WO2005075641A1

WO2005075641A1 - スクリーニング方法

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Publication number: WO2005075641A1
Application number: PCT/JP2005/001887
Authority: WO
Inventors: Takayuki Hida; Tomoko Sekiya; Toru Sawai; Takashi Seiki; Eiki Takahashi; Michiko Kosasa; Kokichi Harada; Toru Arai
Original assignee: Eisai Co Ltd; Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd; Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2004-02-09
Filing date: 2005-02-09
Publication date: 2005-08-18
Anticipated expiration: 2006-08-09
Also published as: EP1721971A1; AU2005210369B2; US20070054850A1; KR100878959B1; US20100168014A1; KR20070004699A; AU2005210369A1; CA2555469A1; JPWO2005075641A1; JP4468304B2; US7638490B2; EP1721971A4

Abstract

　本発明者らは、ＳＡＬＰＲと結合するリラキシン−３をラット脳室内に投与し、投与後の摂食量、体重、脂肪量などを観察することにより、リラキシン−３が有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有することを見出した。　本発明により、有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含有する疾患治療剤、該ポリペプチドの受容体の賦活化、抑制化をする化合物、物質もしくはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、および該ポリペプチドの発現を阻害する物質などを含有してなる摂食抑制剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤などが提供される。

Description

明細書

スクリーニング方法

技術分野

[0001] 本発明は、有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有するポリぺプチド、該ポリペプチドを含有する疾患治療剤、該ポリペプチドの受容体の賦活化、抑制化をする化合物、物質もしくはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、および該ポリペプチドの発現を阻害する物質などを含有してなる摂食抑制剤、肥満治療剤または糖尿病治療剤などに関する。

背景技術

[0002] 摂食は動物が生きて、くために欠力せな、行動である。肥満は飽食時代の現代社会にあって、摂食量とエネルギー消費の調節'バランスが崩れた結果として生じたものであると考えられている。肥満は生活習慣病を始めとする各種疾病の危険因子でもあるため、社会的な関心が高まってきている。食事療法や運動療法など、摂食量とエネルギー消費のバランスを改善する基本的な治療法はあるものの、現状では肥満患者 ·その予備群は増加している。最近では末梢組織での栄養吸収を抑制する薬剤や中枢性に作用し摂食量を減少させる薬剤も開発されているが、肥満治療剤として摂食量を抑制する有効かつ安全な薬剤の開発は望まれている。

[0003] 摂食行動は脳中枢神経からの指令と、末梢組織からのフィードバックによって中枢神経がさらに指令を送る循環で制御されていることがわ力りつつあり、その主体である脳での摂食制御機構に焦点を当てた研究が盛んに行なわれている。脳の特定領域を破壊した動物の研究や、神経ペプチドや神経伝達物質を用いた機能解析により、視床下部領域が摂食行動に重要な役割を果たしていることが分力つてきている。また、視床下部には多くの神経伝達物質や神経ペプチドおよびそれらに対する受容体 (レセプター）が発現しており、これらと摂食行動との関連が示されている。例えば摂食の亢進には視床下部弓状核に存在する-ユーロペプチド Ύゃァグーチ関連ぺプチド等が関わること、さらに摂食の抑制には同所に存在するメラノコルチンや視床下部室傍核力ゝら放出されるコルチコトロピン放出ホルモンやサイロトロピン放出ホルモンが関わっていることが報告されている (非特許文献 1)。し力しながら、摂食を制御する複雑な神経ネットワークには未だ不明な部分が多ぐ未だなお新規な神経伝達因子やその局在についての新たな知見が得られつつある状況である。

[0004] 摂食行動の制御に関わる神経伝達物質や神経ペプチドなどの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプターを介して機能を発揮する。これらのレセプターの中で細胞膜を 7回貫通する構造を有し、細胞内で 3量体 Gタンパク質と共役するレセプターは特に Gタンパク質共役型受容体 (GPCR)と分類されている。 GPCRは特異的なリガンドが結合した時に細胞内にシグナルを伝達し、細胞の賦活化や抑制化をすることで、各種臓器'器官での機能発現に重要な役割を担っている。それ故に G PCRを賦活ィ匕するァゴニストや抑制するアンタゴニストと呼ばれる物質は、医薬品として使用されている。 GPCRに分類されるレセプターの中でもその特異的なリガンドが未同定のものが数多く知られており、それらはォーファン GPCRと呼ばれている。ォーファン GPCRは新たな治療薬のターゲットとしての可能性を秘めており、生体内のリガンド同定や機能を賦活もしくは抑制する物質の研究が進められている。このようにして同定されたリガンドゃ物質を生体に投与してレセプターとそのリガンドの機能を解明することは、医薬品の開発を提供する上できわめて重要である。

[0005] 近年の遺伝子配列情報の充実により、既知のタンパク質 ·ペプチドの配列を元にその相同性や法則性を導きだし、未知のペプチドやタンパク質を予測して、 GPCRの新たなリガンドとして同定する方法も可能となった。インスリン'リラキシン (Insulin'Re laxin)ファミリーに属するリラキシンは、黄体や胎盤から産生される分泌ペプチドであり、妊娠の維持と出産に関わる作用をもつことが以前力知られていた。それ以外の作用としては、例えばリラキシン 2のラット静脈内投与による摂水量の亢進という報告はなされているが（非特許文献 2)、リラキシンの摂食行動との関連については知られて、な!/、。リラキシンをコードする DNAの塩基配列を元に遺伝子配列データべ一スから新たに同定された DNAのコードするタンパク質力リラキシン 3 (Relaxin— 3) ZINSL7と名づけられたポリペプチドである（特許文献 1)。見出されたリラキシン 3 は、免疫細胞系である THP—1の細胞内サイクリック AMP (cAMP)の上昇をともなつて細胞を賦活化することが報告された (特許文献 2、非特許文献 3)。その後リラキシンー 3は、リラキシン 2と共に、 GPCRである LGR7に結合するリガンドの一つであることが示された (非特許文献 4)。 LGR7は脳と末梢組織に発現しており、これまでには生殖器官の発達や妊娠 ·出産に関わることが示唆されているが、摂食との関連につ！ヽては良く分かってヽな、。

[0006] 最近、生体内のリガンドが未同定の GPCRであった、 SALPR(GPCR135)と名づけられているレセプターや、 GPR100 (hGPCRl l、 GPCR142)と呼ばれるレセプタ一のリガンドがリラキシン 3であることが報告された (非特許文献 5、 6、特許文献 3)。また、特許文献 4一 7にもこれらのレセプターに関連する記載がある。 SALPRは脳に局在することが知られており（非特許文献 7)、特に視床下部の室傍核と視索上核に存在することが報告された (特許文献 3、非特許文献 6)。一方、 GPR100は全身性に発現しているレセプターであることが報告されている（非特許文献 8、 9)が、その機能については不明なままである。

一方、リラキシン 3は脳内の橋と呼ばれる領域に存在することが報告されており（非特許文献 6)、リラキシン 3が脳内ペプチドとして中枢性に何らかの機能を発揮して、る可能性は考えられて、たが、これまでにリラキシン 3が摂食を調節する力否かにつ、ても、リラキシン 3が体重調節に関与する力否かにっ、ても報告されて！、なかった。また、リラキシン 3が肥満と関連するかについても知られていな力つた。

[0007] 特許文献 1：国際公開第 01Z068862号パンフレット

特許文献 2：特開 2002— 345468号明細書

特許文献 3：国際公開第 2004Z082598号パンフレット

特許文献 4:国際公開第 00Z24891号パンフレット

特許文献 5 :国際公開第 01Z48189号パンフレット

特許文献 6：国際公開第 02Z31111号パンフレット

特許文献 7 :国際公開第 02Z61087号パンフレット

非特許文献 l : Spiegelmanら、 Cell, 104, p. 541-543, 2001

非特許文献 2： Sinnayahら、 Endocrinology, 140, p. 5082-5086, 1999 非特許文献 3 : Bathgateら、 Biol. Chem. , 277, p. 1148-1157, 200 2 非特許文献 4 : Sudoら、 Biol. Chem. , 278, p. 7855-7862, 2003 非特許文献 5 :Takedaら、 FEBS Letter, 520, p. 97-101 , 2002 非特許文献 6 : Liuら、 Biol. Chem. , 278, p. 50754-50764, 2003 非特許文献 7 : Matsumotoら、 Gene, 248, p. 183— 189, 2000

非特許文献 8 : Liuら、 Biol. Chem. , 278, p. 50765-50770, 2003 非特許文献 9 : Boelsら、 Br. J. Pharamacol. , 140, p. 932-938, 2003 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明は、有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有するポリぺプチド、該ポリペプチドを含有する疾患治療剤、該ポリペプチドの受容体の賦活化、抑制化をする化合物、物質もしくはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、および該ポリペプチドの発現を阻害する物質などを含有してなる摂食抑制剤、肥満治療剤または糖尿病治療剤などに関する。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、リラキシン 3をラット脳室内に投与し、投与後の摂食量を観察することにより、リラキシン 3が摂食亢進作用を有することを見出した。また、ラットにリラキシン- 3を単回投与した後に、当該ラットから採取した血液を測定した結果、体脂肪増加の指標として知られるレプチン濃度が血液中で上昇していることを見出した。さらに、ラット脳室内へリラキシン 3 の持続投与を行なったところ、リラキシン 3投与群では対照の vehicle投与群に比べて有意な摂餌量の増加と体重増加作用が認められた。リラキシン 3の持続投与によつて両群において運動量に差はな力つた。これらのことから、リラキシン 3は摂食亢進作用と共に体重増加作用も有することが初めて明らかとなった。さらに、リラキシン 3を投与し体重が増カロしたラットにおいては脂肪量の増加および、体脂肪含量と相関する血中レブチン濃度が上昇していた。また、糖尿病と関連するインスリン濃度も上昇していた。以上より、リラキシン 3は摂食亢進作用、体重増加作用、肥満作用を有するポリペプチドであると考えられる。本発明はこれらの知見に基づいて達成されたものである。すなわち、本発明は、

(1)配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのァミノ酸配列に関して 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列力なるポリペプチド、またはその塩を含有してなる摂食亢進剤。

(2)配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのァミノ酸配列に関して 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列力なるポリペプチド、またはその塩を含有してなる体重増加剤。

(3)配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのァミノ酸配列に関して 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列力なるポリペプチド、またはその塩を含有してなる脂肪量増加剤。

(4)次の工程;被験物質を、

(A)リラキシン 3受容体、リラキシン 3受容体を含有する細胞もしくはその細胞膜画分に接触させる工程、

(B)リラキシン 3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、

を含むことを特徴とする摂食を亢進する化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(5)次の工程；

配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列力もなるポリペプチド、またはその塩、および被験物質を、

を含むことを特徴とする摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリー- ング方法。

(6)次の工程； (B)リラキシン 3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、

を含むことを特徴とする前記（5)に記載の摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(7)リラキシン 3受容体力 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記 (4)一 (6)の、ずれか一項に記載のスクリーニング方法。

(8) SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（7)に記載のスクリーニング方法。

(9)次の工程;被験物質を、

を含むことを特徴とする摂食を亢進する化合物またはその塩のスクリーニングキット。

(10)次の工程；

を含むことを特徴とする摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリー- ングキット。

(11)次の工程；

を含むことを特徴とする前記（10)に記載の摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニングキット。

(12)リラキシン 3受容体力 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（9)一（11)のヽずれか一項に記載のスクリーニングキット。

(13) SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（12)に記載のスクリーニングキット。

(14)配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのァミノ酸配列に関して 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列力なるポリペプチド、またはその塩を含有してなる体重増加を必要とする疾患の治療剤。

(15)疾患が拒食症または悪疫質である前記（14)に記載の治療剤。

(16)次の工程;被験物質を、

を含むことを特徴とする体重増加作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(17)次の工程；

を含むことを特徴とする体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーユング方法。

(18)次の工程；

を含むことを特徴とする前記（17)に記載の体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリ一二ング方法。

(19)リラキシン 3受容体力 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（16)—（18)のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。

(20) SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（19)に記載のスクリーニング方法。

(21)次の工程;被験物質を、

を含むことを特徴とする体重増加作用を有する化合物またはその塩のスクリーニングキット。

(22)次の工程；

を含むことを特徴とする体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーユングキット。

(23)次の工程；

を含むことを特徴とする前記（22)に記載の体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニングキット。

(24)リラキシン 3受容体力 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（21)—（23)のいずれか一項に記載のスクリーニングキット。

(25) SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（24)に記載のスクリーニングキット。

(26)次の工程;被験物質を、

(B)リラキシン 3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(27)次の工程；

を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(28)次の工程；

を含むことを特徴とする前記（27)に記載の肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(29)リラキシン 3受容体力 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（26)— (28)の、ずれか一項に記載のスクリーニング方法。

(30) SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（29)に記載のスクリーニング方法。

(31)次の工程;被験物質を、

を含むことを特徴とする肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニングキット。

(32)次の工程；

(33)次の工程；

を含むことを特徴とする前記（32)に記載の肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニングキット。

(34)リラキシン 3受容体力 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする前記（31)— (33)の、ずれか一項に記載のスクリーニングキット。

(35) SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（34)に記載のスクリーニングキット。

(36) SALPR阻害作用を有する化合物を含有する摂食抑制剤。

(37) SALPR阻害作用を有する化合物が、前記（7)または（8)に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記（36)に記載の剤。

(38) SALPR阻害作用を有する化合物を含有する体重減少剤。

(39) SALPR阻害作用を有する化合物が、前記（19)または（20)に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記（38)に記載の剤。

(40) SALPR阻害作用を有する化合物を含有する脂肪量減少剤。

(41) SALPR阻害作用を有する化合物が、前記（29)または（30)に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記 (40)に記載の剤。

(42) SALPR阻害作用を有する化合物を含有する肥満治療剤。

(43) SALPR阻害作用を有する化合物が、前記（19)、（20)、（29)または（30)のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記 (42)に記載の剤。

(44) SALPR阻害作用を有する化合物を含有する糖尿病治療剤。

(45) SALPR阻害作用を有する化合物が、前記（19)、（20)、（29)または（30)のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする前記 (44)に記載の剤。

(46) SALPR力配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする前記（36)— (45)の、ずれか一項に記載の剤。

(47)リラキシン 3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の摂食量を測定する工程を含むことを特徴とする、摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(48)リラキシン 3受容体に作用する化合物が、前記 (4)一 (8)の、ずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記 (47)に記載の方法。

(49)リラキシン 3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の体重を測定する工程を含むことを特徴とする、体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(50)リラキシン 3受容体に作用する化合物が、前記（16)— (20)の、ずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記 (49)に記載の方法。

(51)リラキシン 3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の肥満の指標を測定する工程を含むことを特徴とする、肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。

(52)リラキシン 3受容体に作用する化合物が、前記（26)— (30)の、ずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、前記（51)に記載の方法。

などに関する。

図面の簡単な説明

[図 l]pBabeCL (SALPR) IHの構築図を示す。

[図 2A]CRE4VIPZpBluescriptIISK ( + )の構築図を示す。

[図 2B]pBabeCLXの構築図を示す。

[図 2C]pBabeCLcre4vPdNNの構築図を示す。

[図 3]SALPRを発現させた SE302細胞におけるフォルスコリン添カ卩によって上昇した転写活性のリラキシン 3による特異的な用量依存的抑制を示す。黒四角はリラキシン ³を添加した場合を示す。白四角はインスリンを添加した場合を示す。横軸の数字は添加した各リガンドの最終濃度 (nmolZL)を示す。縦軸はフオルスコリン 1 μ molZLを添カ卩した細胞上清のアルカリフォスファターゼの活性を 100、フオルスコリンを添加して、な、細胞上清の活性を 0として算出した各活性の割合を示す。各点は平均値 (N = 3)と標準偏差を示す。

[図 4]SALPR— SE302細胞を用いたリラキシン 3拮抗化合物の評価 (スクリーニング）を示す図である。 Aは、 SALPR— SE302細胞を使用し、 Bは、 SE302細胞を使用した。図中、 FK (—）はフオルスコリン無処置群、 FK( + )は 3 μ Μフオルスコリン処置群、 FK( + )&RLX— 3はフオルスコリンと 3ηΜ リラキシン 3の処置群、 FK ( + ) & RLX— 3 &化合物 1はフオルスコリンとリラキシン 3と化合物 1を共存させた処置群を示す。

圆 5]正常ラット脳室内へのリラキシン 3の単回投与による摂餌量への作用を示す。白四角は vehicle投与群 (対照）を、黒四角はリラキシン 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの摂餌量 (g)の平均値と標準誤差を示す。

[図 6]正常ラット脳室内へのリラキシン 3の単回投与による血中レブチン濃度への作用を示す。白四角は vehicle投与群 (対照）を、黒四角はリラキシン 3投与群を示す o縦軸は各群の血中のレブチン濃度 (ngZmL)の平均値と標準偏差を示す。

圆 7]正常ラットの脳室内に持続投与したリラキシン 3による体重増加量への作用を示す。白四角は vehicle投与群 (対照）を、黒四角はリラキシン 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹当たりの体重増加量 (g)の平均値と標準偏差を示す。

圆 8]正常ラットの脳室内に持続投与したリラキシン 3による摂餌量への作用を示す。白四角は vehicle投与群 (対照）を、黒四角はリラキシン 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの摂餌量 (g)の平均値と標準偏差を示す。

圆 9]正常ラットの脳室内に持続投与したリラキシン 3による精巣周囲脂肪重量への作用を示す。白四角は vehicle投与群 (対照）を、黒四角はリラキシン 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの脂肪重量 (g)の平均値と標準偏差を示す。

[図 10]正常ラットの脳室内に持続投与したリラキシン 3による血中ホルモンの変動を示す。図 10Aは血中レブチン濃度への作用を示す。白四角は vehicle投与群 (対照 )を、黒四角はリラキシン 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの血中レブチン濃度 (ngZml)の平均値と標準偏差を示す。図 10Bは血中インスリン濃度への作用を示す。白四角は vehicle投与群を、黒四角はリラキシン 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの血中インスリン濃度 (ngZml)の平均値と標準偏差を示す。 [図 11]脳室内にリラキシン- 3を持続投与した後、自発運動量を測定しながら飼育したラットの体重増加量の変化を示す。白四角は vehicle投与群 (対照）を、黒四角はリラキシン 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹当たりの体重増加量 (g)の平均値と標準偏差を示す。図中の白三角は、明期の運動量測定日、黒三角は暗期の運動量測定日を示す。

[図 12]脳室内にリラキシン- 3を持続投与したラットの自発運動量に対する作用を示す。白四角は vehicle投与群 (対照）を、黒四角はリラキシン 3投与群を示す。縦軸は各群の一匹あたりの全活動量 (カウント)の平均値と標準偏差を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0012] リラキシン一 3 (relaxin-3)

本発明で使用する「リラキシン 3」とは、遺伝子配列のデータベース力新たに同定されたリラキシンー3 (Relaxin-3) (INSL7 (GenBankァクセッション番号 NM— 0 80864)とも称されて!/、る。 )と称せられて!/、るポリペプチドであり (J. Biol. Chem . 277, 1148— 1157 (2002) )、（i)配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。また、リラキシン 3には、（ii)配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、 (iii)配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列力もなる相同ポリペプチドが含まれる。本発明に使用するリラキシン 3 としては、「配列番号 2で表されるアミノ酸配列力もなるポリペプチド」が好ましい。なお、前記ポリペプチドには、ポリペプチドの塩が含まれ、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。

[0013] ここで、機能的に等価な改変ポリペプチド (以下、「改変ポリペプチド」と称する）とは、そのアミノ酸配列力配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、し力もリラキシン 3と実質的に同じ活性 [例えばリラキシン 3受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性 (例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデ二ル酸シクラーゼの活性化、細胞内 cAMP生成、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍 pH 変化、細胞内タンパク質のリン酸化、 c fosおよび cHunの誘導活性、ァラキドン酸遊離など)、摂食亢進作用、体重増加作用または肥満作用]を有するポリペプチドを意味する。

[0014] 本明細書において「置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、 1または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性 (疎水性)アミノ酸としては、ァラニン、ノリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フエ二ルァラニン、メチォニン等が挙げられる。極性（中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、ァスパラギン、システィン等が挙げられる。陽電荷をもつ (塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性)アミノ酸としては、ァスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。

ここで、欠失、置換、挿入および zまたは付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば

1一 30個、好ましくは 1一 20個、より好ましくは 1一 10個、さらに好ましくは 1一 5個、特に好ましくは 1一 2個である。なお、前記改変ポリペプチドには、改変ポリペプチドの塩が含まれ、さらには糖鎖を有しな、ものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。従って、これらの条件を満たす限り、前記改変ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。例えばヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスタ一、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]由来のリラキシン 3 もしくはその変異体が含まれる。

[0015] 上述の相同ポリペプチドとは、リラキシン 3のアミノ酸配列に関して 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる限り、特に限定されるものではないが、リラキシン 3に関して、好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 9 9%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であって、し力もリラキシンー 3と実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3受容体との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、摂食亢進作用、体重増加作用または肥満作用）を有するポリペプチドを意味する。本明細書において、「相同性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよぐ例えば全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI)の相同性アルゴリズム BLAST (Basic 1 ocal alignment searcn tool) http： / / www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLA¾

TZにおいてデフォルト (初期設定)のパラメーターを用いることにより、算出することができる。なお、前記相同ポリペプチドには、相同ポリペプチドの塩が含まれ、さらには糖鎖を有しないものと糖鎖を有するものとの両方が含まれる。従って、これらの条件を満たす限り、前記相同ポリペプチドの起源は、ヒトに限定されない。例えばヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]由来のリラキシン 3もしくはその変異体が含まれる。

[0016] なお、変異体とは、「variation」、すなわち、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。

[0017] これら本発明に使用するリラキシン 3 (すなわち、リラキシン 3、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）は、種々の公知の方法、例えば遺伝子工学的手法、合成法などによって得ることができる。具体的には、遺伝子工学的手法の場合、リラキシン 3をコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物力所望のポリペプチドを分離および精製することによって調製することができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。また、使用するポリペプチドは配列番号 2の全長および一部でも良ぐシスティン間の架橋や、 N末端環状グルタミン化、 C末端アミド化等、分泌タンパクのプロセッシングを受けた形のポリペプチドでも良、。

[0018] リラキシン 3をコードするポリヌクレオチド

本発明に使用するリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドは、本発明に使用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、 DNAおよび RNAの両方が含まれる。本発明に使用するポリヌクレオチドには、具体的には下記の（a)—（e)からなる群より選択されるちのが挙げられる。

(a)配列番号 1で表される塩基配列力もなる、ポリヌクレオチド；

(b)「配列番号 2で表されるアミノ酸配列力もなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；

(c)「配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記のリラキシン 3と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；

(d)「配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 1または複数個（好ましくは 1または数個）の箇所において、 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を含み、しカゝも、前記のリラキシン 3と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；および

(e)「配列番号 1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、しかも、前記のリラキシン 3と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。

[0019] 本発明の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 1または複数個（好ましくは 1または数個）の箇所において、 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を含み、しカゝも、前記のリラキシン 3と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および Zまたは付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば 1一 30個、好ましくは 1一 20個、より好ましくは 1一 10個、さらに好ましくは 1一 5個、特に好ましくは 1一 2個である。

[0020] 本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号 1で表される塩基配列力なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、ィブリダィズし、し力も、前記のリラキシン 3と実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。

[0021] 本明細書において、ストリンジェントな条件でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドとは、具体的には、 FASTA、： BLAST、 Smith— Waterman〔Meth. Enzym. , 164 , 765 (1988)〕等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト (初期設定)のパラメーターを用いて計算したときに、配列番号 1で表される塩基配列と少なくとも 70% 以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99% 以上の相同性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。また、「ストリンジェントな条件下」とは、当業者が通常使用し得るハイブリダィゼーシヨン緩衝液中で、温度が 40°C 一 70°C、好ましくは 60°C— 65°Cなどで反応を行い、塩濃度が 15— 300mmolZL、好ましくは 15— 60mmolZLなどの洗浄液中で洗浄する方法に従って行なうことができる。温度、塩濃度は使用するプローブの長さに応じて適宜調整することが可能である。

[0022] 本発明に使用するポリヌクレオチドは、例えば天然由来のものであることもできるし、または全合成したものであることもできる。さらには、天然由来のものの一部を利用して合成を行なったものであることもできる。本発明に使用するポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、例えば市販のライブラリーまたは cDNAライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配列（例えば配列番号 2で表されるアミノ酸配列）の情報を基にして作成した適当な DNAプローブを用いてスクリーニングを行なう方法などを挙げることができる。

[0023] 本発明に使用するポリヌクレオチドとしては、「配列番号 1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド」が好ましい。配列番号 1で表される塩基配列は、 1番目一 3番目の ATGで始まり、 427番目一 429番目の TAGで終了するオープンリーディングフレームを有する。

[0024] リラキシン 3を含する医糸且

本発明に使用するリラキシン 3は、摂食亢進剤として食欲不振や摂食量が低下した栄養障害などの治療、体重増加剤、脂肪量増加剤として体重増加を必要とする疾患の治療、肥満調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、およびリラキシンー 3またはリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドの異常等に起因する疾患の治療の医薬として用いることができる。また、各種疾患の発症もしくは各種疾患の治療（例えば術中、術後）に伴い減少した摂食 (もしくは食欲)および Zまたは体重の回復を目的とする治療の医薬として用いることもできる。前記各種疾患は、例えば消化管の運動もしくは機能に係る疾患 (例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群、消化管検査時または手術前後における腸管内容物排除のための排便促進など )、免疫機能調節に係る疾患 (例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症など)、摂食障害、拒食症、 AIDS,癌、または悪液質などが挙げられる。好ましくは、拒食症、悪液質が挙げられる。

当該ポリペプチドまたはその塩を単独で用いることも可能である力薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。

本願明細書における「塩」とは、本発明に係る化合物と塩を形成し、かつ薬学的に許容され得る塩であれば特に限定されな、が、好ましくはハロゲンィ匕水素酸塩 (例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩など）、無機酸塩 (例えば硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩など)有機カルボン酸塩 (例えば酢酸塩、トリフルォロ酢酸塩、シユウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クェン酸塩など）、有機スルホン酸塩 (例えばメタンスルホン酸塩、トリフルォロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩など）、アミノ酸塩 (例えばァスパラギン酸塩、ダルタミン酸塩など）、四級ァミン塩、アルカリ金属塩 (例えばナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩 (マグネシウム塩、カルシウム塩など)などが挙げられ、当該「薬学的に許容され得る塩」として、より好ましくは塩酸塩、シユウ酸塩、などである。この時の有効成分の担体に対する割合は、 1一 90重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与)のいずれかの投与経路で投与することができる。従つて、本発明のリラキシン 3を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口剤、または注射剤、点滴剤、リボソーム剤、坐薬剤等による非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤等を用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クェン酸、塩ィ匕ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。

[0026] それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、ポリペプチドの選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重 lkgあたり例えば約 0. 1— g、好ましくは約 0. 1一 100 g、より好ましくは 1一 50 g程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。

[0027] リラキシン 3 容体用いた食調铺に係る化合物のスクリーユング法

本発明に使用するリラキシン 3に対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明に使用するリラキシン 3と結合活性を有し、リラキシン 3受容体発現細胞の細胞刺激活性 (例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデ二ル酸シクラーゼの活性化、細胞内 cAMP生成、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変ィ匕、細胞膜近傍 ρΗ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、 c fosおよび c junの誘導活性、ァラキドン酸遊離など）を有するものを使用することができる。

[0028] 具体的には、リラキシン 3受容体として、報告されている公知の受容体、例えば L GR7 (GenBankァクセッション番号 NM— 021634)、 SALPR (GenBankァクセッシヨン番号 NM_016568) (GPCR135とも称されている。）または GPR100 (GenB ankァクセッション番号 AB 083593) (hGPCRl l、 GPCR142とも称されている。）などを使用することが可能である。また、これら受容体の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えばリラキシン 3に対する結合能を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。

[0029] 以下、本明細書においては、本発明の好ましい一例として、 SALPRを使用するスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、 SALPR またはその部分ポリペプチドに結合し、摂食調節 (摂食を促進または抑制する）に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、 SALPRまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、該被験物質に摂食を促進または抑制する作用を有するか否かを決定することができる。

[0030] ここで、本発明に使用する SALPRまたはその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法により得ることができ、例えば SALPRをコードするポリヌクレオチド（GenBankァクセッション番号 NM— 016568)を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。また別の態様として、公知のポリペプチドの合成法により得ることができ、例えば液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。さらに、別の態様によれば、 SALPRの部分ポリペプチドは、 SALPRを適当なタンパク質分解酵素で切断することによって調製することができる。

[0031] 本発明に使用する SALPRをコードするポリペプチドは、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または配列番号 4で表されるアミノ酸配列に関して、 70 %以上の相同性、好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 9 0%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上の相同性を有するアミノ酸配列力なるアミノ酸配列であって、しかも SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または摂食調節作用）を有するポリペプチドを意味する。

[0032] ここで、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列力配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリべプチドにおいて 1または複数個（好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、し力も SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または摂食調節作用）を有するポリペプチドを意味する。

[0033] さらに、 SALPRの部分ポリペプチドも、 SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または摂食調節作用）を有する限り、使用することができる。

[0034] 以下、遺伝子工学的手法について、より具体的には SALPRを使用する場合について詳述する力その部分ポリペプチドについても、後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されな、。

[0035] SALPRをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物力所望のポリペプチドを分離および精製すること〖こより調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテイン A結合多糖類を用いる親和性力ラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥等を挙げることができる。

[0036] 本発明に使用する SALPRをコードするポリヌクレオチドは、本発明に使用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、 DNAおよび RNAの両方が含まれる。本発明に使用するポリヌクレオチドには、具体的には下記の（a)—（e)からなる群より選択されるちのが挙げられる。

(a)配列番号 3で表される塩基配列力もなる、ポリヌクレオチド；

(b)「配列番号 4で表されるアミノ酸配列力もなるポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；

(c)「配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；

(d)「配列番号 4で表されるアミノ酸配列の 1または複数個（好ましくは 1または数個）の箇所において、 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を含み、しカゝも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；および (e)「配列番号 3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、しかも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリべプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。

[0037] 本発明の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、配列番号 3 で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチドである。配列番号 3で表される前記ポリヌクレオチドは、配列番号 4で表されるアミノ酸配列力もなる SALPRをコードする。

[0038] 本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号 4で表されるアミノ酸配列の 1または複数個（好ましくは 1または数個）の箇所において、 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および Zまたは付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば 1一 30個、好ましくは 1一 20個、より好ましくは 1一 10個、さらに好ましくは 1一 5個、特に好ましくは 1一 2個である。

[0039] 本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号 3で表される塩基配列力なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、ィブリダィズし、し力も、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。さらに、本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号 3で表される塩基配列力なるポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズし、し力も、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。

[0040] 前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のような SALPRをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。

[0041] また、前記形質転換体も、上記のような SALPRをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、 SALPR を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換すること〖こより得ることができる。

[0042] 前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えば Escherichia coli JM109株）または酵母（例えば Saccharomyces cerevisi ae W303株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えば CHO細胞、 H EK— 293細胞、または COS細胞）または昆虫細胞（例えば BmN4細胞）を挙げることができる。

[0043] また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、 pUC、 pTV、 p GEX、 pKK、または pTrcHisを；酵母に対しては、 pEMBLYまたは pYES2を； CH O細胞、 HEK— 293細胞および COS細胞に対しては、 pcDNA3、 pMAMneoまたは pBabe Puroを； BmN4細胞に対しては、カイコ核多角体ウィルス（BmNPV)のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えば PBK283)を挙げることができる。

[0044] SALPRを含有する細胞は、 SALPRを細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなぐ例えば前記形質転換体 (すなわち、 SALPRをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞)を、 SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、 SALPRをコードする RNAを注入し、 SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることちでさる。

[0045] また、 SALPRを含有する本発明に使用する細胞膜画分は、例えば本発明による S ALPRを発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー（例えば Potter Elvehiem型ホモジナイザー）で細胞を押し潰す方法、ワーリンダブレンダーまたはポリトロン (Kinematica社）による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズル力細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。 [0046] SALPRを介する、本発明による摂食を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法では、 SALPRもしくは前記細胞膜画分 (すなわち、 SALPRを含有する細胞膜画分）、または前記細胞 (すなわち、 SALPRを含有する細胞）を用いることができる。

[0047] また、本発明によるスクリーニング方法にぉ、ては、被験物質が SALPRに特異的に結合するか否かを調べる方法と、 SALPRに被験物質が結合することにより生じる細胞刺激活性 (例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕、細胞内 cAMP生成、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍 ρΗ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、 c fosおよび cHunの誘導活性、ァラキドン酸遊離など)を調べる方法とが挙げられ、それらを利用することができる。

[0048] 本発明によるスクリーニング方法においては、例えば SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、被験物質とを接触させ、 SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、被験物質が結合するか否かを分析することにより、 SALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。

[0049] 具体的には、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、 SA LPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、標識した天然のリガンド (すなわち、リラキシン 3)とを接触させ、前記条件下における SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較することにより、 S ALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、前記被験物質が、 SALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を有する場合には、被験物質非存在下における SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する天然リガンドの特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する。

[0050] 本発明によるスクリーニング方法において、 SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較する場合には、前記天然リガンドとして、標識した天然リガンドを用いることができる。前記指標としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、 [ ]、 [¹⁴C]、 [¹²⁵I]、 [³⁵S]などを用いることができる。前記酵素としては、例えば j8—ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーォキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルォレセイソチオシァネート、 BODIPYなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。場合によっては、天然リガンドと標識物質を結合させるためにピオチンアビジンの系を用いることもできる。

[0051] このように、本発明によるスクリーニング方法において、 SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞に結合して、これらと天然リガンドとの結合を阻害する化合物を、 SALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を区別せずにスクリーニングすることができる。

[0052] 本発明によるスクリーニング方法における別の態様では、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、前記細胞と標識化した天然のリガンド (すなわち、リラキシン 3)とを接触させ、前記各条件下における前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較し、さらに、前記条件下における前記天然リガンドの特定の細胞刺激活性を比較することにより、 SALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。

[0053] 前記態様にお!、ては、前記細胞に結合し、前記細胞に含まれる受容体を介して細胞刺激活性を有する被験物質を、 SALPRを介する摂食を促進する化合物として選択することができる。

[0054] 一方、前記態様において、前記細胞と天然リガンドとの結合を阻害するものの、細胞刺激活性を有しなヽ被験物質を、 SALPRを介する摂食を抑制する化合物として選択することができる。

[0055] 本発明によるスクリーニング方法は、細胞刺激活性として、例えばアデ二ル酸シクラーゼの活性抑制を利用することによって実施することができる。

[0056] この態様のスクリーニング方法においては、例えばアデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕によって細胞内に生成する cAMPを公知の手法で測定すればよぐ SALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、 SALPRに天然リガンドが結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、 SALPRの細胞刺激活性の一つであるアデ二ル酸シクラ一ゼの活性抑制を利用するものである。具体的には、 SALPRに天然リガンドが結合すると、 S ALPRに共役して!/、る Gタンパク質ファミリーの一つである Giファミリ一力アデ-ル酸シクラーゼを抑制し、細胞内に生成されるサイクリック AMP (cAMP :アデ-ル酸シクラーゼにより ATPから生成される）量を減少させることによる。

[0057] 例えば SALPRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)した哺乳動物由来細胞 (例えば HEK— 293細胞もしくは CHO細胞 )にアデ-ル酸シクラーゼの活性化剤 [例えばフオルスコリン (FSK) ]を添加すると、細胞内の cAMPの濃度が上昇する。

[0058] また、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、 SALPRの天然リガンドを加えると、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデ二ル酸シクラーゼ活性促進に加え、前記天然リガンドが本発明による SALPRに作用して生じるアデ-ル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、 cAMPの生成量が減少する。従って、摂食を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で SALP Rを介する天然のリガンドに代わり、被験物質を単独で接触させて cAMPの生成量を減少させる（すなわち天然リガンドと同様の作用を有する)化合物を選択すると良い。

[0059] 摂食を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤、 SALPRの天然リガンド、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよヽ。アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、天然リガンドの作用で cAMPの生成量が減少する力被験物質が天然リガンドの作用に拮抗する場合には、 cAMP生成量の減少を抑制する。このときには、前記被験物質は摂食抑制作用を有する化合物として選択できる。

[0060] 細胞内 cAMP量を測定する方法としては、例えばィムノアッセィ等がある力例えば市販の cAMP定量キットを使用することもできる。

[0061] 別の態様のスクリーニング方法にぉ、ては、例えば SALPRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)し、しかも、 cAMP応答配列（CRE)が 5'上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファタ一ゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子等、または GFP (Green Fluorescent Protein)等の蛍光タンパク質遺伝子等）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、 SALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、前述の cAMPの生成が減少するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されている CREをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が抑制されることを利用している。

[0062] 以下、前記態様による、 SALPRを介する摂食を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。

すなわち、前記スクリーニング用細胞に導入されている CREは、細胞内の cAMP の濃度が上昇すると発現が亢進する遺伝子群 (cAMP誘導性遺伝子)の転写調節領域に共通して存在する塩基配列である。従って、アデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕剤（例えば FSK)をスクリーニング用細胞に添加すると、細胞内の cAMPの濃度が上昇し、その結果、 CREの下流に位置するレポーター遺伝子の発現量が増加する。レポーター遺伝子産物の発現量は、レポーター遺伝子産物と反応し基質から生成した発光物質の量に由来する発光を測定することによりもしくはレポーター遺伝子として産生された蛍光タンパク質由来の蛍光を測定することで容易に測定することが可能である。

[0063] また、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、 SALPRの天然リガンドをカロえると、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデ二ル酸シクラーゼ活性促進に加え、前記天然リガンドが本発明による SALPRに作用して生じるアデ-ル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、レポーター遺伝子産物の発現量が低下する。従って、摂食を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリー- ング系で、 SALPRを介する天然のリガンドに代わり被験物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を減少させる（すなわち天然リガンドと同様の作用を有する)化合物を選択すると良、。

[0064] 摂食を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤、 SALPRの天然リガンド、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよヽ。アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、天然リガンドの作用でレポーター遺伝子産物の発現量は減少する力被験物質が天然リガンドの作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現減少を抑制する。このときには、前記被験物質は摂食抑制作用を有する化合物として選択できる

[0065] 被験物質による作用が、 SALPRに対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞 (すなわち、 SALPRを細胞膜上に発現し、し力も、 CREが 5'上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用、た前記試験と並行して、コントロール用細胞 (例えば CREが 5 '上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、 SALPRを細胞膜上に発現してヽな、細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被験物質による作用が、 SALPR に対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被験物質による作用が、 SALPRに対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。

[0066] また、別の態様として、上記のスクリーニング方法により選択された被験物質をヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ィヌなど)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に投与し、投与後の摂食量や血中パラメーターの変動等の指標を解析することにより摂食調節に影響を与える被験物質を確認および決定することができる。上記哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物（例えば肥満病モデルである obZobマウス、 dbZdbマウス、 Zucker fattyラットなど）や遺伝子改変動物でもよい。被験物質の投与形態としては経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。スクリーニングのための指標としては摂食量のほかにも、例えば体重、運動量、エネルギー代謝量、血中の糖および脂質の量、またはホルモンや分泌ペプチドの量等を測定することも有効である。また、投与の際に絶食もしくは飽食、さらに脂質過剰食等の条件を課すこともできる被験物質の投与回数は 1日あたり一回でも数回に分けても良ぐ被験物質を投与する期間や観察する期間は 1日から数週間にわたつてもよい。

[0067] リラキシン 3受容体を用いた体重調節に係る化合物のスクリーニング方法

[0068] 具体的には、リラキシン 3受容体として、報告されている公知の受容体、例えば L GR7 (GenBankァクセッション番号 NM— 021634)、 SALPR (GenBankァクセッシヨン番号 NM_016568) (GPCR135とも称されている。）または GPR100 (GenB ankァクセッション番号 AB 083593) (hGPCRl l、 GPCR142とも称されている。）などを使用することが可能である。また、これら受容体の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えばリラキシン 3に対する結合能を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。

[0069] 以下、本明細書においては、本発明の好ましい一例として、 SALPRを使用するスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、 SALPR またはその部分ポリペプチドに結合し、体重調節（体重を増加または減少する）に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、 SALPRまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、該被験物質に体重を増加または減少する作用を有する力否かを決定することができる。 [0070] ここで、本発明に使用する SALPRまたはその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法により得ることができ、例えば SALPRをコードするポリヌクレオチド（GenBankァクセッション番号 NM— 016568)を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。また別の態様として、公知のポリペプチドの合成法により得ることができ、例えば液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。さらに、別の態様によれば、 SALPRの部分ポリペプチドは、 SALPRを適当なタンパク質分解酵素で切断することによって調製することができる。

[0071] 本発明に使用する SALPRをコードするポリペプチドは、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または配列番号 4で表されるアミノ酸配列に関して、 70 %以上の相同性、好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 9 0%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上の相同性を有するアミノ酸配列力なるアミノ酸配列であって、しかも SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または体重調節作用）を有するポリペプチドを意味する。

[0072] ここで、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列力配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリべプチドにおいて 1または複数個（好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、し力も SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または体重調節作用）を有するポリペプチドを意味する。

[0073] さらに、 SALPRの部分ポリペプチドも、 SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または体重調節作用）を有する限り、使用することができる。

[0074] 以下、遺伝子工学的手法について、より具体的には SALPRを使用する場合について詳述する力その部分ポリペプチドについても後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されな、。 [0075] SALPRをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物力所望のポリペプチドを分離および精製すること〖こより調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテイン A結合多糖類を用いる親和性力ラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥等を挙げることができる。

[0076] 本発明に使用する SALPRをコードするポリヌクレオチドは、本発明に使用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、 DNAおよび RNAの両方が含まれる。本発明に使用するポリヌクレオチドには、具体的には下記の（a)—（e)からなる群より選択されるちのが挙げられる。

(d)「配列番号 4で表されるアミノ酸配列の 1または複数個（好ましくは 1または数個）の箇所において、 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を含み、しカゝも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードする、ポリヌクレオチド；および

(e)「配列番号 3で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、しかも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリべプチド」をコードする、ポリヌクレオチドに関する。

[0077] 本発明の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、配列番号 3 で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチドである。配列番号 3で表される前記ポリヌクレオチドは、配列番号 4で表されるアミノ酸配列力もなる SALPRをコードする。

[0078] 本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号 4で表されるアミノ酸配列の 1または複数個（好ましくは 1または数個）の箇所において、 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および Zまたは付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば 1一 30個、好ましくは 1一 20個、より好ましくは 1一 10個、さらに好ましくは 1一 5個、特に好ましくは 1一 2個である。

[0079] 本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号 3で表される塩基配列力なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、ィブリダィズし、し力も、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。さらに、本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号 3で表される塩基配列力なるポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズし、し力も、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。

[0080] 前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のような SALPRをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。

[0081] また、前記形質転換体も、上記のような SALPRをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、 SALPR を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換すること〖こより得ることができる。

[0082] 前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えば Escherichia coli JM109株）または酵母（例えば Saccharomyces cerevisi ae W303株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えば CHO細胞、 H EK— 293細胞、または COS細胞）または昆虫細胞（例えば BmN4細胞）を挙げることができる。

[0083] また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、 pUC、 pTV、 p GEX、 pKK、または pTrcHisを；酵母に対しては、 pEMBLYまたは pYES2を； CH O細胞、 HEK— 293細胞および COS細胞に対しては、 pcDNA3、 pMAMneoまたは pBabe Puroを； BmN4細胞に対しては、カイコ核多角体ウィルス（BmNPV)のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えば PBK283)を挙げることができる。

[0084] SALPRを含有する細胞は、 SALPRを細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなぐ例えば前記形質転換体 (すなわち、 SALPRをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞)を、 SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、 SALPRをコードする RNAを注入し、 SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることちでさる。

[0085] また、 SALPRを含有する本発明に使用する細胞膜画分は、例えば本発明による S ALPRを発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー（例えば Potter Elvehiem型ホモジナイザー）で細胞を押し潰す方法、ワーリンダブレンダーまたはポリトロン (Kinematica社）による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズル力細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。

[0086] SALPRを介する、本発明による体重を増加または減少する化合物のスクリーニング方法では、 SALPRもしくは前記細胞膜画分 (すなわち、 SALPRを含有する細胞膜画分）、または前記細胞 (すなわち、 SALPRを含有する細胞）を用いることができる。

[0087] また、本発明によるスクリーニング方法においては、被験物質が SALPRに特異的に結合するか否かを調べる方法と、 SALPRに被験物質が結合することにより生じる細胞刺激活性 (例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕、細胞内 cAMP生成、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍 pH変化、細胞内タンパク質のリン酸化、 c fosおよび cHunの誘導活性、ァラキドン酸遊離など)を調べる方法とが挙げられ、それらを利用することができる。

[0088] 本発明によるスクリーニング方法においては、例えば SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、被験物質とを接触させ、 SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、被験物質が結合するか否かを分析することにより、 SALPRを介する体重を増加または減少する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。

[0089] 具体的には、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下にお!/、て、 SA LPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、標識した天然のリガンド (すなわち、リラキシン 3)とを接触させ、前記条件下における SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較することにより、 S ALPRを介する体重を増加または減少する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、前記被験物質が、 SALPRを介する体重を増加または減少する能力を有する場合には、被験物質非存在下における SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する天然リガンドの特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する。

[0090] 本発明によるスクリーニング方法において、 SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較する場合には、前記天然リガンドとして、標識した天然リガンドを用いることができる。前記指標としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、 [ ]、 [¹⁴C]、 [¹²⁵I]、 [³⁵S]などを用いることができる。前記酵素としては、例えば j8—ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーォキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルォレセイソチオシァネート、 BODIPYなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。場合によっては、天然リガンドと標識物質を結合させるためにピオチンアビジンの系を用いることもできる。

[0091] このように、本発明によるスクリーニング方法において、 SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞に結合して、これらと天然リガンドとの結合を阻害する化合物を、 SALPRを介する体重を増加または減少する能力を区別せずにスクリーニングすることができる。

[0092] 本発明によるスクリーニング方法における別の態様では、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、前記細胞と標識化した天然のリガンド (すなわち、リラキシン 3)とを接触させ、前記各条件下における前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較し、さらに、前記条件下における前記天然リガンドの特定の細胞刺激活性を比較することにより、 SALPRを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。

[0093] 前記態様にお!、ては、前記細胞に結合し、前記細胞に含まれる受容体を介して細胞刺激活性を有する被験物質を、 SALPRを介する体重を増加する化合物として選択することができる。

[0094] 一方、前記態様にお!、て、前記細胞と天然リガンドとの結合を阻害するものの、細胞刺激活性を有しなヽ被験物質を、 SALPRを介する体重を減少する化合物として選択することができる。

[0095] 本発明によるスクリーニング方法は、細胞刺激活性として、例えばアデ二ル酸シクラーゼの活性抑制を利用することによって実施することができる。

[0096] この態様のスクリーニング方法においては、例えばアデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕によって細胞内に生成する cAMPを公知の手法で測定すればよぐ SALPRを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、 SALPRに天然リガンドが結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、 SALPRの細胞刺激活性の一つであるアデ二ル酸シクラ一ゼの活性抑制を利用するものである。具体的には、 SALPRに天然リガンドが結合すると、 S ALPRに共役して!/、る Gタンパク質ファミリーの一つである Giファミリ一力アデ-ル酸シクラーゼを抑制し、細胞内に生成されるサイクリック AMP (cAMP :アデ-ル酸シクラーゼにより ATPから生成される）量を減少させることによる。

[0097] 例えば SALPRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)した哺乳動物由来細胞 (例えば HEK— 293細胞もしくは CHO細胞 )にアデ-ル酸シクラーゼの活性化剤 [例えばフオルスコリン (FSK) ]を添加すると、細胞内の cAMPの濃度が上昇する。

[0098] また、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、 SALPRの天然リガンドをカロえると、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデ二ル酸シクラーゼ活性促進に加え、前記天然リガンドが本発明による SALPRに作用して生じるアデ-ル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、 cAMPの生成量が減少する。従って、体重を増加する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で SALP Rを介する天然のリガンドに代わり、被験物質を単独で接触させて cAMPの生成量を減少させる（すなわち天然リガンドと同様の作用を有する)化合物を選択すると良い。

[0099] 体重を減少する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤、 SALPRの天然リガンド、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよヽ。アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、天然リガンドの作用で cAMPの生成量が減少する力被験物質が天然リガンドの作用に拮抗する場合には、 cAMP生成量の減少を抑制する。このときには、前記被験物質は体重減少作用を有する化合物として選択できる。

[0100] 細胞内 cAMP量を測定する方法としては、例えばィムノアッセィ等がある力例えば市販の cAMP定量キットを使用することもできる。

[0101] 別の態様のスクリーニング方法においては、例えば SALPRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)し、しかも、 cAMP応答配列（CRE)が 5'上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファタ一ゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子等、または GFP (Green Fluorescent Protein)等の蛍光タンパク質遺伝子等）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、 SALPRを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、前述の cAMPの生成が減少するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されている CREをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が抑制されることを利用している。

[0102] 以下、前記態様による、 SALPRを介する体重を増加または減少する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。

[0103] また、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、 SALPRの天然リガンドをカロえると、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデ二ル酸シクラーゼ活性促進に加え、前記天然リガンドが本発明による SALPRに作用して生じるアデ-ル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、レポーター遺伝子産物の発現量が低下する。従って、体重を増加する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリー- ング系で、 SALPRを介する天然のリガンドに代わり被験物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を減少させる（すなわち天然リガンドと同様の作用を有する)化合物を選択すると良、。

[0104] 体重を減少する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤、 SALPRの天然リガンド、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよヽ。アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、天然リガンドの作用でレポーター遺伝子産物の発現量は減少する力被験物質が天然リガンドの作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現減少を抑制する。このときには、前記被験物質は体重減少作用を有する化合物として選択できる [0105] 被験物質による作用が、 SALPRに対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞 (すなわち、 SALPRを細胞膜上に発現し、し力も、 CREが 5'上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用、た前記試験と並行して、コントロール用細胞 (例えば CREが 5 '上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、 SALPRを細胞膜上に発現してヽな、細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被験物質による作用が、 SALPR に対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被験物質による作用が、 SALPRに対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。

[0106] また、別の態様として、上記のスクリーニング方法により選択された被験物質をヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ィヌなど)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に投与し、投与後の摂食量、体重、肥満の指標 (例えば体脂肪率、 BMI (体格指数)、肥満度、体型、身体年齢、インピーダンス、体脂肪量、除脂肪量、体水分量、蛋白質量、筋肉量、無機質量、細胞量、部位別筋肉量、部位別水分量、 BMR (基礎代謝量)、エネルギー所要量、腹部肥満率 (VSR)、内臓脂肪量、皮下脂肪量、内臓脂肪量レベル、臓器重量、血中パラメーターの変動、血中のレプチン、糖および脂質の量、またはホルモンや分泌ペプチドの量等)を測定することにより体重調節に影響を与える被験物質を確認および決定することができる。上記哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物（例えば肥満病モデルである obZobマウス、 dbZ dbマウス、 Zucker fattyラットなど)や遺伝子改変動物でもよい。被験物質の投与形態としては経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。スクリーニングのための指標としては、体重の測定が挙げられ、さらに摂食量及び肥満の指標を測定することも有効である。また、投与の際に絶食もしくは飽食、さらに脂質過剰食等の条件を課すこともできる。被験物質の投与回数は 1日あたり一回でも数回に分けても良ぐ被験物質を投与する期間や観察する期間は 1日から数週間にわたつてもよい。

[0107] リラキシン- 3^容体を用いた肥満調節に係る化合物のスクリーニング方法

[0108] 具体的には、リラキシン 3受容体として、報告されている公知の受容体、例えば L GR7 (GenBankァクセッション番号 NM— 021634)、 SALPR (GenBankァクセッシヨン番号 NM_016568) (GPCR135とも称されている。）または GPR100 (GenB ankァクセッション番号 AB 083593) (hGPCRl l、 GPCR142とも称されている。）などを使用することが可能である。また、これら受容体の部分ポリペプチドとして後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されず、例えばリラキシン 3に対する結合能を有する部分ポリペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含む部分ポリペプチドなども使用することもできる。

[0109] 以下、本明細書においては、本発明の好ましい一例として、 SALPRを使用するスクリーニング方法について本発明の内容を詳述する。すなわち、本発明は、 SALPR またはその部分ポリペプチドに結合し、肥満調節 (肥満を促進または抑制する）に係る化合物のスクリーニング方法を提供するものである。また、 SALPRまたはその部分ポリペプチドに被験物質を作用させ、細胞刺激活性を測定することにより、該被験物質に肥満を促進または抑制する作用を有するか否かを決定することができる。

[0110] ここで、本発明に使用する SALPRまたはその部分ポリペプチドは、種々の公知の方法により得ることができ、例えば SALPRをコードするポリヌクレオチド（GenBankァクセッション番号 NM— 016568)を用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。また別の態様として、公知のポリペプチドの合成法により得ることができ、例えば液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。さらに、別の態様によれば、 SALPRの部分ポリペプチドは、 SALPRを適当なタンパク質分解酵素で切断することによって調製することができる。

[0111] 本発明に使用する SALPRをコードするポリペプチドは、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチド、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチド、または配列番号 4で表されるアミノ酸配列に関して、 70 %以上の相同性、好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、さらに好ましくは 9 0%以上、さらにより好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上、そして最も好ましくは 99%以上の相同性を有するアミノ酸配列力なるアミノ酸配列であって、しかも SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または肥満調節作用）を有するポリペプチドを意味する。

[0112] ここで、配列番号 4で表されるアミノ酸を含むポリペプチドと機能的に等価な改変ポリペプチドとは、そのアミノ酸配列力配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリべプチドにおいて 1または複数個（好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、し力も SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または肥満調節作用）を有するポリペプチドを意味する。

[0113] さらに、 SALPRの部分ポリペプチドも、 SALPRと実質的に同じ活性 (例えばリラキシン 3との結合能およびそれにより生じる種々の細胞刺激活性、または肥満調節作用）を有する限り、使用することができる。

[0114] 以下、遺伝子工学的手法について、より具体的には SALPRを使用する場合について詳述する力その部分ポリペプチドについても後述のスクリーニング方法に使用可能であれば特に限定されな、。

[0115] SALPRをコードするポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、得られた形質転換体から発現可能な条件下で培養し、発現タンパク質の分離および精製に一般的に用いられる方法により、その培養物力所望のポリペプチドを分離および精製すること〖こより調製することができる。前記の分離および精製方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテイン A結合多糖類を用いる親和性力ラムクロマトグラフィー、透析、または凍結乾燥等を挙げることができる。

[0116] 本発明に使用する SALPRをコードするポリヌクレオチドは、本発明に使用するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、 DNAおよび RNAの両方が含まれる。本発明に使用するポリヌクレオチドには、具体的には下記の（a)—（e)からなる群より選択されるちのが挙げられる。

[0117] 本発明の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、配列番号 3 で表される塩基配列力もなるポリヌクレオチドである。配列番号 3で表される前記ポリヌクレオチドは、配列番号 4で表されるアミノ酸配列力もなる SALPRをコードする。

[0118] 本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号 4で表されるアミノ酸配列の 1または複数個（好ましくは 1または数個）の箇所において、 1または複数個 (好ましくは 1または数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。ここで、欠失、置換、挿入および Zまたは付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば 1一 30個、好ましくは 1一 20個、より好ましくは 1一 10個、さらに好ましくは 1一 5個、特に好ましくは 1一 2個である。

[0119] 本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号 3で表される塩基配列力なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノ、ィブリダィズし、し力も、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。さらに、本発明の別の一つの態様によれば、本発明に使用するポリヌクレオチドは、「配列番号 3で表される塩基配列力なるポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズし、し力も、前記 SALPRと実質的に同じ活性を有するポリペプチド」をコードしてなるものである。

[0120] 前記形質転換に使用されるプラスミドは、上記のような SALPRをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、当該ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。

[0121] また、前記形質転換体も、上記のような SALPRをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなぐ例えば当該ポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、当該ポリヌクレオチドを含むプラスミドの形で含有する形質転換体であることもできるし、あるいは、 SALPR を発現していない形質転換体であることもできる。当該形質転換体は、例えば前記プラスミドにより、あるいは、前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換すること〖こより得ることができる。

[0122] 前記宿主細胞としては、例えば通常使用される公知の微生物、例えば大腸菌（例えば Escherichia coli JM109株）または酵母（例えば Saccharomyces cerevisi ae W303株）、あるいは、公知の培養細胞、例えば動物細胞（例えば CHO細胞、 H EK— 293細胞、または COS細胞）または昆虫細胞（例えば BmN4細胞）を挙げることができる。

[0123] また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば大腸菌に対しては、 pUC、 pTV、 p GEX、 pKK、または pTrcHisを；酵母に対しては、 pEMBLYまたは pYES2を； CH O細胞、 HEK— 293細胞および COS細胞に対しては、 pcDNA3、 pMAMneoまたは pBabe Puroを； BmN4細胞に対しては、カイコ核多角体ウィルス（BmNPV)のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えば PBK283)を挙げることができる。

[0124] SALPRを含有する細胞は、 SALPRを細胞膜表面に発現している限り、特に限定されるものではなぐ例えば前記形質転換体 (すなわち、 SALPRをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された細胞)を、 SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることもできるし、あるいは、適当な細胞に、 SALPRをコードする RNAを注入し、 SALPRの発現が可能な条件下で培養することにより得ることちでさる。

[0125] また、 SALPRを含有する本発明に使用する細胞膜画分は、例えば本発明による S ALPRを発現する細胞を破砕した後、細胞膜が多く含まれる画分を分離することにより得ることができる。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー（例えば Potter Elvehiem型ホモジナイザー）で細胞を押し潰す方法、ワーリンダブレンダーまたはポリトロン (Kinematica社）による破砕、超音波による破砕、あるいは、フレンチプレスなどで加圧しながら細いノズル力細胞を噴出させることによる破砕などを挙げることができる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば遠心力による分画法、例えば分画遠心分離法または密度勾配遠心分離法を挙げることができる。

[0126] SALPRを介する、本発明による肥満を促進または抑制する化合物のスクリーニング方法では、 SALPRもしくは前記細胞膜画分 (すなわち、 SALPRを含有する細胞膜画分）、または前記細胞 (すなわち、 SALPRを含有する細胞）を用いることができる。

[0127] また、本発明によるスクリーニング方法においては、被験物質が SALPRに特異的に結合するか否かを調べる方法と、 SALPRに被験物質が結合することにより生じる細胞刺激活性 (例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕、細胞内 cAMP生成、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍 ρΗ変化、細胞内タンパク質のリン酸化、 c fosおよび cHunの誘導活性、ァラキドン酸遊離など)を調べる方法とが挙げられ、それらを利用することができる。

[0128] 本発明によるスクリーニング方法においては、例えば SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、被験物質とを接触させ、 SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、被験物質が結合するか否かを分析することにより、 SALPRを介する肥満を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。

[0129] 具体的には、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、 SA LPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞と、標識した天然のリガンド (すなわち、リラキシン 3)とを接触させ、前記条件下における SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較することにより、 S ALPRを介する肥満を促進または抑制する能力を区別せずに化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、前記被験物質が、 SALPRを介する肥満を促進または抑制する能力を有する場合には、被験物質非存在下における SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する天然リガンドの特異的結合量に対して、被験物質存在下における前記特異的結合量が低下する。

[0130] 本発明によるスクリーニング方法において、 SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較する場合には、前記天然リガンドとして、標識した天然リガンドを用いることができる。前記指標としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、 [ ]、 ["C]、 [¹²⁵I]、 [³⁵S]などを用いることができる。前記酵素としては、例えば j8—ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーォキシダーゼなどを用いることができる。蛍光物質としては、例えばフルォレセイソチオシァネート、 BODIPYなどを用いることができる。発光物質としてはルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。場合によっては、天然リガンドと標識物質を結合させるためにピオチンアビジンの系を用いることもできる。

[0131] このように、本発明によるスクリーニング方法において、 SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞に結合して、これらと天然リガンドとの結合を阻害する化合物を、 SALPRを介する肥満を促進または抑制する能力を区別せずにスクリーニングすることができる。

[0132] 本発明によるスクリーニング方法における別の態様では、被験物質非存在下および被験物質存在下の各条件下において、前記細胞と標識化した天然のリガンド (すなわち、リラキシン 3)とを接触させ、前記各条件下における前記細胞を介する前記天然リガンドの特異的結合量を比較し、さらに、前記条件下における前記天然リガンドの特定の細胞刺激活性を比較することにより、 SALPRを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。

[0133] 前記態様にお!、ては、前記細胞に結合し、前記細胞に含まれる受容体を介して細胞刺激活性を有する被験物質を、 SALPRを介する肥満を促進する化合物として選択することができる。

[0134] 一方、前記態様において、前記細胞と天然リガンドとの結合を阻害するものの、細胞刺激活性を有しなヽ被験物質を、 SALPRを介する肥満を抑制する化合物として選択することができる。

[0135] 本発明によるスクリーニング方法は、細胞刺激活性として、例えばアデ二ル酸シクラーゼの活性抑制を利用することによって実施することができる。

[0136] この態様のスクリーニング方法においては、例えばアデ-ル酸シクラーゼの活性ィ匕によって細胞内に生成する cAMPを公知の手法で測定すればよぐ SALPRを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、 SALPRに天然リガンドが結合することにより生じる細胞内シグナル伝達、すなわち、 SALPRの細胞刺激活性の一つであるアデ二ル酸シクラ一ゼの活性抑制を利用するものである。具体的には、 SALPRに天然リガンドが結合すると、 S ALPRに共役して!/、る Gタンパク質ファミリーの一つである Giファミリ一力アデ-ル酸シクラーゼを抑制し、細胞内に生成されるサイクリック AMP (cAMP :アデ-ル酸シクラーゼにより ATPから生成される）量を減少させることによる。

[0137] 例えば SALPRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)した哺乳動物由来細胞 (例えば HEK— 293細胞もしくは CHO細胞 )にアデ-ル酸シクラーゼの活性化剤 [例えばフオルスコリン (FSK) ]を添加すると、細胞内の cAMPの濃度が上昇する。

[0138] また、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、 SALPRの天然リガンドを加えると、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデ二ル酸シクラーゼ活性促進に加え、前記天然リガンドが本発明による SALPRに作用して生じるアデ-ル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、 cAMPの生成量が減少する。従って、肥満を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリーニング系で SALP Rを介する天然のリガンドに代わり、被験物質を単独で接触させて cAMPの生成量を減少させる（すなわち天然リガンドと同様の作用を有する)化合物を選択すると良い。

[0139] 肥満を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤、 SALPRの天然リガンド、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよヽ。アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、天然リガンドの作用で cAMPの生成量が減少する力被験物質が天然リガンドの作用に拮抗する場合には、 cAMP生成量の減少を抑制する。このときには、前記被験物質は肥満抑制作用を有する化合物として選択できる。

[0140] 細胞内 cAMP量を測定する方法としては、例えばィムノアッセィ等がある力例えば市販の cAMP定量キットを使用することもできる。

[0141] 別の態様のスクリーニング方法においては、例えば SALPRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入し過剰に発現)し、しかも、 cAMP応答配列（CRE)が 5'上流に位置するレポーター遺伝子（例えばアルカリフォスファタ一ゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、クロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ベータガラクトシダーゼ遺伝子等、または GFP (Green Fluorescent Protein)等の蛍光タンパク質遺伝子等）を含有する細胞（以下、「スクリーニング用細胞」と称することもある）を用いることにより、 SALPRを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングすることができる。この態様は、前述の cAMPの生成が減少するとその結果、前記スクリーニング用細胞に導入されている CREをプロモーター領域に有するレポーター遺伝子の転写が抑制されることを利用している。

[0142] 以下、前記態様による、 SALPRを介する肥満を促進または抑制する能力を区別して化合物をスクリーニングする手順について、より具体的に説明する。

[0143] また、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤を添加する際に、 SALPRの天然リガンドをカロえると、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤に起因する前記のアデ二ル酸シクラーゼ活性促進に加え、前記天然リガンドが本発明による SALPRに作用して生じるアデ-ル酸シクラーゼの活性抑制も起こるため、結果として、アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独投与した場合に比べて、レポーター遺伝子産物の発現量が低下する。従って、肥満を促進する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、このスクリー- ング系で、 SALPRを介する天然のリガンドに代わり被験物質を単独で接触させてレポーター遺伝子産物の発現量を減少させる（すなわち天然リガンドと同様の作用を有する)化合物を選択すると良、。

[0144] 肥満を抑制する作用を有する化合物をスクリーニングする場合には、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤、 SALPRの天然リガンド、および被験物質をスクリーニング用細胞に添加するとよヽ。アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤を単独で添加した場合に比べて、天然リガンドの作用でレポーター遺伝子産物の発現量は減少する力被験物質が天然リガンドの作用に拮抗する場合には、レポーター遺伝子産物の発現減少を抑制する。このときには、前記被験物質は肥満抑制作用を有する化合物として選択できる

[0145] 被験物質による作用が、 SALPRに対する結合を介した作用であるか否かは、簡単に確認することができる。例えばスクリーニング用細胞 (すなわち、 SALPRを細胞膜上に発現し、し力も、 CREが 5'上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞）を用、た前記試験と並行して、コントロール用細胞 (例えば CREが 5 '上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、 SALPRを細胞膜上に発現してヽな、細胞）を用いて同様の試験を実施する。その結果、前記被験物質による作用が、 SALPR に対する結合による作用でない場合には、スクリーニング用細胞およびコントロール用細胞でレポーター遺伝子産物の発現量に関して同じ現象が観察されるのに対して、前記被験物質による作用が、 SALPRに対する結合による作用である場合には、スクリーニング用細胞とコントロール用細胞とでレポーター遺伝子産物の発現量に関して異なる現象が観察される。

[0146] また、別の態様として、上記のスクリーニング方法により選択された被験物質をヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ィヌなど)、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に投与し、投与後の摂食量、体重、肥満の指標 (例えば体脂肪率、 BMI (体格指数)、肥満度、体型、身体年齢、インピーダンス、体脂肪量、除脂肪量、体水分量、蛋白質量、筋肉量、無機質量、細胞量、部位別筋肉量、部位別水分量、 BMR (基礎代謝量)、エネルギー所要量、腹部肥満率 (VSR)、内臓脂肪量、皮下脂肪量、内臓脂肪量レベル、臓器重量、血中パラメーターの変動、血中のレプチン、糖および脂質の量、またはホルモンや分泌ペプチドの量等)を測定することにより肥満作用に影響を与える被験物質を確認および決定することができる。上記哺乳動物としては、正常の動物に限らず、遺伝性の病態モデル動物（例えば肥満病モデルである obZobマウス、 dbZ dbマウス、 Zucker fattyラットなど)や遺伝子改変動物でもよい。被験物質の投与形態としては経口的または非経口的に投与する。非経口的な投与経路の様態としては、例えば静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、気道内、直腸内、脳内、好ましくは視床下部近傍の脳室内投与が挙げられる。スクリーニングのための指標としては、肥満の指標を測定することが挙げられ、さらに摂食量及び体重を測定することも有効である。また、投与の際に絶食もしくは飽食、さらに脂質過剰食等の条件を課すこともできる被験物質の投与回数は 1日あたり一回でも数回に分けても良ぐ被験物質を投与する期間や観察する期間は 1日から数週間にわたつてもよい。

[0147] ここで、本発明に使用する被験物質はどのような化合物であってもよいが、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、核酸 (オリゴ DNA 、オリゴ RNA)、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞 (微生物、植物細胞、動物細胞)抽出液、細胞 (微生物、植物細胞、動物細胞)培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物等由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを挙げることができる。

[0148] スクリーニングキット

本発明のスクリーニングキットは、リラキシン 3受容体、好ましくは SALPRもしくは前記細胞膜画分 (すなわち、 SALPRを含有する細胞膜画分)、または前記細胞 (すなわち、 SALPRを含有する細胞）を含む。前記スクリーニングキットは、所望により、種々の試薬、例えば標識したリラキシン 3、非標識のリラキシン 3、結合反応用緩衝液、および Zまたは洗浄用緩衝液、説明書、器具をさらに含むことができる。

[0149] 具体的には、前記スクリーニングキットは、 SALPRもしくは前記細胞膜画分または前記細胞を含み、所望により、標識した天然リガンド (すなわち、リラキシン 3)、非標識の天然リガンド、および Zまたは結合反応用緩衝液、説明書、器具を含むことができる。

[0150] 本発明の別の態様のスクリーニングキットは、リラキシン 3受容体、好ましくは SAL PRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入して過剰に発現)し、しかも、 cAMP応答配列（CRE)が 5'上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞を含み、所望により、アルカリフォスファターゼもしくはルシフェラーゼ等の基質、アデ-ル酸シクラーゼ活性化剤（例えば FSK)、天然リガンド (すなわち、リラキシン 3)、および Zまたは結合反応用緩衝液、説明書、器具を含むことができる。

[0151] 本発明のさらに別の態様のスクリーニングキットは、リラキシン 3受容体、好ましくは SALPRを細胞膜上に発現 (好ましくは、 SALPRを含む発現ベクターを導入して過剰に発現)し、し力も、 cAMP応答配列（CRE)が 5'上流に位置するレポーター遺伝子を含有する細胞と、 CREが 5'上流に位置するレポーター遺伝子を含有するものの、 SALPRを細胞膜上に発現していない細胞とを含み、所望により、レポーター遺伝子産物の基質、アデ二ル酸シクラーゼ活性化剤（例えば FSK)、および Zまたは結合反応用緩衝液、説明書、器具を含むことができる。

[0152] 本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する医本発明のスクリーニング方法により得られる化合物は、摂食を促進もしくは抑制する化合物、体重を増加もしくは減少させる化合物、または肥満を促進もしくは抑制する化合物である。当該化合物は塩を形成してもよぐ薬学的に許容し得る塩が挙げられる。従って、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物またはその塩は、摂食 (もしくは食欲)調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、体重調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、肥満調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、およびリラキシン 3またはリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドの異常に起因する疾患の治療の医薬として用いることができる。また、各種疾患の発症または各種疾患の治療 (例えば術中、術後）に伴い増力!]もしくは減少した摂食 (もしくは食欲)および Zまたは体重の回復を目的とする治療の医薬として用いることもできる。前記疾患は、例えば消化管の運動もしくは機能に係る疾患 (例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群、消化管検査時または手術前後における腸管内容物排除のための排便促進など）、免疫機能調節に係る疾患 (例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症など)、エネルギー代謝に係る疾患 (例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害、拒食症など)、 AIDS,癌、または悪液質などが挙げられる。

本発明によるスクリーニング方法によって、リラキシン 3受容体、好ましくは SALPR またはその部分ポリペプチドを介した細胞刺激活性、より具体的には、 SALPRまたはその部分ポリペプチドに天然リガンドが結合すると引き起こされる細胞刺激活性（例えば細胞内のカルシウムの遊離、アデ二ル酸シクラーゼの活性化、細胞内 cAMP 生成、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン脂質生成、細胞膜電位変化、細胞膜近傍 pH変化、細胞内タンパク質のリン酸化、 c fosおよび cHunの誘導活性、ァラキドン酸遊離など)の阻害作用（SALPR阻害作用）を有する化合物が提供される。このような化合物を含有する薬剤として、摂食抑制剤、体重減少剤、脂肪量減少剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤などが挙げられる。

[0153] 得られたィ匕合物またはその塩を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、 1一 90重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与

、経皮投与)のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明のスクリ一二ング方法により得られる化合物またはその塩を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口剤、または注射剤、点滴剤、リボソーム剤、坐薬剤等による非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤等を用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、エタノール、クェン酸、塩ィ匕ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。

[0154] それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物またはその塩の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重 lkgあたり例えば約 1. 0-1, 500 g、好ましくは約 10— 500 g程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。

[0155] リラキシン 3の活性を阻害する物質およびその使用

本発明に使用するリラキシン 3 (すなわち、リラキシン 3、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド)の活性を阻害する物質によれば、摂食亢進作用、体重増加作用、肥満作用を抑制または阻害することができる。そこで、リラキシン 3の発現を阻害するものは、リラキシン 3の in vivo, ex vivoおよび in vitroにおける摂食制御および体重制御に伴う機能 (例えばエネルギー代謝調節、成長など)、肥満を制限するのに利用できる可能性がある。

本発明に使用するリラキシン 3の活性を阻害する物質には、該活性を有する限り特に制限はな、が、例えばリラキシン 3をコードする塩基配列のアンチセンス配列を有する DNAや、リラキシン 3をコードする塩基配列を有する 2本鎖 RNA (small int erfering RNA; siRNA)、リボザィム等リラキシン 3の発現を阻害するもの、あるいはリラキシン 3の抗体や糖タンパク質、さらには上記スクリーニング方法により得られる化合物等のリラキシン 3もしくはリラキシン 3受容体 (好ましくは、 SALPR)と相互作用してリラキシン 3が有する活性を阻害する物質等が挙げられる。

当該物質は塩を形成してもよぐ薬学的に許容し得る塩が挙げられる。従って、リラキシン 3 (すなわち、リラキシン 3、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）の活性を阻害する物質またはその塩は、摂食 (もしくは食欲)調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、体重調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、肥満調節における何らかの異常に起因する疾患の治療、およびリラキシン 3またはリラキシン 3をコードするポリヌクレオチドの異常に起因する疾患の治療の医薬として用いることができる。また、疾患の発症または疾患の治療 (例えば術中、術後）に伴い増加した摂食 (もしくは食欲)および Zまたは体重の減少を目的とする治療の医薬として用いることもできる。前記疾患は、例えば消化管の運動もしくは機能に係る疾患 (例えば下痢、便秘、機能性便秘症、過敏性腸症候群、消化管検査時または手術前後における腸管内容物排除のための排便促進など)、免疫機能調節に係る疾患 (例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腎疾患、強皮症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、多発性硬化症、リウマチ性間質性肺炎、サルコイド-シス、クローン病、炎症性大腸炎、肝硬変、慢性肝炎、劇症肝炎、脳脊髄炎、重症筋無力症など)、またはェネルギー代謝に係る疾患 (例えば糖尿病、肥満性糖尿病、耐糖能障害、ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、高脂血症、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、肥満、肥満症、摂食障害など)などが挙げられる。好ましくは、摂食抑制剤、体重減少剤、脂肪量減少剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤などとして使用することができる。

[0157] アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する機構としては、 (1) 3重鎖形成による転写開始阻害、（2) RNAポリメラーゼにより形成される局所的開状ループ構造部位とのハイブリッド形成による転写抑制、（3)合成中の RNAとのノ、イブリツド形成による転写阻害、（4)イントロンーェキソン接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（5)スプライソソーム形成部位とのノ、イブリツド形成によるスプライシング抑制、（6) mRNAとのハイブリッド形成による、 mRNAの細胞質への移行抑制、（7 )キヤッビング部位またはポリ A付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（8)翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、（9)リボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、（10) mRNA翻訳領域またはポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長抑制、並びに（11)核酸と蛋白質の相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制が挙げられる（平島および井上『新生化学実験講座 2 核酸 IV 遺伝子の複製と発現』日本生化学会編、東京化学同人、 pp. 319— 347 (1993) )。

[0158] 本発明に使用するリラキシン 3のアンチセンス核酸は、上述の（1)一（11)のどの機構により遺伝子発現を抑制する核酸であってもよい。すなわち、発現を阻害する目的の遺伝子の翻訳領域のみならず、非翻訳領域の配列に対するアンチセンス配列を含むものであってもよい。アンチセンス核酸をコードする DNAは、その発現を可能とする適当な制御配列下に連結して使用され得る。アンチセンス核酸は、標的とする遺伝子の翻訳領域または非翻訳領域に対して完全に相補的である必要はなぐ効果的に該遺伝子の発現を阻害するものであればよい。このようなアンチセンス核酸は、少なくとも 15bp以上、好ましくは lOObp以上、さらに好ましくは 500bp以上であり、通常 3000bp以内、好ましくは 2000bp以内、より好ましくは lOOObp以内の鎖長を有し、標的遺伝子の転写産物の相補鎖に対して好ましくは 90%以上、より好ましくは 9 5%以上同一である。このようなアンチセンス核酸は、リラキシン 3の配列情報を基に、ホスホロチォネート法（Stein (1988) Nucleic Acids Res. 16 : 3209—21 )等により調製することができる。

[0159] リボザィムとは、 RNAを構成成分とする触媒の総称であり、大きくラージリボザィム (1 arge ribozyme)およびスモールリボザィム（small liboyme)に分類される。ラージリボザィムは、核酸のリン酸エステル結合を切断し、反応後に 5'—リン酸と 3'—ヒドロキシル基を反応部位に残す酵素である。ラージリボザィムは、さらに（1)グアノシンによる 5，ースプライス部位でのトランスエステル化反応を行なうグループ Iイントロン RNA、 (2)ラリアット構造を経る二段階反応により自己スプライシングを行なうグループ IIイントロン RNA、および（3)加水分解反応による tRNA前駆体を 5 '側で切断するリボヌクレアーゼ Pの RNA成分に分類される。それに対して、スモールリボザィムは、比較的小さな構造単位 (40bp程度）であり、 RNAを切断して、 5'—ヒドロキシル基と 2'— 3，環状リン酸を生じさせる。スモールリボザィムには、ハンマーヘッド型（Koizumi et al. (1988) FEBS Lett. 228 : 225)、ヘアピン型（Buzayan (1986) Na ture 323 : 349 ; Kikuchi and Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 1 9 : 6751 ; 菊地洋（1992)化学と生物 30 : 112)等のリボザィムが含まれる。リボザィムは、改変および合成が容易なため多様な改良方法が公知であり、例えばリボザィムの基質結合部を標的部位近くの RNA配列と相補的となるように設計することにより、標的 RNA中の塩基配列 UC、 UUまたは UAを認識して切断するハンマーへッド型リボザィムを作ることができる（Koizumi et al. (1988) FEBS Lett. 2 28 : 225 ; 小泉誠および大塚栄子（1990) 蛋白質核酸酵素 35 : 2191 ; Koi zumi et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17 : 7059)。ヘアピン型のリボザィムについても、公知の方法に従って設計、製造が可能である (Kikuchi and S asaki (1992) Nucleic Acids Res. 19 : 6751 ; 菊地洋（1992) 化学と生物 30 : 112)。

[0160] 1998年に、線虫において RNA同士が邪魔し合い働きを失う現象 (RNA干渉）が観察された（Fire et al. (1998) Nature 391 : 806— 11)。 RNA干渉とは、二本鎖の人工 RNAを細胞に導入することにより、同じ塩基配列を有する RNAが分解される現象である。その後の研究により、 RNA干渉等の RNAサイレンシングの現象は、欠陥を持つ mRNAの排除、並びにトランスポゾン、ウィルス等の寄生体に対する防御のための細胞機構であることが示唆されている。現在では、多くの遺伝子の発現を抑制するためのツールとして、二本鎖 RNA(small interfering RNA; siRN A)が利用されており、病気の原因遺伝子等の発現抑制を siRNAを用いて行なうことにより病気を治療 ·予防する方法も検討されている。本発明の siRNAは、リラキシン- 3の mRNAの転写を阻害する限り、特に限定されない。通常、 siRNAは、標的 mRN Aの配列に対するセンス鎖およびアンチセンス鎖の組合せであり、少なくとも 10個から標的 mRNAと同じ個数までのヌクレオチド長を有する。好ましくは、 15— 75個、より好ましくは 18— 50個、さらに好ましくは 20— 25個のヌクレオチド長である。リラキシン 3の発現を抑制するために、 siRNAは公知の方法により細胞に導入することができる。例えば siRNAを構成する二本の RN A鎖を、一本鎖上にコードする DNAを設計し、該 DNAを発現ベクターに組み込み、細胞を該発現ベクターで形質転換し、 siR NAをヘアピン構造を有する二本鎖 RNAとして細胞内で発現させることができる。トランスフエクシヨンにより持続的に siRNAを産生するプラスミド発現ベクターも設計されている（例えば RNAi— Ready pSIREN Vectorゝ RNAi— Ready pSIREN— Ret roQ Vector (BD Biosciences Clontech社））。 siRNAの塩基配列は、例えば Ambion website (http： / Z / www. ambion. com/ techlib/ misc/ siRNA _finder. html)のコンピュータープログラムを用いて設計することができる。機能的 siRNAをスクリーニングするためのキット（例えば BD Knockout RNAi System ( BD Biosciences Clontech社））等も市販されており利用可能である。

患者の細胞内における遺伝子の発現を制御するための遺伝子治療において、本発明のアンチセンス核酸、リボザィムおよび siRNAを、直接組織に投与してもよぐまたはこれらを発現するように作成された構築物を有する任意のベクター（例えば、レトロウィルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス等のウィルス由来のベクター、リポソ一ム等を利用した非ウィルスベクター）を、直接組織に投与してもよい (in vivo法)。これらは、例えば筋肉注射、皮下注射、動脈内注射、静脈内注射等によって、組織部位へ注入することができる。

または、予め体外で、細胞に、本発明のアンチセンス核酸、リボザィムおよび siRN Aを発現するように作成された構築物を有するベクターを導入してもよ!/ヽ。得られた細胞を、例えば筋肉注射、皮下注射、動脈内注射、静脈内注射等により患者の組織に注入する（ex vivo法)。使用細胞は、患者の細胞と異種または同種であってよい力好ましくは同種、より好ましくは患者力も採取した細胞である。

[0162] 本発明のアンチセンス核酸、リボザィムおよび siRNA、またはこれらを発現するように作成された任意のベクターは、単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合されて、医薬品組成物 (例えば摂食抑制剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤）として使用され得る。例えば、注射剤の形態で投与する場合には、医薬品組成物は、蒸留水、塩ィ匕ナトリウム又は塩ィ匕ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マン-トール、ラタトース、デキストラン、グルコース等の糖溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等を含んでもよい。

これらの投与量は、患者の体重、年齢、症状、投与形態等により変動するが、当業者であれば、必要に応じて適当な投与量を選択することができる。

[0163] 本発明に使用する抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および抗体フラグメントが含まれる。

本発明に使用するモノクローナル抗体は、免疫用抗原およびスクリーニング用抗原として、リラキシン 3 (すなわち、リラキシン 3、改変ポリペプチド、相同ポリペプチド）またはそれらの部分断片を用いることを除いて、それ自体公知の手段により得ることができる。例えば前記免疫用抗原を用いてマウスを免疫し、そのマウスから取得した脾臓細胞と、マウス骨髄腫細胞とを、細胞融合法 (Nature, 256, 495 (1975) )、または電気細胞融合法 (J. Immunol. Method, 100, 181— 189 (1987) )を用いて細胞融合し、前記スクリーニング用抗原を用いてスクリーニングすることにより、本発明に使用するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを得ることができる。

[0164] 前記ノ、イブリドーマを培養する培地としては、ハイプリドーマの培養に適した培地であればよぐ好ましくはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Dulbecco's mo dified Eeagle s minimum essential medium;にゥシ月台 ¾血清、 L—グノレタ^ン、 L ピルビン酸および抗生物質（ペニシリン Gおよびストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。前記ハイプリドーマの培養は、培地中で行なう場合には、 5%CO濃度、 3 7°Cの条件下で約 3日間行なうことができる。また、マウスの腹腔内で培養する場合には、約 14日間で行なうことができる。

[0165] このようにして得られた培養液またはマウスの腹水から、タンパク質の分離および精製常法に従って、前記モノクローナル抗体を分離および精製することが可能である。このような方法としては、例えば硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテイン A結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析または凍結乾燥などを挙げることができる。

[0166] また、本発明に使用するポリクローナル抗体も、免疫用抗原およびスクリーニング用抗原として、リラキシン 3 (すなわち、リラキシン 3、改変ポリペプチド、相同ポリぺプチド)またはそれらの部分断片を用いることを除いて、それ自体公知の方法、例えば以下に示す方法により調製することができる。すなわち、抗原を含む生理食塩水を等量のフロイント氏完全アジュバンドもしくは不完全アジュバンド、またはその等価物、例えば Hunter's TiterMax™ (フナコシ社)と乳化混合して、哺乳動物（特にはゥサギまたはャギなど)の皮下、腹腔内または筋肉内などのいずれかに投与する（初回免疫)。以後、 2— 4週間の間隔で同様の操作を行い、数回免疫する。最終免疫から 1 一 2週間後に哺乳動物の頸動脈または心臓力血液を採取して血清を硫酸アンモ- ゥムによって塩析することにより調製することができる。

[0167] 本発明に使用する抗体フラグメントは、前記抗体 (モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む)の部分断片であって、しカゝも、元の抗体と同じ反応特異性を有する限り、特に限定されるものではない。本発明による抗体フラグメントとしては、例えば Fab、 Fab'、 F (ab') または Fvを挙げることができる。本発明に使用する抗体フラ

2

グメントは、例えば前記によって得られることができるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素 (例えばトリプシンなど）によって消ィ匕し、続いて、タンパク質の分離および精製の常法に従って得ることができる。

[0168] また別の態様によれば、本発明に使用する抗体は、国際公開第 01Z068862号パンフレット、特開 2002— 345468号明細書に記載の方法により得ることができる。また。公知となったリラキシン- 3の抗体を使用することができ、例えば特開 2002-345 468号明細書の実施例に記載された抗体 (モノクローナル抗体: HK4— 144 10)を挙げることができる。

[0169] 本発明に使用する抗体は、医薬品組成物として用いることもでき、例えば摂食 (もしくは食欲)抑制剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤として使用することができる。本発明に使用する抗体は、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることができる。この時の有効成分の担体に対する割合は、 1一 90重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は、ヒトまたはヒト以外の生物 [例えば非ヒト哺乳動物（例えばゥシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、ノ、ムスター、ブタ、ィヌなど）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類など]に、種々の形態、経口または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与)のいずれかの投与経路で投与することができる。従って、本発明の抗体を含有する医薬組成物は、投与経路に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口剤、または注射剤、点滴剤、リボソーム剤、坐薬剤等による非経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤等を用いて常法により製造することができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩、ェタノール、クェン酸、塩ィ匕ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。

[0170] それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、抗体の選択、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重 lkgあたり例えば約 0. 01— 30mg、好ましくは約 0. 1— 10 mg程度を投与するのが好ま、範囲である。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量レべルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。

[0171] リラキシン 3もしくはリラキシン 3受容体 (好ましくは SALPR)と相互作用し、リラキシン 3の活性を阻害する物質は、本発明のスクリーニング法によって得ることができる。前記スクリーニング方法によって得られる化合物の好適例として、後述する実施例に記載された 1 ,2 , 5-oxadiazolo[3,4-a] 1 , 2 ,5- oxadiazolo[3 ,4- e]

1,2,5- oxadiazolo[3,4-i] 1,2,5- oxadiazolo[3,4-m][16]annulene (以下、「化合物 1」と称する場合もある。）を挙げることができる。当該化合物の投与形態は、前記本発明のスクリーニング方法により得られる化合物を含有する医薬に関する記載を参照すればよい。

[0172] 本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および Zまたは症状を完全にまたは部分的に防止する点では予防的であり、疾病および/または疾病に起因する悪影響の部分的または完全な治癒と!/、う点では治療的である。本明細書にぉ、て「治療」とは、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば以下の（a)— (c)の治療を含む：

(a)疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持って!/、ると診断されて、な、患者において、疾病または症状が起こることを予防すること；

(b)疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止または遅延すること；

(c)疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退、または症状の進行の逆転を引き起こすこと。

[0173] なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0174] 以下、実施例により本発明についてより詳細に説明する力本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。

[0175] 「実施例 11 SALPRをコードするポリヌクレオチドの調製

SALPRをコードするポリヌクレオチドの単離は、配列番号 3で表される核酸配列を基にして、以下のように行った。配列番号 3では 1857塩基対が示されており、 SALP Rをコードする領域は、 361番目力も 1770番目（1410塩基対， 470アミノ酸残基）とされている（GenBank ァクセッション番号 NM 016568)。 PCR (polymerase c hain reaction)により遺伝子を単離するために、配列番号 5および配列番号 6で表される PCRプライマーを常法に従ヽ作製した。

[0176] human genomic DNA (Roche Diagostics社）を铸型として、配列番号 5および配列番号 6の組合せからなる PCRプライマーと、 Expand High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics社）を用い、 (98°C 1分— 57°C 1分— 72°C 3分）を添付の操作方法に従い、 30回繰り返すことにより PCRを行った。その結果、約 1, 400塩基対の DNA断片を得た。

[0177] この DNA断片を、 pCR2. 1 (Invitrogen社）に挿入し、 ABI prism DNA sequ encing kit (Perkin— Elmer Applied Bio systems社）により配列を確認した。その結果、配列番号 5および 6からなるプライマーの組合せによって得られた pCR2. 1 —SALPRに挿入された 1410塩基対の配列は、配列番号 3における 361番目力も 1 770番目と長さは同一であった力配列中には 1つの変異が見られた。この変異は、該当部位の核酸配列力も翻訳されるアミノ酸には影響を与えないことは明らかであり、 SALPRをコードするポリヌクレオチドを得ることができた。

[0178] 「実施例 2Ίレトロウイルスベクタープラスミドの調製

pBaoe Puro (Morgenstern, J. P. and Land, H. Nucleic Acids Re s. vol. 18 3587— 3596 (1990) ) (配列番号 7)力ら Sailおよび Clalで切断することにより SV40 promoter— puro (r)領域を除き、末端を Klenow fragmentにより平滑化した。ここへ pIREShyg (Clontech社）力 Nsilおよび Xbalで切断することにより IRES-hyg (r)領域を切り出し、 T4ポリメラーゼにより末端を平滑ィ匕したものを挿入し pBabeXIHを得た。

[0179] pBabeXIHから Ssplおよび BamHIで切断することにより 5，一 LTR— packaging si gnalを除、た。ここへ pCLXSN (IMGENEX社）から Ssplおよび BamHIで切断することにより切り出した 5， LTR—CMV promoter-packaging signalを挿入し pBab eCLXIHを得た。

[0180] 「実施例 3Ί SALPR遣伝子導入用レトロウイルスベクタープラスミドの調製

前記実施例 2に記載のレトロウイルス発現用プラスミド pBabeCLXIHを制限酵素 H palで切断した。ここへ前記実施例 1で得た pCR2. 1—SALPR力 EcoRVで切断することにより SALPRをコードするポリヌクレオチドを切り出し、 T4ポリメラーゼにより末端を平滑化したものを挿入し pBabeCL (SALPR) IHを得た（図 1)。

[0181] 「実施例 4Ί SALPR遣伝子導入用レトロウイルスベクターの調製

2 X 10⁶個の 293— EBNA細胞（Invitrogen社）を 10cmコラーゲンコートディッシュ (IWAKI社）で DMEM (Sigma社 )ー10% fetal bovine serum (FCS)—べ- シリン（penicillin) lOOunits/ml ストレプトマイシン（streptomycin) 100 ^t g /ml (PS) (以下、「EBNA培養液」と称する） 10mlを用いて培養した。翌日、 pV-g p (pVPack-GP (Stratagene社）から Nsilおよび Xbalで切断することにより IRES— hisDを除き T4ポリメラーゼによる平滑化後、自己環化したもの）、 pVPack— VSV— G (Stratagene社）、および実施例 3で得た SALPR遺伝子導入用レトロウイルスベクタ一プラスミド（pBabeCL (SALPR) IH)それぞれ 3. 3 μ gをリポフエクシヨン試薬である TransIT(Panvera社）を用いて、前記 293— EBNA細胞にトランスフエクシヨンした。その 6— 12時間後に EBNA培養液を交換し、 37°Cで培養を続けた。

[0182] トランスフエクシヨン 2日後に培養液を回収し、 1, 200 X gで 10分間遠心した。

その上清を 0. 45 μ mのフィルター（Millipore社）でろ過したものを非濃縮レトロウイルスベクターとして、さらにウィルスベクターの濃縮を以下のように行った。

超遠心用チューブ 50 Ultra-Clear Tubes (Beckman社）を 70%エタノールで消毒後に蒸留水ですすぎ、ここへ非濃縮ウィルスベクター約 35mlを入れた。これを超遠心ローター SW28 (Beckman社）に入れ、超遠心装置 XL - 90 (Beckman社）を使って 19, 500rpm 100分間の遠心操作を行った。遠心後、上清を捨てたチューブを氷に入れて放置した。 1時間後、チューブ壁面に残った培養液約 100 1程度の濃縮ウィルスベクター溶液が得られた。

[0183] 「実施例 5Ίサイクリック AMP応答配列を含むレポーター系導入細朐 SE302の構築

(1)サイクリック AMP応答配列を含むレポーター DNAの作成

公表された論文（Durocher et al. Anal Biochem 2000 284 (2) : 316—2 6)を参考に cAMPに応じた転写がみられる unitを以下のように構築した。

cAMP responsive element (CRE)を含む unitの作成のために、 CREx2hb用として配列番号 8および配列番号 9、 CREx2bp用として配列番号 10および配列番号 11で表されるオリゴ DNAを常法に従、作成した。

それぞれの組合せ力もなるオリゴ DNAを 95°Cに熱処理後、徐々に温度を室温まで下げることにより二本鎖 DNA(CREx2hb、 CREx2bp)を形成させた。 CREx2hbを Hindlll, BamHI、 CREx2bpを BamHI, Pstlで消化するとともに、 pBluescriptllS K ( + ) (Stratagene社）を Hindlll, Pstlで消化した。消化した DNAを電気泳動して両端に制限酵素消化部位をもつ DNAを精製した後、これら 3つの DNA(CREx2hb 、 CREx2bp、 pBluescriptIISK( + ) )を一度に連結し（ligation)、得られたプラスミドの配列を解析して、 CRE4ZpBluescriptIISKを作成した。

[0184] 次に VIP (vasoactive intestinal peptide)プロモーターを含む DNAを得るために配列番号 12および配列番号 13で表される PCRプライマーを常法に従、作成した。

Human genomic DNA (Roche Diagostics社）を铸型とし、配列番号 12および配列番号 13の組合せからなる PCRプライマーと、 recombinant Taq polymer ase (Takara社）を用いて（94°C 30秒— 55°C 30秒— 72°C 1分）を 35回繰り返すことにより PCRしたところ、 264塩基対の DNA (配列番号 14)が得られた。この 264 塩基対の DNAを Pstlで消化するとともに CRE4ZpBluescriptIISK ( + )の Pstlサイトに挿入し、得られたプラスミドの配列を確認して CRE4VIPZpBluescriptIISK ( + )を作成した（図 2A)。得られた CRE4VIPZpBluescriptIISK( + )から Hindlllと Smalで消化した後、得られた CRE4VIPプロモーター断片の末端平滑ィ匕を行なった

[0185] 前述の発現用ウィルスベクタープラスミド pBabeCLXIHより IRES— hygro (r)領域を除去した pBabeCLXを作成した（図 2B)。 pBabeCLXよりレトロウイルス本来のェンハンサー活性 (LTR)中の Nhel— Narl領域を除去することによって得られた外来性プロモーター導入用レトロウイルスベクタープラスミドに、 CREと VIPプロモーターを含む配列と、レポーター遺伝子である胎盤由来アルカリフォスファターゼ (PLAP) ( Gotoら， Molecular Pharmacology, 49, p. 860—873, 1996)を導入し、 pBabeCLcre4vPdNNを得た（図 2C)。

[0186] (2)サイクリック AMP応答配列を含むレポーター系導入細胞 SE302の榭立サイクリック AMP応答配列によりレポーター遺伝子 PLAPが誘導されるレトロウィルスベクタープラスミド pBabeCLcre4vPdNNを用い、実施例 4に記載の方法に準じてレトロウイルスベクターを調製した。調製したレトロウイルスベクターを HEK293細胞に導入し、限界希釈法により細胞をクローンィ匕して、 PLAP誘導の反応性が最も良かつたクローン (以下、「SE302細胞」と称する）を以下の実験に供した。

[0187] 「実施例 61 SALPR遣伝子導入用レトロウイルスベクターによる SALPR発現細胞の謹

前記の実施例 4で調製したレトロウイルスベクターによる細胞への SALPR遺伝子導入を以下のように行った。

前記実施例 5で構築した 3 X 10³個の SE302細胞を 96well plate (旭テクノガラス社）に DMEM (SIGMA社 )ー10% fetal bovine serum (FCS)— PS (以下、「培養液」と称する） 100 μ 1を用いて培養した。翌日、実施例 4で調製したレトロウィルスベクターを適宜希釈し、その 100 μ 1を培養液で調製した polybrene (最終濃度 8 μ gZml) (別名 hexadimethrine bromide Sigma社）とともに SE302細胞に加えた。その翌日、培養液を 500 μ g/mlのハイグロマイシン（Hygromycin) (Invitrog en社)含有の培養液 200 1と交換し培養した。この条件で増殖してきた SALPR遺伝子導入 SE302細胞（以下、「SALPR - SE302細胞」と称する）を適時継代して実験に供した。

[0188] 「実施例 71 SALPR— SE302細朐におけるフォルスコリン添加によって増加させた転写活性のリラキシン 3による抑制

前記実施例 6で構築した SALPR— SE302細胞を、転写活性測定用培地 (DME M— 10%FBS (65°Cにて 30分非働ィ匕）をカ卩えたもの）にて縣濁した後、 96 well pi ate (Beckton Dickison社）に 1穴あたり 1 X 10⁴細胞となるようにま、た。翌日、アツセィ用培地 (DMEMに 0. 1%ゥシ血清アルブミンをカ卩えたもの）で希釈した各濃度のリラキシン 3 (Relaxin—3) (Phoenix Pharamaceuticals社）またはインスリン（I nvitrogen社）を添加し、その後フォルスコリン（Carbio Chem社）を最終濃度 1 μ m olZLとなるように添加した。さらに一日培養後、細胞上清を 15 1回収して化学発光測定用の 96well plate (住友ベークライト社）に移し、アツセィ用緩衝液（280mmol /L Na CO -NaHCO、 8mmol/L MgSO、 pHIO)を 60 μ 1、 Lumiphos530

2 3 3 4

(Lumigen社） 70 1を添カ卩して、室温にて 1時間反応させた後、各 wellの化学発光を Fusionプレートリーダー（Perkin Elmer社）にて測定し転写活性量とした。フオルスコリン 1 μ molZLを添加した細胞上清の転写活性を 100%ととし、フオルスコリンを添加して、な、細胞の上清の活性を 0%として各被験サンプルを加えた細胞上清中の活性を％で表示した（図 3)。

[0189] その結果、フオルスコリンによる転写活性の上昇をリラキシン 3は SALPRの活性化を介して抑制することが分力つた。この転写活性の上昇は関連ペプチドであるインスリンでは影響がな力つたので、リラキシン 3特異的な反応であることが分力つた。すなわちこの実験系を用いることで、リラキシン 3による SALPRの活性ィ匕に影響を与える化合物、物質を判別できることが示された。

[0190] 「実施例 8Ί SALPR— SE302細朐を用いたリラキシン 3桔杭物皙のスクリーニング

実施例 7で示した実験系を用いて、リラキシン 3の作用を拮抗する化合物のスクリ一-ングを実施し、拮抗作用を持つ化合物を見出した。

SALPR— SE302細胞を、転写活性測定用培地（DMEM— F12—10%FBS (65°C にて 30分非働ィ匕）をカ卩えたもの）にて縣濁した後、 384 well plate (Greiner社）に 1穴当たり 5000細胞となるようにまいた。翌日、フオルスコリン (Fermentek社)溶液に被験化合物（ 1 ,2 ,5- oxadiazolo[3 ,4- a] 1 ,2, 5- oxadiazolo[3 ,4- e]

1 , 2 ,5-oxadiazolo[3 ,4-i] 1 ,2, 5-oxadiazolo[3 ,4-m] [16]annulene (ィ匕合物 1) )を溶解し、細胞上清に添加した (最終濃度：フオルスコリン 3 μ molZL、被験化合物 20 μ g/m L, DMSO (dimethylsurf oxide) 0. 5%) ₀その後、アツセィ用培地（DMEM— Fl 2に 0. 1 %ゥシ血清アルブミンをカ卩えたもの）で希釈したリラキシン 3 (株式会社ぺプチド研究所)を最終濃度 3nmolZLとなるように添加した。さらに一日培養後、細胞上清 5 μ 1を回収して化学発光測定用の 384well plate (Corning社）に移し、アツセィ用緩衝液を 20 μ L、 Lumiphos530を 25 μ L添カ卩して、室温にて 2時間反応させた後、各 wellの化学発光を ARVOsx3プレートリーダー（Perkin Elmer社）にて測定し転写活性量とした。 SALPRを発現して、な、SE302細胞にっ、ても同様に操作し、被験物質の特異性を確認した。 [0191] その結果、 SALPR— SE302細胞におけるフォルスコリンによる転写活性の上昇をリラキシン 3が抑制し、被験物質である化合物 1がリラキシン 3による転写活性の抑制に拮抗した（図 4A)。また、 SALPRを発現していない SE302細胞における検討では、化合物 1は、転写活性を上昇させることはな力つた（図 4B)。したがって被験物質による作用力 SALPRのリラキシン 3による活性ィ匕を特異的に抑制する化合物であることが確認できた。

[0192] 「実施例 9Ίリラキシン 3脳室内投与による摂食量亢進作用

(1) 験動物脳内投与のための前処置

Wistar雄性ラット（7週齢、日本チャールズリバ一社）に実験動物用飼料 MF (オリェンタル酵母社)を与えて馴化した。ラット（250— 300g)を麻酔下で、側脳室に力- ユーレを挿入した。その後一週間以上飼育した後に投与実験を行った。

(2)リラキシン 3溶液の調製

60 μ gのリラキシン 3 (Phoenix Pharmaceutical社）を DMSOにて溶解した後、最終濃度が 200 μ molZLとなるように人工的脳脊髄液 (artificial cerebrospinal fluid)を添加して調製した。析出した沈殿は遠心操作をして取り除き、上清をリラキシン 3投与液として用いた。ラットへの投与量 (投与液中のリラキシン 3濃度）は実施例 7に示された実験系にて、リラキシン- 3による標準曲線を用、て算出したところ、約 50pmolZラットであった。

( )リラキシン 3溶液の脳室内投

ガイド力-ユーレを装着したラットを 2群に分け（1群 6匹）、リラキシン 3投与液もしくは vehicle (リラキシン 3を除、た前記（2)と同じ組成の溶液)を 5 μ L/2分の速度でインフュージョンポンプを用いてラットに投与した。

(4) ¾f の沏 I

投与液の脳室内投与後すぐに、ラットは予め重量を測定した餌を入れてあるケージに入れ自由摂食させた。 2時間後に餌の減少量を測定することで摂餌量を算出した。各群の平均摂餌量と標準偏差を図 5に示す。その結果、投与後 2時間の摂餌量は、リラキシン 3を約 50pmol投与したラットでは対照の vehicle投与のラットに比べて有意に増加していた (t 検定、 pく 0. 01)。従って、リラキシン 3は摂食行動を増加させることが分力つた。

[0193] 「実施例 10Ίリラキシン 3の単回脳室内投与時の血中レブチン濃度上昇

血中レブチン濃度の測定

摂餌量測定後 (投与後約 3時間後）に前記ラットをネンブタールにて麻酔し、その腹部大動脈より血液を採取した。採取した血液を 1 , 750 X gで 15分間遠心し、その上清を 80°Cにて保存した。後日、上清中のレブチン量をラットレプチン定量 ELISAキット（アマシャムバイオサイエンス社）により定量した。

その結果、単回のリラキシン 3投与ラットでは対照の vehicle投与のラットより血中のレブチン濃度が有意に上昇することが明ら力となった (t 検定、 pく 0. 05、図 6)。

[0194] 列 ί ί Ίリラキシン- 3持綾による体 ¾谐加端作用の谁

Π )リラキシン 3溶液の調製

リラキシン 3 (ペプチド研究所社)を生理食塩水にて 100 μ molZLとなるように溶解し、 vehicle (生理食塩水）またはリラキシン 3溶液を浸透圧ポンプ（alzet osmot ic pump modell002 (DURECT社）投与量 6 LZ日）とチューブ '投与用力- ユーレに注入しそれらを接続した。

(2) ,験 ^ のための

Wistar雄性ラット（6週齢、日本チャールズリバ一社）に実験動物用飼料 MF (オリェンタル酵母社)を与え、個別飼育で 4日間馴化した。前記ラット（250— 270g)を麻酔下で、側脳室にガイド力-ユーレを挿入し、浸透圧ポンプを皮下に収めた。

(3)本力 tH乍) ¾および摂 H の沏 I

手術日を 0日目として自由摂食下で飼育し、毎朝、体重と餌量を測定した。 0日目力もの体重の増加量を図 7に示した。また、摂餌量は、手術前日から手術日までを 0 日目とし、一日当たりの餌の減少量を摂餌量として示した（図 8)。

手術後 1日目よりリラキシン 3投与ラット群では有意な体重の増加が確認された。また、リラキシン 3投与群の摂餌量も 1日目より有意に増カロした (t 検定、 * * pく 0. 01、水 pく 0. 05)。

(4)脂肪量、血中レプチン量およびインスリン量の定量

実験終了日（14日目）に体重と餌量を測定した後、ラットをネンブタールにて麻酔し、精巣周囲の脂肪を取り出し両精巣周囲の脂肪重量を合わせて測定した (図 9)。さらに、腹部大動脈より血液を採取した。採取した血液を 1, 750 X gで 15分間遠心し、その上清を 80°Cにて保存した。後日、上清中のレブチン量をラットレプチン測定キット (L) (IBL社）により定量した（図 10A)。また上清中のインスリン量を超高感度ラットインスリン測定キット (森永生化学研究所社）により定量した（図 10B)。

その結果、精巣周囲脂肪量は対照の vehicle投与のラットに比較し、リラキシン 3 持続投与群で有意に増カロしていた。また血中のレブチン濃度とインスリン濃度も、リラキシン 3を持続投与したラットで有意に上昇していることが明らかとなった (t 検定、 * * pく 0. 01、 * pく 0. 05)。従って、リラキシン 3投与により脂肪蓄積を伴う肥満作用が亢進するとともに、インスリン量が増加することが明ら力となった。

列 ί2Ίリラキシン- 3持綾による体 ¾谐加、運動量への作用

Π )リラキシン 3溶液の調製

(2) ,験 ^ のための

Wistar雄性ラット（5週齢、日本チャールズリバ一社）に実験動物用飼料 MF (オリェンタル酵母社)を与え、個別飼育で 5日間馴化した。前記ラット（170— 200g)を麻酔下で、側脳室にガイド力-ユーレを挿入し、浸透圧ポンプを皮下に収めた。手術日を 0日として運動量の測定日以外は自由摂食 ·飲水下で飼育し、毎朝体重を測定した（図 11)。

前記実施例 11と同様に、投与後 1日後からリラキシン 3投与ラット群では有意な体重の増加が確認された（t 検定、 * * p〈0. 01、 * p〈0. 05)。

(3)自； ί軍 ¾ の沏 I

前記（2)にて、リラキシン 3投与ラットの体重増加作用に有意な差が認められた日の明期および喑期の自発運動量を、 Versamax (Accuscan社）を用いて測定した。明期 (投与開始後 2、 7日後）、暗期 (投与開始後 3、 8日後)のラットを実験開始の 1時間以上前に個別飼育台力実験室へ移動して馴化した後、 Versamaxケージ内にラットを入れ直後から 90分間の行動量を記録した。 90分間の全活動量を図 12に示した。

いずれの日においても各群のラットで運動量には有意な変化は認められな力つた。すなわち、リラキシン 3による体重増加作用は自発運動量の変化が作用しているのではないことが明ら力となった。

産業上の利用可能性

本発明により、有用な摂食亢進作用、体重増加作用および肥満作用を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含有する疾患治療剤、該ポリペプチドの受容体の賦活ィ匕、抑制化をする化合物、物質もしくはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、あるいは該ポリペプチドの発現を阻害する物質などを含有してなる摂食抑制剤、肥満治療剤または糖尿病治療剤などが提供される。

Claims

請求の範囲

[1] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列力なるポリペプチド、またはその塩を含有してなる摂食亢進剤。

[2] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列力なるポリペプチド、またはその塩を含有してなる体重増加剤。

[3] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列力なるポリペプチド、またはその塩を含有してなる脂肪量増加剤。

[4] 次の工程;被験物質を、

[5] 次の工程；

[6] 次の工程； (B)リラキシン 3受容体を介した細胞刺激活性を測定する工程、

を含むことを特徴とする請求項 5に記載の摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニング方法。

[7] リラキシン 3受容体力 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項 4一 6のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。

[8] SALPR力配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項 7に記載のスクリーニング方法。

[9] 次の工程;被験物質を、

[10] 次の工程；

[11] 次の工程；

を含むことを特徴とする請求項 10に記載の摂食を亢進または抑制する化合物またはその塩のスクリーニングキット。

[12] リラキシン 3受容体力 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項 9一 11のいずれか一項に記載のスクリーニングキット。

[13] SALPR力配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項 12に記載のスクリーニングキット。

[14] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、その機能的に等価な改変ポリペプチドもしくは配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列に関して 70%以上の相同性を有するアミノ酸配列力なるポリペプチド、またはその塩を含有してなる体重増加を必要とする疾患の治療剤。

[15] 疾患が拒食症または悪疫質である請求項 14に記載の治療剤。

[16] 次の工程;被験物質を、

[17] 次の工程；

[18] 次の工程；

を含むことを特徴とする請求項 17に記載の体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリ一二ング方法。

[19] リラキシン 3受容体力 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項 16— 18のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。

[20] SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項 19に記載のスクリーニング方法。

[21] 次の工程;被験物質を、

を含むことを特徴とする体重増加作用を有する化合物またはその塩のスクリーニングやット。

[22] 次の工程；

[23] 次の工程；

を含むことを特徴とする請求項 22に記載の体重を増加または減少させる化合物またはその塩のスクリーニングキット。

[24] リラキシン 3受容体力 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項 21— 23のいずれか一項に記載のスクリーニングキット。

[25] SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項 24に記載のスクリーニングキット。

[26] 次の工程;被験物質を、

[27] 次の工程；

[28] 次の工程；

を含むことを特徴とする請求項 27に記載の肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。

[29] リラキシン 3受容体力 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項 26— 28のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。

[30] SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項 29に記載のスクリーニング方法。

[31] 次の工程;被験物質を、

[32] 次の工程；

[33] 次の工程；

を含むことを特徴とする請求項 32に記載の肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニングキット。

[34] リラキシン 3受容体力 SALPRまたはその部分ポリペプチドであることを特徴とする請求項 31— 33のいずれか一項に記載のスクリーニングキット。

[35] SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項 34に記載のスクリーニングキット。

[36] SALPR阻害作用を有する化合物を含有する摂食抑制剤。

[37] SALPR阻害作用を有する化合物が、請求項 7または 8に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする請求項 36に記載の剤。

[38] SALPR阻害作用を有する化合物を含有する体重減少剤。

[39] SALPR阻害作用を有する化合物力請求項 19または 20に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする請求項 38に記載の剤。

[40] SALPR阻害作用を有する化合物を含有する脂肪量減少剤。

[41] SALPR阻害作用を有する化合物力請求項 29または 30に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする請求項 40に記載の剤。

[42] SALPR阻害作用を有する化合物を含有する肥満治療剤。

[43] SALPR阻害作用を有する化合物力請求項 19、 20、 29または 30のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする請求項 4

2に記載の剤。

[44] SALPR阻害作用を有する化合物を含有する糖尿病治療剤。

[45] SALPR阻害作用を有する化合物力請求項 19、 20、 29または 30のいずれか一項に記載のスクリーニング方法により得られる化合物であることを特徴とする請求項 4

4に記載の剤。

[46] SALPRが、配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項 36— 45のいずれか一項に記載の剤。

[47] リラキシン 3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の摂食量を測定する工程を含むことを特徴とする、摂食を亢進または抑制するィ匕合物またはその塩のスクリーニング方法。

[48] リラキシン 3受容体に作用する化合物が、請求項 4一 8のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、請求項 47に記載の方法。

[49] リラキシン 3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の体重を測定する工程を含むことを特徴とする、体重を増加または減少させるィ匕合物またはその塩のスクリーニング方法。

[50] リラキシン 3受容体に作用する化合物が、請求項 16— 20のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、請求項 49に記載の方法。

[51] リラキシン 3受容体に作用する化合物をヒトまたはヒト以外の生物に投与し、投与後の肥満の指標を測定する工程を含むことを特徴とする、肥満調節に係る化合物またはその塩のスクリーニング方法。

[52] リラキシン 3受容体に作用する化合物が、請求項 26— 30のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物である、請求項 51に記載の方法。