加を示した (P <0. 05)。これに対し、口サルタンを同時に加えた群（TNFaZ口サルタン「1. 0/1 0」）では、細胞数の増加が有意に抑制された (P<0. 02)。また、口サルタンを単独で添加した群 (TNFaZ口サルタン「一 Z10」では細胞増殖に変化が認められず、対照群と同等であった。

[0063] 例 10: AIIRブロッカーによる間皙細朐からのパラクリン闵子分泌の抑制

(10-1)

間質細胞（PrSC)を、 0. 1%(WZV)BSAを含有するフエノールレッド無含有 F12 培地中で培養し、アンギオテンシン II (10 μ Μ)を単独で又は口サルタン（「Los」； 10 μ Μ)と同時に添加して 24時間後、培養液を採取し、コンディションド培地（「0. 1% BSA— CM」）とした。

(10-2)

間質細胞 (PrSC)を、 10% (V/V) FCSを含有するフエノールレッド無含有 F12培地中で培養し、 CV(10 μ Μ)又は口サルタン（10 μ Μ)を添カ卩して 24時間後、培養液を採取し、コンディションド培地（「10%FCS— CM」）とした（アンギオテンシン IIは添カ卩しなかった）。同様にして、何も添カ卩しない 10%FCS— CMも調製した。

[0064] 10—1及び 10— 2のいずれにおいても、用いた PrSC細胞は 300万個であった。

[0065] 前立腺がん細胞 PC3細胞を、 0. 1% (W/V) BSAを含有するフエノールレッド無含有 F12培地中で 24時間培養した後、培地を上記で採取した各コンディションド培地に交換し、 10分後に細胞を採取して以下のようにして全細胞タンパクを抽出した。また、同時に、コンディションド培地を添カ卩しない PC— 3細胞についても同様の実験を行った（「Control」）。

[0066] 細胞を、氷冷したリン酸緩衝液 (PBS)で 2回洗浄した後、 200 μ Lの氷冷した細胞溶解液（lysis buffer ; 20mM トリス（pH8. 0)、 137mM NaCl、 10% グリセロール、0. 1% SDS、0. 5% Nonidet P— 40 (商品名）、 lOOmM フツイ匕ナトリウム（ sodium fluoride)、 200mM オノレトノナジゥム酸ナトリウム (sodium orthovanadate)、 ImM EGTA、 2mM フエ-ルメチルスルフォ-ルフロリド（phenylmethylsulfonyl fluoride)、 lmg/nL ロイぺプチン及び 3mgZmL ァプロチュン）中で溶解させ、遠心分離した。上清を回収した。

[0067] このタンパク試料を常法により SDS— PAGEに供し、抗ホスホ MAPキナーゼ抗体（ anti- phospho- MAP kinase antibody)又は抗 MAPキナーゼ抗体 (anti- MAP kinase antibody) (いずれも Cell Signaling Technology (Beverly, MA)から購入した）を検出用抗体として用いてウェスタン'プロットにより MAPKのリン酸化を調べた。

得られた結果から、 NIH image ソフトウェアによって pMAPK及び MAPKの各バンドの発現量を測定した。この結果に基づ、て各レーンの pMAPKZMAPK比を算出し、次にレーン 1 (「Control」）の数値を 1として各レーンの測定値の Controlに対する比（「pMAPK比」）を算出した。

[0068] 結果を図 14に示す。前立腺細胞（上皮細胞及び間質細胞）の増殖においては、種々の成長因子及び Ζ又はサイト力インが細胞膜の受容体に結合することにより、細胞内に増殖シグナルが伝達され、その際、増殖系のシグナル伝達系のひとつである Μ ΑΡΚのリン酸ィ匕が起こり、下流の増殖カスケードに伝わって最終的に増殖系タンパクが作られると考えられている。この実験においては、コンディションド培地を用いずに培養した場合 (レーン 1)と比較して、何も薬剤を添加せずに PrSC細胞を培養して調製したコンディションド培地で培養した場合（レーン 4)にお!/、て PC— 3細胞における MAPKのリン酸化が顕著であることから、間質細胞が IL— 1、 IL 6、 IL 8、 MCP— 1 、 MCSF等の成長因子及び Z又はサイト力イン (パラクリン因子）を分泌し、これによつて PC— 3細胞における MAPKのリン酸ィ匕及び細胞増殖が促進されることが確認された。

[0069] また、アンギオテンシン IIを単独で添カ卩した PrSCコンディションド培地を添カ卩した場合には PC— 3細胞における MAPKのリン酸化が起こったが（レーン 2)、アンギオテンシン IIを口サルタンと同時に添カ卩したコンディションド培地の場合にはこのリン酸化は抑制されていた（レーン 3)。さら〖こ、何も薬剤を添カ卩していないコンディションド培地を添カ卩した場合には PC— 3細胞における MAPKのリン酸化が起こったが（レーン 4)、 C V又は口サルタンを添カ卩したコンディションド培地の場合にはこのリン酸ィ匕は抑制されていた（レーン 5及び 6)。

これらの結果により、間質細胞からのパラクリン因子の分泌が AIIRブロッカーによつて抑制され、前立腺の上皮細胞の増殖が抑制されることが示された。

[0070] 例 11 : AIIRブロッカーによる前立腺間皙細胞の MAPKリン酸化の抑制

間質細胞（PrSC)を、 0. 1 % (WZV) BSAを含有するフエノールレッド無含有 F12 培地中で 24時間培養し、アンギオテンシン II ( 10 μ Μ)又は TNF a ( lng/mL)を単独で、あるいは CV ( 10 μ Μ)又は口サルタン（「Los」； M)と同時に、培地交換により添加して、 10分後に細胞を採取して例 10と同様にして全細胞タンパクを抽出した。また、同時に、何も薬剤を添加しない細胞、及び CV又は Losを単独で添カロした細胞についても同様の実験を行った。それぞれについて、用いた PrSC細胞は 3 00万個であった。

例 10と同様にして、これらの試料を用いてウェスタン'プロットを行った。

[0071] 結果を図 15に示す。アンギオテンシン IIを単独で添カ卩した場合は、 MAPKのリン酸化が強く活性ィ匕されていたが（レーン 2)、 CV又は Losと同時に添加した場合は、 M APKのリン酸化は抑制された（レーン 3及び 4)。 TNF aについても同様であり、単独で添カ卩した場合は、 MAPKのリン酸ィ匕が強く活性ィ匕されていたが（レーン 5)、 CV又は Losと同時に添カ卩した場合は、 MAPKのリン酸ィ匕は抑制された（レーン 6及び 7)。また、 CV又は Losを単独で添カロしても、特に MAPKのリン酸ィ匕は起こらなカゝつた（レーン 8及び 9)。

以上の結果から、 AIIRブロッカーは、前立腺間質細胞に作用して、アンギオテンシン II及び TNF aを含む増殖シグナルの伝達を抑制することが示された。

この出願は、平成 16年 3月 12日出願の日本特許出願、特願 2004— 069946に基づくものであり、特願 2004— 069946の明細書及び特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。

Claims

請求の範囲

[1] アンギオテンシン π受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩

、又はそのプロドラッグを有効成分とする、前立腺肥大症の治療及び Ζ又は予防剤。

[2] 前記アンギオテンシン II受容体拮抗作用を有する化合物力非ペプチド型のアンギォテンシン Π受容体拮抗剤化合物である、請求の範囲 1記載の治療及び Ζ又は予防剤。

[3] 前記アンギオテンシン II受容体拮抗作用を有する化合物力イミダゾール系、ベンズイミダゾール系、イミダゾピリジン系、トリアゾール系、ピリジン系、メトキシピリジン系、ピラゾール系、ピロール系、ァザインデン系、ピリミドン系、キナゾリン系、キサンチン系、縮合イミダゾール系、ピリミジンジオン系又はチェノビリドン系のいずれかのイミダゾール骨格又はイミダゾール類縁骨格を有する化合物である、請求の範囲 1又は 2 記載の治療及び Ζ又は予防剤。

[4] 前記アンギオテンシン II受容体拮抗作用を有する化合物力口サルタン、口サルタンカリウム、カンデサルタン、カンデサルタンシレキセチル、バルサルタン、ェプロサルタン、ゾラサルタン、テルミサルタン、ィルベサルタン、タソサルタン、オルメサルタンメドキソミル、及びオルメサルタン力なる群力選択される 1以上の化合物である、請求の範囲 1一 3のいずれ力 1項記載の治療及び Ζ又は予防剤。

[5] a 1遮断薬、抗男性ホルモン薬、植物性エキス、漢方薬、抗コリン薬、及びアミノ酸製剤からなる群力選択される 1以上の有効成分を含む前立腺肥大症治療及び Z 又は予防剤と、請求の範囲 1一 4のいずれか 1項記載の治療及び Z又は予防剤との組合せからなる医薬。

[6] アンギオテンシン Π受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩、又はそのプロドラッグを有効成分とする、前立腺正常細胞の増殖阻害剤。

[7] 前記前立腺正常細胞が、間質細胞及び Z又は上皮細胞である、請求の範囲 6記載の増殖阻害剤。

[8] アンギオテンシン Π受容体拮抗作用を有する化合物、薬学的に許容されうるその塩、又はそのプロドラッグを有効成分とする、前立腺正常細胞における MAPKリン酸ィ匕阻害剤。前記前立腺正常細胞が、間質細胞及び Z又は上皮細胞である、請求の範囲 8記載の MAPKリン酸化阻害剤。

前記 MAPKリン酸化が、アンギオテンシン IIある、は成長因子又はサイト力インによるものである、請求の範囲 8又は 9記載の MAPKリン酸ィヒ阻害剤。