WO2005077971A1 - ヘビ毒由来の血管内皮増殖因子（ｖｅｇｆ）様タンパク質のヘパリン結合部位より設計された新規なヘパリン結合能を有するペプチドとその用途 - Google Patents

Abstract

　本発明は、ＶＥＧＦ−Ａ１６５のヘパリンあるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する結合を阻害し、ＫＤＲとＶＥＧＦ−Ａ１６５との相互作用に起因する種々の生理的反応を抑制可能な、新規なヘパリン結合性ペプチドとして、 　ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質ｖａｍｍｉｎ中のヘパリン結合部位に基づき設計された、該ヘパリン結合部位に由来する第一の部分アミノ酸配列：Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｑ−Ｇ（Ｘは、Ｒ，Ｗ，Ｈ，Ｋのいずれか）を少なくとも含み、７～２０アミノ酸残基からなるヘパリン結合能を有するペプチドを提供する。

Description

明 細 書

へビ毒由来の血管内皮増殖因子 (VEGF)様タンパク質のへパリン結合 部位より設計された新規なへパリン結合能を有するペプチドとその用途

技術分野

[0001] 本発明は、血管内皮増殖因子受容体 2型（VEGF receptor 2 ; KDR)に対する 特異的結合性を有し、一方、血管内皮増殖因子受容体 1型 (VEGF receptor 1 ; Fit— 1 )に対する結合性は示さない、へビ毒由来の血管内皮増殖因子 (VEGF)様タ ンパク質中のへパリン結合部位に由来するアミノ酸配列に基づき設計されたへパリン 結合性ペプチドと、その医学分野における用途に関する。より具体的には、 Vipera ammodytes ammodytesのへビ毒から単離された VEGF様タンパク質； vammin、 ならびに、 Daboia russelli russelliのへビ毒から単離された VEGF様タンパク質； VR— 1中のへパリン結合部位に由来するアミノ酸配列に基づき設計されたへパリン結 合性ペプチドと、該へパリン結合性ペプチドを利用する、血管内皮増殖因子 (vascul ar endothelial growth factor : VEGF— A)に対するへパリン結合の抑制を介す る、 VEGFの KDRへの結合に起因する生理作用抑制などの医学分野における用途 に関する。

背景技術

[0002] 血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor： VEGF— A)は、血 管形成（vasculogenesis)と血管新生（angiogenesis)において、中心的な役割を 担っている。血管新生は、創傷治癒、女性の性周期における子宮内膜や黄体形成 などといった生理的現象において重要な役割を果たす一方、固形腫瘍の増殖、糖尿 病性網膜症、未熟児網膜症、乾癬などの種々の疾患に対しても、関与していることが 知られている。 VEGF— Aは、分子量 23 kDaのサブユニットがジスルフイド結合によ りホモダイマーを形成した糖タンパク質である。 VEGF— Aと類似する増殖因子として 、 VEGF— B、 VEGF— C、 VEGF— D、 VEGF— E、胎盤成長因子（placental grow th factor : PIGF)がある（渋谷正史、倉林正彦編、 実験医学、 20 (増刊）、 1070 -1269 (2002) ;小野真弓、桑野信彦著、 血管新生とがんの生物学、 共立出版 、 1-97 (2000)；佐藤靖史編、 血管新生の最前線、 羊土社、 10-171 (19 99)を参照）。 VEGFは、血管内皮細胞の VEGFR— l (fms— like tyrosine kinas e_l : Flt_l)と VEGFR— 2 (kmase insert domain— containing receptor : KD R)に高親和性に結合する。 VEGF - Aの内皮細胞の増殖シグナルおよび血圧降下 作用には、主に KDRを介していることが示唆されている（Li, B.等， Hypertensi on, 39， 1095-1100 (2002)を参'照）。また、 KDRを介したシグナノレ伝達 (こよ り産生される NOは、血管弛緩作用、血小板凝集阻害、抗血栓作用、抗炎症作用な どさまざまな生理活性を有し、抗動脈硬化的に働いていると考えられている（渋谷正 史、倉林正彦編、 実験医学、 20 (増刊）、 1070-1269 (2002)を参照）。

[0003] VEGF— Aをコードするヒト遺伝子は、 8個のェキソンで構成され、 alternative spli cingに由来するスプライシング変異体の存在が確認されている。すなわち、成熟モノ マーとして、 121、 145、 165、 189、ならびに、 206アミノ酸残基を有する 5種の iso_ form ;VEGF-A 、 VEGF—A 、 VEGF—A 、 VEGF—A 、 VEGF—A

121 145 165 187 206 存在し、特に、 VEGF-A は、ェキソン 6でコードされる部分アミノ酸配列を欠き、ま

165

た、 VEGF— A は、ェキソン 6、ェキソン 7でコードされる部分アミノ酸配列を欠いて

121

いることが確認されている。なかでも、 VEGF— A は、多くの組織において遊離型と

165

して発現され、成熟型かつ活性型の VEGFとして機能することが確認されている。ま た、 VEGF— A は、へパリンあるいはへパラン硫酸プロテオダリカンに対する結合性

165

をも有し、低い濃度へパリンの共存下においては、 KDRに対する VEGF— A の親

165 和性の亢進がなされ、一方、高い濃度へパリンを存在させた際には、 KDRに対する VEGF— A の親和性の亢進は認められないことも報告されている（国際公開 第 01

165

/ 72829号ノ ンフレットを参照）。その他、 neuropilin— 1も VEGF— A と結合し、

165

KDRへの親和性を亢進することによって、 VEGF— A に対する特異的な co— rece

165

ptorとして機能することも報告されている（特開 2003-12541号公報を参照）。

[0004] 一方、 KDRと VEGF— A との相互作用を阻害すると、固形腫瘍の増殖あるいは

165

転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症における血管新生が抑制され、これら疾患の 進行を阻害可能である。従って、 KDRと VEGF— A との相互作用を阻害する機能

165

を有する、 KDRに対する特異的な親和性を示すアンタゴニスト、あるいは、 VEGF- A に対して特異的な結合性を有する KDRとの結合阻害物質の探索が進められて

165

いる。

なお、上記の Parapoxウィルスに由来する VEGF—Eの他、 VEGF— A と類似す

165 るアミノ酸配列を有し、 KDRに対する結合性を示すタンパク質としては、 Vepera as pis aspisのへビ毒素中から、血圧降下因子（hypotensive factor： HF)力 VEG Fと相同性を有する VEGF様分子として単離された（Komori, Y.等， Toxicon,

28, 359-369 (1990)； Komori, Y.等， Biochemistry, 38， 11796— 11803 (1990)を参照）。更には、つい最近、 snake venom VEGFと increasin g capillary permeability protein (ICPP)の 2種の VEGF様分子力 それぞれ 、他のへビ毒から単離されており、この二種のへビ毒由来の VEGF様蛋白質は、血 管透過性と血管新生の活性を有することが示されている tiunqueira de Azevedo , I. L.等， J. Biol. Chem. , 276, 39836—39842 (2001)； Gasmi,

A.等， Biochem. Biophys. Res. Commun. , 268, 69—72 (2000) ； Gasmi, A.等， J. Biol. Chem. , 277, 29992—29998 (2002)を参 照）。

発明の開示

[0005] 上述するように、 KDRと VEGF— A との相互作用を阻害すると、固形腫瘍の増殖

165

あるいは転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症における血管新生が抑制され、これ ら疾患の進行を阻害可能である。従来の研究においては、 KDRと VEGF— A との

165 相互作用を阻害する手段として、 KDRと VEGF— A との相互作用を阻害する機能

165

を有する、 KDRに対する特異的な親和性を示すアンタゴニスト、あるいは、 VEGF— A に対して特異的な結合性を有する KDRとの結合阻害物質の探索に研究の関心

165

が集中している。

[0006] 本発明者らは、これら従来のアプローチに加えて、 VEGF— A は、へパリンあるい

165

はへパラン硫酸プロテオダリカンに対する結合性をも有し、低レ、濃度の遊離型へパリ ンの共存下においては、 KDRに対する VEGF— A の親和性の亢進がなさる点に

165

着目して、このへパリンあるいはへパラン硫酸プロテオグリカンと VEGF— A との結

165 合を抑制する手段も、 KDRと VEGF— A との相互作用の抑制に大きな貢献を有す ることに想到した。し力 ながら、現状では、細胞表面に存在するへパリンあるいはへ パラン硫酸プロテオダリカンの VEGF— A に対する結合性を抑制する手段として、

165

高い特異性を有し、また有効な手段は提案されてなぐこれ力 解決すべき課題であ ることも判明した。

[0007] 本発明は、前記の課題を解決するものであり、本発明の目的は、 VEGF— A の細

165 胞表面に存在するへパリンあるいはへパラン硫酸プロテオダリカンに対する結合を阻 害し、例えば、へパリンの存在下における、 KDRと VEGF— A との相互作用に起因

165

する種々の生理的反応を抑制可能な、新たな手段を提供することにある。具体的に は、 VEGF— A が細胞膜上に存在する KDRとの結合を形成するに際して、同時に

165

結合して、 VEGF-A に対する co_rece_Ptor様の機能を有する、細胞表面に存在

165

しているへパリンあるいはへパラン硫酸プロテオダリカンと高い結合性を示し、 VEGF -A とへパリンとの複合体形成を競争的に阻害する新規な物質を提供することにあ

165

る。

[0008] 本発明者らは、上記の課題を解決すベぐ鋭意研究を進める過程において、先ず、 VEGF— A のへパリンあるいはへパラン硫酸プロテオダリカンに対する結合に関与

165

する部位は、その C末端側に存在することが報告されていること (Keyt, B. A. et al. , J. Biol. Chem. , vol. 271 7788-7795 (1996)などを参照）に着目 し、具体的には、組換え生産 VEGF— A モノマーにおいて、 Ala¹¹¹— Arg¹⁶⁵の部

165

位をプラスミン消化により除いた、 C末端切除型タンパク質モノマーを調製し、そのへ パリン結合性を検証したところ、へノ^ン結合性を喪失していることが確認された。加 えて、力かる VEGF 由来の C末端切除型タンパク質のホモ二量体は、 in vitroに

165

おける KDRに対する結合性は、ぺパリン非存在下においては、基とした VEGF— A

16 のホモ二量体と適色のないものであることも確認された。しかしながら、 in vitroのゥ

5

シ大動脈内皮細胞の増殖試験において、その増殖惹起作用は、 VEGF 由来の C

165 末端切除型改変タンパク質のホモ二量体は、基とした VEGF のホモ二量体よりも、

165

格段に低下していることも判明した。すなわち、 VEGF の KDRへの結合に加えて

165

、内皮細胞表面に存在するプロテオダリカン型のぺパリン、またはへパラン硫酸プロ テオダリカンとも同時に結合することが、 KDRとの結合に引き続ぐ細胞内での生理 的反応の誘起に必須であることが確認される。

[0009] さらには、発明者らが、へビ毒由来の血管内皮増殖因子 VEGF様タンパク質として 、新たに単離 '同定した Vipera ammodytes ammodytes由来の VEGF様タンパ ク質； vammin、 Daboia russelli russelli由来の VEGF様タンパク質； VR— 1に関 しても、 KDRとの結合に引き続ぐ細胞内での生理的反応の誘起には、細胞表面に 存在するプロテオダリカン型のぺパリン、またはへパラン硫酸プロテオダリカンとも同 時に結合すること必要であることを見出した。これらへビ毒由来の血管内皮増殖因子 VEGF様タンパク質における、へパリンあるいはへパラン硫酸プロテオダリカンに対 する結合に関与する部位を探索したところ、その C末端の部分のみが、へパリンとの 結合に関与することを見出した。実際に、この vamminの C末端部分アミノ酸配列 (A rg⁹⁴-Arg ^o)あるいは VR-1の C末端部分アミノ酸配列 (Arg⁹⁴— Arg^lc>9)を有する ペプチド断片を合成し、そのへパリン結合能 (親和性）を評価したところ、 vammin, V R— 1中のへパリン結合部位に由来するアミノ酸配列を示すことが確認された。また、 V ammin、 VR— 1中のへパリン結合部位に由来するアミノ酸配列に加えて、そのアミノ 酸配列に基づき設計された改変型アミノ酸配列を有する一連のペプチド群も高いへ パリン結合能 (親和性)を保持することも検証した。さらには、そのへパリン結合能 (親 和性）において、支配的な機能を有するアミノ酸配列部分は、 R P R— X— K Q— G (Xは、 Rまたは W)の部分であることも確認した。

[0010] さらには、前記 vammin、 VR-1中のへパリン結合部位に由来するアミノ酸配列に 基づき設計された、へパリン結合能 (親和性)を保持する合成ペプチド断片は、 VEG F-A 、あるいは vamminによる血管内皮細胞の増殖誘導作用を濃度依存的に抑

165

制する作用を示し、また、 in vivoにおいては、 VEGF— A が示す、 KDRを介した

165

シグナル伝達により産生される N〇に因る血圧降下能を濃度依存的に抑制する作用 を示すことをも検証した。以上の知見に基づき、本発明者らは、本発明の第一の形態 を完成するに到った。

[0011] すなわち、本発明の第一の形態にかかるへパリン結合能を有するペプチドは、

vammin中のへパリン結合部位に由来する第一の部分アミノ酸配列：

R_P_R_X_K_Q— G (Xは、 R， W， H， Kのいずれ力、）を少なくとも含み、 7— 20アミノ酸残基からなることを特徴とするへパリン結合能を有するペプチドであ る。

[0012] 従って、本発明の第一の形態に力かるへパリン結合能を有するペプチドには、

vammin中のへパリン結合部位に由来する第一の部分アミノ酸配列：

R_P_R_X_K_Q— G (Xは、 R， W， H， Kのいずれ力、）を少なくとも含み、 A -R-P-R-X-K-Q-G-A

N C

(A、Aは、それぞれアミノ酸数 0— 13までのペプチド鎖から選択され、 A、Aのァ

N C N C

ミノ酸数の合計は、 13以下である）

からなる、 7 20アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するへパリン結合能を有するぺプ チドが包含される。

[0013] さらに、前記第一の部分アミノ酸配歹 IJ : R— P_R_X— K_Q_Gに加えて、

vammin中のへパリン結合部位に由来する第二の部分アミノ酸配列：

K— E— K— P— Rをも含み、

前記第一の部分アミノ酸配列の C末端に、前記第二の部分アミノ酸配列が、 4一 6 アミノ酸残基からリンカ一配列を介して連結されているへパリン結合能を有するぺプ チドとすることもできる。

[0014] 特には、 vammin中のへパリン結合部位に由来するアミノ酸配列：

R-P-R-R-K-Q-G-E-P-D-G-P-K-E-K-P-R

力 なるアミノ酸配歹 |J、または、その配列中に少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、 且つ前記第一の部分アミノ酸配列を保持してなる改変型アミノ酸配列を含む、へパリ ン結合能を有するペプチドとすることもできる。

[0015] カロえて、本発明は、上記の本発明の第一の形態にかかるへパリン結合能を有する ペプチドを利用する方法の発明として、 VEGF-A とへパリンとの結合に対する阻

165

害剤としての用途発明をも提供し、

すなわち、本発明の第一の形態に力かる VEGF— A とへパリンとの結合に対する

165

阻害剤は、

VEGF-A のへパリンに対する結合の競争的阻害剤であって、

165

該競争阻害活性成分は、上述する本発明の第一の形態に力かるへパリン結合能を 有するペプチドであることを特徴とする VEGF— A とへパリンとの結合に対する阻害

165

剤である。

[0016] かかる本発明の第一の形態にかかる VEGF— A とへパリンとの結合に対する阻害

165

剤は、例えば、注射液剤の剤形に調製する際には、

投与対象者の静脈内投与に適する、薬学的に許容される液性担体中に、上述する 本発明の第一の形態に力、かるへノ^ン結合能を有するペプチドの有効量を溶解して なる組成物とすること力 Sできる。

[0017] あるいは、点眼薬の剤形に調製する際には、

投与対象者に対して、その眼球または眼窩への適用に適する、薬学的に許容される 液性担体中に、上述する本発明の第一の形態にかかるへパリン結合能を有するぺ プチドの有効量を溶解してなる組成物とすることができる。

[0018] 本発明の第一の形態に力かる新規なへパリン結合能を有するペプチドは、へビ毒 由来の血管内皮増殖因子 VEGF様タンパク質； vamminならびに VR— 1中のへパリ ン結合部位のアミノ酸配列に基づき設計された、 7— 20アミノ酸残基からなるぺプチ ド化合物であり、 VEGF— A 、あるいは vamminの KDRへの結合により誘起される

165

、一酸化窒素 (NO)依存性の強力な血圧降下活性や血管新生促進作用の発揮に 必要な、 VEGF— A 、あるいは vamminと細胞表面上のへパリンとの間の結合を、

165

競争的に阻害する作用を有する。その結果、例えば、固形腫瘍の増殖や転移、糖尿 病性網膜症、未熟児網膜症、乾癬など、種々の疾患の要因となる、 VEGF— A に

165 起因する血管新生促進の抑制を目的とする治療用途に、本発明にかかる新規なへ パリン結合能を有するペプチドは利用可能である。その際、塩基性アミノ酸を多数含 有する 7 20アミノ酸残基のペプチドであるため、 MHCにより提示される抗原ぺプ チドとはならず、免疫原性を示さないので、反復投与に付随する抗体創製に起因す る治療効果の低減もないものとなる。

[0019] カロえて、本発明者らは、本発明の第一の形態に力かるへパリン結合能を有するぺ プチドを基礎として、更なるアミノ酸配列の改変を行レ、、遜色の無いへパリン結合能 を有する合成ペプチド断片を創製した。具体的には、本発明の第一の形態にかかる へパリン結合能を有するペプチドが有するへパリン結合能 (親和性）において、支配 的な機能を有する前記第一のアミノ酸配列部分： R— P-R— X— K-Q-G (Xは、 Rまた は W)に対して改変を施し、 R-X -X -X -K-Q-G (X は、 Pまたは R、X は、

01 02 03 01 02

Rまたは K、 X は、 Κ、 Ηまたは R)へと変換する際、遜色の無レ、へパリン結合能を示

03

すことを見出した。

[0020] さらには、前記 R— X -X -X -K-Q-G (X は、 Pまたは R、 X は、 Rまたは K、

01 02 03 01 02

X は、 Κ、 Ηまたは R)の改変された第一のアミノ酸配列部分を有し、へパリン結合能

03

(親和性）を保持する合成ペプチド断片は、同様に、 VEGF-A による血管内皮細

165

胞の増殖誘導作用を濃度依存的に抑制する作用を示すことをも検証した。以上の知 見に基づき、本発明者らは、本発明の第二の形態を完成するに到った。

[0021] すなわち、本発明の第二の形態にかかるへパリン結合能を有するペプチドは、

vammin中のへパリン結合部位に由来する、改変された第一の部分アミノ酸配列： R-X -X -X -K-Q-G (X は、 Pまたは R、X は、 Rまたは K、 X は、 Κ、 Ηま

01 02 03 01 02 03

たは Rである）を少なくとも含み、

7— 20アミノ酸残基からなることを特徴とするへパリン結合能を有するペプチドであ る。

[0022] 従って、本発明の第二の形態に力かるへパリン結合能を有するペプチドには、

vammin中のへパリン結合部位に由来する、改変された第一の部分アミノ酸配列： R-X -X -X -K-Q-G (X は、 Pまたは R、X は、 Rまたは K、 X は、 Κ、 Ηま

01 02 03 01 02 03

たは Rである）を少なくとも含み、

A -R-X -X -X -K-Q-G-A

Nl 01 02 03 CI

(A 、A は、それぞれアミノ酸数 0— 13までのペプチド鎖から選択され、 A 、A

Nl CI Nl CI のアミノ酸数の合計は、 13以下である）

からなる、 7 20アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するへパリン結合能を有するぺプ チドが包含される。

[0023] さらに、前記改変された第一の部分アミノ酸配列: R— X -X -X 一 K_Q_Gに加

01 02 03

えて、

vammin中のへパリン結合部位に由来する第二の部分アミノ酸配列：

K— E— K— P— Rをも含み、 前記改変された第一の部分アミノ酸配列の c末端に、前記第二の部分アミノ酸配列 力 4一 6アミノ酸残基からリンカ一配列を介して連結されているへパリン結合能を有 するペプチドとすることもできる。

[0024] 特には、前記リンカ一配列として、 E_P_D_G_Pを選択してなる、

R-X -X -X -K-Q-G-E-P-D-G-P-K-E-K-P-R

01 02 03

(X は、 Pまたは R、X は、 Rまたは K、X は、 Κ、 Ηまたは Rである）からなるァミノ

01 02 03

酸配列、または、その配列中に少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、且つ前記改変 された第一の部分アミノ酸配列を保持してなる改変型アミノ酸配列を含む、へパリン 結合能を有するペプチドとすることもできる。

[0025] カロえて、本発明は、上記の本発明の第二の形態にかかるへパリン結合能を有する ペプチドを利用する方法の発明として、 VEGF-A とへパリンとの結合に対する阻

165

害剤としての用途発明をも提供し、

すなわち、本発明の第二の形態に力かる VEGF— Α とへパリンとの結合に対する

165

阻害剤は、

VEGF-A のへパリンに対する結合の競争的阻害剤であって、

165

該競争阻害活性成分は、上述する本発明の第二の形態に力かるへパリン結合能を 有するペプチドであることを特徴とする VEGF— A とへパリンとの結合に対する阻害

165

剤である。

[0026] かかる本発明の第二の形態にかかる VEGF— A とへパリンとの結合に対する阻害

165

剤は、例えば、注射液剤の剤形に調製する際には、

投与対象者の静脈内投与に適する、薬学的に許容される液性担体中に、上述する 本発明の第二の形態に力、かるへノ^ン結合能を有するペプチドの有効量を溶解して なる組成物とすること力 Sできる。

図面の簡単な説明

[0027] [図 1]図 1は、 peptide 1— peptide 6の 6種合成ペプチドのへパリン結合能の評価 結果を示し、標品ペプチド（lOO x g)を、 10mLの 50mM Tris-HCl ρΗ8· 0に溶 角军後、 HiTrap Heparin HPカラム (カラム容量 10mL、 Amersham Bioscience s)にアプライし、流速 lmL/minで、該緩衝液を 5カラム容量流し、引き続き、 10カラ ム容量、 1 · 0Μ NaCほでの直線勾配で溶出を行レ、、溶出条件 (NaCl濃度）を測定 した結果を示す。

園 2]図 2は、本発明にかかるへノ^ン結合能を有するペプチドの設計の基礎を説明 し、 図 2の Aは、 vamminとヒト VEGF— A のペプチド鎖のアミノ酸配列ァライン結

165

果から予測される、 vamminモノマー鎖内、二量体の鎖間のジスルフイド結合部位と 、システィンナット'モチーフを表示し、また、ヒト VEGF— A 中のへパリン結合に関

165

与する領域を点線で囲って示し、 図 2の Bは、 vamminの C末端部アミノ酸配列（A 中に下線で表示）と、それに基づき設計された、 peptide 1一 3のアミノ酸配列を対 比して示す。

[図 3]図 3は、 peptide 1の VEGF— A による血管内皮細胞の増殖促進作用、なら

165

びに vamminによる血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価結果を示し 、低血清培養条件にぉレ、て、 VEGF— A または vammin (各最終濃度 InM)の添

165

加によるゥシ大動脈内皮細胞の増殖促進に対する、共添加する peptide 1による抑 制を、 6日間培養後の細胞数によって評価した、白：コントロール、黒: VEGF— A ま

165 たは vamminのみ添加（陽性対照）、薄レ、灰色： 30 μ M (最終濃度）の peptide 1の 添力 0、濃い灰色： 100 /i M (最終濃度）の peptide 1の添加時の結果を対比して示 す。

[図 4]図 4は、 peptide 1の VEGF— A による血圧降下作用、ならびに vamminに

165

よる血圧降下作用に対する阻害能評価結果を示し、 図 4 (A)は、上: vammin (用 量 0. l i g/g)の静脈注射後（！印）のラット頸動脈圧の時間推移、下: peptide 1 (用量 3 / g/g)を事前投与後（▼印）、 vammin (用量 0. 1 / g/g)の静脈注射 後（i印）のラット頸動脈圧の時間推移、 図 4 (B)は、上: VEGF-A (用量 0. 1

165

μ g/g)の静脈注射後（丄印）のラット頸動脈圧の時間推移、中： peptide 1 (用量 3 μ g/g)を事前投与後（T印）、 VEGF-A (用量 0. 1 μ g/g)の静脈注射後（

165

丄印）のラット頸動脈圧の時間推移、下: peptide 1 (用量 30 z gZg)を事前投与 後（T印）、 VEGF— A (用量 0. 1 μ g/g)の静脈注射後（丄印）のラット頸動脈圧

165

の時間推移を対比して示す。

[図 5]図 5は、 peptide 1— 3の三種ペプチドの VEGF— A による血圧降下作用に 対する阻害能を比較評価した結果を示し、図中、 A:VEGF-A (用量 0. 1 μ g/

165

g)のみを投与した際 印）（陽性対照）、 B : peptide 1 (用量 30 i g/g)を予め 投与後 印）、 VEGF— A (用量 0· 1 / g/g)を投与した際 印）、 C : peptide

165

2 (用量 30 x gZg)を予め投与後（T印）、 VEGF—A (用量 0. 1 z gZg)を投

165

与した際 印）、 D : peptide 3 (用量 30 μ g/g)を予め投与後（T印）、 VEGF— A (用量 0. l z g/g)を投与した際（！印）における、ラット頸動脈圧の時間推移

165

を対比して示す。

[図 6]図 6は、へビ毒由来の VEGF様タンパク質とヒト VEGF— A のペプチド鎖のァ

165

ミノ酸配列ァライン結果を示す。へビ毒由来の VEGF様タンパク質において、一致す るアミノ酸残基は網掛けで、システィン残基は、白ヌキで示し、鎖内、鎖間のジスルフ イド結合を表示し、また、システィンナット'モチーフを形成する、ヒト VEGF— A 鎖内

165 のループ部分は横線で示されている。また、ヒト VEGF— A のへパリン結合部位は

165

、点線で囲まれている。ヒト VEGF— A 中の、 KGR受容体結合のための重要な残

165

基を、秦印で、 Fit— 1結合のために重要な残基を、口印で、へビ毒由来の VEGF様 タンパク質における、 Flt-1への結合性の低下に寄与する、アミノ酸置換部位を、▼ 印で示す。 HF :Vipera aspis aspisのへビ毒由来の hypotensive factor ; ICP P :Vipera lebetmaのへヒ毒由来の increasing capillary permeability prote in ; VEGF165 : ヒト血管内皮増殖因子 ヒト VEGF— A (GenBank 登録番号

165

, AAM03108)

[図 7]図 7は、培地中に共添加されるへパリンと、 VEGF— A ならびに vamminとの

165

結合に起因する、 VEGF— A または vammin刺激による血管内皮細胞増殖作用の

165

抑制効果を示す。血清添加培養条件において、種々の濃度の未分画へパリンと、 V

EGF-A または vammin (最終濃度 InM)を添加し、 3日間培養後の生存細胞数

165

を評価した。黒丸翁： vammin、白丸〇： VEGF— A 刺激による血管内皮細胞の増

165

殖促進時、培地中にへパリンを各濃度で共添加した際における、 WST— 8法におけ る、発色の吸収係数 A (生存細胞数）を示す。

405-630

[図 8]図 8は、 peptide 1、 peptide 2、 peptide 3の各ペプチド力示す、 VEGF— A による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価結果を示す。血清添加

165 培養条件において、 VEGF-A (最終濃度 InM)の添加によるヒト臍帯静脈内皮細

165

胞の増殖促進に対する、共添加する各ペプチドによる抑制を、 3日間培養後の細胞 数によって評価した。黒丸き： peptide 1、白丸〇：peptide 2、黒三角▲： peptide

3を、各濃度添加した際における、増殖促進率を示す。

[図 9]図 9は、 peptide 1と peptide 9 (TFPI^{254 265})の各ペプチドが示す、 VEGF— A による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価結果を示す。血清添

165

加培養条件において、 VEGF-A (最終濃度 InM)の添カ卩によるヒト臍帯静脈内皮

165

細胞の増殖促進に対する、共添加する各ペプチドによる抑制を、 3日間培養後の細 胞数によって評価した。黒色： peptide 1、灰色： peptide 9 (TFPI^{254 265})を、各濃 度添加した際における、増殖促進率を示す。

[図 10]図 10は、 peptide 1、 peptide 7、 peptide 8の各ペプチド力示す、 VEGF -A による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価結果を示す。血清

165

添加培養条件において、 VEGF-A (最終濃度 InM)の添加によるヒト臍帯静脈内

165

皮細胞の増殖促進に対する、共添加する各ペプチドによる抑制を、 3日間培養後の 細胞数によって評価した。黒丸き： peptide 1、白丸〇：peptide 7、黒三角 A : pe ptide 8を、各濃度添加した際における、増殖促進率を示す。

[図 11]図 11は、培地中に共添加される peptide 1に因る、 VEGF— A または塩基

165

性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)刺激による血管内皮細胞増殖作用の抑制効果を 示す。血清添加培養条件において、種々の濃度の peptide 1と、 VEGF-A また

165 は bFGF (最終濃度 InM)を添加し、 3日間培養後の生存細胞数を評価した。黒丸 秦: VEGF— A 、白丸〇： bFGF刺激による血管内皮細胞の増殖促進時、培地中

165

に peptide 1を各濃度で共添加した際における、増殖促進率を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0028] 以下に、本発明をより詳細に説明する。

[0029] 本発明に先立ち、本発明者らは、

Vipera ammodytes ammodytesのへビ毒から精製 ·単離された VEGF様タンパ ク質： vamminおよび Daboia russelli russelliのへビ毒から精製 '単離された VE GF様タンパク質: VR-1は、それぞれ、 110アミノ酸からなるペプチド鎖二本力 鎖 間のジスルフイド結合で連結されたホモ 2量体、ならびに、 109アミノ酸からなるぺプ チド鎖二本が、鎖間のジスルフイド結合で連結されたホモ 2量体であること、加えて、 これら vamminおよび VR— 1は、血管内皮増殖因子受容体 2型（VEGF receptor 2 ;KDR)に対する結合性を有し、血管内皮増殖因子受容体 1型 (VEGF receptor l ; Flt_l)、血管内皮増殖因子受容体 3型（VEGF receptor 3 ; Flt_4)、および ニューロピリン- 1 (neuropilin-1)に対する結合性は示さない特徴を有することを解 明した。具体的には、 vamminを構成する、 110アミノ酸からなるペプチド鎖の一次 構造 (アミノ酸配列）は、下記の配列 1 :

配列 1 : vamminの 110アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造

EVRPFLEVHE RSACQARETL VPILQEYPDE ISDIFRPSCV AVLRCSGCCT DESLKCTPVG KHTVDLQIMR VNPRTQSSKM EVMKFTEHTA CECRPRRKQG EPDGPKEKPR

また、 VR— 1を構成する、 109アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造（アミノ酸配歹 IJ) は、下記の配列 2 :

配列 2 : VR— 1の 109アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造

EVRPFLDVYQ RSACQTRETL VSILQEHPDE ISDIFRPSCV AVLRCSGCCT DESMKCTPVG KHTADIQIMR MNPRTHSSKM EVMKFMEHTA CECRPRWKQG EPEGPKEPR

である。

なお、前記 Vipera ammodytes ammodytesのへビ毒から精製'単離された VE GF様タンパク質: vamminl lOアミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造は、同様に、 110アミノ酸からなるペプチド鎖二本力 鎖間のジスルフイド結合で連結されたホモ 2 量体である、 Vepera aspis aspisのへビ毒素から単離されている HFの一次構造、 下記配列 3 :

配列 3： HFの 110アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造

EVRPFLEVHE RSACQARETL VSILQEYPDE ISDIFRPSCV AVLRCSGCCT DESLKCTPVG

KHTVDLQIMR VNPRTQSSKM EVMKFTEHTA CECRPRRKQG EPDGPKEKPR

あるいは、 Vipera lebetinaのへビ毒から単離されている ICPPの一次構造、下記配 歹 IJ4 :

配列 4： ICPPの 110アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造

EVRPFPDVHE RSACQARETL VSILQEYPDE ISDIFRPSCV AVLRCSGCCT DESLKCTPVG KHTVDMQIMR VNPRTQSSKM EVMKFTEHTA CECRPRRKQG EPDGPKEKPR

と対比すると、図 6に示すように極めて高い相同性を示すことを、同時に、これら一連 のへビ毒由来 VEGF様タンパク質の生理活性と、そのアミノ酸配列との相関を十分 に検討した結果、アミノ酸配列の一致部分のなかでも、 KDRとの高い親和性を維持 しつつ、一方、 Flt-1との結合性を持たないという特性に深く関与する、あるいは、顕 著に貢献するアミノ酸配列上の特徴の一つとして、配列 1中の Alal 3、 Lys55、 Arg 74、 Ser77、 Lys79の 5つのアミノ酸の存在と、 KDRに対する高い選択性との間に 高い相関性が見出されることを既に解明し、それを報告している (Yamazaki, Y. e t al. , J. Biol. Chem. , vol. 278 51985—51988 (2003)を参照）。 一方、分子量 38. 2kDaのホモ二量体タンパク質である、ヒトの血管内皮増殖因子 VEGF-A は、へパリンあるいはへパラン硫酸プロテオダリカンに対する結合性を

165

も有し、低い濃度へパリンの共存下においては、 KDRに対する VEGF-A の親和

165 性の亢進がなさる点に着目して、 VEGF-A 中に存在するへパリン結合性を支配

165

する領域の特定を進めた。その過程で、プラスミン消化により C末端の Arg¹¹¹— Arg^{1 65}の領域を切除した、 C末端切除体は、へパリン結合性を喪失することを見出した。さ らには、 C末端切除体 (VEGF110)は、例えば、 VEGF-A が本来示す血管内皮

165

増殖促進活性と対比すると、その血管内皮増殖促進活性は著しく低下することが確 認され、 VEGF— A の KDRへの結合に伴い発揮される種々の生理活性発現には

165

、該 KDRが発現されている対象細胞表面に存在するへパリンとの結合も不可欠な過 程であることが判明した。

[0032] 実際に、 VEGF— A 中に存在する C末端の Arg¹¹¹— Arg¹⁶⁵の領域は、図 2に示

165

すように、力かる領域内部で鎖内のジスルフイド結合により形成される三次元構造を 有しており、その三次元構造を構成した際、含まれる複数の塩基性アミノ酸残基がへ パリン中の酸性置換基の硫酸エステル、硫酸アミド構造と相互作用する結果、へパリ ンとの結合を達成してレ、ると推断される。

[0033] また、へパリンの多糖鎖は、下に模式的に示すように、 Lーィズロン酸、 D—ダルク口 ン酸、 D—ダルコサミンを構成単位とし、硫酸化は、ほとんど全ての D—ダルコサミンの アミノ基、その他、一部 6位のヒドロキシ基、一部ゥロン酸 2位のヒドロキシ基にも存在 している。細胞においては、多くは、タンパク質のァミノ残基側鎖上に結合したプロテ オダノレカンの形態で存在している。また、細胞種類に応じて、へパリンの多糖鎖上に 存在する、この硫酸化部位、ならびに、構成糖単位の配列の差違が存在し、様々な 生理活性に関与している。

[0034] [化 1] - - -

α - D-グルクロン酸 ）3 -L-ィズロン酸- 2-硫酸 a -D -ダルコサミン- Ν, Ο-二硫酸

[0035] 一方、 vamminでは、図 2に示す対比から、 VEGF-A 中に存在する C末端の Ar

165

g¹¹¹— Arg¹⁶⁵領域のような、三次元構造を有するへパリン結合部位は無いにも係わら ず、同じぐへパリンとの結合性を示すこと、また、 vamminの KDRへの結合に伴レヽ 発揮される種々の生理活性発現においても、該 KDRが発現されている対象細胞表 面に存在するへパリンとの結合も不可欠な過程であることを解明した。さらには、 VR _1に関しても、やはりへパリンとの結合性を示すこと、また、 VR— 1の KDRへの結合 に伴い発揮される種々の生理活性発現においても、該 KDRが発現されている対象 細胞表面に存在するへパリンとの結合も不可欠な過程であることを解明した。これら の新事実から、 vamminや VR-1において見出されるへパリンとの結合性は、それら の C末端部分、すなわち、 vamminの C末端部分アミノ酸配歹 lJ (Arg⁹⁴— Arg^11Q)ある レ、は VR— 1の C末端部分アミノ酸配歹 lJ (Arg⁹⁴— Arg¹⁰⁹)により支配されているとの着 想を得て、実際に、下記の実施例に示す通り、かかる C末端部分アミノ酸配列に相当 する合成ペプチド peptide 1を作製して、いずれもへパリンとの結合能を示すぺプ チドであることを検証した。

[0036] 従って、 vamminや VR—1のみならず、他のへビ毒由来の VEGF様タンパク質 HF 、 ICPPにおいても、共通して、力かる C末端部分アミノ酸配歹 lJ (Arg⁹⁴ Arg^11Q)がへ パリンとの結合を可能としていることも結論された。

[0037] § Iき続き、 vamminの C末端部分アミノ酸配列（Arg⁹⁴ Arg^u°)あるいは VR_1の C末端部分アミノ酸配歹 lJ (Arg⁹⁴— Arg¹⁰⁹)により支配されているへパリンとの結合性 において、その主要な部分領域を特定するため、図 2の Bに示す peptide 2、 pepti de 3の二種の部分断片型ペプチドを調製し、そのへパリン結合性を評価したところ 、合成ペプチド peptide 2は、合成ペプチド peptide 1と遜色のないへパリン結合 性を示すが、合成ペプチド peptide 3は、へパリン結合性を喪失していることが判明 した。

[0038] さらに、合成ペプチド peptide 2に含まれる、 vammin由来の部分アミノ酸配列： R -P-R-R-K-Q-G-Eと、 VEGF-A 由来の C末端切除体 (VEGF110)におレヽ

165

て C末端に残余する部分アミノ酸配歹 IJ : R— P— K一 K一 D— Rと対比させると、双方とも に、塩基性アミノ酸残基に富むアミノ酸配列であるものの、部分アミノ酸配列： R— P— K一 K一 D— Rでは、へパリン結合性が損なわれているという決定的な相違がある。

[0039] すなわち、 vammin由来の部分アミノ酸配列： R_P_R_R_K_Q_G_Eと、 VR—1 の対応する領域、ならびに、へパリン結合性を示さない VEGF110の C末端に残余 する部分アミノ酸配列を相互に対比すると、

vammin ： R— P— R— R— K— Q_G— E

VR-1 ： R-P-R-W-K-Q-G-E

VEGF 110 : R-P-K-K-D-R

想定部分配列 ： R_P_R_X_K_Q_G (Xは、 R, W, H, Kのいずれか） 前記の想定部分配列（第一の部分アミノ酸配列）を保持すると、少なくとも、合成ぺプ チド peptide 2におけるへパリン結合性と遜色ないへパリン結合性を示すと判断され る。特には、下線を付した 4アミノ酸力 上に例示するような、へパリン中の硫酸化され た糖鎖における硫酸エステル構造、硫酸アミド構造との相互作用に適する相対配置 に塩基性アミノ酸残基を配置する役割を果たしていると判断される。従って、本発明 の第一の形態に力、かるへノ^ン結合能を有するペプチドでは、

前記第一の部分アミノ酸配歹 IJ : R_P_R_X_K_Q_G (Xは、 R, W, H, Kのいずれ 力 をその内部に含み、全体のアミノ酸残基数は、 7— 20アミノ酸残基からなるぺプチ ドとする。前記全体のアミノ酸残基数の範囲は、種々のペプチド 'ホルモンを構成す るペプチド鎖長、例えば、アンギオテンシン IIの 8アミノ酸残基、あるいは、インスリン A 鎖の 21アミノ酸残基など、機能を発揮しつつ、水溶性を保持する上で適正なぺプチ ド鎖長に相当している。

[0040] 上述するように、本発明の第一の形態に力かるへパリン結合能を有するペプチドに は、

vammin中のへパリン結合部位に由来する第一の部分アミノ酸配列：

R-P-R-X-K-Q_G (Xは、 R, W, H, Kのいずれ力 を少なくとも含み、 A -R-P-R-X-K-Q-G-A

N C

(A 、Aは、それぞれアミノ酸数 0— 13までのペプチド鎖から選択され、 A 、Aのァ

N C N C

ミノ酸数の合計は、 13以下である）

からなる、 7— 20アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するへパリン結合能を有するぺプ チドが包含される力 例えば、下記する合成ペプチド peptide 4、 5の例にしめされ るように、 A の部分には、アミノ酸が存在しない形態とすることができる。一般に、 N末

N

に保護用のアミノ酸として、例えば、 Gly、 Alaなどの嵩の小さなアミノ酸を付加し、最 小のアミノ酸数 8以上の形態とすることが望ましい。

[0041] 加えて、合成ペプチド peptide 1では、 C末端に K_E_K_P_Eの部分配列をも備 えており、合成ペプチド peptide 2よりも若干へパリン結合性が優っており、この第二 の部分アミノ酸配歹 IJ:K_E_K_P_Eをも有することが望ましい。その際、第一の部分 アミノ酸配列と第二の部分アミノ酸配列の間を適正な間隔に配置することが好ましぐ リンカ一配列として、 5アミノ酸残基程度、従って、 4一 6アミノ酸残基からリンカ一配列 、より好ましくは、 5アミノ酸残基からリンカ一配列を設ける、

R-P-R-X-K-Q-G-X -X -X—X—X -K—E—K—P-R

1 2 3 4 5

(Xは、 R, W， H, Kのいずれか、なお、—X -X -X -X -X—は、リンカ一配列）

1 2 3 4 5

と表記されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。特には、 vammin中のへパリン結合 部位に由来するアミノ酸配列：

R-P-R-R-K-Q-G-E-P-D-G-P-K-E-K-P-R

力、らなるアミノ酸配歹 |J、または、その配列中に少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、且 つ前記第一の部分アミノ酸配列を保持してなる改変型アミノ酸配列を含む、へパリン 結合能を有するペプチドとすることもできる。この種の改変アミノ酸配列の好ましレ、一 例として、

R-P-R-X-K-Q-G-E-P-D-G-P-K-E-K-P-R

(Xは、 W, H, Kのいずれか）

また、 C末端に Rを付加している、

R-P-R-X-K-Q— G_E_P_D_G_P_K_E— K-P-R-R

(Xは、 R, W, H, Kのいずれか）

などを挙げることができる。

カロえて、前記第二の部分アミノ酸配歹 ΐ』:Κ_Ε_Ι£_Ρ_βに代えて、第一の部分アミノ 酸配歹 IJ : R-P-R-X-K-Q-G (Xは、 R, W, H, Kのいずれ力 をリンカ一配列で連 結している

R-P-R-X-K-Q-G-X -X -X -X -X -R-P-R-X—K-Q—G

1 2 3 4 5

と表記されるアミノ酸配列を選択することも可能である。すなわち、第一の部分アミノ 酸配列がリンカ一配列を介して、タンデム型に連結された形態となり、へパリンとの結 合に関与できる部位が増したものとなる。あるいは、 Aの部分として、 VEGF— A 中

C 165 に存在する C末端の 5アミノ酸残基 (Asp¹⁶¹— Arg¹⁶⁵)： D_K_P_R_Rに対応させて 、前記 K一 E_K_P_R_Rを、 Κ_β_Κ— P_R_Rへと変換した、

R-P-R-X-K-Q-G-E-P-D-G-P-K-D-K-P-R-R

(Xは、 R, W， H, Kのいずれか) のようなアミノ酸配列を有するものとすることもできる。

[0043] 更には、第一の部分アミノ酸配列部分としては、 Xとして Rを選択する、 R— P—R— R 一 K_Q_Gを用いることがより好ましレ、。

[0044] なお、上記リンカ一配列、例えば、 5アミノ酸残基からリンカー配歹 IJ：一 X -X -X -X

1 2 3

-X -部分の役割は、第一の部分アミノ酸配列部分に対して、第二の部分アミノ酸配

4 5

列部分を連結し、第一の部分アミノ酸配列部分が主体となるへパリン結合性に対して 、第二の部分アミノ酸配列部分とへパリン間の弱い相互作用の寄与を付加することを 目的とするものである。従って、投与対象の体内に存在する、プロテアーゼ、ぺプチ ダーゼの作用によって、かかるリンカ一配列:一 X—X—X—X—X一部分の切断がな

1 2 3 4 5

されないものを利用することができる。カロえて、 L体アミノ酸からなるリンカ一配列に代 えて、 D体アミノ酸からなるリンカ一配列を利用することで、体内のプロテアーゼによる 消化を抑制することも可能である。また、種々のペプチド試薬において利用される、 ペプチド結合のミミック構造を力かるリンカ一配列部分に利用することで、体内のプロ テアーゼによる消化を抑制することも可能である。但し、このリンカ一配列内で切断を 受けた場合にも、第一の部分アミノ酸配列部分自体の切断が成されない限り、へパリ ン結合性を保持する第一の部分アミノ酸配列部分側断片を副生するので、特には、 問題とはならない。

[0045] 一般に、ペプチド化合物の体内分解を防止する上では、 N末端ならびに C末端に 余剰のアミノ酸を付加する、あるいは、修飾を施す手法が有効である。例えば、 N末 端のアミノ基に種々のァシル基修飾を施す、あるいは、 C末端のカルボキシ基をアミド 化することもできる。本発明の第一の形態にかかるへパリン結合能を有するペプチド は、化学的合成手法を利用して作製することが可能であるので、例えば、固相合成 法を利用して、 C末端側からペプチド鎖の延長を行う際には、樹脂上に固定される C 末端のアミド化を行うと、合成上も好適である。また、前記リンカ一配歹' j :一 X -X -X

1 2 3

-X—X—部分などは、天然のアミノ酸に代えて、人工のアミノ酸を含むものとすること

4 5

ができる。人工のアミノ酸を利用することで、ペプチド鎖の酵素的切断を抑制するもの に、該リンカ一配列を設計することも可能である。

[0046] また、 vammin中のへパリン結合部位に由来するアミノ酸配列において、前記リンカ 一配列:一 X -X -X -X -X一部分に相当するアミノ酸配列は、 _E_P_D_G_P—と

1 2 3 4 5

なっているが、それに含まれる、— D— G— (Asp— Gly)の配列では、場合によっては、 Aspの側鎖上のカルボキシ基（一 COOH)と Glyの N末のイミノ窒素（一 N—）との間の 反応に伴レ、スクシイミド構造の形成、あるいは、 j3位への転位が起こることが知られて いる。

[化 2] スクシイミド構造の形成：

[0048] [化 3]

/3位への転位

[0049] この種のペプチド分子内の反応に伴う、構造変化を抑制するため、例えば、 -D-G - (Asp-Gly)の配列を、 -D-A- (Asp-Ala)や— N_G_ (Asn_Gly)のような構造 的には類似するものの、不要な分子内反応を抑制するアミノ酸置換を行うこともでき る。

[0050] 本発明の第一の形態に力かるへパリン結合能を有するペプチドは、全体のアミノ酸 残基数は、 7— 20アミノ酸残基からなるペプチドであり、また、親水性アミノ酸、特に は、塩基性アミノ酸を多く含有しており、広い濃度範囲の水溶液とすることが可能であ る。医薬用途に適用する際には、水性媒体、例えば、種々のペプチド 'ホルモンを含 有する注射液の調製に利用される水性媒体、あるいは、経口投与可能なペプチド性 生理活性物質を含有する液剤の調製に利用される水性媒体を担体とする組成物に 調製することが好ましい。また、所定量の水を加えることによって、前記水性媒体を用 いた組成物の作製が可能な、凍結乾燥混合物の形態とすることも可能である。一般 に、水溶解性は、ペプチドを構成するアミノ酸残基数が増加するに伴い、低下する傾 向を有するが、本発明にかかるへノ^ン結合能を有するペプチドは、第一の部分アミ ノ酸配列部分、さらには、第二の部分アミノ酸配列部分にも、親水性に富むアミノ酸 を高い比率で有するため、その水に対する溶解度は、少なくとも、 20mgZmLを超え るものとなる。

[0051] 一方、本発明の第二の形態にかかるへパリン結合能を有するペプチドは、

上述する本発明の第一の形態に力、かるへパリン結合能を有するペプチドにおいて 利用される、前記第一の部分アミノ酸配歹 U : R— P_R_X— K_Q_G (Xは、 R, W， H , Kのいずれ力 に代えて、改変された第一の部分アミノ酸配列：

R-X -X -X -K-Q-G (X は、 Pまたは R、X は、 Rまたは K、 X は、 Κ、 Ηま

01 02 03 01 02 03

たは Rである）をその内部に含み、全体のアミノ酸残基数は、 7— 20アミノ酸残基から なるペプチドとする。先に説明したように、前記全体のアミノ酸残基数の範囲は、種々 のペプチド 'ホルモンを構成するペプチド鎖長、例えば、アンギオテンシン IIの 8ァミノ 酸残基、あるいは、インスリン Α鎖の 21アミノ酸残基など、機能を発揮しつつ、水溶性 を保持する上で適正なペプチド鎖長に相当してレ、る。

[0052] 上述するように、本発明の第二の形態に力かるへパリン結合能を有するペプチドに は、

vammin中のへパリン結合部位に由来する、改変された第一の部分アミノ酸配列： R-X -X -X -K-Q-G (X は、 Pまたは R、X は、 Rまたは K、 X は、 Κ、 Ηま

01 02 03 01 02 03

たは Rである）を少なくとも含み、

A -R-X -X -X -K-Q-G-A

Nl 01 02 03 CI

(A 、A は、それぞれアミノ酸数 0— 13までのペプチド鎖から選択され、 A 、A

Nl CI Nl CI のアミノ酸数の合計は、 13以下である）

からなる、 7 20アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するへパリン結合能を有するぺプ チドが包含される力 例えば、下記する合成ペプチド peptide 7、 8の例にしめされ るように、 A の部分には、アミノ酸が存在しない形態とすることができる。一般に、 N末

N

に保護用のアミノ酸を付加する際には、例えば、 Gly、 Alaなどの嵩の小さなアミノ酸 を付カ卩し、最小のアミノ酸数 8以上の形態とすることが望ましレ、。

[0053] 加えて、合成ペプチド peptide 7、 8では、合成ペプチド peptide 1と同様に、 C末 端に K_E_K_P_Eの部分配列をも備えており、合成ペプチド peptide 2よりも若干 へパリン結合性が優っており、この第二の部分アミノ酸配歹 IJ :K_E_K_P_Eをも有す ることが望ましい。その際、前記改変された第一の部分アミノ酸配列と第二の部分アミ ノ酸配列の間を適正な間隔に配置することが好ましぐリンカ一配列として、 5アミノ酸 残基程度、従って、 4一 6アミノ酸残基からリンカー配歹 IJ、より好ましくは、 5アミノ酸残 基からリンカ一配列を設ける、

R-X —X —X — K— Q— G— X— X— X— X— X— K— E— K— P— R

01 02 03 1 2 3 4 5

(X は、 Pまたは R、X は、 Rまたは K、X は、 Κ、 Ηまたは R、なお、 -X -X -X _

01 02 03 1 2 3

X -X一は、リンカ

4 5 一配列）

と表記されるアミノ酸配列を含むことが好ましレ、。

[0054] 特には、前記改変された第一の部分アミノ酸配列と、前記第二の部分アミノ酸配列 とを連結する、リンカ一配列として、 E— P— D— G— Ρを選択してなる、

R-X -X -X -K-Q-G-E-P-D-G-P-K-E-K-P-R

01 02 03

(X は、 Ρまたは R、X は、 Rまたは K、X は、 Κ、 Ηまたは Rである）からなるァミノ

01 02 03

酸配列、または、その配列中に少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、且つ前記改変 された第一の部分アミノ酸配列を保持してなる改変型アミノ酸配列を含む、へパリン 結合能を有するペプチドとすることもできる。この種の改変アミノ酸配列の好ましレ、一 例として、

R-X -X -X -K-Q-G-E-P-D-G-P-K-E-K-P-R

01 02 03

(X は、 Ρまたは R、X は、 Rまたは K 、 Κ

02 、X は

03 、 Ηまたは Rである）

01

に対して、 C末端に Rを付加している、

R-X -X -X -K-Q-G-E-P-D-G-P-K-E-K-P-R-R

01 02 03

(X は、 Ρまたは R、X は、 Rまたは K、X は、 Κ、 Ηまたは Rである）

01 02 03

を挙げることができる。あるいは、 Αの部分に含まれる前記第二の部分アミノ酸配列 に代えて、 VEGF-A 中に存在する C末端の 5アミノ酸残基 (Asp¹⁶¹— Arg¹⁶⁵) : D

165

_K一 P_R_Rに対応させて、前記 K一 E— K_P_R_Rを、 K一 D— K一 P—R— Rへと変換 した、

R-X -X -X -K-Q-G-E-P-D-G-P-K-D-K-P-R-R

01 02 03

(X は、 Pまたは R、X は、 Rまたは K、X は、 Κ、 Ηまたは Rである）

01 02 03

のようなアミノ酸配列を有するものとすることもできる。

[0055] 更には、第一の部分アミノ酸配列部分としては、 Xとして Rを選択する、 R— P—R— R 一 K_Q_Gを用いることがより好ましレ、。

[0056] なお、上記リンカ一配列、例えば、 5アミノ酸残基からリンカー配歹 IJ：一 X -X -X -X

1 2 3

-X -部分の役割は、第一の部分アミノ酸配列部分に対して、第二の部分アミノ酸配

4 5

列部分を連結し、第一の部分アミノ酸配列部分が主体となるへパリン結合性に対して 、第二の部分アミノ酸配列部分とへパリン間の弱い相互作用の寄与を付加することを 目的とするものである。従って、投与対象の体内に存在する、プロテアーゼ、ぺプチ ダーゼの作用によって、かかるリンカ一配列：一 X -X -X -X -X一部分の切断がな

1 2 3 4 5

されないものを利用することができる。カロえて、 L体アミノ酸からなるリンカ一配列に代 えて、 D体アミノ酸からなるリンカ一配列を利用することで、体内のプロテアーゼによる 消化を抑制することも可能である。また、種々のペプチド試薬において利用される、 ペプチド結合のミミック構造を力かるリンカ一配列部分に利用することで、体内のプロ テアーゼによる消化を抑制することも可能である。但し、このリンカ一配列内で切断を 受けた場合にも、第一の部分アミノ酸配列部分自体の切断が成されない限り、へパリ ン結合性を保持する第一の部分アミノ酸配列部分側断片を副生するので、特には、 問題とはならない。

[0057] 一般に、ペプチド化合物の体内分解を防止する上では、 N末端ならびに C末端に 余剰のアミノ酸を付加する、あるいは、修飾を施す手法が有効である。例えば、 N末 端のアミノ基に種々のァシル基修飾を施す、あるいは、 C末端のカルボキシ基をアミド 化することもできる。本発明の第二の形態にかかるへパリン結合能を有するペプチド も、化学的合成手法を利用して作製することが可能であるので、例えば、固相合成法 を利用して、 C末端側からペプチド鎖の延長を行う際には、樹脂上に固定される C末 端のアミド化を行うと、合成上も好適である。また、前記リンカー配歹 ij : X -X -X -X

1 2 3 X -部分などは、天然のアミノ酸に代えて、人工のアミノ酸を含むものとすることが

4 5

できる。人工のアミノ酸を利用することで、ペプチド鎖の酵素的切断を抑制するものに 、該リンカー配歹 [Jを設計することも可能である。

[0058] すなわち、本発明の第二の形態に力かるへパリン結合能を有するペプチドでは、前 記改変された第一の部分アミノ酸配列以外のペプチド鎖部分は、上述する本発明の 第一の形態に力、かるへパリン結合能を有するペプチドにおいて説明した、様々な変 異、修飾、改変を同様に利用する態様とすることも可能である。

[0059] 本発明に力かる新規なへパリン結合能を有するペプチドは、 VEGF— A の KDR

165 への結合により誘起される血管新生促進作用の発揮に必要な、 VEGF-A と血管

165 内皮細胞表面上のへパリンとの間の結合を、競争的に阻害する作用を有し、抗 VEG F-A 剤として利用可能であり、例えば、固形腫瘍の増殖や転移、糖尿病性網膜症

165

、未熟児網膜症、乾癬など、種々の疾患の要因となる、 VEGF-A に起因する血

165

管新生促進の抑制を目的とする治療薬、予防薬の用途に、適用可能である。

[0060] これら内因性の血管内皮増殖因子 VEGF— A に起因する血管新生促進の抑制

165

を目的とする治療用途では、本発明にかかるへパリン結合能を有するペプチドは、血 流中に直接投与し、作用部位の血管内皮細胞表面へ供給する形態での投与が適し ており、通常、静脈内投与に適する剤形の医薬組成物に調製することが好ましい。具 体的には、種々の生理活性を有するペプチド製剤の静脈内投与に利用されている 剤形、例えば、静脈注射剤、点滴剤などの剤形とされ、各単位投与用量は、その治 療用途に応じて、適宜決定される。また、投与対象（患者）の状況、症状の重篤さ、性 別、年齢、体重、その他の健康状態などを考慮して、その推定される総血液量にお いて、所望の生理活性が発揮される血中濃度となるように、投与用量を設定すること が好ましい。なお、本発明にかかるへパリン結合能を有するペプチドを静脈注射剤の 剤形で利用する際には、通常、複数回に分けて投与することも可能であるが、合計さ れる用量は、 1一 100mg/kg体重の範囲、好ましくは、 3— 50mg/kg体重の範囲 に設定することが望ましい。例えば、総血液量を考慮した上で、投与直後の投与量 が均一に分散すると仮定した際、その平均血中濃度が、 0. 1 μ M ΙΟ μ Μの範囲 、好ましくは、 1 /i M— 3 /i Mの範囲に投与総量を設定することが望ましい。

[0061] また、適用される器官部位が特定される、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症に対す る、 VEGF-A に起因する血管新生促進の抑制を目的とする治療薬、予防薬とし

165

ては、点眼薬の剤形に調製することも可能である。この投与対象者に対して、その眼 球または眼窩への適用に適する、薬学的に許容される液性担体中に、へパリン結合 能を有するペプチドの有効量を溶解した点眼薬の剤形では、通常、液中濃度を、 0. l μ M—10 μ Mの範囲、好ましくは、 1 μ Μ 3 μ Μの範囲に設定することが望まし レ、。

実施例

[0062] 以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。ここに示す具体例は 、本発明に力かる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら具体例 に限定されるものではない。

[0063] 実施例 1

(ペプチド合成と精製）

へビ毒由来の血管内皮増殖因子 VEGF様タンパク質; vamminならびに VR— 1の アミノ酸配列を参照して、そのへパリン結合性に関与すると想定される、 vamminの C 末端部分アミノ酸配列 (Arg⁹⁴— Arg¹¹⁽⁾)あるいは VR - 1の C末端部分アミノ酸配列 ( Arg⁹，一 Arg^1Q9)に基づき、下記表 1に示す peptide 1— peptide 6の 6種のぺプチ ドを設計した。

[0064] 設計されたアミノ酸配列に基づき、各ペプチドは、ペプチドシンセサイザー（Applie d Biosystems, モデル 431A)を用いて、 F_moc法による固相合成法により調製 した。常法に従って、合成ペプチドは、脱保護ならびに、 F-mocタリーべッジ法よる 基材レジンから分離、溶出し、回収される粗ペプチドを凍結乾燥した。

[0065] 粗ペプチドの精製は、 AKTAexplorer 10S (Amersham Biosciences)ならび に HPLCシステム（日本分光）を利用して行った。なお、カラム溶出画分におけるぺ プチドの検出は、 240nmの吸光度測定により行った。

[0066] 得られた粗ペプチド 40mgを、 10mLの 50mM Tris-HCl pH8. 0に溶解後、 Hi Trap Heparin HPカフム カフム谷量 lOmL、 Amersham Biosciencesノ ίこアノ。 ライした。該へパリン'ァフィ二ティカラムより、流速 lmL/minで、 5カラム容量、 1 · 0 M NaClまでの直線勾配で溶出を行った。

[0067] 前記へパリンに対する結合性を示すペプチド画分をプール、回収した後、 Cosmos il 5〇18ΑΚ_300 (2αη φ X 25cm (L) ) こアプライし、ァセトニトリノレ 0^ο/ο一 30% の線形勾配で溶出し、所望のアミノ酸数を有するペプチド画分を単離した。精製ぺプ チドは凍結乾燥し、アミノ酸シーケンサ一によりアミノ酸配列を確認した後、アミノ酸分 析法によって、ペプチド濃度を定量した。

[0068] (アミノ酸配列分析）

前記精製済みのペプチドのアミノ酸配列確認は、プロテイン 'シークェンサ一 (Appl ied Biosystems models 473A, 477、 Shimadzu モデル PPSQ—21A) を用いて行った。

[0069] (へパリン結合性の評価）

精製済みペプチド（100 /i g)を、 10mLの 50mM Tris— HC1 ρΗ8· 0に溶解後、 Hi Trap Heparin HPカフム (刀フム容直 10mL、 Amersham Biosciences) ίこ プライした。その後、流速 lmL/minで、前記緩衝液を 5カラム容量流し、引き続き、 10カラム容量、 1. OM NaCほでの直線勾配で溶出を行い、溶出条件（NaCl濃度） を測定した。

[0070] 図 1に、各ペプチドについて、へパリンに対する結合性を示すペプチド画分の溶出 ピーク位置 (太線部）を示す。また、表 1に、そのピーク極大点における溶出 NaCl濃 度をまとめて示す。

[0071] [表 1]

表 1

各種べプチドのへパリン結合特性

ペプチド アミノ酸配列 NaCl (M)による溶出条件

Peptide 1 G R P R R K Q G E P D G P K E K P R G 0.36

Ί 9残基

Peptide 2 G R P R R K Q G E 0.34

9残基

Peptide 3 G P D G P K E K P R G <0.1 (素通り）

1 1残基

Peptide 4 R P R R K Q G E P D G P K E K P R G 0.37

1 8残基

Peptide 5 R P R K Q G E P D G P K E - P R G 0.25

1 7残基

Peptide 6 R P R R K Q G E P D G P K E K P R R 0.40

1 8残基

[0072] また、へビ毒由来の血管内皮増殖因子 VEGF様タンパク質; vamminならびに VR _1に関しても、同様に前記へパリン'ァフィ二ティカラムから溶出されるタンパク質画 分のピーク極大点における溶出 NaCl濃度を測定した結果を表 2にしめす。

[0073] [表 2]

表 2

V a mm i nならびに VR— 1のへパリン結合特性

タンパク質 C末端領域のアミノ酸配列 NaCl (M)による溶出条件

V a mm i n R P R R K Q G E P D G P K E K P R 0.33

VR- 1 R P R * K Q G E P D G P K E - P R 0.16

[0074] (in vitroにおける VEGF— A による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻

165

害能評価）

上記のへパリン結合能を有するペプチドが、 VEGF— A による血管内皮細胞の増

165

殖促進作用を抑制することを、下記する in vitroの評価系において検証した。同時 に、 vamminによる血管内皮細胞の増殖促進作用を抑制することも、併せて検証した

[0075] ゥシ大動脈内皮細胞（BAEC)の細胞懸濁液を、 5， 000個/ゥエルの密度で、 96 ゥエルの細胞培養プレートに播種した。ゥエル中の細胞の接着後、 0.1。/₀ゥシ胎児 血清を添加した培地に交換し、延べ 18時間培養した。その時点で、培地に、血管内 皮増殖因子タンパク質の VEGF— A あるいは vamminを最終濃度 1 nM、ならび

165

に peptide 1を、それぞれ、所定の最終濃度で添加した。その後、 6日間培養を継 続した後、各ゥエル中の細胞数について、 Tetra Color One (生化学工業）を用い て、 WST— 8法により生存細胞数密度を評価した。

[0076] WST— 8法における、発色の吸収係数 A を、生存細胞数の指標とした。図 3

405-630

に、同じプレート上において併行して評価された、

左側：血管内皮増殖因子タンパク質ならびに peptide 1を添加していないゥエル（陰 性対照：白色カラム）、

中央： vamminに加えて、 peptide 1を最終濃度 100 μ M (濃い灰色カラム：中央の 右）、 30 μ Μ (薄レ、灰色カラム：中央の中）、 0 μ Μ (無添加：陽性対照；黒色カラム： 中央の左）添加したゥエル、

右側： VEGF-A に加えて、 peptide 1を最終濃度 100 μ M (濃い灰色カラム：中

165

央の右）、 30 μ Μ (薄レ、灰色カラム：中央の中）、 0 μ Μ (無添加：陽性対照；黒色カラ ム：中央の左）添加したゥエル、

における測定結果を示す。

[0077] 図 3に示す結果を比較すると、添加される VEGF— Α ならびに vamminは血管内

165

皮細胞の増殖促進作用をしているが、 peptide 1の共存下においては、その添加濃 度依存的に、その細胞の増殖促進作用が抑制を受けている。従って、へパリン結合 能を有する peptide 1は、 BAEC細胞表面に存在するへパリンに対して結合するこ とで、 VEGF— A ならびに vamminが血管内皮細胞の増殖促進作用を発揮する上

165

で必要な、 KDRへの結合とへパリンとの結合のうち、へパリンとの結合を競争的に阻 害する結果、 VEGF - A ならびに vamminが示す血管内皮細胞の増殖促進作用

165

を抑制していると判断される。

[0078] (in vivoにおける VEGF— A による血圧降下作用に対する阻害能評価）

165

上記のへパリン結合能を有するペプチドが、 VEGF— A による血圧降下作用を抑

165

制することを、下記する in vivoの評価系において検証した。同時に、 vamminによ る血圧降下作用を抑制することも、併せて検証した。

[0079] VEGF-A あるいは vamminによる血圧降下能の測定は、ォスの Wistar rat (

165

各群個体数 n = 3または 5， 150-220 g)を使用して行った。各個体について、 力ルバミン酸ェチルエステル（1 g/kg)の腹膜注射による麻酔後、 25% MgSO

4 で満たしたポリエチレンチューブを頸動脈に揷入し、圧力トランスデューサー（モデル P10EZ, Becton Dickinson)に接続して、頸動脈圧をモニターした。圧カトラン スデューサ一で測定される頸動脈圧は、アンプ (model AP—621日本光電）につな がれたレコーダーで記録した。

[0080] 各被験個体に対して、生理食塩水（600 z L)注射により血圧が安定していること を確認後、へパリン結合能を有するペプチド（600 μ L)、ならびに、 VEGF-A ま

165 たは vammin (600 μ L)を左大腿静脈から投与した。

[0081] 図 4の Aは、上： vammin (用量 0. 1 μ g/g)のみを投与した際、

下： peptide 1 (用量 3 x g/g)を予め投与後、 vammin (用量 0. l x g/g)を投 与した際における、頸動脈圧の低下量を示し、

図 4の Bは、上: VEGF—A (用量 0. 1 x gZg)のみを投与した際、

165

中： peptide 1 (用量 3 x g/g)を予め投与後、 VEGF—A (用量 0. 1 μ gZg)

165

を投与した際、

下： peptide 1 (用量 30 i g/g)を予め投与後、 VEGF—A (用量 0. 1 /i g/g

165

)を投与した際における、頸動脈圧の低下量を示している。

[0082] 図 4に示す結果を比較すると、投与される VEGF— A ならびに vamminは血圧降

165

下を誘起している力 peptide 1の共存下においては、その添加濃度依存的に、そ の血圧降下の誘起作用が抑制を受けている。なお、ここで評価される VEGF— A な

165 らびに vamminが示す血圧降下作用は、 VEGFタンパク質の KDRへの結合により 誘起される、一酸化窒素（NO)依存性の強力な血圧降下活性に基づくものであり、 従って、へパリン結合能を有する peptide 1は、 KDRを発現している細胞表面に存 在するへパリンに対して結合することで、 VEGF— A ならびに vamminが血圧降下

165

作用を発揮する上で必要な、 KDRへの結合とへパリンとの結合のうち、へパリンとの 結合を競争的に阻害する結果、 VEGF— A ならびに vamminによる血圧降下作用

165

を抑制していると判断される。

[0083] 上記の R_P_R_X_K_Q_G_X -X—X—X—X _K_E_K_P_Rのアミノ酸配列

1 2 3 4 5

を含む、本発明にかかるへノ^ン結合能を有するペプチドにおいて、特に、 R-P-R _X_K_Q_G (Xは、 R, W, H, Kのいずれ力、）の部分のみによって、 VEGF—A な

165 らびに vamminが血圧降下作用を発揮する上で必要な、 KDRへの結合とへパリンと の結合のうち、へパリンとの結合を競争的に阻害する結果、 VEGF-A ならびに va

165

mminによる血圧降下作用を抑制する効果が達成されることの検証も行った。

[0084] 具体的には、 peptide 1にカロ; て、 peptide 1の N末領域に相当する peptide 2 、ならびに C末領域に相当する peptide 3について、 VEGF— A による血圧降下

165

作用を抑制する効果の有無について、前記の in vivo評価系で併行して評価した。

[0085] 図 5中、 A:VEGF-A (用量 0. 1 μ gZg)のみを投与した際（陽性対照）、

165

B : peptide 1 (用量 30 g/g)を予め投与後、 VEGF—A (用量 0. 1 ^ gZg)

165

を投与した際、

C : peptide 2 (用量 30 ^ g/g)を予め投与後、 VEGF—A (用量 0. 1 gZg)

165

を投与した際、

D : peptide 3 (用量 30 μ g/g)を予め投与後、 VEGF—A (用量 0. 1 μ gZg)

165

を投与した際における、頸動脈圧の低下量をそれぞれ示してレ、る。

[0086] 図 5に示す結果を比較すると、投与される VEGF— A が誘起している血圧降下作

165

用に対して、事前に投与される peptide 1および peptide 2は、その血圧降下作用 を抑制する効果を示している力 peptide 3に関しては、抑制効果は観測されてい なレ、。従って、へパリン結合能を有する peptide 1および peptide 2は、 KDRを発 現している細胞表面に存在するへパリンに対して結合することで、 VEGF— A が血

165 圧降下作用を発揮する上で必要な、 KDRへの結合とへパリンとの結合のうち、へパ リンとの結合を競争的に阻害する結果、 VEGF— A による血圧降下作用を抑制し

165

ていると判断される。一方、 peptide 3は、へパリン結合能を示さず、そのため、抑制 効果は観測されてレ、なレ、と判断される。

[0087] 結論として、上記の R_P_R_X_K_Q_G_X -X -X -X -X _K_E_K_P_Rの

1 2 3 4 5

アミノ酸配列を含む、本発明にかかるへパリン結合能を有するペプチドにおいて、特 に、 R_P_R_X_K_Q_G (Xは、 R, W, H, Kのいずれ力 の部分が、へパリン結合 能を支配する部位であると判断される。加えて、該 R-P-R-X-K-Q—G (Xは、 R, W, H, Kのいずれ力 の部分を利用することで、 in vivoにおいても、 KDRを発現し ている細胞表面に存在するへパリンに対して結合することで、 VEGF— A が種々の

165 生理的活性、作用を発揮する上で必要な、 KDRへの結合とへパリンとの結合のうち 、 へパリンとの結合を競争的に阻害する結果、 VEGF-A による生理的活性、作用

165

を抑制していると判断される。

[0088] 参考例 1

本例では、 VEGF-A ならびに vamminが血管内皮細胞の増殖促進作用を発揮

165

する上で必要な、 KDRへの結合とへパリンとの結合のうち、血管内皮細胞表面上の へパリンとの結合を阻害することで、 VEGF-A ならびに vamminが示す血管内皮

165

細胞の増殖促進作用が抑制されることを検証した。

[0089] (in vitroにおける VEGF— A または vamminによる血管内皮細胞の増殖促進

165

作用に対する、未分画へパリンの阻害能評価）

上述するように、 VEGF-A ならびに vamminは、遊離型へパリンとの結合能を示

165

すので、予め、 VEGF— A ならびに vamminに対して、遊離型へパリンを結合させ

165

ると、結果的に、血管内皮細胞表面上のへパリンとの結合を阻害することが可能とな る。

[0090] VEGF— A ならびに vamminとの結合能を示す未分画へパリンは、 VEGF— A

165 165 または vamminによる血管内皮細胞の増殖促進作用を抑制する効果を示すことを、 下記する in vitroの評価系におレ、て検証した。

[0091] ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC)の細胞懸濁液を、 5, 000個/ゥエルの密度で、 コラーゲンコートした 96ゥエルの細胞培養プレートに播種した。播種後、 6時間培養 し、ゥエル中の細胞の接着を行った後、 1 %ヒト血清を添加した培地に交換し、一夜（ 延べ 18時間）培養した。その時点で、培地に、血管内皮増殖因子タンパク質の VEG F-A または vamminを最終濃度 1 nM、ならびに、未分画へパリンを所定の最終

165

濃度で添加した。その後、 3日間培養を継続した後、各ゥエル中の細胞数について、 Tetra Color One (生化学工業）を用いて、 WST— 8法により生存細胞数密度を評 価した。

[0092] WST— 8法における、発色の吸収係数 A を、生存細胞数の指標とした。 VEG

405-630

F-A または vammin、ならびに未分画へパリンを添加しない状態で、前記 1%血

165

清添加培地において培養した際の生存細胞数を、陰性対照（unstimulated)、未分 画へパリンを添加せず、 VEGF— A または vamminのみが添加されている状態で、

165 前記 1 %血清添加培地にぉレ、て培養した際の生存細胞数を、陽性対照（stimulate d)とし、評価された生存細胞数に基づき、増殖促進に対する抑制効果を見積もる。

[0093] 図 7は、培地中に共添加される未分画へパリンと、 VEGF— A ならびに vamminと

165

の結合に起因する、 VEGF-A または vammin刺激による血管内皮細胞増殖作用

165

の抑制効果を示す。血清添加培養条件において、種々の濃度の未分画へパリンと、 VEGF-A または vammin (最終濃度 InM)を添カ卩し、 3日間培養後の生存細胞

165

数を評価した。黒丸き： vammin、白丸〇： VEGF— A 刺激による血管内皮細胞の

165

増殖促進時、培地中に未分画へパリンを各濃度で共添加した際における、 WST-8 法における、発色の吸収係数 A (生存細胞数）を示す。

405-630

[0094] 培地中に添加される未分画へパリンの濃度に依存して、 VEGF— A または vamm

165

in刺激による血管内皮細胞増殖作用は抑制を受けている。すなわち、 VEGF— A

165 または vamminに予め未分画へパリンを結合させておくと、血管内皮細胞の増殖促 進作用を発揮する上で必要な、 KDRへの結合とへパリンとの結合のうち、血管内皮 細胞表面上のへパリンとの結合が阻害を受け、結果として、 KDRへの結合は生じる ものの、 VEGF— A または vamminによる血管内皮細胞増殖作用は発揮されてい

165

ない。

[0095] 以上の結果は、 VEGF— A または vammin刺激による血管内皮細胞増殖作用の

165

発揮は、 VEGF— A または vamminと、血管内皮細胞表面上のへパリンとの結合を

165

阻害することで、抑制可能であることを査証している。

[0096] 実施例 2

更に、前記の peptide 6： R— P - R— R— K— Q - G_E_P_D_G_P_K— E - K— P— R 一 Rに基づき、その第一の部分アミノ酸配列部分に相当する R— P_R_R_K_Q_G部 分に改変を施し、下記表 3に示す peptide 7、 peptide 8の 2種のペプチドを設計し た。加えて、へパリン結合性を有する Tissue factor pathway inhibitor (TFPI) 蛋白質中の部分アミノ酸配列（Lys²⁵⁴— Lys²⁶⁵)に相当する peptide 9を、対照へパ リン結合性ペプチドとして設計した。

[0097] (へパリン結合性の評価）

実施例 1に記載する (ペプチド合成と精製）と (アミノ酸配列分析)の手順に従って、 peptide 7、 peptide 8、ならびに peptide 9の 3種のペプチドの精製済み評品を 作製した。

[0098] 次いで、実施例 1に記載する（へパリン結合性の評価）の手法に従って、 HiTrap Heparin HPカラム上に結合した精製済みペプチドに対する、溶出条件 (NaCl濃 度）を測定した。

[0099] 表 3に、前記三種のペプチドについて、溶出ピークのピーク極大点における溶出 N aCl濃度の測定結果をまとめて示す。

[0100] [表 3]

表 3

—各種べプチドのへパリン結合特性 ―

ペプチド ァミノ酸配列 NaCl (M)による溶出条件

Peptide 7 ~ R P K K K Q G E P D G P K E K P R R 0.36

1 8残基

Peptide 8 R P H K Q G E P D G P K E K P R R 0.52

1 8残基

Peptide 9 K T R K R K K Q R V K 0.73

1 2残基

[0101] (in vitroにおける VEGF— A による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻

165

害能評価）

上記のへパリン結合能を有するペプチドが、 VEGF-A による血管内皮細胞の増

165

殖促進作用を抑制することを、下記する in vitroの評価系において検証した。

[0102] ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC)の細胞懸濁液を、 5, 000個/ゥエルの密度で、 コラーゲンコートした 96ゥエルの細胞培養プレートに播種した。播種後、 6時間培養 し、ゥエル中の細胞の接着を行った後、 1%ヒト血清を添加した培地に交換し、一夜（ 延べ 18時間）培養した。その時点で、培地に、血管内皮増殖因子タンパク質の VEG F-A を最終濃度 1 nM、ならびに各ペプチドを、それぞれ、所定の最終濃度で添

165

加した。その後、 3日間培養を継続した後、各ゥエル中の細胞数について、 Tetra C olor One (生化学工業）を用いて、 WST— 8法により生存細胞数密度を評価した。

[0103] WST— 8法における、発色の吸収係数 A を、生存細胞数の指標とした。 VEG

405-630

F-A 、ならびに被験ペプチドを共に添加しなレ、状態で、前記 1 %血清添加培地に

165

おいて培養した際の生存細胞数を、陰性対照：増殖促進 0%、被験ペプチドを添カロ せず、 VEGF— A のみが添加されている状態で、前記 1%血清添加培地において 培養した際の生存細胞数を、陽性対照：増殖促進 100%とし、評価された生存細胞 数に基づき、増殖促進率を算出した。

[0104] 図 8に、 peptide 1、 peptide 2、 peptide 3の各ペプチド力 S示す、 VEGF—A

165 による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価結果を示す。血清添加培 養条件において、 VEGF-A (最終濃度 InM)の添カ卩によるヒト臍帯静脈内皮細胞

165

の増殖促進に対する、共添加する各ペプチドによる抑制効果を、 3日間培養後の生 存細胞数によって評価した。

[0105] なお、培地内に添加されている血清中には、若干量の VEGFが元々含有されてお り、 VEGF-A による血管内皮細胞の増殖促進作用を完全に阻害する条件では、

165

この血清由来の VEGFに起因する増殖促進作用も同様に阻害される。従って、 VE GF-A による血管内皮細胞の増殖促進作用が完全に阻害されている場合、見か

165

け上、増殖促進率は負の値を示す。一般には、「増殖促進率が負の値を示す」場合 には、被験化合物 (ペプチド）は、対象細胞に対する「細胞毒性」を示すと推断される 。し力しながら、この血清添加培養条件を利用する評価系では、この図に示される程 度の「負の増殖促進率」は、「細胞毒性」を意味しない点は、予め、血清添加量を 0. 1 %以下に抑えた低濃度血清添加培地による培養時の生存細胞数を測定することで 確認される。

[0106] 図 8中、黒丸拿で示す、 peptide 1の添加濃度依存性は、 VEGF— A による血

165 管内皮細胞の増殖促進作用に対する濃度依存的な阻害活性を示している。一方、 P eptide 1と比較して、へパリン結合能が劣る、白丸〇：peptide 2、黒三角 A : pept ide 3を添加した際には、そのへパリン結合能の差違を反映して、 50%阻害を達成 できる添加濃度（ED )は高濃度となっている。従って、 peptide 1、 peptide 2、 p

50

eptide 3の各ペプチドは、いずれも、血管内皮細胞表面上の KDRへの結合とへパ リンとの結合のうち、へパリンとの結合を競争的に阻害する結果、 VEGF— A が示

165 す血管内皮細胞の増殖促進作用を抑制していると判断される。また、 50。/o阻害添加 濃度（ED )の差違は、 peptide 1、 peptide 2、 peptide 3の各ペプチドが示す、

50

血管内皮細胞表面上のへパリンとの結合能の差違に起因することも確認される。

[0107] 市販のへパリン親和性カラムに利用される遊離型へパリンに対しては、 peptide 9 (TFPI²⁵⁴—²⁶⁵)は、 peptide 1と同等の結合能を有するものの、 peptide 1は、血管 内皮細胞表面上のへノ^ンに対して特異的な結合能を有するが、一方、 peptide 9 (TFPI²⁵⁴— ²⁶⁵)は、血管内皮細胞表面上のへパリンに対して、特異的な結合能を示さ ないことを、以下の評価法によって検証した。

前記の in vitroにおける VEGF— A による血管内皮細胞の増殖促進作用に対

165

する阻害能評価系において、 peptide 9 (TFPI^254-265)の示す阻害活性と、 peptide 1の示す阻害活性とを対比評価した。

[0108] 図 9は、 peptide 1と peptide 9 (TFPI^{254 265})の各ペプチドが示す、 VEGF—A

165 刺激によるヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価結果を示す

。血清添加培養条件にぉレ、て、 VEGF-A (最終濃度 InM)の添加によるヒト臍帯

165

静脈内皮細胞の増殖促進に対する、共添加する各ペプチドによる抑制を、 3日間培 養後の細胞数によって評価した。黒色： peptide 1、灰色： peptide 9 (TFPI²⁵⁴— ²⁶⁵ )を、各濃度添加した際における、増殖促進率を示す。

peptide 1は、濃度依存的に VEGF— A 刺激によるヒト臍帯静脈内皮細胞の増

165

殖を抑制してレ、るが、 peptide 9 (TFPI²⁵⁴"²⁶⁵)は、僅かな抑制効果を示すのみであ る。

[0109] すなわち、 peptide 1は、血管内皮細胞表面上のへパリンに対して、特異的な結 合能を有するため、血管内皮細胞表面上の KDRへの結合とへパリンとの結合のうち 、へパリンとの結合を競争的に阻害する結果、 VEGF - A が示す血管内皮細胞の

165

増殖促進作用を効果的に抑制している。一方、 peptide 9 (TFPI^254-265)は、血管 内皮細胞表面上のへパリンに対して、特異的な結合能を有していないため、同じ添 加濃度では、血管内皮細胞表面上のへパリンの一部と結合するのみである。その場 合、 VEGF— A は、血管内皮細胞表面上の KDRへと結合した際、相当部分は、細

165

胞表面上のへパリンとの結合が可能であり、結果的に、 VEGF— A が示す血管内

165

皮細胞の増殖促進作用は、大部分が保持された状態を保つ。

[0110] 換言するならば、 peptide 1は、該 peptide 9 (TFPI²⁵⁴— ²⁶⁵)のアミノ酸配列を内 在している、 Tissue factor pathway inhibitor (TFPI)蛋白質と特異的に複合 体を形成し、血液凝固抑制作用を発揮する遊離型へパリン分子に対しては、特異性 を示さないと判断される。その起源によって、へパリン鎖の構造、硫酸化部位に相違 が存在するため、 peptide 1は、血管内皮細胞表面上に存在するプロテオダリカン 型のへパリン鎖に対して、特異的な結合能を有するが、他の起源のへパリンに対して は、特異的な結合能を具えていないと判断される。

[0111] 本実施例 2で作製した peptide 7、 peptide 8力 peptide 1と同様に、 VEGF_ A による血管内皮細胞の増殖促進作用を効果的に抑制することを、前記の in vit

165

roの評価系を利用して検証した。

[0112] 図 10は、 peptide 1、 peptide 7、 peptide 8の各ペプチド力示す、 VEGF— A

16 による血管内皮細胞の増殖促進作用に対する阻害能評価結果を示す。血清添カロ

5

培養条件において、 VEGF-A (最終濃度 InM)の添カ卩によるヒト臍帯静脈内皮細

165

胞の増殖促進に対する、共添加する各ペプチドによる抑制を、 3日間培養後の細胞 数によって評価した。黒丸 ·： peptide 1、白丸〇：peptide 7、黒三角▲： peptide 8を、各濃度添加した際における、増殖促進率を示す。 peptide 7、 peptide 8は , peptide 1と同様に、濃度依存的に VEGF-A 刺激によるヒト臍帯静脈内皮細

165

胞の増殖を抑制している。また、この三種のペプチドが示す阻害活性は、実質的に 差違を有してレ、なレ、ことも確認される。

[0113] なお、図 10に示す結果では、被験ペプチドの高添加濃度においては、見かけ上、

「増殖促進率が負の値を示している」が、培地内に添加されている血清中には、若干 量の VEGFが元々含有されており、この図に示される程度の「負の増殖促進率」は、

「細胞毒性」を意味しない点は、先に説明した通りである。

[0114] 実施例 3

上記のへパリン結合能を有するペプチドは、 VEGF-A による血管内皮細胞の

165

増殖促進作用を抑制するが、塩基性繊維芽細胞増殖因子 (bFGF)による血管内皮 細胞の増殖促進作用への抑制効果を示さないことを、下記する in vitroの評価系に おいて検証した。

[0115] ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC)の細胞懸濁液を、 5, 000個/ゥエルの密度で、 コラーゲンコートした 96ゥェルの細胞培養プレートに播種した。播種後、 6時間培養 し、ゥエル中の細胞の接着を行った後、 1 %ヒト血清を添加した培地に交換し、一夜（ 延べ 18時間）培養した。その時点で、培地に、 VEGF-A または bFGFを最終濃

165

度 1 nM、ならびに被験ペプチドを所定の最終濃度で添加した。その後、 3日間培 養を継続した後、各ゥエル中の細胞数について、 Tetra Color One (生化学工業） を用いて、 WST— 8法により生存細胞数密度を評価した。

[0116] WST— 8法における、発色の吸収係数 A を、生存細胞数の指標とした。 VEG

405-630

F-A または bFGF、ならびに被験ペプチドを添加しなレ、状態で、前記 1 %血清添

165

加培地において培養した際の生存細胞数を、陰性対照：増殖促進 0%、被験ぺプチ ドを添加せず、 VEGF-A または bFGFのみが添加されている状態で、前記 1%血

165

清添加培地にぉレ、て培養した際の生存細胞数を、陽性対照：増殖促進 100%とし、 評価された生存細胞数に基づき、増殖促進率を算出した。

[0117] 図 11は、培地中に共添加される peptide 1に因る、 VEGF-A または bFGF刺

165

激による血管内皮細胞増殖作用の抑制効果を示す。血清添加培養条件において、 種々の濃度の peptide 1と、 VEGF— A または bFGF (最終濃度 InM)を添加し、

165

3日間培養後の生存細胞数を評価した。黒丸 ·： VEGF-A 、白丸〇： bFGF刺激

165

による血管内皮細胞の増殖促進時、培地中に peptide 1を各濃度で共添加した際 における、増殖促進率を示す。

[0118] VEGF-A 刺激による血管内皮細胞増殖作用に対して、 peptide 1は添加濃度

165

依存的に抑制効果をしめすが、 bFGF刺激による血管内皮細胞増殖作用に対して は、見かけ上、僅かに抑制効果が示すのみであった。培地内に添加されている血清 中には、若干量の VEGFが元々含有されており、 peptide 1を添加すると、この血清 由来の VEGFに起因する血管内皮細胞増殖は抑制を受ける。そのため、 bFGF刺 激による血管内皮細胞増殖作用は、抑制を受けないが、全体の増殖促進率では、見 かけ上、僅かに抑制効果が観測される。また、上で説明した通り、 VEGF— A 刺激

165 による血管内皮細胞増殖を行う系では、 peptide 1を高濃度で添加する際、見かけ 上、「増殖促進率が負の値を示す」という評価結果となる。つまり、 bFGF刺激による 血管内皮細胞増殖を行う系において、 peptide 1を高濃度で添加する際、図 11に 示される程度、見かけ上「増殖促進率が若干低下する」状態は、 bFGF刺激による血 管内皮細胞増殖作用に対して、 peptide 1は高い添加濃度でも、全く抑制効果を示 していないと判断される。

[0119] 従って、以上の結果から、 peptide 1は、血管内皮細胞表面上に存在するプロテ ォグリカン型のへパリン鎖に対して、特異的な結合能を有し、特には、 VEGF-A

165 が血管内皮細胞増殖作用を発揮する上で必要な、血管内皮細胞表面上の KDRへ の結合とへパリンとの結合のうち、血管内皮細胞表面上のへパリンとの結合を競争的 に阻害すること、一方、 peptide 1あるレ、は VEGF— A が特異的に結合可能な、血

165

管内皮細胞表面上のへパリンは、 bFGF刺激による血管内皮細胞増殖の機構には、 直接的な関与をしていなことが判る。

産業上の利用可能性

[0120] 本発明にかかる新規なへパリン結合能を有するペプチドは、へビ毒由来の血管内 皮増殖因子 VEGF様タンパク質; vamminならびに VR— 1中のへパリン結合部位の アミノ酸配列に基づき設計された、 7— 20アミノ酸残基からなるペプチド化合物であり 、 VEGF— A の KDRへの結合に付随する、 VEGF— A と細胞表面上のへパリン

165 165

との間の結合を競争的に阻害する作用を有し、その結果、 VEGF— A の KDRへの

165

結合および細胞表面上のへパリンとの結合の双方を必要とする、血管新生促進作用 の発揮を抑制するペプチド性医薬として利用可能である。

Claims

請求の範囲

[1] vammin中のへパリン結合部位に由来する第一の部分アミノ酸配列：

R_P_R_X_K_Q— G (Xは、 R， W， H， Kのいずれ力、）を少なくとも含み、 7— 20アミノ酸残基からなる

ことを特徴とするへパリン結合能を有するペプチド。

[2] さらに、前記第一の部分アミノ酸配歹 IJ : R— P_R_X— K_Q_Gに加えて、

vammin中のへパリン結合部位に由来する第二の部分アミノ酸配列：

K— E— K— P— Rをも含み、

前記第一の部分アミノ酸配列の C末端に、前記第二の部分アミノ酸配列が、 4一 6 アミノ酸残基からリンカ一配列を介して連結されている

ことを特徴とする請求の範囲 第 1項に記載のへパリン結合能を有するペプチド。

[3] vammin中のへパリン結合部位に由来するアミノ酸配列：

R-P-R-R-K-Q-G-E-P-D-G-P-K-E-K-P-R

力 なるアミノ酸配歹 |J、または、その配列中に少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、 且つ前記第一の部分アミノ酸配列を保持してなる改変型アミノ酸配列を含むぺプチ ドである

ことを特徴とする請求の範囲 第 1項または第 2項に記載のへパリン結合能を有する ペプチド。

[4] vammin中のへパリン結合部位に由来する第一の部分アミノ酸配列：

R_P_R_X_K_Q— G (Xは、 R， W， H， Kのいずれ力、）を少なくとも含み、 A -R-P-R-X-K-Q-G-A

N C

(A、Aは、それぞれアミノ酸数 0— 13までのペプチド鎖から選択され、 A、Aのァ

N C N C

ミノ酸数の合計は、 13以下である）

力もなる、 7 20アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する

ことを特徴とする請求の範囲 第 1項に記載のへパリン結合能を有するペプチド。

[5] VEGF-A のへパリンに対する結合の競争的阻害剤であって、

165

該競争阻害活性成分は、請求の範囲 第 1項一第 4項のいずれか一項に記載のへ パリン結合能を有するペプチドである ことを特徴とする VEGF— A とへパリンとの結合に対する阻害剤。

165

[6] VEGF-A とへパリンとの結合に対する阻害剤としての用途を有する医薬組成物

165

であって、

前記阻害活性成分は、請求の範囲 第 1項一第 4項のいずれか一項に記載のへパ リン結合能を有するペプチドであり、

投与対象者の静脈内投与に適する、薬学的に許容される液性担体中に、前記へ パリン結合能を有するペプチドの有効量を溶解してなる

ことを特徴とする組成物。

[7] vammin中のへパリン結合部位に由来する、改変された第一の部分アミノ酸配列：

R-X -X -X -K-Q-G (X は、 Pまたは R、X は、 Rまたは K、 X は、 Κ、 Ηま

01 02 03 01 02 03 たは Rである）を少なくとも含み、

7— 20アミノ酸残基からなる

ことを特徴とするへパリン結合能を有するペプチド。

[8] さらに、前記改変された第一の部分アミノ酸配列: R— X -X -X -K-Q-G (X

01 02 03 01 は、 Pまたは R、 X は、 Rまたは K、 X は、 Κ

02 03 、 Ηまたは Rである）に加えて、

vammin中のへパリン結合部位に由来する第二の部分アミノ酸配列：

K— E— K— P— Rをも含み、

前記第一の部分アミノ酸配列の C末端に、前記第二の部分アミノ酸配列が、 4-6 アミノ酸残基からリンカ一配列を介して連結されている

ことを特徴とする請求の範囲 第 7項に記載のへパリン結合能を有するペプチド。

[9] 前記リンカ一配列として、 E_P_D_G_Pを選択してなる、

R-X -X -X -K-Q-G-E-P-D-G-P-K-E-K-P-R

01 02 03

(X は、 Pまたは R、X は、 Rまたは K、X は、 Κ、 Ηまたは Rである）からなるァミノ

01 02 03

酸配列、または、その配列中に少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、且つ前記改変 された第一の部分アミノ酸配列を保持してなる改変型アミノ酸配列を含むペプチドで ある

ことを特徴とする請求の範囲 第 8項に記載のへパリン結合能を有するペプチド。

[10] vammin中のへパリン結合部位に由来する、改変された第一の部分アミノ酸配列： R-X -X -X -K-Q-G (X は、 Pまたは R K

01 02 03 01 、X は、 Rまたは

02 、 X は、 K

03 、 Hま たは Rである）を少なくとも含み、

A -R-X -X -X -K-Q-G-A

Nl 01 02 03 CI

(A 、A は、それぞれアミノ酸数 0— 13までのペプチド鎖から選択され、 A

CI Nl、A

Nl CI のアミノ酸数の合計は、 13以下である）

力もなる、 7 20アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する

ことを特徴とする請求の範囲 第 7項に記載のへパリン結合能を有するペプチド。

[11] VEGF-A のへパリンに対する結合の競争的阻害剤であって、

165

該競争阻害活性成分は、請求の範囲 第 7項一第 10項のいずれか一項に記載の へパリン結合能を有するペプチドである

ことを特徴とする VEGF— A とへパリンとの結合に対する阻害剤。

165

[12] VEGF-A とへパリンとの結合に対する阻害剤としての用途を有する医薬組成物

165

であって、

前記阻害活性成分は、請求の範囲 第 7項一第 10項のいずれか一項に記載のへ パリン結合能を有するペプチドであり、

投与対象者の静脈内投与に適する、薬学的に許容される液性担体中に、前記へ パリン結合能を有するペプチドの有効量を溶解してなる

ことを特徴とする組成物。