WO2005076002A1

WO2005076002A1 - 抗体の測定方法

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Publication number: WO2005076002A1
Application number: PCT/JP2005/002103
Authority: WO
Inventors: Seizaburo Kashiwagi; Hiroshi Shiraki; Yasuko Sagara
Original assignee: Kyowa Medex Co Ltd
Current assignee: Minaris Medical Co Ltd
Priority date: 2004-02-06
Filing date: 2005-02-04
Publication date: 2005-08-18
Anticipated expiration: 2006-08-06
Also published as: JPWO2005076002A1

Abstract

ＨＴＬＶ−１関連疾患の発症ならびに無発症ＨＴＬＶ−１キャリアが重複感染したＨＴＬＶ−１以外の感染症の発症の有無を判定するための試薬が求められている。本発明により、抗ｇｐ４６−１９７抗体の測定方法ならびに測定試薬、ＨＴＬＶ−１関連疾患の発症、並びに無発症ＨＴＬＶ−１キャリアが重複感染したＨＴＬＶ−１以外の感染症の発症の有無を判定するための該試薬が提供される。また、本発明により抗ｇｐ４６−１９７抗体の測定試薬と公知のＨＴＬＶ−１に結合する抗体の測定試薬とを組み合わせてなる、ＨＴＬＶ−１関連疾患の発症ならびにＨＴＬＶ−１感染と、無発症ＨＴＬＶ−１キャリアが重複感染したＨＴＬＶ−１以外の感染症の発症の有無を判定するためのキットが提供される。さらに本発明は抗ｇｐ４６−１９７抗体の有無を検出するＨＴＬＶ−１関連疾患の診断薬および発症の有無の判定方法、並びに無発症ＨＴＬＶ−１キャリアが重複感染したＨＴＬＶ−１以外の感染症の診断薬および発症の有無の判定方法が提供される。また、本発明により抗ｇｐ４６−１９７抗体の測定に用いられる固相が提供される。

Description

明細書抗体の測定方法技術分野 ,

本発明は、ヒト Tリンパ球好性ウィルス 1 (以下、 HTLV— 1と記す）外被の糖蛋白質 gp46の Aspl 97— Leu216の領域に相当するペプチド（以下、 gp 46-197と記す）を用いることを特徴とする、 HTLV— 1関連疾患の発症の有無を判定するための、検体中の gp 46 - 197に結合する抗体（以下、抗 gp46 -197抗体と記す）の測定方法および測定試薬、並びに無発症 HTLV 一 1キヤリァが重複感染した H T L V— 1以外の感染症の発症の有無を判定するための、検体中の抗 gp 46- 197抗体の測定方法ならびに測定試薬に関する。また、本発明は抗 gp 46 - 197抗体の測定試薬と H T L V— 1に結合する抗体の測定試薬と含有する、 HTLV— 1関連疾患の発症の有無を判定するためのキット、並びに無発症 HTLV— 1キヤリアが重複感染した HTLV— 1以外の感染症の発症の有無を判定するためのキットに関する。さらに、本発明は検体中の抗 gp 46 - 197抗体を検出することを特徴とする、 HTLV— 1関連疾患の診断薬および疾患の有無の判定方法、並びに検体中の抗 gp 46一 197抗体を検出することを特徴とする、無発症 HTLV— 1キヤリアが重複感染した HTLV— 1以外の感染症の診断薬および疾患の有無の判定方法に関する。また、本発明は、 gp46 一 197が固定化され、 HSC 70を含まない物質によるブロッキングがなされた固相に関する。背景技術

ヒト T,リンパ球好性ゥィルス（以下、 HTLVと記す）は、レトロウイルスの 1 種であり、 1型と 2型の 2つの型が存在する。このうち、 HTLV— 1は、 1981 年に日沼らによって成人 T細胞白血病/リンパ腫（以下、 ATLLと記す）の原因ウイゾレスとして同定された [Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 78, 6476(1981)、 Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 79, 2031 (1982)、 Sciences, 219, 856(1983)]。ヒトにおける H T L V— 1感染は、主に母から子への垂直感染ならびに夫から妻への水平感染であるが、輸血による医原性感染も知られていた。輸血による医原性感染は、 1986年から開始された抗 HTLV— 1 (または 2)抗体を検査することにより防止された。輸血による医原性感染の疫学的研究から、 H TLV- 1感染は血球細胞成分が介在していることが知られている。

ゥィルス感染において、ゥィルスの標的となる血球細胞の受容体の認識おょぴゥ TJP2005/002103 ィルスと当該受容体との結合に関わる機能は、ウィルスの外被の糖蛋白質に備わつている。 HTLV— 1外被の蛋白質は、 6 lkD aの前駆体糖蛋白質として生合成され、細胞性プロテアーゼにより、 Me t 1— Ar g 312からなる N末端側の膜表在糖蛋白質 gp 46と、 Ala313— Leu488からなる C末端側の膜貫通糖蛋白質 g P 21に切断される。 gp46と gp21は非共有結合により複合体を形成し、 gp 21が gp 46のアンカー蛋白質となってウィルス表面に存在している。その後、 gp 46上の Ly s 111— Asp l 38に該当する領域、 gp 4 6上の Asp 197-Leu216に該当する領域および g p 21上の Cys 4 00-Leu429に該当する領域の 3領域が HT LV— 1感染に関与する領域 . であることが解明された [Journal of Virology, 70, 1564(1996)]。

HTLV— 1が関与する疾患（以下、 HTLV— 1関連疾患と記す）として、 A TLL以外に、 HTLV— 1関連脊髄症 (HAM/TSP)、ブドウ膜炎（HU) などが知られている。 HTLV— 1に感染すると、生体中に抗 HTLV— 1抗体が生成してくるので、抗 HTLV— 1抗体を測定することにより、 HTLV— 1の感染を知ることができる。抗 HTLV— 1抗体を測定する方法としては、免疫学的手法を用いた測定方法が知られており、ゼラチン粒子凝集法（PA法）、蛍光抗体法

(FA法）、間接蛍光抗体法（IF法）、酵素免疫法.（EL I S A法)'、ゥエスタンブロヅト法（WB法）などが知られている。 PA法は、操作が簡便で多数の検体を測定できるため、一次スクリーニングには PA法が用いられる。しかしながら、 P A法は血清中の抗体価が低いことによる偽陽性あるいは非特異反応などの問題があり、また、従来 ©EL I SA法においては、自己抗体による非特異反応などの問題がある。このような非特異反応は、抗体検出に用いる抗原が HTLV— 1感染細胞株の培養物由 *の単一ではない抗原を使用していることが原因と考えられている。単一の抗原を使用する EL I S A法としては、 gp 46上の P he 175から I 1 e 199の領域に相当するペプチド（以下、 gp46— 175と記す）を用いた酵素免疫学的測定法が報告されており [平成 2年度厚生省成人 T細胞白血病

(ATL) の母子感染防止に関する研究， ' 174]、該方法では、 HTLV— 1感染献血者の 90 %以上で g p 46— 175と反応する抗体が検出可能であるが、全ての H T L V— 1感染献血者から該抗体を検出できる方法ではない。

単独の方法での H TLV- 1感染の判定は確実ではなく、一次スクリーニングで陽性と判断された場合でも、： FA法、 WB法といった二次スクリーニングを行う必要がある。さらに当該被験者が HTLV— 1に感染しているという診断を最終的に下すためには、末梢血またはリンパ節細胞のリンパ球ゲノムに HTLV— 1プロウィルス DN Aが組み込まれていることをサザンプロヅト法あるいは P CR法を用いて遺伝子的に証明する必要がある。

現在のところ、 HTLV— 1関連疾患の発症の有無を判定する方法は、臨床的所見に因る方法が主に用いられている。リンパ球ゲノムに HTLV— 1プロウィルス DNAが組み込まれていることを検出する P C R法では、無発症の H T L V— 1キャリアと HTLV— 1関連疾患を発症した患者の電気永動での染色像が異なることから、 P C R法は H T L V— 1関連疾患の発症の有無を判定するための指標となる可能性があるが、 PC I法は煩雑な操作を伴う。

これまでにも、簡便な方法により、 H T L V— 1関連疾患発症の判定に使用できる因子は広く探索されたが、生体内ゥィルス量や家族内発症歴などで傍証が得られているのみで HTLV— 1関連疾患発症の判定に使用できる因子は同定されていない。

また、 HTLV— 1に感染した患者はウィルス感染症、カビによる感染症、カリ二原虫による肺炎、糞線虫症など、健康な人にはほとんどみられない特殊な日和見感染症を発症し易く、 H T L V— 1以外の感染症との重複感染の危険性が高くなる [Journal of Infectious Disease, 184， 1114(2001) ]。発明の闢示

本発明の目的は、' gp 46 -197を用いることを特徴とする、 HTLV—1関連疾患の発症の有無を判定するための、検体中の抗 gp 46- 197.抗体の測定方法および測定試薬、並びに無発症 HTLV— 1キャリアが重複感染した H T L V— 1以外の感染症の発症の有無を判定するための、検体中の抗 gp 46- 197抗体の測定方法ならびに測定試莱を提供することにある。また、本発明の目的は、抗 g p 46— 197抗体の測定試薬と HTLV— 1に結合する抗体の測定試薬と含有する、 HTLV— 1関連疾患の発症の有無を判定するためのキット、並びに無発症 H T L V— 1 'キヤリァが重複感染した H T L V— 1以外の感染症の発症の有無を判定するためのキトを提供することにある。さらに、本発明の目的は、検体中の抗 gp 46—197抗体を検出することを特徴とする、 HTLV— 1関連疾患の診断薬および発症の有無の判定方法、並びに検体中の抗 gp 46 - 197抗体を検出することを特徴とする、無発症 HTLV— 1キャリアが重複感染した HTLV— 1 以外の感染症の診断薬および発症の有無の判定方法を提供することにある。また、本発明の目的は、 g_P46— 197が固定化され、 HSC70を含まない物質によるブロッキングがなされた固相を提供することにある。本発明は、下記（1) 〜（27) に関する。

( 1)HTLV— 1外被の糖蛋白質 gp 46の Asp l 97— Leu216の領域に相当するぺプチド（以下、 gp46 - 197と記す）を用いることを特徴とする、 HTLV— 1関連疾患の発症の有無を判定するための、検体中の gp 46-197 に結合する抗体（以下、抗 gp 46— 197抗体と記す）の測定方法。 JP2005/002103

(2) gp46 - 197を用いることを特徴とする、無発症 HTLV— 1キヤリアが重複感染した H T L V— 1以外の感染症の発症の有無を判定するための、 f贪体中の抗 gp46— 197抗体の測定方法。

(3) HTLV— 1以外の感染症が、 C型肝炎ウィルス（以下、 HCVと記す）感染症である（2) に記載の方法。

(4) gp46- l 97が配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドまたは配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、付加または置換され、抗 gp46— 197抗体と結合できるぺプチドである（1)〜（3) のいずれか 1項に記載の方法。

(5)抗体の測定方法が免疫学的測定法である（1)〜（4)のいずれか 1項に記載の方法。

( 6 )免疫学的測定法が、 p 46 - 197が固定化された固相を用いる方法である（ 5 ) に記載の方法。

( 7 )免疫学的測定法が、 g p 46— 197が固定化され、 71 kD aの熱ショヅク類似蛋白質（以下、 HSC70と記す）を含まない物質によるプロヅキングがなされた固相を用いる方法である（5) または（6) に記載の方法。

(8) HSC 70を含まない物質が合成高分子である（7) に記載の方法。

(9)合成高分子が界面活性剤である（8) に記載の方法。

(10)免疫学的測定法が酵素免疫学的測定法（ELISA法）である（5)〜（9) のいずれか 1項に記載の方法。

(11)以下の工程を含むことを特徴とする、（10) に記載の測定方法。

(a) gp46- 197を担体に固定ィ匕させて 46 - 197が固定ィ匕された固相を作製する工程

(b)検体と固相上に固定化された gp 46 - 197とを反応させる工程（ 1次反応工程）

(c)固相上に固定化された gp 46— 197と該ペプチドに結合した抗 gp 46 - 197抗体とからなる複合体に、標識化二次抗体を反応させる工程（2次反応ェ程）

(d)固相上に固定ィ匕された gp 46— 197と該ペプチドに結合した抗 gp 46 - 197抗体とからなる複合体に結合した標識化二次抗体の標識量を測定するェ程

(e)抗 gp46— 197抗体を含有する標準物質を用いて作成した抗 gp46— 197抗体濃度と標識量との関係を表す検量線と、（d)で測定した測定値とから、検体中の抗 gp 46 - 197抗体濃度を決定する工程

(12) gp46 - 197を用いることを特徴とする、 HTLV— 1関連疾患の発症の有無を判定するための、検体中の抗 gp 46 - 197抗体の測定試薬。 (13) gp46- 197を用いることを特徴とする、無発症 HTLV— 1キヤリァが重複感染した H T L V— 1,以外の感染症の発症の有無を判定するための、検体中の抗 gp 46— 197抗体の測定試薬。

(14) HTLV-1以外の感染症が、 H C V感染症である（ 13 )に記載の試薬。

( 15) gp46- 197が配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドまたは配列番号 1に示されるァミノ酸配列において 1以上のァミノ酸が欠失、付加または置換され、抗 gp46 - 197抗体と結合できるペプチドである（12)〜

(14)のいずれか 1項に記載の試薬。

(16)抗体の測定法が免疫学的測定法である（ 12 )〜（ 15 )のいずれか 1項に記載の試薬。 '

(17)免疫学的測定法が、 g p 46— 197が固定化された固相を用いる方法である（16) に記載の試薬。

(18)免疫学的測定法が、 g p 46— 197が固定化され、 H S C 70を含まない物質によるブロッキングがなされた固相を用いる方法である（16)または（1 7) に記載の試薬。

(19) HSC70を含まない物質が合成高分子である（18) に記載の試薬。 (20)合成高分子が界面活性剤である（18) に記載の試薬。

(21)免疫学的測定法が酵素免疫学的測定法（E L I S A法）である（ 16 ) ~ (20) のいずれか 1項に言 3載の試薬。

(22)標準物質として、抗 gp 46— 197ヒト抗体を含む（ 12) 〜（21) のいずれか 1項に記載の抗体の測定試薬。

(23) HTLV— 1に結合する抗体の測定試薬と、（12)〜（22)のいずれか 1項に記載の試薬とを組み合わせてなる、 HTLV— 1関連疾患の発症の有無を判定するためのキット。

(24) HTLV— 1に結合する抗体の測定試薬と、（12)〜（22)のいずれか 1項に記載の試薬とを組み合わせてなる、無発症 HT LV— 1キヤリァが重複感染した HTLV— 1以外の感染症の発症の有無を判定するためのキヅト。

(25) HTLV— 1以外の感染症が、 HCV感染症である（24) に記載のキヅ

(26) HTLV— 1に結合する抗体が、 HTLV— 1外被の糖蛋白質 gp46の Phe 175-11 e 199の領域に相当するぺプチド（以下、 gp46— 175 と記す）に結合する抗体（以下、抗 gp 46— 175抗体と記す）である（23) 〜（25) のいずれか 1項に記載のキヅト。

(27) gp46 -175が配列番号 2に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたは、配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、付加または置換され、抗 gp 46—175抗体と結合できるペプチドである（26) に記載の試薬。 (28) gp46 - 197が固定化され、 HS C 70を含まない物質によるプロヅキングがなざれた固相。

(29) HSC70を含まない物質が合成高分子である（28) に記載の固相。 (30)合成高分子が界面活性剤である（29) に記載の固相。

(31)検体中の抗 gp46— 197抗体を検出することを特徴とする、 HTLV ― 1関連疾患の診断薬。

(32)検体中の抗 gp46— 197抗体を検出することを特徴とする、無発症 H TLV— 1キャリアが重複感染した HTLV— 1以外の感染症の診断薬。

(33) HTLV— 1以外の感染症が、 HCV感染症である（32)に記載の診断薬。

(34)検体中の抗 gp46— 197抗体を検出することを特徴とする、 HTLV 一 1関連疾患の発症の有無の判定方法。

(35)検体中の抗 gp46 - 197抗体を検出することを特徴とする、無発症 H TLV— 1キヤリアが重複感染した HTLV— 1以外の感染症の発症の有無の判定方法。

(36) HTLV— 1以外の感染症が、 HCV感染症である（35)に記載の判定, 方法 o 以下、本発明を詳細に説明する。.本願は、 2004年 2月 6日に出願された日本国特許出願 2004— 31431号の優先権を主張するものであり、当該特許出願の明細書及び図面に記載される内容を包含する。本^明は、 g_P46— 197を用いることを特徴とする、 HTLV— 1関連疾患の発症の有無を判定するための、検体中の抗 gp 46 - 197抗体の測定方法、並びに無発症 H T L V— 1キヤリァが重複感染した H T L V— 1以外の感染症の発症の有無を判定するための、検体中の抗 gp 46 - 197抗体の測定方法に関する。 gp46— 197は、 HTLV— 1外被の糖蛋白質 gp46の Asp l 97— L eu216に相当するペプチドであって、配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有する。

本発明において、配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 1以上のアミノ酸が欠失、付加または置換され、抗 gp 46— 197抗体と結合できる活性を有するペプチドも本発明の gp 46- 197に包含される。抗 gp 46 - 197抗体とは、 p 4 6-197に結合する抗体をいう。

欠失、付加または置換されるアミノ酸の数は 1個以上でありその数は特に限定ざれないが、モレキュラー 'クロ一ニング第 2版、：/レント 'プロ卜コールズ 'イン · モレキュラー 'バイオロジー、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79， 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids 2005/002103

Research, 13 , 4431 (1985 )、 Proc . Natl . Acad . Sci USA, 82 , 488 (1985 )など）に記載の部位特異的変異導入法などの周知の技術により、欠失、付加または置換できる程度の数であり、例えば、 1〜数十個、好ましくは 1〜2 0個、より好ましくは 1〜1 0個、さらに好ましくは 1〜5個である。

アミノ酸配列において 1以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換されたとは、同一配列中の任意かつ 1もしくは複数のァミノ酸配列中において、 1または複数のアミノ酸残基の欠失、付加または置換があることを意味し、欠失、付加まこは置換が同時に生じてもよく、欠失、付加または置換されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、 L-ァラニン、 L -ァスパラギン、 L-ァスパラギン酸、 L-グル夕ミシ、 L -グルタミン酸、グリシン、 L-ヒスチジン、 L- イソロイシン、 L-ロイシン、 L-リジン、 L-メチォニン、 L-フエ二ルァラニン、 L- . プロリン、 L-セリン、' L-スレオニン、 L-トリプトファン、 L-チロシン、 L-バリン、 L-システィンなどがあげられる。

以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。以下の同一群に含まれるァミノ酸残基は相互に置換可能である。

A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルパリン、ァラニン、 2-アミノブタン酸、メチォニン、 0-メチルセリン、 t-プチルグリシン、 t-プチルァラニン、シクロへキシルァラニン

, Β群：ァスパラギン酸グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2-アミノアジピン酸、 2-アミノスべリン酸

C群：ァスパラギン、グルタミン .

D群：リジン、アルギニン、オル二チン、 2, 4 -ジアミノブタン酸、 2，3-ジァミノプロビオン酸

Ε群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン

F群：セリン、スレオニン、ホモセリン

G群：フエ二ルァラニン、チロシン

本発明で用いられる g p 4 6— 1 9 7は、該ペプチドのアミノ酸配列をコードする cDNAを含む発現べクタ一を大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などに導入、発現させ、組換え型ペプチドとして取得することができる。あるいは、該配列を有する合成ペプチドを用いることもできる。

合成ぺプチドにはキヤリア蛋白質と架橋するために、システィンを末端に付加することもできる。また、合成べプチドは必要に応じペプチドの N末端はァセチル化、 C末端はアミド化する場合もある。

合成べプチドは一般的な液相、固相べプチド合成法およびそれらを適宜組み合わせる方法、またはそれらに準じる方法によって合成することができる（The

Peptides , Analysis , Synthesis , Biology, Vol . 1， 1979 ; Vol . 2 , 1980 ; Vol . 3 , 1981 , Academic Press ; ペプチド合成の基礎と実験、丸善、 1985 ; 続医薬品の開発、第 14巻、ペプチド合成、廣川書店、 1991; International Journal of Peptide & Protein Research, 35, 161-214, 1990) 。

また、合成べプチドは自動ぺプチド合成機を用いて合成できる。ぺプチド合成機によるべプチドの合成は、島津製作所製ぺプチド合成機、 AppliedBiosystems, Inc., 社（以下、 ABI社と表記する）製ペプチド合成機、 Advanced ChemTech Inc.社（以下、 ACT社と表記する）製ペプチド合成機などの市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護した No:- Fmoc-アミノ酸あるいは Να-Boc-アミノ酸などを用い、それそれの合成プログラムに従って実施することができる。

原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、 ABI社、島津製作所、国産化学 (株)、 NovaBiochem社、渡辺化学（株）、 ACT社またはペプチド研究所（株）などから入 '手することができる。また、原料となる保護アミノ酸、保護有機酸、保護有機アミンは報告されている合成法に従って、あるいはそれに準じて合成することができる (The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol.1, 1979; Vol.2, 1980; Vol. 3， 1981, Academic Press; ペプチド合成の基礎と実験、丸善、 1985；続医薬品の開発、第 14卷、ぺプチド合成、廣川書店、 1991; International Journal of Peptide & Protein Research, 35, 161-214, 1990) 。

抗 gp 46 - 197抗体は、 HTLV— 1関連疾患が発症した患者、並びに無発症 HTLV— 1キヤリァが重複感染した H T L V— 1以外の感染症が発症した患者に特異的に出現が認められるため、検体中の抗 gp 46 - 197抗体を測定す ¾ ことは HTLV— 1関連疾患の発症の有無の判定、並びに無発症 H T L V— 1キヤリァが重複感染した H T L V— 1以外の感染症の発症の有無を判定などに有効でめる。

本発明の検体としては、抗 gp '46— 197抗体を含む可能性がある被験者由来の生体試料であればいかなるものも使用することができる。例えば血液、血漿、血清、唾液、羊水、尿、汗、脬液、精液、母乳などが挙げられ、血漿、血清が好適に用いられる。

本発明の、検体中の抗 gp 46 - 197抗体の測定方法としては、 gp 64— 1 97を用いる測定法であればいかなる方法でもよいが、免疫学的測定法が好ましく用いられる。

免疫学的測定法としては、任意の公知の免疫学的測定方法があげられ、例えば、放射免疫測定法（R I A)、酵素免疫測定法 (E I Aまたは E L I S A)、蛍光免疫測定法 (F I A) 間接蛍光抗体法 (I nd i r e ct F luo r e s c en c e a s s a y)、発光免疫測定法 (L um i η e s c e η t immun o a s s ay)、物理化学的測定法（TIA、 LAP I A, PCIA) _N ウエスタンブロッティング法などがあげられるが、 EL I S A法が好ましく用いられる [単クロ —ン抗体実験マニュアル（講談社サイェンティフィック、 1987)、続生化学実験講座 5免疫生化学研究法（東京化学同人、 1986) ]。放射免疫測定法（R I A)で用いる標識体としては、生化学実験で一般的に用いられる放射性同位元素があげられる。例えば、 ^{1 4} C、 ^{3 2} P、 ^{1 2 5}ェなどがあげられる。

酵素免疫測定法で用いる標識体としては、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファ夕一ゼ標識、ペルォキシダーゼ標識、ルシフェラ一ゼ標識などを用いることができる。

蛍光免疫測定法または間接蛍光抗体法で用いる標識体としては、任意の公知（川生明著、蛍光抗体法、ソフトサイエンス社）の蛍光標識を用いることができる。例えば、 FITC標識、 RITC標識な^を用いることができる。

発光免疫測定法で用いる標識体としては、任意の公知 [今井一洋編、生物発光と化学発光、廣川書店；臨床検査 (1998) ]の発光票識を甩いることができる。例えば、ァクリジニゥムエステル標識、口フィン標識などを用いることができる。物理化学的測定法（ T I A、 L A P I A P C I A) とは、抗原抗体反応により形成した免疫複合体を濁度の上昇などにより検出する方法である。具体的には、抗原と結合する抗体を用いて、抗原と抗体とを結合させることにより形成される凝集体を検出することにより行う。の他の物理ィ匕学的測定法としては、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法あるいはラテツクス免疫比濁法などで測定する方法があげられる [臨床検査法提要、金原出版、 (1998) ] 。

•ラテックス免疫比濁法では、例えば、抗体または抗原を感作させた粒径 0 . 1〜 1 /m程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原あるいは抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度あるいは積分球濁度として検出することにより抗原または抗体の量を測定することができる。

本発明の抗 g p 4 6 - 1 9 7抗体の免疫学的測定方法と,しては、固相上での抗原抗体反応を用いる免疫学的測定方法が用いられ、具体的には、固相に gp 4 6 - 1 9 7を公知の方法で担体に固定化させ、固相に固定化させた該ぺプチドと検体とを反応させて、固相上に結合した抗 g p 4 6 - 1 9 7抗体を任意の方法で検出する方法を用いることができるが、好ましくは E L I S A法が用いられる。

E L I S A法とは、固相に固定ィ匕した抗原と抗体とを反応させ、さらに抗原に結合した抗体にペルォキシダーゼ、アル力リフォスファタ一ゼなどの酵素標識などを施した二次抗体を反応させた後、酵素標識を適当な方法で測定する方法であり、例えば、競合法、サンドイッチ法 [免疫学イラストレイテッド第 5版（南光堂） ] があげられる。

サンドィツチ法は、固相に第一の抗原を固定させた後、抗体をトラップさせ、標識した第二の抗体を反応させる方法などがあげられる。

競合法は、例えば上記のサンドィツチ法の抗体と同時に第一の抗原と同じ抗原を P T/JP2005/002103 添加、反応させる方法であり、抗原の添加時と非添加時の測定値と比較して、抗体を測定する方法である。

以下に、 EL I S A法による測定を例にあげ、本発明の抗 46 - 197抗体の測定方法および該測定方法の利用を詳細に説明する。

1. 検体中の抗 g p 46 - 197抗体の測定方法

検体中の抗 g p 46 - 197抗体の測定は、 gp46— 197を用いて、以下に示すサンドイツチ法ぁるいは競合法などにより行うことができる。

測定方法 1 (サンドィツチ法)

(1) gp46- l 97を担体に固定化させて gp 46一 197が固定化された固相を作製する工程；

(2)検体と固相上に固定化された gp 46 - 197とを反応させる工程（ 1次反応工程）；

(3)固相上に固定化された gp46— 197と該ぺプチドに結合した抗 gp 46 ― 197抗体とからなる複合体に、標識化二次抗体を反応させる工程（2次反応ェ程）；

(4)固相上に固定化された gp 46— 197と該ペプチドに結合した抗 46 - 197抗体とからなる複合体に結合した標識ィ匕二次抗体の標識量を測定するェ程；

(5)抗 gp 46— 197抗体を含有する標準物質を用いて作成した抗 gp 46—· 197抗体濃度と標識量との関係を表す検量線と、（4)で測定した測定値とから、検体中の抗 gp 46— 197抗体濃度を決定する工程；

からなる測定方法。

測定方法 2 (競合法— 1)

(1) p 46 - 197を担体に固定化させて g p 46 _ 197が固定化された固相を作製する工程；

(2)検体および標識化抗 gp 46— 197抗体と固相上に固定化された gp 46 一 197とを反応させる工程（一次反応工程）；

(3)固相上に固定化された gp 46— 197と該ペプチドに結合した標識化抗 g p 46— 197抗体中の標識量を測定する工程；

(4)抗 gp 46—197抗体を含有する標準物質を用いて作成した抗 gp46— 197抗体濃度と標識量との関係を表す検量線と、（3)で測定した測定値とから、検体中の抗 gp 46 - 197抗体濃度を決定する工程；

からなる測定方法。

測定方法 3 (競合法一 2)

( 1 )抗 gp 46— 1.97抗体を担体に固定ィ匕させて抗 gp 46 - 197抗体が固定ィ匕された固相を作製する工程； 02103

(2)検体、標識化 46 - 197および固相上に固定化された抗 gp 46— 1 97抗体を反応させる工程（一次反応工程）；

(3)固相上に固定化された抗 gp 46—197抗体と該抗体に結合した標識化 g p46 - 197とからなる複合体中の標識量を測定する工程；

(4)抗 gp46— 197抗体を含有する標準物質を用いて作成した抗 gp 46— 197抗体濃度と標識量との関係を表す検量線と、（3)で測定した測定値とから、検体中の抗 gp 46 - 197抗体濃度を決定する工程；

からなる測定方法。

上記の測定方法 1〜3において用いられる、 gp 46— 197が固定化された固相は、以下の工程を含有する方法により、作製することができる。

( 1 )担体に g p 46— 197を固定ィ匕する工程；

(2) gp46- 197が固定化された担体の表面を、プロヅキングする工程；

(3) ブロヅキング後の担体を洗浄する工程。

上記の固相の作製方法において、工程（2)および（3.)は、洗浄に使用する洗浄液にブロッキングに用いる物質を含む洗浄液を用いて同時に行ってもよい。担体としては、.gp 46— 197または抗 gp46 - 197抗体を結合させて保持できるものであればいかなるものも包含されるが、各種高分子素材を用途に合うように成形した素材が用いられる。

具体的には、担体の形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックスなどの微粒子、スティヅクなどがあげられ、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネ —ト、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナィロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、ァガロース、セルロース、ポリエチレンテレフ夕レートなどの高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属などがあげられる。

gp46-l 97または抗 gp46— 197抗体の固相—化の方法としては物理的方法と化学的方法またはこれらの併用などの公知の方法が用いられる。物理的結合としては、例えば物理吸着などがあげられる。化学的結合としては、例えば共有結合、非共有結合などがあげられる。非共有結合としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合、配位結合などがあげられる。例えば、ポリスチレン製 96ゥェルの免疫測定用マイクロ夕一プレートにぺプチドなどを疎水固相化したものがあげられる。

固定化させる gp 46 - 197または抗 gp 46 - 197抗体は、直接 gp 46 ― 197または抗 gp 46- 197抗体を固相に固定化しても良いし、 gp46— 197または抗 gp 46 - 197抗体を一旦蛋白質などのキャリア物質に結合させてから、固相に固定化しても良い。 gp46—197または抗 gp 46-197 抗体を結合させるキャリア物質としては、例えば、ゥシ血清由来アルブミン（以下、 BSAと記す）ゃキ一ホールリンぺヅトへモシアン（以下、 KLHと記す）などが用いられる。

上記測定法 1または 3において固定化させる抗 gp 46 - 197抗体または測定法 2において標識化抗 gp 46— 197抗体の作製に用いられる抗 gp46— 197抗体としては、 gp 46 - 197に結合できる抗体であれば、いかなる抗体でも用いることができ、該抗体はポリク口ーナル抗体であってもモノクロ一ナル抗体、あるいは Fa b、 Fab 'ヽ F (ab，） ₂、一本鎖抗体およびジスルフィド安定化抗体などを用いることができる。

上記の gp46— 197または抗 gp46— 197抗体を固定化させた固相は、プロッキングにより、担体上に残存する官能基を保護する。プロヅキングに用いられる物質としては、通常蛋白質、界面活性剤および市販のブロッキング試薬などが用いられるが、 HSC70 [Nucleic Acids Res. 15 (13 ), 5181-5197 (1987).] を含まない物質が好ましく用いられる。 HSC70を含まない物質としては、例えば、合成高分子があげられ、合成高分子としては、例えば、界面活性剤があげられる。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤などがあげられるが、非イオン性界面活性剤が好適に用いられる。非イオン性界面活性剤としては、例えば、酸アミド型、ポリオキシエチレン誘導体^、脂肪酸エステル型などがあげられる。ポリオキシェチレン誘導体型界面活性剤としては、例えば、ポリォキシェチレンアルキルァミン型、ポリォキシエチレンアルキルェ一テル型、ポリォキシェチレンァリ一ルエーテル型、ポリォキシェチレン ·ポリオキシプロピレン混合型などがあげられる。脂肪酸エステル型界面活性剤としては、例えば、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル型、脂肪酸のポリオキシエチレンソルビ夕ンエステル型などがあげられる。本発明のプロヅキングに用いられる物質としては、脂肪酸のポリオキシエチレンソルビ夕ンエステル型の脂肪酸エステル型界面活性剤が好適に用いられ、具体的には、 Twe en 20™があげられる。 '

プロッキングは、例えば、 4〜 37 °Cにて 30分間以上反応させることにより行うことができる。

本発明の検体中の抗 gp 46-197抗体の測定方法において、一次反応工程または二次反応工程における反応条件としては、通常の抗原一抗体反応がなされる条件であればよい。反応温度は抗体の反応性が変化しない範囲であればよく、例えば、 4 °C〜 40 °Cなどの範囲で自由に設定することができる。反応時間は反応温度にしたがって設定することができ、例えば、反応温度が 4 °Cの場合には反応時間は 1時間以上であり、反応温度が室温の場合には反応時間は 10分〜 8時間であることが好ましい。 .

上記の測定方法において、検体はそのまま用いられるが、検体希釈液などにより希釈されて用いられてもよい。 TJP2005/002103 検出に用いる二次抗体としては、ヒト抗体に結合できる抗体であれば、いかなる抗体でも用いることができ、該抗体はポリクロ—ナル抗体であってもモノクロ一ナル抗体、あるいは Fa b、 Fab'ヽ F (ab') ₂、一本鎖抗体おょぴジスルフィド安定化抗体などを用いることができる。好ましくはポリクローナル抗体が好ましく用いられる。

検出に用いられる二次抗体、抗 gp 46— 197抗体または gp 46 - 197は、検出のために標識化して使用される。該ぺプチド、該抗体あるいは抗体断片を標識する物質としては、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の酵素標識、発光標識、蛍光標識あるいは放射性同位元素などを用いることができ、ァビジン、ストレプトアビジンまたはピオチンなども用いることができる。例えば、酵素標識であればアルカリフォスファタ一ゼ標識、ペルォキシダ一ゼ標識、ルシフエラ一ゼ標識などを、発光標識であればァクリジニゥムエステル標識、口フィン標識を、蛍光標識であればグリーンフルオレセンスプロテイン標識、レツドフルォレセンスプロテイン標識、フルオレセンス 4一イソシァネート（F IT C)標識などを、放射性同位元素であれば¹⁴ C、 ³²P、 ¹²⁵ Iの放射 1生同位元素などが用いられる。 .

検出に用いられる二次抗体、抗 gp 46- 197抗体または gp 46— 197を上記の標識により標識ィ匕する方法としては、遺伝子工学的に結合させる方法や、化学的に結合させる方法が用いられる。遺伝子工学的に結合させる方法は、文献

[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 974 (1996); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7826 (1996)] 記載の方法に従って行うことができる。化学的に結合させる方法は、文献 [Science, 261, 212 (1993)] 記載の方法に従って行うことができる。また、放射性同位元素を化学的に結合させる方法は、文献 [Antibody Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 3, 60 (1990) ; Anticancer Research, 11, 2003 (1991 )] 記載の方法に従って行.うことができる。 .

上記の測定方法において、反応中の固相は操作の途中で必要に応じて洗浄し、未反応の gp46— 197、抗 gp46— 197、食体、標識化 gp46— 197および標識化抗 gp 46 - 197抗体などを除去してもよい。洗浄は、後述する洗浄液を用いて、公知の免疫学的反応における洗净方法により'行われる。例えば、固相に 96穴プレートを使用した場合には、市販のプレート洗浄機などを用いることができる。

標識量を測定する方法としては、吸光度法（比色法）、蛍光法、発光法、放射活性法などがあげられる。標識が酵素である場合、酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、標識量を測定することができる。酵素の基質と当該酵素との反応条件としては、標識に用いた酵素毎に設定することができる。反応温度は当該酵素の反応性が変化しない範囲であればよく、 4 °C以上の範囲で自由に設定することができる。反応時間は反応温度にしたがつて設定することができ、例えば、反応温度が 4 °Cの場合には反応時間は 1時間以上であり、反応温度が室温の場合には反応時間は 10分〜 8時間が好ましい。

酵素がペルォキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法などによりべルォキシダーゼ量を測定することができる。吸光度法によりペルォキシダ一ゼ量を測定する方法としては、例えばペルォキシダーゼとその基質である過酸化水素および酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計などで測定する方法などがあげられる。酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、化カツプリング発色型色原体などがあげられる。

ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルォキシダ一ゼなどの過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、 o—フヱニレンジアミン、 10—N—カルボキシメチルカルバモイルー 3， 7—ビス（ジメチルァミノ）一 10H—フエノチアジン（CCAP)、 10—N—メチルカルバモイルー 3 , 7 一ビス（ジメチルァミノ）一 10H—フエノチアジン（MCDP)、 N- (カルボキシメチルァミノカルボニル）一4， 4⁵ 一ビス（ジメチルァミノ）ジフエニルァミンナトリウム塩 (DA- 64)ヽ 4， 4，一ビス（ジメチルァミノ）ジフエ二ルァミン、ビス〔3—ビス（4—クロ口フエニル）メチル一4ージメチルァミノフェニル〕ァミン（BCMA) などがあげられる。

酸化力ップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルォキシダ一ゼなどの過酸化活性物質の存在下、 2つの化合物が酸化的カツプリングして色素を生成する物質である。 2つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとァニリン類（トリンダ —試薬）との組み合わせ、カプラーとフエノール類との組み合わせなどがあげられる。カプラーとしては、例えば 4一ァミノアンチピリン（4— AA)、 3—メチル - 2—ベンゾチアゾリノンヒドラジンなどがあげられる。ァニリン類としては、 N - (3—スルホプロピル）ァニリン、 N—ェチル一N— （2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル）一 3—メチルァニリン（'TOO S)、 N—ェチル—N— (2—ヒド口キシー 3 _スルホプロピル）一 3, 5—ジメチルァニリン（MAOS)、 N—ェチル一 N— （2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル）一3, 5—ジメトキシァニリン（DA0S)、 N—ェチル— N— (3—スルホプロピル）一 3—メチルァニリン

(TOPS) s N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル）一 3, 5-ジメトキシァニリン（HDAOS)、 N, N—ジメチルー 3—メチルァニリン、 N， N—ジ

(3—スルホプロビル）一 3， 5—ジメトキシァニリン、 1^_ェチル一!^ー（3— スルホプロピル）一3—メトキシァニリン、 N—ェチル一 N— (3—スルホプロビル）ァニリン、

— N— (3—スルホプロピル） _3, 5—ジメトキシァ二リン、 N— (3—スルホプロビル）一 3， 5—ジメトキシァニリン、 N—ェチル —N— (3—スルホプロピル）—3, 5—ジメチルァニリン、 N—ェチルー N— (2 —ヒドロキシ—3 _スルホプロピル）一3—メトキシァニリン、 N—ェチルー N—

(2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル）ァニリン、 N—ェチル一 N— (3—メチルフエニル）一 N，一サクシニルエチレンジァミン（EMSE)、 N—ェチルー N 一（3—メチルフエニル） — N⁵ —ァセチルエチレンジァミン、 N—ェチル一 N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル）一4一フルオロー 3, 5—ジメトキシァ二リン（F— DAOS) などがあげられる。フエノール類としては、フエノール、 4一クロ口フエノール、 3—メチルフエノール、 3—ヒドロキシ一 2, 4, 6—トリヨ一ド安息香酸（HTIB) などがあげられる。

蛍光法によりペルォキシダーゼ量を測定する方法としては、例えばペルォキシダーゼとその基質である'過酸化水素および蛍光物質の組み合わせとを反応させ、生成した蛍光の強度を測定する方法などがあげられる。当該蛍光物質としては、例えば 4ーヒドロキシフエニル酢酸、 3— (4—ヒドロキシフエニル）プロピオン酸、クマリンなどがあげられる。

酵素がアル力リ性ホスファ夕一ゼである場合には、例えば発光法などによりアル力リ性ホスファ夕一ゼ量を測定することができる。発光法によりアル力リ性ホスファ夕一ゼ量を測定する方法としては、例えばアル力リ性ホスファターゼとその基質とを反させ、生成した発光の発光強度を発光強度計などで測定する方法などがあげられる。アルカリ性ホスファタ一ゼの基質としては、例えば 3— (2，一スピロァダマンタン）一4—メトキシ一 4— (3，一ホスホリルォキシ）フエニル一 1, 2—ジォキセ夕ン 'ニナトリウム塩（AMPPD)、 2—クロ口一 5— {4—メトキシスピロ [1， 2—ジォキセ夕ン一3, 2，一（5，一クロ口）トリシクロ [3. 3. 1. 13, 7]デカン]— 4—ィル } フエニルホスフェート 'ニナトリウム塩 (CDP-S t a r™) , 3— {4—メトキシスピロ [ 1， 2—ジォキセタン一 3， 2' — (5，一クロ口）卜リシクロ [3. 3. 1. 13， 7]デカン] _4— ィル } フエニルホスフェート 'ニナトリウム塩（CSPD^TM)、 [10-メチルー 9 ( 10 H) ーァクリジニルイデン] フエノキシメチルリン酸'ニナトリウム塩（Lumi gen^TM APS— 5) などがあげられる。

酵素が 5— D—ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法（比色法）などにより/?一 D _ガラクトシダーゼ量を測定することができる。吸光度法（比色法）により/?— D—ガラクトシダ一ゼ量を測定する方法としては、例えば/?— D—ガラクトシダ一ゼとその基質とを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計などで測定する方法などがあげられる。 /?一 D—ガラクトシダ一ゼの基質としては、例えば 2 - クロ口一 4一二ドロフヱニル ?— D—ガラクトシドなどがあげられる。

標識に放射性同位元素を用いる Rェ Aで上記測定を行う場合には、放射性同位元素の量は、放射活性をシンチレ一シヨンカウン夕一などにより測定することにより決定することができる。

検量線は、標準物質として濃度既知の抗 gp 46 - 197抗体溶液を数点段階希釈したものを準備し、上記の測定方法を行うことにより得られる。

2. 抗 46— 197抗体の測定試藥本発明の抗 gp 46 - 197抗体の測定試薬は、上記の測定方法に用いられ、該方法が実施できる構成要素を含む該抗体の測定試薬の各構成要素と本質的に同一、またはその一部と本質的に同一な物質が含まれていれば、構成または形態が異なつていても、本発明の試薬に包含される。

構成要素としては、 gp46- 197または抗 gp46 -197抗体が固定化された固相、並びに検出に用いられる標識された二次抗体またはその抗体断片、抗 g p46-l 97抗体または gp 46- 197などがあげられ、また必要に応じ、上記の測定方法に用いられる検体の希釈液、反応緩衝液、洗浄液、標識体の検出用試薬、抗 gp46— 197ヒト抗体の標準物質なども含まれる。

検体の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などに安定化剤を含む水溶液などがあげられる。検体として全血を用いる場合には、水性溶液は、赤血球などの血球の膨張や収縮による血清中の成分濃度の変化を防止する目的で、塩類、糖類などを含

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み、緩衝剤などにより等張液に調製されたものであることが好ましい。塩類としては、特に制限はないが、例えば塩化ナトリゥム、塩化力リゥムなどのハロゲン化ァルカリ金属塩などがあげられる。糖類としては、特に制限はないが、例えば、マン二トール、ソルビトールなどの糖アルコールなどがあげられる。

■ 反応緩衝液としては、抗原一抗体反応の溶媒条件を提供するものであればいかなるものであってもよい。また、必要に応じて、界面活性剤、緩衝剤、防腐剤、安定化剤、酵素活性調節剤あるいは酵素安定化剤などを添加してもよい。

洗浄液としては、未反応の物質を除去、洗浄でき、抗原一抗体反応に影響を与えなければ、いかなるものも使用することができる。また、必要に応じて、緩衝剤、界面活性剤、防腐剤あるいは安定ィ匕剤などを添力！]してもよい。例えば、 0. 05% の Twe en20^TMを含むリン酸緩衝液生理食塩水（以下 PBSと表す）などが通常使用される。

緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、 ρΗ1〜11 の例えば乳酸緩衝剤、クェン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フ夕ル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤（但し、標識がアル力リ性ホスファタ一ゼである場合を除く）、トリエタノールアミン緩衝剤、ジェ夕ノールァミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビヅ一ル緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ夕ン緩衝剤、ィミダゾ一ル緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シユウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤などがあげられる。グッド緩衝剤としては、例えば ME S (2—モルホリノエ夕ンスルホン酸）緩衝剤、ビス—トリス [ビス（2 ーヒドロキシェチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン]緩衝剤、 ADA

[N— (2—ァセトアミド）イミノニ酢酸]緩衝剤、 PIPES [ピペラジン— N, N' —ビス（2—ェ夕ンスルホン酸） ]緩衝剤、 ACES {2- [N- (2—ァセトアミド）ァミノ]エタンスルホン酸 }緩衝剤、 MOPSO (3—モルホリノ— 2 —ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、 BES {2— [N，'N—ビス（2—ヒドロキシェチル）ァミノ] エタンスルホン酸 }緩衝剤、 MOPS (3—モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤、 TES 〈2— {N— [トリス（ヒドロキシメチル）メチル] アミノ}ェ夕ンスルホン酸〉緩衝剤、 HE PES [N— (2—ヒドロキシェチル）一 N'— ( 2—スルホェチル）ピぺラジン]緩衝剤、 DIPSO{3-[N₃ N—ビス（2—ヒドロキシェチル）ァミノ]— 2—ヒドロキシプロパンスルホン酸）緩衝剤、 TAP SO '〈2—ヒドロキシー 3— { [N—トリス（ヒドロキシメチル）チル] アミノ}プロパンスルホン酸〉緩衝剤、 POP SO [ピペラジン一 N, N⁵ —ビス（2—ヒドロキシプロパン— 3—スルホン酸） ]緩衝剤、 HEPPSO [N - (2-ヒドロキシェチル）一 N，一（2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル）ピペラジン]緩衝剤、 EPPS [N— (2—ヒドロキシェチル）一 N，一（3—スルホプロピル）ピペラジン]緩衝剤、トリシン [N—トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン]緩衝剤、ビシン [N， N—ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン] 緩衝剤、 TAPS {3- [N—トリス（ヒドロキシメチル）メチル] アミノブロパンスルホン酸 }緩衝剤、 CHES [2— （N—シクロへキシルァミノ）エタンスルホン酸]緩衝剤、 CAPS0 [3- (N—シクロへキシルァミノ）一 2—ヒドロキシプロパンスルホン酸]緩衝剤、 CAPS [3— (N—シクロへキシルァミノ）プ口パンスルホン酸] 緩衝剤などがあげちれる。

界面活性剤としては、上記 1. に記載の界面活性剤があげられる。

安定化剤としては、例えば、 BSA、ゼラチン、ガゼインなどの蛋白質があげられる。

酵素活性調節剤、酵素安定化剤としては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオンなどの金属イオンがあげられる。試薬中のこれらの金属イオンの含量としては、測定において、酵素が安定化される含量であれば特に制限はない。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質などがあげられる。試薬中のこれらの防腐剤の含量としては、測定において、検体中の被測定物質が適切に測定されるような含量であれば特に制限はない。

標識体の検出用試薬としては、上記 1，に記載の標識用酵素に応じた発色用基質を含み、該酵素が反応できればいかなるものでもよく、必要に応じて、界面活性剤、緩衝剤、防腐剤、安定化剤、反応促進剤、酵素活性調節剤あるいは酵素安定化剤などを添加してもよい。

抗 gp46- 197抗体の標準物質としては、 HTLV— 1関連疾患に発症した患者血清、該患者血清などの生体試料から取得された抗 gp 46— 197ヒト抗体が既知濃度で含まれていればよい。標準物質に用いられる抗体は、該患者血清から、通常の蛋白質の精製方法を組み合わせて取得する方法、 p46 - 197を用いたァフィ二ティクロマトグラフィーにより精製して取得する方法、また通常の抗体作製法によりモノクローン化した抗体産生細胞から取得する方法により取得することができる。 3. 抗 gp46— 197抗体の測定方法の利用

本発明の抗 gp 46 - 197抗体の測定方法は、 HTLV— 1関連疾患が発症した患者に特異的に出現が認められる抗 gp 46 - 197抗体を測定することができるため、 HTLV— 1関連疾患の発症の有無を判定するために使用することがでぎる。

また、本発明の抗 gp 46—197抗体の測定方法は、 11丁 ¥—1関連疾患を発症していない無発症 HTLV— 1キャリアであって、重複感染した HTLV— 1 以外の感染症を発症した患者に特異的に出現が認められる抗 gp 46— 197抗体を測定することができるため、無発症 HTLV— 1キヤリァが重複感染した H T L V— 1以外の感染症の発症の有無を判定することができる。

HTLV- 1関連疾患としては、 H T. L V— 1感染細胞が感染者に引き起こした疾患であればいかなる疾患も包含される。 HTLV— 1関連疾患としては、具体的には、血流内やリンパ器官内で発症した成人 T細胞性白血病 Zリンパ腫（ A T L L )、脊髄内で発症した HTLV— 1関連脊髄症 (HAM/T SP)あるいは眼球内で発症したプドウ膜炎（HU) などがあげられる。

本発明において発症とは、 HTLV— 1感染細胞が感染者に病状を引き起こすことをいい、臨床的所見は認められていても、認めらていなくてもよい。 HTLV— 1感染細胞は、患者体内の各所で病状を引き起こす。

HTLV- 1以外の感染症としては、具体的には MR S Aなどの黄色ブドゥ球菌、緑膿菌、病原性大腸菌、カンジダ菌感染症、サイトメガロウィルス、ヘルぺスウイルス、ヒト後天性免疫不全ゥィルス、 E Bウィルスまたは C型肝炎ウイルス（以下、 HCVと記す）などのウィルス感染症、カリニ肺炎またはトキソプラズマ原虫などの原虫感染症などがあげられる。

本発明の抗 g p 46— 197抗体の測定試薬は、 HTLV- 1感染者のスクリーニングに用いられる、 HTLV— 1に結合する抗体の測定試薬と組み合わせて、キヅトとして使用することができる。このようなキヅトは、 HTLV— 1感染の有無と同時に、 HTLV— 1関連疾患の発症の有無あるいは HTLV— 1と重複感染した ΐί T L V— 1以外の感染症の発症の有無を判定するためにも使用することができる。すなわち、 HTLV— 1に結合する抗体の測定試薬で H T L V— 1に結合する抗体が検出され、抗 gp 46- 197抗体の測定試薬で抗 gp 46 - 197抗体が検出されなかった場合、無発症 H T L V— 1キヤリァであると判定される。 H T LV- 1に結合する抗体の測定試薬で HT LV— 1に結合する抗体が検出され、かつ、抗 gp 46— 197抗体の測定試薬で抗 gp 46-197抗体が検出された場合、 HTLV— 1関連疾患が発症していると判定されるか、または無発症 HTLV — 1キヤリアが HTLV— 1以外の感染症を発症していると判定される。

HTLV-1に結合する抗体の測定試薬としては、 HTLV— 1に結合する抗体を測定できるいずれの試窠でもよいが、好ましくは免疫学的手法を用いる試薬が用いられる。具体的には、セロディア HTLV— 1 (富士レビォ社製）、エイテスト (ェ一ザィ社製）、 gp46の Phe l 75_I le l 99の領域に相当するぺプチド（以下、 g p 46— 175と記す）に結合する抗体（以下、以下、 g p 46— 175抗体と記す）を検出する試薬 [平成 2年度厚生省成人 T細胞白血病（ATL) の母子感染防止に関する研究、 174頁] などがあげられる。

本発明のキヅトに用いられる H T L V— 1に結合する抗体の測定試薬として、抗 gp 46- 175抗体の測定試薬を使用する場合には、当該試薬による測定は、上記 1. に記載の抗 gp46— 197抗体の測定方法と同様に行うことができる。

gp46— 175は、 gp46の N末端から数えて 175番目の Phe〜l 99 番目の I 1 eまでに相当するアミノ酸配列を有するぺプチドであり、具体的には配列番号 2で示されるァミノ酸配列で示されるぺプチドである。

gp46 -175の代わりに配列番号 2で示されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、付加または置換され、 gp 46— 175に結合する抗体と結合できるぺプチドを用いることもできる。

欠失、付加または置換されるアミノ酸の数は 1個以上でありその数は特に限定されないが、モレキュラー 'クロ一ニング第 2版、カレント 'プロトコールズ 'イン · モレキュラー 'バイオロジー、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34， 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)など）に記載の部位特異的変異導入法などの周知の技術により、欠失、付加または置換できる程度の数であり、例えば、 1〜数十個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個である。

本発明のキットとしては、 HTLV— 1に結合する抗体の測定試薬および本発明の抗 gp46 - 197抗体の測定試薬が各々独立したキヅトを組み合わせてもよいし、同一のキットに含めたものでもよい。また、同一のキットに含めたものにおいて、各々の測定試薬のうち共通する試薬は共用することができる。共通する試薬としては、例えば、本発明の抗 gp 46 - 197抗体の測定試薬に含まれる生体試料の希釈液、反応緩衝液、洗浄液、標識された二次抗体またはその抗体断片、標識体の検出用試薬などがあげられる。また本発の抗 gp 46 - 197抗体の測定試薬などに、測定に適した機器を組み合わせて、キットとしてもよい。

4. HTLV— 1関連疾患の診断薬および発症の有無の判定方法、並びに無発症 HTLV— 1キヤリァが重複感染した H T L V— 1以外の感染症の診断薬および発症の有無の判定方法

本発明において、抗 gp46— 197抗体は、 HTLV— 1関連疾患が発症した患者で特異的に検出される抗体であるため、該抗体を測定、検出することで、 HT LV- 1関連疾患の診断薬として使用することができる。また、抗 gp46— l 97抗体は、無発症 HTLV— 1キャリアであって、重複感染した HTLV— 1以外の感染症を発症した患者で特異的に検出される抗体であるため、該抗体を測定または検出することで、無発症 H T L V— 1キヤリァが重複感染した H T L V— 1以外の感染症の診断薬として使用することができる。

HTLV— 1関連疾患の診断薬として使用する場合、例えば (1)被験者由来の検体に含まれる抗 gp 46 1 97抗体の濃度を測定し、（2)当該濃度がある一定の基準値を超えているか否かを決定することにより、被験者が、臨床的所見が得られていない HTLV— 1感染者であっても、 HTLV— 1関連疾患を発症していると判定することができる。

さらに、無発症 H T L V— 1キヤリァが重複感染した HTLV— 1以外の感染症の発症の有無を判定する場合、例えば（1)被験者由来の検体に含まれる抗 46 ― 197抗体の濃度を測定し、（2)当該濃度がある一定の基準値を超えているか否かを決定することにより、被験者が、臨床的所見が得られていない無発症 HTLV — 1キヤリアであっても、重複感染した HTLV— 1以外の感染症の発症の有無を判定することができる。

これらの基準値は同一物質を測定している場合であっても、判定する疾患毎に異なっていてもよい。基準値は統計学的に算定することもでき、例えば、健常人などの陰性コントロールでの抗 g p 46 - 1 97抗体濃度の測定値を二倍にした値などが用いられる。以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記の試薬類を使用した。また、 gp46— 197に相当するアミノ酸配列を有するぺプチド（gp 46- 1 9 7相当べプチド）については、自動ぺプチド合成機 43 1A ept i de s ynt he s i z e r (AB Iアプライドバイオシステムズ社製）により合成したペプチドを使用した。

炭酸ナトリゥム (和光純薬工業社製)、炭酸水素ナトリゥム (和光純薬工業社製)、 96穴プレート Maxisorp I匪 unomodule (Nunc社製) 、 Twe en 20 (片山化学社製）、西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識抗ヒト I 0抗体（^ 81^社製）、 o—フエ二レンジァミン（シグマ社製）、クェン酸（和光純薬工業社製)'、過酸ィ匕水素水（和光純薬工業社製）、硫酸（和光純薬工業社製）発明を実施するための最良の形態

実施例 1. gp 46— 197固定ィ匕プレートの作製

以下のようにして、 gp46— 1 97が固定ィ匕されたプレートを作製した。凍結乾燥した gp 46— 197を 10 mm o 1/L Na₂C0₃— NaHCO

3緩衝液（pH 9. 55) に溶解し、 gp46— 197の 5〃g/mL溶液を調製した。当該溶液を、 96穴プレート Maxisorp Immunonioduleに、 1ゥエル当たり 100 L分注して 4°Cにてー晚静置した。各ゥエル中の溶液を除去した後、リン酸緩衝化生理食塩水（0. 15mo 1/L 塩化ナトリウムを含有する pH 7. 2 10mmo l/L リン酸緩衝液；以下、 PBSと記す）に Twe en20^TMを 0. 05%含有させた洗浄液（以下、 Twe en— PBSと記す）を用いてゥエルを洗浄した。この洗净操作は計 4回繰り返した。実施例 2 · 検体中の抗 g p 46— 197抗体の測定

検体中の抗 gp 46- 197抗体の測定は以下のように行った。

実施例 1で作製したプレートの各ゥエルに、 5。〃^/^^ の 6- 197 を含む PB Sで 100倍に希釈した血清試料 100〃Lを添加し、 37°Cにて 1時間静置して反応させた（以下、 gp 46— 197存在下での吸収試験と記す）。この時、同時に gp46- 197を含まない PBSで 100倍に希釈した血清試料 1 00 Lをプレートの各ゥエルに添加し、 37 °Cにて 1時間静置して反応させた基本反応試験を行った（以下、 gp 46— 197非存在下での反応試験と記す）。反応後、 Twe e n— PB Sでの洗浄操作を 4回繰り返し、各ゥエルに残っていた水分を完全に除去した。次に、 l〃gZmLの西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ標識抗ヒト I gG抗体および 5%ブロックエース（大日本製薬社製）を含む PBS溶液を、各ゥエルへ 100〃L添加し、 37 °Cにて 45分間静した。反応後、 Twe en -PBSでの洗浄操作を 4回繰り返し、各ゥエルに残っていた水分を完全に除去した。次に、 0. 7mg/mLの o—フエ二レンジァミンの 0. lmmo l/L クェン酸緩衝液溶液に 1/2容量の 0.5 %過酸化水素水を添加した発色試薬を 1ゥエル当たり 150〃L添加して 37°Cにて 10分間静置した後、発色停止液（2. 5mmo 1/L 硫酸）を 1ゥエル当たり 50 L添加し、 492 nmにおける吸光度を測定した。実施例 3. 被験者の H T L V— 1関連疾患の発症の判定

検体として、（1)無発症 HTLV— 1キャリア由来の血清、（2)成人 T細胞白血病 (ATLL) 患者由来の血清、（3)HTLV— 1関連脊髄症（HAM) 患者由来の血清、（4)無発症 H TLV- 1/HC Vキヤリァ由来の血清および (5)無発症 H C V キヤリア由来の血清を用いて、実施例 2と同様の方法により各検体中の抗 gp 46 一 197抗体を測定した。各検体は以下の通りである。

(1 )無発症 H T L V— 1キヤリァ由来の血清

HTLV— 1関連疾患を発症していない被験者の献血により得られた血液の血清について、セロディア HTLV— 1 (富士レビォ社製）および HTLV— 1感染細胞株による間接蛍光抗体法 (indirect fluorescence assay) により陽性を示した検体 85例を無発症 H T LV— 1キャリアとした。 (2) ATLL患者由来の血清

AT LL患者より採取した血清 47例を用いた。

(3) HAM患者由来の血清、

HAM患者より採取した血清 32例を用いた。

(4)無発症 H T L V— 1キヤリァ ZH C Vキヤリァ由来の血清

C型肝炎発症者の献血により得られた血液の血清について、セロディァ HTLV - 1 (富士レビォ社製）において陽性を示した検体 20例を用いた。

(5)無発症 H CVキャリア由来の血清

HCV関連疾患を発症していな、被験者の献血により得られた血液の血清について、 HCV.PHA (ダイナボット社製）において陽性を示した検体 70例を用いた。

基本反応試験での吸光度が 0. 300よりも大きく、さらに、基本反応試験における吸光度に対して吸収反応試験における吸光度が 30 %以上減少した検体を陽性と判定した。また、各検体における抗 gp 46— 197抗体価については、検体を各倍率に希釈して調製した各希釈検体の吸光度から、吸光度 0. 5を示す希釈倍率を算出し、その逆数を抗体価とした。なお、抗体保有率 (%) は陽性献体数 Z全体献体数である。

その結果を第 1表および第 2表に示した。

HTLV— 1関連疾患患者における抗 gp 46 - 197抗体の保有率

無発症

HTLV- 1 ATLL患者 HAM患者

キャリア

抗体保有率 (％) 5.9 95.7 100

(5/85) (45/47) (32/32)

体価 5-68 692-10520

(median士 SD) (41±25) (1784±1077) (3855±2705)

第 2表

HTLV— 1キヤリアおよび無発症 HCVキヤリアにおける

抗 gp46_ l 97抗体の保有率

第 1表に示した結果より、ほとんどすべての H TLV- 1関連疾患発症患者において抗 gp46 - 197抗体が見出されることから、抗 gp 46— 197抗体の有無を測定することにより、 HTLV—1関連疾患の発症の有無を判定することが可能である。

さらに、第 1表の無発症 H TLV— 1キャリア群と、第 2表の無発症 H C Vキヤリアで示される HCV単独感染群において、それそれ抗 gp 46 - 197抗体の保有率が非常に低いのに対して、無発症 H T L V— 1キヤリァが重複染した H C V 発症群においては本抗体の保有率は 95%と極めて高い。従って、検体中の抗 gp 46 - 197抗体の測定により、無発症 HTLV— 1キャリアが重複感染した HT L V— 1以外の発症の有無を判定することが可能となる。

また、 HTLV— 1非感染で HCVが発症した患者では、 96例が陰性と判定された。このことから、抗 gp46_ 197抗体を測定する方法は HTLV— 1感染に特異性が高く、 HTLV— 1以外のウィルスのみに感染した患者を HTLV— 1 感染と判定することがない方法であることが示された。実施例 4. 抗 gp 46— 197抗体と抗 gp46_ 175抗体との比較

(1)無発症 HTLV— 1キャリア由来の血清、（2)成人 T細胞白血病（ATLL) 患者由来の血清、（3)HTLV— 1関連脊髄症（HAMZTSP)患者由来の血清中の抗 gp46 - 197抗体および抗 gp 46 - 175抗体の抗体の保有率および抗体価を、実施例 2および実施例 3と同様の方法により算出した。

その結果を第 3表に示した。第 3表

HTLV- 1関連疾患の発症者における

第 3表に示されるように、 ATLL患者由来の血清、および、 HAM/TSP患者由来の血清中では、抗 gp 46— 197抗体の抗体保有.率が高いが、無発症 HT L'V— 1キヤ.リア由来の血清中の抗 gp46 - 197抗体の抗体保有率は低い。従つて、抗 gp46_ 197抗体を測定することにより、 HTLV— 1関 ¾疾患の発症の有無を判定できる。 . — 更に、無発症 HTLV— 1キヤリアおよび ATLL患者の血清中における抗 gp 46-19.7抗体および抗 gp 46 - 175抗体の抗体保有率を比較した結果、無発症 HTLV— 1キャリアでは、抗 gp 46— 175抗体は陽性であり、抗 gp4 6-197抗体は陰性であった。一方、 ATLL患者では抗 gp 46- 175抗体および抗 gp 46 - 197抗体は陽性であった。従って、血清における上記の二種類の抗体の有無から被験者を、 1. HTLV— 1に非感染である、 2.無発症 HT LV— 1キヤリアである、および 3. HTLV— 1関連疾患を発症しているという 3つの分類に分類することが可能となる。

また、 HTLV— 1に感染してい ¾い 96例の健常人の血清を用いて、同様の検討を行ったところ、いずれの血清でも抗 gp 46 - 197抗体は検出されなかった。実施例 5. ¾¾gp46-l 97抗体測定法の検証

実施例 1で作製した 96穴プレートの洗浄後に通常の EL I SA法で利用される蛋白質によるブロッキングを試みた。

洗浄後の 96穴プレートに 0.5%ミルクカゼイン、 0.05%Tween20 10%非働化ャギ血清を含むブロッキング試薬を 1ゥヱル当たり 100〃L分注し、室温で放置して、ブロッキング操作を行った。実施例 1に記載の洗浄操作を行つた後、実施例 2に記載の方法で陰性コントロールである健常人の血清、および抗 gp 46 - 197抗体を含有することが実施例 3において確認された ATLL患者由来の血清を測定した。その結果、両検体ともに発色が認められなかった。また、ブロッキング試薬としてゥシ血清アルブミン、ゼラチンなどの通常用いられるゥシ由来の物質を用いてブロッキングを行ったが、発色は認められなかった。このように通常用いられるプロヅキング操作を加えた方法では、抗 gp 46— 197抗体を測定することはできず、実施例 1〜 4に記載の Tween— PBSでの洗浄操作のみを行った 96穴プレートにおいてのみ、抗 gp 46— 197抗体を測定することができた。

gp46— 197と HSC70蛋白質は結合できる [Journal of Virology, 72， 535(1998 )] ため、ブロッキング試薬に含まれる HSC70が ATLL患者由来の血清における発色喪失の原因であると考えられた。そこで、精製標品の HSC70 を用いて、 H S C 7.0が抗 gp 46 - 197抗体の測定に及ぼす影響を調べるため、以下の検討を行った。

実施例 1で作製した 96穴プレートに精製標品の H SC70の希釈系列を反応させ、添加し、 37°Cにて 1時間ゥヹルを静置した。 Twe en— PB Sでの洗浄操作を 4回繰り返し、各ゥヱルに残っていた水分を完全に除去した。次に、 0. 5 〃g/mLのラット抗 HSC70抗体（S t res s G e n社製）を含む PBS 溶液を、各ゥエルへ 100〃L添カ卩し、 37 °Cにて 1時間静置した。反応後、 Tw e en— PB Sでの洗浄操作を 4回繰り返し、各ゥエルに残 όていた水分を完全に除去した。次に、 0. 5〃g/mLの西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識抗ラット I gG抗体および 10%プロックエース（大日本製薬社製）を含む PBS溶液を、各ゥエルへ 100 zL添加し、 37 °Cにて 1時間静置した。反応後、 Tween— P B Sでの洗浄操作を 4回繰り返し、各ゥヱルに残っていた水分を完全に除去した。次に、 0. 7mg/mLの 0—フエ二レンジァミンの 0. 1 mmo 1/L クェン酸緩衝液溶液に 1/2容量の 0.5%過酸化水素水を添加した発色試薬を 1ゥエル当たり 150〃L添加して 37°Cにて 10分間静置した後、発色停止液（2. 5m mo 1/L 硫酸）を 1ゥエル当たり 50〃L添加し、 492 nmにおける吸光度を測定した。

上記の操作により、 HSC70の濃度依存的な発色が確認されたことから、本 E L I S A法により、 H S C 70が抗 g p 46— 197抗体の測定に影響を与えることが明らかとなった。従って、抗 gp46— 197抗体の測定において、固相のブロッキング溶液または洗浄液、並びに gp 46 - 197と抗 gp46— 197抗体との反応時に用いられる反応緩衝液には、 HSC70を含むと考えられる、通常用いられるゥシ由来のゥシ血清アルプミン、ゼラチンまたはミルクカゼインなどを用いることができないことが明らかとなった。

Claims

請求の範囲

1. HTLV— 1外被の糖蛋白質 gp46の Asp 197-Leu216の領域に相当するペプチド（以下、 gp46— 197と記す）を用いることを特徴とする、 HTLV- 1関連疾患の発症の有無を判定するための、検体中の g p 46— 197 に結合する抗体（以下、抗 gp 46— 197抗体と記す）の測定方法。

2. gp46-l 97を用いることを特徴とする、無発症 HTLV— 1キヤリアが重複感染した H T LV- 1以外の感染症の発症の有無を判定するための、検体中の抗 gp46— 197抗体の測定方法。

3. HTLV— 1以外の感染症が、 C型肝炎ウィルス（以下、 HCVと記す）感染症である請求の範囲 2に記載の方法。

4. gp46-l 97が配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有するペプチまたは配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、付加または置換され、抗 gp 46— 197抗体と結合できるぺプチドである請求の範囲 1〜 3のいずれか 1項に記載の方法。

5.抗体の測定方法が免疫学的測定法である請求の範囲 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。

6.免疫学的測定法が、 46 _ 197が固定ィ匕された固相を用いる方法である請求の範囲 5に記載の方法。

7. 免疫学的測定法が、 gp 46— 197が固定化され、 71 kD aの熱ショヅク類似蛋白質（以下、 HSC70と記す）を含まない物質によるブロッキングがなされた固相を用いる方法である請求の範囲 5または 6に記載の方法。

8. HSC70を含まない物質が合成高分子である請求の範囲 7に記載の方法。

9. 合成高分子が界面活性剤である請求の範囲 8に記載の方法。

10.免疫学的測定法が酵素免疫学的測牢法（EL I SA法）である請求の範囲 5 〜 9のいずれか 1項に記載の方法。

11. 以下の工程を含むことを特徴とする、請求の範囲 10に記載の測定方法。

(a) gp46 - 197を担体に固定化させて gp 46— 197が固定化された固相を作製する工程， .

(b)検体と固相上に固定化された gp 46 - 197とを反応させる工程（ 1次反応工程），

(c)固相上に固定化された gp 46 - 197と該ペプチドに結合した抗 gp 46 ― 197抗体とからなる複合体に、標識化二次抗体を反応させる工程（2次反応ェ程）

(d)固相上に固定化された gp46— 197と該ペプチドに結合した抗 gp 46 197抗体とからなる複合体に結合した標識化二次抗体の標識量を測定するェ ■ 程 ' (e)irLgp 46 - 197抗体を含有する標準物質を用いて作成した抗 g p 46— 197抗体濃度と標識量との関係を表す検量線と、（d)で測定した測定値とから、検体中の抗 gp 46 - 197抗体濃度を決定する工程

12. gp46-l 97を用いることを特徴とする、 HTLV— 1関連疾患の発症の有無を判定するための、検体中の抗 gp 46 - 197抗体の測定試薬。

13. gp46-l 97を用いることを特徴とする、無発症 HTLV— 1キヤリアが重複感染した H T L V— 1以外の感染症の発症の有無を判定するための、検体中の抗 gp 46— 197抗体の測定試薬。

14. HTLV— 1以外の感染症が、 HCV感染症である請求の範囲 13に記載の

B式。

15. p46 - 197が配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有するぺプチドまたは配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、付カロまたは置換され、抗 gp 46—197抗体と結合できるペプチドである請求の範囲 1

2〜 14のいずれか 1項に記載の試薬。

16.抗体の測定法が免疫学的測定法である請求の範囲 12〜15のいずれか 1項に記載の試薬。

17.免疫学的測定法が、 gp 46— 197が固定化された固相を用いる方法である請求の範囲 16に記載の試薬。

18.免疫学的測定法が、 gp46—197が固定ィ匕され、 HSC70を含まない物質によるブロッキングがなされた固相を用いる方法である請求の範囲 16または 17に記載の試薬。

19. HSC70を含まない物質が合成高分子である請求の範囲 18に記載の試薬。

20. 合成高分子が界面活性剤である請求の範囲 18に記載の試薬。

21.免疫学的測定法が酵素免疫学的測定法 (EL I S A法）である請求の範囲 1 6~20のいずれか 1項に記載の試薬。

22.標準物質として、抗 gp46_197ヒト抗体を含む請求の範囲 12〜21 のいずれか 1項に記載の抗体の測定試薬。

23. HTLV— 1に結合する抗体の測定試薬と、請求の範囲 12〜22のいずれか 1項に記載の試薬とを組み合わせてなる、 HTLV— 1関連疾患の発症の有無を判定するためのキット。

24. HTLV- 1に結合する抗体の測定試薬と、請求の範囲 12〜 22のいずれか 1項に記載の試薬とを組み合わせてなる、無発症 H T L V— 1キヤリァが重複感染した HTLV— 1以外の感染症の発症の有無を判定するためのキット。

25. HTLV-1以外の感染症が、 H C V感染症である請求の範囲 24に記載のキット。

26. HTLV— 1に結合する抗体が、 HTLV— 1外被の糖蛋白質 gp 46の P he l 75-I le l 99の領域に相当するぺプチド（以下、 gp46_175と記す）に結合する抗体（以下、抗 gp 46— 175抗体と記す）である請求の範囲 23〜25のいずれか 1項に記載のキヅト。 .

27. gp46 - 175が配列番号 2に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたは、配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、付加または置換され、抗 gp 46— 175抗体と結合できるペプチドである請求の範囲 26に記載の試薬。

28. gp46 - 197が固定化され、 HSC70を含まない物質によるブロッキングがなされた固相。

29.HSC70を含まない物質が合成高分子である請求の範囲 28に記載の固相。

30. 合成高分子が界面活性剤である請求の範囲 29に記載の固相。

31.検体中の抗 gp 46— 197抗体を検出することを特徴とする、 HTLV—

1関連疾患の診断薬。 '

32.検体中の抗 gp 46— 197抗体を検出することを特徴とする、無発症 HT L V— 1キヤリァが重複感染した H T L V— 1以外の感染症の診断薬。

33. HTLV- 1以外の感染症が、 HCV感染症である請求の範囲 32に記載の診断薬。

34.検体中の抗 gp 46— 197抗体を検出することを特徴とする、 HTLV— 1関連疾患の発症の有無の判定方法。

35.検体中の抗 gp 46— 197抗体を検出することを特徴とする、無発症 HT LV— 1キャリアが重複感染した HTLV— 1以外の感染症の発症の有無の判定方法 o

36. HTLV— 1以外の感染症が、 HCV感染症である請求の範囲 35に記載の判定方法。