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WO2005056834A1 - 核酸配列解析方法 - Google Patents

核酸配列解析方法 Download PDF

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WO2005056834A1
WO2005056834A1 PCT/JP2004/018483 JP2004018483W WO2005056834A1 WO 2005056834 A1 WO2005056834 A1 WO 2005056834A1 JP 2004018483 W JP2004018483 W JP 2004018483W WO 2005056834 A1 WO2005056834 A1 WO 2005056834A1
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WO
WIPO (PCT)
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nucleic acid
hybrid
detected
probe
sequence
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2004/018483
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English (en)
French (fr)
Inventor
Tomonori Nagaoka
Takatomo Satoh
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Olympus Corp
Original Assignee
Olympus Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Olympus Corp filed Critical Olympus Corp
Priority to JP2005516189A priority Critical patent/JPWO2005056834A1/ja
Publication of WO2005056834A1 publication Critical patent/WO2005056834A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing a nucleic acid sequence.
  • a sequencing-by-hybridization (SBH) method is known as a method for determining a base sequence using a DNA array (Patent Document 1).
  • the SBH method consists of all possible combinations of nucleotides that make up an oligonucleotide of a certain length.Each sequence is arranged on a substrate, and a completely complementary hybrid formed by a hybridization reaction with sample DNA. The sequence is determined by selectively detecting
  • Non-Patent Document 1 a method for comparing and judging the signal intensity of a perfect match, a hybrid form, and a signal strength of a hybrid form, including a single base mismatch, which is somewhat weaker than that of a perfect match.
  • a single-base mismatch probe having a single-base mismatch at the center of the probe sequence of a 15-mer oligonucleotide is prepared, and a perfect match probe and a single-base mismatch probe are formed between the sample DNA and each sample.
  • the intensity of the signal from the hybrid was measured and compared. If the intensity of the perfect match was higher, it was determined that a sequence complementary to the perfect match probe was present in the sample DNA.
  • Patent Document 2 As an analysis example using a plurality of fluorescent dyes, a method described in Patent Document 2 is known. In the method described in this document, a population of nucleic acids obtained from cells Measurements are performed using different fluorescent dyes, and comparative analysis of expression profiles and genomic DNA is performed. In this example, only expression analysis between cells is performed, and the temperature, the composition and the type of the hybridization buffer, and the like are kept constant.
  • Patent Document 1 U.S. Pat.No. 5,202,231
  • Patent Document 2 European Patent No. 0834576B1
  • Non-Patent Document 1 Chie M. et al., "Science”, (USA), 1996, vol. 274, pp. 610-614.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and is intended to reduce the number of spots per unit analysis item and increase the total number of analysis items on an array, which are required for sequence analysis. , Means for reducing the cost of the experimental system.
  • the present invention has the following configuration.
  • a sample containing a nucleic acid to be detected is brought into contact with a probe nucleic acid having a sequence complementary to a part of the nucleic acid to be detected to form a first hybrid. Forming step;
  • the labeled nucleic acid for sequence analysis which is significantly lower than the Tm value of the first hybrid and hybridizes at the Tm value, Contacting one hybrid to form a second hybrid;
  • the labeled nucleic acid for sequence analysis has at least a part different bases from each other. There may be a plurality of probe nucleic acid groups having different labels that can be distinguished.
  • the nucleic acid to be detected is labeled with a separate label that can be distinguished from other labels according to the methods of (1) and (2), and the separate label is used.
  • the method may further include a step of measuring the amount of the first hybrid based on knowledge.
  • nucleic acid sequence analysis method of the present invention two or more non-overlapping regions present in the target nucleic acid are complementary to the methods (1) and (3), respectively.
  • Two or more groups of labeled probe nucleic acids for sequence analysis may be used in the step of forming the second hybrid.
  • the step of measuring the signal may be performed by force-intensity data acquisition.
  • the probe nucleic acid may be preliminarily prepared on the carrier surface so as not to affect hybridization with the nucleic acid to be detected. After being immobilized on a surface, separation of the first hybrid and unreacted nucleic acid and separation of the complex and unreacted nucleic acid can be performed by washing the carrier surface.
  • the probe nucleic acid is preliminarily bonded to magnetic beads so as not to affect hybridization with the nucleic acid to be detected, so that the first hybrid is separated from the unreacted nucleic acid, and the complex is separated from the unreacted nucleic acid. Can be performed by applying a magnetic field to the reaction system.
  • the probe nucleic acid in the method of (7) or (9), may have a plurality of kinds of forces and may be immobilized on the same or separate spots. It is possible.
  • the expression level of the gene of interest can be quantified, and the same experiment can be performed following the formation of the first hybrid.
  • the amount of the second hybrid formed in the system it becomes possible to obtain information on the sequence species in the expressed gene as well.
  • analysis of gene expression and analysis of sequence information in the expressed gene have been performed in separate arrays. In the present invention, both are performed in a short time in the same experimental system. It becomes possible.
  • FIG. 1A shows a step of capturing a nucleic acid to be detected with a probe nucleic acid immobilized on a carrier and forming a first hybrid in the nucleic acid sequence analysis method of the present invention. is there.
  • FIG. 1B shows a step of contacting two labeled sequence analysis probe nucleic acids with the first hybrid after the formation of the first hybrid of FIG. 1A in the nucleic acid sequence analysis method of the present invention.
  • FIG. 1C shows a state of a second hybrid formed as a result of the contacting step of FIG. 1B in the nucleic acid sequence analysis method of the present invention.
  • FIG. 2A This figure shows that, when a nucleic acid to be detected contains a plurality of splicing variants, the nucleic acid to be detected is captured by a probe nucleic acid immobilized on a carrier in the nucleic acid sequence analysis method of the present invention.
  • 1 shows a process of forming one hybrid.
  • FIG. 2B This figure shows the step of contacting two labeled probe nucleic acids for sequence analysis with the first hybrid formed in FIG. 2A.
  • FIG. 2C This figure shows the state of the second hybrid formed as a result of the step of FIG. 2B.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a splicing variant.
  • FIG. 4A This figure shows that, in the nucleic acid sequence analysis method of the present invention, when two insertion mutations are present in the nucleic acid to be detected, the nucleic acid to be detected is captured by the probe nucleic acid immobilized on the carrier. 3 illustrates a step of forming a first hybrid.
  • FIG. 4B This figure shows the step of contacting two labeled sequence analysis probe nucleic acids with the first hybrid formed in FIG. 4A.
  • FIG. 4C This figure shows the state of the second hybrid formed as a result of the step of FIG. 4B.
  • FIG. 5A This figure shows that in the nucleic acid sequence analysis method of the present invention, when a plurality of mutations are present in a nucleic acid to be detected, the nucleic acid to be detected is captured by a probe nucleic acid immobilized on a carrier. 1 shows a process of forming one hybrid.
  • FIG. 5B This figure shows the step of contacting four labeled probe nucleic acids for sequence analysis with the first hybrid formed in FIG. 5A.
  • FIG. 5C This figure shows the state of the hybrid portion in the second hybrid formed as a result of the step of FIG. 5B.
  • FIG. 6 shows the experimental results of Example 1.
  • FIG. 7 shows the experimental results of Example 2.
  • Nucleic acid means any of DNA, DNA containing artificial nucleotides, RNA, RNA containing artificial nucleotides, PNA, and PNA containing artificial nucleotides.
  • Hybrid means a duplex formed between any of the nucleic acids described above.
  • the “signal” is a signal that can be appropriately detected and measured by an appropriate means, and includes fluorescence, radioactivity, chemiluminescence and the like.
  • the sequence analysis method comprises the steps of contacting a sample containing a nucleic acid to be detected with a probe nucleic acid having a sequence complementary to a part of the nucleic acid to be detected to form a first hybrid (1);
  • the labeled nucleic acid for sequence analysis which is significantly lower than the Tm value of the first hybrid and hybridizes at the Tm value, Contacting one hybrid to form a second hybrid (3);
  • a probe nucleic acid 2 having a sequence complementary to a specific site of a nucleic acid 3 to be detected in advance is used as a carrier according to methods known in the art.
  • First, an operation of contacting the nucleic acid 3 to be detected with the solid phase immobilized in 1 is performed. Since the sequence of the probe nucleic acid 2 used here is used to capture the nucleic acid 3 to be detected, it is complementary to the sequence of the detection target site of the nucleic acid 3 to be detected, and Desirably, non-specific double strands are not formed between the probe nucleic acid 2 and the probe nucleic acid 2. More preferably, they are completely complementary.
  • the probe nucleic acid 2 to be used is preferably complementary to an invariable part in the gene. That is, if it is considered that a polymorphism or mutation exists in the nucleic acid 3 to be detected in the sample, such a polymorphism or a region containing the mutation is affected by the type of the collected sample. It is considered that it is desirable to use a probe nucleic acid having a sequence complementary to the region).
  • the nucleic acid 3 to be detected may be labeled in advance with a label 10 (for example, a fluorescent substance).
  • a label 10 for example, a fluorescent substance
  • the amount of the nucleic acid to be detected in a sample can be estimated by detecting the label 10. It becomes possible to perform expression frequency analysis. Conversely, it is also possible to estimate the amount of the probe nucleic acid immobilized on the carrier, which can be used for correcting the signal value in the following step (5), which contributes to an increase in measurement accuracy. it can.
  • nucleic acid 3 to be detected is a gene that may cause alternative splicing (see FIGS. 2A to 2C and FIG. 3)
  • Expression level analysis can be performed simultaneously.
  • a sequence complementary to a part of the sequence (sequence a) that does not change even when alternative splicing (FIG. 3) occurs forms first and second hybrids.
  • Nucleic acid 3 to be detected having a sequence complementary to this sequence as a part is captured (FIG. 2A).
  • a hybrid is formed with the probe nucleic acids 4 and 5 corresponding to the sequence b and the sequence c. (Fig. 2B), and by detecting sequence sites that differ due to each alternative splicing (Fig. 2C), it becomes possible to analyze the nucleic acid amount of each splice noriant.
  • step (1) the carrier 1 after the hybridization reaction is removed in order to remove the unreacted nucleic acid 3 to be detected that did not form a hybrid from the hybridization reaction system.
  • step (2) of cleaning the surface of (2) as appropriate (return to FIGS. 1A-C).
  • This step is optional, and if not performed, it may be performed by washing in the following step (4) V.
  • a solution used for washing a solution having a composition such that the first hybrid 8 is not dissociated is used under such conditions that the first hybrid 8 is not dissociated.
  • a region different from the region where the probe nucleic acid 2 (see FIG. 1B) hybridizes to the nucleic acid 3 to be detected is significantly lower than the Tm value of the above-mentioned first hybrid 8 and is hybridized at the Tm value.
  • the labeled sequence analysis probe nucleic acids 4 and 5 containing the labeled sequence analysis probe nucleic acid 5 to be contacted are brought into contact with the first hybrid 8 described above.
  • a step of forming the second hybrid 9 is performed. This hybridization is performed under the condition that only the labeled nucleic acid for sequence analysis probe nucleic acid 4 hybridizes with the nucleic acid 3 to be detected, and competition occurs between both probes.
  • Probe nucleic acids 4 and 5 shown in FIG.1B have labels 11 and 12, respectively, and have base 21 complementary to base 20 or base 22 different from base 21 in the nucleic acid to be detected, respectively. Have. Here, the signs 11 and 12 need to be distinguishable from each other.
  • the label is not particularly limited as long as it can be detected in the measurement system to be used, but more specifically, a fluorescent substance can be used. Examples of the fluorescent substance include fluorescent dyes such as FITC, rhodamine, Cy3, Cy5, and Texas Red, and fluorescent glass particles. Labels other than fluorescent substances include colloidal particles of various metals such as gold and silver, and resins such as latex. It is also possible to use colloidal particles of a dielectric such as semiconductor, glass and the like.
  • FIG. 1C shows a state where the second hybrid 9 is formed following the first hybrid 8. Since the hybridization reaction is performed under the condition that only a perfect match is formed, only the probe nucleic acid 4 having a sequence that perfectly matches the specific region in the nucleic acid 3 to be detected is used as the nucleic acid 3 to be detected. And a second hybrid, and a probe nucleic acid 5 that does not completely match the specific region and an extra probe nucleic acid 4 exist outside the second hybrid 9.
  • base 20 in the nucleic acid to be detected and base 21 in probe nucleic acid 4 are complementary to each other, forming base pair 23.
  • base pair 23 Although not specifically shown, since the second hybrid is a perfect match, all parts other than base pair 23 form base pairs.
  • a step of separating a complex consisting of the first hybrid 8 and the second hybrid 9 from unreacted nucleic acids contained in the entire reaction system is performed.
  • This step can be performed by washing similarly to the above optional step.
  • the solution used for the washing is a solution having such a composition that the first hybrid 8 and the second hybrid 9 and the hybrid 9 are not dissociated, and the washing is performed under the condition that non-specific binding other than both hybrids does not occur.
  • a probe solution is used in a sample solution in which a hybridization reaction has been carried out, and a probe solution is used.
  • a step of measuring a signal of the labeling power in the complex is performed, and a sequence is analyzed using the obtained data.
  • FIG. 1B and FIG. 1C two kinds (complete match and incomplete match) of probe nucleic acids for sequence analysis were used, and competition and competition were performed.
  • the analysis of the mutation in the region was performed. This can be used in SNPs analysis.
  • the present invention can also be applied to simultaneous detection of a plurality of (two in FIG. 4A-C) insertion mutations, for example, as shown in FIGS. 4A-C.
  • FIG. 4A shows a test containing insertion mutation 24 and insertion mutation 25, and further labeled with fluorescent substance 10.
  • This shows a state in which the target nucleic acid 3 is hybridized to the probe nucleic acid 2 immobilized on the carrier 1.
  • probe nucleic acids 4 and 5 labeled with fluorescent substances 11 and 12, respectively are brought into contact (FIG. 4B). This contact is performed under conditions where only a perfect match between the probe nucleic acids 4 and 5 and the nucleic acid 3 to be detected occurs.
  • FIG. 4C shows a state after washing the carrier surface to remove unreacted nucleic acids as described above.
  • insertion mutation can be simultaneously detected by using a plurality of probe nucleic acids.
  • the mode of detecting an insertion mutation is shown, but it is also possible to detect a deletion mutation, an inversion mutation, and the like.
  • FIGS. 1A-C, FIGS. 2A-C, and FIGS. 4A-C basic examples using two types of labeled sequence analysis probe nucleic acids are shown. Types and four types of labeled probe nucleic acids for sequence analysis can also be used. If each probe nucleic acid for sequence analysis is labeled with a distinguishable label, it becomes possible to simultaneously detect information on polymorphism of the nucleic acid to be detected contained in the sample.
  • sequence of the nucleic acid molecule to be a sample is heterozygous (heterozygous
  • the present invention can be effectively used in such a case.
  • mammalian cells there are two types of sequence because a paternal sequence and a maternal sequence exist.
  • sequence diversity as in the case of cancer cells, more types of sequences may be mixed. Therefore, when performing mutation analysis of a sample containing such a heterologous nucleic acid molecule, in the present invention, a plurality of probe nucleic acids for sequence analysis are each labeled with a discriminable fluorescent substance or the like to express each mutation. By examining the frequency, it is possible to analyze the diversity of the sequence in the sample.
  • the amount ratio of the label of the plurality of types of probe nucleic acids for sequence analysis in the second hybrid depends on the sequence in the sample containing the nucleic acid to be detected. It is a true reflection of the species abundance.
  • the reaction using the probe nucleic acid for each sequence analysis is used in an independent spot, so that the amount of the nucleic acid immobilized on the surface of the carrier is determined. Without the correction, it was impossible to determine the abundance ratio of the sequence species as in the present invention. Force In the present invention, this has been made possible by forming a first hybrid and a second hybrid.
  • FIGS. 5A to 5C show the results of analysis using four types of probe nucleic acids when there is diversity in the sequence of the nucleic acid to be detected in the sample.
  • FIG.5A shows a state in which the nucleic acid 3 to be detected is hybridized to the probe nucleic acid 2 immobilized on the carrier 1, but the nucleic acid 3 to be detected is located at a specific site in a certain region. It shows a polymorphism containing any of base 20, base 30, base 40 or base 50.
  • the probe nucleic acids 4, 5, 6, and 7 are brought into contact with the first hybrid in this state.
  • probe nucleic acids 4, 5, 6, and 7 are labeled with fluorescent substances 10, 11, 12, or 13, respectively, and each of them has a base 20, 30, 40, or 50 in the nucleic acid 3 to be detected.
  • Complementary bases 21, 31, 41, or 51 are included at corresponding sites.
  • FIG. 5C shows a state in which a hybrid is formed by perfect match between each of nucleic acid 3 to be detected and probe nucleic acids 4, 5, 6, and 7, with respect to the hybridized portion.
  • a state is shown in which bases 20 and 21, a base 30 and a base 31, a base 40 and a base 41, and a base 50 and a base 51 form a complementary pair (the same symbols in the figure). Indicates a complementary base pair).
  • the present invention by labeling a plurality of probe nucleic acids with a distinguishable fluorescent substance or the like, the polymorphism contained in the nucleic acid to be detected in the sample is simultaneously detected, and further, the respective fluorescence intensities are detected. By comparing the results, it becomes possible to analyze the frequency of mutation.
  • the data of the signal when measuring a signal from a hybrid, can be obtained forcefully.
  • the acquisition of force-kinetic data means that the measurement is performed while changing the measurement conditions or detection conditions of the hybridization reaction between the nucleic acid to be detected and the probe nucleic acid.
  • Performing force-independent measurement 'detection can reduce the effects of sequence differences.
  • Force-independent data acquisition can be performed within a range of minutes to hours by changing the reaction temperature, which is not a fixed point in time, or at least one of the composition, volume, or type of the reaction solution. Do with.
  • the reaction conditions can be changed stepwise or continuously.
  • the hybridization reaction can be advanced under a plurality of reaction conditions and measured over time. Becomes possible. Therefore, even if multiple types of probes with different sequence-specific characteristic values, such as Tm values, are immobilized on the same array, the kinetic data acquisition can reduce the range of the characteristic values. By conducting experiments taking this into account, it is possible to detect multiple types of sequences almost simultaneously and accurately.
  • the hybrid containing the magnetic beads by applying a magnetic field to the reaction solution containing the hybrid nucleic acid and the unreacted nucleic acid without bonding the probe nucleic acid to the carrier surface without immobilizing it on the carrier surface, It is also possible to separate unreacted nucleic acids that do not contain magnetic beads. When this mode is used, it is possible to perform a reaction, measurement, and the like in a liquid phase without going through a reaction in a solid phase.
  • a probe nucleic acid when a probe nucleic acid is immobilized on a carrier, various forms of the carrier can be applied.
  • a two-dimensional substrate such as a silicon wafer or glass, a membrane filter, a microtiter plate, various glass bead resin beads, various porous substrates, and various gels can be applied.
  • Microarrays can be used.
  • a plurality of types of probe nucleic acids can be immobilized on the same or different spots on a carrier such as a microarray.
  • the first probe is also immobilized on the same spot by selecting a plurality of local forces in the sequence of the same target nucleic acid.
  • a first hybrid is formed between the target nucleic acid and the first probe.
  • the first probe is of one type and the efficiency of the hybridization is low, sufficient signal intensity may not be obtained even if the second hybrid is formed.
  • the first probe must be Selecting from multiple locations in the sequence allows the efficiency of the hybridization to be averaged, so that sufficient signal strength is obtained when the second hybrid is formed.
  • a probe nucleic acid for detecting a p53 cancer suppression gene that hybridizes with the amplified DNA was synthesized and immobilized on a substrate having a porous structure.
  • the hybridization was analyzed using a PAM microarray system (FD10, manufactured by Olympus Corporation).
  • the experimental system is designed to automatically drive the solution around the reaction filter, control the temperature, and record images of the fluorescent spots! 50 L of the reaction solution was added to the reaction portion of the dedicated chamber in which the microarray having a diameter of 6 mm was installed, the solution was driven and the temperature was changed, and a fluorescence image was taken.
  • the sample solution is dissolved in hybridization buffer to 3xSSPE, added to the microarray, and transferred to and from the nucleic acid reaction carrier with a porous structure at 52 ° C 30 times. (Drive control).
  • the nucleic acid to be detected and the probe nucleic acid for detecting the P53 cancer suppressor gene hybridized to form a first hybrid are dissolved in hybridization buffer to 3xSSPE, added to the microarray, and transferred to and from the nucleic acid reaction carrier with a porous structure at 52 ° C 30 times. (Drive control).
  • the nucleic acid to be detected and the probe nucleic acid for detecting the P53 cancer suppressor gene hybridized to form a first hybrid is dissolved in hybridization buffer to 3xSSPE, added to the microarray, and transferred to and from the nucleic acid reaction carrier with a porous structure at 52 ° C 30 times. (Drive control).
  • a normal-type probe nucleic acid (SEQ ID NOS: 5 and 7) for p53 cancer suppressor gene sequence analysis which is fluorescently labeled with Cy3 and has an ATG sequence at codon 273, is labeled with Cy5, and codon 273 is
  • An equal amount of a variant probe nucleic acid (SEQ ID NOS: 6 and 8) for p53 cancer suppression gene sequence analysis having an ATA sequence was added, and the probe solution for sequence analysis was driven 30 times at 50 ° C. In these reactions, hybridization occurred only when the nucleic acid to be detected and the probe nucleic acid for p53 cancer suppressor gene sequence analysis were completely identical, and hybrid nos. And nino hybrids were formed by the completely identical hybrid. The signal of each fluorescent dye is detected and These images were analyzed using analysis software programmed for mutation detection, and the presence of the sequence was estimated.
  • RNA extraction was performed using an RNA extraction kit ISOGEN (Futtsubon Gene) according to the instructions.
  • the cell population after the culture was mixed at each ratio, and dissolved in 3 mL of Isogen (4 M guanidinium thiocyanate, 25 mM sodium cyanate, 0.5% sarcosyl sarcosyl, 0.1 M j8-mercaptoethanol, pH 7.0).
  • Isogen 4 M guanidinium thiocyanate, 25 mM sodium cyanate, 0.5% sarcosyl sarcosyl, 0.1 M j8-mercaptoethanol, pH 7.0.
  • the suction operation was performed 20 to 30 times with a 2.5 mL syringe equipped with a 20G cathelin injection needle.
  • RNA Fluorescence Labeling Core Kit TaKaRa
  • reverse transcription was performed using oligo-dT as a primer and Reverse Transcriptase to prepare a single-stranded fluorescently labeled cDNA.
  • labeling was performed using Alexa Fluor 488-dUTP (Moleculer probe) instead of Cy3-dUTP or Cy5-dUTP as a substrate.
  • this cDNA was purified using a column attached to the kit, and enzymes were removed by phenol-form extraction with chloroform and ethanol precipitation, followed by dissolving in 35 ml of water. This was heat-denatured at 94 ° C for 5 minutes, quenched to 4 ° C, and mixed with 6xSSPE buffer to obtain a hybridization sample.
  • the fluorescence levels of these three fluorescent dyes were measured.
  • the relationship between the fluorescence intensity and the number of molecules of the probe used for the sequence analysis was measured in advance, and the amount of fluorescence between dyes could be estimated.
  • the expression level of the entire gene and the expression level of each genotype could be estimated.
  • the p53 gene of WTK-1 did not show a normal signal, and all were expressed as mutants.
  • the nucleic acid sequence analysis method of the present invention can perform gene expression analysis and mutation analysis in parallel, and can not only examine the expression of a specific gene, but also determine the type of mutation in the expressed gene. Information can be obtained quickly and accurately. SNPs analysis and nucleotide sequence analysis of point mutation, insertion mutation, deletion mutation and the like can be performed. In addition, the expression frequency analysis of the gene can be performed simultaneously with the analysis of these nucleotide sequences. Select more Even if the expression frequency of a gene that may cause splicing is analyzed, it is possible to analyze the nucleic acid amount of the nuclear splice novel, so that an analysis that has a good correlation with the expression level of the protein must be performed. It becomes possible.

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Abstract

　本発明は、ＤＮＡアレイ等を用いた核酸配列解析系における、解析可能数を増大させることを目的とする。本発明の核酸配列解析を行う方法は、検出対象核酸を捕獲するためのプローブ核酸と検出対象との間に第一のハイブリッドを形成しておき、そのハイブリッドに対して、別個の標識済配列解析用プローブ核酸を接触して第二のハイブリッドを形成し、その完全マッチしたハイブリッド中のシグナルを選択的に測定する。

Description

核酸配列解析方法
技術分野
[0001] 本発明は、核酸配列を解析する方法に関する。
背景技術
[0002] DNAアレイを利用して塩基配列を決定する方法としてシーケンシング ·バイ ·ハイブ リダィゼーシヨン法（Sequencing by Hybridization: SBH)が知られている（特許文献 1) 。 SBH法は、ある長さのオリゴヌクレオチドを構成する、ヌクレオチドの可能な組合せ 配列の全てからなるものの各配列を基板上に並べ、検体 DNAとのハイブリダィゼー シヨン反応によって形成される完全に相補的なハイブリッドを選択的に検出すること で配列を決定するものである。
[0003] SBH法に限らず、一般にオリゴヌクレオチドプローブと検体 DNAの相補性を調べ る場合には、ひとつの塩基について 1種類のプローブのみでハイブリッドの有無を判 定してその塩基を決定することは非常に難しい。理由の一つにはハイブリッドの安定 性自体がそれぞれの配列に依存して変動するものであることが挙げられる。また特定 の測定結果が得られれば完全に相補的なノ、イブリツドが形成されていると判断できる ような「測定値の絶対値」と 、うものが存在しな 、ためでもある。
[0004] そこで、完全マッチのノ、イブリツド体と、完全マッチのものより幾分強度が弱くなる 1 塩基のミスマッチを含むノ、イブリツド体のシグナル強度を比較して判定する方法が開 発されている（非特許文献 1)。この方法では、 15merのオリゴヌクレオチドのプロ一 ブ配列の中心部分に 1塩基ミスマッチを配した 1塩基ミスマッチプローブを用意し、完 全マッチプローブと 1塩基ミスマッチプローブのそれぞれが検体 DNAとの間で形成 するハイブリッドからのシグナル強度を測定 '比較し、完全マッチの方が強度が強いと きにその完全マッチプローブに相補的な配列が検体 DNA中に存在すると判定して いる。
[0005] また、複数の蛍光色素を用いた解析例として、特許文献 2に記載の方法が知られて いる。この文献に記載の方法においては、細胞から得た核酸の集団に対しそれぞれ 異なった蛍光色素を用いて測定を行 ヽ、発現プロファイルやゲノム DNAの比較解析 を行っている。この例においては細胞間の発現解析を行うのみであり、温度ゃハイブ リダィゼーシヨンバッファーの組成や種類などを一定条件にしている。
特許文献 1 :米国特許第 5,202,231号明細書
特許文献 2：欧州特許第 0834576B1号明細書
非特許文献 1 :チ一ら（Chee M. et al.)、 「サイエンス」（"Science") , (米国）、 1996年 、 274卷、 pp.610 - 614
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] SBH法やマイクロアレイにおいて多数の 1塩基置換を検出する場合には、 1塩基ず つ異なった全ての種類の配列をスポットする必要がある。アレイの作成において、固 相化するプローブを製造して、これを個々のスポットに固相化するのに必要なコスト はアレイ全体の製造コストの中で非常に大きい割合を占める。例えば 10箇所の SNP を検出する場合には、最低でも 20 (10SNPサイト x2タイプ)のプローブを製造して担 体へスポットする必要がある。そのため、一枚のアレイにおいて解析することができる 変異の数には限界が存在している。このような限界に鑑みて、解析の効率性を高め るためにアレイのスポット密度を増やし、各アレイの解析能力を向上させることが望ま しいと考えられる。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明は斯力る事情に鑑みてなされたものであり、配列解析において必要となる、 単位解析項目数当たりのスポット数を減らし、アレイ上での全解析項目数を増やすこ とによって、実験系のコストを削減する手段を提供するものである。
[0008] 本発明は以下のような構成をとる。
(1)本発明の核酸配列解析方法は、検出対象核酸が含まれる試料を、当該検出対 象核酸の一部に対して相補的な配列を有するプローブ核酸に接触して第 1ハイプリ ッドを形成する工程；
適宜、未反応の上記プローブ核酸及び/又は未反応の上記検出対象核酸を、第 1 ノ、イブリツドから分離する工程； 上記プローブ核酸が上記検出対象核酸にハイブリダィズする領域とは異なる領域 に対して、当該第 1ハイブリッドの Tm値よりも有意に低 、Tm値でノヽイブリダィズする 標識済配列解析用プローブ核酸を、上記第 1ハイブリッドに接触して第 2ハイブリッド を形成する工程；
上記第 1ハイブリッド及び上記第 2ハイブリッドからなる複合体を、反応系全体に含 まれる未反応核酸から分離する工程；
上記複合体中の標識力 のシグナルを測定する工程；
を含むものである。
[0009] (2)本発明の核酸配列解析方法では上記（1)の方法にぉ 、て、前記標識済配列 解析用プローブ核酸を、少なくともその一部において互いに異なる塩基を有し、それ ぞれ識別可能な異なった標識を有する複数のプローブ核酸群とすることができる。
(3)また本発明の核酸配列解析方法では上記（ 1)及び (2)の方法にぉ 、て、前記 検出対象核酸を他の標識と識別可能な別個の標識によって標識し、当該別個の標 識に基づき前記第 1ハイブリッドの量を測定する工程を更に含めることも可能である。
[0010] (4)本発明の核酸配列解析方法では上記（1)一 (3)の方法にぉ 、て、上記標的核 酸中に存在する、重なり合わない二以上の領域に対してそれぞれ相補的なニ群以 上の標識済配列解析用プローブ核酸群を、上記第 2ハイブリッドを形成する工程に おいて使用してもよい。
(5)また本発明の核酸配列解析方法では上記（1)一 (4)の方法にぉ 、て、上記第 1ハイブリッドの量を基にして、検出された標識の量の補正を行う工程を更に含めるこ とがでさる。
(6)本発明の核酸配列解析方法では上記（1)一 (5)の方法にぉ 、て、前記シグナ ルを測定する工程を、力イネティックなデータ取得により行うことも可能である。
[0011] (7)更に本発明の核酸配列解析方法では上記（1)一（6)の方法において、上記プ ローブ核酸を、検出対象核酸とのハイブリダィズに影響しな 、ようにして予め担体表 面に固相化しておき、前記第 1ハイブリッドと未反応核酸との分離、及び前記複合体 と未反応核酸との分離を、当該担体表面の洗浄により行うことが可能である。
(8)また、本発明の核酸配列解析方法では上記（1)一（6)の方法において、上記 プローブ核酸を、検出対象核酸とのハイブリダィズに影響しな ヽようにして予め磁気 ビーズと接合しておき、前記第 1ハイブリッドと未反応核酸との分離、及び前記複合 体と未反応核酸との分離を、反応系に磁場をかけることにより行うことも可能である。
[0012] (9)本発明の核酸配列解析方法では上記（7)の方法にぉ 、て、上記担体としてマ イクロアレイを使用することが好まし 、。
(10)また、本発明の核酸配列解析方法では上記（7)又は（9)の方法において、上 記プローブ核酸を複数種類力もなるものとし、同一又は別個のスポット上に固相化す ることが可能である。
発明の効果
[0013] 本発明の方法においては、形成された第 1ハイブリッドの量を測定することにより、 注目している遺伝子の発現量を定量することが可能となり、第 1ハイブリッドの形成に 引き続いて同一実験系にて形成される第 2ハイブリッドの量を測定することにより、当 該発現遺伝子中の配列種についての情報をあわせて取得することが可能になる。従 来の方法では、遺伝子の発現についての解析と、発現した遺伝子中の配列情報の 解析は、それぞれ別個のアレイにおいて行われていた力 本発明においては両者を 同一実験系にて短時間で行うことが可能となって 、る。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1A]この図は本発明の核酸配列解析方法において、担体上に固相化されたプロ ーブ核酸により検出対象核酸を捕獲して第 1ハイブリッドを形成する工程を示すもの である。
[図 1B]この図は本発明の核酸配列解析方法において、図 1Aの第 1ハイブリッドの形 成後に、二つの標識済配列解析用プローブ核酸を当該第 1ハイブリッドに接触させる 工程を示すものである。
[図 1C]この図は本発明の核酸配列解析方法において、図 1Bの接触工程の結果形 成される第 2ハイブリッドの状態を示すものである。
[図 2A]この図は本発明の核酸配列解析方法において、検出対象核酸中にスプライ シングバリアントが複数含まれる場合に、担体上に固相化されたプローブ核酸により 検出対象核酸を捕獲して第 1ハイブリッドを形成する工程を示すものである。 [図 2B]この図は図 2Aで形成された第 1ハイブリッドに対して、二つの標識済配列解 析用プローブ核酸を接触させる工程を示すものである。
[図 2C]この図は図 2Bの工程の結果形成される第 2ハイブリッドの状態を示すもので ある。
[図 3]この図は、スプライシングバリアントを説明する図である。
圆 4A]この図は本発明の核酸配列解析方法において、検出対象核酸中に二つの挿 入変異が存在する場合に、担体上に固相化されたプローブ核酸により検出対象核 酸を捕獲して第 1ハイブリッドを形成する工程を示すものである。
[図 4B]この図は図 4Aで形成された第 1ハイブリッドに対して、二つの標識済配列解 析用プローブ核酸を接触させる工程を示すものである。
[図 4C]この図は図 4Bの工程の結果形成される第 2ハイブリッドの状態を示すもので ある。
圆 5A]この図は本発明の核酸配列解析方法において、検出対象核酸中に複数の変 異が存在する場合に、担体上に固相化されたプローブ核酸により検出対象核酸を捕 獲して第 1ハイブリッドを形成する工程を示すものである。
圆 5B]この図は図 5Aで形成された第 1ハイブリッドに対して、 4つの標識済配列解析 用プローブ核酸を接触させる工程を示すものである。
[図 5C]この図は図 5Bの工程の結果形成される第 2ハイブリッドにおけるハイブリッド 部分の状態を示すものである。
[図 6]この図は、実施例 1の実験結果を示すものである。
[図 7]この図は、実施例 2の実験結果を示すものである。
符号の説明
1· · '担体、 2· · 'プローブ核酸 A、 3·· ·検出対象核酸、 3' · · ·検出対象核酸 (スブラ イシングバリアント # 1)、 3" · · '検出対象核酸 (スプライシングバリアント # 2)、 4 · · · プローブ核酸 B、 5·· 'プローブ核酸 C、 6·· 'プローブ核酸 D、 7· · 'プローブ核酸 Ε、 8·· '第 1ノヽイブリツド、 9·· '第 2ハイブリッド、 10· · '蛍光物質 Α、 11·· '蛍光物質 Β、 12·· ·蛍光物質 C、 13·· ·蛍光物質 D、 20· · ·塩基 A、 21·· ·塩基 Aと相補的な塩基 、 22· · ·塩基 Aと非相補的な塩基、 23· · ·相補的塩基対、 24· · ·挿入変異 A、 25··· 挿入変異 B、 30· · ·塩基 B、 31 · · ·塩基 Bと相補的な塩基、 40· · ·塩基 C、 41…塩 基 Cと相補的な塩基、 50· · ·塩基 D、 51 · · ·塩基 Dと相補的な塩基
発明を実施するための最良の形態
[0016] (定義）
本願明細書にぉ 、ては、以下の用語を以下に定義した意味にぉ 、て用いる。 「核酸」とは、 DNA、人工的ヌクレオチドを含む DNA、 RNA、及び人工的ヌクレオ チドを含む RNA、 PNA、人工ヌクレオチドを含む PNAの何れをも意味する。
「ハイブリッド」とは、上記の核酸の何れかの間に形成される二重鎖を意味する。 「シグナル」とは、適当な手段により適宜検出'測定可能な信号であって、蛍光、放 射能、化学発光等が含まれる。
[0017] 以下においては、プローブ核酸が担体に固相化されている例を本発明の一実施 態様として、その構成、実施方法、効果等について、適宜図を参照しながら説明する 本発明の核酸配列解析方法は、検出対象核酸が含まれる試料を、当該検出対象 核酸の一部に対して相補的な配列を有するプローブ核酸に接触して第 1ハイブリッド を形成する工程（1) ;
適宜、未反応の上記プローブ核酸及び未反応の上記検出対象核酸を、第 1ハイブ リツドから分離する工程 (2) ;
上記プローブ核酸が上記検出対象核酸にハイブリダィズする領域とは異なる領域 に対して、当該第 1ハイブリッドの Tm値よりも有意に低 、Tm値でノヽイブリダィズする 標識済配列解析用プローブ核酸を、上記第 1ハイブリッドに接触して第 2ハイブリッド を形成する工程 (3) ;
上記第 1ハイブリッド及び上記第 2ハイブリッドからなる複合体を、反応系全体に含 まれる未反応核酸から分離する工程 (4)；
上記複合体中の標識力 のシグナルを測定する工程 (5)；
を含んでいる。
[0018] 上記工程（1)においては（図 1A参照）、予め検出対象核酸 3の特定部位に相補的 な配列を有するプローブ核酸 2を当該技術分野にぉ 、て知られる方法にぉ 、て担体 1に固相化しておいたものに対し、検出対象核酸 3を接触する操作をまず行う。ここで 使用するプローブ核酸 2の配列は検出対象核酸 3を捕獲するために行うものであるた め、検出対象核酸 3の検出対象部位の配列に対して相補的なものであり、検出対象 核酸 3とプローブ核酸 2との間に非特異的な二本鎖が形成されな 、ことが望ま 、。 より好ましくは両者は完全に相補的である。検出対象核酸 3が含まれる試料が例えば 特定の遺伝子を含む DNAである場合、使用するプローブ核酸 2は、当該遺伝子中 の不変部分に対して相補的であることが好ましい。即ち試料中の検出対象核酸 3に 多型や変異が存在すると考えられる場合には、そのような多型を構成したり、変異を 含んで 、な 、領域 (採取した試料の種類によって影響を受けな 、と考えられて 、る領 域）に対して相補的な配列を有するプローブ核酸を利用することが望ま 、。
[0019] 検出対象核酸 3とプローブ核酸 2との間の接触は、検出対象核酸 3中に特定領域 が含まれる場合に、当該プローブ核酸との間で完全にマッチしたハイブリッド (第 1ノヽ イブリツド 7)のみが形成される条件において行う。より具体的には、接触を行う際の温 度、塩濃度、 pHなどを当該技術分野で公知の基準に基づいて決定するか、または 予備実験を行って最適な条件を検討しておくことが望ましい。
[0020] 検出対象核酸 3を予め標識 10 (例えば蛍光物質）により標識しておいてもよぐその 場合には標識 10を検出することにより、試料中の検出対象核酸の量を推定すること が可能になり、発現頻度解析を行うことが可能になる。また逆に、担体に固相化した プローブ核酸の量を推定することも可能であり、以下の工程（5)のシグナル値の補正 に供することが可能となり、測定精度の上昇に寄与することができる。
[0021] 更には、検出対象核酸 3が、選択的スプライシングが起こる可能性がある遺伝子で ある場合には（図 2A-C、図 3参照）、配列の異なる検出対象核酸 3'、 3" (配列の異 なった RNA分子；図 2A-C中、配列 b及び配列 cを含む検出対象核酸 3"と、配列 bを 含まず配列 cを含む検出対象核酸 3'とが存在している）の発現量解析を同時に行う ことができる。図 2A-Cに示される例の場合、選択的なスプライシング（図 3)が起こつ ても変化しない配列（配列 a)の一部に相補的なものを、第一のノ、イブリツドを形成さ れるプローブに用い、この配列と相補的な配列を一部に持つ検出対象核酸 3を捉え る（図 2A)。次に、配列 bと配列 cに対応したプローブ核酸 4、 5とハイブリッドを形成さ せて（図 2B)、それぞれの選択的スプライシングによって異なってくる配列部位を検 出する（図 2C)ことによって、各スプライスノリアントの核酸量を解析することが可能に なる。
[0022] 上記工程（1)に引き続き、ハイブリッドを形成するに至らなかった未反応検出対象 核酸 3をノヽイブリダィゼーシヨン反応系から除去するため、ハイブリダィゼーシヨン反 応後の担体 1の表面を洗浄する工程（2)を適宜行う（図 1A-Cに戻る）。この工程は オプションであり、行わない場合には以下の工程 (4)における洗浄により実施してもよ V、が、第 2ハイブリッド 9の形成をより好ま 、条件下で行うためには、工程 (2)を行 ヽ 、未反応の検出対象核酸 3を除去しておくことが望ましい。洗浄に使用する溶液は、 第 1ハイブリッド 8が解離しないような組成の溶液を、同じく第 1ハイブリッド 8が解離し な 、ような条件にぉ 、て使用する。一般的にはハイブリッド形成反応を行った試料溶 液に検出対象核酸を含めていないものを利用して、ハイブリッド反応よりも高くなぐ 非特異的結合がプローブ核酸と検出対象核酸との間に形成されない温度で洗浄を 行う。
[0023] 次に、プローブ核酸 2 (図 1B参照）が検出対象核酸 3にハイブリダィズする領域とは 異なる領域に対し、上記第 1ハイブリッド 8の Tm値よりも有意に低 、Tm値でノヽイブリダ ィズする標識済配列解析用プローブ核酸 5を含んだ標識済配列解析用プローブ核 酸 4及び 5を、上記第 1ハイブリッド 8に接触する。これにより第 2ハイブリッド 9を形成 する工程を行う。このハイブリッド形成は、標識済配列解析用プローブ核酸 4のみが 検出対象核酸 3とハイブリダィズする条件にお ヽて行われ、両プローブ間で競合が 生じる。図 1Bにおいて示されるプローブ核酸 4及び 5は、標識 11、 12を有し、検出対 象核酸中の塩基 20に対して相補的な塩基 21、又は塩基 21とは異なる塩基 22をそ れぞれ有している。ここで標識 11、 12は、互いに識別できるものである必要がある。 標識としては、使用する測定系において検出可能なものであれば特にその制限はな いが、より具体的には蛍光物質を利用することが可能である。蛍光物質としては、 FI TC、ローダミン、 Cy3、 Cy5、テキサスレッド等の蛍光色素や、蛍光ガラスの粒子など を挙げることができる力 これ以外のものも利用することが可能である。更に蛍光物質 以外の標識としては、金や銀等の種々の金属のコロイド粒子や、ラテックス等の榭脂 、半導体、ガラス等の誘電体のコロイド粒子を用いることも可能である。
[0024] 図 1Cは、第 1ハイブリッド 8に引き続き、第 2ハイブリッド 9が形成された状態を示す ものである。ハイブリダィゼーシヨン反応は、完全マッチのみが形成される条件下で行 つているため、検出対象核酸 3中の特定領域と完全にマッチする配列を有するプロ ーブ核酸 4のみが検出対象核酸 3と第 2ハイブリッドを形成しており、当該特定領域と は完全にはマッチしないプローブ核酸 5、及び余剰のプローブ核酸 4が、第 2ハイブリ ッド 9外に存在している。第 2ハイブリッドは、検出対象核酸中の塩基 20とプローブ核 酸 4中の塩基 21が互いに相補的であり、塩基対 23を形成している。特に図示してい ないが、第 2ハイブリッドは完全マッチであるため、塩基対 23以外の部分においても 全て塩基対を形成している。
[0025] 次に、第 1ハイブリッド 8及び第 2ハイブリッド 9からなる複合体を、反応系全体に含ま れる未反応核酸から分離する工程を行う。この工程は、上記のオプション工程と同様 に、洗浄により行うことができる。洗浄に使用する溶液は、第 1ハイブリッド 8及び第 2 ノ、イブリツド 9が解離しな 、ような組成の溶液を使用し、同じく両ハイブリッド以外の非 特異的結合が生じない条件において行う。一般的にはハイブリッド形成反応を行った 試料溶液にプローブ核酸を含めて 、な 、ものを利用する。
[0026] 次に上記複合体中の標識力 のシグナルを測定する工程を行い、得られたデータ を利用して配列の解析を行う。
[0027] 上記の例では、第 1ハイブリッドの形成後に第 2ハイブリッドの形成を行った力 これ とは逆に、予め液相で第 2ハイブリッドの形成を行ってから、第 1ハイブリッドの形成を 行うことも可能である。
[0028] 図 1B及び図 1Cにお 、ては配列解析用プローブ核酸として 2種類 (完全マッチ及び 不完全マッチ）を用いて、互いに競合するようなノ、イブリダィゼーシヨンを行い、ーケ 所の領域の変異についての解析を行った。これは SNPs解析において利用すること ができるものである。本発明は更に、例えば図 4A-Cに示されるような複数の（図 4A- Cでは二つの)挿入変異を含んでいる場合にそれぞれを同時に検出することにも応 用可能となっている。
[0029] 図 4Aは、挿入変異 24及び挿入変異 25を含み、更に蛍光物質 10で標識された検 出対象核酸 3が、担体 1に固相化されたプローブ核酸 2にハイブリダィズしている状 態を示している。ここに、それぞれ蛍光物質 11又は 12により標識されたプローブ核 酸 4及び 5を接触させている（図 4B)。この接触はプローブ核酸 4、 5と検出対象核酸 3との間の完全マッチのみが生じる条件下で行う。特に図示していないが、未反応の 核酸を除去すベぐ担体表面の洗浄を上記のようにして行った後の状態が図 4Cに示 されている。このように本発明は、複数のプローブ核酸を使用することにより、挿入変 異を同時に検出することも可能なものとなっている。ここでは挿入変異を検出する態 様を示したが、その他にも欠失変異、逆位変異などの検出を行うことも同様に可能で ある。
[0030] 図 1A-C、図 2A-C、及び図 4A-Cにおいては、 2種類の標識済配列解析用プロ一 ブ核酸を利用した基本的な例を示したが、本発明においては 3種類、及び 4種類の 標識済配列解析用プローブ核酸を使用することもできる。それぞれの配列解析用プ ローブ核酸を、互いに識別可能な標識でラベルしておけば、試料中に含まれる検出 対象核酸の多形の情報等について同時に検出することが可能となる。
[0031] 試料となる核酸分子の配列がヘテロである場合 (heterozygousな場合、及び
heterogeneousな場合）があるが、本発明はそのような場合において有効に利用する ことができる。例えば、哺乳類の細胞には、父系の配列と母系の配列とが存在してい るから 2種類の配列種が存在する場合がある。また、癌細胞の場合のように配列の多 様性がある場合には、更に多くの種類の配列が混在することが考えられる。従ってこ のようなへテロな核酸分子を含む試料の変異解析を行う場合には、本発明において 複数の配列解析用プローブ核酸をそれぞれ識別可能な蛍光物質などで標識して、 それぞれの変異の発現頻度を調べれば試料中の配列の多様性の解析を行うことが 可能である。本発明では第 1ハイブリッド形成において、検出対象核酸を捕獲してい るから、第 2ハイブリッド中の複数種類の配列解析用プローブ核酸の標識の量比は、 検出対象核酸を含んでいる試料中の配列種の存在比を忠実に反映したものとなる。 従来の方法にお!ヽては、各配列解析用プローブ核酸を用いた反応をそれぞれ独立 したスポットにお 、て利用して 、たため、担体表面に固相化された核酸の量にっ 、て の補正を行わなければ、本発明のような配列種の存在比を求めることができな力つた 力 本発明では第 1ハイブリッド、第 2ハイブリッドの形成を行うことによりそれが可能 になった。
[0032] 図 5A-Cは、試料中の検出対象核酸の配列に多様性が存在する場合に 4種類の プローブ核酸を利用して解析しているものである。図 5Aは、担体 1に固相化されたプ ローブ核酸 2に対して、検出対象核酸 3がハイブリダィズしている状態を示しているが 、検出対象核酸 3は、ある領域の特定部位において、それぞれ塩基 20、塩基 30、塩 基 40、又は塩基 50の何れかを含む、多型を示すものである。この状態の第 1ハイブリ ッドに対して、プローブ核酸 4、 5、 6、及び 7を接触させる。これらのプローブ核酸 4、 5、 6、及び 7は、それぞれ蛍光物質 10、 11、 12、又は 13により標識されていて、また 、それぞれ検出対象核酸 3中の塩基 20、 30、 40、又は 50に相補的な塩基 21、 31、 41、又は 51を対応する部位に含んでいる。
[0033] 図 5Cは、検出対象核酸 3と、プローブ核酸 4、 5、 6、及び 7のそれぞれの間に完全 マッチによりハイブリッドが形成された状態を、ハイブリダィズ部分に関して示したもの である。この図においては、塩基 20と塩基 21、塩基 30と塩基 31、塩基 40と塩基 41 、及び塩基 50と塩基 51とが相補対を形成している状態が示されている（図中、同一 記号の対は相補的な塩基対を示している）。このように、本発明においては、複数の プローブ核酸をそれぞれ識別可能な蛍光物質などで標識することにより、試料中の 検出対象核酸に含まれる多形性を同時に検出し、更にはそれぞれの蛍光強度を比 較することにより変異の頻度の解析を行うことが可能になっている。
[0034] 本発明の核酸配列解析方法にお!、ては、ハイブリッドからのシグナルを測定する際 に、シグナルのデータ取得を力イネティックに行うことができる。力イネティックなデー タ取得とは、検出対象核酸とプローブ核酸との間のハイブリッド形成反応の測定条件 又は検出条件を変更しながら行うことを意味する。力イネティックな測定'検出を行うこ とにより、配列の差による影響を低減することが可能になる。力イネティックなデータ取 得は、時間に関して定点ではなぐ反応温度、又は反応溶液の組成、容量、若しくは 種類のうちの少なくとも 1つを変更しながら、測定時間を数分間から数時間程度の範 囲内で行う。反応条件の変更は、段階的に又は連続的に行うこともできる。
[0035] 検出対象核酸とプローブ核酸との間のノ、イブリツド形成は通常、配列情報に基づい た推定の最適条件において行われるものである。従ってその条件が本当に最適条件 であるかはわ力もないのが普通である。そのために、静的（非力イネティック）に、又は 定点的に測定を行う場合には、最適ではな 、条件下でのデータ取得を行って 、る可 能性がある。その結果、データの信頼性が十分ではな力つたり、データのばらつきが 存在したりするなどの問題が存在する。
[0036] しかし本発明にお 、て、力イネティックなデータ取得と連動して反応条件を変更す ることにより、複数の反応条件でハイブリダィズ反応を進行させ、それを経時的に測 定することが可能となる。従って、例えば Tm値など、配列固有の特性値が異なる複 数種類のプローブが同一アレイ上に固相化されている場合であっても、カイネテイツ クなデータ取得を行えば、その特性値の範囲を考慮して実験を行い、複数種類の配 列の検出をほぼ同時に正確に行うことが可能となる。
[0037] 上記では、プローブ核酸を予め担体表面に固相化しておき、ハイブリッドと未反応 核酸との分離を、担体表面の洗浄により行う例を挙げた。一方、本発明においてはプ ローブ核酸を担体表面には固相化せずに磁気ビーズに接合させ、ハイブリッドと未 反応核酸力 なる反応溶液に対して磁場をかけて磁気ビーズを含んだハイブリッドと 、磁気ビーズを含まない未反応核酸とを分離することも可能である。この態様を利用 する場合には、固相での反応を介することなぐ液相で反応、測定などを行うことが可 能となる。
[0038] 本発明にお 、て担体にプローブ核酸を固相化する場合には、担体としては、種々 の形態のものを適用することが可能である。例えばシリコンウェハやガラスのような 2 次元基板、メンブレンフィルター、マイクロタイタープレート、種々のガラスビーズゃ榭 脂ビーズ、種々の多孔質基板、種々のゲルを適用することが可能である。マイクロア レイを使用することができる。マイクロアレイ等の担体には、複数種類のプローブ核酸 を、同一又は別個のスポット上に固相化することができる。第 1のプローブを同一標的 核酸の配列中の複数の個所力も選択して、同一スポットに固相化する。次に標的核 酸と第一のプローブとの間に第一のハイブリッドを形成される。第 1のプローブが、 1 種類の時に、ノ、イブリダィゼーシヨンの効率が低いと、第 2のハイブリッドを形成しても 十分な信号強度が得られない場合がある。しかし、第 1のプローブを同一標的核酸の 配列中の複数の個所から選択すると、ハイブリダィゼーシヨンの効率を平均化するこ とができるので、第 2のハイブリッドを形成したときに十分な信号強度が得られる。 実施例 1
p53ガン抑制遺伝子の Codon237における変異を解析する実験を行った。試料とし て、ヒトリンパ芽球腫 WTK-1及び正常細胞株 TK6の細胞株を利用した。 WTK-1では 、 p53遺伝子のェクソン第 7コドンの 273部分力ATG力 ATAへ変異して!/、ることが確 認されている。各培養細胞株のゲノム DNAを定法によって抽出し、それぞれの培養 細胞の DNAを TK6=100%、 TK6:WTK-1=1:1、 WTK-1=100%となるように混合し、この 変異部分を含む 234bpを、配列番号 1-2のプライマーを用いて PCR法により増幅処理 した。得られた増幅 DNAを、 95°Cで熱変性させた。 10分後に急冷し、一本鎖の DN Aサンプルとした。一方、この増幅 DNAとハイブリダィズする p53ガン抑制遺伝子検 出用プローブ核酸 (配列番号 3-4)を合成し、多孔質の構造を有する基板上に固相 化した。ハイブリダィゼーシヨンの分析は、ォリンパス (株)製の PAMマイクロアレイシ ステム： FD10によって行った。この実験システムは、反応フィルターの周りの溶液駆動 と温度制御、および蛍光スポットの画像の記録を自動的に行うことが出来るように設 計されて!、る。直径 6mmのマイクロアレイが設置された専用チャンバ一の反応部分に 、 50 Lの反応溶液を加え、溶液駆動と温度変化を与え、蛍光画像を撮像した。第 1 ハイブリッドの形成反応は、試料溶液をハイブリダィゼーシヨンバッファーに 3xSSPEに なるように溶解し、マイクロアレイに添加後、 52°Cで、多孔質構造を有する核酸反応 担体への出し入れを 30回行うことにより実施した (駆動制御)。これらの反応で、検出 対象核酸と P53ガン抑制遺伝子検出用プローブ核酸がハイブリダィズし、第一のハイ ブリツドが形成された。次に、 Cy3で蛍光標識され、コドン 273部分が ATGの配列を持 つ p53ガン抑制遺伝子配列解析用正常型プローブ核酸 (配列番号 5、 7)と、 Cy5で蛍 光標識され、コドン 273部分が ATAの配列を持つ p53ガン抑制遺伝子配列解析用変 異型プローブ核酸 (配列番号 6、 8)を等量添加し、 50°Cで、配列解析用プローブ溶液 の駆動を 30回行った。これらの反応で、検出対象核酸と p53ガン抑制遺伝子配列解 析用プローブ核酸が完全一致である場合のみハイブリダィズが生じ、完全一致ハイ ブリツドによる第ニノ、イブリツドを形成した。各蛍光色素のシグナルを検出し、得られ た画像を変異検出用にプログラムした解析ソフトウェアを利用して解析しその配列の 存在を推定した。
[0040] 結果を図 4A-Cに示した。本発明を利用したこの実験系にお 、ては、一つのスポッ ト内で、 2色蛍光の強度を測定'比較することにより、一塩基の違いの識別が可能であ ることが確認された。即ち、 TK6のゲノム DNA100%の試料では、 Cy3の蛍光のみがみ られ、 Cy5の蛍光は見られなかった。また、 TK6:WTK-1のゲノム DNAを 1:1に混合し たの試料では、 Cy3と Cy5のシグナルが両方見られた。 WTK-1のゲノム DNA100%の 試料では、 Cy5の蛍光がみられ、 Cy3の蛍光は見られなかった。
実施例 2
[0041] ある細胞内の一遺伝子に、点突然変異による変異型遺伝子と正常型遺伝子が存 在するへテロ接合である場合、発現している mRNAもへテロで存在する。それらの mRNAの存在比率を解析するモデル実験を行った。発現する mRNAがへテロである モデルサンプルとして、ヒトリンパ芽球腫 WTK-1と TK-6の細胞株を利用した。培養細 胞株を TK6:WTK- 1=1:1、 TK6:WTK- 1=0:1となるように混合し、各培養細胞株集団よ り、全 RNAの抽出を行った。全 RNA抽出は、 RNA抽出キット ISOGEN (二ツボンジーン) を用いてその説明書に従って行った。培養後の細胞集団を各割合で混合し、 3 mLの Isogen (4Mチォシアン酸グァ-ジゥム、 25mMシアン酸ナトリウム、 0.5%サルコシル サルコシル、 0.1M j8 -メルカプトエタノール、 pH7.0)に溶解させた。 20Gカテラン注射 針付 2.5 mL注射器で 20— 30回吸出操作を行った。 CHC1を 0.6 mL (Isogenの 1/5量）
3
カロえて、ミキサーで 15秒間混合させた後、室温で 2— 3分間静置させた。 4°Cで 15,000 rpm、 15分間遠心を行った。上清を新しいチューブに移し、 Ethachinmate (二ツボン ジーン) 3 μ L、イソプロパノール 1.5 mL (Isogenの 1/2量）を加え、転倒混和して室温で 10分間静置させた。 4°Cで 15,000rpm、 15分間遠心を行い、沈殿物に 75%エタノール 3 mL (Isogenの等量）をカ卩え、 15,000 rpm、 4°Cで 5分間遠心した。沈殿物を風乾もしく は 2— 3分間真空乾燥させた。 RNase-free蒸留水を 10 /z Lカ卩えて RNA溶液とした。次 に、 p53遺伝子を検出するためのプローブ核酸 (配列番号 3)を合成し、多孔質の構 造を有する基板上に固相化した。ノヽイブリダィゼーシヨンの分析は、ォリンパス (株） 製の PAMマイクロアレイシステム： FD10によって行った。 cDNA合成は、以下のように 行った。全 RNA 2-5 μ g力ら、 RNA Fluorescence Labeling Core Kit (TaKaRa)のプロ トコールにそって cDNAの合成と蛍光ラベリングを行った。即ち、 oligo-dTをプライマー として、 Reverse Transcriptaseを用いて逆転写し 1本鎖の蛍光標識 cDNAを作製した 。この際、基質として Cy3- dUTPや Cy5- dUTPの代わりに、 Alexa Fluor 488- dUTP (Moleculer probe社製)を用い標識した。次に、キットに付属のカラムにより、この cDNA を精製し、フエノール'クロ口ホルム抽出による酵素類の除去とエタノール沈殿を行い 、 35mlの水に溶解した。これを 94°Cで 5分の熱変性を行い、 4°Cに急冷後、 6xSSPEバ ッファーと混合し、ハイブリダィゼーシヨンサンプルとした。これをアレイに入れ、 50°C で 2時間ハイブリダィゼーシヨンした。ハイブリダィゼーシヨン後、 6xSSPEバッファーで 後洗浄を行い、さらに Alexa Fluor 568- dUTP (Moleculer probe)によって標識された p53遺伝子のェクソン第 7コドンの 273部分が ATAへ変異した配列を検出する解析用 プローブ（配列番号 8)と Alexa Fluor 680- dUTP (Moleculer probe)によって標識され た p53遺伝子のェクソン第 7コドンの 273部分が ATGの正常型配列を検出する解析用 プローブ（配列番号 7)を添カ卩し、さらにハイブリダィゼーシヨンを行った。 15分間のハ イブリダィゼーシヨンの後、これらの 3つの蛍光色素の蛍光量を測定した。なお、配列 の解析に用いたプローブの蛍光強度と分子数の関係を予め測定しておき、色素間の 蛍光量力も分子数を推定できるようにした。その結果、図 5A-Cのように、一つのスポ ット内で、 3色蛍光の強度を観察することによって、遺伝子全体の発現量とそれぞれ の遺伝子型の発現量を推定することができた。即ち、 TK6:WTK-1=1:1とした p53遺伝 子は、正常型の mRNAと変異型の mRNAがへテロで発現しているモデルであり、正常 型と変異型の発現量はほぼ 1 : 1の割合であった。また、 WTK-1の p53遺伝子は、正 常型のシグナルが見られず、全て変異型の発現であった。
産業上の利用可能性
本発明の核酸配列解析方法は、遺伝子の発現解析及び変異解析を並行して行う ことが可能であり、特定遺伝子の発現を調べるのみならず、その発現遺伝子中の変 異の種類にっ 、ての情報を迅速且つ正確に取得することが可能である。 SNPs分析 、点変異、挿入変異、欠失変異等の塩基配列解析を行うことができる。また、遺伝子 の発現頻度解析を、これらの塩基配列解析と同時に行うことが可能になる。更に選択 的なスプライシングが起こる可能性のある遺伝子の発現頻度解析を行っても、核スプ ライスノ リアントの核酸量を解析することが可能となるので、タンパク質の発現量と良 好な相関を持った解析が可能となる。

Claims

請求の範囲
[1] 検出対象核酸が含まれる試料を、当該検出対象核酸の一部に対して相補的な配 列を有するプローブ核酸に接触して第 1ハイブリッドを形成する工程；
適宜、未反応の上記プローブ核酸及び/又は未反応の上記検出対象核酸を、第 1 ノ、イブリツドから分離する工程；
上記プローブ核酸が上記検出対象核酸にハイブリダィズする領域とは異なる領域 に対して、当該第 1ハイブリッドの Tm値よりも有意に低 、Tm値でノヽイブリダィズする 標識済配列解析用プローブ核酸を、上記第 1ハイブリッドに接触して第 2ハイブリッド を形成する工程；
上記第 1ハイブリッド及び上記第 2ハイブリッドからなる複合体を、反応系全体に含 まれる未反応核酸から分離する工程；
上記複合体中の標識力 のシグナルを測定する工程；
を含む、核酸配列解析を行う方法。
[2] 前記標識済配列解析用プローブ核酸が、少なくともその一部において互いに異な る塩基を有し、それぞれ識別可能な異なった標識を有する複数のプローブ核酸群で ある、請求項 1に記載の方法。
[3] 前記検出対象核酸を他の標識と識別可能な別個の標識によって標識し、当該別個 の標識に基づき前記第 1ハイブリッドの量を測定する工程を更に含む、請求項 1又は
2に記載の方法。
[4] 上記標的核酸中に存在する、重なり合わない二以上の領域に対してそれぞれ相補 的な二群以上の標識済配列解析用プローブ核酸群を、上記第 2ハイブリッドを形成 する工程において使用する、請求項 1乃至 3の何れか一項に記載の方法。
[5] 上記第 1ハイブリッドの量を基にして、検出された標識の量の補正を行う工程を更に 含む、請求項 1乃至 4の何れか一項に記載の方法。
[6] 前記シグナルを測定する工程が、力イネティックなデータ取得により行われる、請求 項 1乃至 5の何れか一項に記載の方法。
[7] 上記プローブ核酸を、検出対象核酸とのハイブリダィズに影響しな 、ようにして予 め担体表面に固相化しておき、前記第 1ハイブリッドと未反応核酸との分離、及び前 記複合体と未反応核酸との分離を、当該担体表面の洗浄により行う、請求項 1乃至 6 の何れか一項に記載の方法。
[8] 上記プローブ核酸を、検出対象核酸とのハイブリダィズに影響しな 、ようにして予 め磁気ビーズと接合しておき、前記第 1ハイブリッドと未反応核酸との分離、及び前記 複合体と未反応核酸との分離が、反応系に磁場をかけることにより行われる、請求項
1乃至 6の何れか一項に記載の方法。
[9] 上記担体がマイクロアレイである、請求項 7に記載の方法。
[10] 上記プローブ核酸を複数種類力もなるものとし、同一又は別個のスポット上に固相 化されている、請求項 7又は 9に記載の方法。
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