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WO2005085439A1 - 蛋白質核内移行検出用プローブとそれを用いた蛋白質核内移行の検出・定量方法 - Google Patents

蛋白質核内移行検出用プローブとそれを用いた蛋白質核内移行の検出・定量方法 Download PDF

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WO2005085439A1
WO2005085439A1 PCT/JP2005/004591 JP2005004591W WO2005085439A1 WO 2005085439 A1 WO2005085439 A1 WO 2005085439A1 JP 2005004591 W JP2005004591 W JP 2005004591W WO 2005085439 A1 WO2005085439 A1 WO 2005085439A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
probe
protein
nuclear
nucleus
terminal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2005/004591
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yoshio Umezawa
Takeaki Ozawa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
Japan Science and Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science and Technology Agency filed Critical Japan Science and Technology Agency
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Priority to EP05720845A priority patent/EP1731603B1/en
Priority to CA2559299A priority patent/CA2559299C/en
Priority to JP2006510829A priority patent/JP4628355B2/ja
Publication of WO2005085439A1 publication Critical patent/WO2005085439A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US12/656,138 priority patent/US20100221719A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5035—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on sub-cellular localization
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

Definitions

  • the invention of this application relates to a probe pair for detecting and quantifying nuclear translocation of a protein caused by the action of a biologically active substance. More specifically, the invention of this application relates to a probe pair for accurately detecting and quantifying the nuclear translocation of a protein induced by the action of a biologically active substance, and the detection and quantification of the protein nuclear translocation using the probe pair. And a method for screening for a substance that induces or inhibits the nuclear import of a protein.
  • Complex signaling networks in eukaryotic cells are controlled by compartmentalization of various proteins.
  • the regulation of the degree and specificity of gene expression is closely related to the nuclear transport of proteins in response to stimuli from inside and outside the cell.
  • Such nuclear cytoplasmic transport is controlled by post-translational modification of proteins such as ligando receptor binding, protein phosphorylation, and protein hydrolysis.
  • Non-patent Documents 1 to 4 a screening method that can detect nuclear cytoplasmic transport at high speed is established, the discovery of substances with antitumor activity and the realization of substance toxicity testing methods It is expected that new knowledge on the mechanism of nuclear plasma transfer will be obtained (Non-patent Documents 1 to 4).
  • Trip Patent Document 5 As a technique for monitoring protein dynamics in a single living cell, generally, a method using Imnoassay and a method using a genetically labeled green fluorescent protein (GFP) are known (Trip Patent Document 5). These methods are effective in spatially and temporally imaging the dynamics of a target protein in a single cell. However, it takes a long time to confirm and quantify the intracellular localization under a microscope, and to image the dynamics in living organisms, it is necessary to use complicated techniques such as extraction and sectioning of organelles. There was a problem that a procedure was required.
  • Non-Patent Document 1 Kau, T.. & Silver, P.A. Drug Discov. Today
  • Non-Patent Document 2 Kau, T.R. et al. Nat. Rev. Cancer 4, 1-12
  • Non-Patent Document 3 Rudin, M. & Weissleder, R. Nat. Rev. Drug Discov.
  • Non-Patent Document 4 Gray, L.E., Jr. et al. Toxicology 181-
  • Non-Patent Document 5 Elion, EA Methods Enzymol. 351, 607-
  • Non-Patent Document 6 Singh, S. M. et al. Curr. Med. Chem. 7, 211-247
  • Non-Patent Document 7 Lorenz,. W. et al. Pro Natl. Acad. Sci. USA
  • Non-Patent Document 8 Mathews, J. C. et al. Biochemistry 16, 85-91
  • Non-Patent Document 9 Paulmurugan, R. & Gambhir, SS Anal. Chem. 75,
  • Non-Patent Document 10 Kaihara, A. et al. Anal. Ce. 75, 4176-4181 (2003)
  • Non-patent literature Bhaumik, S. & Gambhir, S. S. Proc. Natl. Acad.
  • Non-Patent Document 12 Sun, L. et al. Appl. Environ. Microbiol. 67,
  • Non-Patent Document 13 Wu, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,
  • Non-Patent Document 14 Yang, J. et al. Proc, Natl. Acad. Sci. USA 100,
  • Non-Patent Document 15 Giriat, I. & Muir, T.W.J. Am. Chem. Soc. 125,
  • Non-Patent Document 16 Chin, HG. Et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
  • Non-Patent Document 17 Ozawa, T. et al. Anal. Chem. 73, 5866-5874
  • Non-Patent Document 18 Ozawa, T. et al. Anal. Chem. 73, 2516-2521
  • Non-Patent Document 19 Ozawa, T. et al. Nat. Biotechnol. 21, 287-293
  • Non-Patent Document 20 Paulmurugan, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Non-Patent Document 2 Massoud, T.F. & Gambliir, S.S.Genes Dev. 17,
  • Non-Patent Document 22 Greer, L.F., 3rd & Szalay, A.A. Luminescence
  • Non-Patent Document 23 Weissleder, R. & Ntziachristos, V. Nat. Med.
  • the invention of this application has been made in view of the circumstances described above, and solves the problems of the prior art, and performs the transfer of protein into the nucleus by endogenous and exogenous substances to living cells and living cells. It is an object of the present invention to provide a simple and accurate method for local detection of a living individual.
  • the invention of this application solves the above-mentioned problems.
  • the polypeptide at the C-terminal side of the int ein divided into two and the labeling protein divided into two parts The protein whose nuclear translocation is to be detected and quantified is linked to the N-terminal or C-terminal side of the [inte in-labeled protein-C] fusion structure in which the polypeptides at the C-terminal side of the N-terminal are linked in order.
  • Probe pair a probe pair.
  • the invention of this application is based on the fact that at least the N-terminal polypeptide obtained by dividing the labeled protein into two and the N-terminal polypeptide obtained by dividing the inte in two are sequentially linked.
  • a probe I consisting of the protein whose nuclear translocation is to be detected and quantified, and at least 2 inteins [Inte in-CZ labeled protein-C] fusion in which the remaining C-terminal polypeptide from the split and the remaining C-terminal polypeptide from the split of the labeled protein into two are sequentially linked
  • a probe pair for detecting nuclear translocation of a protein comprising a probe II having a nuclear localization signal linked to the N-terminal side or the C-terminal side of the structure.
  • the invention of the present application relates to a probe pair for detecting protein nuclear translocation in which intein is DnaE derived from cyanobacteria, and fourth, a protein nuclear translocation detecting method in which the labeled protein is luciferase.
  • a probe pair a probe pair for detecting and quantifying the nuclear translocation of a protein induced by the action of a biologically active substance, wherein the method comprises the steps of: To provide a method for detecting and quantifying protein nuclear translocation characterized by coexisting a biologically active substance in the cytoplasm, localizing probe II in the nucleus, and measuring the signal of the labeled protein in the nucleus. .
  • the invention of this application is to introduce a polynucleotide expressing any one of the above-mentioned probe pairs into cells, thereby allowing probe I and a bioactive substance to coexist in the cytoplasm, and allowing probe II to be introduced into the nucleus.
  • a method for detecting and quantifying the nuclear transport of a protein into a cell is described.
  • a polynucleotide expressing any one of the above-mentioned probe pairs is introduced into a cell, and a non-human animal totipotent cell generates a coagulate.
  • the present invention provides a method for detecting and quantifying protein nuclear translocation in which probe I and a biologically active substance coexist in the cytoplasm in all cells of the animal or its progeny, and probe II is localized in the nucleus.
  • the invention of this application is a method for screening a substance that induces nuclear translocation of a protein, comprising introducing probe I in any one of the above probe pairs into the cytoplasm, A method of screening a protein nuclear transduction-inducing substance, which comprises localizing II in the nucleus, introducing a nuclear transduction-inducing substance into the cytoplasm, and measuring a signal of a labeled protein in the nucleus. .
  • the invention of this application is a method for screening for a substance that inhibits the nuclear translocation of a protein, comprising introducing probe I in any one of the probe pairs into the cytoplasm, After localizing probe II in the nucleus and introducing a candidate substance for inhibiting nuclear translocation into the cytoplasm, further introducing a substance that induces protein nuclear translocation into the cytoplasm and measuring the signal of the labeled protein in the nucleus,
  • a method for screening for a protein nuclear import inhibitor which comprises comparing the signal of a labeled protein when only an internalization inducer is introduced into the cytoplasm.
  • probe I is introduced into a cytoplasm and probe II is localized in a nucleus by introducing a polynucleotide expressing any one of the probe pairs into a cell. And (1) introducing a polynucleotide expressing any one of the probe pairs into cells and ontogenizing a non-human animal totipotent cell. Probes in all cells of the animal or its progeny
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating the configuration and action of a probe pair for detecting protein nuclear transfer according to the invention of the present application.
  • FIG. 2 is a diagram showing a fluorescence microscopic image and a transmission microscopic image of the cells when the pcDRc-AR expression vector is transiently transfected into COS-7 cells.
  • A anti-AR antibody
  • b anti-Flag antibody
  • 1 DHT not added
  • 2 DHT added
  • FIG. 3 is a diagram showing a western blot obtained in an example of the invention of this application.
  • A protein extract of C0S-7 cells; b: cells that co-expressed probe I and II (with DHT); c: cells that co-expressed probe I and II (without DHT))
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the concentration of DHT added into cells and the fluorescence intensity of reconstructed RLuc.
  • FIG. 5 shows the relationship between the concentrations of various endogenous hormones and synthetic chemicals and the fluorescence intensity of reconstructed RLuc.
  • A endogenous hormone
  • b synthetic chemical
  • c protein nuclear export inhibitor
  • FIG. 6 is a CCD image showing protein nuclear translocation in a mouse transplanted with transiently transfected COS-7 cells. (1: no probe; 2: only probe II is expressed; 3: only probe I is expressed; 4: probe I and II are expressed)
  • FIG. 7 is a diagram showing the average of photon values in a mouse transplanted with transiently transfected C0S-7 cells. (1: No probe; 2: Expression of probe II only; 3: Expression of probe I only; 4: Expression of probe I and II)
  • Figure 8 shows the time course of luminescence kinetics after ip injection of coelenterazine into mice transfected with transiently transfected C0S-7 cells (1: no probe; 2: only probe II is expressed; 3: (Expression of probe I only; 4: Expression of probe I and II)
  • FIG. 9 shows CCD images of mice transfected with C0S-7 cells co-transfected with probes I and II after DHT injection without dish T injection.
  • FIG. 10 is a diagram showing the photon values of mice transplanted with COS-7 cells co-transfected with probes I and II after no DHT injection or DHT injection. (Average of 4 animals)
  • FIG. 11 is a CCD image showing the inhibition of protein nuclear transfer by procymidone PCB in mice transplanted with COS-7 cells co-transfected with probes I and II.
  • A control (DMS0 stimulation); b: DHT; c: DHT + procymidone; d: DHT + PCB)
  • FIG. 12 is a graph showing inhibition of protein nuclear transfer by procymidone and PCB in mice transplanted with COS-7 cells co-transfected with probes I and II.
  • A control (DMS0 stimulation); b: DHT; c: DHT + procymidone; d: DHT + PCB)
  • FIG. 13 is a schematic diagram illustrating the configuration and action of a probe pair for protein nuclear import detection (Glucocorticoid receptor as a protein) according to the invention of this application.
  • FIG. 14 is a diagram showing a fluorescence microscope image and a transmission microscope image of the cells obtained by transiently transfecting NIH3T3 cells with the pcDRc-GR expression vector.
  • FIG. 15 shows Cort icos terone, Dexamethasone, Cort isol, Proges terone, Te s tosterone, 2DG, DHT, Mf (RU486), E2
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the concentration and the fluorescence intensity of the reconstructed RLuc.
  • Figure 16 is a CCD image showing the nuclear translocation of proteins in mice transfected with transiently transfected NIH3T3 cells. (1: No probe; 2: Probe I only; 3: Probe I only; 4: Probes I and II)
  • FIG. 17 is a schematic diagram illustrating the configuration and operation of a probe pair for protein nuclear translocation detection (the protein, Sterol Regulatory Element-Binding Protein-2) of the invention of this application.
  • FIG. 18 shows a fluorescence microscopic image and a transmission microscopic image of the cell when the cell was transiently transfected with the pcDRc-SREBP expression vector.
  • A detection of N-teninal protein
  • b detection of SREBP-2
  • arrow 1 state before nuclear translocation (localization);
  • arrows 2 to 4 state after nuclear translocation;
  • + chol in the presence of cholesterol;
  • -chol in the absence of cholesterol
  • FIG. 19 shows the relationship between the concentration of cholesterol (chol) added into cells and the fluorescence intensity of the reconstructed RLuc.
  • FIG. 20 is a schematic diagram illustrating the configuration and action of a probe pair (as a protein, Signal Transducer and Activator of Transcription 3) for detecting protein nuclear translocation according to the invention of this application.
  • FIG. 21 is a diagram showing a fluorescence microscopic image and a transmission microscopic image of a cell when a pcDRc-STAT-3 expression vector is transiently transfected into HEK293 cells.
  • FIG. 22 is an S graph showing the relationship between the 0SM concentration added to the cells and the fluorescence intensity of the reconstructed RLuc. The symbols in the figure indicate the following.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the principle of a probe pair for detecting protein nuclear translocation according to the invention of the present application. That is, the probe pair (1) for detecting protein nuclear translocation according to the invention of the present application comprises at least the C-terminal polypeptide (4c) of inte in (4) and the labeled protein (3) The C-terminal polypeptide (3c) of the two halves of the protein is linked to the [intein-C / labeling protein-C] fusion structure at the N-terminal or C-terminal to the nuclear translocation.
  • Probe I (11), to which the protein (2) to be detected and quantified is linked, and at least the remaining N-terminal polypeptide (3n) of the labeled protein (3), inte in (4) N _ terminal Probe (NZ) with a nuclear localization signal (5) linked to the N-terminal or C-terminal of the [labeled protein-NZinteiii-N] fusion structure in which the polypeptides (4n) are linked in sequence.
  • probe pairs are used by being introduced into cells, where probe I (11) is localized in the cytoplasm and probe II (12) is localized in the nucleus.
  • probe I (11) migrates from the cytoplasm (C) side to the nucleus (N), and probe II (12) ).
  • the two sites (4c, 4n) of intein (4), which were split into two parts, then came into close proximity and folded correctly, resulting in splicing, and the intein (4) from probe I (11) and probe II (12).
  • Is excised, and the two sites (3c, 3n) of the labeled protein (3) are connected by peptide bonds, and the labeled protein (3) is reconstructed.
  • the nuclear translocation of the protein (2) can be detected.
  • the probe I (11) is a tandem fusion protein having the structure of [protein (2) Xintein-C (4c) Z-labeled protein-C (3c)], [intein-C (4c) labeled protein-C (3c) protein] Tandem fusion protein having the structure of white matter (2), tandem fusion protein having the structure of [protein (2) Z-labeled protein-N (3n) / intein-N (4n)], or [sequence protein -N ( 3n) / intein-N (4n) / protein (2)], but such a probe I has not only these sites but also And the like may contain a polypeptide or the like as the linker sequence (7).
  • probe II (12) is composed of a tandem fusion protein having the structure of [labeled protein-N (3n) / intein-N (4n) / nuclear localization signal (5)], [nuclear localization signal ( 5) A sequence fusion protein having the structure of / labeled protein-N (3n) / intein-N (4n), [intein-C (4c) labeled protein-C (3c) Z nuclear localization signal (5 )] Or a tandem fusion protein having the structure of [nuclear localization signal (5) / intein-C (4c) / labeled protein-C (3c)].
  • a polypeptide or the like may be contained as a linker sequence (7) between each site or the like.
  • the protein (2) contained in the probe I (11) is not particularly limited as long as it is one that wants to detect and quantify nuclear localization.
  • An example is the well-known nuclear hormone receptor, androgen receptor Yuichi (AR). It is known that AR is translocated from the cytoplasm to the nucleus by binding to 5 ⁇ -dihydrotestosterone (DHT) (Non-Patent Document 6).
  • diaryl carboxylate receptor (AhR) is known to be translocated to the nucleus by dioxin
  • thyroid hormone is capable of translocated to the nucleus S known thyroid hormone receptor (ThR)
  • ThR thyroid hormone receptor
  • sterol responsive element known as a cholesterol sensor
  • SREBP binding protein
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • NFB nuclear factor- ⁇
  • the probe II (12) is intended to be localized in the nucleus (N), and its structure and sequence are not particularly limited. Specifically, one having SEQ ID NO: 1 is exemplified. Of course, in addition to these, those derived from Nucleoplasmin (SEQ ID NO: 2) and those derived from HIV-1 Rev
  • NLS nuclear localization sequence
  • the probe for nuclear localization detection of the invention of this application (1) is divided into two portions, each of which is a C-terminal polypeptide (3c) and an N-terminal polypeptide
  • the labeling protein (3) used as probe (3n) in probe I (11) and probe II (12) is directly bound to the peptide by splicing of iiite in (4), reconstructed, and analyzed. Anything can be used.
  • a fluorescent protein or luminescence catalyst oxygen is preferably applied. Fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP) are preferred because they emit light when ligated and can be analyzed visually.
  • GFP green fluorescent protein
  • a luminescent catalytic enzyme such as luciferase is also preferable because it is linked to form an active center and emits light that can be easily detected by a luminometer.
  • Renilla luciferase is particularly preferred because it has a small molecular weight of 36-kDa and does not require ATP or post-translational modification for activation (Non-Patent Documents 7 and 8).
  • the N- and C-termini of the split RLuc do not show fluorescence individually, and in order to combine and regain activity, a method of dividing the active center into two should be used. Good. Specifically, it has been reported that a cutting force between G229 and K230 is preferable (Non Patent Literature 9, 10).
  • RLuc can be said to be preferable because the intestinal luciferin (coelenterazine), which is a substrate of RLuc, penetrates the cell membrane and generates sufficient intensity of fluorescence for in vivo visualization (Non-Patent Document 11).
  • the probe pair (1) for detecting nuclear translocation of the invention of the present application the probe I (11) is divided into two parts, each as a C-terminal polypeptide (4c) and an N-terminal polypeptide (4n).
  • probe II (12)
  • Known inteins (4) derived from various organisms can be applied.
  • the protein (2) in probe I (11) interacts with the nuclear transport inducer (6), and probe I (11) migrates into the nucleus (E) and approaches probe II (12).
  • inte in (4) is preferably a site-specific endonuclease.
  • DnaE derived from blue-green algae is easy to handle because the DNA sequence of s train PCC6803 is clear and it is a natural split inte.
  • probe I (11) and probe II (12) are required for effective intein (4) splicing.
  • the two sites involved in protein splicing must be correctly folded and aligned. Therefore, as the intein, those derived from living organisms may be used as they are, but splicing may be performed by converting or deleting some amino acid residues, or introducing an appropriate linker sequence. Anything that is designed to be easy to occur may be used.
  • probe pair (1) for detecting protein nuclear translocation for example, one of the two polypeptides of intein (4) (for example, C-terminal side: 4c) is divided into two. N-terminal side or C-terminal side of the [intein-C (4c) Z-labeled protein-C (3c)] fusion structure linked to one polypeptide of the labeled protein (3) (in this case, 3c) Then, a protein (2) whose nuclear translocation is to be detected and quantified is linked to construct probe I (11).
  • the nuclear localization signal (5), the probes (11, 12), etc. may be linked by any method. For example, commonly used chemical, biochemical or genetic engineering techniques can be applied.
  • the invention of this application provides a method for detecting and quantifying the nuclear translocation of the protein (2) using the probe (1) for detecting protein nuclear translocation as described above. Specifically, probe I (11) in the above probe pair (1) coexists with the bioactive substance (6) in the cytoplasm (C), and probe II (12) localizes in the nucleus (N). Then, the signal of the labeled protein (3) in the nucleus (N) is measured.
  • probe I (11) stays in the cytoplasm (C), and probe II (12) stays in the nucleus (N) due to the presence of the nuclear localization signal (5).
  • the protein (2) recognizes and binds to the biologically active substance (6), and the probe I (11) moves from the cytoplasm (C) to the nucleus (N).
  • the probe I (11) and the probe I I (12) come close to each other, the inte in (4) in these two is cut out by splicing, and the labeled protein (3) is reconstructed. Therefore, the labeled protein
  • a probe I (11) and a bioactive substance (6) are allowed to coexist in the cytoplasm (C),
  • a polynucleotide expressing the probe pair (1) can be introduced into cells.
  • a polynucleotide expressing the probe pair (1) is introduced into cells, and the totipotent cells of the non-human animal are ontogenously generated, whereby probe I (11) is used in all cells of this animal or its progeny.
  • Biologically active substances (6) can coexist in the cytoplasm, and probe II (12) can be localized in the nucleus (N).
  • the invention of this application further provides a method for screening for a substance that induces nuclear import of protein (2). That is, the probe I (11) in any of the probe pairs (1) is introduced into the cytoplasm (C), the probe II (12) is localized in the nucleus (N), and the candidate for inducing nuclear translocation is obtained. The substance (6 ') is allowed to coexist in the cytoplasm (C), and then the signal of the labeled protein in the nucleus (N) is measured, whereby the substance that induces nuclear translocation can be screened.
  • probe I (11) When the candidate for induction of nuclear translocation (6 ') interacts with the protein (2) in probe I (11) and induces nuclear translocation of this protein (2), probe I (11) becomes cytoplasmic. It moves from (C) to the nucleus (N), and comes close to the probe II (12) localized in the nucleus (N). As a result, one polypeptide (eg, C-terminal side: 4c) of the inte int split into two and the other polypeptide (4n) come into close proximity, splicing occurs, and then the two-split labeled protein (3c And 3n) are peptide-bonded to reconstruct the labeled protein (3). Therefore, by measuring the signal of the labeled protein (3), it is possible to confirm whether or not nuclear translocation has occurred, and it is possible to determine the substance that has translocated to the nucleus as a substance that induces nuclear translocation.
  • polypeptide eg, C-terminal side: 4c
  • the probe I (11) is introduced into the cytoplasm (C), and the probe II (12) is localized in the nucleus (N).
  • a method of introducing a polynucleotide expressing pair (1) into cells is applied.
  • Probe pair (1) Is introduced into cells and the totipotent cells of the non-human animal are ontogenized, probe I (11) is introduced into the cytoplasm of all cells of this animal or its progeny, and probe II ( 12) can be localized in the nucleus (N).
  • the invention of this application provides a method for screening a protein nuclear transport inhibitor. That is, the probe I (11) in any of the probe pairs (1) is introduced into the cytoplasm (C), and the probe II (12) is localized in the nucleus (N).
  • the candidate inhibitor (6 ") is introduced into the cytoplasm (C).
  • the protein nuclear translocation inducer (6) is introduced into the cytoplasm, and the signal of the labeled protein in the nucleus (N) is measured. By comparing this with the signal of the labeled protein when only the protein nuclear transport inducer (6) is introduced into the cytoplasm (C), the nuclear transport inhibitor can be screened.
  • the candidate for nuclear transport inhibition (6 ′ ′) inhibits the binding of protein (2) to protein nuclear transporter (6) in probe I (11)
  • the signal intensity of labeled protein (3) is Decreased in the presence of the candidate for nuclear import (6 ''), compared to the absence of the candidate for nuclear import (6 '') (that is, when only the nuclear inducer (6) is present). Therefore, a substance that decreases the signal of the labeled protein (3) can be determined as a nuclear transport inhibitor.
  • the peptide encoding SEQ ID NO: 4 was shown at the C-terminus of the cDNA encoding the N-terminal domain of RLuc (RLuc-N; 1-229 AA) and SEQ ID NO: 5 at the N-terminus.
  • FLAG epitope DYKDDDDK
  • the cDNA encoding the modified RLuc-N was fused to the cDNA encoding the N-terminal domain of DnaE (DnaE-N; 1-123 AA) through a native HindIII site.
  • the cDNA encoding the C-terminal domain of DnaE-N was fused to the cDNA of a nuclear localization signal (SEQ ID NO: 1; NLS; (DPKKKRKV) 3) via the Ncol site.
  • the peptide (FNLSH) of SEQ ID NO: 6 and a unique enzyme site Muni were added to the N-terminus of the cDNA (RLuc-C; 230-311 AA) encoding the C-terminal domain of RLuc.
  • a linker of SEQ ID NO: 7 (GGGGSG) and a unique enzyme site Notl were introduced at the termini.
  • a unique enzyme site at the N-terminus and Xhol at the C-terminus, of the cDNA encoding AR (1-918 AA) was introduced by PCR.
  • the cDNA encoding this modified RLuc-C is fused to the cDNA encoding the C-terminal fragment of DnaE (DnaE-C; 1-36 AA) at the Muni site, and to the cDNA encoding the full-length AR at the Notl site. Fused.
  • the fidelity of the PCR product was measured using the BigDye Terminator Cycle Seaning It was confirmed by sequence analysis using the kit and the gene analyzer ABI Prism310 (PE Biosystems).
  • C0S-7 cells were cultured in MEM supplemented with 10 steroid-free fetal calf serum (charcoal-extracted FBS) and 1% penicillin Z streptomycin at 5 C02, 37.
  • the above plasmid I was transfected using lipoiectAMIIiE2000 (Invitrogen).
  • pcRDn-NLS or pcDRc_AR was transfected into COS-7 cells and incubated for 24 hours. Wash cells once in PBS and add 200 I 1 lysis buffer (1% sodium dodecyl sulfate, 10% glycerin, 10% 2-mercaptoethanol, 0.001% bromophenol blue, 50 mM Tris-HCK pH 6-8). Equal amounts of the samples were electrophoresed in a 6% acrylamide gel, transferred onto a nitrocellulose membrane, and blotted with a mouse anti-AR antibody (Santa Cruz). The blots were visualized by Incubatere and Chemiluminescence (New England Biolabs) in the presence of an alkaline phosphatase-conjugated secondary antibody.
  • I 1 lysis buffer 1% sodium dodecyl sulfate, 10% glycerin, 10% 2-mercaptoethanol, 0.001% bromophenol blue, 50 mM Tris-HCK pH 6-8. Equal amounts of the
  • COS-7 cells were cultured directly on glass microscope slides (2X105 cells / slide) and transfected with the constructed plasmid. Transfected cells were fixed with a 3% paraformaldehyde solution. After pro- and zoking the cells with 0.2% fish skin gelatin, the cells were incubated in the presence of mouse anti-AR antibody (Santa Cruz) or mouse anti-FLAG antibody (Sigma). In addition, cells were incubated with Cy-5-conjugated secondary antibody and recorded using a confocal laser scanning microscope (LSM510; Carl Zeiss) equipped with a 647 M force-off filter and a 665 am LP. did.
  • LSM510 Carl Zeiss
  • COS-7 cells were transfected with the plasmid and incubated for 12 hours. The culture solution was replaced with DMEM supplemented with 10% FBS, and 24 hours later, steroid hormones or synthetic chemicals were added to each well.
  • C0S-7 cells were incubated for 2 hours, the cells were collected, and the luciferase activity was measured by a luminometer (Minilumat LB9506; Berthold GmbH) using a Renilla luciferase assay kit (Pro ega) (integration time: approx. Second).
  • the plasmids pcRDn-NLS and pcDRc-AR constructed in the above (1) were transfected individually or co-transfected into COS-7 cells. After transfection, the cells were incubated in dish EM with 10EM FBS for 12 hours and cells were collected. The cells were suspended in PBS and aliquots containing 1 ⁇ 10 6 cells were transferred to four different sites on the back of anesthetized BALB / c nude mice (female, 5 weeks old, weighing about 17 g) .
  • COS-7 cells (1 ⁇ 10 6 cells) were directly injected into the backs of two groups of nude mice.
  • the first mouse group of the two groups was injected ip with 100 1 of 1.0% (vol / vol) DMS0 (vehicle).
  • the second group was injected with 100 l of DHT (100 ig / kg body weight).
  • COS-7 cells (1 ⁇ 10 5 cells) transfected with both the above-mentioned plasmids pcRDn-NLS and pcDRc-AR were used in nude mice at a depth of 3 marauds through a dragon's incision hole. Transplanted into forebrain. Immediately after transplantation, the first and second groups of mice were injected ip with 100 l of 1.OS! DMSO. 3rd The fourth mouse group was injected ip with 100 UI of procymidone and PCB (10 mg / kg body weight) dissolved in 1.0% DMSO, respectively.
  • pcDRc-AR was added to COS-7 cells.
  • the expression vector was transfected transiently.
  • DHT-induced probe I nuclear translocation was performed using an in vitro cell assay. Migration was measured.
  • COS-7 cells were transfected with both pcRDii-NLS and pcDRc-AR or pcRDn-NLS alone, and various concentrations of DHT were added to each well. The cells were collected, and the lysate was mixed with a coelenterazine solution.
  • Fluorescence measurement confirmed that the fluorescence intensity increased with increasing DHT concentration.
  • the fluorescence intensity was at a level that was sufficiently distinguishable from the background fluorescence (Fig. 4).
  • procymidone was shown to inhibit DHT-induced strong fluorescence (Figure 5c), indicating that binding of AR to procymidone did not induce nuclear translocation of AR.
  • the mouse image observed by the cooled CCD showed a significant fluorescent signal only at the cell injection site containing the pcRDn-NLS and pcDRc-AR constructs ( Figures 6 to 8).
  • the fluorescence intensity of the two co-transfected cells was more than 20 times higher than that of the cells transfected with either pcRDn-NLS or pcDRc-AR alone. It was confirmed that biofluorescence due to RLuc reconstruction could be detected with high accuracy inside the dermis layer.
  • DMS0 solvent
  • DHT 100 tg / kg body weight
  • Cells transfected with pcRDn-NLS and pcDRc-AR at the same time are injected into the mouse brain at a depth of 3 mm.10-7 M DHT alone in 1.0% DMS0, or procymidone or PCB at various concentrations. And various hormone mixtures were injected intraperitoneally (ip).
  • the photon counts obtained from the brain were significantly increased (gf11, 12) compared to the photon counts of the DMS0-treated control, indicating that DHT induced nuclear translocation of AR by DHT. was suggested.
  • plasmid pcDRc-AR used in Examples 1 to 6 was cut with restriction enzymes Notl and Xhol to remove the cDNA encoding AR.
  • a cDNA encoding glucocorticoid receptor (GR) was ligated to Notl and Xhol site to this plasmid to construct a plasmid (Fig. 13).
  • the same experiment as in the case of AR was performed using the prepared plasmid.
  • the peptide encoding SEQ ID NO: 8 was added to the C-terminal of the cDNA (RLuc-N; 1-229 AA) encoding the N-terminal domain of RLuc, and the C-terminal of RLuc.
  • the peptide encoding SEQ ID NO: 9 was introduced into the N-terminal of the cDNA encoding the flanking domain (RLuc-C; 230-311 AA).
  • NIH3T3 cells were transfected with the pcDRc-GR expression vector to confirm that the DNA linked to the C-terminal domain of Rluc and DnaE was correctly localized in the intracellular organs of animal cells.
  • probe I was mainly present in the cytoplasm (upper row of Fig. 14, "Corti-” in the figure).
  • corticosterone was added, it was confirmed that probe I translocated to the nucleus (second stage in Fig. 14, "Corti +" in the figure).
  • corticosterone-induced nuclear translocation of pro I was measured using an in vitro cell assay.
  • NIH3T3 cells were transfected with both pcRDn-NLS and pcDRc-GR, and various concentrations of corticosterone were added to each well. The cells were collected and the lysate was mixed with a coelenterazine solution.
  • the luminescence intensity increased as the corticosterone concentration increased. It was confirmed that the degree increased. The emission intensity was sufficiently distinguishable from the fluorescence of the packed ground.
  • GR nuclear translocation in a mouse individual can be observed using the probe of the invention of this application.
  • NIH3T3 cells transfected with PcRDn-NLS and pcDRc-GR at the same time were injected into the dermis inside the back of living mice (Fig. 16). After 12 hours, the mice were allowed to swim in a water bath for 10 minutes and were stressed. One hour later, coelenterazine was administered, and the luminescence intensity was measured using a CCD camera.
  • the stressed mice (“swiimiiig (+)” in the figure) were stronger than the non-stressed mice (rswimming (-) j in the figure).
  • the emission intensity could be observed.
  • the plasmid pcDRc-AR used in Examples 1 to 6 was digested with restriction enzymes Notl and Xhol to remove the cDNA encoding AR.
  • a cDNA encoding SREBP-2 was ligated to Notl and Xhol site to this plasmid to construct a plasmid (Fig. 17). This plasmid was designated as pcDRc-SREBP.
  • the peptide encoding SEQ ID NO: 4 was added to the C-terminal of cDNA (RLuc-N; 1-229 AA) encoding the N-terminal domain of RLuc.
  • the peptide encoding SEQ ID NO: 9 was introduced into the N-terminal of the cDNA (RLuc-C; 230-311 AA) encoding the C-terminal domain of RLuc.
  • Luminescence measurements confirmed that luminescence intensity increased with decreasing cholesterol concentration (Figure 19). In addition, the emission intensity was sufficiently distinguishable from the background fluorescence. From the above, it was found that the degree of SREBP-2 translocation into the nucleus can be detected using the luminescence intensity as an index.
  • the plasmid pcDRc-AR used in Examples 1 to 6 was digested with restriction enzymes Notl and Xhol to remove the cDNA encoding AR.
  • a plasmid encoding STAT-3 was ligated to Notl and Xhol site to construct the plasmid (FIG. 20). This plus The mid was used as pcDRc-STAT3, which was used.
  • HEK293 cells were transfected with both pcRDn-NLS and pcDRc-STAT3, and various concentrations of 0SM were added to each well. The cells were collected, and the lysate was mixed with a coelenterazine solution.
  • Luminescence measurements confirmed that the luminescence intensity increased with increasing 0SM concentration ( Figure 22). The emission intensity was sufficiently distinguishable from the background fluorescence. From the above, it was confirmed that the degree of STAT-3 nuclear translocation can be quantitatively detected using the luminescence intensity as an index.
  • the present invention provides a method capable of noninvasively imaging the nuclear translocation of a protein in a living cell or an organism.
  • the present invention also provides a method for simply quantifying the degree of protein nuclear translocation.
  • the detection and quantification method of protein nuclear translocation using the probe pair of the invention of this application is different from the conventional fluorescence technology, and since it does not have a background signal due to the bioluminescence method, it has high accuracy and high sensitivity. Detection is possible. Therefore, for drug development and drug discovery, such as treatment and identification of toxic chemicals, It is expected to be applied to processes.
  • the probe pair for detecting protein nuclear translocation comprises at least a C-terminal polypeptide obtained by dividing intein into two and a C-terminal polypeptide obtained by dividing the labeled protein into two. Are linked in sequence to the [inte in-C Z-labeled protein-C] fusion structure at the N-terminal side or C-terminal side of the fusion structure.
  • the remaining N-terminal polypeptide of the protein split into two parts and the remaining N-terminal polypeptide of the inte in two parts were sequentially linked [labeled protein-NZ inte in- N It consists of a probe II with a nuclear localization signal linked to the N-terminal or C-terminal end of the fusion structure.
  • the probe pair for detecting protein nuclear translocation comprises at least a _-terminal polypeptide obtained by dividing the labeled protein into two and an intein obtained by dividing the intein into two.
  • the N-terminal polypeptide is linked in one jet.
  • the protein whose nuclear translocation is to be detected and quantified is linked to the N-terminal or C-terminal of the [labeled protein-NZ inte in-N] fusion structure.
  • Probe I and at least the remaining C-terminal: ⁇ peptide of the inte in bisecting, and the remaining C-terminal polypeptide of the bisecting the labeled protein.
  • Probe II in which a nuclear localization signal is connected to the N-terminal side or the C-terminal side of the [inte in-CZ-labeled protein-C] fusion structure linked in order.
  • probe I remains in the cytoplasm, and probe II is localized in the nucleus.
  • Probe I When the protein recognizes and binds to the biologically active substance and translocates from the cytoplasm to the nucleus by its action, Probe I comes into proximity with Probe II, which is localized in the nucleus. As a result, the iaJe in split into two in the probes I and II is cut out by splicing, and the labeled protein is reconstructed. Therefore, by measuring the signal of the labeled protein, it becomes possible to detect the nuclear translocation of the protein by the biologically active substance with high accuracy.
  • inte in is indigo. Since it is DnaE derived from algae, intein can be reliably cut out automatically.
  • the labeled protein is luciferase
  • a luminescent catalytic enzyme splicing occurs between probes I and II, and luciferase is reconstructed.
  • active centers are formed and emit light that is easily detectable with a luminometer.
  • the probe I and the biologically active substance in the probe pair are allowed to coexist in the cytoplasm, the probe II is localized in the nucleus, and the labeled protein is detected in the nucleus. Measure the signal.
  • the probe I stays in the cytoplasm, but when the protein recognizes and binds to the bioactive substance, it moves from the cytoplasm to the nucleus by its action. Then, the probe I comes close to the probe I I localized in the nucleus, the two inte in the probes I and II are cut out by splicing, and the labeled protein is reconstructed.
  • the signal of the labeled protein is measured, it is possible to detect the translocation of the protein into the nucleus by the biologically active substance with high accuracy and precision. In addition, it becomes possible to quantify the amount of protein translocated into the nucleus.
  • the probe I and the biologically active substance coexist in the cytoplasm by introducing a polynucleotide expressing the probe pair into the cell, and the probe II Can be localized.
  • the method further comprises introducing a polynucleotide expressing the probe pair into a cell, and ontogenizing a non-human animal totipotent cell, thereby obtaining the animal or its progeny.
  • Probe I and a bioactive substance can coexist in the cytoplasm in all animal cells, and probe II can be localized in the nucleus.
  • probe I in a probe pair is introduced into the cytoplasm, and probe II is localized in the nucleus.
  • the candidate substance for inducing nuclear translocation is introduced into the cytoplasm, and the signal of the labeled protein that is localized in the nucleus is measured.
  • probe I comes into proximity with the localized probe II and is divided by 20% in probes I and II.
  • the intein is cut out by splicing, and the labeled protein is reconstructed. Therefore, if the signal of the labeled protein is measured, whether or not the candidate substance acts as a protein nuclear transport inducer can be screened at high speed and with high accuracy.
  • the probe I in the probe pair is introduced into the cytoplasm, the probe II is localized in the nucleus, and the nuclear transport inhibitor candidate substance is expressed in the cytoplasm.
  • the protein nuclear transduction-inducing substance is introduced into the cytoplasm, and the signal of the labeled protein in the nucleus is measured.
  • the candidate substance acts as a nuclear transport inhibitor, the candidate substance first binds to the protein.
  • the protein nuclear inducer cannot bind to the protein, and nuclear transport is inhibited.
  • the signal of the labeled protein is reduced as compared to the signal of the labeled protein when only the protein nuclear transport inducer is introduced into the cytoplasm.
  • the candidate substance does not act as a nuclear translocation inhibitor, the candidate substance does not bind to the protein, and thus, when the protein nuclear translocation inducer is introduced into the cytoplasm, binding to the protein occurs, Moves into the nucleus. Therefore, the signal of the labeled protein is equivalent to the signal of the labeled protein when only the protein nuclear transport inducer is introduced into the cytoplasm.
  • a polynucleotide expressing the probe pair is introduced into a cell, the probe I is introduced into the cytoplasm, and D probe II can be localized in the nucleus
  • a polynucleotide representing a probe pair is introduced into cells, and the totipotent cells of a non-human animal are ontogenously generated.
  • probe I can be introduced into the cytoplasm, and probe II can be localized in the nucleus.

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Abstract

少なくとも、inteinを2分割したうちのC-末端側のポリペプチドと、標識蛋白を2分割したうちのC-末端側のポリペプチドが順に連結された[intein-C/標識蛋白-C]融合構造のN-末端側またはC-末端側に、核内移行を検出・定量したい蛋白質が連結されてなるプローブIと、少なくとも、標識蛋白を2分割したうちの残りのN-末端側のポリペプチドと、inteinを2分割したうちの残りのN-末端側のポリペプチドが順に連結された[標識蛋白-N/intein-N]融合構造のN-末端側またはC-末端側に、核局在化シグナルが連結されてなるプローブIIからなることを特徴とする蛋白質核内移行検出用プローブ対を用い、内在性および外来性の物資による蛋白質核内移行を、生細胞や生物個体の局所で検出するための簡便で精度高い方法とする。

Description

明 細 書 蛋白質核内移行検出用プローブと それを用いた蛋白質核内移行の検出 ·定量方法 技術分野
この出願の発明は、 生物活性物質の作用により生じる蛋白質の核内移 行を検出、 定量するためのプローブ対に関するものである。 さらに詳し くは、 この出願の発明は、 生物活性物質の作用により誘発される蛋白質 の核内移行を精度高く検出、 定量するためのプローブ対と、 それを用い た蛋白質核内移行の検出 ·定量方法、 並びに蛋白質の核内移行を誘発ま たは阻害する物質をスクリーニングするための方法に関するものであ る。 背景技術
真核細胞における複雑なシグナル伝達ネットワークは、様々な蛋白質 の区画化により制御されている。 また、 遺伝子発現の度合いや特異性の 制御には、細胞内外からの刺激に対する応答としての蛋白質の核原形質 輸送が深く関わっている。 そして、 このような核原形質輸送は、 リガン ドーレセプター結合、 蛋白質リン酸化、 蛋白質加水分解などの蛋白質の 翻訳後修飾により制御されている。
一方、腫瘍細胞内ではしばしば核蛋白質が誤った場所に局在化するこ とが明らかになつており、蛋白質を正しい区画に再輸送させる小分子が 盛んに検討されている。 同様の誤った蛋白質局在化は、 特定の外来性化 学物質に曝された細胞においても見られることから、 これらの物質が生 物に与える影響が懸念される。
そこで、核原形質輸送を高速で検出できるスクリーニング方法が確立 されれば、 抗腫瘍活性を有する物質の発見や、 物質毒性試験方法の実現 につながり、 さらに、 核原形質輸送のメカニズムに関する新たな知見が 得られると期待される （非特許文献 1〜4)。
単一生細胞内において蛋白質の動態をモニタリングする技術として は、 一般に、 ィムノアッセィによる方法や、 遺伝子的に標識された緑色 蛍光蛋白質 （GFP) を使用する方法が知られている （穽特許文献 5)。 こ れらの方法は、 単一細胞内における対象蛋白質の動態を、 空間的および 時間的に画像化する上では効果的である。 しかし、 顕微鏡下で細胞内局 在を確認し、 定量するためには長時間を要し、 さらに、 生物内での動態 を画像化するためには、 オルガネラの抽出や切片化等の煩雑なアツセィ 手順を要するという問題があった。
非特許文献 1 ： Kau, T. . & Silver, P. A. Drug Discov. Today
8， 78-85 (200 3).
非特許文献 2 ： Kau, T. R. et al. Nat. Rev. Cancer 4, 1-12
(2004).
非特許文献 3 ： Rudin, M. &Weissleder， R. Nat. Rev. Drug Discov.
2， 123-13 1 (2003).
非特許文献 4 ： Gray, L. E. , Jr. et al. Toxicology 181-
182， 371-382 (2002).
非特許文献 5 ： El ion, E. A. Methods Enzymol. 351, 607-
622 (2002).
非特許文献 6 ： Singh, S. M. et al. Curr. Med. Chem. 7, 211-247
(2000).
非特許文献 7 ： Lorenz, . W. et al. Pro Natl. Acad. Sci. USA
88, 4438-4442 (1991).
非特許文献 8 ： Mathews, J. C. et al. Biochemistry 16， 85-91
(1977).
非特許文献 9 ： Paulmurugan, R. &Gambhir, S. S. Anal. Chem. 75,
1584-1589 (2003). 非特許文献 1 0 ： Kaihara, A. et al. Anal. C ei. 75, 4176-4181 (2003)
非特許文献 ： Bhaumik, S. &Gambhir, S. S. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 99， 377-382 (2002).
非特許文献 1 2 ： Sun, L. et al. Appl. Environ. Microbiol. 67,
1025-1029 (2001).
非特許文献 1 3 ： Wu, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,
9226-9231 (1998).
非特許文献 14： Yang, J. et al. Proc, Natl. Acad. Sci. USA 100,
3513-3518 (2003).
非特許文献 1 5 ： Giriat, I. &Muir, T. W. J. Am. Chem. Soc. 125,
7180-7181 (2003).
非特許文献 1 6 ： Chin, H. G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
100, 4510-4515 (2003).
非特許文献 1 7 ： Ozawa, T. et al. Anal. Chem. 73, 5866-5874
(2001).
非特許文献 1 8 ： Ozawa, T. et al. Anal. Chem. 73, 2516-2521
(2001).
非特許文献 1 9 ： Ozawa, T. et al. Nat. Biotechnol. 21, 287-293
(2003).
非特許文献 2 0 ： Paulmurugan, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 99, 15608-15613 (2002).
非特許文献 2 ： Massoud, T. F. &Gambliir, S. S. Genes Dev. 17,
545-580. (2003).
非特許文献 2 2 ： Greer, L. F. , 3rd&Szalay, A. A. Luminescence
17, 43-74 (2002).
非特許文献 23 ： Weissleder, R. & Ntziachristos, V. Nat. Med.
9， 123-128 (2003). 発明の開示
そこで、 この出願の発明は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたも のであり、 従来技術の問題点を解消し、 内在性および外来性の物質によ る蛋白質核内移行を、 生細胞や生物個体の局所で検出するための簡便で 精度高い方法を提供することを課題としている。
この出願の発明は、 上記の課題を解決するものとして、 第 1には、 少 なくとも、 int e inを 2分割したうちの C一末端側のポリペプチドと、標 識蛋白を 2分割したうちの C一末端側のポリペプチドが順に連結され た [inte in- 標識蛋白- C]融合構造の N—末端側または C—末端側に、 核内移行を検出 ·定量したい蛋白質が連結されてなるプローブ I と、 少 なくとも、標識蛋白を 2分割したうちの残りの N—末端側のポリべプチ ドと、 inteinを 2分割したうちの残りの N—末端側のポリぺプチドが順 に連結された [標識蛋白- NZ intein- N] 融合構造の N—末端側または C —末端側に、 核局在化シグナルが連結されてなるプローブ I I からなる ことを特徴とする蛋白質核内移行検出用プローブ対を提供する。 また、 この出願の発明は、 第 2には、 少なくとも、 標識蛋白を 2分割したうち の N—末端側のポリペプチドと、 inte inを 2分割したうちの N—末端側 のポリペプチドが順に連結された [標識蛋白 - NZ intein- N] 融合構造の N—末端側または C一末端側に、 核内移行を検出 ·定量したい蛋白質が 連結されてなるプロ一ブ I と、少なくとも、 inteinを 2分割したうちの 残りの C—末端側のポリペプチドと、 標識蛋白を 2分割したうちの残り の C—末端佴 ίίのポリぺプチドが順に連結された [ inte in-CZ標識蛋白 - C] 融合構造の N—末端側または C一末端側に、 核局在化シグナルが連 結されてなるプローブ II からなることを特徴とする蛋白質核内移行検 出用プローブ対を提供する。
この出願の発明は、 第 3には、 inte inが藍藻由来の DnaEである蛋白 質核内移行検出用プローブ対を、 また、 第 4には、 標識蛋白がルシフエ ラーゼである蛋白質核内移行検出用プローブ対を提供する。 さらに、 この出願の発明は、 第 5には、 生物活性物質の作用によって 誘発される蛋白質の核内移行を検出、 定量するための方法であって、 前 記いずれかのプローブ対におけるプローブ I と生物活性物質を細胞質 中で共存させ、 プローブ I I を核内に局在化させ、 核内における標識蛋 白のシグナ レを測定することを特徵とする蛋白質核内移行検出 ·定量方 法を提供する。
この出願の発明は、 第 6には、 前記いずれかのプローブ対を発現する ポリヌクレオチドを細胞内に導入することにより、 プローブ Iと生物活 性物質を細胞質中で共存させ、 プローブ I I を核内に局在化させる蛋白 質核内移行検出 ·定量方法を、 第 7には、 前記いずれかのプローブ対を 発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を 痼体発生することにより、 この動物またはその子孫動物の全細胞におい てプローブ I と生物活性物質を細胞質中で共存させ、 プローブ I I を核 内に局在化させる蛋白質核内移行検出 ·定量方法を提供する。
さらに、 この出願の発明は、 第 8には、 蛋白質の核内移行を誘発する 物質をスクリーニングするための方法であって、前記いずれかのプロ一 ブ対におけるプローブ Iを細胞質に導入し、 プローブ I I を核内に局在 化させ、核内移行誘発候補物質を細胞質に導入して核内における標識蛋 白のシグナルを測定することを特徵とする蛋白質核内移行誘発物質の スクリーニング方法を提供する。
この出願の発明は、 また、 第 9には、 蛋白質の核内移行を阻害する物 質をスクリ一ニングするための方法であって、 前記いずれかのプローブ 対におけるプローブ Iを細胞質に導入し、 プローブ I I を核内に局在化 させ、 核内移行阻害候補物質を細胞質に導入した後、 さらに蛋白質核内 移行誘発物質を細胞質に導入して核内における標識蛋白のシグナルを 測定し、蛋白質核内移行誘発物質のみを細胞質に導入した場合の標識蛋 白のシグナルと比較することを特徵とする蛋白質核内移行阻害物質の スクリーニング方法を提供する。 この出願の発明は、 第 1 0には、 前記いずれかのプローブ対を発現す るポリヌクレオチドを細胞内に導入することにより、 プローブ Iを細胞 質に導入し、 プローブ I I を核内に局在化させる前記のスクリーニング 方法を、 そして、 第 1 1には、 前記いずれかのプローブ対を発現するポ リヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生す ることにより、 この動物またはその子孫動物の全細胞においてプローブ
Iを細胞質に導入し、 プローブ I I を核内に局在化させる前記のスクリ 一二ング方法をも提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 この出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対の構成お よび作用を例示した概略模式図である。
図 2は、 COS- 7細胞に pcDRc- AR発現べクタ一を過渡的に形質移入した 際の細胞の蛍光顕微鏡像および透過顕微鏡像を示す図である。 （a ：抗 AR抗体； b ：抗 Flag抗体； 1 ： DHT未添加； 2 ： DHT添加）
図 3は、 この出願の発明の実施例において得られたウエスタンブロッ トを示した図である。 （a ： C0S-7細胞の蛋白質抽出物； b ：プロ一ブ I および I Iを同時発現させた細胞 （DHT添加） ； c ：プローブ Iおよび I I を同時発現させた細胞 （DHT未添加））
図 4は、 細胞内に添加された DHT濃度と再構築された RLucによる蛍 光強度の関係を示した図である。
図 5は、各種の内在性ホルモンおよび合成化学物質の濃度と再構築さ れた RLucによる蛍光強度の関係を示した図である。 （a ：内在性ホルモ ン； b ：合成化学物質； c ：蛋白質核内移行阻害剤）
図 6は、過渡的に形質移入された COS- 7細胞を移植されたマウス体内 における蛋白質核内移行を示す CCD画像である。 （ 1 ： プローブなし ； 2 ： プローブ II のみ発現； 3 ： プローブ Iのみ発現； 4 ： プローブ I および IIを発現） 図 7は、過渡的に形質移入された C0S-7細胞を移植されたマウス体内 におけるフォトン値の平均を示した図である。 （1 ：プロ一ブなし； 2 ： プローブ II のみ発現 ； 3 ： プローブ Iのみ発現； 4 ： プローブ Iおよ ぴ I Iを発現）
図 8は、過渡的に形質移入された C0S-7細胞を移植されたマウスにセ レンテラジンを i. p.注射した後の発光動態の経時変化（1 ：プローブな し； 2 ：プローブ I I のみ発現； 3 ： プローブ Iのみ発現； 4 ： プロ一 ブ Iおよび I Iを発現）
図 9は、 プローブ I および I I を同時形質移入された C0S-7細胞を移 植されたマウスの皿 T未注射おょぴ DHT注射後の CCD画像を示した図で ある。
図 1 0は、 プローブ Iおよび I I を同時形質移入された COS- 7細胞を 移植されたマウスの DHT未注射おょぴ DHT注射後のフォトン値を示した 図である。 （4匹の平均値）
図 1 1は、 プローブ Iおよび II を同時形質移入された COS- 7細胞を 移植されたマウスにおけるプロシミドンおょぴ PCBによる蛋白質核内移 行阻害を表す CCD画像である。 （a ：対照 （DMS0刺激） ； b ： DHT； c ： DHT + プロシミドン ； d ： DHT + PCB)
図 1 2は、 プローブ Iおよび I I を同時形質移入された COS- 7細胞を 移植されたマウスにおけるプロシミドンおよび PCBによる蛋白質核内移 行阻害を表すグラフである。 （a ：対照 （DMS0刺激）； b ： DHT； c ： DHT + プロシミドン； d ： DHT + PCB)
図 1 3は、 この出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対 （蛋白 質として、 Glucocort icoid receptor) の構成および作用を例示した概 略模式図である。
図 1 4は、 NIH3T3細胞に pcDRc- GR発現ベクターを過渡的に形質移入 した際の細胞の蛍光顕微鏡像および透過顕微鏡像を示す図である。
( a ：抗 GR抗体； b ：抗 Flag抗体； Cort i-： cort icos t erone未添力 13； Cort ii： cort icosterone添加）
図 1 5は、 細胞内に添加された Cort icos terone、 Dexamethasone, Cort isol, Proges terone, Te s tosterone, 2DG、 DHT、 Mf (RU486) , E2お ょぴ C- terminal only (cort i)それぞれの濃度と、 再構築された RLucに よる蛍光強度の関係を示した図である。
図 1 6は、 過渡的に形質移入された NIH3T3細胞を移植されたマウス 体内における蛋白質核内移佇を示す CCD画像である。 （ 1 ： プローブな し； 2 ： プローブ I I のみ発現； 3 ： プローブ Iのみ発現； 4 ： プロ一 ブ Iおよび IIを発現）
図 1 7は、 この出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対 （蛋白 質として、 Sterol Regulatory Element-Binding Prote in- 2) の構成お よび作用を例示した概略模式図である。
図 1 8は、細胞に pcDRc-SREBP発現ベクターを過渡的に形質移入した 際の細胞の蛍光顕微鏡像および透過顕微鏡像を示す図である。 （a ： N-teninal prote inの検出； b ： SREBP-2の検出；矢印 1 ：核移行前（局 在） の状態；矢印 2から 4 ： 核移行後の状態； +chol ： コレステロール 存在下； -chol： コレステロール非存在下）
図 1 9は、 細胞内に添加されたコレステロール濃度 （chol) と、 再構 築された RLucによる蛍光強度の関係を示した図である。
図 2 0は、 この出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対 （蛋白 質として、 Signal Transduce r and Act ivator of Transcript ion 3) の 構成および作用を例示した概略模式図である。
図 2 1は、 HEK293細胞に pcDRc-STAT- 3発現ベクターを過渡的に形質 移入した際の細胞の蛍光顕微鏡像および透過顕微鏡像を示す図である。
( a ：抗 Flag抗体； b ：抗 STAT抗体； 0SM-： 0SM未添加； 0SM+： 0SM 添加）
図 2 2は、 細胞内に添加された 0SM濃度と、 再構築された RLucによ る蛍光強度の関係を示した Sである。 なお、 図中の符号は次のものを示す。
1 蛋白質核内移行検出用プローブ対
11 プローブ I
12 プローブ II
2 蛋白質
3 標識蛋白
3c 標識蛋白の C一末端側のポリペプチド
3n 標識蛋白の N—末端側のポリペプチド
4 intein
4c inteinの C一末端個 Iのポリペプチド
4n inteinの N—末端 のポリペプチド
5 核局在化シグナル
6 生物活性物質、 蛋白質核内移行誘発物質
6' 核内移行誘発候補物質
6" 核内移行阻害候補物質
7 リンカ一
8 核膜 発明を実施するための最良の形態
図 1にこの出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対の原理を 表す概略摸式図を示した。 すなわち、 この出願の発明の蛋白質核内移行 検出用プローブ対 （1) は、 少なくとも、 inte in (4) を 2分割したうち の C—末端側のポリペプチド （4c) と、 標識蛋白 （3) を 2分割したう ちの C—末端側のポリペプチド （3c) が順に連結された [ intein- C/標 識蛋白- C] 融合構造の N—末端側または C一末端側に、 核内移行を検 出 ·定量したい蛋白質 （2) が連結されてなるプローブ I ( 11) と、 少 なくとも、 標識蛋白 （3) を 2分割したうちの残りの N—末端側のポリ ペプチド （3n) と、 inte in (4) を 2分割したうちの残りの N _末端側 のポリペプチド （4n) が順に連結された [標識蛋白- NZinteiii-N] 融合 構造の N—末端側または C一末端側に、 核局在化シグナル （5) が連結 されてなるプローブ II (12) からなるもの、 もしくは、 少なくとも、 標 識蛋白 （3) を 2分割したうちの N—末端側のポリペプチド （3ιι) と、 intein (4) を 2分割したうちの N—末端側のポリペプチド （4n) が順 に連結された [標識蛋白 - NZintein-N]融合構造の N—末端側または C 一末端側に、 核内移行を検出 ·定量したい蛋白質 （2) が連結されてな るプローブ I (11) と、 少なくとも、 intein (4) を 2分割したうちの 残りの C一末端側のポリペプチド （4c) と、 標識蛋白 （3) を 2分割し たうちの残りの C—末端側のポリペプチド （3c) が順に連結された
[intein-C/標識蛋白- C] 融合構造の N—末端側または C一末端側に、 核局在化シグナル （5) が連結されてなるプローブ II (12) からなるも のである。
これらのプローブ対は、 細胞内に導入されて使用されるが、 そのとき プローブ I (11)は細胞質に、 プローブ II (12)は核内に局在化される。 プローブ I (11) における蛋白質 （2) が核内移行誘発物質 （6) と結合 した場合、 プローブ I (11) は、 細胞質 （C)側から核内 （N)へ移行し、 プローブ II (12) と近接する。 すると 2分割された intein (4) の二つ の部位 （4c、 4n) が接近して正しく折りたたまれ、 これにより、 スプラ イシングが起こり、プローブ I (11)およびプローブ II (12)から intein (4)が切り出され、 2分割された標識蛋白 （3) の二つの部位 （3c、 3n) がペプチド結合により連結され、 標識蛋白 （3) が再構築される。
一方、 プローブ I (11) における蛋白質 （2) が核内移行誘発物質 （6) と結合しない場合には、 intein (4) のスプライシングが起こらないた め、 標識蛋白 （3) は再構築されない。
したがって、 この標識蛋白 （3) のシグナルを測定することにより、 蛋白質 （2) の核内移行を検出することができる。
以上のとおりの蛋白質核内移行検出用プローブ対において、 プローブ I (11) は、 [蛋白質 （2) Xintein-C (4c) Z標識蛋白- C (3c)] の構 成を有する直列融合蛋白質、 [intein - C (4c) 標識蛋白- C (3c) 蛋 白質 （2)] の構成を有する直列融合蛋白質、 [蛋白質 （2) Z標識蛋白 - N (3n) /intein-N (4n)] の構成を有する直列融合蛋白質、 または [標 識蛋白- N (3n) /intein-N (4n) /蛋白質 （2)] の構成を有する直列融 合蛋白質のいずれかであるが、 このようなプローブ Iには、 これらの部 位以外にも、 各部位の間等にリンカ一配列 （7) としてポリペプチド等 が含まれていてもよい。
同様に、 プローブ II (12) は、 [標識蛋白- N (3n) /intein-N (4n) /核局在化シグナル (5)] の構成を有する直列融合蛋白質、 [核局在化 シグナル （5) /標識蛋白- N (3n) /intein-N (4n)] の構成を有する直 列融合蛋白質、 [intein- C (4c) 標識蛋白- C (3c) Z核局在化シグナ ル （5)] の構成を有する直列融合蛋白質、 または、 [核局在化シグナル (5) /intein-C (4c) /標識蛋白- C (3c)] の構成を有する直列融合蛋 白質のいずれかであるが、 これらの部位以外にも、 各部位の間等に、 リ ンカ一配列 （7) としてポリペプチド等を含んでいてもよい。
この出願の発明の核内移行検出用プローブ対 （1) において、 プロ一 ブ I (11) に含まれる蛋白質 （2) は、 核内移行を検出 ·定量したいも のであればよく、 とくに限定されない。 例えば、 よく知られた核ホルモ ン受容体であるアンドロゲンレセプ夕一 （AR) が例示される。 ARは 5 α -ジヒドロテストステロン （DHT) に結合することにより細胞質から核内 へ移行することが知られている （非特許文献 6)。 また、 ダイォキシン により核内移行することが知られるァリル炭化水素受容体 （AhR)、 甲状 腺ホルモンにより核内移行すること力 S知られる甲状腺ホルモン受容体 (ThR)、 コレステロールセンサーとして知られる sterol responsive element binding protein (SREBP)、 細胞増殖シグナルに関与する mitogen - activated protein kinase (MAPK)、 アポ l—シスを誘導する nuclear factor- κΒ (NF B) 等も例示される。 一方、 この出願の発明の核内移行検出用プローブ対 （1) において、 プローブ II ( 12)に含まれる核局在化シグナル（5)は、プローブ I I ( 12) が細胞内に導入された際に、 プローブ I I ( 12) が核内 （N) に局在化さ れるようにするためのものであり、その構造や配列はとくに限定されな い。 具体的には、 配列番号 1のものが例示される。 もちろん、 これ以外 にも、 Nucleoplasmin由来のもの （配列番号 2 )、 HIV-1 Rev由来のもの
(配列番号 3 ) 等の公知の核局在化配列 （NLS) が適用できる。
この出願の発明の核内移行検出用プローブ対 （1) において 2分割さ れて各々 C一末端側のポリペプチド （3c )、 N—末端側のポリペプチド
(3n) としてプローブ I ( 11) およびプローブ II ( 12) で使用される標 識蛋白 （3) は、 iiite in (4) のスプライシングにより直接ペプチド結合 し、 再構築されて解析可能となるものであれば、 どのようなものであつ てもよい。 例えば、 蛍光蛋白や発光触媒酸素が好ましく適用される。 緑 色蛍光蛋白 （GFP) などの蛍光蛋白は、 連結されたとき発光し、 可視的 に解析でき、 好ましい。 また、 ルシフェラーゼ等の発光触媒酵素も連結 されて活性中心を形成し、ルミノメーターで容易に検出可能な光を発す るため好ましい。 とくに、 レニラルシフェラーゼ （RLuc) は、 分子量が 36-kDaと小さく、活性化に ATPや翻訳後修飾が不要であることから、好 ましい（非特許文献 7、 8 )。分割された RLucの N—および C—末端が、 夫々個々では蛍光を示さず、結合して再び活性を取り戻すようにするた めには、 活性中心を 2つに分割するような分け方をするとよい。 具体的 には、 G229と K230の間で切断すること力 s好ましいことが報告されてい る（非特許文献 9、 1 0 )。また RLucの基質である腔腸ルシフェリン（セ レンテラジン） が細胞膜を透過し、 in v ivoでの可視化に十分な強度の 蛍光を生じることからも、 RLucが好ましいといえる（非特許文献 1 1 )。 さらに、 この出願の発明の核内移行検出用プローブ対（1) において、 2分割されて各々 C一末端側のポリペプチド （4c)、 N—末端側のポリ ペプチド （4n) としてプローブ I ( 11) およびプローブ I I ( 12) で使用 される intein (4) としては、 種々の生物由来の公知のものが適用でき る。 プローブ I ( 11) における蛋白質 （2) と核内移行誘発物質 （6) が 相互作用し、 プローブ I ( 11) が核内 （E) に移行してプローブ II ( 12) と近接することにより inte in (4) が自動的に切り出されるためには、 inte in (4)は、部位特異的エンドヌクレアーゼであることが好ましい。 具体的には、 酵母 VMA由来の inteinや藍藻由来の DnaE inte inが好ま しく例示される。 中でも藍藻由来の DnaEは、 s train PCC6803の DNA配 列が明らかになつている上、天然の分割 inte inであるため、扱い易い。
(非特許文献 1 2〜 2 0 )
さらに、 この出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対 （1) に おいて、 intein (4) のスプライシングが有効に起こるためには、 プロ ーブ I ( 11) とプローブ II (12) が核内で近接した際に、 プロテインス プライシングに関与する二つの部位が正しく折り畳まれ、 かつ、 正確に 並べられなければならない。 したがって、 int e inとしては、 生物由来の ものをそのまま用いてもよいが、 一部のアミノ酸残基を変換したり、 削 除したり、 適当なリンカ一配列を導入したりして、 スプライシングが起 こりやすいように設計されたものを使用してもよい。
この出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対 （1) では、 例え ば、 2分割された intein (4) の一方のポリペプチド （例えば、 C一末 端側： 4c) が、 2分割された標識蛋白 （3) の一方のポリペプチド （こ の場合、 3c) に連結された [ intein-C (4c) Z標識蛋白- C (3c) ] 融合 構造の N—末端側または C一末端側に、 核内移行を検出 ·定量したい蛋 白質 （2) が連結されてプローブ I ( 11〉 を構成する。
また、 プローブ Iで使用されなかった標譏蛋白 （3) のもう一方のポ リペプチド （前記の例では、 3n) が、 プローブ Iで使用されなかった inte in (4) のもう一方のポリペプチド （この場合、 N—末端側： 4n) に順に連結された [標識蛋白- N (3n) / inte in- N (4n) ] 融合構造の N 一末端側または C一末端側に、 核局在化シグナル （5) が連結されてプ ローブ I I ( 12) を構成する。
このような蛋白質核内移行検出用プローブ対 （1) において、 inte in - C
(4c) と標識蛋白- C (3c) や [intein-C (4c) Z標識蛋白- C (3c) ] 融 合構造と蛋白質、 標識蛋白- N (3n) と intein - N (4n) や [標識蛋白 - N
(3n) / intein-N (4n)] 融合構造と核局在化シグナル （5) は、 蛋白質
(2)、 核局在化シグナル (5)、 各プローブ （11、 12) 等の作用に影響を 及ぼさなければ、 どのような方法で連結されたものであってもよい。 例 えば、 通常用いられる化学的、 生物化学的、 あるいは、 遺伝子工学的手 法が適用できる。
この出願の発明では、以上のとおりの蛋白質核内移行検出用プローブ 対 （1) を用いて蛋白質 （2) の核内移行を検出 ·定量する方法が提供さ れる。 具体的には、 前記のプローブ対 （1) におけるプローブ I ( 11) を細胞質中 （C) で生物活性物質 （6) と共存させ、 プローブ I I ( 12) を 核内 （N) に局在化させ、 核内 （N) における標識蛋白 （3) のシグナ ルを測定する。
このような蛋白質核内移行の検出 ·定量方法では、 プローブ I ( 11) は細胞質 （C) に留まり、 プローブ II ( 12) は核局在化シグナル （5) の 存在により核内 （N) に局在化するが、 蛋白質 （2) が生物活性物質 （6) を認識、 結合することによりプローブ I ( 11) が細胞質 （C) から核内 (N) へ移行する。 すると、 プローブ I ( 11) とプローブ I I ( 12) が近 接し、 これらにおける 2分割された inte in (4) がスプライシングによ り切り出されて標識蛋白 （3) が再構築される。 したがって、 標識蛋白
(3) のシグナルを測定すれば、 生物活性物質 （6) による蛋白質 （2) の核内移行を精度高く検出することが可能となる。 また、 予め標識蛋白
(3) の濃度と標識蛋白 （3) のシグナル強度の関係から検量線を求めれ ば、 蛋白質 （2) の核内移行量を定量することも可能となる。
この出願の発明の蛋白質核内移行の検出 ·定量方法において、 プロ一 ブ I ( 11) と生物活性物質 （6) を細胞質 （C) 中で共存させ、 プローブ I I ( 12) を核内 （N) に局在化させるためには、 プローブ対 （1) を発現 するポリヌクレオチドを細胞内に導入することができる。 あるいは、 プ ローブ対 （1) を発現するポリ クレオチドを細胞内に導入し、 非ヒ ト動物全能性細胞を個体発生することにより、 この動物またはその子孫 動物の全細胞においてプローブ I ( 11) と生物活 '性物質 （6) を細胞質 中で共存させ、 プローブ I I ( 12) を核内 （N) に局在化させることもで きる。
この出願の発明では、 さらに、 蛋白質 （2) の核内移行を誘発する物 質をスクリーニングするための方法も提供される。 すなわち、 前記いず れかのプローブ対 （1) におけるプローブ I ( 11) を細胞質 （C) に導入 し、 プローブ I I ( 12) を核内 （N) に局在化させ、 核内移行誘発候補物 質 （6' ) を細胞質 （C) に共存させ、 その後、 核内 （N) における標識蛋 白質のシグナルを測定することにより核内移行誘発物質をスクリー二 ングできる。
核内移行誘発候補物質 （6' ) がプローブ I ( 11) における蛋白質 （2) と相互作用し、 この蛋白質 （2) の核内移行が誘発されるとき、 プロ一 ブ I ( 11) が細胞質 （C) から核内 （N) へ移行し、 核内 （N) に局在化 されたプローブ I I ( 12) と近接する。 これにより 2分割された inte in の一方のポリペプチド （例えば、 C—末端側： 4c) ともう一方のポリべ プチド (4n) が近接し、 スプライシングが起こり、 次いで 2分割された 標識蛋白 （3cおよび 3n) がペプチド結合して標識蛋白 （3) が再構築さ れる。 したがって、 この標識蛋白 （3) のシグナルを測定すれば、 核内 移行が起こったか否かを確認でき、核内移行を起こした物質を核内移行 誘発物質として判定することが可能となる。
この出願の発明の核内移行誘発物質のスクリーニング方法において、 プローブ I ( 11) を細胞質 （C) に導入し、 プローブ I I ( 12) を核内 （N) に局在化させるためには、 プローブ対 （1) を発現するポリヌクレオチ ドを細胞内に導入する方法が適用される。 あるい ½：、 プローブ対 （1) を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 非ヒト動物全能性細 胞を個体発生すれば、 この動物またはその子孫動物の全細胞においてプ ローブ I ( 11) を細胞質に導入し、 プローブ I I ( 12) を核内 （N) に局 在化させることができる。
さらに、 この出願の発明では、 蛋白質核内移行阻害物質をスクリー二 ングする方法が提供される。 すなわち、 前記いずれかのプローブ対 （1) におけるプローブ I ( 11) を細胞質 （C) に導入し、 プロ一ブ I I ( 12) を核内 （N) に局在化させ、 まず、 核内移行阻害候補物質 (6" ) を細胞 質 （C) に導入する。 その後、 蛋白質核内移行誘発物質 （6) を細胞質 に導入して核内 （N) における標識蛋白のシグナルを測定し、 その結果 を、 蛋白質核内移行誘発物質 （6) のみを細胞質 （C) に導入した場合の 標識蛋白のシグナルと比較することにより核内移行阻害物質をスクリ —ニングできる。
核内移行阻害候補物質 （6' ' ) がプローブ I ( 11) における蛋白質 （2) と蛋白質核内移行誘発物質 （6) の結合を阻害する場合、 標識蛋白 （3) のシグナル強度は、 核内移行阻害候補物質 （6' ' ) 存在 で、 核内移行 阻害候補物質 （6' ' ) 非存在下 （すなわち核内移行誘発物質 （6) のみ存 在時） に比べて減少する。 したがって、 このように、 標識蛋白 （3) の シグナルを減少させる物質を核内移行阻害物質として判定することが でさる。
このような核内移行阻害物質のスクリーニング方法においても、 プロ ーブ I ( 11) を細胞質 （C) に導入し、 プローブ I I ( 12) を核内 （N) に 局在化させるためには、 プローブ対 （1) を発現するポリヌクレオチド を細胞内に導入する方法が適用される。 あるいは、 プローブ対 （1) を 発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を 個体発生すれば、 この動物またはその子孫動物の全細胞においてプロ一 ブ I ( 11) を細胞質に導入し、 プローブ I I ( 12) を核内 (N) に局在化 させることができる。 以下、 添付した図面に沿って実施例を示し、 この発明の実施の形態に ついてさらに詳しく説明する。 もちろん、 この発明は以下の例に限定さ れるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言う までもない。 実施例
〔手順〕
( 1 ) プラスミドの構築
PCR により、 RLuc の N—末端側ドメインをエンコー ドする cDNA (RLuc- N； 1〜229 AA) の C—末端に配列番号 4のペプチド （KFAEYC) を、 また N—末端に配列番号 5に示される FLAGェピトープ （DYKDDDDK) を導入した。 さらに、 修飾 RLuc-Nをエンコードする cDNAを、 未変性の Hindl ll サイトにより、 DnaE の N—末端側ドメインをエンコードする cDNA (DnaE-N； 1〜123 AA) に融合した。 そして、 DnaE-Nの C一末端側 ドメインをエンコードする cDNAを、 Ncolサイトにより、 核局在シグナ ル （配列番号 1 ： NLS； (DPKKKRKV) 3) の cDNAに融合した。
PCR により、 RLuc の C一末端側ドメインをェンコ一ドする cDNA (RLuc- C； 230〜311 AA) の N—末端に配列番号 6のペプチド （FNLSH) とユニークな酵素部位 Muni を、 また C—末端に配列番号 7のリンカー (GGGGSG) とユニークな酵素部位 Not lを導入した。
さらに、 PCRにより、 ARをエンコードする cDNA ( 1〜918 AA) の N— 末端にユニークな酵素部位である Not lを、 C—末端に Xholを導入した。 この修飾 RLuc- Cをエンコードする cDNAは、 Muni部位により DnaEの C —末端側断片をエンコードする cDNA (DnaE-C ; 1〜36 AA)に融合し、 Not l 部位により全長 ARをエンコードする cDNAに融合した。
これらは、発現ベクター pcDNA 3. 1 (+) (Invi t rogen)の醇素部位 BamHI および Xhol部位にサブクロ一ニングされた。
なお、 PCR生成物の忠実度は、 BigDye Terminator Cyc l e Seauenc ing kit ならびに遺伝子分析機 ABI Prism310 (PE Biosystems) を用 たシ 一ケンス解析により確認した。
(2) 細胞培養と形質移人
C0S-7細胞の培養は、 10 ステロイド除去ゥシ胎児血清（木炭抽出 FBS) と 1 %ペニシリン Zストレプトマイシンを添加した MEM中、 5 C02、 37 での条件下で行った。
細胞を 12ゥエルの培養プレート上に播種した後、 lipoiectAMIIiE2000 (Invitrogen)を用いて、 記のプラスミド I の形質移入を行った。
(3) ウエスタンブロッ卜分析
pcRDn-NLSまたは pcDRc_ARを COS- 7細胞に形質移入し、 24時間ィン キュベ一トした。細胞を PBS中で 1回洗浄し、 200 I 1の溶解緩衝液（1 % ドデシル硫酸ナトリウム、 10 ¾グリセリン、 10 % 2-メルカプトェタノ ール、 0.001 %ブロモフエノールブルー、 50 mM Tris-HCK pH 6- 8) 中 で可溶化した。 等量の試 を 6 %アクリルアミドゲル中で電気泳動し、 ニトロセルロース膜上に 写した後、 マウス抗 AR抗体 （Santa Cruz) でブロット処理した。ブロ ットはアルカリホスファターゼ結合二次抗体 存在下でィンキュベートレ、ケミルミネッセンス（New England Bi olabs) により可視化した。
(4) 免疫細胞化学手法
C0S-7細胞の培養は、 顕微鏡ガラススライド上で直接行い （2X105細 胞 /スライド）、 構築されたプラスミ ドにより形質移入を行った。 形質 移入された細胞は、 3 %パラホルムアルデヒド溶液で固定した。 細胞を 0.2%魚皮ゼラチンでプロ、ゾキングした後、マウス抗 AR抗体（Santa Cruz) またはマウス抗 FLAG抗体 （Sigma) 存在下でインキュベートし fe:。 さ らに、 細胞を Cy- 5-複合化二次抗体によりインキュベートし、 647 M力 ットオフフィル夕と 665 am LP.フィル夕を装着した共焦点レーザース キャン顕微鏡 （LSM510 ; Carl Zeiss) を用いて記録した。
(5) in vitroアツセィ （細胞） プラスミドを用いて COS- 7細胞に形質移入し、 12時間ィンキュベート した。 培養液を 10%FBS添加 DMEMに置換し、 その 24時間後に各ゥエル にステロイドホルモンまたは合成化学物質を添加した。
さらに、 C0S-7細胞を 2時間インキュベートし、 細胞を収集して、 ル シフェラ一ゼ活性を、 Renilla luciferase assay kit (Pro ega) によ り、 ルミノメータ （Minilumat LB9506； Berthold GmbH) (積分時閎 20 秒） を用いて評価した。
(6) in vivoイメージング （マウス）
前記（ 1 )で構築したプラスミド pcRDn- NLSおよび pcDRc- ARを、 COS- 7 細胞に個別に形質移入、 または同時形質移入した。 形質移入後、 10¾ FBS 添加皿 EM中で 12時間にわたりインキュベートし、 細胞を収集した。 こ の細胞を PBS中に懸濁し、 1X106個細胞を含む分割量を、麻酔した BALB/c ヌードマウス （メス、 5週齢、 体重約 17 g) の背中の異なる 4力所に移 植した。
移植 12時間後、 100 1の DHT (画 g/kg体重）または 1.0¾(vol/vol) DMS0 (溶媒） を腹腔内 （i. p. ) 注射した。 注射の 2時間後、 100/x 1のセ レンテラジン (2.8 mg/kg体重） を i.p.注射し、 2分間隔でマウスのィ メージングを行った。
RLuc活性に対する DHTの影響を調べるため、 2群のヌードマウスの背 中に、 COS- 7細胞 （1X106細胞） を直接注入した。 2群のうち最初のマ ウス群には、 100 1 の 1.0 % (vol/vol) DMS0 (溶媒） を i.p.注射し た。 第 2群には 100 lの DHT (100 ig/kg体重） を注射した。 3時間 後に 100 l のセレンテラジン （1.4 mg/kg体重） を i.p.注射し、 10 分後にマウスのイメージングを行った （ιι=4)。
脳実験のために、 前記のプラスミド pcRDn- NLSおよび pcDRc- ARの両 方を形質移入した COS- 7細胞 （1X105細胞） を、 1龍の穿剌孔から 3匪 の深さでヌードマウスの前脳に移植した。 移植直後、 4群のうち第 1お よび第 2マウス群には、 100 lの 1. O S! DMSOを i.p.注射した。 第 3お よび第 4マウス群には 1.0 % DM SOに溶解した 100 U Iのプロシミドン と PCB (10 mg/kg体重） をそれぞれ i.p.注射した。
注射 1時間後に、第 2および第 3マウス群に 1.0¾ DMS0に溶解した 100 ilの DHT (10 xg/kg体重） を i.p.注射した。 このホルモン刺激の 2 時間後、 10 ti lのセレンテラジン (1.4mg/kg体重） を側脳室内 （i. ） 注射し、 各マウス群の代表 （n=3) を取り、 2分間隔で同時にィメ一ジン グを行った。
なお、全てのマウスイメージングは冷却 CCDカメラ（IVIS100 system, Xenogen) を用いて行った。 マウス内への注入細胞より放出されたフォ トンを収集し、 1分間隔で積算した。 画像処理は LIVING IMAGE software (Xenogen) を用いて行った。 測 J定光を定量するため、 細胞注入領域上 に解析対象領域 （R0I) を描き、 平均発光強度 （フオトン/秒/ cm2) を計 算した。
ぐ実施例 1>
RLucと DnaEの C末端ドメインに連結された AR (すなわち、 プローブ I) が、 哺乳動物細胞内の細胞下区画に正しく局在化されることを確認 するために、 COS- 7細胞に pcDRc— AR発現ベクターを過渡的に形質移入し た。
DHTの非存在下では、 プローブ Iは主として細胞質中に存在していた (図 2 a-1)が、 DHTを添加したところ、 プローブ Iが核へ移行した（図 2 a-2)0一方、核局在化シグナ レ（NLS)を有する RLuc ドメインと DnaE の N末端ドメイン （すなわち、 プローブ II) は、 DHTの存在 *非存在に 関わらず、 核内に局在化していた （図 2 b)。
この結果は、 ウエスタンプロット分析の結果とも一致した （図 3)。 DHT非存在下では、 AR抗体は、 プロ一ブ Iプラスミドとプローブ IIプ ラスミドを含む細胞粗抽出液に: 13いて、 スプライシングされていない前 駆体、 すなわち RLuc-Cと DnaE - Cに連結された 115 kDaの ARという特 定成分だけを認識した。 一方、 DHT存在下では、 AR抗体は、 スプライシングされていない前駆 体とともに、 135kDaと 160kDaのポリペプチド物質を認識した。 なお、 これらの物質の電気泳動移動度は、 スプライシング後の生成物とスプラ イシング中間体の予想分子量にそれぞれ合致していた。
以上の結果から、 DHTが ARに結合することにより核内移行が起こり、 プローブ対におけるスプライシングが起こることが確認された。
ぐ実施例 2 >
次にこの出願の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対を用いて AR の核内移行を定量できることを確認するために、 in vi tro細胞アツセィ を用いて、 DHTが誘発するプローブ Iの核内移行を測定した。
COS- 7細胞に pcRDii- NLS と pcDRc- ARの両方または pcRDn-NLS単独を 形質移入し、 それぞれのゥエルに各種濃度の DHTを添加した。 細胞を収 集し、 その溶解物にセレンテラジン溶液を混合した。
蛍光測定を行ったところ、 DHT濃度の増加に伴い蛍光強度が増大する ことが確認された。 また、 その蛍光強度は、 バックグラウンドの蛍光と 十分区別できるレベルであった （図 4 )。
以上の結果より、 この出願の発明のプローブ対を用いて ARの核内移 行を定量できることが示された。
ぐ実施例 3 >
この出願の発明のプローブ対を用いて、 各種の内在性ホルモンや合成 化学物質による ARの核内移行を確認した。
図 5より、 テストステロンや 19-ノルテストステロンなどの内在性ァ ンドロゲンは、 10—8 Mから 10—5 Mの濃度範囲で大きな蛍光強度を示すこ とが明らかになった。テストステロンと 19 -ノルテストステロンの 10— 6 M 濃度における相対強度は、 それぞれ同濃度の DHTに対する強度の 72%と 6«であった （図 5 a )。 また、 内在性ステロイドホルモンの 17 )8 -エス トラジオールとプロゲステロン、合成ステロイドホルモンの酢酸シプロ テロン （CPA)、 抗アンドロゲン合成化学物質のビンクロゾリンとフル夕 ミドは、 同様に蛍光強度を僅かに増加させた （図 5 b )。 逆にプロシミ ドンは試験対象の濃度範囲では、蛍光強度の特異的増加を全く誘発しな かった。
反対に、 プロシミドンは DHTに誘発される強い蛍光を阻害することが 明らかになった （図 5 c ) ことから、 ARがプロシミドンに結合しても、 ARの核内移行が誘発されないことが示された。
他の試験物質では o， p' -DDTが少量の ARを核内移行させることが明 らかになつたが、 PCB同属種である Aroc l or 1254は、 DHTが誘発する AR の核内移行を阻害することが確認された。
ぐ実施例 4 >
次に、 この出願の発明のプローブ対を用いて、 化合物の動物細胞小器 官における分布を観察できることを確認した。
冷却 CCDカメラを用いた工学的な生物発光イメージング技術は、操作 の容易性、 習得時間の短さ、 複数マウスを一度に同時測定できる等の利 点を有し、高速イメージングを可能とする（非特許文献 3、 2 1〜2 3 )。 生きたマウス内で再構築された RLucの発する蛍光強度が CCDカメラ による検出に足りる十分な強度を有することを確認するため、 100万個 の非形質移入 COS- 7細胞 （参考例）、 pcRDn-NLSまたは pcDRc-ARを過渡 的に形質移入した細胞、 もしくは pcRDn- NLSと pcDRc-ARの両者を同時 形質移入した細胞を、生きたマウスの背面各箇所の真皮内部に注入した。
8〜35 分経過後に冷却 CCD により観察されたマウス画像には、 pcRDn-NLS と pcDRc- AR の作成物を含む細胞注入部位だけに顕著な蛍光 シグナルが現れた （図 6〜8 )。 15分経過時点で 2つを同時に形質移入 した細胞による蛍光強度は、 pcRDn-NLSまたは pcDRc- ARのいずれかを単 独で形質移入した細胞による強度の 20倍を上回ったことから、 生きた マウスの真皮層内部で、 RLucの再構築による生体蛍光が精度高く検出で きることが確認された。
ぐ実施例 5 > そこで、 生きたマウス中での DHT 存性の AR核内移行を観察するた めに、 2 グループの生きたマウスの簿面に、 プラスミド pcRDn-NLS と eDRc-ARの両方を同時に過渡的形質移入した C0S-7細胞を移植し、溶媒 (DMS0) または DHTにより刺激した。
一方のマウス群 4匹には 2時間にわたり 1. 0 % DMS0 (溶媒） による刺 激を行い、もう一方のマウス群 4匹には同じ時間 DHT ( 100 t g/kg体重） による刺激を行った。 DHT刺激による蛍光強度は、 溶媒刺激の場合と比 ベて 3. 5倍増加していた （図 9、 1 0 )。
以上の結果から生きたマウスを対象に、 DHT非存在下に対する DHT存 在下での ARの核内移行度の差を画像 匕し、 定量評価できることが確認 された。
<実施例 6 >
さらにまた、 この出願の発明のプローブ対を用いて、 マウス脳内にお ける ARの核内移行に対する阻害物質の影響を調べた。
pcRDn-NLSと pcDRc- ARを同時に形質移入した細胞をマウス脳内に 3mm の深さで注入し、 1. 0 % DMS0に 10-7 M DHT単独、 またはそれ以外に各 濃度のプロシミ ドンか PCB を加え 各種のホルモン混合液を腹腔内 ( i. p. ) 注入した。
脳より得られるフォトン計数値が、 DMS0処置を行った対照のフォトン 計数値と比較して顕著に増加した （gf 1 1、 1 2 ) ことから、 DHTによ り ARの核内移行が誘発されたことが 唆された。
なお、 3匹のマウスより得たデータ を平均したところ、 生物発光の増 加量は対照の発光強度に比べて大きかつた。 DHTに加えてプロシミドン あるいは PCBを同時に注射すると蛍光強度が減少したことから、 これら が 2時間以内に血液脳関門を通過し、 Rの核内移行を阻害できることが 示唆された。
<実施例 7 >
Glucocort icoid receptor (ダルココルチコィド受容体： GR) の核内 移行検出プローブによる、 核内移行の検討を行った。
プラスミ ドの構築は、 まず、 実施例 1から 6で用いたプラスミ ド pcDRc- ARを制限酵素 Notlと Xholで切断し， ARをコードする cDNAを取 り除いた。 このプラスミドに、 glucocorticoid receptor (GR)をコード する cDNAを Notlと Xholサイトで連結し、 プラスミドを構築した （図 13)。 この作製したプラスミドを用いて、 上記 ARの場合と同様の実験 を行った。
なお、 PCRにより、 RLucの N—末端側ドメインをエンコードする cDNA (RLuc- N; 1〜229 AA) の C一末端には、 配列番号 8のペプチド （KFAEY) を、 また、 RLucの C—末端側ドメインをェンコードする cDNA (RLuc-C； 230〜311 AA).の N—末端には配列番号 9のペプチド （CFNLSH) を導入 した。
(1) GRの局在の確認
Rlucと DnaEの C末端ドメインに連結された が動物細胞内の細胞内 器官に正しく局在していることを確認するために、 NIH3T3 細胞に pcDRc-GR発現べク夕一を遺伝子導入した。
結果、 corticosterone非存在下では、 プローブ Iは主として細胞質中 に存在していた （図 14の上段、 図中の 「Corti -」）。 その一方で、 corticosteroneを添加したところ、プローブ Iが核へ移行したことを確 認できた （図 14の 2段目、 図中の 「Corti+」）。
(2) GRの核内移行の定量
次に、 このプローブを用いて GRの核内移行を定量できることを確認 するために、 in vitro細胞アツセィを用いて、 corticosteroneが誘発 するプロ一: Iの核内移行を測定した。
NIH3T3細胞に pcRDn-NLSと pcDRc-GRの両方を遺伝子導入し、 それぞ れのゥエルに各種濃度の corticosteroneを添加した。 細胞を収集し、 その溶解物にセレンテラジン溶液を混合した。
発光測定を行ったところ、 corticosterone濃度の増加に伴い、発光強 度が増大することが確認された。 また、 その発光強度は、 パックグラウ ンドの蛍光と充分区別可能であった。
この出願の発明のプローブ対を用いて、 合成化学物質による GRの核 内移行を確認した。 図 1 5 に示したとお り、 dexame thasone、 proges terone, Cort isolが GRの核内移行を誘導することがわかった。
( 3 ) マウス個体における GR核内移行
次にこの出願の発明のプローブを用いて、 マウス個体内における GR 核内移行を観察できることを実証した。; PcRDn- NLSと pcDRc- GRを同時に 遺伝子導入した NIH3T3 細胞を、 生きたマウスの背面各所の真皮内部に 注入した （図 1 6 )。 1 2時間後、 マウスを 1 0分間水浴中で泳がせ、 ストレスを与えた。 1時間後セレンテラジンを投与して、 CCDカメラに より発光強度測定を行った。
その結果、 図 1 6に示したとおり、 ストレスを与えたマウス （図中の 「swiimiiig (+)」） からは、 ストレスを与えなかったマウス （図中の rswimming (-) j) に対し、 強い発光強度を観測できた。
以上から生きたストレス刺激によるマウスの生理的 cort icos terone 濃度上昇を、 Rlucの再構成により精度よく検出できることが確認できた。 <実施例 8 >
S terol Regulatory Element-Bind ing Prote in- 2 (SREBP-2) 核内移行 検出プローブによる、 核内移行検出の検討を、 実施例 7と同様の手法に よって行った。
プラスミドの構築は、 実施例 1から 6で用いたプラスミド pcDRc-AR を制限酵素 Not lと Xholで切断し， ARをコードする cDNAを取り除いた。 このプラスミドに、 SREBP-2をコードする cDNAを Not l と Xholサイトで 連結し、プラスミドを構築した（図 1 7 )。このプラスミドを pcDRc- SREBP とした。
なお、 PCRにより、 RLucの N—末端側ドメインをエンコードする cDNA (RLuc-N ; 1〜229 AA)の C一末端には、配列番号 4のペプチド （KFAEYC) を、 また、 RLucの C—末端側ドメインをエンコードする cDNA (RLuc-C； 230〜311 AA) の N -末端には配列番号 9のペプチド （CFNLSH) を導入 した。
(1) SE BP-2の局在の確認
Rlucと DnaEの C末端ドメインに連結された SERBP- 2が、 動物細胞内 の細胞内器官に正しく局在していることを確認するために、 COS - 7細胞 に pcDRc- SREBP発現べク夕一を遺伝子導入した。
結果、 コレステロール存在下 （図 1 8中の 「+cholJ) では、 SREBP- 2 を連結したプローブは主として細胞質中に存在していた （図 1 8の
( 1) )。 一方、 コレステロール非存在下 （図 1 8中の 「- chol」） では、 プローブが核へ移行した （図 1 8の （2) から （4))。
(2) SERBP-2の核内移行の定量
次に、 SERBP-2の核内移行の定量を、実施例 7と同様の手法で行った。 C0S-7細胞に pcRDn-NLSと pcDRc- SREBPの両方を遺伝子導入し， それぞ れのゥエルに各種濃度のコレステロールを添加した。 細胞を収集し、 そ の溶解物にセレンテラジン溶液を混合した。
発光測定を行ったところ、 コレステロール濃度の減少に伴い、 発光強 度が増大することが確認された （図 1 9)。 また、 その発光強度は、 パ ックグラウンドの蛍光と充分区別可能であった。 以上から、 SREBP- 2の 核内移行の程度を、 発光強度を指標に検出できることが分かった。
ぐ実施例 9 >
Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (STAT - 3)核 内移行検出プローブによる、 核内移行検出の検討を、 実施例 7および 8 と同様の手法によって行った。
プラスミドの構築は、 実施例 1から 6で用いたプラスミド pcDRc-AR を制限酵素 Notlと Xholで切断し、 ARをコードする cDNAを取り除いた。 次いで、 このプラスミドに、 STAT - 3をコードする cDNAを Notl と Xhol サイトで連結して、 プラスミドの構築を行った （図 2 0)。 このプラス ミドを pcDRc-STAT3とし、 これを用いた。
( 1 ) STAT- 3の局在の確認
Rlucと DnaEの C末端ドメィンに連結された STAT- 3が動物細胞内の細 胞内器官に正しく局在していることを確認するために、 HEK293 細胞に pcDRc-STAT3発現べクタ一を遺伝子導入した。
結果、リガンドの一つである oncos tat in M (OSM)非存在下では， STAT - 3 を連結したプローブは主として細胞質中に存在していた （図 2 1の
「0SM- J )。 そして、 OSMを添加したところ、 プローブが核へ移行するこ とが確認された （図 2 1の 「0SM+」；)。
( 2 ) STAT- 3の核内移行の定量
次に、 SERBP-2の核内移行の定量を、 実施例 7、 8と同様の手法で行 つた。
HEK293細胞に pcRDn- NLS と pcDRc-STAT3の両方を遺伝子導入し、 そ れぞれのゥエルに各種濃度の 0SMを添加した。 細胞を収集し、 その溶解 物にセレンテラジン溶液を混合した。
発光測定を行ったところ、 0SM濃度の増加に伴い、 発光強度が増大す ることが確認された （図 2 2 )。 また、 その発光強度は、 バックグラウ ンドの蛍光と充分区別可能であった。以上から、 STAT-3核内移行の程度 を、 発光強度を指標に定量的に検出できることが確認できた。 産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、 この発明によって、 生細胞や生物での蛋 白質の核内移行を非侵襲的にイメージングできる方法が提供される。 ま た、 この発明により、 蛋白質核内移行の程度を簡便に定量する方法も提 供される。 この出願の発明のプローブ対を用いた蛋白質核内移行の検 出 -定量方法は、 従来の蛍光技術と異なり、 生物発光法によるためパッ クグラウンドシグナルが無いことから、 高精度 ·高感度での検出が可能 である。 したがって、 治療や毒性化学物質の特定等、 薬品開発や創薬の プロセスへの応用が期待される。
上記第 1の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対は、 少なくとも、 inteinを 2分割したうちの C—末端側のポリぺプチドと、標識蛋白を 2 分割したうちの C一末端側のポリペプチドが順に連結され [inte in-C Z標識蛋白- C] 融合構造の N—末端側または C—末端側に、 核内移行を 検出 ·定量したい蛋白質が連結されてなるプローブ I と、 少なくとも、 標識蛋白を 2分割したうちの残りの N—末端側のポリペ プチドと、 inte in を 2分割したうちの残りの N—末端側のポリペプ ドが順に連 結された [標識蛋白- NZ inte in- N] 融合構造の N—末端側 たは C一末 端側に、 核局在化シグナルが連結されてなるプローブ IIか らなる。
また、同様に、上記第 2の発明の蛋白質核内移行検出用プ n—ブ対は、 少なくとも、標識蛋白を 2分割したうちの Ν _末端側のポ ペプチドと、 intein を 2分割したうちの N—末端側のポリペプチドが 1噴に連結され た [標識蛋白 - NZ inte in-N]融合構造の N—末端側または C一末端側に、 核内移行を検出 ·定量したい蛋白質が連結されてなるブローブ I と、 少 なくとも、 inte inを 2分割したうちの残りの C—末端側の:^リぺプチド と、標識蛋白を 2分割したうちの残りの C一末端側のポリ プチドが順 に連結された [inte in- CZ標識蛋白- C] 融合構造の N—末端側または C 一末端側に、核局在化シグナルが連結されてなるプローブ IIからなる。 これらのプローブ対を細胞に導入した場合、 プローブ I ίま細胞質に留 まり、 プローブ I I は核内に局在化される。 プローブ Iに: ける蛋白質 が生物活性物質を認識、 結合し、 その作用により細胞質から核内へ移行 するとき、 プローブ Iは核内に局在化されたプローブ II と近接する。 これにより、 プローブ Iおよび I Iにおける 2分割された iaJe inがスプ ライシングにより切り出され、 標識蛋白が再構築される。 Lたがって、 標識蛋白のシグナルを測定することにより、生物活性物質 ίこよる蛋白質 の核内移行を精度高く検出することが可能となる。
上記第 3の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対では、 inte inが藍 藻由来の DnaEであることから、 inteinが確実に自動的に切り出される ようになる。
上記第 4の発明の発明の蛋白質核内移行検出用プローブ対では、標識 蛋白が発光触媒酵素のルシフェラ一ゼであることから、 プローブ Iおよ び I I の間でスプライシングが起こり、 ルシフェラーゼが再構築された 場合、 活性中心が形成され、 ルミノメータ一で容易に検出可能な光を発 するようになる。
上記第 5の発明の蛋白質核内移行検出 ·定量方法では、 プローブ対に おけるプローブ I と生物活性物質を細胞質中で共存させ、 プローブ II を核内に局在化させ、 核内における標識蛋白のシグナルを測定する。 こ のとき、プローブ Iは細胞質に留まるが、蛋白質が生物活性物質を認識、 結合する場合には、その作用により細胞質から核内へ移行する。すると、 プローブ Iは核内に局在化されたプローブ I I と近接し、 プローブ Iお よび IIにおける 2分割された inte inがスプライシングにより切り出さ れ、 標識蛋白が再構築される。 したがって、 標識蛋白のシグナルを測定 すれば、生物活性物質による蛋白質の核内移行を確度および精度高く検 出することが可能となる。 また、 蛋白質の核内移行量を定量することも 可能となる。
上記第 6の発明の蛋白質核内移行検出 ·定量方法では、 プローブ対を 発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入することにより、 プローブ I と生物活性物質を細胞質中で共存させ、 プローブ I I を核内に局在化さ せることができる。 また、 上記第 7の発明の蛋白質核内移行検出 ·定量 方法では、 プローブ対を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより、 この動物またはその 子孫動物の全細胞においてプローブ I と生物活性物質を細胞質中で共 存させ、 プローブ I Iを核内に局在化させることができる。
上記第 8の発明の核内移行誘発物質のスクリーニング方法では、 プロ ーブ対におけるプローブ Iを細胞質に導入し、 プローブ I I を核内に局 在化させ、核内移行誘発候補物質を細胞質に導入して核内に^ 3ける標識 蛋白のシグナルを測定する。候補物質がプローブ Iにおける 白質と結 合し、 蛋白質の核内移行が誘発されると、 プローブ Iは核内 iこ局在化さ れたプローブ IIと近接し、 プローブ Iおよび I Iにおける 2 割された inteinがスプライシングにより切り出され、 標識蛋白が再禱築される。 したがって、 標識蛋白のシグナルを測定すれば、 該候補物質 該蛋白質 に対して、蛋白質核内移行誘発物質として作用するものであるか否かを 高速で精度高くスクリーニングできる。
上記第 9の発明の核内移行阻害物質のスクリ一ニング方法では、 プロ —ブ対におけるプローブ Iを細胞質に導入し、 プローブ I I を核内に局 在化させ、 核内移行阻害候補物質を細胞質に導入した後、 蛋白質核内移 行誘発物質を細胞質に導入して核内における標識蛋白のシ ナルを測 定する。 このとき、 候補物質が核内移行阻害物質として作用する場合に は、 まず、 該候補物質が蛋白質と結合する。 そのため、 蛋白賀核内移行 誘発物質が蛋白質と結合できなくなり、 核内移行が阻害される。 したが つて、 標識蛋白のシグナルが、 蛋白質核内移行誘発物質のみ ¾細胞質に 導入した場合の標識蛋白のシグナルと比較して減少する。 一方、 候補物 質が核内移行阻害物質として作用しない場合には、該候補物質は蛋白質 と結合しないため、 蛋白質核内移行誘発物質を細胞質に導 した際に、 蛋白質との結合が起こり、 蛋白質が核内に移行する。 したがって、 標識 蛋白のシグナルは、蛋白質核内移行誘発物質のみを細胞質に導入した場 合の標識蛋白のシグナルと同等となる。
上記第 1 0の発明のスクリーニング方法では、 プローブ対 発現する ポリヌクレオチドを細胞内に導入することにより、 プローブ Iを細胞質 に導入し、 プローブ II を核内に局在化させることができる D そして、 上記第 1 1の発明のスクリーニング方法では、 プローブ対を 現するポ リヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生す ることにより、 この動物またはその子孫動物の全細胞においてプローブ Iを細胞質に導入し、 プローブ II を核内に局在化させることが可能と なる。

Claims

請求の範囲
1 . 生物活性物質の作用によって誘発される蛋白質の核内移行を検出、 定量するためのプローブ対であって、
少なくとも、 inteinを 2分割したうちの C一末端側のポリペプチドと、 標識蛋白を 2分割したうちの C一末端側のポリぺプチドが順に連結さ れた [intein-CZ標識蛋白- C] 融合構造の N—末端側または C一末端側 に、 核内移行を検出 '定量したい蛋白質が連結されてなるプローブ Iと 少なくとも、標識蛋白を 2分割したうちの残りの N—末端側のポリぺプ チドと、 inteinを 2分割したうちの残りの N—末端側のポリペプチドが 順に連結された [標識蛋白- NZ intein-N] 融合構造の N—末端側または C—末端側に、 核局在化シグナルが連結されてなるプローブ II からなることを特徴とする蛋白質核内移行検出用プローブ対。
2 . 生物活性物質の作用によって誘発される蛋白質の核内移行を検出、 定量するためのプローブ対であって、
少なくとも、標識蛋白を 2分割したうちの N—末端側のポリペプチドと、 intein を 2分割したうちの N—末端側のポリペプチドが順に連結され た [標識蛋白- NZintein- N]融合構造の N—末端側または C一末端側に、 核内移行を検出 ·定量したい蛋白質が連結されてなるプローブ Iと 少なくとも、 inte inを 2分割したうちの残りの C—末端側のポリべプチ ドと、標識蛋白を 2分割したうちの残りの C一末端側のポリペプチドが 順に連結された [intein-CZ標識蛋白- C] 融合構造の N—末端側または C一末端側に、 核局在化シグナルが連結されてなるプローブ I I からなることを特徴とする蛋白質核内移行検出用プローブ対。
3 . inte inは、 藍藻由来の DnaEである請求項 1または 2のいずれか のプローブ対。
4 . 標識蛋白は、 ルシフェラーゼである請求項 1または 2のいずれか のプローブ対。
5 . 生物活性物質の作用によって誘発される蛋白質の核内移 を検出、 定量するための方法であって、請求項 1ないし 4のいずれかのプロ一プ 対におけるプローブ Iと生物活性物質を細胞質中で共存させ、プローブ IIを核内に局在化させ、核内における檫識蛋白のシグナルを測定するこ とを特徴とする蛋白質核内移行検出 ·定量方法。
6 . 請求項 1ないし 4のいずれかのプロ一ブ対を発現するポ *Jヌクレ ォチドを細胞内に導入することにより、プロ一ブ Iと生物活性翻質を細 胞質中で共存させ、プローブ IIを核内に局在化させる請求項 5 の検出 · 定量方法。
7 . 請求項 1ないし 4のいずれかのプロ一ブ対を発現するポ >Jヌクレ ォチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することに より、 この動物またはその子孫動物の全細胞においてプローブ Iと生物 活性物質を細胞質中で共存させ、 プローブ IIを核内に局在化させる請 求項 5の検出■定量方法。
8 . 蛋白質の核内移行を誘発する物質をスクリーニングする feめの方 法であって、請求項 1ないし 4のいずれかのプローブ対におけるプロ一 ブ Iを細胞質に導入し、 プローブ II を核内に局在化させ、 核 f¾移行誘 発候補物質を細胞質に導入して核内における標識蛋白のシグ:? "ルを測 定することを特徵とする蛋白質核内移行誘発物質のスクリーニング方 法。
9 . 蛋白質の核内移行を阻害する物質をスクリーニングする めの方 法であって、請求項 1ないし 4のいずれかのプローブ対におけるプロ一 プ Iを細胞質に導入し、 プローブ II を核内に局在化させ、 核 移行阻 害候捕物質を細胞質に導入した後、 さらに蛋白質核内移行誘発 ¾7質を細 胞質に導入して核内における標識蛋白のシグナルを測定し、蛋白質核内 移行誘発物質のみを細胞質に導入した場合の標識蛋白のシグナルと比 鲛することを特徴とする蛋白質核内移行阻害物質のスクリー二ング方 法。
1 0 . 請求項 1ないし 4のいずれかのプローブ対を発現するポリヌク レオチドを細胞内に導入することにより、 プローブ Iを細胞質に導入し、 プローブ II を核内に局在化させる請求項 8または 9のスクリーニング 方法。
1 1 . 請求項 1ないし 4のいずれかのプローブ対を発現するポリヌク レオチドを細胞内に導入し、非ヒ卜動物全能性細胞を個体発生すること により、 この動物またはその子孫動物の全細胞においてプローブ Iを細 胞質に導入し、 プローブ II を核内に局在化させる請求項 8または 9の スクリーニング方法。
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