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WO2005054511A1 - 遺伝子破壊株を用いた化学物質検定方法 - Google Patents

遺伝子破壊株を用いた化学物質検定方法 Download PDF

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WO2005054511A1
WO2005054511A1 PCT/JP2004/017779 JP2004017779W WO2005054511A1 WO 2005054511 A1 WO2005054511 A1 WO 2005054511A1 JP 2004017779 W JP2004017779 W JP 2004017779W WO 2005054511 A1 WO2005054511 A1 WO 2005054511A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
disrupted
chloride
transport
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2004/017779
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Junko Takahashi
Chiaki Kato
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daikin Industries Ltd
Original Assignee
Daikin Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daikin Industries Ltd filed Critical Daikin Industries Ltd
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Priority to DE602004027157T priority patent/DE602004027157D1/de
Priority to US10/581,085 priority patent/US8173387B2/en
Priority to EP04819823A priority patent/EP1693465B1/en
Priority to AT04819823T priority patent/ATE467687T1/de
Publication of WO2005054511A1 publication Critical patent/WO2005054511A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics

Definitions

  • the present invention relates to a method for assaying a chemical substance present in a sample in the environment.
  • Patent Documents 1 and 2 There is an Atsushi system that utilizes the toxic response of yeast cells to detect chemicals present in the environment.
  • Patent document l WO 03/018792
  • Patent Document 2 JP-A-2003-061676
  • the present inventors have developed a bioassay method that accumulates genetic information induced by a chemical substance and uses the toxic response of yeast cells as described in Patent Documents 1 and 2 described above. Have been considering.
  • the sensitivity of a bioassay to detect a chemical depends on the sensitivity of the cell or organism to the chemical as an indicator. Therefore, in order to construct a system with higher sensitivity in the bioassay method using the toxic response of yeast cells, it is necessary to use more sensitive yeast cells.
  • An object of the present invention is to provide a more sensitive bioassay method utilizing a toxic response of a microorganism.
  • the present invention provides:
  • a method for testing whether or not a chemical substance is present in a test sample comprising culturing a gene-disrupted strain of a microorganism in the presence of the test sample and disrupting the gene for the chemical substance
  • a method wherein the cellular response of the gene-disrupted strain to a chemical is cell viability and alteration of Z or proliferative capacity, respiratory volume, enzyme activity and Z or gene expression, and more preferably,
  • a method in which the change in gene expression is a change in RNA amount or mRNA amount, more preferably a method in which the change in gene expression is measured by a reporter 'Gene'
  • Metabolism (01) of amino acid metabolism (01.01), nitrogen and sulfur metabolism (01.02), nucleotide metabolism (01.03), phosphate metabolism (01.04), metabolism of carbohydrates and carbohydrates (01.05), lipids, fatty acids and Metabolism of isopropanoid metabolism (01.06), metabolism of vitamins, cofactors and prosthetic groups (01.07);
  • Protein targeting (06), protein targeting, translocation (06.04), protein modification (06.07), assembly of protein complexes (06.10), proteolytic breakdown (06.13);
  • Intracellular transport and transport mechanism (08) Nuclear transport (08.01), vesicle transport (Golgi network etc.) (
  • vacuolar transport 8.13
  • cell import 8.19
  • cytoskeletal transport 8.22
  • other intracellular transport activities 8.99
  • Transport enhancer (67) ion transporter (67.04), vitamin / cofactor transporter (67.21), transport mechanism (67.50), other transport enhancer (67.99);
  • the disrupted gene is involved in vacuoles, for example, in the case of yeast, specifically, YPR036W, YDR027C, YHR026W, YHR039C-A, YKL080W, YLR447C, YGR105W, YKL119C, YHR060W (where YHR039C-A is sometimes referred to as YHR039C-B),
  • the method wherein the genes to be disrupted are:
  • microorganism is a microorganism other than yeast and the disrupted gene is a gene corresponding to the gene defined in (2).
  • kits wherein the cellular response to the chemical is viability of the cell, and changes in Z or proliferative capacity, respiratory volume, enzyme activity and Z or gene expression, more preferably,
  • a kit in which the change in gene expression is a change in the amount of RNA or mRNA, more preferably a kit for measuring the change in gene expression using a reporter 'Gene'
  • the microorganism is yeast, and the disrupted gene is the kit defined in (4) above, and the disrupted gene is a microorganism other than yeast, and the disrupted gene is defined in (2) above.
  • the kit according to (4) above which is a gene corresponding to the specified gene;
  • composition wherein the cellular response to the chemical is viability of the cell and a change in Z or proliferative capacity, respiratory volume, enzyme activity and Z or gene expression, more preferably,
  • a composition wherein the change in gene expression is a change in the amount of RNA or the amount of mRNA, more preferably a composition in which the change in gene expression is measured by a reporter 'Gene'
  • the microorganism is yeast, and the gene to be disrupted is the composition of (6) above, and the microorganism to be disrupted is a microorganism other than yeast as defined in (2) above.
  • the cellular response to the chemical is a change in cell viability and death and Z or proliferative capacity, respiratory volume, enzyme activity and Z or gene expression, more preferably
  • the change in gene expression is a change in RNA amount or mRNA amount, more preferably use in which the change in gene expression is measured by a reporter gene's assay.
  • the microorganism is yeast, and the disrupted gene is defined in (2) above, the use of (8) above, and the microorganism is a yeast other than yeast, and the disrupted gene is defined in (2) above.
  • the present invention is a highly sensitive Atsey system that can suitably detect a chemical substance even when only a low concentration of the chemical substance is present in the test sample. Since the Atsey system of the present invention has high sensitivity, it is not necessary or necessary to concentrate the test sample, so that even if the target chemical is volatile, the chemical can be suitably detected. .
  • FIG. 1 is a graph showing sensitivity to sodium meta arsenite in a gene-disrupted strain DEL011 transformed with a plasmid P-YPL171C.
  • FIG. 2 is a graph showing sensitivity to sodium meta arsenite in gene disrupted strains DEL011, DEL014, and DELO16 transformed with plasmid p-YBR072W.
  • FIG. 3 is a graph showing susceptibility to cadmium chloride in gene-disrupted strains DEL002, DEL011, DELO16, DEL019 and DEL025 transformed with plasmid p-YBR072W.
  • FIG. 4 is a graph showing the susceptibility of the gene-disrupted strains DELOOO, DEL019, DEL022 and DEL025 to the bencho curve transformed with the plasmid p-YBR072W.
  • FIG. 5 is a graph showing the susceptibility of the gene-disrupted strains DEL011, DELO 16 and DEL025 transformed with plasmid p-YPL171C to mercuric chloride.
  • FIG. 8 Gene-disrupted strains DEL007 and DE L022 transformed with plasmid P-YPL171C were 1Z1000 of non-disrupted strains of DEL006, DEL0018 and DEL019 at a concentration of 1ZlO, and DEL001 and DEL0020 were at a concentration of 1Z3.
  • 3 is a graph showing the sensitivity to thiuram in FIG. All the gene-disrupted strains are homozygous diploids.
  • FIG. 9 is a graph showing the sensitivity of a homozygous diploid and a heterozygous diploid of a gene-disrupted strain DEL006 transformed with a plasmid p-YPL171C to thiuram at a concentration of 1Z10 of a non-gene-disrupted strain.
  • FIG. 10 Sensitivity to benchocarb at the concentration of 1/10 that of the non-gene-disrupted strains of DEL006, EL007 and DEL022, and DEL012, DEL013 and DEL020 of 1Z3 at the gene-disrupted strains transformed with plasmid p-YBR072W A graph showing. All the gene-disrupted strains are homozygous diploids.
  • FIG. 11 Homozygous diploid of gene disrupted strain DEL0022 transformed with plasmid p-YBR072W is 1Z10 concentration of non-disrupted strain, and heterozygous diploid of gene disrupted strain DEL0022 is non-disrupted.
  • FIG. 4 is a graph showing the sensitivity of a strain to a bencho curve at a 1Z3 concentration.
  • yeast gene As an example.
  • Yeast Deletion Homozygous Diploid (YKO Plate sets: Yeast Deletion Homozygous Diploid complete set, ResGen, Invitrogen) used as a yeast gene-disrupted strain 84 strains showing good sensitivity to chemicals from 4800 gene-disrupted strains (Example 1).
  • the disrupted genes of these 84 strains were classified according to the classification of a public database: MIPS (Munich Information Center for Protein Sequences).
  • MIPS Unich Information Center for Protein Sequences
  • yeast genes are classified as shown in the following table.
  • Tricarboxylic acid pathway (culinic acid cycle, t- crepes cycle, TCA cycle)
  • Unclassified proteins 84 selected strains showing good sensitivity to chemicals were classified according to the above public database: MIPS classification.
  • Delta 3-cis-delta 2-trans-o-no-Co A isomerase delta3-ci
  • TFIIF subunit transcription screening factor
  • 30 kD TFIIF subunit
  • U5 snRNA-related protein U5 snRN
  • CTD Carboxyl-terminal domain
  • CTD 4 terminal domain
  • RNA 3'-end forming protein Transcription RNA 3'-end forming protein: RNA 3 ⁇
  • Iron-regulated transcription factor iron-regulat
  • Late stimulator components component, destine
  • Heavy chain of clathrin clathrin hea est ination
  • DEL020 YKL119C protein H +-ATPase assembly prote in
  • Inner membrane transport protein Putative
  • KD Subunit H +-ATPase VIo domain 54 KD subunit ; vacuolar o O VP51-54 composite subunit, protein selection in late Golgi apparatus in yeast
  • Kinesin-related tank kinesin-related tank
  • Metal binding activator metal bindi Kakugaku poison DEL027 YMR021C 11.01
  • Iron-regulated transcription repressor iron-regu
  • Escherichia coli undecrypted gene Similar to: simila
  • Transport promotion-Ion transporter-I (67.04) 4
  • Transport promotion single-wheel transport mechanism (67.50) 4
  • Unclassified protein (99) 4 When the same gene has overlapping functions, it was counted in duplicate. In particular, intracellular transport and transport mechanisms-vacuolar transport (08.13), intracellular environmental regulation Z interaction-ionic homeostasis (13.01), transport-promoting-one ion transporter (67.04), transport-promoting-transport regulation (67.50) Had many duplications.
  • intracellular transport and transport mechanisms-vacuolar transport 8.13
  • intracellular environmental regulation Z interaction-ionic homeostasis 13.01
  • transport promoting one ion transporter 67.04
  • transport promoting-transport mechanism 67.50
  • microorganisms include, for example, animal cells derived from humans, mice and other mammals, and established strains of animal cells, cells of fish and nematodes, insect cells, and fungal cells of yeast and the like, which have been used in bioassays. And bacterial cells such as Escherichia coli. Then, if a gene-disrupted strain corresponding to the gene having the function found in the above yeast is prepared using a known database or the like by a known technique, it can be used for the method of the present invention.
  • microorganisms may be sensitive or resistant to chemicals.
  • the “gene disrupted strain” includes a haploid gene disrupted strain, a homozygous diploid gene disrupted strain, and a heterozygous diploid gene disrupted strain.
  • yeast cells ⁇ -type cells and a-type cells, which are haploid, can join to form a diploid.
  • a homozygous diploid gene-disrupted strain is a strain in which the genes disrupted by ⁇ and a are the same
  • a heterozygous diploid gene-disrupted strain is a strain in which the genes disrupted by ⁇ or a are different
  • a strain in which the gene is disrupted in only one of a and a is the gene to be disrupted is not limited to one gene, and a plurality of genes among the genes listed above may be disrupted.
  • the present invention selects a gene-disrupted strain having improved sensitivity to a chemical substance and uses it for assaying the chemical substance.
  • the presence of the chemical is tested using the cell response of the gene-disrupted strain to the chemical as an indicator.
  • Cell response to chemicals is the life and death of cells, and
  • the reporter 'Gene' Atssei is a method for measuring a specific gene activity as a marker for examining the function of a gene centering on transcriptional activity, and includes the promoter atssay method and the like.
  • the promoter-assay method is a method in which a polynucleotide encoding a marker protein is operably linked to the polynucleotide sequence of a promoter of a certain gene, and the expression of the gene is indirectly measured (Barelle CJ, Manson CL, MacCallum DM, Odds F, Gow Na, Brown AJ .: GFP as a quantitative reporter of gene regulation in Candida albicans. Yeast 2004 Mar; 21 (4): 333-40).
  • YPR036W YDL151C, YDR027C, YGL026C, YGR180C, YHR026W, YHR039C-A, YKL080W, YLR447C, YDR127W, YDR150W, YGL240W, YGR006W, YGR105W, YJR104C, YBL058W, YCR0C, YCR, YCR028C, YCR028C, YCR028C, YCR028C YLR285W, YLR311C, YML112W, YMR021C, YOR221C, YOR331C, YPR123C, YAL021C, YDL151C, YDR195W, YDR414C, YDR525W-A, YDR539W, YDR540C, YGL224C, YGL246C,
  • a plasmid usable for the reporter gene's assay is described in WO03Z01872.
  • a polynucleotide sequence comprising the promoter of the yeast gene described in WOO 3/01872
  • a plasmid containing a polynucleotide operably linked to a polynucleotide encoding a marker protein is used.
  • YHR026W 9 Methylmercury chloride Sodium arsenous acid. Nickel (II) chloride. Potassium dichromate. Tritin tin nitrochloride. Mercuric chloride. Lead chloride. D SO, Zinc chloride.
  • YKL080W 9 Methylmercury chloride Sodium arsenite. Nickel (II) chloride. Triniculolai. Mercuric chloride. Lead chloride SDS DivlSO Zinc chloride.
  • YJR104C 8 Sodium arsenite, potassium dichromate triflate chloride, mercuric chloride. SDS. DMSO, zinc chloride
  • YCR028C 7 Methylmercury chloride Triznic chloride. Mercuric chloride. ⁇ Acid. SDS DMSO
  • YDR149C 7 Methylmercury chloride Sodium arsenite, potassium dichromate. Mercuric chloride. Potassium chloride. Lead chloride.
  • YML1 12W 7 Sodium arsenite, potassium dichromate. Fluorinus nichloride. Mercuric chloride.
  • YPR1 23C 7 Methylmercury chloride Sodium arsenous acid. Nickel (II) chloride.
  • YAL 021C 6 Sodium arsenite. Potassium dichromate. Tris chloride. Mercuric chloride. Copper sulphate Lead chloride.
  • YDR525W-A 6S Black. Copper sulfate Zinc chloride
  • YGL224C 6 Triffee chloride Chloride copper sulfate. Potassium chloride.
  • YHR060W 6 Methylmercury chloride Trinic chloride. Mercuric chloride. Lead chloride Zinc chloride
  • YLR290C 6 oz mercuric chloride, copper sulfate, lead chloride.
  • Nickel (II) trinyltin chloride mercuric chloride chloride.
  • YDR148C 5 Potassium dichromate Chlorai. Mercuric chloride. Copper sulfate. Lead chloride.
  • YJL1 92C 5 Black mercuric chloride Copper sulfate Lead chloride.
  • Triflate tin ride Mercuric chloride Chloride iti
  • YLR266C 5 Trifrenyltin chloride. Mercuric chloride. Copper sulfate.
  • YPL030W 5 Trif Niltin Nichloride Copper Sulfate. Potassium Cyanide.
  • the kit of the present invention includes a dried product of the above-described gene-disrupted strain, for example, a lyophilized product, a container containing an L-dried product or a frozen product, a culture medium, and the like.
  • the culture medium a medium having a composition suitable for the gene-disrupted strain used is used.
  • the present invention provides a composition for testing whether or not a chemical substance is present in a test sample, the composition comprising a gene-disrupted strain of a microorganism.
  • the composition of the present invention is a culture medium containing the gene-disrupted strain.
  • Yeast Deletion Homozygous Diploid As a yeast gene-disrupted strain, Yeast Deletion Homozygous Diploid (YKO Plate sets: Yeast Deletion Homozygous Diploid complete set, ResGen, Invitrogen) was used. The parent strain of this disrupted strain is Saccharomyces crevisiae BY4743. Yeast gene disruption From the 6,000 strains, select multiple disrupted strains that can be sensitive to chemicals. Some gene-disrupted strains cannot grow if they are deficient depending on the type of gene. Therefore, in this experiment, about 4800 gene-disrupted strains capable of growing as Homozygous diploids (homozygous diploids) were selected.
  • YKO Plate sets Yeast Deletion Homozygous Diploid complete set, ResGen, Invitrogen
  • the cryopreserved gene-disrupted strain was grown in a YPD medium (yeast extract 1%, polypeptone 2%, dulose 2%) with shaking at 25 ° C to a steady state.
  • the cells in the steady state were diluted 10000-fold with the same medium, and added dropwise to a chemical-containing agar medium (chemical plate) in 1.5 L portions, and after 3 days, the formation of colonies was observed.
  • Chemical plates were prepared by adding chemicals to YPD agar medium (yeast extract 1%, polypeptone 2%, glucose 2%, agar 2%) so that the final concentration was as shown in Table 5.
  • genes such as an increase in the permeability of a chemical substance due to deletion of a gene of a cell membrane constituent or response to a low concentration of a chemical substance due to deletion of a gene related to detoxification
  • gene-disrupted strains as strains exhibiting different properties, considering that the sensitivity may be improved for various reasons.
  • Chemical substances S How organisms damage organisms and how organisms respond has not been exhaustively analyzed. Therefore, by conducting experiments to select gene-disrupted strains that are sensitive to many types of chemicals, the gene-disrupted strain may be used as an indicator organism
  • Yeast cells have about 6000 genes, and most of them have already been deleted and gene-strained strains have been prepared and marketed.
  • the gene-disrupted strain may have a very low growth rate or a different medium component capable of growing. Therefore, in this experiment for examining the host cells of the promoter atsay method, considering the ease of comparison with the control experiment, among the gene-disrupted strains obtained as a result of Several strains which were sensitive and grew by the same operation as the parent strain were selected.
  • the eight gene-disrupted strains selected were DELOOO, DEL002, DELO11, DEL014, DEL016, DEL019, DEL022, and DEL025 shown in Table 7.
  • the parent strain BY4743 was used as a control.
  • Combinent cells were prepared for the parent strain of the gene-disrupted strain and the selected gene-disrupted strain, respectively.
  • p-YBR072W ligating GFP downstream of the YBR072W promoter
  • p-YPL171C ligating GFP downstream of the YPL171C promoter
  • YPL171C is a gene encoding NAPDH dehydrogenase
  • YBR072W is a gene encoding a heat shock protein, all of which show responses to multiple types of chemicals when the promoter is assayed.
  • P-YBR072W was prepared by the following method.
  • Primers for amplifying a polynucleotide containing a promoter sequence of the yeast gene YBR072W (SCPD: The Promoter Database of baccnaromyces cerevisiae [medium 1]) by PCR [medium number 1] were prepared. Primers are designed using Oligo 4.0-S, Sequencherl Macintosh version of the primer design software, and the base sequence of the upper primer is
  • GCAGTCAACGAGGAGCGAATCAG SEQ ID NO: 2
  • PCR uses yeast chromosomes (Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat. 40802, Research Genetics, In) as a template, and reagents are commercially available kits (KOD DNA
  • the vector used is a YEp-type shuttle vector that is replicated in both E. coli and yeast.
  • PYES2 pYES2, Cat no: V825—20, Invitrogen Corporation, USA
  • the GFP portion (SEQ ID NO: 4) of the vector pQBI63 (Cat no. 54-0082, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • a vector was prepared in which a GFP polynucleotide was inserted into the multiple cloning site of pYES2.
  • the GAL1 promoter portion of pYES2 was replaced with a polynucleotide containing the promoter sequence of YBR072W, a yeast gene, to obtain a target plasmid vector. Insertion of a polynucleotide containing GFP and a promoter sequence was performed by selecting appropriate restriction enzymes.
  • yeast Saccharomyces cerevisiae BY4743 (YKO Plate sets: Yeast Deletion Homozygous Diploid complete set, ResGen, Invitrogen) was transformed with this plasmid vector. The procedure of the transformation is shown below. 1) Yeast cells Saccharomyces cerevisiae BY4743 is shake-cultured in 200 ml of YPD medium until the OD660 becomes 0.5.
  • Transformation was confirmed using a selective medium (SD medium (Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15) + glucose + amino acids (histidine, leucine). Colonies grown on agar plates in the selective medium). Further confirmed the auxotrophy of amino acids.
  • SD medium yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15) + glucose + amino acids (histidine, leucine). Colonies grown on agar plates in the selective medium). Further confirmed the auxotrophy of amino acids.
  • P-YPL171C was prepared as follows.
  • Primers for amplifying a polynucleotide containing a promoter sequence of the yeast gene YPL171C (SCPD: The Promoter Database of baccnaromyces cerevisiae [ ⁇ ]) (item 5) from PCR were prepared. Primers are designed using Oligo 4.0-S, Sequencherl Macintosh version of the primer design software, and the base sequence of the upper primer is
  • ACGCCCCTTCCTTTTTCCCTTTC (; SEQ ID NO: 6;)
  • CTTCTAAATTTAAACTTCGCTA (SEQ ID NO: 7)
  • PCR used a yeast chromosome (Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat. 40802, Research Genetics, In) as a template, and used a commercially available kit (KOD DNA Polymerase; code KOD-101, Toyobo) as a reagent.
  • yeast chromosome Sacharomyces cerevisiae S288C, Cat. 40802, Research Genetics, In
  • KOD DNA Polymerase code KOD-101, Toyobo
  • the vector used is a YEp-type shuttle vector that is replicated in both E. coli and yeast.
  • PYES2 pYES2, Cat no: V825—20, Invitrogen Corporation, USA
  • the polynucleotide encoding the marker protein GFP the GFP portion (SEQ ID NO: 4) of the vector pQBI63 (Cat no. 54-0082, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • a vector was prepared in which a GFP polynucleotide was inserted into the multiple cloning site of pYES2.
  • the GAL1 promoter portion of pYES2 was replaced with a polynucleotide containing the promoter sequence of YPL171C, a yeast gene, to obtain a target plasmid vector. Insertion of a polynucleotide containing GFP and a promoter sequence was performed by selecting appropriate restriction enzymes.
  • yeast Saccharomyces cerevisiae BY4743 (YKO Plate sets: Yeast Deletion Homozygous Diploid complete set, ResGen, Invitrogen) was transformed with this plasmid vector.
  • the procedure of the transformation is shown below.
  • Transformation was confirmed using a selective medium (SD medium (Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15) + glucose + amino acids (histidine, leucine). Colonies grown on agar plates in the selective medium). Further confirmed the auxotrophy of amino acids.
  • SD medium yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15) + glucose + amino acids (histidine, leucine). Colonies grown on agar plates in the selective medium). Further confirmed the auxotrophy of amino acids.
  • the obtained transformant was grown in a SD medium (histidine, leucine) at 25 ° C. with shaking so as to be in a steady state.
  • the transformant in the steady state was diluted 500-fold with the same medium described above, and cultured with shaking at 25 ° C for 15 hours.
  • Different concentrations of chemicals were loaded.
  • the fluorescence of the cells cultured for 4 hours was measured using a flow cytometer (FITC filter 1, EPICS XL-MCL, Bechmancoulter), and the expression level of a marker gene, GFP (green fluorescence protein) was determined.
  • the fluorescence intensity of 10,000 cells was measured in one measurement using a flow cytometer, and the average value of the fluorescence intensity of all cells was determined and used as the measured value. Similarly, the fluorescence intensity of the cells not loaded with the daniel substance was determined and expressed as a fluorescence intensity ratio.
  • Figure 2 shows that the gene disrupted strain DEL011 responded to sodium meta arsenite at 1/10 the concentration of the parent strain, the gene disrupted strain DEL014, the concentration of S1Z3000, and the gene disrupted strain DEL016 at the concentration of 1Z3. .
  • Figure 3 shows that the gene-disrupted strain DEL002 is 1/3 of the parent strain, the gene-disrupted strain DEL011 is 1Z3, the DEL016 is 1Z3, the DEL019025 is 1/3, and the gene-disrupted strain DEL is 1Z3. This indicates that he responded to cadmium.
  • FIG 4 shows that the gene-disrupted strain DEL000 responded to the concentration of 1/3 of the parent strain, the gene-disrupted strain DEL019 responded to the concentration of 1Z100, the DEL022 to the concentration of 1Z10, and the gene-disrupted strain DEL025 to the concentration of 1/3. Show that.
  • FIG. 5 shows that the gene-disrupted strain DEL011 responded to mercury salt 2 at a concentration 1/10 that of the parent strain and the concentration of the gene-disrupted strain DEL016 S1Z3.
  • DEL000, DEL002, DEL011, DEL014, DEL016, DEL019, DEL022 and DEL025 are three times more responsive to chemicals than the parent strain BY4743.
  • the force was also confirmed to be 1000 times higher.
  • DEL0014 showed a significant difference compared to BY4743 even at 1 / 1000th of the detectable concentration of the parent strain (Fig. 2).
  • YGR006W (DELO12), YGR105W (DRLO13), YJR104C (DELO14), YGL206C (DEL018), YIL036W (DELO19), YKL119C (DEL020), YLR226W (DEL022), YLR311C (DEL025) was replaced with the transformation marker.
  • the N-terminal side (ORF (upper)) and the C-terminal side (ORF (lower)) of each ORF were used as primers for PCR amplification.
  • the length of the homologous sequence (ORF (upper) and ORF (lower)) of the primer to the ORF was 45 or 50 bp.
  • the strain that produces the yeast gene-disrupted strain is W303a-conjugated ATCC200903 (MATa ade2-1 trpl-1 leu2-3 leu2- 112 his3- 11 his3- 15 ura3- 1 canl-100) and W303 ⁇ -junction ATCC201238 (MAT a ade2-1 trpl-1 leu2- 3 leu2- 112 his3- 11 his3- 15 ura3 -1 canl-100).
  • W303a-conjugated and W303 ⁇ -conjugated competent 'cells were prepared and transformed with the gene-disrupted strain transformation cassette prepared above. Use a commercially available kit (S. easyComp TM Transformation Kit: Invitrogen) for preparing and transforming the competent cells! /, 7
  • Transformation was confirmed by PCR.
  • PCR was performed by setting the upper primer in the promoter region of the target gene and the lower primer in the transformation marker. As a result, it was confirmed that if the ORF site was replaced with a transformation marker and the gene was disrupted, the site sandwiched by the primers was amplified, and the gene was disrupted and the gene was not amplified.
  • a / a type diploids By mixing and culturing Saccharomyces crevisiae a and ⁇ mating type monophasic bodies, a / a type diploids can be produced.
  • heterozygous diploids in which DEL006, DEL014 and DEL022 and non-gene disrupted strains are conjugated hereinafter referred to as DEL006 heterozygous diploid, DEL014 heterozygous diploid, DEL022 heterozygous diploid
  • DEL006 heterozygous diploid DEL014 heterozygous diploid
  • DEL022 heterozygous diploid DEL022 heterozygous diploid
  • a heterozygous diploid in which DEL000 and DEL014 were conjugated hereinafter referred to as a DEL000Z014 heterozygous diploid
  • the resulting combi- ent cells were ligated to two types of plasmids for the promoter assembly, p-YBR072W (GFP was ligated downstream of the YBR072W promoter) and P-YPL171C (GFP was ligated downstream of the YPL171C promoter.
  • p-YBR072W was ligated downstream of the YBR072W promoter
  • P-YPL171C GFP was ligated downstream of the YPL171C promoter.
  • P-YBR072W was prepared by the following method.
  • a polynucleotide containing the promoter sequence of the yeast gene YBR072W (SCPD: The Promoter Database of baccharomyces cerevisiaei trowel ⁇ r ⁇ (rooster c stem [J number ⁇ ]). Designed using Oligo 4.0-S, Sequencherl Macintosh version of the primer design software, the base sequence of the upper primer is
  • GCAGTCAACGAGGAGCGAATCAG SEQ ID NO: 2
  • PCR uses yeast chromosomes (Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat. 40802, Research Genetics, In) as a template, and reagents are commercially available kits (KOD DNA
  • the vector used is a YEp-type shuttle vector that is replicated in both E. coli and yeast.
  • PYES2 pYES2, Cat no: V825—20, Invitrogen Corporation, USA
  • the GFP portion (SEQ ID NO: 4) of the vector pQBI63 (Cat no. 54-0082, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • a vector was prepared in which a GFP polynucleotide was inserted into the multiple cloning site of pYES2.
  • GAL1 promoter portion of pYES2 was replaced with a polynucleotide containing the promoter sequence of YBR072W, a yeast gene, to obtain a target plasmid vector.
  • Polynucleotide containing GFP and promoter sequence was performed by selecting an appropriate restriction enzyme.
  • the transformation was confirmed using a selective medium (SD medium (Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15) + glucose + amino acids (adenine, histidine, tryptophan, mouth isine)).
  • SD medium yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15) + glucose + amino acids (adenine, histidine, tryptophan, mouth isine)
  • the colonies that were identified further confirmed the nutritional requirements of the amino acids.
  • P-YPL171C was prepared as follows.
  • a polynucleotide containing the promoter sequence of the yeast gene YPL171C (SCPD: The Promoter Database of saccharomyces cerevisiaei trowel ⁇ r ⁇ (rooster c system [J number ⁇ ]). Designed using Oligo 4.0-S, Sequencherl Macintosh version, which is a primer design software, and the base sequence of the upper primer is
  • ACGCCCCTTCCTTTTTCCCTTTC (; SEQ ID NO: 6;)
  • CTTCTAAATTTAAACTTCGCTA (SEQ ID NO: 7)
  • yeast chromosomes Sacharomyces cerevisiae S288C, Cat. 40802, Research Genetics, In
  • reagents are commercially available kits (KOD DNA Polymerase; code KOD-101, Toyobo) was used.
  • the vector used is a YEp-type shuttle vector that is replicated in both E. coli and yeast.
  • PYES2 pYES2, Cat no: V825—20, Invitrogen Corporation, USA
  • the GFP portion (SEQ ID NO: 4) of the vector pQBI63 (Cat no. 54-0082, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • a vector was prepared in which a GFP polynucleotide was inserted into the multiple cloning site of pYES2.
  • the GAL1 promoter portion of pYES2 was replaced with a polynucleotide containing the promoter sequence of YPL171C, a yeast gene, to obtain a target plasmid vector. Insertion of a polynucleotide containing a GFP and a promoter sequence was performed by selecting an appropriate restriction enzyme.
  • the transformation was confirmed using a selective medium (SD medium (Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15) + glucose + amino acids (adenine, histidine, tryptophan, mouth isine)).
  • SD medium yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919-15) + glucose + amino acids (adenine, histidine, tryptophan, mouth isine)
  • the colonies that were identified further confirmed the nutritional requirements of the amino acids.
  • the fluorescence intensity of 10,000 cells was measured in one measurement using a flow cytometer, and the average value of the fluorescence intensities of all the cells was obtained as the measured value. Similarly, the fluorescence intensity of the cells was obtained without loading the measured chemical substance, and the result was shown as a difference in the fluorescence intensity.
  • the chemical substances to be loaded were selected from sodium meta arsenite and thiuram, which respond when W303 was used as a host in the promoter assay using the plasmid p-YPL171C, and a benchy curve from P-YBR072W.
  • Figures 6 to 11 show the results of a load test performed by preparing a dilution series of chemical substances.
  • DEL003, DEL006, DEL008, DEL014, DEL019 and DEL022 showed the same or higher fluorescence intensity than the non-gene-disrupted strain at the same concentration of chemical substance. All the gene-disrupted strains are homozygous diploids.
  • FIG. 8 DEL001, DEL006, DEL007, DEL018, DEL019, DEL020, DEL02 2 and DEL025 showed the same or higher fluorescence intensity than the non-disrupted strain at the same concentration of the chemical substance. All the gene-disrupted strains are homozygous diploids.
  • FIG. 10 DEL006, DEL007, DEL012, DEL013, DEL020, DEL022 and DELO
  • No. 25 showed the same or higher fluorescence intensity than the non-gene-disrupted strain at the same concentration of the chemical substance. All the gene-disrupted strains are homozygous diploids.
  • Fig. 11 Fluorescent intensity was higher than that of the non-gene-disrupted strain at the same concentration of chemical substance.

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Abstract

　検体試料中の化学物質の存在を検定するための、微生物の細胞応答を利用したバイオアッセイ法において、より高感度の方法を提供する。 　本発明の方法は、特定の遺伝子破壊株を使用することを特徴とする。

Description

明 細 書
遺伝子破壊株を用いた化学物質検定方法
技術分野
[0001] 本発明は環境中の試料中に存在する化学物質を検定する方法に関する。
背景技術
[0002] 人類力これまでに作りだしたィ匕学物質は膨大な数にのぼり、さらに年々新しいィ匕学 物質が開発されている。これら化学物質は現代生活のあらゆる面で利用され、人類 の生活向上に役立っている。その反面、化学物質の中には、その製造、流通、使用 、廃棄等の様々な段階で環境中に放出され、環境での残留、食物連鎖による生物学 的濃縮などを通じ、人の健康や生態系に有害な影響を及ぼすものがあり、環境汚染 は社会問題ィ匕している。よって、化学物質について人体や生態系に与える影響を評 価する要請がある。
被検試料中に存在する化学物質を検出する場合、検出システムの検出感度を向 上させることは非常に重要である。被検試料中に低濃度の化学物質しか存在しない 場合、低濃度の化学物質を検出するために用いる検出システムの検出感度に応じ、 被検試料を濃縮しなければならない。しかし、環境試料のような水溶液の濃縮を行う には濃縮装置が必要となる。また、対象とする化学物質が揮発性の場合、濃縮操作 により化学物質が消失してしまうことがある。このため、できるかぎり濃縮操作の必要 が無 ヽ検出システム、すなわち高!ヽ検出感度を有するアツセィ系が望まれる。
環境中に存在する化学物質の検出に酵母細胞の毒性応答を利用するアツセィ系 力ある（特許文献 1および 2)。
[0003] 特許文献 l :WO 03/018792
特許文献 2：特開 2003-061676
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明者らは、これまで上記特許文献 1および 2に示すように化学物質によって誘 導される遺伝子情報を蓄積し、酵母細胞の毒性応答を利用したバイオアツセィ法を 検討してきた。バイオアツセィによる化学物質の検出感度は指標とする細胞や生物の 化学物質に対する感受性に依存する。従って、酵母細胞の毒性応答を利用したバイ オアッセィ法において、より高感度のシステムを構築するためには、より感受性の高 い酵母細胞を利用する必要がある。そこで、酵母の遺伝子 6000種類の遺伝子破壊 株の中でホモ接合の二倍体として生育可能な遺伝子破壊株約 4800種類の中から、 化学物質検出のアツセィ系に適した化学物質感受性を有する遺伝子破壊株を選択 した。
本発明は、微生物の毒性応答を利用したバイオアツセィ法において、より高感度の 方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0005] 即ち、本発明は、
(1) 被検試料中に化学物質が存在するか否かを検定するための方法であって、該 被検試料の存在下に微生物の遺伝子破壊株を培養し、その化学物質に対する遺伝 子破壊株の細胞応答を指標に用いることを特徴とする方法、好ましくは、
化学物質に対する遺伝子破壊株の細胞応答が、細胞の生死、および Zまたは増 殖能、呼吸量、酵素活性および Zまたは遺伝子発現の変化である方法、さらに好ま しくは、
遺伝子発現の変化が RNA量または mRNA量の変化である方法、より好ましくは、 遺伝子発現の変化をレポーター'ジーン'アツセィにより測定する方法、
[0006] (2)微生物が酵母である、上記（1)の方法、好ましくは、
破壊される遺伝子が、公的データベース： MIPSの分類に従 、、
代謝 (01)のアミノ酸代謝 (01.01)、窒素および硫黄代謝 (01.02)、ヌクレオチド代謝 (01.03)、リン酸代謝 (01.04)、 C-ィ匕合物および炭水化物代謝 (01.05)、脂質、脂肪 酸およびイソプロパノイド代謝 (01.06)、ビタミン、コファクターおよび補欠分子族の代 謝 (01.07) ;
03.03)；
転写（04)の mRNA転写（04.05)、 RNA輸送（04.07)； 蛋白合成 (05)のリボゾーム生合成 (05.01)、翻訳制御（05.07)；
蛋白フ イト（06)の蛋白ターゲッティング、局在、転位（06.04)、蛋白修飾（06.07)、 蛋白複合体のアセンブル (06.10)、蛋白分解的崩壊 (06.13)；
細胞内輸送と輸送機構 (08)の核輸送 (08.01)、小胞輸送（ゴルジネットワーク他 .）（
08.07)、液胞輸送 (08.13)、細胞移入 (08.19)、細胞骨格輸送 (08.22)、他の細胞内 輸送活性 (08.99) ;
細胞レスキュー，防御と病原性（11)のストレス応答（11.01)、解毒（11.07)； 細胞内環境調節 Z相互作用（13)のイオン性ホメォスタシス（13.01)、細胞感受性と 応答（13.11) ;
細胞フェイト（14)の細胞成長 I形態形成（14.01)、細胞分化（14.04)；
細胞組織の制御（30)の細胞壁 (30.01)、細胞骨格 (30.04)、核 (30.10)、ミトコンドリ ァ（30.16)；
輸送促進（67)のイオントランスポーター（67.04)、ビタミン/コファクタートランスポー ター（67.21)、輸送機構 (67.50)、他の輸送促進 (67.99)；
未分類 (98)；および Zまたは
未分類蛋白（99)に分類される方法、さらに好ましくは、
破壊される遺伝子が下記表 2の機能に関与している方法、より好ましくは、 破壊される遺伝子が液胞に関与している、例えば酵母の場合、具体的には以下に 示す YPR036W、 YDR027C, YHR026W、 YHR039C- A、 YKL080W、 YLR447C, YGR105W、 YKL119C、 YHR060Wである方法（ここに、 YHR039C— Aは YHR039C— Bと 呼称されることもある）、
さらに具体的には破壊される遺伝子が以下のものである方法：
(2-1) 代謝（01)遺伝子である YGL026C、 YGR180C、 YDR127W, YCR028C、 YLR284C, YOR221C, YAL021C, YGL224C, YBL042C, YDR148C、 YHL025W、 YLR307W, YLR345W、 YLR354C、 YPL129W、 YPR060C；
(2-2) 細胞周期と DNAプロセッシング (03)遺伝子である YGR180C、 YDR150W、 YGL240W, YBL058W、 YIL036W、 YLR226W, YLR381W、 YOR026W、 YPL018W、 YBL063W、 YDR363W- A、 YIR026C、 YLR234W, YMR032W, YPL129W; (2-3) 転写 (04)遺伝子である YGR006W、 YIL036W、 YKR082W, YLR226W, YML112W, YMR021C, YAL021C、 YDR195W、 YOL068C、 YBR279W, YGL070C, YGL071W、 YGL222C, YHL025W、 YLR266C、 YPL129W;
(2-4) 蛋白合成 (05)遺伝子である YBL058W、 YLR287C- A、 YGR084C、 YLR344W
(2-5) 蛋白フェイト (06)遺伝子である YKL080W、 YLR447C, YGL240W, YGR105W 、 YGL206C、 YKL119C、 YDR414C, YHR060W、 YLR292C, YLR306W、 YGL227W, YGR270W;
(2-6) 細胞内輸送と輸送機構 (08)遺伝子である YPR036W、 YDR027C, YHR039C、 YKL080W, YLR447C, YGL206C、 YKR082W, YLR292C, YBL063W;
(2-7) 解毒 (11)遺伝子である YJR104C、 YMR021C ;
(2-8) 細胞内調節 Z相互作用 (13)遺伝子である YPR036W、 YHR039C、 YKL080W 、 YLR447C, YGL071W、 YIR026C；
(2-9) 細胞フェイト (14)遺伝子である YDL151C、 YBL058W、 YKR082W, YDL151C 、 YOL068C、 YDR363W- A、 YHL025W、 YIR026C、 YLR307W, YMR032W,
YPL129W;
(2-10) 細胞組織の制御 (30)遺伝子である YDR027C、 YDR414C, YLR381W、 YGR084C、 YMR032W;
(2-11) 輸送促進 (67)遺伝子である YPR036W、 YHR026W、 YHR039C、 YKL080W、
YLR447C, YCR028C、 YLR292C；
(2-12) 未分類 (98)遺伝子である YBL056W；または
(2-13) 未分類蛋白 (99)遺伝子である YDR149C、 YLR285W、 YLR311C、 YOR331C 、 YPR123C、 YDR525W- A、 YDR539W、 YDR540C、 YGL246C, YJL204C, YLR282C 、 YLR287C, YLR290C、 YJL188C, YJL192C, YJL211C, YKL037W, YLR283W、 YLR312C, YLR315W、 YLR320W、 YPL030W、
[0008] (3)酵母以外の微生物であり、破壊される遺伝子が上記（2)にて規定される遺伝子 に相当する遺伝子である上記（1)の方法、
[0009] (4) 被検試料中に化学物質が存在するか否かを検定するために使用される、微生 物の遺伝子破壊株を含むキット、好ましくは、
化学物質に対する細胞応答が細胞の生死、および Zまたは増殖能、呼吸量、酵素 活性および Zまたは遺伝子発現の変化であるキット、さらに好ましくは、
遺伝子発現の変化が、 RNA量または mRNA量の変化であるキット、より好ましくは、 遺伝子発現の変化をレポーター'ジーン'アツセィにより測定するキット、
(5)微生物が酵母であり、破壊される遺伝子が上記（2)にて規定される、上記 (4)の キット、および酵母以外の微生物であり、破壊される遺伝子が上記（2)にて規定され る遺伝子に相当する遺伝子である上記 (4)のキット、
(6) 被検試料中に化学物質が存在するか否かを検定するための、微生物の遺伝子 破壊株を含む組成物、好ましくは、
化学物質に対する細胞応答が細胞の生死、および Zまたは増殖能、呼吸量、酵素 活性および Zまたは遺伝子発現の変化である組成物、さらに好ましくは、
遺伝子発現の変化が、 RNA量または mRNA量の変化である組成物、より好ましくは 遺伝子発現の変化をレポーター'ジーン'アツセィにより測定する糸且成物、
(7)微生物が酵母であり、破壊される遺伝子が上記（2)にて規定される、上記 (6)の 組成物、および酵母以外の微生物であり、破壊される遺伝子が上記（2)にて規定さ れる遺伝子に相当する遺伝子である上記（6)の組成物、および
(8) 被検試料中に化学物質が存在するか否かを検定するための、微生物の遺伝子 破壊株の使用、好ましくは、
化学物質に対する細胞応答が細胞の生死、および Zまたは増殖能、呼吸量、酵素 活性および Zまたは遺伝子発現の変化である使用、さらに好ましくは、
遺伝子発現の変化が、 RNA量または mRNA量の変化である使用、より好ましくは、 遺伝子発現の変化をレポーター ·ジーン'アツセィにより測定する使用、
(9)微生物が酵母であり、破壊される遺伝子が上記（2)にて規定される、上記 (8)の 使用、および酵母以外の微生物であり、破壊される遺伝子が上記（2)にて規定され る遺伝子に相当する遺伝子である上記（8)の使用、に関する。
発明の効果 [0011] 本発明は、被検試料中に低濃度の化学物質しか存在しない場合であっても、好適 に化学物質を検出できる、高感度のアツセィ系である。本発明のアツセィ系は高感度 であるため、被検試料を濃縮する必要がなぐまた濃縮する必要がないことから対象 とする化学物質が揮発性の場合であっても好適に化学物質を検出できる。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]プラスミド P- YPL171Cにより形質転換された遺伝子破壊株 DEL011におけるメ タ亜ヒ酸ナトリウムに対する感受性を示すグラフ。
[図 2]プラスミド p- YBR072Wにより形質転換された遺伝子破壊株 DEL011、 DEL01 4および DELO 16におけるメタ亜ヒ酸ナトリゥムに対する感受性を示すグラフ。
[図 3]プラスミド p- YBR072Wにより形質転換された遺伝子破壊株 DEL002、 DEL01 1、 DELO 16, DEL019および DEL025における塩化カドミウムに対する感受性を 示すグラフ。
[図 4]プラスミド p- YBR072Wにより形質転換された遺伝子破壊株 DELOOO、 DEL01 9、 DEL022および DEL025におけるベンチォカーブに対する感受性を示すグラフ
[図 5]プラスミド p- YPL171Cにより形質転換された遺伝子破壊株 DEL011、 DELO 16 および DEL025における塩ィ匕第二水銀に対する感受性を示すグラフ。
[図 6]プラスミド p- YPL171Cにより形質転換された遺伝子破壊株 DEL006と DEL014 が遺伝子非破壊株の 1Z30の濃度、 DEL003、 DEL008と DEL022が 1Z3の濃 度にお 、てメタ亜ヒ酸ナトリウムに対する感受性を示すグラフ。遺伝子破壊株は何れ もホモ接合二倍体である。
[図 7]プラスミド P- YPL171Cにより形質転換された遺伝子破壊破壊株 DEL014のホモ 接合二倍体と DEL000Z014ヘテロ接合二倍体が遺伝子非破壊株の 1Z30の濃 度においてメタ亜ヒ酸ナトリウムに対する感受性を示すグラフ。
[図 8]プラスミド P- YPL171Cにより形質転換された遺伝子破壊破壊株 DEL007と DE L022が遺伝子非破壊株の 1Z1000の濃度、 DEL006、 DEL0018とDEL019が1 ZlOの濃度において、 DEL001と DEL0020が 1Z3の濃度においてチウラムに対 する感受性を示すグラフ。遺伝子破壊株は何れもホモ接合二倍体である。 [図 9]プラスミド p- YPL171Cにより形質転換された遺伝子破壊破壊株 DEL006のホモ 接合二倍体およびへテロ接合二倍体が遺伝子非破壊株の 1Z10の濃度においてチ ウラムに対する感受性を示すグラフ。
[図 10]プラスミド p- YBR072Wにより形質転換された遺伝子破壊破壊株 DEL006、 EL 007と DEL022が遺伝子非破壊株の 1/10の濃度、 DEL012、 DEL013と DEL02 0が 1Z3の濃度において、ベンチォカーブに対する感受性を示すグラフ。遺伝子破 壊株は何れもホモ接合二倍体である。
[図 11]プラスミド p- YBR072Wにより形質転換された遺伝子破壊破壊株 DEL0022の ホモ接合二倍体が遺伝子非破壊株の 1Z10の濃度、遺伝子破壊破壊株 DEL0022 のへテロ接合二倍体が遺伝子非破壊株の 1Z3の濃度においてベンチォカーブに 対する感受性を示すグラフ。
発明を実施するための最良の形態
本発明の一態様として、酵母遺伝子を例に挙げて説明する。
1)遺伝子破壊株の選別とその機能分類
酵母遺伝子破壊株として用いた Yeast Deletion Homozygous Diploid (YKO Plate sets: Yeast Deletion Homozygous Diploid complete set, ResGen , Invitrogen)の遺 伝子破壊株 4800種類の中から、化学物質に良好な感受性を示す株 84種を選別し た（実施例 1)。この 84種の株の破壊遺伝子を公的データベース： MIPS (Munich Information center for Protein Sequences)の分類に従 ヽ、分類した。なお、 MIPSの分 類とは遺伝子をその機能により分類したものであり、以下の URLにてその情報は容 易に入手できる：
http://mips.gsf.ae/ genre/proj/yeast/searchし atalogrirstAction.do?style=cataiog.xsl t&table=FUNCTIONAL— CATEGORIES
MISPの分類によれば、酵母遺伝子は以下の表のように分類されて 、る。
表 1
[表 1-1] 01 代謝
01. 01 - . アミノ酸代謝
01. 02 - . 窒素および硫黄代謝
01. 03 , . ヌクレオチド代謝
01. 04 リン酸代謝
01. 05 c-化合物および炭水化物代謝
01. 06 脂質、 脂肪酸およびイソプロパノイ ド代謝
01. 07 - . ビタミ ン、 コファクタ一および補欠分子族の代謝
01. 20 . . 二次代謝
02 エネルギー
02. 01 解糖および糖新生
02. 07 . . ペン トースリン酸回路
02. 10 - . ト リ カルボン酸経路 (クェン酸回路 t クレプス回路， TCA回路）
02. 11 - . 電子伝達および膜関連エネルギ一保存
02. 13 . . 呼吸
02. 16 . . ¾酵
02. 19 エネルギー保存の代謝 （例えば、 グリ コーゲン， ト レリ、 π—ス)
02. 22 ダリオキシル酸回路
02. 25 - .脂肪酸の酸化
02. 99 他のエネルギ一発生活性
03 細胞周期と D N Aプロセッシング
03. 01 , . D N Aプロセッシング
03. 03 . .細胞周期
03. 99 他の細胞分裂と DNA合成活性
04 転写
04. 01 , . rRNA 転写
04. 03 , . tRNA 転写
04. 05 . . mRNA 転写
04. 07 , . RNA 輸送
04. 99 他の転写活性
05 蛋白合成
05. 01 リボゾーム生合成
05. 04 . . 翻訳
05. 07 翻訳制御
05. 10 , . アミ ノアシル- tRNA-シンセターゼ
05. 99 他の蛋白合成活性
[表 1-2] 06 蛋白フェイ ト （フォールデイング、 修飾、 デスティネーショ ン）
06. 01 - . 蛋白フォールデイングと安定化
06. 04 - . 蛋白タ一ゲッティング、 局在、 転位
06. 07 . . 蛋白修飾
06. 10 蛋白複合体のアセンブル
06. 13 蛋白分解的崩壊
06. 99 他の蛋白フェイ ト関連活性
08 細胞内輸送と輸送機構
08. 01 . . 核輸送
08. 04 , . ミ トコン ドリァ輸送
08. 07 小胞輸送 （ゴルジネッ トワーク他.）
08. 10 ペルォキシソ一ム輸送
08. 13 液胞輸送
08. 16 - . 細胞外輸送， ェキソサイ ト一シスおよび分泌
08. 19 . . 細胞移入
08. 22 . . 細胞骨格輸送
08. 99 他の細胞内輸送活性
10 細胞伝達/シグナル伝達機構
10. 01 . . 細胞内シダナリンダ
10. 05 - . 膜貫通シグナル伝達
11 細胞レスキュー， 防御と病原性
11. 01 , . ス ト レス応答
11. 07 . . 解毒
11. 10 外来化合物の分解
11. 99 他の細胞レスキュ一活性
13 細胞内環境調節 Z相互作用
13. 01 - . イオン性ホメォスタシス
13. 11 細胞感受性と応答
14 細胞フエイ ト
14. 01 細胞成長 / 形態形成
14. 04 細胞分化
14. 10 細胞死
14. 20 細胞加齢
[表 1-3]
29 転位性要素、 ウィルスおよびプラス ミ ド蛋白
29. 07 - . ト ランスポゾン移動の統合または阻害に必要な蛋白
29. 99 - .他の転位性要素、 ウィルスおよびプラスミ ド蛋白
30 細胞組織の制御
30. 01 .. 細胞壁
30. 02 原形質膜
30. 03 細胞質
30. 04 細胞骨格
30. 05 .. 中'、体
30. 07 小胞体
30. 08 ゴノレジ
30. 09 .. 細胞内輸送小胞
30. 10 - . 核
30. 16 - . ミ ト コ ン ドリ ア
30. 19 ペルォキシソ一ム
30. 22 , . エン ドソ一ム
30. 25 .. 液胞またはリ ソゾーム
30. 99 細胞組織の他の制御
40 細胞内局在
40. 01 細胞壁
40. 02 .. 原开さ質膜
40. 03 .. 細胞質
40. 04 .. 細胞骨格
40. 05 .. 中'！ >体
40. 07 小胞体
40. 08 , . コノレシ
40. 09 細胞内輸送小胞
40. 10 , . 核
40. 16 , . ミ トコン ドリア
40. 19 , . ぺノレ才キシソーム
40. 22 , . エン ドソーム
40. 25 .. 液胞またはリ ソゾ一ム
40. 27 細胞外 / 分泌蛋白
[¾1-4]
62 蛋白活性調節
62. 01 調節の機構
62. 02 調節の標的
63 結合機能を有する蛋白またはコファクタ一必要素 （構造的または触媒的）
63. 01 蛋白結合
63. 03 核酸結合
63. 09 脂質結合
67 輸送促進
67. 01 - . チャネル / 細孔クラス トランスポ一タ一
67. 04 イオン トランスポーター
67. 07 - . c-化合物と炭水化物 トランスポ一タ
67. 10 アミノ酸 トランスポーター
67. 1 1 - . ぺプチド トランスポ一タ一
67. 13 - . 脂質トランスポ一タ一
67. 16 ヌク レオチ ド トランスポ一タ一
67. 19 アラン トインおよび アラン トェ一 ト トランスポ一タ一
67. 21 ビタ ミ ン/コファクタ一 トランスポ一タ一
67. 28 - . 薬物 トランスポ一タ一
67. 50 輸送機構
67. 99 他の輸送促進
98 未分類
99 未分類蛋白 化学物質に良好な感受性を示す選別した株 84種を上記公的データベース： MIPS の分類に従い、分類した。
表 2.機能による分類
化学物質感受性 84遺伝子破壊株の遺伝子の機能分類
[表 2-1]
機能 No 遺伝子 MIPS分類 機能 (description)
卜ジプ卜ファ ンシンターゼ： tryptoph
DEし 003 YGL026C 01.01.01
an synthase
リボヌク レオチ ドリ ダクターゼ 小サ
DEL004 YGR180C ブュ-ッ h ribonuc leotide reducta se small subuni t
ァロムペンタフア ンクショナル酵素
DEし 009 YDR127W 01.01.01
： arom pentarunct ional enzyme
01.02.04 ノ ン 卜テン ノ一ミ ^ーゼ： Pan tot he 01.05.04 nat e permease
DEL016 YCR028C
01.06.10
01.07.10
デルタ 3-シス-デルタ 2-トランス-ェ o ノィ - Co A イソメラーゼ： delta3-ci
DEし 023 YLR284C 01.06.04
s~del ta2~ trans- en oyl-CoA isomeras e
マロ二 /レ- CoA ACP トランスフェラ一
DEし 028 Y0R221C 01.06.07
ゼ ： malonyl - CoA ACP transferase 代謝 fe~ 調 6卩因 ： transcriptional regu
DEし 031 YAL021C 01.05.04
01 ■■ METABO lator
LISM ピリ ミ ジン 5-ヌク レオチタ一ゼ ： pyr
DEし 038 YGし 224C 01.03.04
lmidine 5 - nucleotidase ゥ ンンノ、^ ~ ~セ ： Uridine perm
DEし 052 YBし 042C 01.03.04
ease
2-ォキソグルタル酸デヒ ドロゲナー ゼ複合体 E2 成分： 2-oxoglutarate
DEし 056 YDR148C 01.05.01
dehydrogenase complex E2 componen t
全転写活性因子： Global transcripti
DEし 064 YHL025W 01.05.04
on act lvator
胞子形成-キチンデァセチラ一ゼ： spo
DEし 073 YLR307W 01.05.01 rulat ion- specif ic chit in deetcety丄 ase
Pfk26p, 6-ホスホフルク ト -2-キナー
DEし 078 YLR345W 01.05.04 ゼ類似体： similarity to Pfk26p and other 6-phospho ructo-2-kinases 卜ランスァノレドラーゼ： transaldolas
DEし 079 YLR354C 01.05.01
e
[表 2-2]
Figure imgf000014_0001
[表 2-3] TFIIF サブュニッ ト （転写ィユシェ 一ショ ン因子）， 30 kD ： TFIIF sub
DEL082 YPL129W 03.03.01
unit (transcription initiation f actor)， 30 kD
04.05.05.0 U5 snRNA-関連タンパク質： U5 snRN
DEL012 YGR006W
1 A - associated protein
04.05.01.0 ATF/CREB i¾†生因子 ： ATF/CREB acti
DEL019 YIL036W
4 vator
核 S奠孑しタンノヽク ： nuclear pore pro
DEし 021 YKR082W 04.07
tein
04.05.01.0 CDK-サイク リ ン分岐化複合体： dive
DEL022 YLR226W
4 rgent CDK - cyclin complex
カルボキシル末端 ドメイン（CTD)キ
04.05.01.0 ナーゼ、 γサブュニッ ト ： carboxy-
DEし 026 YML112W
4 terminal domain (CTD) kinase, ga mma subuni t
04.05.01.0 金属結合活性因子 ： metal binding
DEし 027 YMR021C
4 act ivator
04.05.01.0 車 4調整 Id子 ： transcriptional re
DEし 031 YAL021C
4 gulator
転写 RNA 3'末端 形成タンパク質： RNA 3^
DEし 033 YDR195W 04.05.05
04 .. TRANS -end formation protein
CRIPTION 04.05.01.0 遺伝子抑制タンパク質： silencing
DEし 049 Y0L06SC
4 protein
DNA依存性 RNA ポリメーラーゼ II
04.05.01.0
DEし 055 YBR279W 調節因子 ： DNA - directed RNA polym
4
erase 丄丄 regulator
DNA依存性 RNA ポリメーラーゼ II,
04.05.01.0 14.2 KD サブュニッ ト ： DNA- direc
DEし 058 YGL070C
1 ted RNA polymerase II, 14.2 KD s ubunit
04.05.01.0 鉄調節転写抑制因子 ： iron-regulat
DEし 059 YGL071W
4 ea transcriptional repressor
04.05.05.0 mRNA ディキヤッビング促進 ： stimu
DEL060 YGL222C
3 lat es mRNA decapping
04.05.01.0 転写活性因子 ： global transcripti
DEし 064 YHL025W
4 on act ivator
04.05.01.0 転写因子 （弱類似） ： weak similar
DEし 071 Yし R266C
4 l ty to transcript ion factors
[表 2- 4] TFIIFサブュニッ ト （転写ィニ シエーシヨ ン因子）， 30 kD ： T
DEL082 YPL129W
FI IF subuni t (transcription initiation ractor) , ύθ kD
Glc7 ポテンシャル調節サブ
DEし 015 YBL05SW ュ -ッ 卜 ： potential regulato ry subunit ror Glc
40S 小サブュニッ トリポソ一 蛋白合成 DEL044 YL 287C-A 05.01 ムタンノ ク ： 40S small subuni
05 .. PROTE t ribosomal prote in
IN SYNTHESI ミ トコン ドリアリボソームタ
S ンノ ク、 /J、サブ、ュ- ッ 卜 ： mito
DEL062 YG 084C 05.01
chondrial ribosomal protein s all subuni t
o o o o o o ， m
o
60S 大サブュニッ トリボソ o o o 一
DEL077 YLR344W o o o ムタンノヽク ： 60S large subuni o t ribosomal prote m
o
液胞 H— ATPァーゼ VI ドメイ ン 42 KD サブュニッ 卜 ： H+- A
DEL007 YKL080W
TPase VI omain 42 KD subun it, vacuolar
液胞 H— ATPァーゼ V0 ドメイン 36 KD サブュニッ ： H+-ATPa 蛋白フェイ DEL008 YLR447C
se V0 domain 36 KD subunit, ト （ホールデ
vacuolar
ィング、 修飾
後期促進因子成分 ： component 、 デスティネ
DEL011 YGL240 of the anaphase promoting c ——ンョ ン）
omplex
06 .. PR0TE
ATPァーゼ内膜ァセンブリータ IN FATE (fo
DEL013 YGR105W ンノヽク質： ATPase assembly in lding, modi
tegral membrane prote m fixation, d
クラ 卜ジ ン重鎖： clathrin hea est ination) DEL018 YGL206C 06.04
vy chain
H+- ATPァ一ゼァッセンブリ一
DEL020 YKL119C タンパク質： H+ - ATPase assemb ly prote in
内膜輸送タンパク質： Putative
06.04
DEL034 YDR414C transport protein of inner
06.07
membranes
[表 2-5] 液胞 ATPァ一ゼ アセンブリ一タ
DEし 040 YHR060W ンノ ク質： vacuolar ATPase asse mbly protein
ERタンパク質膜通過複合サブュニ
DEし 046 YLR292C 06.04 ッ 卜 ： ER prote in- trans lo cat ion
complex subuni t
2ュビキチン結合酵素 ： E2 ubiqui
DEし 047 YLR306W 06.07
t in - conjugat ing enzyme ヒ 卜 RANBPM NP_005484.1 (弱類似
DEし 061 YGL227W ) ； weak similarity to human R
ANBPM NP_005484.1
26Sプロテアソームサブュニッ ト
DEし 063 YGR270W
： 2DS proteasome subuni t 液胞 H+-ATPァーゼ VI ドメイ ン 54
DEし 000 YPR036W O O o 08.13 KD サブュニッ 卜： H+- ATPase VI o domain 54 KD subuni t; vacuolar o O VP51-54複合サブュニッ ト、酵母後 期ゴルジ体におけるタンパク質選
DEし 002 YDR027C 08.07 別に必須： subunit of VP51-54 c omplex, requirea ror protein s ort ing at the yeast late Golgi 液胞 H+ -輸送 ATPァーゼ V0 ドメ イン 13 KD サブュニッ ト ： H+- tr
DEし 006 YHR039C-A 08.13
ansport ing A iPase V0 domain 13 KD subunit, vacuolar
細胞内輸送
液胞 H+-輸送 ATPァーゼ VIドメイ
08 .. CEしし Uし
ン 42 KD サブュニッ 卜 ： H+- ATPas
AR TRANSPORT DEし 007 YKLOSOW 08.13
e Vi domain 42 KD suDunit, vac AND TRANSPO
uolar
RT MECHANISM
液胞 H十-輸送 ATPァーゼ V0 ドメ
S
イン 36 KD サブュニッ ト ： H— AT
DEし賴 YLR447C 08.13
Pase V0 domain 36 KD suouni t , vacuolar
クフスジン重鎖： c lathrin heavy
DEL018 YGL206C 08.19
chain
核 B奠 Lタンノヽク ： nuclear pore p
DEL021 YKR082W 08.01
rotein
ERタンパク質膜通過複合サブュ-
DEL046 YLR292C 08.99 ッ 卜 ： ER prote in-trans location
complex subunit
キネシン関連タンノ ク ： kinesin-
DEし 054 YBL063W 08.22
related protein
[表 2-6] Cu/Zn ォキシドジス 角學毒
DEL014 YJR104C 11.07 ムターゼ ： copper-zinc superox
11.07 .. det
l de dismutase
oxif ication
金属結合活性因子 ： metal bindi 角學毒 DEL027 YMR021C 11.01
ng activator
液胞 H+-ATPァーゼ VI ドメィ ン 54 KD サブュニッ ト： H+- ATPase
DEL000 YP 036W 13.01.01.03
VI domain 54 KD subuni t , vacu olar
液胞 H—輸送 ATPァーゼ V0 ドメ
YHR039C イン 13 KD サブュニッ 卜 ： H+ -
DEL006 13.01.01.03
-A ransportmg Ά TPase V0 domain 細胞内環境調 13 KD subunit, vacuolar 節/相互作用 液胞 H十-輸送 ATPァーゼ VI ドメイ 13 ■■ REGULA ン 42 KD サブュ-ッ ト ： H— ATPa
DEL007 YKL080W
TION OF 1 IN se VI domain 42 KD subunit, v TERACTION WI acuolar
TH CELLULAR 液胞 H—輸送 ATPァーゼ V0 ドメ ENVIRONMENT イン 36 KD サブュニッ 卜 ： H+- A
DEL008 Yし R447C 13.01.01.03
TPase V0 omain 36 KD subunit , vacuolar
鉄調節転写抑制因子 ： iron-regu
DEL059 YGし 071W 13.01.01.01 lated transcript lonal repress or
チロシンフォスファターゼ ： pro
DEL065 YIR026C 13.11.03.01
tein tyrosine phosphatase 双極性出芽サイ 卜選抜に関連 ： i
DEL001 YDL151C 14.04.03.01 nvol ved in bipolar bud site s e lection
Glc7p ポテンシャル調節サブュ
DEL015 YBし 058W 14.04.03.01 ニッ ト ： potential regulatory subunit ror Glc7p
Glc7 ポテンシャル調節サブュ
DEL021 YK 082W 14.04.03.05 ニッ ト ： potential regulatory 細胞フェイ ト
subunit ror Glc7p
14 .. CELL F
双極性出芽サイ ト選抜に関連 ： i ATE
DEL032 YDL151C 14.04.03.01 nvol ved in bipolar bud site s e lection
遣伝子抑制タンパク質 ： silenci
DEL049 YOし 068C 14.04.03.03
ng protein
ェクソサイ ト一シス， 仮性菌糸
YD 363W 分化調 ¾卩 ： regulator of exocyt
DEL057 14.04.03.01
-A osis and pseudohyphal di ere ntiation
[表 2-7]
Figure imgf000019_0001
[表 2-8] 67.04 液胞 Η+ -輸送 ATPァーゼ V0 ドメイ
.01.0 ン 36 KD サブュニッ ト： H+- ATPase
DEL008 YLR447C 2 VO domain 36 KD subuni t , vacuola
67.50 r
.22
ン 卜テン S 7"ーゼ ： Pantot
DEL016 YCR028C
henate permease
ERタンパク質膜通過複合サブュニッ
DEL046 YLR292C 卜 ： ER protein- trans location com plex subuni t
セリ ン/スレオニン タンパク質フ
DEし 053 YBL056W 98. ォスファタ一ゼ PP2C ser/thr pro tein pnosphatase PP2
DEL017 YDR149C 99.
A. thaliana仮説タンパク （弱類似）
DEし 024 YLR285W 99. weak similarity to A. thaliana hypothetical protein
S. tarentolaeのク ジプ卜ジーンタン パク質 G4 weak similar
DEL025 YLR311C 99.
l ty to S. tarentolae cryptogene p rote in G4
未分類蛋白
DEL029 YOR331C 99.
UNCLASSIFIED
DEし 030 YPR123C 99.
PROTEINS
DEし 035 YDR525W-A 99. PMP3/SNA1 (類似)
E. coli rfah-rfe遺伝子間の仮説タ ンパク質 55.3 kDa (類 © ： similari
DEL036 YDR539W 99. ty to E. coli hypothetical 55.3 k
Da protein in rf ah~rf e intergeni c region
大腸菌未解読遣伝子 （類似 ： simila
DEし 037 YDR540C 99.
ri ty to E. coli unknown gene
C. elegansドム- 3タンパク質（弱類似
DEし 039 YGL246C 99. ) weak similarity to C. elegans dom-j protein
[表 2-9]
Figure imgf000021_0001
[0015] さらに、以下の実施例にて試験した 12種類の化学物質のうち 7種類以上の化学物 質に感受性を示した遺伝子破壊株を機能カゝら分類すると、表 3のようになる。
[0016] 表 3.機能による分類
[表 3]
機能 遺伝子破
壊株数
代謝ーァミノ酸代謝 （01. 01 ) 2
代謝 C-化合物おょぴ炭水化物代謝 （01. 05) 1
脂質、 脂肪酸およびイソプロパノ ド代謝 （01
3
. 06)
細胞周期と D N Aプロセッシング- - D N Aプロ
2
セッシング （03. 01)
細胞周期と D N Aプロセッシング- -細胞周期（0
4
3. 03)
転写一 m R N A転写 （04. 05) 5
蛋白フェイ ト （フォールデイング、 修飾、 デス
1
ティネーシヨン） 一蛋白修飾 （06. 07)
蛋白フェイ ト （フォールデイング、 修飾、 デス
ティネーシヨン） 一蛋白複合体のアセンブル （0 4
6. 10)
細胞内輸送と輸送機構ー液胞輪送 (08. 13) 3
細胞内環境調節 Z相互作用ーィォ: 性ホメォス
3
タシス (13. 01)
細胞フェイ トー細胞分化（14. 04) 3
輸送促進一イオントランスポータ 一 (67. 04) 4
輸送促進一輪送機構 （67. 50) 4
未分類蛋白（99) 4 同じ遺伝子が重複する機能を有する場合は、重複してカウントした。特に、細胞内 輸送と輸送機構 -液胞輸送 (08.13)、細胞内環境調節 Z相互作用 -イオン性ホメォス タシス (13.01)、輸送促進一イオントランスポーター（67.04)、輸送促進一輸送調節（ 67.50)は重複が多かった。
特に、細胞内輸送と輸送機構 -液胞輸送 (08.13)、細胞内環境調節 Z相互作用- イオン性ホメォスタシス (13.01)、輸送促進一イオントランスポーター（67.04)、輸送促進 -輸送機構 (67.50)は遺伝子が重複している力 上位 10遺伝子のうち、 50%がこの カテゴリーに入ったため、本検討により化学物質の解毒には液胞が重要な役割を果 たすことが確認された。また、転写一 mRNA転写 (04.05)、細胞周期と DNA合成一細 胞周期（03.03)、細胞フェイト一細胞分化 (14.04)、細胞周期と DNA合成一 DNA合成 (03.01)、蛋白フェイト（フォールデイング、修飾、デスティネーション)—蛋白複合体の アセンブル (06.10)、代謝一アミノ酸生合成 (01.01)、代謝一 C-結合、炭水化物代謝（ 01.05)、脂質、脂肪酸、イソプロパノイド代謝 (01.06)も化学物質の応答に深く関与す ることがわ力つた。さらに、機能が知られていない遺伝子の有用性が確認された。 [0018] 本発明は酵母以外の微生物も用いることができる。ここに微生物は、例えばヒト、マ ウスその他の哺乳類由来の動物細胞および動物細胞の榭立株、これまでバイオアツ セィに用いられている魚類、線虫等の細胞、昆虫細胞、酵母等の真菌細胞、および 大腸菌等の細菌細胞の何れであっても良 、。そして公知のデータベース等を利用し て上記酵母において見出された機能を有する遺伝子に相当する遺伝子の破壊株を 公知の手法により作成すれば、本発明の方法に利用できる。特に、上記表 2 :機能に よる分類において「機能 (description) として記載している機能に相当する遺伝子が 破壊株における破壊遺伝子の対象とすることができる。
[0019] (2)選別した遺伝子破壊株の使用
特定の遺伝子を破壊することにより、微生物は化学物質に対して感受性または耐 性を示すことがある。
本発明において「遺伝子破壊株」には、一倍体遺伝子破壊株、ホモ接合二倍体遺 伝子破壊株およびへテロ接合二倍体遺伝子破壊株が含まれる。酵母細胞は一倍体 である α型細胞と a型細胞が接合して二倍体を形成することができる。ホモ接合二倍 体遺伝子破壊株は、 αと aで破壊された遺伝子が同一である株であり、他方へテロ接 合二倍体遺伝子破壊株は、 αもしくは aで破壊された遺伝子が異なる株およびひもし くは aの一方のみで遺伝子が破壊された株を指す。破壊される遺伝子は 1遺伝子に 限らず、先に挙げた遺伝子のうち複数の遺伝子が破壊されていてもよい。
[0020] 本発明は、化学物質に対する感受性が向上している遺伝子破壊株を選択し、化学 物質の検定に利用する。化学物質の存在は、遺伝子破壊株の化学物質に対する細 胞応答を指標として検定する。化学物質に対する細胞応答とは細胞の生死、および
Zまたは増殖能、呼吸量、酵素活性および Zまたは遺伝子発現の変化を示す。 ここに、「細胞の生死」は生細胞の割合や ATP量により、「増殖能」は細胞数の増加 割合により、「呼吸量」は酸素の消費量により、「酵素活性」は、指標細胞が本来有す る酵素活性の測定により、「遺伝子発現の変化」は RNA量または mRNA量の測定によ り、評価することができる。また、本発明では、特定の遺伝子発現の変化の測定として 、ノザン 'ブロッテイング法 (細胞の分子生物学 第 2版、教育社、 1990年発行、 189 一 191ページ)やレポーター 'ジーン'アツセィ法で測定する特定遺伝子の発現量測 定方法も利用できる。
なかでも細胞の生死、増殖能、呼吸量、特定の遺伝子の発現の変化をレポーター · ジーン'アツセィにより測定する方法力 操作が簡便なのでバイオアツセィに適してい る。レポーター'ジーン'アツセィとは、転写活性を中心とした遺伝子の機能を調べる ための、 目印となる特定の遺伝子活性を測定する手法であり、プロモーターアツセィ 法などが包含される。プロモーターアツセィ法とは、ある遺伝子のプロモーターのポリ ヌクレオチド配列にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連 結し、遺伝子の発現を間接的に計測する方法である（Barelle CJ, Manson CL, MacCallum DM, Odds Fし, Gow Na, Brown AJ.： GFP as a quantitative reporter of gene regulation in Candida albicans. Yeast 2004 Mar;21(4):333- 40)。
[0021] 細胞応答を指標とする本発明の化学物質検定に好適に使用できる遺伝子破壊株 は、次の遺伝子が破壊されている株である：
YPR036W、 YDL151C、 YDR027C, YGL026C、 YGR180C、 YHR026W、 YHR039C- A、 YKL080W, YLR447C, YDR127W, YDR150W、 YGL240W, YGR006W、 YGR105W、 YJR104C, YBL058W、 YCR028C、 YDR149C、 YGL206C、 YIL036W、 YKL119C、 YKR082W, YLR226W, YLR284C, YLR285W、 YLR311C、 YML112W, YMR021C, YOR221C, YOR331C、 YPR123C、 YAL021C, YDL151C、 YDR195W、 YDR414C, YDR525W- A、 YDR539W、 YDR540C、 YGL224C, YGL246C, YHR060W、 YJL204C, YLR282C, YLR287C, YLR287C- A、 YLR290C、 YLR292C, YLR306W、 YLR381W、 YOL068C、 YOR026W、 YPL018W、 YBL042C, YBL056W、 YBL063W、 YBR279W, YDR148C、 YDR363W- A、 YGL070C、 YGL071W, YGL222C, YGL227W, YGR084C 、 YGR270W, YHL025W、 YIR026C、 YJL188C, YJL192C, YJL211C, YKL037W, YLR234W, YLR266C、 YLR283W、 YLR307W, YLR312C、 YLR315W、 YLR320W、 YLR344W, YLR345W、 YLR354C、 YMR032W, YPL030W、 YPL129W、 YPR060C。
[0022] 化学物質に対する細胞応答として遺伝子発現の変化を選択し、その変化をレポ一 ター ·ジーン'アツセィにより測定する場合、レポーター ·ジーン'アツセィに利用できる プラスミドは WO03Z01872に記載されている。本発明の 1態様においては、 WOO 3/01872に記載されている酵母遺伝子のプロモーターを含むポリヌクレオチド配列 にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結したポリヌクレ ォチドを含むプラスミドを利用する。
好適に使用できる遺伝子破壊株と検定できる化学物質との好適な組み合わせは次 の通りである：
表 4.遺伝子破壊株と化学物質との対応
[表 4-1]
破壊されて 化学 化学物質の種類
し、る遺伝子 物質
の数
YPR036W 10 塩化メチル水銀 亜ヒ酸ナトリウム. 塩化第一ニッケル ニクロム酸カリウム トリ 二 ズ =クロライ 塩化第二水銀. 塩化 SDS. DMS〇
YDし 151C 9 亜ヒ酸ナトリウム. ニクロム酸カリウム ニルスズ =クロライド 塩化鉛. SDS, D SO, 塩化亜鉛
YDR027C 9 亜ヒ酸ナトリウム、 塩化第一ニッケル ニクロム酸カリウム.
塩化鉛. SDS, D SO, 塩化亜鉛
YGL026C 9 亜ヒ酸ナトリウム、 塩化第一ニッケル フエニルスズ=クロライド
酸銅 塩化鉛. SDS DM SO 塩化亜鉛
YGR180C 9 亜ヒ酸ナトリウム、 ニクロム酸カリウム トリフ ズ クロライド、 塩化第二水銀. 塩化鉛 SDS DivlSO 塩化亜鉛
YHR026W 9 塩化メチル水銀. 亜ヒ酸ナトリウム 塩化第一ニッケル. ニクロム酸カリウム. トリ 二 ルスズニクロライ 塩化第二水銀. 塩化鉛. D SO, 塩化亜鉛
YHR039C-A 9 塩化メチル水銀. 亜ヒ酸ナトリウム ニクロム酸カリウム. トリ ズニクロライド 塩化第二水銀. 塩化鉛 SDS DivlSO 塩化亜鉛
YKL080W 9 塩化メチル水銀. 亜ヒ酸ナトリウム 塩化第一ニッケル. トリ ズニクロライ 塩化第二水銀. 塩化鉛 SDS DivlSO 塩化亜鉛
YLR447C 9 亜ヒ酸ナトリウム. ニクロム酸カリウム ズ クロライド
.· 塩化第二水銀 塩化鉛 SDS. D SO. 塩化亜 §
YDR127W 8 トリ ズ= ライド . 塩化第二水銀. 硫酸銅 塩化 SD
S. DMSO . 塩化亜 iti
YDR150W 8 塩化メチル水銀 亜ヒ酸ナトリウム. ニクロム酸カリウム ズ クロライド.
塩化第二水銀 硫酸銅 化カリウム 塩化亜
YGL240W 8 トリ ズ クロ ^酸銅. 化力リウ ム SDS, DMSO, 塩化亜鉛
YGR006W 8 トリフエ ズ クロ 塩化第二水銀 硫酸銅. 化力リウ ム 塩化鉛 SDS,
YGR105W 8 ニクロム酸カリウム、 フ ズ クロライド、
塩化鉛. SDS, DMSO, 塩化亜鉛
YJR104C 8 亜ヒ酸ナトリウム、 ニクロム酸カリウム トリフ ズ クロライド、 塩化第二水銀. SDS. DMSO, 塩化亜鉛
YBL058W 7 亜ヒ酸ナトリウム トリ ズニクロライド. 塩化第二水銀. 硫酸銅 塩化鉛. Dlvl
SO. 塩化亜鉛
YCR028C 7 塩化メチル水銀. トリ ズニクロライド. 塩化第二水銀. ^酸銅. SDS DMSO
. 塩化亜
YDR149C 7 塩化メチル水銀. 亜ヒ酸ナトリウム ニクロム酸カリウム 塩化第二水銀. 化カリ 塩化鉛. 塩化亜
YGL206C 7 亜ヒ酸ナトリウム. 塩化第一ニッケル ニクロム酸カリウム 塩化第二水銀 S
DS, DMSO
[表 4- 2] YIL036W 7 塩化 水銀. 亜ヒ酸ナトリウム クロ 塩化第二水銀 硫酸 銅 塩化亜鉛
YKし 1 1 9C 7 亜ヒ酸ナトリウム トリ クロライド. 塩化第二水銀.
化鉛. 塩化亜鉛
YKR082W 7 ニクロム酸カリウム. トリ クロライド. 塩化第二水銀. 化カリウム 塩化 化亜鉛
YLR226W 7 塩化メチル水銀 ニクロム酸カリウム ニルスズ =クロライド 塩化第二水銀 硫 酸銅 塩化鉛 塩化亜鉛
YLR284C 7 卜 ズ =クロライド. 塩化第二水銀. 硫酸銅 塩化鉛 塩化亜 鉛
YLR285W 7 トリフエ ズ =クロ 硫酸銅 塩化鉛 . 〇 塩化 亜鉛
YLR31 1 C 7 トリフエ ズ=クロライド ^酸銅. 塩化鉛 塩化亜鉛
YML1 12W 7 亜ヒ酸ナトリウム、 ニクロム酸カリウム. フ 二 ルスズニクロライド. 塩化第二水銀.
YMR021 C 7 亜ヒ酸ナトリウム、 フ =
塩化亜鉛
YOR221 C 7 亜ヒ酸ナトリウム、 塩化第二水銀、 硫酸銅 . 塩化亜 鉛
YOR331 C 7 塩化第一ニッケル ニクロム酸カリウム トリ クロライド 塩化第二水銀.
塩化 ί' 塩化亜鉛
YPR1 23C 7 塩化メチル水銀. 亜ヒ酸ナトリウム 塩化第一ニッケル. トリフエニルス クロライ 塩化第二水銀 塩化亜鉛
YAL 021C 6 亜ヒ酸ナトリウム. ニクロム酸カリウム. トリ ズ =クロライド . 塩化第二水銀. 硫 酸銅 塩化鉛
YDし 151 C 6 塩化メチル水銀 亜ヒ酸ナトリウム. 塩化第二水銀. 硫酸銅 塩化
YDR1 95W 6 亜ヒ酸ナトリウム. ニクロム酸カリウム. トリ ズ クロライド 塩化第二水銀 シ アン化カリウム.
YDR4 14 C 6 ニクロム酸カリウム 卜 ズ =クロライド 塩化第二水銀 硫酸銅 塩 化亜鉛
YDR525W-A 6 ズ =クロ . 硫酸銅 塩化亜鉛
YDR539W 6 ズ =クロ . 硫醚銅 塩化亜鉛
YDR540C 6 トリ クロ 塩化第二水銀 硫酸銅. 塩化亜鉛
YGL224C 6 トリフエ =クロライド 硫酸銅. 化カリウム. 塩 化亜 Iti
YGL246C 6 トリフエニルスズ =クロライド 塩化鉛. 塩化亜鉛
YHR060W 6 塩化メチル水銀. トリ ズニクロライド. 塩化第二水銀. 塩化鉛 塩化 亜鉛
YJし 204C 6 トリ ズニクロライド 塩化第二水銀 硫酸銅. 塩化鉛 塩化亜鉛
YLR282C 6 トリフエニルスズニクロライド 塩化第二水銀 塩化鉛.
YLR287C 6 トリ =クロ 塩化第二水銀、 硫酸銅 〇. 塩化亜鉛
[表 4- 3] YLR287C-A 6 トリ 塩化第二水銀 硫酸銅. 塩化鉛
YLR290C 6 ズ = 塩化第二水銀、 硫酸銅 塩化鉛. 塩化亜 ti
YLR292C 6 塩化第二水銀 硫酸銅. 塩化鉛
YLR306W 6 塩化メチル水銀 ズ=クロライド 塩化第二水銀 硫酸銅 塩化 ti.
YLR381 W 6 ニルス =クロライ 塩化第二水銀 硫酸銅 塩化鉛. 塩化亜鉛
YOL 0 68 C 6 塩化メチル水銀 ニクロム酸カリウム ニルスズ =クロライド 塩化第二水銀 硫 酸銅 塩化
YOR026W 6 塩化第一ニッケル トリ ニルスズ =クロライド 塩化第二水銀 塩化 .
〇
YPL01 8W 6 ズ = ライド. 塩化第二水銀. 硫酸銅 化カリウム 塩化鉛.
YBし 042C 5 硫酸銅. 塩化鉛. 塩化亜鉛
YBL056W 5 塩化亜鉛
YBL063W 5 卜 ズ = ライド. 塩化第二水銀. 塩化 塩化亜鉛
YBR279W 5 塩化メチル水銀 ニクロム酸カリウム 塩化第二水銀
YDR148C 5 ニクロム酸カリウム. クロライ 塩化第二水銀. 硫酸銅. 塩化鉛
YDR363W-A 5 =クロ 塩化亜鉛
YGL070C 5 フエ =クロライド、 塩化第二水銀、 化カリウム、
YGL07 1 W 5 塩化第一 ニクロム酸カリウム. ズ二クロライド. 塩化第二水銀 塩化亜鉛
YGL222C 5 亜ヒ酸ナトリウム、 フエ =クロライド 硫酸銅 塩化亜鉛
YGL227W 5 塩化第二水銀 硫酸銅 シアン化カリウム. 塩化亜鉛
YGR084C 5 硫酸銅 塩化鉛 塩化亜 §
YGR270W 5 亜ヒ酸ナトリウム ニクロム酸カリウム. 硫酸銅 塩化亜鉛
YHL025W 5 亜ヒ酸ナトリウム トリ ズニクロライド
YIR026C 5 亜ヒ酸ナトリウム トリ ライド. 塩化鉛 塩化亜鉛
YJL188C 5 塩化第二水銀. 硫酸銅、 塩化鉛、
YJL1 92C 5 =クロ 塩化第二水銀 硫酸銅 塩化鉛. 〇
YJL21 1 C 5 塩化メチル水銀 卜 ズ=クロ 硫酸銅 塩化亜鉛
YKL037W 5 亜ヒ酸ナトリウム. 卜リフ ニルスズ = ライド 塩化第二水銀 塩化亜 iti
[表 4- 4]
YLR234W 5 塩化第一ニッケル 塩化第二水銀. 塩化 H
YLR266C 5 トリフエニルスズ =クロライド. 塩化第二水銀. 硫酸銅.
YLR283W 5 硫酸銅
YLR307W 5 卜リフエニルスズ =クロライド、 塩化第二水銀. 塩化鉛 塩化亜鉛
YLR31 2C 5 卜リフ ニルスズ：クロライド. 塩化第二水銀. 硫酸銅 塩化鉛 塩化亜
YLR31 5W 5 塩化メチル水銀 亜ヒ酸ナトリウム ニクロム酸カリウム. 卜リフ ニルスズ =クロライド.
シアン化カリウム
YLR320W 5 亜ヒ酸ナトリウム ニクロム酸カリウム トリフエニルスズ =クロライド シアン化カリウム
塩化亜
YLR344W 5 塩化第二水銀、 硫酸銅 塩化亜鉛
YLR345W 5 硫酸銅. 塩化鉛 塩化亜鉛
YLR354C 5 塩化第二水銀. 塩化 塩化亜鉛
5 ニクロム酸カリウム トリフエニルスズニクロライド. 塩化第二水銀. 硫酸銅. 塩化鉛
YPL030W 5 トリフ: ニルスズニクロライド 硫酸銅. シアン化カリウム.
YPL 12 9W 5 ニルスズ =クロ
YPR060C 5 塩化第一ニッケル. 塩化第二水銀. 塩化 H
[0024] (3)キット
本発明のキットには上記遺伝子破壊株の乾燥品、例えば凍結乾燥品、 L乾燥品ま たは凍結品を含む容器、培養培地等が含まれる。
培養培地としては、用いる遺伝子破壊株に適した組成を有する培地を用いる。
[0025] (4)組成物
本発明は別の態様として、被検試料中に化学物質が存在するか否かを検定するた めの、微生物の遺伝子破壊株を含む組成物を提供する。典型的には本発明組成物 は、上記遺伝子破壊株を含む培養培地である。
実施例
[0026] 以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
実施例 1
ケミカルプレートにおける生育阻害を指標とした遺伝子破壊株の化学物質感受性試 験
a)方法
酵母遺伝子破壊株は Yeast Deletion Homozygous Diploid (YKO Plate sets: Yeast Deletion Homozygous Diploid complete set, ResGen , Invitrogen)を使用した。この 遺伝子破壊株の親株は Saccharomyces crevisiae BY4743である。酵母の遺伝子破壊 株 6000種類の中から、化学物質感受性となりうる破壊株を複数選択する。実際の遺 伝子破壊株は遺伝子の種類によっては欠損すると生育出来ないものがある。そこで 、本実験の対象は Homozygous diploids (ホモ接合二倍体）として生育可能な遺伝子 破壊株約 4800種類を選択した。
[0027] 凍結保存された遺伝子破壊株を YPD培地 (酵母エキス 1%、ポリペプトン 2%、ダル コース 2%)にて 25°Cにおいて振盪培養することにより定常状態になるように増殖さ せた。定常状態の細胞を上記同じ培地で 10000倍希釈し、化学物質含有寒天培地 (ケミカルプレート）に 1. 5 Lずつ滴下し、 3日後にコロニーの形成を観察した。ケミ カルプレートは YPD寒天培地（酵母エキス 1%、ポリペプトン 2%、グルコース 2%、寒 天 2%)に最終濃度が表 5になるように化学物質を付加して作成した。
[0028] 表 5.ケミカルプレートによる遺伝子破壊株の感受性実験の化学物質
[表 5]
Figure imgf000030_0001
[0029] b)結果
約 4800種類の遺伝子破壊株につ 、て化学物質感受性の実験を行った。試験結 果から、各々の遺伝子破壊株について感受性を示したィ匕学物質数を算出して表 6に まとめた。ここで、感受性を示すとは、 2濃度以上で親株に対して生育阻害が見られ たものを指す。 2濃度以上とは、表 5に示すように化学物質それぞれについて異なる 3濃度にっ 、て生育を比較した場合、親株との生育と比較して 2つ以上の濃度にお いて生育が悪いもしくは生育しないことを意味する。また細胞の生育は、細胞の生死 および増殖能 (生育数もしくは生育速度)を指標として！ヽる。
表 6.化学物質について感受性を示す遺伝子破壊株数
[表 6]
Figure imgf000031_0001
[0030] 遺伝子破壊株約 4800のうち、 10種類の化学物質に感受性を示す遺伝子破壊株 数は 1、 9種類の化学物質に対しては 8、 8種類の化学物質に対しては 6、 7種類の化 学物質に対しては 16、 6種類の化学物質に対しては 21、 5種類の化学物質に対して は 32、 4種類の化学物質に対しては 61、 3種類の化学物質に対しては 59、 2種類の 化学物質に対しては 135、 1種類の化学物質の化学物質に対しては 348あり、化学 物質に全く感受性を示さないものは 4149であった。特に 5以上の化学物質に感受性 を示す遺伝子破壊株を表 7に示す。
[0031] 表 7. 5以上の化学物質に感受性を示した遺伝子破壊株
[表 7-1]
2濃度以上で生育 破壊されて 阻害を示した化学 破壊株名 いる遺伝子 物質の数
DEL000 YP 03BW 10
DEL001 YDL151C 9
DEL002 YD 027C 9
DEL003 YGL026C 9
DEL004 YGR1S0C 9
DEL005 YH 026W 9
DEL006 YH 039C-A 9
DEL007 Y L080W 9
DEL00S YL 447C 9
DEL009 YDR12TW 8
DEL010 YDR150W 8
DEL011 YGL240W 8
DEL012 YG 006W 8
DEL013 YG 105W 8
DEL014 YJ 104C 8
DEL015 YBL05SW 7
DEL016 YCR02SC 7
DEL017 YD 149C 7
DEL018 YGL206C 7
DEL019 YIL036W 7
DEL020 Y L119C 7
DEL021 82W 7
DEL022 YLR226W 7
DEL023 YL 2S4C 7
DEL024 YL 2S5W 7
DEL025 YL 311C 7
DEL026 YML112W 7
DEL027 YM 021C 7
DEL028 Y0 221C 7
DEL029 Y0 331C 7
DEL030 YP 123C 7
DEL031 YAL021C B
DEL032 YDL151C 6
DEL033 YDR195W 6
DEL034 YD 414C B
DEL035 YD 525W-A B
DEL036 YD 539W B
DEL037 YD 540C B
DEL03S YGL224C 6
DEL039 YGL246C 6
DEL040 YH 060W B
[表 7-2] DEL041 YJL204C B
DEL042 YLR282C 6
DEL043 YLR2STC 6
DEL044 YL 2S7C-A 6
DEL045 YL 290C B
DEL046 YL 292C B
DEL047 YL 30BW B
DEL04S YLR3S1W 6
DEL049 Y0L068C B
DEL050 Y0R026W B
DEL051 YPL018W B
DEL052 YBL042C 5
DEL053 YBL056W 5
DEL054 YBL063W 5
DEL055 YB 279W 5
DEL056 YD 148C 5
DEL057 YD 363W-A 5
DEL05S YGL070C 5
DEL059 YGL071W 5
DEL060 YGL222C 5
DEL061 YGL227W 5
DEL062 YG 084C 5
DEL0B3 YG 270W 5
DEL0B4 YHL025W 5
DEL065 YIR026C 5
DEL066 YJL188C 5
DEL067 YJL192C 5
DELOBS YJL211C 5
DEL069 Y L037W 5
DEL070 YLR234W 5
DEL071 YL 26BC 5
DEL072 YL 283W 5
DEL073 YL 307W 5
DEL074 YL 312C 5
DEL075 YL 315W 5
DEL076 YL 320W 5
DEL077 YLR344W 5
DEL078 YL 345W 5
DEL079 YL 354C 5
DEL080 YM 032W 5
DEL081 YPL030W 5
DEL082 YPL129W 5
DEL083 YPR060C 5 実施例 2
プロモーターアツセィを用いたホモ接合二倍体遺伝子破壊株の検出感度の検討 上記のとおり、検出可能な感度が低い場合、一般的には試料の濃縮等の前処理が 必要となり、特に高倍率の濃縮を行う場合にはその種類によっては対象とする化学 物質が濃縮操作中に失われる可能性がある。レポーター ·ジーン ·アツセィ法による 化学物質の検出感度は指標生物の感受性に依存する。指標生物を代えずに感受 性を上げる方法として、同じ種の中で感受性の高 ヽ系統を選択することが考えられる 。細胞膜の構成成分の遺伝子が欠失することにより化学物質の膜透過性が上がる、 または解毒機構に関する遺伝子が欠失することにより低濃度の化学物質に応答する 等、遺伝子が欠失することにより様々な理由で感受性が向上する可能性があると考 え、ここでは、異なる性質を示す系統として遺伝子破壊株に注目している。化学物質 力 Sどの様に生物に障害を与え、生物がどの様に応答するかはこれまで網羅的に解析 されていない。そこで、実験により多くの種類の化学物質に対して感受性を示す遺伝 子破壊株を選択することにより、遺伝子破壊株が指標生物として使える可能性がある
。酵母細胞には約 6000の遺伝子があり、殆どの遺伝子について遺伝子を欠失した株 が既に作成され市販されているので、これを対象にスクリーニングを行った。
方法
1)遺伝子破壊株の選択
遺伝子破壊株は破壊された遺伝子によっては生育速度が非常に遅くなることや生 育可能な培地成分が異なる場合がある。そこで、プロモーターアツセィ法のホスト細 胞を検討する本実験においては対照実験との比較しやすさを考慮して、実施例 1の 結果得られた遺伝子破壊株の中で、多くの化学物質に対する感受性を有し、かつ親 株と同様の操作で生育する数株を選択した。選択した遺伝子破壊株は、表 7におけ る DELOOO、 DEL002, DELOl l, DEL014, DEL016, DEL019, DEL022, D EL025の 8株である。さらに、対照として親株の BY4743を用いた。
2)形質転換体の作成
遺伝子破壊株の親株および選択した遺伝子破壊株各々のコンビテントセルを作成 した。このコンビテントセルを、作成したプロモーターアツセィ用の 2種類のプラスミド、 p- YBR072W(YBR072Wのプロモーターの下流に GFPを連結）および p- YPL171C ( YPL171Cのプロモーターの下流に GFPを連結）を用いて形質転換した。なお、 YPL171Cは NAPDHデヒドロゲナーゼ、 YBR072Wは熱ショック蛋白をコードする遺伝 子であり、何れもプロモーターアツセィを行うと複数種類の化学物質に対して応答を 示すものである。
詳細には、 P-YBR072Wを次の手法により調製した。
酵母遺伝子 YBR072Wのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（SCPD： The Promoter Database of baccnaromyces cerevisiae【こ飞 ) (目歹 号 1)を PCR【こより 増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェア である Oligo4.0- S, Sequencherlマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマ 一の塩基配列は、
GCAGTCAACGAGGAGCGAATCAG (配列番号 2)
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
GTTAATTTGTTTAGTTTGTTTG (配列番号 3)
とした。 PCRはテンプレートとして酵母の染色体（Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat.40802, Reserch Genetics, In ）を用い、試薬は市販のキット（KOD DNA
Polymerase ;コード KOD- 101、 Toyobo)を使用した。
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製される YEp型シャトルベクターであ る pYES2 (pYES2, Cat no:V825— 20, Invitrogen Corporation, USA) (R.W.オールド、 S.B.プリムローズ遺伝子操作の原理原書第 5版，培風館， pp.234-263, 2000) )を用 いた。また、マーカータンパク質 GFPをコードするポリヌクレオチドはベクター pQBI 63 (Cat no.54-0082,和光純薬工業 (株)）の GFPの部分 (配列番号 4)を用いた。まず、 p YES2の多重クロー-ング部位（multiple cloning site)の中に GFPのポリヌクレオチド を挿入したベクターを作成した。次いで、 pYES2の GAL1プロモーターの部分を酵母 遺伝子である YBR072Wのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドと置換し、 目的と するプラスミドベクターを得た。 GFPおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチド の挿入操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
次に、このプラスミドベクターで酵母 Saccharomyces cerevisiae BY4743 (YKO Plate sets: Yeast Deletion Homozygous Diploid complete set, ResGen , Invitrogen)を形 質転換した。形質転換の手順を以下に示す。 1)酵母細胞 Saccharomyces cerevisiae BY4743を YPD培地 200mlにて OD660が 0. 5 になるまで振とう培養する。
2)集菌して 5mlの TE-bufferに懸濁する。
3) 2.5Mのリチウムァセティト 250 μ Lを添加する。
4) 300 μ 1ずつ分注し 10 μ 1の上記プラスミドベクターを添カ卩し、 30°C30分培養する。
5) 700 μ 1の 5O%PEG4000を添カ卩し、 30°C60分振とう培養する。
6)ヒートショック (42°C、 5分)後、急冷する。
7) 1Mソルビトールで 2回洗浄する。
8)最小栄養培地 (SD培地に必要なアミノ酸 (ヒスチジン、ロイシン)を加えたもの）で作 成した寒天プレートに播種する。
[0035] 开質転換の確認は選択培地（SD培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919- 15) +グルコース +アミノ酸（ヒスチジン、ロイシン）により行った。選択培 地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
[0036] P-YPL171Cは次のようにして調製した。
酵母遺伝子 YPL171Cのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（SCPD : The Promoter Database of baccnaromyces cerevisiae【こ飞 ) (目 歹 号 5)を PCR【こより 増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェア である Oligo4.0- S, Sequencherlマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマ 一の塩基配列は、
ACGCCCCTTCCTTTTTCCCTTTC (；配列番号 6；)
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
CTTCTAAATTTAAACTTCGCTA (配列番号 7)
とした。 PCRはテンプレートとして酵母の染色体（Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat.40802, Reserch Genetics, In ）を用い、試薬は市販のキット（KOD DNA Polymerase ;コード KOD- 101、 Toyobo)を使用した。
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製される YEp型シャトルベクターであ る pYES2 (pYES2, Cat no:V825— 20, Invitrogen Corporation, USA) (R.W.オールド、 S.B.プリムローズ遺伝子操作の原理原書第 5版，培風館， pp.234-263, 2000) )を用 いた。また、マーカータンパク質 GFPをコードするポリヌクレオチドはベクター pQBI 63 (Cat no.54-0082,和光純薬工業 (株)）の GFPの部分 (配列番号 4)を用いた。まず、 p YES2の多重クロー-ング部位（multiple cloning site)の中に GFPのポリヌクレオチド を挿入したベクターを作成した。次いで、 pYES2の GAL1プロモーターの部分を酵母 遺伝子である YPL171Cのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドと置換し、 目的と するプラスミドベクターを得た。 GFPおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチド の挿入操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
[0037] 次に、このプラスミドベクターで酵母 Saccharomyces cerevisiae BY4743 (YKO Plate sets: Yeast Deletion Homozygous Diploid complete set, ResGen , Invitrogen)を形 質転換した。形質転換の手順を以下に示す。
1)酵母細胞 Saccharomyces cerevisiae BY4743を YPD培地 200mlにて OD660が 0. 5 になるまで振とう培養する。
2)集菌して 5mlの TE-bufferに懸濁する。
3) 2.5Mのリチウムァセティト 250 μ Lを添加する。
4) 300 μ 1ずつ分注し 10 μ 1の上記プラスミドベクターを添カ卩し、 30°C30分培養する。
5) 700 μ 1の 5O%PEG4000を添カ卩し、 30°C60分振とう培養する。
6)ヒートショック (42°C、 5分)後、急冷する。
7) 1Mソルビトールで 2回洗浄する。
8)最小栄養培地 (SD培地に必要なアミノ酸 (ヒスチジン、ロイシン)を加えたもの）で作 成した寒天プレートに播種する。
[0038] 开質転換の確認は選択培地（SD培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919- 15) +グルコース +アミノ酸（ヒスチジン、ロイシン）により行った。選択培 地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄養要求性を確認した。
[0039] 3)化学物質感受性試験
得られた形質転換体を SD培地 (ヒスチジン、ロイシン）にて 25°Cにおいて振盪培養 することにより定常状態になるように増殖させた。定常状態の形質転換体を上記同じ 培地で 500倍希釈して 25°C、 15時間振盪培養を行 、対数増殖期として 600nmの 吸光度が 0. 2から 0. 5であることを確認した後、異なる濃度の化学物質を負荷した。 化学物質負荷後、 4時間培養した細胞の蛍光をフローサイトメーター（FITCフィルタ 一， EPICS XL-MCL, Bechmancoulter)を用いて計測し、マーカー遺伝子である GFP (green fluorescence protein)の発現量とした。フローサイトメーターにより 1測定で 1万 個の細胞の蛍光強度を測定し、すべての細胞の蛍光強度の平均値を求め測定値と した。同様に計測したィ匕学物質を負荷しない細胞の蛍光強度を求めて、蛍光強度比 として示した。
4)結果
遺伝子破壊株 DEL000、 DEL002, DEL011, DEL014, DEL016, DEL019 、 DEL022、 DEL025 (表 7)をホスト細胞とした場合のプロモーターアツセィ法の検 出感度を検討した。負荷する化学物質は BY4743をホストとした場合に応答を示す、 メタ亜ヒ酸ナトリウム、塩ィ匕カドミウム、ベンチォカーブおよび塩ィ匕水銀 (II)を選択して 用いた。化学物質の希釈系列を作成して負荷試験を行った結果を図 1から 5に示す 図 1は、遺伝子破壊株 DEL011が親株の 1/3の濃度にぉ 、てメタ亜ヒ酸ナトリウム に応答したことを示して 、る。
図 2は、遺伝子破壊株 DEL011が親株の 1/10の濃度、遺伝子破壊株 DEL014 力 S1Z3000の濃度、遺伝子破壊株 DEL016が 1Z3の濃度においてメタ亜ヒ酸ナト リウムに応答したことを示して 、る。
図 3は、遺伝子破壊株 DEL002が親株の 1/3の濃度、遺伝子破壊株 DEL011が 1Z3の濃度、 DEL016が 1Z3の濃度、 DEL019025が 1/3の濃度、遺伝子破壊 株 DELが 1Z3の濃度において塩ィ匕カドミウムに応答したことを示している。
図 4は、遺伝子破壊株 DEL000が親株の 1/3の濃度、遺伝子破壊株 DEL019が 1Z100の濃度、 DEL022が 1Z10の濃度、遺伝子破壊株 DEL025が 1/3の濃度 にお 、てベンチォカーブに応答したことを示して 、る。
図 5は、遺伝子破壊株 DEL011が親株の 1/10の濃度、遺伝子破壊株 DEL016 力 S 1Z3の濃度にぉ 、て塩ィ匕第二水銀に応答したことを示して 、る。
このように、 DEL000、 DEL002, DEL011, DEL014, DEL016, DEL019, D EL022および DEL025は、親株である BY4743より化学物質に対する応答性が 3倍 力も 1000倍高いことが確認された。特に、 DEL0014は親株の検出可能な濃度の 1/ 1000の濃度においても BY4743と比べ有為な差がみられた（図 2)。
[0041] 実施例 3
プロモーターアツセィを用いたホモ接合およびへテロ接合二倍体遺伝子破壊株の検 出感度の検討
方法
1)遺伝子破壊株の作成
a— 1)遺伝子破壊株形質転換カセット作成
遺伝子破壊株形質転換カセット作成のため、化学物質感受性を有する遺伝子:表 7における YPR036W(DELOOO)、 YDL151C (DELOOl)、 YGL026C (DEL003)、 YHR039C-A (DEL006)、 YKL080W(DELOO7)、 YLR447C (DEL008)、
YGR006W(DELO12)、 YGR105W(DRLO13)、 YJR104C (DELO14)、 YGL206C ( DEL018)、 YIL036W(DELO19)、 YKL119C (DEL020)、 YLR226W(DEL022)、 YLR311C (DEL025)を選択し、それぞれの遺伝子をカナマイシン耐性などの形質 転換マーカーと置き換えた。 PCR増幅を行うためのプライマーとしては、それぞれの ORFにおける N末端側（ORF(upper))および C末端側 (ORF(lower))を用いた。プライ マーの ORFとの相同配列（ORF(upper)および ORF(lower))の長さは 45または 50bpと した。
遺伝子破壊株形質転換カセット
ORF (upper) Γ 形質転換マーカー 1 ORF ( l ower) ]
(約 1 kb ) これらのプライマーを用いて形質転換マーカーの遺伝子配列を含むプラスミドをテ ンプレートとして PCR反応を行 ヽ電気泳動した結果、全ての遺伝子のプライマーにお V、て約 lkbの均一なバンドが確認された。これら PCR生成物を遺伝子破壊株形質転 換カセットとした。
[0042] a— 2)コンビテント ·セルの作成および形質転換
酵母遺伝子破壊株を作成する株は W303 a接合型 ATCC200903 (MATa ade2- 1 trpl-1 leu2-3 leu2- 112 his3- 11 his3- 15 ura3- 1 canl- 100)と W303 α接合型 ATCC201238 (MAT a ade2- 1 trpl-1 leu2- 3 leu2- 112 his3- 11 his3- 15 ura3- 1 canl-100)を用いた。 W303a接合型および W303 α接合型のコンビテント'セルを作 成し、先に調製した遺伝子破壊株形質転換カセットで形質転換を行った。コンビテン ト 'セルの作成および形質転換は市販のキット（S. easyComp™ Transformation Kit ： Invitrogen)を用！/、 7こ。
[0043] a— 3)形質転換の確認
形質転換の確認は PCRを用いた。ターゲットとした遺伝子のプロモーター領域内に アッパープライマー、形質転換マーカー内にロウワープライマーを設定し、 PCRを行 つた。この結果、 ORF部位が形質転換マーカーで置換され遺伝子破壊がなされてい るとプライマーに挟まれた部位が増幅され、遺伝子が破壊されて ヽな ヽと増幅されな いことから確認できた。
[0044] b)ホモ接合二倍体、ヘテロ接合二倍体の作成
Saccharomyces crevisiae aおよび αの接合型の単相体を混合培養することにより a / a型の 2倍体を作成することができる。
同一の遺伝子にっ 、て遺伝子破壊操作を行った W303 a接合型 (ATCC200903) と W303 a接合型 (ATCC201238)を、接合操作 (酵母遺伝子実験マニュアル：丸善 株式会社 p83- 92)により接合を行い Homozygous diploids (ホモ接合二倍体）を作成 した。また、 W303 a接合型と遺伝子破壊を行わない W303 α接合型の接合を同様 の操作で行い Heterozygous diploids (ヘテロ接合二倍体）を作成した。
この様な操作により表 7における DEL000、 DEL001, DEL003, DEL006, DE L007, DEL008, DEL012, DEL013, DEL014, DEL018, DEL019, DEL0 20、 DEL022、 DEL025のホモ接合二倍体を作成した。また、 DEL006、 DEL014 および DEL022と遺伝子非破壊株を接合させたヘテロ接合二倍体 (以下、 DEL00 6ヘテロ接合二倍体、 DEL014ヘテロ接合二倍体、 DEL022ヘテロ接合二倍体と記 述）、さらに DEL000と DEL014を接合させたヘテロ接合二倍体（以下、 DEL000Z 014ヘテロ接合二倍体と記述）を作成した。
[0045] c)プロモーターアツセィ形質転換体の作成 遺伝子破壊株の親株である W303 ATCC201239 (MATa/MAT a leu2- 3/leu2- 3 Ieu2-112/leu2-112 trpl- 1/trpl- 1 ura3- l/ura3- 1 his3- l l/his3- 11 his3- 15/his3- 15 ade2-l/ade2-l canl- 100/canl- 100)および作成した遺伝子破壊株各々のコンビテ ントセルを作成した。このコンビテントセルを、作成したプロモーターアツセィ用の 2種 類のプラスミド、 p- YBR072W(YBR072Wのプロモーターの下流に GFPを連結）および P-YPL171 C (YPL 171 Cのプロモーターの下流に GFPを連結）を用 、て形質転換した 詳細には、 P-YBR072Wを次の手法により調製した。
酵母遺伝子 YBR072Wのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（SCPD： The Promoter Database of baccharomyces cerevisiaeiこて ^r^ (酉 c歹 [J番号丄) Pし R【こ り 増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェア である Oligo4.0- S, Sequencherlマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマ 一の塩基配列は、
GCAGTCAACGAGGAGCGAATCAG (配列番号 2)
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
GTTAATTTGTTTAGTTTGTTTG (配列番号 3)
とした。 PCRはテンプレートとして酵母の染色体（Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat.40802, Reserch Genetics, In ）を用い、試薬は市販のキット（KOD DNA
Polymerase ;コード KOD- 101、 Toyobo)を使用した。
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製される YEp型シャトルベクターであ る pYES2 (pYES2, Cat no:V825— 20, Invitrogen Corporation, USA) (R.W.オールド、 S.B.プリムローズ遺伝子操作の原理原書第 5版，培風館， pp.234-263, 2000) )を用 いた。また、マーカータンパク質 GFPをコードするポリヌクレオチドはベクター pQBI 63 (Cat no.54-0082,和光純薬工業 (株)）の GFPの部分 (配列番号 4)を用いた。まず、 p YES2の多重クロー-ング部位（multiple cloning site)の中に GFPのポリヌクレオチド を挿入したベクターを作成した。次いで、 pYES2の GAL1プロモーターの部分を酵母 遺伝子である YBR072Wのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドと置換し、 目的と するプラスミドベクターを得た。 GFPおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチド の挿入操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
次に、このプラスミドベクターで親株もしくは遺伝子破壊株を形質転換した。形質転 換の手順を以下に示す。
1)酵母細胞 Saccharomyces cerevisiae W303を YPD培地 200mlにて OD660が 0. 5に なるまで振とう培養する。
2)集菌して 5mlの TE-bufferに懸濁する。
3) 2.5Mのリチウムァセティト 250 μ Lを添加する。
4) 300 μ 1ずつ分注し 10 μ 1の上記プラスミドベクターを添カ卩し、 30°C30分培養する。
5) 700 μ 1の 5O%PEG4000を添カ卩し、 30°C60分振とう培養する。
6)ヒートショック (42°C、 5分)後、急冷する。
7) 1Mソルビトールで 2回洗浄する。
8)最小栄養培地（SD培地に必要なアミノ酸 (アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、口 イシン）を加えたもの）で作成した寒天プレートに播種する。
开質転換の確認は選択培地（SD培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919- 15) +グルコース +アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、口イシ ン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄 養要求性を確認した。
P-YPL171Cは次のようにして調製した。
酵母遺伝子 YPL171Cのプロモーター配列を含むポリヌクレオチド（SCPD : The Promoter Database of saccharomyces cerevisiaeiこて ^r^ (酉 c歹 [J番号 ό) Pし R【こ り 増幅するためのプライマーを作成した。プライマーはプライマー設計用のソフトウェア である Oligo4.0- S, Sequencherlマッキントッシュ版を用いて設計し、アッパープライマ 一の塩基配列は、
ACGCCCCTTCCTTTTTCCCTTTC (；配列番号 6；)
であり、ロウワープライマーの塩基配列は、
CTTCTAAATTTAAACTTCGCTA (配列番号 7)
とした。 PCRはテンプレートとして酵母の染色体（Saccharomyces cerevisiae S288C, Cat.40802, Reserch Genetics, In ）を用い、試薬は市販のキット（KOD DNA Polymerase ;コード KOD- 101、 Toyobo)を使用した。
使用するベクターは大腸菌と酵母の両方で複製される YEp型シャトルベクターであ る pYES2 (pYES2, Cat no:V825— 20, Invitrogen Corporation, USA) (R.W.オールド、 S.B.プリムローズ遺伝子操作の原理原書第 5版，培風館， pp.234-263, 2000) )を用 いた。また、マーカータンパク質 GFPをコードするポリヌクレオチドはベクター pQBI 63 (Cat no.54-0082,和光純薬工業 (株)）の GFPの部分 (配列番号 4)を用いた。まず、 p YES2の多重クロー-ング部位（multiple cloning site)の中に GFPのポリヌクレオチド を挿入したベクターを作成した。次いで、 pYES2の GAL1プロモーターの部分を酵母 遺伝子である YPL171Cのプロモーター配列を含むポリヌクレオチドと置換し、 目的と するプラスミドベクターを得た。 GFPおよびプロモーター配列を含むポリヌクレオチド の挿入操作は、適当な制限酵素を選択して行った。
次に、このプラスミドベクターで親株もしくは遺伝子破壊株を形質転換した。形質転 換の手順を以下に示す。
1)酵母細胞 Saccharomyces cerevisiae W303を YPD培地 200mlにて OD660が 0. 5に なるまで振とう培養する。
2)集菌して 5mlの TE-bufferに懸濁する。
3) 2.5Mのリチウムァセティト 250 μ Lを添加する。
4) 300 μ 1ずつ分注し 10 μ 1の上記プラスミドベクターを添カ卩し、 30°C30分培養する。
5) 700 μ 1の 5O%PEG4000を添カ卩し、 30°C60分振とう培養する。
6)ヒートショック (42°C、 5分)後、急冷する。
7) 1Mソルビトールで 2回洗浄する。
8)最小栄養培地（SD培地に必要なアミノ酸 (アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、口 イシン）を加えたもの）で作成した寒天プレートに播種する。
开質転換の確認は選択培地（SD培地（Yeast nitrogen base without amino acids (Difco 0919- 15) +グルコース +アミノ酸（アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、口イシ ン）により行った。選択培地の寒天プレートに生育したコロニーはさらに、アミノ酸の栄 養要求性を確認した。
2)化学物質感受性試験 得られたプロモーターアツセィ形質転換体を SD培地 (アデニン、ヒスチジン、トリブト ファン、ロイシン）にて 25°Cにおいて振盪培養することにより定常状態になるように増 殖させた。定常状態の形質転換体を上記同じ培地で 500倍希釈して 25°C、 15時間 振盪培養を行い対数増殖期として 600nmの吸光度が 0. 2から 0. 5であることを確認 した後、異なる濃度の化学物質を負荷した。化学物質負荷後、 4時間培養した細胞 の蛍光をフローサイトメーター（FITCフィルター， EPICS XL-MCL, Bechmancoulter) を用いて計測し、マーカー遺伝子である GFP (green fluorescence protein)の発現量 とした。フローサイトメーターにより 1測定で 1万個の細胞の蛍光強度を測定し、すべ ての細胞の蛍光強度の平均値を求め測定値とした。同様に計測した化学物質を負 荷しな 、細胞の蛍光強度を求めて、蛍光強度の差として示した。
結果
遺伝子破壊株 DEL000、 DEL001、 DEL003、 DEL006、 DEL007、 DEL008 、 DEL012, DEL013, DEL014, DEL018, DEL019, DEL020, DEL022, D EL025 (表 7)のホモ接合二倍体をホスト細胞とした場合のプロモーターアツセィ法の 検出感度を検討した。さら〖こ DEL006、 DEL014および DEL022と遺伝子非破壊 株のへテロ接合二倍体、また DELOOOと DEL014のへテロ接合二倍体をホスト細胞 とした場合のプロモーターアツセィ法の検出感度を検討した。負荷する化学物質は、 プラスミド p- YPL171Cを用いたプロモーターアツセィ法には W303をホストとした場合 に応答を示すメタ亜ヒ酸ナトリウムおよびチウラム、 P-YBR072Wにはベンチォカーブ を選択して用いた。化学物質の希釈系列を作成して負荷試験を行った結果を図 6か ら図 11に示す。
図 6 : DEL003、 DEL006, DEL008、 DEL014、 DEL019と DEL022は同濃度 の化学物質負荷により遺伝子非破壊株より同等もしくはそれ以上の蛍光強度を示し た。遺伝子破壊株は何れもホモ接合二倍体である。
図 7 : DELOOOホモ接合二倍体、 DEL014ヘテロ接合二倍体、 DEL014のホモ接 合二倍体および DEL000Z014ヘテロ接合二倍体は同濃度の化学物質負荷により 遺伝子非破壊株より同等もしくはそれ以上の蛍光強度を示した。
図 8 : DEL001, DEL006, DEL007, DEL018, DEL019, DEL020, DEL02 2と DEL025は同濃度の化学物質負荷により遺伝子非破壊株より同等もしくはそれ 以上の蛍光強度を示した。遺伝子破壊株は何れもホモ接合二倍体である。
図 9 : 同濃度の化学物質負荷により遺伝子非破壊株より同等もしくはそれ以上の蛍 光強度を示した。
図 10 : DEL006, DEL007, DEL012, DEL013, DEL020, DEL022と DELO
25は同濃度の化学物質負荷により遺伝子非破壊株より同等もしくはそれ以上の蛍光 強度を示した。遺伝子破壊株は何れもホモ接合二倍体である。
図 11： 同濃度の化学物質負荷により遺伝子非破壊株より強い蛍光強度を示した。 産業上の利用可能性
ケミカルプレートによる化学物質感受性試験の結果カゝら遺伝子破壊株を選択し、実 際にこれをホスト細胞として化学物質応答遺伝子組換え体細胞を作成し、化学物質 応答性を測定した。その結果、化学物質によっては約 1000倍の感受性が得られた。 このことから、この手法を用いることにより実用の場面で必要な感度を有するホスト細 胞の開発の可能性が確認された。
今回のホスト細胞の検討は、化学物質全般に感受性を示す遺伝子破壊株を用い た力 レポーター'ジーン'アツセィ法に用いる遺伝子およびターゲットとする化学物 質によっては、特定の化学物質に感受性を有する方が有利な場合も考えられる。

Claims

請求の範囲
[1] 被検試料中に化学物質が存在するか否かを検定するための方法であって、該被検 試料の存在下に微生物の遺伝子破壊株を培養し、その化学物質に対する遺伝子破 壊株の細胞応答を指標に用いることを特徴とする方法。
[2] 化学物質に対する遺伝子破壊株の細胞応答が、細胞の生死、および Zまたは増 殖能、呼吸量、酵素活性および Zまたは遺伝子発現の変化である請求項 1記載の方 法。
[3] 遺伝子発現の変化が、 RNA量または mRNA量の変化である請求項 2記載の方法。
[4] 遺伝子発現の変化をレポーター ·ジーン'アツセィにより測定する請求項 2記載の方 法。
[5] 微生物が酵母である、請求項 1から 4までのいずれか記載の方法。
[6] 破壊される遺伝子が、公的データベース: MIPSの分類に従い、
代謝 (01)のアミノ酸代謝 (01.01)、窒素および硫黄代謝 (01.02)、ヌクレオチド代謝 (01.03)、リン酸代謝 (01.04)、 C-ィ匕合物および炭水化物代謝 (01.05)、脂質、脂肪 酸およびイソプロパノイド代謝 (01.06)、ビタミン、コファクターおよび補欠分子族の代 謝 (01.07) ;
03.03)；
転写（04)の mRNA転写（04.05)、 RNA輸送（04.07)；
蛋白合成 (05)のリボゾーム生合成 (05.01)、翻訳制御（05.07)；
蛋白フ イト（06)の蛋白ターゲッティング、局在、転位（06.04)、蛋白修飾（06.07)、 蛋白複合体のアセンブル (06.10)、蛋白分解的崩壊 (06.13)；
細胞内輸送と輸送機構 (08)の核輸送 (08.01)、小胞輸送（ゴルジネットワーク他 .）（
08.07)、液胞輸送 (08.13)、細胞移入 (08.19)、細胞骨格輸送 (08.22)、他の細胞内 輸送活性 (08.99) ;
細胞レスキュー，防御と病原性（11)のストレス応答（11.01)、解毒（11.07)； 細胞内環境調節 Z相互作用（13)のイオン性ホメォスタシス（13.01)、細胞感受性と 応答（13.11) ; 細胞フェイト（14)の細胞成長 I形態形成（14.01)、細胞分化（14.04)；
細胞組織の制御（30)の細胞壁 (30.01)、細胞骨格 (30.04)、核 (30.10)、ミトコンドリ ァ（30.16)；
輸送促進（67)のイオントランスポーター（67.04)、ビタミン/コファクタートランスポー ター（67.21)、輸送機構 (67.50)、他の輸送促進 (67.99)；
未分類 (98)；および Zまたは
未分類蛋白（99)に分類される、請求項 5記載の方法。
破壊される遺伝子が液胞に関与して ヽる、請求項 6記載の方法。
破壊される代謝（01)遺伝子力YGL026C、 YGR180C、 YDR127W, YCR028C、 YLR284C, YOR221C, YAL021C, YGL224C, YBL042C, YDR148C、 YHL025W、 YLR307W、 YLR345W、 YLR354C、 YPL129W、 YPR060Cである請求項 6記載の方法 破壊される細胞周期と DNAプロセッシング (03)遺伝子力YGR180C、 YDR150W、 YGL240W, YBL058W、 YIL036W、 YLR226W, YLR381W、 YOR026W、 YPL018W、 YBL063W、 YDR363W- A、 YIR026C、 YLR234W, YMR032W, YPL129Wである請求 項 6記載の方法。
破壊される転写 (04)遺伝子力 SYGR006W、 YIL036W、 YKR082W, YLR226W, YML112W, YMR021C, YAL021C、 YDR195W、 YOL068C、 YBR279W, YGL070C, YGL071W, YGL222C, YHL025W、 YLR266C、 YPL129Wである請求項 6記載の方法 破壊される蛋白合成 (05)遺伝子力YBL058W、 YLR287C- A、 YGR084C、 YLR344W である請求項 6記載の方法。
破壊される蛋白フェイト (06)遺伝子力YKL080W、 YLR447C, YGL240W, YGR105W 、 YGL206C、 YKL119C、 YDR414C, YHR060W、 YLR292C, YLR306W、 YGL227W, YGR270Wである請求項 6記載の方法。
破壊される細胞内輸送と輸送機構 (08)遺伝子が YPR036W、 YDR027C, YHR039C、 YKL080W、 YLR447C, YGL206C、 YKR082W, YLR292C, YBL063Wである請求項 6 記載の方法。 破壊される解毒 (11)遺伝子が YJR104C、 YMR021Cである請求項 6記載の方法。 破壊される細胞内調節 Z相互作用 (13)遺伝子が YPR036W、 YHR039C-B、 YKL080W、 YLR447C, YGL071W、 YIR026Cである請求項 6記載の方法。
破壊される細胞フェイト (14)遺伝子が YDL151C、 YBL058W、 YKR082W, YDL151C 、 YOL068C、 YDR363W- A、 YHL025W、 YIR026C、 YLR307W, YMR032W,
YPL129Wである請求項 6記載の方法。
破壊される細胞組織の制御 (30)遺伝子力YDR027C、 YDR414C, YLR381W、 YGR084C、 YMR032Wである請求項 6記載の方法。
破壊される輸送促進 (67)遺伝子が YPR036W、 YHR026W、 YHR039C、 YKL080W、 YLR447C、 YCR028C、 YLR292Cである請求項 6記載の方法。
破壊される未分類 (98)遺伝子が YBL056Wである請求項 6記載の方法。
破壊される未分類蛋白 (99)遺伝子力YDR149C、 YLR285W、 YLR311C、 YOR331C、 YPR123C、 YDR525W- A、 YDR539W、 YDR540C、 YGL246C, YJL204C, YLR282C, YLR287C, YLR290C、 YJL188C, YJL192C, YJL211C, YKL037W, YLR283W、 YLR312C、 YLR315W、 YLR320W、 YPL030Wである請求項 6記載の方法。
被検試料中に化学物質が存在するか否かを検定するために使用される、微生物の 遺伝子破壊株を含むキット。
被検試料中に化学物質が存在するか否かを検定するための、微生物の遺伝子破 壊株を含む組成物。
被検試料中に化学物質が存在するか否かを検定するための、微生物の遺伝子破 壊株の使用。
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