WO2005056811A1

WO2005056811A1 - β−1，4−グルカンをα−グルカンに変換する方法

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Publication number: WO2005056811A1
Application number: PCT/JP2004/018416
Authority: WO
Inventors: Koji Odan; Takeshi Takaha; Takashi Kuriki; Kenichi Kudo; Mamoru Wada; Michihiro Sunako; Junichi Takahara
Original assignee: Ezaki Glico Co Ltd; Sanwa Starch Co Ltd
Current assignee: Ezaki Glico Co Ltd; Sanwa Starch Co Ltd
Priority date: 2003-12-12
Filing date: 2004-12-09
Publication date: 2005-06-23
Anticipated expiration: 2006-06-12
Also published as: CN1894418A; CN1894418B; US20070092949A1; JP4318315B2; JPWO2005056811A1

Abstract

　β−１，４−グルカンからα−グルカンを製造する方法であって、β−１，４−グルカンと、プライマーと、リン酸源と、β−１，４−グルカンホスホリラーゼと、α−１，４−グルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、α−グルカンを生産する工程を包含する、方法が提供される。この方法においては、上記β−１，４−グルカンは、セロビオースであり、上記β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、セロビオースホスホリラーゼであり得る。

Description

明細書

]3—1， 4ーグルカンを α—グルカンに変換する方法

技術分野

[0001] 本発明は、 β -1, 4ーグルカンからひーグルカンを製造する方法に関する。

背景技術

[0002] 人間は、デンプンなどの a—グルカンを消化してエネルギー源として利用している。

a—グルカンは食品産業以外にも、医薬、化粧品、化学工業、製紙、繊維などにおける原料としても幅広く利用されており、非常に有用性の高い物質である。 a—グルカンの中でも特に、アミロースは豊富な機能ゆえ、幅広い分野での利用が期待されている

[0003] 近年、人口増加により食糧危機が問題視されており、植物の生産するデンプンだけでは将来エネルギー源が不足すると予想されている。

[0004] 一方、人間は、セルロースなどの j8—グルカンを消化できないので、エネルギー源として利用することができず、食物繊維成分としてのみ利用されている。それゆえ、 β— グルカンを食糧危機問題の解決には利用できない。しかし、 |8—グルカンの年間生産量は、デンプンの約 2万倍と推定されており、枯渴の心配はない。そのため、 β -ダルカンを、人間がエネルギー源とし得る物質に変換する種々の試みが行われている。

[0005] 例えば、セルロースをグルコースまで分解し、エタノール醱酵に利用することが検討されている。グルコースは人間によって代謝され得る力甘すぎるため、エネルギー源として大量に摂取することができな、。

[0006] βーグルカンを人間にとってより摂取しやすい物質（特に、同じグルコースのポリマ一であるデンプン）に変換することができれば、食糧危機問題の解決に大きな貢献ができるが、これまでにそのような技術は開示されてヽなヽ。

[0007] そこで、本発明者らは、 βーグルカンを原料として a—グルカンを産生することを試みた。 βーグルカンを直接 aーグルカンに変換することはできなヽ。従来の方法においては、セロビオースホスホリラーゼ（CBP)の作用によって G—1—Pおよびダルコ一ス力セロビオースを合成する方法が知られて、セロデキストリンホスホリラーゼ（ CDP)の作用によって、 G— 1 Pおよびセロオリゴ糖 (重合度 n)から重合度 n+ 1のセ口オリゴ糖を合成する方法もまた知られている。また、 _α 1 , 4—グルカンホスホリラーゼの作用によって、 G—1— Ρおよび低分子量 aーグルカンから高分子量 aーグルカンを合成する方法が知られている。一般に、酵素によって触媒される反応は可逆反応であることが多いので、本発明者らは、 CBPによって触媒される反応をセロビオースの分解方法に、 CDPによって触媒される反応をセロオリゴ糖の分解方向に進ませて G— 1 Pを産生し、そして得られる G— 1 Pから α—グルカンを合成することができない力と考えて、 β— 1, 4ーグルカンからのひダルカンの合成法の構築を検討した。この方法は、セロビオースホスホリラーゼ (CBP)またはセロデキストリンホスホリラーゼ (C DP)を用いて j8—グルカンを加リン酸分解して G— 1 Pを得て (第 1工程）、この G— 1— Pを原料としてグルカンホスホリラーゼ (GP)によって α—グルカンを合成する（第 2ェ程） 2段階方法である。この方法の βーグルカンを加リン酸分解する反応において G— 1 Ρを効率よく得るためには、多量の無機リン酸を添加する必要がある力この多量の無機リン酸は、次の反応である G— 1 Ρを原料とするひーグルカンの合成反応を阻害するため、第 1工程の反応終了後にこの無機リン酸を取り除力なければならない。しかし、その精製ステップには多大なコストがかかること力この 2段階方法の欠点の 1つである。

[0008] また、 G— 1 Ρを原料に α—グルカンを合成しょうとすると、反応時に等モルのリン酸を副生するため、反応終了後に除去する必要を生じる。また、リン酸副産物に起因する ρΗの大幅な低下が見られるため、アルカリなどの添加あるいは高濃度の緩衝液を使用することにより反応液の ρΗを維持する操作等が必要となってしまい、そのため、この 2段階方法は簡便な製造方法とは、えな、。

[0009] そのため、これら欠点を克服する低コスト、簡便かつ効率的な方法の開発が望まれている。

[0010] 2つの酵素反応工程力もなる触媒反応を行うために、各酵素をカップリングさせて 1 つの反応系で反応させる方法が、他の触媒反応において開発されている。このような反応系の従来公知の例は、 2種類のホスホリラーゼをカップルさせて利用する方法である。例えば、北岡ら (非特許文献 1)はスクロースホスホリラーゼ (SP)と CBPを同時に作用させることにより、スクロースをセロビオースに効率的に変換する技術を開示している。また、藤井ら (特許文献 1)は、 SPと GPを同時に作用させることにより、スクロースをアミロースに効率的に変換する技術を開示して、る。

[0011] これらの技術は、 2種類の酵素力その基質および生産物を共有しあう（北岡らの例では、 G— 1— Pは SPの生産物であると同時に CBPの基質にもなつているし、またリン酸は SPの基質であると同時に CBPの生産物にもなつている）という、複雑な反応を利用している。それゆえ、単一の酵素を用いる反応とは異なり、反応メカニズムが極めて複雑である。そのため、単に 2種類の酵素を組み合わせても必ずしも原料となる基質を目的とする生産物に変換できないことが技術常識である。

[0012] 北岡らは日本応用糖質科学会 2001年度大会において、 SPおよび CBPを用いたシステムは、スクロース力 G— 1 Pを経由してセロビオースを合成する方法には有効に利用できる力セロビオース力も G— 1 Pを経由してスクロースを合成する反応は進行しな、ことを口頭で報告して!/、る。この報告に基づ、て本発明者らが確認実験 (参考例 2)を行ったところ、セロビオースカゝら G— 1 Pを経由してスクロースを合成する反応が進まな、ことが確認されて、る。

[0013] つまり、 CBPにより G— 1 Pを合成する酵素反応と、合成された G— 1 Pに対するさらなる酵素反応とを同時に行うことができないのである。

[0014] 従って、セロビオースを出発物質として 2段階の酵素反応を同時に行うことは困難であると考えられていた。

[0015] さらに、 G— 1 Pを経由する方法以外の方法においても、 β— 1 , 4ーグルカンから α ーグルカンを合成する効率的な方法が存在しなカゝつたので、結局、 β— 1 , 4ーグルカンから α—グルカンを合成する、低コスト、簡便かつ効率的な方法は存在しな力つた。

[0016] β -1 , 4—グルカンから α—グルカンを産生する酵素反応には、グルコースが関与する。そのため、グルコース濃度を制御することによって、目的の酵素反応を効率的に行うことが可能になるとも考えられる。

[0017] 北岡ら (非特許文献 2)は、スクロース力セロビオースを合成するシステムにおいて、セロビオース合成側に反応を進行させるためには、ァクセプターとして必須な原料であるグルコースの濃度を、反応系内で低く保つことが重要であることを主張して!/、る。そのため、 SPの作用により生じるフラクトースを、キシロースイソメラーゼを用いてグルコースに変換することで、グルコースを系外から添加することなく反応を進行させてセロビオースの収率を高めている。北岡らは、これは、グルコースが CBPの G— 1— P に対する拮抗阻害剤であるため、高濃度のグルコースの蓄積は CBPのセロビオース合成反応を著しく低下させるためであると説明している。従って、従来は、セロビオースを基質とする酵素反応においては、セロビオースの合成方向に反応を進めるためには反応液中のダルコース濃度を低下させ、逆にセロビオースの分解方向に反応を進めるためには反応液中のグルコース濃度を高めることが重要であると考えられていた。

[0018] 本発明では、 CBPを用いてその基質であるセロビオースを分解する反応を包含する。上記知見に基づけば、グルコース濃度が高いことは、セロビオース合成反応が阻害されセロビオース分解にとって有利な条件であると当業者は考える。

[0019] 一方、 2つの酵素を用いるセロビオースからアミロースへの変換反応において、 CB Pの反応の平衡は、 G—1—P/リン酸比、グルコース/ CBP比によってコントロールされるため、グルコースの濃度のみを下げたとしても全体の反応力セロビオースからアミロースへの変換に有利になるかどうかは不明である。実際、セロビオースからスクロースを合成する系においては、グルコース濃度を低下させても、反応収率を上げることはできな力つた (参考例 2)。このことは、 2種類のホスホリラーゼを組み合わせた複雑な反応系にお、ては、副産物を消去しても反応効率が向上しな、ことを意味する。

特許文献 1：国際公開第 02Z097107号パンフレット

非特許文献 1 :北岡ら、 Denpun Kagaku, vol. 39, No. 4, 1992, pp. 281—283 特許文献 2 :北岡ら、 Trends in Glycoscience and Glycotechnology, vol . 14, No. 75, 2002, pp. 35—50

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0020] 本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、食糧とはなりえない j8 -1, 4 グルカンを、複雑な製造工程を経ることなく効率良く α ダルカンに変換する方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0021] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 β—1 , 4ーグルカンホスホリラーゼの存在下で βーグルカンを加リン酸分解してグルコース— 1—リン酸を合成する反応と、 aーグルカンホスホリラーゼの存在下でグルコース 1 リン酸とプライマーとを反応させて aーグルカンを合成する反応とをカップリングすることにより、 β -1 , 4ーグルカンから a ダルカンが効率よく合成されることを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。

[0022] 本発明者らはまた、従来の知見に反して、この反応系において、 β— 1 , 4ーグルカンホスホリラ一ゼの存在下で /3ーグルカンを加リン酸分解する際に生じるグルコースの濃度を減少させることにより、 a—グルカンをより一層効率的に製造することができることを予想外に見出した。

[0023] 本発明の方法は、 j8— 1 , 4ーグルカンから α—グルカンを製造する方法であって、 j8 -1 , 4ーグルカンと、プライマーと、リン酸源と、 j8—l , 4—グルカンホスホリラーゼと、 a -1 , 4ーグルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、ひーグルカンを生産するェ程を包含する。

[0024] 1つの実施形態では、上記 j8 -1 , 4ーグルカンは、セロビオースであり得、上記 13 1 , 4ーグノレカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼであり得る。

[0025] 1つの実施形態では、上記 j8 -1 , 4ーグルカンは、重合度 3以上のセロオリゴ糖であり得、上記 j8— 1 , 4—グルカンホスホリラーゼは、セロデキストリンホスホリラーゼであり得る。

[0026] 1つの実施形態では、上記 j8 -1 , 4ーグルカンは、重合度 3以上のセロオリゴ糖であり得、上記 j8— 1 , 4ーグルカンホスホリラーゼは、セロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼであり得る。

[0027] 1つの実施形態では、上記生産工程において、上記 a ダルカンの生産と同時に副生するグルコースを、上記溶液から除去する工程をさらに包含し得る。

[0028] 1つの実施形態では、上記溶液は、グルコースイソメラーゼまたはグルコースォキシダーゼをさらに含み得る。 [0029] 1つの実施形態では、上記溶液は、グルコースォキシダーゼおよびムタロターゼをさらに含み得る。

[0030] 1つの実施形態では、上記溶液は、カタラーゼまたはペルォキシダーゼをさらに含み得る。

[0031] 1つの実施形態では、上記リン酸源は、無機リン酸、グルコース 1 リン酸、または無機リン酸とグルコース- 1-リン酸との混合物であり得る。

[0032] 1つの実施形態では、上記リン酸源の濃度は、 ImM— 50mMであり得る。

[0033] 1つの実施形態では、上記 α—グルカン力アミロースである、請求項 1に記載の方法。

発明の効果

[0034] 本発明の方法により、非消化性のセルロースを消化性の食品へと効率よく変換できる。

図面の簡単な説明

[0035] [図 1]図 1は、本発明の製造方法において生じる反応の概略を示す。

[図 2]図 2は、 β— 1, 4ーグルカンとしてセロビオースを用い、 β— 1， 4ーグルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼを用いた場合の、本発明の製造方法にお V、て生じる反応の概略を示す。

[図 3]図 3は、セロビオースホスホリラーゼの濃度を変化させた場合のアミロース収率の変化を示す。

[図 4]図 4は、リン酸濃度を変化させた場合のアミロース収率の変化を示す。

[図 5]図 5は、セロビオース濃度と、プライマー濃度と、リン酸濃度との比率を一定としてセロビオース濃度を上昇させた場合のアミロース収率の変化を示す。

[図 6]図 6は、本発明の製造方法において、グルコースイソメラーゼ (GI)またはダルコースォキシダーゼ（GOx) +ムタロターゼ（MT) +ペルォキシダーゼ（POx)を添カロした場合のアミロース収率の変化を示す。

配列表フリーテキスト

[0036] 配列番号 1は、合成 DNAプライマー 1の塩基配列であり；

配列番号 2は、合成 DNAプライマー 2の塩基配列である。発明を実施するための最良の形態

[0037] 以下、本発明を詳細に説明する。

[0038] 本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。

[0039] 本明細書中では「 aーグルカン」とは、 D グルコースを構成単位とする糖であって、 a -1, 4 ダルコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも 2糖単位以上有する糖をいう。 α—グルカンは、直鎖状、分岐状または環状の分子であり得る。直鎖状 α— グルカンと α— 1, 4-グルカンとは同義語である。直鎖状 α -ダルカンでは、 α— 1, 4 ダルコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。 6—ダルコシド結合を 1つ以上含む aーグルカンは、分岐状 aーグルカンである。 aーグルカンは、好ましくは、直鎖状の部分をある程度含む。分岐のない直鎖状 α ダルカンがより好ましい。本発明で製造される α—グルカンは、好ましくは、アミロース、環状構造を有するグルカンまたは分岐構造を有するグルカンであり、より好ましくはアミロースである。 1 分子の α ダルカンに含まれる糖単位の数を、この α—グルカンの重合度という。

[0040] α—グルカンは、場合によっては、分岐の数 (すなわち、 6 ダルコシド結合の数）が少ないことが好ましい。このような場合、分岐の数は、代表的には 0— 10000 個、好まし <は 0— 1000個、より好まし <は 0— 500個、さらに好まし <は 0— 100個、さらに好ましくは 0— 50個、さらに好ましくは 0— 25個、さらに好ましくは 0個である。

[0041] 本発明の方法によって製造される分岐状 α—グルカンでは、 α 1, 6 ダルコシド結合を 1としたときの 6 ダルコシド結合の数に対する a—1, 4 ダルコシド結合の数の比は、好ましくは 1一 10000であり、より好ましくは 10— 5000であり、さらに好ましくは 50— 1000であり、さらに好ましくは 100— 500である。

[0042] a— 1, 6—ダルコシド結合は、 α—グルカン中に無秩序に分布していてもよいし、均質に分布して、てもよ、。 aーグルカン中に糖単位で 5個以上の直鎖状部分ができる程度の分布であることが好まし、。

[0043] a—グルカンは、 D グルコースのみから構成されていてもよいし、 a—グルカンの性質を損なわな、程度に修飾された誘導体であってもよヽ。修飾されてヽなヽことが好ましい。 α ダルカンの性質を損なわない程度の修飾としては、エステル化、エーテル化、架橋などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの修飾は、当該分野で公知の方法に従って行われ得る。

[0044] α—グルカンは、代表的には約 1 X 10³以上、好ましくは約 5 X 10³以上、より好ましくは約 I X 10⁴以上、さらに好ましくは約 5 X 10⁴以上、さらに好ましくは約 I X 10⁵以上の分子量を有する。 α—グルカンは、代表的には約 1 X 10⁶以下、好ましくは約 5 X 10⁵以下、さらに好ましくは約 1 X 10⁵以下の分子量を有する。

[0045] 当業者は、本発明の製造方法で用いられる基質 (例えば、プライマー、 β—1, 4-グルカンなど)の量、酵素の量、反応時間などを適宜設定することによって所望の分子量の α -ダルカンが得られることを容易に理解する。

[0046] < α ダルカンの製造に用いる材料〉

本発明の製造方法では、例えば、 j8— 1, 4ーグルカンと、プライマーと、リン酸源と、 β— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼと、 α -1, 4ーグルカンホスホリラーゼを含む溶液を用いる。この溶液の調製においては、例えば、 β— 1, 4-グルカンと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース 1 リン酸と、 |8—1, 4ーグルカンホスホリラーゼと、 α -1 , 4ーグルカンホスホリラーゼと、緩衝剤およびこれらを溶力している溶媒を主な材料として用いる。これらの材料は通常、反応開始時に全て添加される力反応の途中でこれらのうちの任意の材料を追カ卩して添カ卩してもよい。

[0047] 本明細書において使用される用語「リン酸源」とは、 CBPの触媒反応にリン酸を提供し得る分子をいい、無機リン酸（例えば、 NaH PO、 Na HPO、 KH POおよび

2 4 2 4 2 4

K HPOのような無機リン酸塩)ならびに有機リン酸塩 (例えば、グノレコース 1 リン

2 4

酸)が挙げられるが、これらに限定されない。

[0048] 本発明の製造方法では、溶液中にグルコースイソメラーゼまたはグルコースォキシダーゼをさらに含み得る。グルコースォキシダーゼを用いる場合、ムタロターゼをさらに含み得る。グルコースォキシダーゼを用いる場合はまた、本発明の溶液は、力タラーゼまたはペルォキシダーゼも含み得る。

[0049] 本発明の製造方法では、必要に応じて、枝切り酵素、ブランチングェンザィム、 4— α—ダルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングェンザィムからなる群より選択される酵素を用いることができる。枝切り酵素、ブランチングェンザィム、 4 a ダルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングェンザィムからなる群より選択される酵素は、目的とする α—グルカンの構造に応じて、本発明の製造方法の最初力も溶液中に添加してもよぐ途中力も溶液中に添加してもよ、。

(1. j8— 1, 4—グルカン）

本明細書中では「j8— 1, 4-グルカン」とは、 D-グルコースを構成単位とする糖であつて、 β - 1, 4 ダルコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも 2糖単位以上有する糖をいう。 β - 1, 4ーグルカンは、直鎖状の分子であり得る。直鎖状 j8—グルカンと j8— 1, 4—グルカンとセルロースとは同義語である。直鎖状 j8—グルカンでは、 β —1, 4 ダルコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。 1分子の /3— 1, 4—グルカンに含まれる糖単位の数を、この |8—1, 4—グルカンの重合度という。 β—1 , 4ーグルカンの重合度は、好ましくは、約 2—約 10であり、より好ましくは約 2—約 8であり、より好ましくは約 2—約 5である。重合度が約 2—約 10の j8— 1, 4—グルカンを、セロオリゴ糖ともいう。重合度が 2の j8— 1, 4—グルカンを特に、セロビオースという。重合度が 3の j8— 1, 4—グルカンをセロトリオースという。重合度が 4の j8— 1, 4—グルカンをセロテトラオースという。 β -1, 4ーグルカンの重合度が低いほど溶解度が高ぐ取り扱いが容易であるので、重合度の低い j8—l, 4—グルカンがより好ましい。 β -1 , 4ーグルカンは、あらゆる植物中に存在する。 β -1 , 4ーグルカンは、植物から単離されたまま未改変のものであってもよぐ植物力も単離したものをィ匕学的または酵素的に処理することによって得られたものであってもよい。 β— 1, 4ーグルカンはまた、古紙、建材、古布などの廃棄物力再生されるセルロースまたはそれから調製されたものであってもよい。例えば、植物から単離した高分子量のセルロースに対してセルラーゼを作用させることによって、より低分子量のセロオリゴ糖が得られる。植物からセ口オリゴ糖を大量に生産する方法は当該分野で公知である。このような文献の例としては、特開 2001— 95594号公報が挙げられる。 β -l, 4ーグルカンは、 13— 1, 4ーグルカンを含む植物破砕液カゝら精製 β -1, 4ーグルカンに至る、ずれの生成段階のものとして提供されてもよい。本発明の方法で使用される j8—l, 4—グルカンは、純粋なものであることが好ましい。しかし、本発明で用いる酵素の作用を阻害しない限り、任意の他の夾雑物を含んで、てもよ、。

[0051] 溶液中に含まれる β -1 , 4ーグルカンの濃度は、代表的には約 0. 1 %—約 40%であり、好ましくは約 0. 5%—約 30%であり、より好ましくは約 1 %—約 20%であり、特に好ましくは約 2%—約 15%であり、最も好ましくは約 3%—約 12%である。なお、本明細書中で j8— 1 , 4—グノレカンの濃度は、 WeightZVolumeで、すなわち、

( j8 -l , 4ーグルカンの重量） X 100/ (溶液の容量）

で計算する。 β— 1 , 4ーグルカンの重量が多すぎると、溶液中に未反応の |8— 1 , 4 グルカンが析出する場合がある。 β— 1 , 4ーグルカンの使用量が少なすぎると、高温での反応において、反応自体は起こるものの、収率が低下する場合がある。

[0052] 本明細書中では、溶液中の β—1 , 4ーグルカンモル濃度を、反応溶液中の無機リン酸のモル濃度とグルコース 1 リン酸のモル濃度との合計によって除算することによつて得られる比率を、 β— 1 , 4ーグルカン：リン酸比率という。すなわち、以下の通りでめる：

[0053] [数 1]

，4-グルカン：リン酸比率

=( -1,4-グルカンモル濃度)/ (無機リン酸のモル濃度とグルコース- 1 -リン酸のモル濃度との合計）全反応材料を投入して反応を始めて、反応中に材料の追加をしなヽのであれば、 β -1 , 4ーグルカン:リン酸比率は反応開始時が最大である。反応開始時の j8— 1 , 4 ーグルカン：リン酸比率は、任意の比率であり得る力好ましくは、約 0. 01以上であり、より好ましくは約 0. 03以上であり、さらに好ましくは約 0. 06以上であり、特に好ましくは約 0. 1以上であり、最も好ましくは約 0. 1—約 0. 6である。

[0054] (2.プライマー）

本発明の方法で用いられるプライマーとは、 α—グルカンの合成にぉヽてグリコシド残基を付加するための出発物質として作用する分子をいう。なお、本明細書中では、グリコシド残基とグルコース残基とは交換可能に使用され得る。プライマーは、 G-1- Ρのグリコシド残基のァクセプターとして作用する分子ともいうことができる。プライマ一は、 α— 1 , 4 ダルコシド結合で糖単位が結合できる遊離部分を 1個以上有すれば、他の部分は糖以外の部分によって形成されていてもよい。本発明の方法では、反応開始時に含まれるプライマーに対して 1つのグリコシド残基が α— 1, 4結合で転移すること〖こよって、このプライマーよりも重合度が 1大きい α—グルカンが形成される。形成されたこの α—グルカンは、同じ溶液中で再度ァクセプターとして作用することができる。このようにして、本発明の方法では、プライマーに対してグリコシド残基が α 1, 4 ダルコシド結合で順次結合されて、任意の重合度の α ダルカンが合成される。プライマーとしては、グルカンホスホリラーゼによって糖単位が付加され得る任意の糖が挙げられる。

[0055] プライマーは、本発明の反応の出発物質として作用し得ればよぐ例えば、本発明の方法によって合成された α—グルカンをプライマーとして用いて、本発明の方法によって 4—ダルコシド鎖を再度伸長することも可能である。

[0056] プライマーは、 α— 1, 4 ダルコシド結合のみを含む 4—グルカンであっても、 α -1, 6—ダルコシド結合を部分的に有してもよい。当業者は、所望のグルカンに応じて、適切なプライマーを容易に選択し得る。直鎖状のアミロースを合成する場合には、 α -1 , 4 ダルコシド結合のみを含む 4—グルカンをプライマーとして用いれば、枝切り酵素などを用いずに直鎖状アミロースを合成できるので好ましい。

[0057] プライマーの例としては、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロぺクチン、グリコーゲン、デキストリン、プルラン、カップリングシュガー、澱粉およびこれらの誘導体が挙げられる。

[0058] マルトオリゴ糖は、本明細書中では、約 2個一約 10個のグルコースが脱水縮合して生じた物質であって、 4結合によって連結された物質をいう。マルトオリゴ糖は、好ましくは約 3個一約 10個の糖単位、より好ましくは約 4個一約 10個の糖単位、さらに好ましくは約 5個一約 10個の糖単位を有する。マルトオリゴ糖の例としては、マルトース、マノレトトリオース、マノレトテトラオース、マノレトペンタオース、マノレトへキサォース、マノレトヘプタオース、マノレトォクタオース、マノレトノナオース、マノレトデ力オースなどのマルトオリゴ糖が挙げられる。 1つの実施形態では、マルトオリゴ糖は、好ましくはマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトへキサオースまたはマルトへプタオースであり、より好ましくはマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトへキサオースまたはマルトへプタオースであり、さらに好ましくはマルトテトラオ一スである。マルトオリゴ糖は、単品であってもよいし、複数のマルトオリゴ糖の混合物であってもよい。コストが低いため、マルトオリゴ糖の混合物が好ましい。 1つの実施態様では、マルトオリゴ糖の混合物は、マルトテトラオースの重合度以上の重合度のマルトオリゴ糖に加えて、マルトトリオース、マルトースおよびグルコースのうちの少なくとも 1つを含有する。ここで、「マルトテトラオースの重合度以上の重合度のマルトオリゴ糖」とは、重合度 4以上のマルトオリゴ糖をいう。オリゴ糖は、直鎖状のオリゴ糖であつてもよいし、分枝状のオリゴ糖であってもよい。オリゴ糖は、その分子内に、環状部分を有し得る。本発明では、直鎖状のオリゴ糖が好ましい。

[0059] アミロースとは、 _α— 1, 4結合によって連結されたグルコース単位力構成される直鎖分子である。アミロースは、天然の澱粉中に含まれる。

[0060] アミロぺクチンとは、 α -1, 4結合によって連結されたグルコース単位に、 α ΐ, 6結合でグルコース単位が連結された、分枝状分子である。アミロぺクチンは天然の澱粉中に含まれる。アミロぺクチンとしては、例えば、アミロぺクチン 100%からなるヮキシ一コーンスターチが用いられ得る。例えば、重合度が約 1 X 10⁵程度以上のアミロぺクチンが原料として用いられ得る。

[0061] グリコーゲンは、グルコース力構成されるグルカンの一種であり、高頻度の枝分かれを有するグルカンである。グリコーゲンは、動植物の貯蔵多糖としてほとんどあらゆる細胞に顆粒状態で広く分布している。グリコーゲンは、植物中では、例えば、トウモ口コシの種子などに存在する。グリコーゲンは、代表的には、グルコースの 4— 結合の糖鎖に対して、グルコースおよそ 3単位おきに 1本程度の割合で、平均重合度 12—18のグルコースの0；—1, 4—結合の糖鎖が α— 1, 6—結合で結合している。また、 α— 1, 6—結合で結合している分枝にも同様にグルコースの 4—結合の糖鎖がひ— 1, 6—結合で結合している。そのため、グリコーゲンは網状構造を形成する

[0062] グリコーゲンの分子量は代表的には約 1 X 10⁵—約 1 X 10⁸であり、好ましくは約 1

< 10⁶—約1 10⁷でぁる。

[0063] プルランは、マルトトリオースが規則正しぐ階段状に α— 1, 6—結合した、分子量約 10万一約 30万（例えば、約 20万）のグルカンである。プルランは、例えば、澱粉を原料として黒酵母 Aureobasidium pullulansを培養することにより製造される。プルランは、例えば、林原商事から入手され得る。

[0064] カップリングシュガーは、ショ糖、ダルコシルスクロース、マルトシルスクロースを主成分とする混合物である。カップリングシュガーは、例えば、ショ糖と澱粉との混合溶液に Bacillus megateriumなどが産生するサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることにより製造される。カップリングシュガーは、例えば、林原商事力入手され得る。

[0065] 澱粉は、アミロースとアミロぺクチンとの混合物である。澱粉としては、通常市販されて、る澱粉であればどのような澱粉でも用いられ得る。澱粉に含まれるアミロースとァミロぺクチンとの比率は、澱粉を産生する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどの有する澱粉のほとんどはアミロぺクチンである。他方、アミロースのみからなり、かつアミロぺクチンを含まない澱粉は、通常の植物からは得られない。

[0066] 澱粉は、天然の澱粉、澱粉分解物および化工澱粉に区分される。

[0067] 天然の澱粉は、原料により、いも類澱粉および穀類澱粉に分けられる。いも類澱粉の例としては、馬鈴薯澱粉、タピオ力澱粉、甘藷澱粉、くず澱粉、およびわらび澱粉などが挙げられる。穀類澱粉の例としては、コーンスターチ、小麦澱粉、および米澱粉などが挙げられる。天然の澱粉の例は、澱粉を生産する植物の品種改良の結果、アミロースの含量を 50%— 70%まで高めたノヽィアミロース澱粉 (例えば、ノ、ィァミロースコーンスターチ)である。天然の澱粉の別の例は、澱粉を生産する植物の品種改良の結果、アミロースを含まないヮキシ一澱粉である。

[0068] 可溶性澱粉は、天然の澱粉に種々の処理を施すことにより得られる、水溶性の澱粉をいう。

[0069] 化工澱粉は、天然の澱粉に加水分解、エステル化、または a化などの処理を施して、より利用しやすい性質を持たせた澱粉である。糊化開始温度、糊の粘度、糊の透明度、老化安定性などを様々な組み合わせで有する幅広!、種類の化工澱粉が入手可能である。化工澱粉の種類には種々ある。このような澱粉の例は、澱粉の糊化温度以下において澱粉粒子を酸に浸漬することにより、澱粉分子は切断するが、澱粉粒子は破壊して!/、な、澱粉である。

[0070] 澱粉分解物は、澱粉に酵素処理または加水分解などの処理を施して得られる、処理前よりも分子量が小さいオリゴ糖もしくは多糖である。澱粉分解物の例としては、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物および澱粉部分加水分解物が挙げられる。

[0071] 澱粉枝切り酵素分解物は、澱粉に枝切り酵素を作用させることによって得られる。

枝切り酵素の作用時間を種々に変更することによって、任意の程度に分岐部分 (すなわち、 α -1, 6-ダルコシド結合)が切断された澱粉枝切り酵素分解物が得られる。枝切り酵素分解物の例としては、糖単位数 4一 10000のうち α— 1, 6—ダルコシド結合を 1個一 20個有する分解物、糖単位数 3— 500の α - 1, 6 -ダルコシド結合を全く有さない分解物、マルトオリゴ糖およびアミロースが挙げられる。澱粉枝切り酵素分解物の場合、分解された澱粉の種類によって得られる分解物の分子量の分布が異なり得る。澱粉枝切り酵素分解物は、種々の長さの糖鎖の混合物であり得る。

[0072] 澱粉ホスホリラーゼ分解物は、澱粉にグルカンホスホリラーゼ (ホスホリラーゼともいう）を作用させることによって得られる。グルカンホスホリラーゼは、澱粉の非還元性末端カゝらグルコース残基を 1糖単位ずつ他の基質へと転移させる。グルカンホスホリラーゼは、 α— 1, 6—ダルコシド結合を切断することができないので、グルカンホスホリラーゼを澱粉に充分に長時間作用させると、 α -1, 6—ダルコシド結合の部分で切断が終わった分解物が得られる。本発明では、澱粉ホスホリラーゼ分解物の有する糖単位数は、好まし <は約 10—約 100, 000、より好まし <は約 50—約 50, 000、さらにより好ましくは約 100—約 10, 000である。澱粉ホスホリラーゼ分解物は、分解された澱粉の種類によって得られる分解産物の分子量の分布が異なり得る。澱粉ホスホリラーゼ分解物は、種々の長さの糖鎖の混合物であり得る。

[0073] デキストリンおよび澱粉部分加水分解物は、澱粉を、酸、アルカリ、酵素などの作用によって部分的に分解して得られる分解物をいう。本発明では、デキストリンおよび澱粉部分加水分解物の有する糖単位数は、好ましくは約 10—約 100, 000、より好ましくは約 50—約 50, 000、さらにより好ましくは約 100—約 10, 000である。デキストリンおよび澱粉部分加水分解物の場合、分解された澱粉の種類によって得られる分解産物の分子量の分布が異なり得る。デキストリンおよび澱粉部分加水分解物は、種々の長さを持つ糖鎖の混合物であり得る。

[0074] 澱粉は、可溶性澱粉、ヮキシ一澱粉、ノ、ィアミロース澱粉、澱粉枝切り酵素分解物、澱粉ホスホリラーゼ分解物、澱粉部分加水分解物、化工澱粉、およびこれらの誘導体力もなる群力も選択されることが好ま、。

[0075] 本発明の方法では、上記各種糖の誘導体は、プライマーとして用いられ得る。例えば、上記糖のアルコール性水酸基の少なくとも 1つ力ヒドロキシアルキル化、アルキルィ匕、ァセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化、あるいはリン酸化された誘導体などが用いられ得る。さらに、これらの 2種以上の誘導体の混合物が原料として用いられ得る。

[0076] (3.無機リン酸またはグルコース 1 リン酸）

本明細書中において、無機リン酸などのリン酸源とは、 CBPの反応においてリン酸基質を供与し得る物質をいう。ここでリン酸基質とは、グルコース 1 リン酸のリン酸部分 (moiety)の原料となる物質を、う。 13—1, 4ーグルカンホスホリラーゼによって触媒される j8— 1, 4—グルカン加リン酸分解において、無機リン酸はリン酸イオンの形態で基質として作用して、ると考えられる。当該分野ではこの基質を慣習的に無機リン酸というので、本明細書中でも、この基質を無機リン酸という。無機リン酸には、リン酸およびリン酸の無機塩が含まれる。通常、無機リン酸は、アルカリ金属イオンなどの陽イオンを含む水中で使用される。この場合、リン酸とリン酸塩とリン酸イオンとは平衡状態になるので、リン酸とリン酸塩とは区別をしにくい。従って、便宜上、リン酸とリン酸塩とを合わせて無機リン酸という。本発明において、無機リン酸は好ましくは、リン酸の任意の金属塩であり、より好ましくはリン酸のアルカリ金属塩である。無機リン酸の好ましい具体例としては、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素ニナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三カリウム、リン酸 (H

3

PO )、リン酸二水素アンモニゥム、リン酸水素二アンモニゥムなどが挙げられる。

4

[0077] 無機リン酸は、反応開始時の CBP— GP反応系にお、て、 1種類のみ含有されてもよぐ複数種類含有されてもよい。

[0078] 無機リン酸は、例えば、ポリリン酸 (例えば、ピロリン酸、三リン酸および四リン酸)のようなリン酸縮合体またはその塩を、物理的、化学的または酵素反応などによって分解したものを反応溶液に添加することによって提供され得る。

[0079] 本明細書において、グルコース— 1—リン酸とは、グルコース— 1—リン酸（C H O P)

6 13 9 およびその塩をいう。グルコースー1 リン酸は好ましくは、狭義のグルコースー1 リン酸 (C H O P)の任意の金属塩であり、より好ましくはグルコース 1 リン酸 (C H

6 13 9 6 13

O P)の任意のアルカリ金属塩である。グルコース— 1—リン酸の好ましい具体例として

9

は、グルコース— 1—リン酸ニナトリウム、グルコース— 1—リン酸二カリウム、グルコース— 1 リン酸 (C H O P)、などが挙げられる。本明細書において、括弧書きで化学式を

6 13 9

書いていないグルコース 1 リン酸は、広義のグルコース 1 リン酸、すなわち狭義のグルコース— 1—リン酸（C H O P)およびその塩を示す。

6 13 9

[0080] グルコース 1 リン酸は反応開始時の CBP— GP反応系において、 1種類のみ含有されてもよく、複数種類含有されていてもよい。

[0081] 本発明の方法において、反応開始時の反応溶液中のリン酸とグルコース 1 リン酸との間の比率は、任意の比率であり得る。

[0082] 反応溶液中に含まれる無機リン酸のモル濃度とグルコース 1 リン酸のモル濃度との合計は、代表的には約 0. ImM—約 1000mM、好ましくは約 ImM—約 500mM 、より好ましくは約 ImM—約 50mMであり、さらにより好ましくは約 5mM—約 30mM である。無機リン酸およびグルコース 1 リン酸の量が多すぎると、反応自体は起こるものの、 _α—ダルカンの収率が低下する場合がある。これらの使用量が少なすぎると、 α -ダルカンの合成に時間が力かる場合がある。

[0083] 本発明の方法における溶液中の無機リン酸の含有量は、当該分野で公知の方法によって定量され得る。この溶液中のグルコース 1 リン酸の含有量は、当該分野で公知の方法によって定量され得る。反応に関与しないリン含有物質を使わない場合、そのような場合は原子吸光法によって無機リン酸およびグルコース 1 リン酸の合計含有量を測定してもよい。

[0084] 無機リン酸は、例えば、リン酸イオンとして以下の方法により求められる。無機リン酸を含む溶液（200 μ 1)に対し、 800 μ 1のモリブデン試薬（15mM モリブデン酸アンモ-ゥム、 lOOmM 酢酸亜鉛）を混合し、続、て 200 μ 1の 568mMァスコルビン酸（ pH5. 0)を加えて攪拌し、反応系を得る。この反応系を、 30°Cで 20分間保持した後、分光光度計を用いて 850nmでの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。この定量法では、無機リン酸の量が定量され、グルコース 1 リン酸の量は定量されない。

[0085] グルコース 1 リン酸は、例えば、以下の方法により定量され得る。 300 μ 1の測定試薬（200mM Tris-HCl (pH7. 0)、 3mM NADP、 15mM 塩化マグネシウム、 3mM EDTA、 15 Μグノレコース一 1, 6—二リン酸、 6 /z gZml ホスホグノレコムターゼ、 6 μ g/ml グルコース- 6-リン酸脱水素酵素）に、適切に希釈したグルコース- 1—リン酸を含む溶液 600 1を加えて攪拌し、反応系を得る。この反応系を、 30°Cで 30分間保持した後、分光光度計を用いて 340nmでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース 1 リン酸ナトリウムを用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース 1— リン酸濃度を求める。通常は、 1分間に: L molのグルコース 1 リン酸を生成する活性を 1単位とする。この定量法では、グルコース 1 リン酸のみが定量され、無機リン酸の量は定量されない。

[0086] (4. |8—1, 4ーグルカンホスホリラーゼ）

本明細書中では、「j8— 1, 4—グルカンホスホリラーゼ」とは、 13— 1, 4ーグルカンの非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う任意の酵素をいう。 β— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応である |8—1, 4— グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存するが、この反応は、 β - 1, 4ーグルカン合成反応の方向に進みやすい傾向がある。 β— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される

[0087] [化 1]

β - 1 , 4ーグルカン (重合度 η) +無機リン酸

β - 1 , 4—グルカン（重合度 η _ 1 ) + 一 D _グルコース一 1—リン酸なお、この式において、出発時の j8—l, 4—グルカンの重合度が 2の場合、 β— 1, 4 ーグルカンの代わりにグルコースが得られる。

[0088] β— 1， 4—グルカンホスホリラーゼは好ましくは、セロビオースホスホリラーゼ（EC : 2 . 4. 1. 20)またはセロデキス卜リンホスホリラーゼ（EC : 2. 4. 1. 49)である。

[0089] セロビオースホスホリラーゼは、セロビオースの非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う酵素をいう。セロビオースホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：

[0090] [化 2]

セロビオース +無機リン酸

o グルコース + _α— D—グルコース一 1一リン酸

セロデキストリンホスホリラーゼは、重合度 3以上のセロオリゴ糖の非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う酵素を、う。セロオリゴ糖は、セロデキストリンとも呼ばれる。セロデキストリンホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：

[0091] [化 3]

セロオリゴ糖（重合度 η) +無機リン酸

^ セロオリゴ糖（重合度 η— + α— D—グルコース一 1一リン酸

本発明の方法においては、 13— 1, 4ーグルカンがセロビオースである場合、 β— 1，

4ーグルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼを用いることが好まし!/、。本発明の方法においては、 j8— 1, 4—グルカンがセロオリゴ糖である場合、 β— 1, 4 グルカンホスホリラーゼとしてセロデキストリンホスホリラーゼを用いることが好ましい。本発明の方法においてはまた、 j8—l, 4—グルカンがセロオリゴ糖である場合、 β -1

, 4ーグルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼを用いることが好ましい。この場合、セロデキストリンホスホリラーゼの作用によってセロオリゴ糖が分解されることによって生じたグルコース 1—リン酸がひグルカン合成に使用され、かつ最終的に生じたセロビオースをセロビオースホスホリラーゼによって分解し得るので、セロオリゴ糖からひダルカンの合成速度がより速くなる。

[0092] β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。 j8 -l, 4 ーグルカンホスホリラーゼを産生する生物の例としては、 Clostridium属の生物（例えば、 Clostridium thermocellumおよび Clostridium sterocorarium)、 Cellvib rio属の生物（例えば、 Cellvibrio gilvus)、 Thermotoga属の生物（例えば、 Ther motoga neapolitanaおよび Thermotoga maritima)、 Ruminococcas属の生物 (例えば、 Ruminococcas flavofaciens)、 Forties属の生物 (例えば、 Forties a nnos)、 Cellulomonas属の生物および Erwinia属の生物が挙げられる。 β— 1， 4 グルカンホスホリラーゼを産生する生物は好ましくは、 Clostridium thermocellum 、 Clostridium sterocorarium^ し ellvibrio gilvus ^ Thermotoga neapolitana 、 Thermotoga maritima ^ Ruminococcas flavofaciens ^ Forties annos、 Cel lulomonas sp. 、 Erwinia sp.力らなる群より選択される。 j8—l, 4—グルカンホスホリラーゼは、植物由来であってもよい。

[0093] セロビオースホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。セロビオースホスホリラ一ゼを産生する生物の例としては、 Clostridium属の生物（例えば、 Clostri dium thermocellumおよびし lostridium sterocorarium;、 Cellviorio属の生物（例えば、 Cellvibrio gilvus)、 Thermotoga属の生物（例えば、 Thermotoga neapolitanaおよび Thermotoga maritima)、 Ruminococcas属の生物 (例ば、 Ruminococcas flavofaciens)、 Forties属の生物 (例えは、 Forties annos) 、 Cellulomonas属の生物および Erwinia属の生物が挙げられる。セロビオースホスホリラーゼを産生する生物は好ましくは、 Clostridium thermocellum, Clostridiu m sterocorarium ^ し ellvibrio gilvus、 hermotoga neapolitana^ Thermoto ga maritima ^ Ruminococcas flavofaciens ^ Forties annosゝし ellulomonas sp. , Erwinia sp.からなる群より選択され、より好ましくは Clostridium thermoc eliumまた iiCellviorio gilvusで &)り、最も好ましく ίまし lostridium thermoceliu mである。セロビオースホスホリラーゼは、植物由来であってもよい。

[0094] セロデキストリンホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。セロデキストリンホスホリラーゼを産生する生物の例としては、 Clostridium属の生物（例えば、 C1 ostndium thermocellumおよび Clostridium sterocorarium)、し ellvibrio属の生物（例えば、 Cellvibrio gilvus)、 Thermotoga属の生物（例えば、 Thermoto ga neapolitanaおよび Thermotoga maritima)、 RuminococcasJ¾の生物 (f列えば、 Ruminococcas flavofaciens)、 Forties属の生物 (f列えば、 Forties annos )、 Cellulomonas属の生物および Erwinia属の生物が挙げられる。セロデキストリンホスホリラーゼを産生する生物は好ましくは、 Clostridium thermocellum、 Clostr ldium sterocorarium、 Cellvibno gilvus、 Tnermotoga neapolitana、 Ther motoga maritima、 Ruminococcas flavofaciens ^ Forties annosゝ Cellulom onas sp. , Erwinia sp.からなる群より選択され、より好ましくは Clostridium the rmoceliumまた i Cellulomonas sp.であり、最もタナ 3;しく ίま Clostridium therm ocellumである。セロデキストリンホスホリラーゼホスホリラ一ゼは、植物由来であってちょい。

[0095] β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼ (好ましくはセロビオースホスホリラーゼまたはセロデキストリンホスホリラーゼ、最も好ましくはセロビオースホスホリラーゼ）は、 13— 1, 4 グルカンホスホリラーゼ (好ましくはセロビオースホスホリラーゼまたはセロデキストリンホスホリラーゼ、最も好ましくはセロビオースホスホリラーゼ）を産生する任意の生物由来であり得る。 β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼは、ある程度の耐熱性を有することが好ましい。 -1, 4ーグルカンホスホリラーゼは、耐熱性が高ければ高いほど好ましい。例えば、 j8— 1, 4—グルカンホスホリラーゼを 1. 4mMの 2 メルカプトエタノールを含む 50mMリン酸緩衝液 (pH7. 5)中で 55°Cにて 20分間加熱した場合に加熱前の β— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼの活性の 50%以上の活性を保持するものであることが好ましぐ 60%以上の活性を保持するものであることがより好ましぐ 70%以上の活性を保持するものであることがさらに好ましぐ 80%以上の活性を保持するものであることが特に好ましぐ 85%以上の活性を保持するものであることが最も好ましい。 j8—l, 4—グルカンホスホリラーゼは、好ましくは Clostridium thermocellum、 C1 ostndium sterocorarium、 Cellviono giivus、 Thermotoga neapolrcana、 T hermotoga maritima、 Ruminococcas flavofaciens ^ Forties annos ^ Cellul omonas sp.、 Erwinia sp.からなる群より選択される細菌由来である。

[0096] β— 1， 4—グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合、セロビ才ーススホリフーセ【ま、好まし <αま Clostridium thermocellum、 Clostridium s terocoranum^ Cell vibrio gilvusゝ Tnermotoga neanolitana、 fhermotoga maritima、 Ruminococcas flavofaciens、 Forties annos、 Cellulomonas sp. , Erwinia sp.力なる群より選択される細菌由来であり、より好ましくは Clostridiu m thermocellumまたは Cellvibrio gilvus由来であり、最も好ましくは Clostridiu m thermocellum由来である。

[0097] β -1, 4—グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合、セロビ才ーススホリフーセ【ま、好まし <αま Clostridium thermocellum^ Clostridium s terocoranum^ Cell vibrio gilvusゝ Tnermotoga neapolitana^ fhermotoga maritima、 Ruminococcas flavofaciens、 Forties annos、 Cellulomonas sp. 、 Erwinia sp.力なる群より選択される細菌由来であり、より好ましくは Clostridiu m thermocellumまた ίま Cellulomonas sp.由来であり、最も好 3;しく ίま Clostridi um thermocellum由来（？ある。

[0098] 本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなぐその生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物力入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌力酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。

[0099] 本発明で用いられる j8—l, 4—グルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、 β— 1, 4-グルカンホスホリラーゼを産生する生物力も直接単離され得る。本発明で用いられる j8—l, 4—グルカンホスホリラーゼは、上記の生物から単離した |8— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物 (例えば、細菌、真菌など)力も単離してもよい。

[0100] 本発明の方法で用いられる β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼは、例えば、以下のようにして調製され得る。まず、 /3— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）を培養する。この微生物は、 β— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼを直接生産する微生物であってもよい。また、 j8— 1, 4—グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子をクローン化し、得られた遺伝子で j8—l, 4—グルカンホスホリラーゼ発現に有利な微生物 (例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えして組換えされた微生物を得、得られた微生物から j8—l, 4—グルカンホスホリラーゼを得てもよい。 [0101] β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼ遺伝子での遺伝子組換えに用いられる微生物は、 β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。 β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでし力発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。 β— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでし力発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生される j8—l, 4—グルカンホスホリラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。

[0102] クローンィ匕した遺伝子での微生物（例えば、細菌、真菌など）の遺伝子組換えは、当業者に周知の方法に従って行われ得る。クローン化した遺伝子を用いる場合、この遺伝子を、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターに作動可能に連結することが好ましい。「作動可能に連結する」とは、プロモーターと遺伝子とが、そのプロモ一ターによって遺伝子の発現が調節されるように連結されることをいう。誘導性プロモ一ターを用いる場合、培養を、誘導条件下で行うことが好ましい。種々の誘導性プロモーターは当業者に公知である。

[0103] クローンィ匕した遺伝子について、生産される β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼが菌体外に分泌されるように、シグナルペプチドをコードする塩基配列をこの遺伝子に連結し得る。シグナルペプチドをコードする塩基配列は当業者に公知である。

[0104] 当業者は、 j8 -1, 4ーグルカンホスホリラーゼを生産するために、微生物（例えば、細菌、真菌など)の培養の条件を適切に設定し得る。微生物の培養に適切な培地、各誘導性プロモーターに適切な誘導条件などは当業者に公知である。

[0105] 例えば、発現された j8 -1, 4ーグルカンホスホリラーゼが形質転換細胞内に蓄積する場合、形質転換細胞を適切な条件下で培養した後、培養物を遠心分離または濾過することによって細胞を回収し、次いで適切な緩衝液に懸濁する。次いで超音波処理などにより細胞を破砕した後、遠心分離もしくは濾過することによって上清を得る。あるいは、発現された j8—l, 4—グルカンホスホリラーゼが形質転換細胞外に分泌される場合、このようにして形質転換細胞を培養した後、培養物を遠心分離または濾過することによって細胞を分離して上清を得る。 β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼが形質転換細胞内に蓄積する場合も、形質転換細胞外に分泌される場合も、このようにして得られた ι8—1, 4—グルカンホスホリラーゼ含有上清を通常の手段 (例えば、塩析法、溶媒沈澱、限外濾過）を用いて濃縮し、 j8 -l, 4ーグルカンホスホリラーゼを含む画分を得る。この画分を濾過、あるいは遠心分離、脱塩処理などの処理を行い粗酵素液を得る。さらにこの粗酵素液を、凍結乾燥、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、晶出などの通常の酵素の精製手段を適宜組み合わせることによって、比活性が向上した粗酵素あるいは精製酵素が得られる。ひアミラーゼなどのダルカンを加水分解する酵素が含まれていなければ、粗酵素をそのまま、例えば、 α—グルカンの製造に用い得る。

[0106] 反応開始時の溶液中に含まれる β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中の j8—l, 4—グルカンに対して、代表的には約 0. 01-1, OOOU/g β -1, 4—グルカン、好ましくは約 0. 05-500U/g β -1, 4—グルカン、より好ましくは約 0. l-100U/g β -1, 4—グルカンであり、特に好ましくは約 0. 5— 50UZ g j8— 1, 4—グルカンであり、最も好ましくは約 1一 7UZ j8— 1, 4—グルカンである。 j8— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。

[0107] β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。 β - 1, 4ーグルカンホスホリラーゼは、固定ィ匕されていても固定ィ匕されていなくともよい。 β— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼは、固定ィ匕されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法 (たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法 (格子型またはマイクロカプセル型)など、当業者に周知の方法が使用され得る。 β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼは、担体上に固定ィ匕されていることが好ましい。

[0108] (5. α -1, 4ーグルカンホスホリラーゼ）

α -1, 4—グルカンホスホリラーゼ（EC : 2. 4. 1. 1)とは、 α— 1, 4—グルカン（重合度 n)のカロリン酸分解による、 ex -1 , 4ーグルカン（重合度 n 1)と α—D グルコース

1 リン酸との産生を触媒する酵素の総称であり、ホスホリラーゼ、スターチホスホリラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼなどと呼ばれる場合もある。グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応である、 α -1 , 4-グルカン（重合度 η— 1)および α— D グルコース 1 リン酸から α—1 , 4—グルカン（重合度 η)を合成する反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存する。生体内では、無機リン酸の量が多いので、グルカンホスホリラーゼは加リン酸分解の方向に反応が進む。本発明の方法では、無機リン酸は、 j8 -l , 4ーグルカンのカロリン酸分解に使われ、反応溶液中に含まれる無機リン酸の量が少ないので、 α—グルカンの合成の方向に反応が進む。

[0109] α -1 , 4ーグルカンホスホリラーゼは、デンプンまたはグリコーゲンを貯蔵し得る種々の植物、動物および微生物中に普遍的に存在すると考えられる。

[0110] α -1 , 4ーグルカンホスホリラーゼを産生する植物の例としては、藻類、ジャガイモ（馬鈴薯ともいう）、サツマィモ（甘藷ともいう）、ャマイモ、サトイモ、キヤッサバなどの芋類、キャベツ、ホウレンソゥなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、ォォムギ、ライムギ、ァヮなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。

[0111] α -1 , 4ーグルカンホスホリラーゼを産生する動物の例としては、ヒト、ゥサギ、ラット、ブタなどの哺乳類などが挙げられる。

[0112] α— 1 , 4—グルカンホスホリラーゼを産生する微生物の例としては、 Thermus aqu aticus、 Bacillus stearothermophilus、 Demococcus raaioaurans^ Tnermo coccus litoralis、 Streptomyces coelicolor、 Pyrococcus horikoshiゝ Myco bacterium tuberculosis ^ Thermotoga mariuma、 Aquifex aeolicus、 Meth anococcus Jannaschii、 Pseudomonas aeruginosa ^ Chlamydia pneumoni ae、 Chlorella vulgaris ^ Agrobacterium tumefaciens、 Clostridium pasteu rianum、 Klebsiella pneumoniae ^ Synecococcus sp .、 Synechocystis sp. 、 E. coli、 Neurospora cmssa、 Saccharomyces cerevisiae^ Chlamydomon as sp .などが挙げられる。 α -1 , 4ーグルカンホスホリラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。 [0113] 本発明で用いられる 4—グルカンホスホリラーゼは、ジャガイモ、 Thermus a quaticus、 Bacillus stearothermophilusに由来すること; 0好まし \、ンャ 7ィモに由来することがより好ましい。本発明で用いられる 4—グルカンホスホリラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高い 4—グルカンホスホリラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。

[0114] 本発明で用いられる α— 1 , 4ーグルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、 4—グルカンホスホリラーゼを産生する動物、植物、および微生物から直接単離され得る。

[0115] 本発明で用いられる 4—グルカンホスホリラーゼは、これらの動物、植物または微生物力単離した 4—グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物 (例えば、細菌、真菌など)から単離してもよい。

[0116] α -1 , 4ーグルカンホスホリラーゼは、上記の 13—1 , 4ーグノレカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。

[0117] 遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記の β—1 , 4 ダルカンホスホリラーゼと同様に、 _α 1 , 4—グルカンホスホリラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。 4ーグルカンホスホリラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好まし、ので、アミラーゼを産生しな、かまたは低レベルでし力発現しな、微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。 α -1 , 4-グルカンホスホリラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用 V、ることが好まし、。アミラーゼを産生しな、かまたは低レベルでし力発現しな、微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生される 4—グルカンホスホリラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。

[0118] 遺伝子組換えによって得られた 4—グルカンホスホリラーゼの生産および精製は、上記の j8— 1 , 4—グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。

[0119] 反応開始時の溶液中に含まれる α— 1 , 4ーグルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中の j8— 1 , 4ーグノレカン【こ対して、代表的【こ ίま約 0. 05- 1 , 000U/g β -1 , 4—グルカン、好ましくは約 0. l-500U/g β -1 , 4—グルカン、より好ましくは約 0. 5— lOOUZg j8— 1 , 4—グルカンであり、特に好ましくは約 1一 80UZg β -1 , 4—グルカンであり、最も好ましくは約 10— 50UZg β— 1 , 4ーグルカンである。 α -1 , 4ーグルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。

[0120] 4—グルカンホスホリラーゼは、精製されていても未精製であってもよい。 α -

1 , 4ーグルカンホスホリラーゼは、固定ィ匕されていても固定ィ匕されていなくともよい。 α -1 , 4ーグルカンホスホリラーゼは、固定ィ匕されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法 (たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法 (格子型またはマイクロカプセル型)など、当業者に周知の方法が使用され得る。 α -1 , 4ーグルカンホスホリラーゼは、担体上に固定ィ匕されていることが好ましい。 α -1 , 4ーグルカンホスホリラーゼはまた、 13— 1 , 4ーグルカンホスホリラーゼと同じ担体上に固定ィ匕されていてもよいし、別の担体上に固定ィ匕されていてもよ V、。同じ担体上に固定ィ匕されて、ることが好まし、。

[0121] (6.グルコースイソメラーゼ（EC : 5. 3. 1. 5) )

本発明の製造方法においては、溶液液中にグルコースイソメラーゼをさらに含むことが好ましい。溶液中にグルコースイソメラーゼを含むことにより、セロビオースの加リン酸分解によって生じたグルコースをフルクトースへと変換できる。グルコースはセロビオースの力!]リン酸分解方向の反応を阻害するので、溶液中にグルコースイソメラーゼを含むことにより、セロビオースのカロリン酸分解をより一層促進することができ、最終的に得られる α—ダルカンの収率を向上させることができる。

[0122] 本発明の製造方法で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、 D—グルコースと D— フルクトースとの相互変換を触媒し得る酵素である。グルコースイソメラーゼは、 D—キシロースと D—キシルロースとの相互変換をも触媒し得るので、キシロースイソメラーゼとち呼ばれる。

[0123] グルコースイソメラーゼは、微生物、動物および植物に存在する。グルコースイソメラーゼを産生する微生物の例としては、 Streptomyces rubiginosus、 Streptomy ces olivochromogenes、 Streptomyces murmus、 Streptomvces violaceo niger、 Streptomyces diastaticus、 Streptomyces albus、 Streptomyces sp . 、 Escherichia coli、 Bacteroides xylanolyticus、 Arthrobacter sp. 、 Cand ida boidinii、 Clostridium thermo sulf urogene s、 Clostridium thermohydr osulfuricum、 Thermoanaerobacterium saccharolyticum、 Thermoanaerob acter sp. 、 Thermotoga neapolitana、 Thermus aquaticus、 Lactobacillus brevis、 Lactobacillus xylosus、 Agrobacterium tumefaciens、 Bacillus s p. 、 Actinoplanes missouriensisおよび Paracolobacterium aerogenoides力 S 挙げられる。グルコースイソメラーゼを産生する動物の例としては、 Trypanosoma b ruceiが挙げられる。グルコースイソメラーゼは、植物由来であってもよい。グルコースイソメラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。

[0124] 本発明で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、 Streptomyces rubiginosusまたは Bacillus sp. に由来することカナ¾しく、 streptomyces rubiginosusに由来することがより好ましい。本発明で用いられるグルコースイソメラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグルコースイソメラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。

[0125] 本発明で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、上記のような自然界に存在する、グルコースイソメラーゼを産生する生物カゝら直接単離され得る。

[0126] 本発明で用いられ得るグルコースイソメラーゼは、これらの生物力単離したダルコースイソメラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など)力も単離してもよい。

[0127] グルコースイソメラーゼは、上記の 13 -1, 4—グルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物カゝら得られ得る。

[0128] 遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記の β—1, 4 ダルカンホスホリラーゼと同様に、グルコースイソメラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。グルコースイソメラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでし力発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましヽ。グルコースイソメラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでし力発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるグルコースイソメラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好まし、。

[0129] 遺伝子組換えによるグルコースイソメラーゼの生産および精製は、上記の β— 1, 4 -グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。

[0130] 反応開始時の溶液中に含まれるグルコースイソメラーゼの量は、反応開始時の溶液中の j8— 1, 4ーグノレカン【こ対して、代表的【こ ίま約 0. 01一 500U/g β -1, 4ーグノレカン、好ましく ίま約 0. 05— 100U/g β— 1, 4—グノレカン、より好ましく ίま約 0. 1 -50U/g j8— 1, 4—グルカンであり，特に好ましくは約 0. 5— lOUZg β ~1, 4- グルカンであり、最も好ましくは約 1一 5UZg β— 1, 4ーグルカンである。グルコースイソメラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。

[0131] グルコースイソメラーゼは、精製されて!、ても未精製であってもよ!/ヽ。グルコースイソメラーゼは、固定ィ匕されていても固定ィ匕されていなくともよい。グルコースイソメラーゼは、固定ィ匕されることが好ましい。固定ィ匕の方法としては、担体結合法 (たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法)、架橋法または包括法 (格子型またはマイクロカプセル型)など、当業者に周知の方法が使用され得る。グルコースイソメラーゼは、担体上に固定ィ匕されていることが好ましい。グルコースイソメラーゼはまた、 β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼおよび α 1, 4ーグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定ィ匕されて、てもよ、し、別の担体上に固定ィ匕されて、てもよい。 β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼおよび 4—グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定ィ匕されていることが好ましい。

[0132] (7.グルコースォキシダーゼ）

本発明の製造方法においては、溶液中にグルコースォキシダーゼをさらに含むことが好ましい。反応液中にグルコースォキシダーゼを含むことにより、セロビオースの加リン酸分解によって生じた α グルコースから自然変換された β グルコースを βーグルコノー δラタトンヘと変換できる。 α—グルコースはセロビオースのカロリン酸分解方向の反応を阻害するので、溶液中にグルコースォキシダーゼを含むことにより、セロビオースのカロリン酸分解をより一層促進することができ、最終的に得られる α—グルカンの収率を向上させることができる。

[0133] 本発明の製造方法で用いられ得るグルコースォキシダーゼは、以下の反応を触媒し得る酵素である：

[0134] [化 4]

β—D—グルコース + H₂0 + FAD + ¹ /₂0₂

→D—グルコノ _ dラクトン +H₂0₂ + FADH₂

グルコースォキシダーゼは、微生物および植物に存在する。グルコースォキシダーセを産生する微生物の f列としては、 Aspergillus niger、 Penicillium amagasaki ense、 Penicillium notatumおよび Phanerochaete chrysosporium力挙げられる。グルコースォキシダーゼは植物由来であってもよい。グルコースォキシダーゼを産生する生物はこれらに限定されな!ヽ。

[0135] 本発明で用いられ得るグルコースォキシダーゼは、 Aspergillus nigerまたは Pen icillium amagasakienseに由来すること; 0好まし \、 Aspergillus nigerに由来することがより好ましい。本発明で用いられるグルコースォキシダーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグルコースォキシダーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。

[0136] 本発明で用いられ得るグルコースォキシダーゼは、上記のような自然界に存在する、グルコースォキシダーゼを産生する生物から直接単離され得る。

[0137] 本発明で用いられ得るグルコースォキシダーゼは、これらの生物から単離したダルコースォキシダーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など)力も単離してもよい。

[0138] グルコースォキシダーゼは、上記の β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。

[0139] 遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記の β—1, 4 ダルカンホスホリラーゼと同様に、グルコースォキシダーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。ダルコ一スォキシダーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでし力発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好まし、。グルコースォキシダーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでし力発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるグルコースォキシダーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好まし、。

[0140] 遺伝子組換えによるグルコースォキシダーゼの生産および精製は、上記の j8— 1 , 4-グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。

[0141] 反応開始時の溶液中に含まれるグルコースォキシダーゼの量は、反応開始時の溶液中の j8— 1, 4ーグノレカンに対して、代表的には約 0. 5- 1, OOOU/g β -1, 4 グルカン、好ましくは約 1一 500UZg β— 1, 4—グルカン、より好ましくは約 5— 400 U/g j8— 1, 4—グルカンであり，特に好ましくは約 10— 300UZg j8— 1, 4—グルカンであり、最も好ましくは約 20— 200UZg β— 1, 4ーグルカンである。グルコースォキシダーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。

[0142] グルコースォキシダーゼは、精製されて!、ても未精製であってもよヽ。グルコースォキシダーゼは、固定ィ匕されていても固定ィ匕されていなくともよい。グルコースォキシダーゼは、固定ィ匕されることが好ましい。固定ィ匕の方法としては、担体結合法 (たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法)、架橋法または包括法 (格子型またはマイクロカプセル型)など、当業者に周知の方法が使用され得る。グルコースォキシダーゼは、担体上に固定ィ匕されていることが好ましい。グルコースォキシダーゼはまた、 j8— 1 , 4ーグルカンホスホリラーゼおよび α— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定ィ匕されていてもよいし、別の担体上に固定ィ匕されていてもよい。 j8—l, 4—グルカンホスホリラーゼおよび 4—グノレカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定ィ匕されていることが好ましい。 [0143] (8.ムタロターゼ）

本発明の製造方法にお!、て溶液中にグルコースォキシダーゼを含む場合、溶液中にムタロターゼをさらに含むことが好ましい。溶液中にムタロターゼを含むことにより、セロビオースの加リン酸分解によって生じた a グルコースと 13 グルコースとを相互変換し得る。 OC—グルコースと β グルコースとは、ムタロターゼを加えなくとも自然に相互変換されるとはいえ、ムタロターゼをカ卩えることによって相互変換が促進されるので、反応によって生じた α グルコースを溶液力も減らす効率をより向上させ得る。それゆえ、反応液中にグルコースォキシダーゼおよびムタロターゼを含むことにより、反応液中の α グルコース濃度を低下させ、その結果、セロビオースのカロリン酸分解をより一層促進することができ、最終的に得られる α—グルカンの収率を向上させることができる。

[0144] 本発明の製造方法で用いられ得るムタロターゼは、 a グルコースと 13 グルコースとの相互変換を触媒し得る酵素である。

[0145] ムタロターゼは、微生物、動物および植物に存在する。ムタロタ一ゼを産生する微生物の例としては、 Penicillium notatumおよび Escherichia coliが挙げられる。ムタロタ一ゼを産生する動物の例としては、ブタおよび Bos taurusが挙げられる。ムタロターゼを産生する植物の例としては、 Capsicum frutescensが挙げられる。ムタロターゼを産生する生物はこれらに限定されない。

[0146] 本発明で用いられ得るムタロターゼは、ブタまたは Bos taurusに由来することが好ましぐブタに由来することがより好ましい。本発明で用いられるムタロターゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いムタロターゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。

[0147] 本発明で用いられ得るムタロターゼは、上記のような自然界に存在する、ムタロタ一ゼを産生する生物から直接単離され得る。

[0148] 本発明で用いられ得るムタロターゼは、これらの生物から単離したムタロタ一ゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物 (例えば、細菌、真菌など)から単離してちょい。

[0149] ムタロターゼは、上記の β -1 , 4ーグルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。

[0150] 遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記の β—1 , 4 ダルカンホスホリラーゼと同様に、ムタロターゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。ムタロターゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まな、ことが好ま U、ので、アミラーゼを産生しな！、かまたは低レベルでし力発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。ムタロターゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好まし、。アミラーゼを産生しな、かまたは低レベルでしか発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるムタロターゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。

[0151] 遺伝子組換えによるムタロターゼの生産および精製は、上記の j8— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。

[0152] 反応開始時の溶液中に含まれるムタロタ一ゼの量は、反応開始時の溶液中の β 1, 4ーグノレカン【こ対して、代表的【こ ίま約 0. 01一 500U/g β -1, 4ーグノレカン、好ましくは約 0. Ol- lOOU/g β— 1, 4—グルカン、より好ましくは約 0. 01— 50UZ g j8— 1, 4—グルカンであり，特に好ましくは約 0. 05— lOUZg j8— 1, 4—グルカンであり、最も好ましくは約 0. l-5U/g β -1, 4ーグルカンである。ムタロターゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。

[0153] ムタロターゼは、精製されて!ヽても未精製であってもよ！/、。ムタロターゼは、固定ィ匕されていても固定ィ匕されていなくともよい。ムタロターゼは、固定ィ匕されることが好ましい。固定ィ匕の方法としては、担体結合法 (たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法)、架橋法または包括法 (格子型またはマイクロカプセル型)など、当業者に周知の方法が使用され得る。ムタロターゼは、担体上に固定ィ匕されていることが好ましい。ムタロターゼはまた、 β— 1, 4—グルカンホスホリラーゼおよび 4— グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定ィ匕されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。 β— 1， 4ーグルカンホスホリラーゼおよび α— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定ィ匕されていることが好ましい [0154] (9.カタラーゼおよびペルォキシダーゼ）

本発明の製造方法にお!、て溶液中にグルコースォキシダーゼを含む場合、溶液中にカタラーゼまたはペルォキシダーゼをさらに含むことが好ましい。溶液中にカタラーゼまたはペルォキシダーゼを含むことにより、グルコースォキシダーゼによって触媒される反応によって生じる過酸化水素を酸素に変換し、酸素をリサイクルさせることができる。それゆえ、反応液中にグルコースォキシダーゼと、カタラーゼまたはペルォキシダーゼとを含むことにより、反応液中のひグルコース濃度を低下させ、その結果、セ口ビオースのカロリン酸分解をより一層促進することができ、最終的に得られる α ダルカンの収率を向上させることができる。

[0155] 本発明の製造方法で用いられ得るカタラーゼは、過酸ィ匕水素を酸素と水とに分解する反応を触媒する酵素である。

[0156] カタラーゼは、微生物、動物および植物に存在する。カタラーゼを産生する微生物の ί列とし一しは、 Acetobacter peroxydans、 Acholeplasma equifetale、 Achole plasma hippikon、 Acholeplasma laidlawu、 Aspergillus niger、 Penicillium janthinellum、 Halobacterium halobium、 Haloarcula marismortui、 Esch erichia coli、 Mycoplasma arthritidis、 Mycoplasma capricolum、 Mycoba cterium smegmatis、 Mycobacterium tuberculosis^ Mycoplasma pulmon is、 Mycoplasma sp. 、 Bacillus stearothermophilus ^ Rhodobacter sphaer oides、 Lactobacillus plantarum、 Thermoleophilum album ^ Phanerochaet e chrysosporium、 Saccharomyces cerevisiae、し andida mgosa、 Kloeck era sp、 Klebsiella pneumoniae ^ Pseudomonas stutzeriおよび Paracoccus denitrificansが挙げられる。カタラーゼを産生する動物の例としては、 Capra aeg agrus nircus、 Bos taurus、 Homo sapiens^ Rattus norvegicusおよび Noto mastus lobatus (多毛類）が挙げられる。カタラーゼを産生する植物の例としては、 Gossypium hirsutum、 Smapis aloa、 ¾pmacia oleracea、 Nicotiana tabac um L. 、 Nicotiana sylvestris、 Euglena gracilis (藻類)および Pisum sativu mが挙げられる。カタラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。 [0157] 本発明で用いられ得るカタラーゼは、 Aspergillus niger, Bovine Liver (牛肝臓）または Human Erythrocyte (ヒト赤血球）に由来することが好ましく、 Aspergillus nigerに由来することがより好ましい。本発明で用いられるカタラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いカタラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。

[0158] 本発明の製造方法で用いられ得るペルォキシダーゼは、過酸化水素を水素受容体として種々の有機物の酸化を触媒する酵素である。

[0159] ペルォキシダーゼは、微生物、動物および植物に存在する。ペルォキシダーゼを産生する微生物の例としては、 Pleurotus ostreatus、 Halobacterium halobiu m、 Haloarcula marismortui、し oprmus friesu、 Phanerochaete chrysospo rium、 Mycobacterium smegmatis、 Mycobacterium tuberculosis^ Flavob acterium meningosepticum、 Arthromyces ramosus、 Phellinus igniarius 、 Escherichia coli、 Thermoleophilum album、 Kloeckera sp.、 Bacillus s tearothermophilus、 Coprinus cinereusおよび Coprinus macrorhizus力 S挙げられる。なお、本明細書中では、微生物は、細菌および真菌を含む。ペルォキシダーゼを産生する動物の例としては、 Homo sapiens, Cards familiaris、 Rattus no rvegicus、 Sus scrofa、 Ovis ariesが挙げられる。ぺノレオキシダ一ゼを産生する植物の f列としては、西洋ヮサビ (horseradish)、 Armoracia rusticana、 Armoraci a lapathifolia、 Actmiaia chmensis、 Citrus sinensis^ Populus trichocarp a、 Nicotiana sylvestris、 Picea sitchensis Carr.、 Picea abies L. , Kars ten、 Petunia hybrida、 Carica papaya^ Vitis Pseudoreticulata、 Hordeu m vulgare、 Brassica rapa、 Prunus persica、 Vicia faba、 Oryza sativa L .が挙げられる。ペルォキシダーゼを産生する生物はこれらに限定されない。

[0160] 本発明で用いられ得るペルォキシダーゼは、西洋ヮサビおよび Bacillus stearot hermophilusに由来することが好ましく、西洋ヮサビに由来することがより好ま U、。本発明で用いられるペルォキシダーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いペルォキシダーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。

[0161] 本発明で用いられ得るカタラーゼまたはペルォキシダーゼは、上記のような自然界に存在する、カタラーゼまたはペルォキシダーゼを産生する生物力も直接単離され得る。

[0162] 本発明で用いられ得るカタラーゼまたはペルォキシダーゼは、これらの生物から単離したカタラーゼまたはペルォキシダーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物 (例えば、細菌、真菌など)力も単離してもよい。

[0163] カタラーゼまたはペルォキシダーゼは、上記の 13 1, 4ーグルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。

[0164] 遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記の β 1 , 4 ダルカンホスホリラーゼと同様に、カタラーゼまたはペルォキシダーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。カタラーゼまたはペルォキシダーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好まし、ので、アミラーゼを産生しな、かまたは低レベルでし力発現しな、微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。カタラーゼまたはペルォキシダーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用 V、ることが好まし、。アミラーゼを産生しな、かまたは低レベルでし力発現しな、微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるカタラーゼまたはペルォキシダーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。

[0165] 遺伝子組換えによるカタラーゼまたはペルォキシダーゼの生産および精製は、上記の j8— 1, 4-グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。

[0166] 反応開始時の溶液中に含まれるカタラーゼまたはペルォキシダーゼの量は、反応開始時の溶液中の j8— 1, 4—グルカンに対して、代表的には約 0. 05-1, OOOU/ g j8— 1, 4—グルカン、好ましくは約 0. 1— 500UZg j8— 1, 4—グルカン、より好ましくは約 1. 0-200U/g β -1, 4ーグルカンである。カタラーゼまたはペルォキシダーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。

[0167] カタラーゼまたはペルォキシダーゼは、精製されて!ヽても未精製であってもよヽ。力タラーゼまたはペルォキシダーゼは、固定ィ匕されていても固定ィ匕されていなくともよい。カタラーゼまたはペルォキシダーゼは、固定ィ匕されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法 (たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法)、架橋法または包括法 (格子型またはマイクロカプセル型)など、当業者に周知の方法が使用され得る。カタラーゼまたはペルォキシダーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。カタラーゼまたはペルォキシダーゼはまた、 j8— 1 , 4 ダルカンホスホリラーゼおよびひ 1 , 4ーグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定ィ匕されていてもよいし、別の担体上に固定ィ匕されていてもよい。 β— 1 , 4 ーグルカンホスホリラーゼおよび 4—グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定ィ匕されて、ることが好まし、。

[0168] ( 10.枝切り酵素）

本発明の方法において、 α— 1 , 6 ダルコシド結合を含有する出発材料を用いる場合などの、生成物に分岐が生じる場合には、必要に応じて、枝切り酵素を用いることができる。

[0169] 本発明で用いられ得る枝切り酵素は、 α -1 , 6 ダルコシド結合を切断し得る酵素である。枝切り酵素は、アミロぺクチンおよびグリコーゲンにともによく作用するイソアミラーゼ（EC 3. 2. 1. 68)と、アミロぺクチン、グリコーゲンおよびプルランに作用する atーデキストリンエンド— 1 , 6- a ダルコシダーゼ（プルラナーゼとも!/、う） (EC 3. 2. 1. 41)との 2つに分類される。

[0170] 枝切り酵素は、微生物および植物に存在する。枝切り酵素を産生する微生物の例としては、 Saccharomyces cerevisiae、 Chlamyaomonas sp. 、 Bacillus brev is、 Bacillus acidopullulyticus、 Bacillus macerans、 Bacillus stearothermo philus、 Bacillus circulans、 Thermus aquaticus、 Klebsiella pneumoniae、 Ί hermoactinomyces thalpophilus、 Thermoanaerobacter ethanolicus、 Ps eudomonas amyloderamosaなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する植物の例としては、ジャガイモ、サツマィモ、トウモロコシ、イネ、コムギ、ォォムギ、オートムギ、サトウダイコンなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する生物はこれらに限定されない

[0171] 本発明で用いられ得る枝切り酵素は、 Klebsiella pneumoniae, Bacillus brevi s、 Bacillus acidopullulyticus、 Pseudomonas amyloderamosaに由来することカ十しく、 Klebsiella pneumoniae ^ Pseudomonas amyloderamosaに由来することがより好ましい。本発明で用いられる枝切り酵素は、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高い枝切り酵素は、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。

[0172] 本発明で用いられ得る枝切り酵素は、上記のような自然界に存在する、枝切り酵素を産生する微生物および植物から直接単離され得る。

[0173] 本発明で用いられ得る枝切り酵素は、これらの微生物および植物力単離した枝切り酵素をコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物 (例えば、細菌、真菌など)から単離してもよい。

[0174] 枝切り酵素は、上記の j8 -1, 4ーグルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。

[0175] 遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記の β—1 , 4 ダルカンホスホリラーゼと同様に、枝切り酵素の発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。枝切り酵素は、夾雑物としてアミラーゼを含まな、ことが好ま U、ので、アミラーゼを産生しな！、かまたは低レベルでし力発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。枝切り酵素の遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好まし、。アミラーゼを産生しな、かまたは低レベルでしか発現しない微生物 (例えば、細菌、真菌など)を用いて産生される枝切り酵素は、アミラーゼを実質的に含まな、ため、本発明の方法での使用に好まし、。

[0176] 遺伝子組換えによる枝切り酵素の生産および精製は、上記の j8 -1, 4ーグルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。

[0177] 反応開始時の溶液中に含まれる枝切り酵素の量は、反応開始時の溶液中の β 1 , 4ーグノレカン【こ対して、代表的【こ ίま約 0. 05—1, 000U/g β— 1， 4ーグノレカン、好ましくは約 0. l-500U/g β -1, 4—グルカン、より好ましくは約 0. 5— 100UZ g β -1, 4ーグルカンである。枝切り酵素の重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。

[0178] 枝切り酵素は、精製されていても未精製であってもよい。枝切り酵素は、固定化されていても固定化されていなくともよい。枝切り酵素は、固定化されることが好ましい。固定ィ匕の方法としては、担体結合法 (たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法)、架橋法または包括法 (格子型またはマイクロカプセル型)など、当業者に周知の方法が使用され得る。枝切り酵素は、担体上に固定化されていることが好ましい。枝切り酵素はまた、 β— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼおよび 4—グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定ィ匕されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。 β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼおよび 4—グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定ィ匕されていることが好ましい。

[0179] (11.ブランチングェンザィム（EC. 2. 4. 1. 18) )

本発明の方法において、生成物に分岐を生じさせることが所望される場合には、必要に応じて、ブランチングェンザィムを用いることができる。

[0180] 本発明で用いられ得るブランチングェンザィムは、 α— 1, 4—グルカン鎖の一部をこ (D a -1, 4ーグルカン鎖のうちのあるグルコース残基の 6位に転移して分枝を作り得る酵素である。ブランチングェンザィムは、 1, 4 α—グルカン分枝酵素、枝つくり酵素または Q酵素とも呼ばれる。

[0181] ブランチングェンザィムは、微生物、動物、および植物に存在する。ブランチングェンザィムを産生する微生物の例としては、 Bacillus stearothermophilus, Bacillu s subtilis、 Bacillus caldolyticus、 Bacillus licneniformis、 Bacillus amyloi iquefaciens、 Bacillus coagulans、 Bacillus caldovelox、 Bacillus thermoca tenulatus、 Bacillus smithu、 Bacillus megaterium、 Bacillus brevis、 Alkal ophillic Bacillus sp.、 Streptomyces coelicolor、 Aquifex aeolicus、 Syne chosystis sp.、 E. coli、 Agrobacteirum tumefaciens、 Thermus aquaticus 、 Rhodothermus obamensis、 Neurospora crassa、酵母なと； 0举げられる。ブランチングェンザィムを産生する動物の例としてはヒト、ゥサギ、ラット、ブタなどの哺乳類が挙げられる。ブランチングェンザィムを産生する植物の例としては、藻類、ジャガイモ、サツマィモ、ャマイモ、キヤッサバなどの芋類、ホウレンソゥなどの野菜類、トゥモロコシ、イネ、コムギ、ォォムギ、ライムギ、ァヮなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。ブランチングェンザィムを産生する生物はこれらに限定されない。

[0182] 本発明で用いられ得るブランチングェンザィムは、ジャガイモ、 Bacillus stearoth ermophilus、 Aquifex aeolicusに由来することカナ¾しく、 Bacillus stearother mophilus, Aquifex aeolicusに由来することがより好ましい。本発明で用いられるブランチングェンザィムは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いブランチングェンザィムは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。

[0183] 本発明で用いられ得るブランチングェンザィムは、上記のような自然界に存在する、ブランチングェンザィムを産生する微生物、動物、および植物から直接単離され得る。

[0184] 本発明で用いられ得るブランチングェンザィムは、これらの微生物、動物、および植物から単離したブランチングェンザィムをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物 (例えば、細菌、真菌など)から単離してもよい。

[0185] ブランチングェンザィムは、上記の 13 -1, 4ーグルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。

[0186] 遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記の β—1 , 4 ダルカンホスホリラーゼと同様に、ブランチングェンザィムの発現の容易さ、培養の容易さ

、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。ブランチングェンザィムは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでし力発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好まし、。ブランチングェンザィムの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好ましい。アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでし力発現しない微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生されるブランチングェンザィムは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好まし、。

[0187] 遺伝子組換えによるブランチングェンザィムの生産および精製は、上記の β— 1, 4 -グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。 [0188] 反応開始時の溶液中に含まれるブランチングェンザィムの量は、反応開始時の溶液中の j8— 1, 4ーグノレカンに対して、代表的には約 10— 100, OOOU/g β ~1, 4 グルカン、好ましくは約 100— 50, 000U/g β -1, 4—グルカン、より好ましくは約 1 , 000— 10, 000U/g β— 1, 4ーグルカンである。ブランチングェンザィムの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。

[0189] ブランチングェンザィムは、精製されて!ヽても未精製であってもよ!/ヽ。ブランチングェンザィムは、固定ィ匕されていても固定ィ匕されていなくともよい。ブランチングェンザィムは、固定ィ匕されることが好ましい。固定ィ匕の方法としては、担体結合法 (たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法)、架橋法または包括法 (格子型またはマイクロカプセル型)など、当業者に周知の方法が使用され得る。ブランチングェンザィムは、担体上に固定ィ匕されていることが好ましい。ブランチングェンザィムはまた、 j8—l, 4—グルカンホスホリラーゼおよび 4—グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定ィ匕されていてもよいし、別の担体上に固定ィ匕されていてもよい。 -1, 4ーグルカンホスホリラーゼおよび 4—グノレカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定ィ匕されていることが好ましい。

[0190] (12. 4— α—グルカノトランスフェラーゼ（EC. 2. 4. 1. 25) )

本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて、 4— a ダルカノトランスフェラーゼを用いることができる。

[0191] 本発明で用いられ得る 4— aーグルカノトランスフェラーゼは、デイスプロポーシヨネ一ティングェンザィム、 D 酵素、アミ口マルターゼ、不均化酵素などとも呼ばれ、マルトオリゴ糖の糖転移反応 (不均一化反応）を触媒し得る酵素である。 4— aーグルカノトランスフェラーゼは、供与体分子の非還元末端からダルコシル基あるいは、マルトシルもしくはマルトオリゴシルユニットを受容体分子の非還元末端に転移する酵素である。従って、酵素反応は、最初に与えられたマルトオリゴ糖の重合度の不均一化をもたらす。供与体分子と受容体分子とが同一の場合は、分子内転移が生じ、その結果、環状構造をもつ生成物が得られる。

[0192] 4— a ダルカノトランスフェラーゼは、微生物および植物に存在する。 4— a—ダルカノトランスフェラーゼを産生する微生物の例としては、 Aquifex aeolicus, Strept ococcus pneumoniae ^し lostridium Dutylicum、 Deinococcus raaioaurans 、 Haemophilus influenzae ^ Mycobacterium tuberculosis^ Thermococcus litralis、 Thermotoga maritima、 Thermotoga neapolitana、 Chlamydia p sittaci、 Pyrococcus sp.、 Dictyoglomus thermophilum、 Borrelia burgdor feri、 Synechosystis sp.、 E. coli、 Thermus aquaticusなど力 S挙げられる。 4— α—グルカノトランスフェラーゼを産生する植物の例としては、ジャガイモ、サツマィモ、ャマイモ、キヤッサバなどの芋類、トウモロコシ、イネ、コムギ、などの穀類、えんどう豆、大豆、などの豆類などが挙げられる。 4 α ダルカノトランスフェラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。

[0193] 本発明で用いられ得る 4— aーグルカノトランスフェラーゼは、ジャガイモ、 Thermus aquaticus、 Tnermococcus litralisに由来すること力 S好 3；しく、ンャ刀モ、 Ther mus aquaticusに由来することがより好ましい。本発明で用いられる 4— α—グルカノトランスフェラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高い 4- α -ダルカノトランスフェラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。

[0194] 本発明で用いられ得る 4 α ダルカノトランスフェラーゼは、上記のような自然界に存在する、 4 a ダルカノトランスフェラーゼを産生する微生物および植物から直接単離され得る。

[0195] 本発明で用いられ得る 4 α ダルカノトランスフェラーゼは、これらの微生物および植物から単離した 4 a ダルカノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物 (例えば、細菌、真菌など)力も単離してもよい。

[0196] 4— α—グルカノトランスフェラーゼは、上記の 13—1 , 4ーグルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。

[0197] 遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記の β—1 , 4 ダルカンホスホリラーゼと同様に、 4 α ダルカノトランスフェラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。 4 α ダルカノトランスフェラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好まし、ので、アミラーゼを産生しな、かまたは低レベルでし力発現しな、微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。 4— α—ダル力ノトランスフエラーゼの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用 V、ることが好まし、。アミラーゼを産生しな、かまたは低レベルでし力発現しな、微生物（例えば、細菌、真菌など）を用いて産生される 4 α ダルカノトランスフェラーゼは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。

[0198] 遺伝子組換えによる 4 α ダルカノトランスフェラーゼの生産および精製は、上記の β— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。

[0199] 反応開始時の溶液中に含まれる 4 a ダルカノトランスフェラーゼの量は、反応開始時の溶液中の j8— 1, 4ーグノレカン【こ対して、代表的【こ ίま約 0. 05- 1, OOOU/g β -1, 4—グルカン、好ましくは約 0. l-500U/g β -1, 4—グルカン、より好ましくは約 0. 5— 100U/g β -1, 4ーグルカンである。 4— α—グルカノトランスフェラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。

[0200] 4 a ダルカノトランスフェラーゼは、精製されて!、ても未精製であってもよ、。 4 a ダルカノトランスフェラーゼは、固定ィ匕されていても固定ィ匕されていなくともよい。 4 α ダルカノトランスフェラーゼは、固定ィ匕されることが好ましい。固定ィ匕の方法としては、担体結合法 (たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法)、架橋法または包括法 (格子型またはマイクロカプセル型)など、当業者に周知の方法が使用され得る。 4 α ダルカノトランスフェラーゼは、担体上に固定ィ匕されていることが好ましい。 4—α ダルカノトランスフェラーゼはまた、 13— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼおよび α— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定ィ匕されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。 β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼおよび α— 1 , 4ーグルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定ィ匕されていることが好ましい。

[0201] (13.グリコーゲンデブランチングェンザィム（EC. 2. 4. 1. 25/EC. 3. 2. 1. 33

) )

本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて、グリコーゲンデブランチングェンザィムを用いることができる _n [0202] 本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングェンザィムは、 6 ダルコシダーゼ活性と、 4 a ダルカノトランスフェラーゼ活性との 2種類の活性をもつ酵素である。グリコーゲンデブランチングェンザィムが持つ、 4 α ダルカノトランスフェラーゼ活性により、環状構造を持つ生成物が得られる。

[0203] グリコーゲンデブランチングェンザィムは、微生物および動物に存在する。グリコーゲンデブランチングェンザィムを産生する微生物の例としては、酵母などが挙げられる。グリコーゲンデブランチングェンザィムを産生する動物の例としては、ヒト、ゥサギ、ラット、ブタなどの哺乳類が挙げられる。グリコーゲンデブランチングェンザィムを産生する生物はこれらに限定されない。

[0204] 本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングェンザィムは、酵母に由来することが好ましい。本発明で用いられるグリコーゲンデブランチングェンザィムは、反応至適温度が高、ことが好ま、。反応至適温度が高、グリコーゲンデブランチングェンザィムは、例えば、タンパク質工学的手法により、中温で作用し得る酵素に改変をカロ免ることで得られる。

[0205] 本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングェンザィムは、上記のような自然界に存在する、グリコーゲンデブランチングェンザィムを産生する微生物および動物カゝら直接単離され得る。

[0206] 本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングェンザィムは、これらの微生物および動物力単離したグリコーゲンデブランチングェンザィムをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物 (例えば、細菌、真菌など)力も単離してもよい。

[0207] グリコーゲンデブランチングェンザィムは、上記の 13 -1, 4ーグルカンホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。

[0208] 遺伝子組換えに用いる微生物（例えば、細菌、真菌など）は、上記の β 1 , 4 ダルカンホスホリラーゼと同様に、グリコーゲンデブランチングェンザィムの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。グリコーゲンデブランチングェンザィムは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好まし、ので、アミラーゼを産生しな、かまたは低レベルでしか発現しなヽ微生物（例えば、細菌、真菌など）を遺伝子組換えに用いることが好ましい。グリコーゲン zザィムの遺伝子組換えのためには、大腸菌または枯草菌のような中温菌を用いることが好まし、。アミラーゼを産生しな、かまたは低レベルでし力発現しない微生物 (例えば、細菌、真菌など)を用いて産生されるグリコーゲンデブランチングェンザィムは、アミラーゼを実質的に含まないため、本発明の方法での使用に好ましい。

[0209] 遺伝子組換えによるグリコーゲンデブランチングェンザィムの生産および精製は、上記の j8— 1, 4—グルカンホスホリラーゼと同様に行われ得る。

[0210] 反応開始時の溶液中に含まれるグリコーゲンデブランチングェンザィムの量は、反応開始時の溶液中の j8— 1, 4—グルカンに対して、代表的には約 0. 01-5, OOOU /g β— 1, 4—グルカン、好ましくは約 0. 1- 1, OOOU/g β -1, 4—グルカン、より好ましくは約 1一 500UZg β— 1, 4ーグルカンである。グリコーゲンデブランチングェンザィムの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。

[0211] グリコーゲンデブランチングェンザィムは、精製されてヽても未精製であってもよヽ。グリコーゲンデブランチングェンザィムは、固定ィ匕されていても固定ィ匕されていなくともよい。グリコーゲンデブランチングェンザィムは、固定ィ匕されることが好ましい。固定ィ匕の方法としては、担体結合法 (たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法)、架橋法または包括法 (格子型またはマイクロカプセル型)など、当業者に周知の方法が使用され得る。グリコーゲンデブランチングェンザィムは、担体上に固定ィ匕されていることが好ましい。グリコーゲンデブランチングェンザィムはまた、 j8— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼおよび α— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方と同じ担体上に固定ィ匕されて、てもよ、し、別の担体上に固定ィ匕されて、てもよヽ。 j8—l, 4—グルカンホスホリラーゼおよび 4—グルカンホスホリラーゼの両方と同じ担体上に固定ィ匕されて、ることが好ま U、。

[0212] (14.溶媒）

本発明の方法に用いる溶媒は、 β— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼおよび 4— グルカンホスホリラーゼの酵素活性を損なわない溶媒であれば任意の溶媒であり得る。

[0213] なお、グルカンを生成する反応が進行し得る限り、溶媒が本発明の方法に用いる材料を完全に溶解する必要はない。例えば、酵素が固体の担体上に担持されている場合には、酵素が溶媒中に溶解する必要はない。さらに、 /3 - 1, 4ーグルカンなどの反応材料も全てが溶解してヽる必要はなぐ反応が進行し得る程度の材料の一部が溶解していればよい。

[0214] 代表的な溶媒は、水である。溶媒は、上記 j8— 1 , 4ーグルカンホスホリラーゼまたは α -1, 4ーグルカンホスホリラーゼを調製する際に |8—1, 4—グルカンホスホリラーゼまたは 4—グルカンホスホリラーゼに付随して得られる細胞破砕液のうちの水分であってもよい。

[0215] 水は、軟水、中間水および硬水のいずれであってもよい。硬水とは、硬度 20° 以上の水をいい、中間水とは、硬度 10° 以上 20° 未満の水をいい、軟水とは、硬度 10 ° 未満の水をいう。水は、好ましくは軟水または中間水であり、より好ましくは軟水でめる。

[0216] (15.他の成分）

β— 1, 4—グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース— 1—リン酸、 β— 1, 4 —グルカンホスホリラーゼおよび oi -1, 4ーグルカンホスホリラーゼを含む溶液中には、 j8 -l, 4ーグルカンホスホリラーゼと j8—l, 4—グルカンとの間の相互作用および α -1, 4ーグルカンホスホリラーゼとプライマーとの間の相互作用を妨害しない限り、任意の他の物質を含み得る。このような物質の例としては、緩衝剤、 β - 1, 4ーグルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、 α -1, 4 ダルカンホスホリラーゼを産生する微生物 (例えば、細菌、真菌など)の成分、塩類、培地成分などが挙げられる。

[0217] < α—グルカンの製造〉

本発明の α—グルカンは、 β— 1, 4—グルカン、プライマー、無機リン酸またはダルコースー 1 リン酸、 β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼ、および 4—グノレカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させる工程により製造される。

[0218] 図 2に、本願発明の製造方法において生じる反応の概略を示す。 |8— 1, 4ーグルカン (重合度 n)と無機リン酸から、 β -1, 4ーグルカンホスホリラーゼを用いて、ダルコ一スー 1 リン酸および j8—l, 4—グルカン (重合度 n— 1)が生成される。生成されたダルコース 1 リン酸（および溶液にカ卩えたグルコース 1 リン酸）は、直ちに α— 1 , 4— グルカンホスホリラーゼにより、適切なプライマー（重合度 m)に 4—結合で転移され、 α—グルカン鎖 (重合度 m+ 1)として伸長される。また、その際に生成される無機リン酸は、再度 j8— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼの反応にリサイクルされる仕組みになっている。

[0219] なお、初発の 13 -1, 4ーグルカンがセロビオースであって、 13 -1, 4ーグルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合の、本願発明の製造方法において生じる反応の概略を図 2に示す。セロビオース (重合度 2)と無機リン酸から、セロビオースホスホリラーゼを用いて、グルコースー1 リン酸およびグルコースが生成される。生成されたグルコース 1 リン酸（および溶液に加えたグルコース 1 リン酸）は、直ちに 4ーグルカンホスホリラーゼにより、適切なプライマー（重合度 m)に α— 1, 4 結合で転移され、 α—グルカン鎖 (重合度 m+ 1)が伸長される。また、その際に生成される無機リン酸は、再度 j8—l, 4—グルカンホスホリラーゼの反応にリサイクノレされる。

[0220] 本発明の製造方法にお!、ては例えば、まず、溶液を調製する。溶液は、例えば、適切な溶媒に、固体状の j8— 1, 4—グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース 1 リン酸、 β— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼ、および 4—グルカンホスホリラーゼを添加することにより調製され得る。あるいは、溶液は、 β— 1, 4-グルカン、ブライマ一、無機リン酸またはグルコース— 1—リン酸のようなリン酸源、 β— 1, 4—グルカンホスホリラーゼ、または α— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼをそれぞれ含む溶液を混合することによって調製してもよい。あるいは、溶液は、 β— 1, 4ーグルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース— 1—リン酸のようなリン酸源、 β— 1 , 4ーグルカンホスホリラーゼ、および 4—グルカンホスホリラーゼのうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。本発明の製造方法で用いられる溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、 ρΗを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。この溶液の ρΗは、酵素反応を過度に阻害しない限り、任意の pHであり得る。 pH値は、好ましくは約 6—約 8であり、より好ましくは約 6. 5—約 7. 5である。 pHは、反応に用いる酵素の至適 pHに合わせて適切に設定され得る。溶液の塩濃度もまた、酵素反応を過度に阻害しない限り、任意の塩濃度であり得る。塩濃度は、好ましくは 1. OmM— 50mMであり、より好ましくは 5mM— 30 mMである。

[0221] β— 1， 4ーグルカン力セロビオースであり、 β— 1， 4ーグノレカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼである場合、この溶液には、 α ダルカンの生成の際に生成するグルコースを溶液から除去するために、例えば、グルコースイソメラーゼまたはグルコースォキシダーゼ（およびムタロターゼ）をさらに添カ卩してもよい。さらに、溶液中にカタラーゼまたはペルォキシダーゼを添カ卩してもよい。あるいは、酵母のような、グルコースを資化することによってグルコースを溶液中から除去する微生物を添加してもよい。あるいは、グルコース特異的吸着榭脂を添加してもよい。酵素または微生物を添加する方法は、反応を連続して進行させながらグルコースを同時に除去し得るので好ましい。なお、本明細書中では、「除去する」とは、反応液中のグルコースの量を低減させることおよびグルコースを存在させなくすることを包含する。

[0222] また、この溶液には、必要に応じて枝切り酵素、ブランチングェンザィム、 4 aーグルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングェンザィムからなる群より選択される酵素を添加してもよい。これらの酵素は、 α—グルカン合成反応の開始時に添加されてもよぐ反応の途中に添加されてもよぐまた、反応が終了した後に添カロされてちょい。

[0223] 次いで、溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。溶液の温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり、添カロした酵素がその活性を示す温度である。例えば、耐熱性酵素を用い、反応温度をその耐熱酵素に最適な温度にすることによって、添加した耐熱性酵素以外の混入した酵素の活性を抑え得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれる j8—l , 4—グルカンホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方、好ましくは両方の活性の約 50%以上、より好ましくは約 80%以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は、好ましくは約 30°C 一約 70°Cの温度であり、より好ましくは約 35°C—約 60°Cである。

[0224] 反応時間は、反応温度、反応により生産されるグルカンの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約 1時間一約 100時間、より好ましくは約 1時間一約 72時間、さらにより好ましくは約 2時間一約 36時間、最も好ましくは約 2時間一約 24時間である。

[0225] 加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えたステンレス製反応タンクの中に入れられて攪拌される。

[0226] 本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、 /3 - 1, 4ーグルカン、 /3— 1 , 4ーグルカンホスホリラーゼおよび 4—グルカンホスホリラーゼのうちの少なくとも 1つを反応溶液に追加してもよい。

[0227] β— 1， 4ーグルカン力セロビオースであり、 β— 1， 4ーグノレカンホスホリラーゼが、セ口ビオースホスホリラーゼである場合、上述したように、グルコースイソメラーゼなどの酵素を添加して、 α—ダルカンの生産と同時に副生するグルコースを除去する工程を、生産工程と同時に行うことが好ましい。他方、グルコースを除去する工程は、 α—グルカン生産工程とタイミングをずらして行ってもよい。例えば、本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、反応によって生成されたグルコースを除去するために、溶液をクロマト分画、膜分画法などの物理的グルコース除去方法で処理し、その後再度、反応を進行させてもよい。物理的グルコース除去方法は、 1回実施されても、 2回以上実施されてもよい。 2回以上実施する場合、例えば、反応を 2時間進行させた後、グルコース除去を行い、次いで再度反応を 2時間進行させた後、グルコース除去を行い、次いで再度反応を 2時間行うこととし得る。

[0228] このようにして、 α—グルカンを含有する溶液が生産される。

[0229] 反応終了後、溶液は、必要に応じて例えば、 100°Cにて 10分間加熱することによつて溶液中の酵素を失活させ得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。溶液は、そのまま保存されてもよいし、生産されたグルカンを単離するために処理されてもょ、。

[0230] <精製方法 > 生産された α—グルカンは、必要に応じて精製され得る。精製することにより除去される不純物の例は、グルコースである。 α ダルカンの精製法の例としては、有機溶媒を用いる方法（T. J. Schochら、 J. American Chemical Society, 64, 2957 ( 1942) )および有機溶媒を用、な、方法がある。

[0231] 有機溶媒を用いる精製に使用され得る有機溶媒の例としては、アセトン、 n—ァミルァノレコーノレ、ペンタゾーノレ、 n—プロピノレアノレコーノレ、 n—へキシノレアノレコーノレ、 2—ェチノレー 1ーブタノ一ノレ、 2—ェチノレー 1一へキサノーノレ、ラウリノレアノレコーノレ、シクロへキサノール、 n ブチルアルコール、 3 ペンタノール、 4ーメチルー 2 ペンタノール、 d, 1 ボルネオール、 α テルピネオール、イソブチルアルコール、 sec ブチルアルコール、 2—メチルー 1ーブタノール、イソアミルアルコール、 tert—ァミルアルコール、メントール、メタノール、エタノールおよびエーテルが挙げられる。

[0232] 有機溶媒を用いない精製方法の例を、以下に示す。

[0233] ( 1) aーグルカン生産反応後、反応溶液を冷却することにより exーグルカンを沈澱させ、そして沈澱した α—グルカンを、膜分画、濾過、遠心分離などの一般的な固液分離方法により精製する方法；

(2) aーグルカン生産反応の間もしくは aーグルカン生産反応後に反応溶液を冷却して α—グルカンをゲル化し、ゲル化した α—グルカンを回収し、そしてゲル化した α ーグルカンから、グルコースを、水による洗浄、凍結融解、ろ過などの操作によって除去する方法;ならびに

(3) α—グルカン生産反応後、水に溶解している α—グルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供してグルコースを除去する方法。

[0234] 精製に使用され得る限外濾過膜の例としては、分画分子量約 1, 000—約 100, 0

00、好まし <は約 5, 000—約 50, 000、より好まし <は約 10, 000—約 30, 000の限外濾過膜 (ダイセル製 UF膜ユニット）が挙げられる。

[0235] クロマトグラフィーに使用され得る担体の例としては、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体、配位子交換クロマトグラフィー用担体、イオン交換クロマトグラフィー用担体および疎水クロマトグラフィー用担体が挙げられる。実施例 1

[0236] 以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。本発明は以下の実施例のみに限定されない。

[0237] (1.測定方法および計算方法）

本発明における各種酵素の活性および得られる α—グルカンの収率を、以下の測定方法によって測定した。

[0238] (1. 1 セロビオースホスホリラーゼの活性測定法）

30 μ 1の 40mMセロビオース水溶液と 30 μ 1の 40mMリン酸ナトリウム水溶液（ρΗ7 . 5)とを混合し、さらに適切に希釈した酵素液 (試料) 60 1を加えて 120 1の混合物として反応を開始させる。この混合物を 37°Cで 10分間インキュベートすることにより反応を進行させた後、 100°Cで 10分間保持することによって酵素を失活させる。続 V、て 780 μ 1の 1M Tris—塩酸緩衝液 (pH7. 0)および 120 μ 1の発色試薬（ダルコース AR— II発色試薬（和光純薬社製） )をこの混合液に添カ卩して混合し、 505nmでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース水溶液を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース量を求める。セロビオースホスホリラーゼ 1単位とは、上記方法により 2 OmMセロビオースから 1分間に 1 μ molのグルコースを生成する酵素量と定義する。

[0239] (1. 2 α -1, 4ーグルカンホスホリラーゼの活性測定法）

50 μ 1の 4%クラスターデキストリン水溶液と 50 μ 1の 50mMグルコース— 1—リン酸ナトリウム水溶液とを混合し、さらに適切に希釈した酵素液 100 1を加えて 200 1の混合物として反応を開始させる。この混合物を 37°Cで 15分間インキュベートして反応を進行させた後、 800 1のモリブデン試薬（15mM モリブデン酸アンモ-ゥム、 100 mM 酢酸亜鉛）を混合し、反応を停止させる。続、て 200 μ 1の 568mMァスコルビン酸 (pH5. 0)を加えて攪拌し、反応系を得る。この反応系を、 30°Cで 20分間保持した後、分光光度計を用いて 850nmでの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。この方法により、 1分間に 1 molの無機リン酸を生成する活性を、 α -1, 4ーグルカンホスホリラーゼ 1単位とする。

[0240] (1. 3 得られる a—グルカンの収率の計算方法）

本発明の製造方法による aーグルカンの収率を、得られた aーグルカン中に取り込まれたグルコース残基のモル数力最初に添加された初発セロビオースのモル数の何％にあたるかによって計算した。反応終了後の溶液にエタノールを終濃度 50%になるよう加えて a—グルカンを沈殿させて上清を捨て、更に適量の 50%エタノールで a—グルカンを 2度洗浄した後、乾燥し、適量の水に溶解後、フエノールー硫酸法によりグルコース濃度を測定することにより、 _a—ダルカンの収量 (モル数)を計算した。この収量（モル数）をセロビオースのモル数で除算して 100倍することにより、収率を計算した。この計算式を次式に示す。

[0241] [数 2]

( ーグルカン収率 (%))

二（ーグルカン (mM グルコース当量》 ÷ (初発セロビオース (mM)) x 100

(1. 4 a—ダルカンの重量平均分子量の測定法）

本発明で合成した a—グルカンを 1N水酸ィ匕ナトリウムで完全に溶解し、適当量の塩酸で中和した後、 a—グルカン約 300 /z g分を、示差屈折計および多角度光散乱検出器を併用したゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより平均分子量を求めた

[0242] 詳しくは、カラムとして Shodex SB806M— HQ (昭和電工製）を用い、検出器としては多角度光散乱検出器 (DAWN— DSP、 Wyatt Technology社製)および示差屈折計 (Shodex RI— 71、昭和電工製)をこの順序で連結して用いた。カラムを 40 °Cに保ち、溶離液としては 0. 1M硝酸ナトリウム溶液を流速 lmLZ分で用いた。得られたシグナルを、データ解析ソフトウェア（商品名 ASTRA、 Wyatt Technology社製)を用いて収集し、同ソフトを用いて解析することにより、重量平均分子量を求めた

[0243] (2.酵素の調製）

本発明の実施例で用いた各種酵素を、以下の方法によって調製した。

[0244] (2. 1 組換えセロビオースホスホリラーゼの調製方法） Clostridium thermocellumの染色体遺伝子を抽出し、これをテンプレートとした。以下の 2種の合成 DN Aプライマー：

合成 _UNAプフマ¹ ~~ 1： 5 aaactctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacca tggagttcggtttttttgatgat 3，（配列番号 1)および

合成 DN Aプライマー 2 : 5， aaactcgagaattacttcaactttgtgagtcttt 3，（配歹 IJ番号 2)

を用い、

98°Cで 1分間、 55°Cで 1分間、 68°Cで 3分間の順で 30サイクル加熱

の条件下で PCRを行うことにより、 CBP遺伝子を含む領域を増幅させた。増幅した遺伝子を選択マーカー遺伝子 Km¹とともに発現ベクター pET28a (STRATAGENE 社製）に組み込み、プラスミド pET28a— CBP1を得た。このプラスミドでは、セロピオースホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル一 β -D-チォガラタトピラノシド (IPTG)誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。

[0245] このプラスミドを、大月昜菌 BL21 (DE3) pLysS (STRATAGENE社製）に、コンビテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含む LB培地（1 %トリプトン (Difco社製）、 0. 5%酵母エキス (Dif co社製）、 1%塩ィ匕ナトリウム、 1. 5 %寒天））を含むプレートにプレーティングして、 37°Cでー晚培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、 Clostridium thermocellum由来セロビオースホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。

[0246] 得られた大腸菌がセロビオースホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がセロビオースホスホリラーゼを発現してヽることを、活性測定によって確認した。

[0247] この大腸菌を、抗生物質カナマイシンを含む LB培地（1%トリプトン、 0. 5%酵母ェキス（ともに Dif co社製）、 1%塩ィ匕ナトリウム） 1リットルに接種し、 120rpmで振盪させながら 37°Cで 3時間振盪培養した。その後、 IPTGを 1. OmMになるようにこの培地に添カ卩し、 37°Cでさらに 8時間振盪培養した。次いで、この培養液を 5, OOOrpmにて 5分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、 50mlの 1. 4m Mの 2—メルカプトエタノールを含む 50mMリン酸緩衝液（pH7. 5)中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液 50mlを得た。この破砕液中には、 132U/ mlのセロビオースホスホリラーゼが含まれて!/ヽた。

[0248] この菌体破砕液を、 55°Cで 20分間加熱した。加熱後、 8, 500rpmにて 20分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去して上清を得た。得られた上清を、あらかじめ平衡化してぉ、た His— Tag吸着榭脂 Ni— NTA agarose (QIAGEN社製）に流してセロビオースホスホリラーゼをこの樹脂に吸着させた。この榭脂を、 300mM塩化ナトリウムと 20mMイミダゾールおよび 1. 4mM2—メルカプトエタノール含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、タンパク質を 300mM塩ィ匕ナトリウムと 150 mMイミダゾールおよび 1. 4mM 2—メルカプトエタノールを含む緩衝液で溶出させ、組換えセロビオースホスホリラーゼ酵素溶液とした。

[0249] (2. 2 組換え馬鈴薯 α— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼの調製方法）

馬鈴薯 α— 1, 4—グルカンホスホリラーゼ遺伝子（Nakanoら、 Journal of Bioche mistry (Tokyo) 106 (1989) 691)を選択マーカー遺伝子 Amp¹"とともに発現べクタ一 pET3d (STRATAGENE社製）に組み込み、プラスミド pET— PGP113を得た。このプラスミドでは、グルカンホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル- 18— D-チォガラタトビラノシド (IPTG)誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。このブラスミドを、大月昜菌 BL21 (DE3) (STRATAGENE社製）に、コンビテントセノレ法により導入した。この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含む LB培地（1%トリプトン (Difco 社製）、 0. 5%酵母エキス (Difco社製）、 1%塩ィ匕ナトリウム、 1. 5%寒天)）を含むプレートにプレーティングして、 37°Cでー晚培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、馬鈴薯由来 α— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。得られた大腸菌がグルカンホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌力 1, 4—グルカンホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。

[0250] この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含む LB培地（1%トリプトン (Difco社製）、 0 . 5%酵母エキス (Difco社製）、 1%塩ィ匕ナトリウム） 1リットルに接種し、 120rpmで振盪させながら 37°Cで 3時間振盪培養した。その後、 IPTGを 0. lmM、ピリドキシンを ImMになるようにそれぞれこの培地に添カ卩し、 22°Cでさらに 20時間振盪培養した。次いで、この培養液を 5, OOOrpmにて 5分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、 50mlの 0. 05%の TritonX— 100を含む 20mM Tris—塩酸緩衝液 (PH7. 0)中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液 50mlを得た。この破砕液中には、 4. 7U/mgのグルカンホスホリラーゼが含まれていた。

[0251] この菌体破砕液を、 55°Cで 30分間加熱した。加熱後、 8, 500rpmにて 20分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去して上清を得た。得られた上清 (タンパク質 125mgを含む）を、平衡化緩衝液（20mMリン酸緩衝液 pH7. 0)を用いてあらかじめ平衡ィ匕しておいた陰イオン交換榭脂 Q— Sepharoseに流してグルカンホスホリラ一ゼを榭脂に吸着させた。榭脂を、 200mM塩ィ匕ナトリウムを含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、タンパク質を 300mM塩ィ匕ナトリウムを含む緩衝液で溶出させ、組換えグルカンホスホリラーゼ酵素溶液とした。

[0252] (実施例 1—1一 1—6：種々のプライマー濃度でのアミロース合成）

以下の表 1に示す糸且成 (反応開始時)の反応混合物を用いて、 45°Cで 16時間にわたってインキュベートすることによってアミロース合成を行った。

[0253] [表 1]

表 1

* G4 :マルトテトラオ一ス

2 リン酸は、リン酸二水素カリウム一リン酸水素ニナトリウム緩衝液として添加した。リン酸緩衝液の pHは 7.0である。

反応後、合成されたアミロースの重量平均分子量を上記 1. 4に従って決定した。結果を表 1に示す。

[0254] この結果、セロビオースに、リン酸の存在下でセロビオースホスホリラーゼ（CBP)を作用させてグルコース 1 リン酸およびグルコースを生じる反応と、グルコース 1ーリン酸に、プライマー存在下でグルカンホスホリラーゼ (GP)を作用させてプライマーにグルコース残基を転移させる反応とを同一の溶液中で行うことにより、アミロースを製造することができた。また、反応液のプライマー濃度を変化させることで、合成されるアミロースの重合度を自在にコントロールできる、すなわち、高分子量のアミロースを合成したい場合、少ない量のプライマーを用いればよぐ低分子量のアミロースを合成した!/、場合、多量のプライマーを用いればよ!、ことが確認された。

[0255] (実施例 2— 1 2— 5 :種々のセロビオースホスホリラーゼ濃度でのアミロース合成）以下の表 2に示す糸且成 (反応開始時)の反応混合物を用いて、 45°Cで 16時間にわたってインキュベートすることによってアミロース合成を行った。

[0256] [表 2]

表

G4 :マルトテトラオース

* ² リン酸は、リン酸二水素カリウム一リン酸水素ニナ Wゥム緩衝液として添加した。リン酸緩衝液の pHは 7.0である。

反応後、合成されたアミロースの重量平均分子量および収率を上記 1. 3および 1. 4に従って決定した。結果を表 2および図 3に示す。

[0257] この結果、 6. 60U/gセロビオースまでは、セロビオースホスホリラーゼの量を増やすほど、アミロースの収率が高くなる力 6. 60UZgセロビオースを超えると、セロビオースホスホリラーゼの量を増やしても、得られるアミロースの収率はそれほど増えないことがわかった。それゆえ、 6. 60UZgセロビオースのセロビオースホスホリラーゼ濃度が好適な濃度であることがわ力つた。また、アミロース合成反応収率は最大で 33 . 8%であるので、これらの結果から、工業レベルでのアミロース生産が可能であることが確認された。 [0258] (実施例 3— 1 3— 5 :種々のリン酸濃度でのアミロース合成）

以下の表 3に示す糸且成 (反応開始時)の反応混合物を用いて、 45°Cで 16時間にわたってインキュベートすることによってアミロース合成を行った。

[0259] [表 3]

表 3

* ¹ G4 :マルトテトラオース

* ² リン酸は、リン酸二水素カリウム一リン酸水素ニナトリウム緩衝液として添加した。リン酸緩衝液の pHは 7.0である。

反応後、合成されたアミロースの重量平均分子量および収率を上記 1. 3および 1. 4に従って決定した。結果を表 3および図 4に示す。

[0260] この結果、リン酸濃度が 15mM— 30mMのときにアミロースの収率が最も高いが、 5mM— 45mMの範囲では、アミロースの収率はそれほど大きく変わらないため、 5m M— 45mMの範囲で効率的なアミロース合成を行えることがわかった。

[0261] (実施例 4 1 4 3：種々のセロビオース濃度でのアミロース合成）

以下の表 4に示す糸且成 (反応開始時)の反応混合物を用いて、 45°Cで 16時間にわたってインキュベートすることによってアミロース合成を行った。

[0262] [表 4] 表 4

* ¹ G4：マルトテトラオース

* ² リン酸は、リン酸二水素カリウム一リン酸水素ニナトリウム緩衝液として添加した。リン酸緩衝液の ρ Ηは 7. 0である。

反応後、合成されたアミロースの重量平均分子量および収率を上記 1. 3および 1.

4に従って決定した。結果を表 4および図 5に示す。

[0263] この結果、セロビオースとプライマーとリン酸との濃度比を変化させずにセロビオースの濃度を上昇させた場合、セロビオースの濃度の上昇によるアミロース合成の阻害は生じな力た。そのため、アミロースを大量に合成するために、セロビオースの濃度を上昇させることができることがわ力つた。

[0264] (実施例 5—1— 5— 4：グルコースイソメラーゼ、またはグルコースォキシダーゼ、ムタロターゼおよびペルォキシダーゼを用いたアミロース合成）

以下の表 5に示す糸且成 (反応開始時)の反応混合物を用いて、 45°Cで 16時間にわたってインキュベートすることによってアミロース合成を行った。

[0265] [表 5]

表 5

*¹ G4:マル卜テトラオース

*² リン酸は、リン酸二水素カリウム一リン酸水素ニナトリウム緩衝液として添加した。リン酸緩衝液の pHは 7.0である _c

反応後、合成されたアミロースの重量平均分子量および収率を上記 1. 3および 1. 4に従って決定した。結果を表 5および図 6に示す。

[0266] この結果、反応系にグルコースイソメラーゼ（GI)またはグルコースォキシダーゼ（G Ox) +ムタロターゼ（MT) +ペルォキシダーゼ（POx)を添カ卩することによって、アミロースの収率が飛躍的に向上することがわかった。特に、グルコースォキシダーゼ（G Ox) +ムタロターゼ（MT) +ペルォキシダーゼ（POx)を添カ卩した場合には、アミロースの収率は 64. 8%と、これらの酵素を添カ卩しない場合（32. 8%)の約 2倍であった。

[0267] この収率の向上は、セロビオースの加リン酸分解で生じるグルコースが CBPおよび GPの反応を阻害するため、 GIまたは GOxにより反応液中のダルコースを分解してその相対濃度を下げることにより、 CBPおよび GPに対する反応阻害の問題を回避できたためであると考えられる。

[0268] (実施例 6 : α -1, 6分岐を含むダルカンの合成）

セロビオース 0. 3g、プライマー（G4) 0. 75マイクロモルを、 30mMリン酸緩衝液（p H7. 0) 10mlに溶解させ、ここに上記の 2. 1の調製方法に従って得られた組換えセロビオースホスホリラーゼ 1. 98U、上記の 2. 2の調製方法に従って得られた組換え馬鈴薯 α— 1, 4—グルカンホスホリラーゼ 15U、さらに特開 2000— 316581号の実施例 1に記載の方法に従って調製した Aquif ex aeolicus由来ブランチングェンザィム 1, 500Uを加えて反応液を調製し、この反応液を 45°Cで 16時間インキュベートした。インキュベート終了後、反応液に等量の 100%エタノールをカ卩えてグルカンを沈澱させた。遠心分離を行い、沈澱を回収し、この沈澱を凍結乾燥することによって、分岐構造を有するグルカン 0. 048gを得た (収率約 32%)。

[0269] (実施例 6で得られたグルカンの分析）

実施例 6で合成されたグルカンが分岐構造を有するか否か、および合成されたダルカンの平均単位鎖長を、 H. Takataら、 Carbohydr. Res. , 295, 91—101 (1996 )に記載の方法に従って決定した。その結果、合成されたグルカンが分岐構造を有することおよび平均単位鎖長が 11であることが確認された。このように、反応液中に CBPおよび GPに加えてブランチングェンザィムをさらに含むことにより、セロビオースから、分岐構造を有するグルカンを合成し得ることがゎカゝつた。 [0270] (実施例 7：環状構造を有するグルカンの合成）

セロビオース 0. 3g、プライマー（G4) 0. 75マイクロモルを、 30mMリン酸緩衝液（p H7. 0) 10mlに溶解させ、ここに上記の 2. 1の調製方法に従って得られた組換えセロビオースホスホリラーゼ 1. 98U、上記の 2. 2の調製方法に従って得られた組換え馬鈴薯 α— 1, 4—グルカンホスホリラーゼ 15U、さらに Thermus aquaticus由来 4— a ダルカノトランスフェラーゼ 1. 5Uをカ卩えて反応液を調製し、この反応液を 45°Cで 16時間インキュベートした。なお、 Thermus aquaticus由来 4— a—グルカノトランスフエラーゼとしては、 Thermus aquaticus由来 4— —グルカノトランスフェラーゼの唯一公知の DNA配列を使用して、上記 2. 2の α— 1, 4ーグルカンホスホリラーゼと同様の方法で調製したものを使用した。

[0271] インキュベート終了後、反応液に等量の 100%エタノールをカ卩えてグルカンを沈澱させた。遠心分離を行い、沈澱を回収し、この沈澱を凍結乾燥することによって、環状構造を有するグルカン (環状グルカン)と直鎖状ダルカン (アミロース）との混合物を 0. 05g得た (収率約 33%)。

[0272] (実施例 7で得られたグルカンの分析）

4 α ダルカノトランスフェラーゼがアミロースに作用すると、アミロースから完全に環状のグルカンが切り出されて合成され、そしてその環状グルカンの鎖長分短くなつたアミロースが残る。そこで、合成された環状グルカンの量を、 T. Takaha, M. Yan ase, H. Takata, S. Okada and S. M. Smith : J. Biol. Chem. , 271, 2902— 2908 (1996)に記載の方法に従って測定した。この方法では、溶液中のアミロースをグルコース単位に分解し、残存する環状ダルカンの量が測定される。この測定の結果、環状ダルカンが形成されたことが確認された。また、測定された環状ダルカンの量を出発原料のセロビオースの量と比較し、環状ダルカンの収率を算出したところ、 9 . 6%であった。従って、実施例 7で得られたグルカンのうちの約 29%が環状グルカンであり、残りの約 71%が直鎖状のアミロースであることがわかった。このように、反応液中に CBPおよび GPに加えて 4 aーグルカノトランスフェラーゼをさらに含むことにより、セロビオースから、環状構造を有するグルカンを合成し得ることがゎカゝつた。

[0273] (参考例 1：スクロースホスホリラーゼの平衡収率）スクロースホスホリラーゼ（SP)の平衡収率を調べるために、 G— 1 Pを出発原料にした場合の平衡収率を求めた。

[0274] まず、

終濃度 50mMの G— 1 P；

終濃度 50UZmlの酵素（SP)；

終濃度 50mMのァクセプター（フルクトース）；および

終濃度 50mMの Tris— HCl (pH7. 0)

を混合し、 45°Cで 6時間または 16時間インキュベート後、遊離したリン濃度をモリブデン法により測定した。得られたリン濃度から、この酵素についての平衡収率を次式に従って求めた：

平衡収率 (％) =リン濃度 (mM) /50 X 100。

[0275] 結果を以下の表 6に示す：

[0276] [表 6]

表 6

(参考例 2：リン酸の存在下で 2つのホスホリラーゼをカップリングさせた場合の生産物の収率）

以下の 2つの場合の反応収率を求めた：

(2-1)セロビオースからのスクロース生産（CBP + SP+Fru)；

(2—2) GOx+MT+POx共存下での、セロビオースからのスクロース生産（CBP + SP+Fru+GOx+MT+POx)。

[0277] まず、終濃度 50mMの出発原料（セロビオース）、終濃度 10、 30または lOOmMのリン酸緩衝液 (PH7. 0)、および終濃度 50U/mlのそれぞれの酵素を混合し、 45°C で 16時間反応させた。反応終了後、反応液をインベルターゼで分解し、遊離するグルコース濃度を測定することでスクロース濃度を求めた。これらの 2つの反応系のいずれにおいてもスクロースが生産物である。得られたスクロース濃度から、それぞれの反応系につ、ての平衡収率を次式に従って求めた：

平衡収率（％) =スクロース濃度（mM) Z50 (mM) X 100。

[0278] 結果を以下の表 7に示す：

[0279] [表 7]

" リン酸は、リン酸二水素カリウム一リン酸水素ニナ Wゥム緩衝液として添加した。リン酸緩衝液の pHは 7.0である。

この結果、セロビオースからスクロースを合成する反応の収率は、リン酸濃度を変えても、きわめて低かった。また、グルコースォキシダーゼ、ムタロターゼおよびペルォキシダーゼを用いて反応系力グルコースを消去することによってスクロースの収率アップを図ったが、ほとんど収率は上がらなかった。

産業上の利用可能性

[0280] 本発明の方法により、非消化性の β 1, 4ーグルカン (特に、セルロースおよびその部分分解物）を可食性の食品へと変換できる。本発明の方法により、地球上に大量に存在するバイオマスである j8—l , 4—グルカンを、安価で効率的に 4—ダルカンに変換することができるので、食糧危機問題、ゴミ問題の解決にも大きく貢献する。

[0281] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきた力本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

Claims

請求の範囲

[I] j8 -1, 4ーグルカンから aーグルカンを製造する方法であって、

β— 1, 4—グルカンと、プライマーと、リン酸源と、 β— 1, 4—グルカンホスホリラーゼと

、 α -1, 4ーグルカンホスホリラーゼを含む溶液を反応させて、 α—グルカンを生産する工程を包含する、方法。

[2] 前記 13 -1, 4ーグルカン力セロビオースであり、前記 13 -1, 4ーグルカンホスホリラーゼ力セロビオースホスホリラーゼである、請求項 1に記載の方法。

[3] 前記 /3 1, 4ーグルカン力重合度 3以上のセロオリゴ糖であり、前記 /3 1, 4 ダルカンホスホリラーゼが、セロデキストリンホスホリラーゼである、請求項 1に記載の方法

[4] 前記 /3 -1, 4ーグルカン力重合度 3以上のセロオリゴ糖であり、前記 /3 -1, 4 ダルカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼである、請求項 1に記載の方法。

[5] 前記生産工程において、前記 α ダルカンの生産と同時に副生するグルコースを、前記溶液から除去する工程をさらに包含する、請求項 1に記載の方法。

[6] 前記溶液が、グルコースイソメラーゼまたはグルコースォキシダーゼをさらに含む、請求項 5に記載の方法。

[7] 前記溶液が、グルコースォキシダーゼおよびムタロターゼをさらに含む、請求項 5に記載の方法。

[8] 前記溶液が、カタラーゼまたはペルォキシダーゼをさらに含む、請求項 7に記載の方法。

[9] 前記リン酸源が、無機リン酸、グルコース 1 リン酸、または無機リン酸とグルコース

1 リン酸との混合物である、請求項 1に記載の方法。

[10] 前記リン酸源の濃度が、 ImM— 50mMである、請求項 1に記載の方法。

[II] 前記 α—グルカン力アミロースである、請求項 1に記載の方法。