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WO2005045400A1 - Verfahren und vorrichtungen zur untersuchung eines deformierbaren objekts - Google Patents

Verfahren und vorrichtungen zur untersuchung eines deformierbaren objekts Download PDF

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WO2005045400A1
WO2005045400A1 PCT/EP2004/012741 EP2004012741W WO2005045400A1 WO 2005045400 A1 WO2005045400 A1 WO 2005045400A1 EP 2004012741 W EP2004012741 W EP 2004012741W WO 2005045400 A1 WO2005045400 A1 WO 2005045400A1
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WO
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field
deformation
positioning
cell
cells
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PCT/EP2004/012741
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French (fr)
Inventor
Thomas Schnelle
Torsten Müller
André HÖMKE
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Revvity Cellular Technologies GmbH
Original Assignee
Evotec Technologies GmbH
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Publication date
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Priority to EP04797789A priority patent/EP1682868A1/de
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    • G01N2015/1497—Particle shape

Definitions

  • the invention relates to methods for examining a deformable object suspended in a liquid, in particular for examining deformation properties of biological particles, such as biological cells, with the features of the preamble of claim 1.
  • the invention also relates to devices for implementing such methods and Applications of high-frequency field cages in fluidic microsystems.
  • red blood cells damaged by parasite attack in malaria are red blood cells damaged by parasite attack in malaria (see FK Glenister et al. In “Contribution of parasite proteins to altered mechanical properties of malaria-infected red blood cells ", BLOOD, Vol. 99, No. 3, 2002, pp. 1060 to 1063).
  • optical stretcher acts as a so-called optical stretcher (or: laser stretcher).
  • the optical stretcher uses two counter-rotating, barely focused laser beams to capture cells suspended in a liquid in the flow at low light output (10 - 100 mW). If the light output is increased (100 mW - 1.5 W), the cells are distorted (deformed) to different extents depending on the cell type. Healthy cells hardly change, while tumor cells deform significantly.
  • the use of the optical stretcher to detect cancer cells has several disadvantages.
  • a major disadvantage is that the optical stretcher can only function reliably with individual cells, but there is no possibility of selecting individual cells from the suspension liquid.
  • Several cells caught between the laser beams interact with each other so that the deformation to be examined is influenced. To avoid this problem, extremely diluted samples must be used. This limits the sample throughput.
  • Another disadvantage is that the de- tection of the deformation cannot be reliably automated.
  • the capture area due to the small diameter of the light guide for coupling the laser beams is only a small size of z. B. 5 microns.
  • the described deformation of cells serves to influence the permeability of the cell membrane during the so-called electropermeabilization.
  • This deformation technique is unsuitable for the above-mentioned detection of healthy or sick cells for the following reason.
  • field strengths of a few 10 kV / m up to the MV / m range are required for the deformation. Due to the high field strengths, only low conductivity solutions are used to avoid ohmic losses.
  • the Cells are additionally drawn to the electrodes via positive dielectrophoresis to generate the DC or AC voltage fields, so that interactions occur between the cells and the electrodes, which make reproducible and quantitative observation of the deformation difficult. Electrode contact in the cell affects its vitality and the cell can often not be detached from the electrodes, or not at all, without destruction.
  • Sharp-edged electrodes are arranged at a distance of 50 ⁇ m in a cuvette. When the electrodes are exposed to a high-frequency electrical voltage, one or more erythrocytes are arranged between the The erythrocytes are drawn to the electrodes. A brief increase in field strength causes a deformation that can be optically observed and quantitatively evaluated.
  • the technique described by H. Engelhardt has several disadvantages. A major problem is that, as with In the technique described above by KJ Müller et al., the erythrocytes touch the electrodes. This distorts the observation of the deformation.
  • the erythrocytes cannot be deformed in different directions in a defined manner.
  • Another problem is that in the case of H. Engelhardt e t al. proposed experimental conditions must be worked with an extremely low conductivity of the buffer solution that surrounds the erythrocytes.
  • the conductivity of the buffer solution is in the range from 1 mS / m to 10 S / m.
  • these conductivities are considerably lower than the conductivities of physiological solutions, so that the investigated erythrocytes are exposed to additional stress or can be destroyed.
  • the object of the invention is to provide improved methods for examining deformation properties of objects, in particular biological cells, with which the disadvantages of the conventional methods are overcome and which in particular enable characterization of deformation properties with increased accuracy and reproducibility. Methods according to the invention are also intended to enable quantitative characterization of the deformation properties and with reduced device technology
  • Another object of the invention is to provide improved devices for examining deformation properties of objects, in particular for implementing the method according to the invention.
  • the invention is based on the general technical teaching, for the examination of an object suspended in a liquid after its positioning in a potential minimum of a high-frequency electrical positioning field in an examination area of a fluid microsystem on the object with a deformation field to exercise and to detect a reaction of the object to the deformation force by detecting at least one property from the group of the electrical, geometric and optical properties of the object.
  • the use of the high-frequency electrical positioning field advantageously enables contactless, dielectric positioning of individual objects with high stability and location accuracy.
  • the non-contact Positioning includes holding individual objects, such as. B. individual biological cells in a freely suspended state, ie floating in the suspension or a treatment liquid without direct mechanical contact (without direct contact) with components of the fluid microsystem.
  • the object to be examined is in free solution during positioning and deformation, ie it is surrounded on all sides by the liquid, and there are distances from all neighboring wall surfaces or electrodes of the microsystem.
  • the stability of the positioning allows a detector to be precisely adjusted to the object and to be set up to record the desired properties.
  • the deformation field acts on the basis of negative dielectrophoresis.
  • the combination of the holder by means of negative dielectrophoresis with the effect of the deformation field which was proposed for the first time with the present invention, has the advantage of enabling a particularly gentle examination of biological objects in fluidic microsystems, as they are per se for manipulation, treatment, sorting and analysis for example of biological cells are already available.
  • a capture field is preferably generated by negative dielectrophoresis and alternately or at the same time a deformation field is generated using positive or negative dielectrophoresis, this combination of capture field and deformation field preventing the objects from contacting the electrodes.
  • Holding objects by negative dielectrophoresis has particular advantages when studying biological ones Objects.
  • the conductivity of the surrounding suspension or treatment liquid can, for example, be considerably increased compared to the technique described by H. Engelhardt, in particular in the range of physiological conditions.
  • the conductivity can e.g. B. greater than 0.3 S / m and in particular corresponding to the physiological value 1.5 S / m.
  • the negative dielectrophoresis advantageously occurs in the entire frequency range of interest, in particular above 1 kHz up to the GHz range.
  • an enlarged frequency range is available for the deformation field, wherein the deformation field can be generated for negative or positive dielectrophoretic conditions and different deformation effects can be set at different frequencies.
  • Another important advantage of using a suspension or treatment liquid with an increased external conductivity is the reduction of ohmic heating effects, e.g. B. up to a factor of 5, so that the cell physiology is hardly influenced during the measurement.
  • the deformation field acts on the basis of positive dielectrophoresis, which can be advantageous for certain objects for contactless holding.
  • Electrode contact is advantageously avoided in general by the method and the device according to the invention. This avoids mechanical damage to the cells, particularly when treating cells.
  • a suitable temporal and geometric field formation can cause a deformation in both homogeneous and also take place in inhomogeneous electric fields, corresponding to the parallel or anti-parallel polarization in the external electric field.
  • a detection of the geometric properties of the object accordingly means that the outer shape of the object, for example, with a camera during the deformation and / or
  • the detection of optical properties here denotes the detection of the interaction of the object with light, such as a fluorescence measurement or a scattered light measurement. If the examination according to the invention is carried out, for example, on biological cells which react to mechanical stimuli by changing the membrane structure and can accordingly activate fluorescence markers, the optical detection comprises a fluorescence measurement during the deformation and / or relaxation.
  • the method according to the invention advantageously has a high degree of flexibility with regard to the time of the deformation measurement.
  • the detection can be carried out once or several times at times selected in the entire time range during and after the deformation of the object.
  • the detection can include detection of deformation properties or, when the deformation forces are briefly exerted, relaxation properties of the object. Advantages with regard to an expanded information content of the detection can result if a time dependency of the respectively measured electrical, geometrical and / or optical quantity is recorded.
  • the radio-frequency field cage is operated as a field cage which is closed on all sides and has an essentially point-shaped potential minimum which is fixed in the microsystem.
  • the deformation and detection can advantageously be carried out on the stationary object.
  • the high-frequency field cage is operated as an open field cage with a line-shaped potential minimum which is in longitudinal extends direction of a channel in the fluidic microsystem. The object moves with the suspension fluid through the cage electrode arrangement, the field cage merely ensuring that the object is positioned on a specific trajectory through the channel.
  • the deformation and detection can be carried out dynamically on the moving object, so that the invention can also be implemented during the operation of high-throughput systems.
  • the technical effort involved in implementing the invention can be reduced if the cage electrode arrangement provided for forming the positioning field is also used to generate the deformation field.
  • the cage electrode arrangement provided for forming the positioning field is also used to generate the deformation field.
  • dielectric and / or optical properties and additionally the desired mechanically elastic properties of the object can be examined in a manner known per se.
  • This variant is particularly advantageous for screening tasks in which the mechanical-elastic properties of the object are to be related to other measurement parameters.
  • a separate deformation electrode arrangement can be used to generate the deformation field, which may result in advantages for the control of the positioning and deformation fields.
  • the deformation field is set for a duration of 1 ms to 500 ms, there can be advantages with regard to a relatively low mechanical, low electrical and low thermal load on the object. It is particularly advantageous if the deformation field is generated in a pulsed manner, since in this case the time behavior of the Relaxation of the object deformation can be detected with increased accuracy.
  • a temporary solution exchange can advantageously take place, for example to examine the deformation behavior of the object in different media or to carry out an object treatment with a specific treatment liquid between examinations with different deformation directions .
  • the object is preferably positioned at a channel junction or crossing in the fluidic microsystem, to which the respective treatment liquid is supplied.
  • a multiple measurement is carried out on a specific object, such as, for example, on a biological cell to be examined.
  • the steps of generating the deformation field and detection are carried out several times in succession.
  • the multiple detection can be directed, for example, to repeat the deformation with identical process conditions in order to increase the accuracy of the measurement.
  • the process conditions such as, for example, the forces exerted, the field strengths, phases and / or frequencies of the high-frequency electrical fields, the duration of the force application or the addition of the treatment liquid can be varied in order to obtain additional information about the object.
  • a control loop can advantageously be implemented in which the positioning field and / or the deformation field is set as a function of the result of the previous detection. Furthermore, in the case of successive examinations, the deformation field can be set and / or the object is rotated so that the object is deformed in different directions.
  • This variant of the invention can have advantages for the examination of objects with anisotropic elastic properties.
  • the duration of the multiple measurement is preferably at least one second.
  • elastic properties of the object When putting the invention into practice, in particular when examining biological cells, it is preferred to determine elastic properties of the object from the detected electrical, geometric and / or optical properties.
  • one or more of the following variables can be recorded as deformation properties as integral or structure-selective parameters: elastic modulus, shear modulus, viscosity, spring constant, stiffness constant and relaxation time.
  • elastic modulus e.g., elastic modulus, shear modulus, viscosity, spring constant, stiffness constant and relaxation time.
  • an adjustment can be made on the basis of models known per se, as described, for example, by H. Engelhardt et al. (see above).
  • the invention is not limited to the measurement of elastic properties. Plastic deformation properties or intermediate forms between elastic and plastic behavior can also be determined.
  • the method according to the invention can generally be carried out with any flexible, in particular elastically or plastically deformable, object that is smaller than the respective examination area.
  • objects to be examined typically have sizes in the range from 1 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • the object can have a regular or irregular shape and in particular be spherical.
  • the object can be a synthetic object made of a deformable, compact or hollow material.
  • membrane vesicles filled with a liquid can be examined in order to examine the structure of the membrane envelope.
  • Preferred applications of the invention are given when the object to be examined comprises at least one biological cell, a cell group, a cell component or such an object in combination with a synthetic particle.
  • the object to be examined can also be porous and the objects themselves can be cells, cell pairs, cell aggregates / cell groups or cell components. It is also possible for synthetic particles, for example several beads, to also aggregate.
  • the preferred application of the invention in biotechnology and pharmacy is based on the idea of capturing individual cells in dielectric field cages and changing the field at the electrodes for a short time in such a way that sufficiently high deformation forces are generated.
  • the electric field can then be put back into capture mode and the relaxation of the cell deformation can be observed in the area of low field strength.
  • the field between the modes can also be temporarily switched off. This process can advantageously be repeated several times on a cell.
  • a distinction is made between normal and modified cells or between normal cells with different physiological properties, for example during their cell cycle.
  • the method according to the invention can be used to differentiate between normal differentiated cells and stem cells.
  • the method according to the invention can be used in particular for the detection and sorting of stem cells from a large number of cells. Additional information about the cells examined can be obtained if the dielectric, geometric and / or optical properties of the cell are detected as a function of the frequency and / or voltage of the positioning field and / or the deformation field. Furthermore, dependencies on the ambient temperature, on the material composition, the ambient fluid and / or the duration of individual deformations or the duration of multiple measurements can be carried out. If, according to the invention, cell pairs or cell aggregates are measured, which may only be brought together or connected in the positioning field, there are advantages compared to the laser stretcher, with which only individual particles can be deformed
  • the above-mentioned object of the invention is achieved with a measuring apparatus for examining at least one object, which has a fluidic microsystem with an examination area with at least one electrode arrangement, a detector device for electrical and / or optical measurement of object properties, and a field shaping device with at least one contains a high frequency generator and a switching device with which between the
  • Capture mode in which a high-frequency positioning field is generated in the examination area with the at least one electrode arrangement, and the deformation mode can be switched over, in which a deformation field is generated in the examination area with the at least one electrode arrangement.
  • the detector device has a microscope with a camera, there may be advantages with regard to the accuracy of the detection on microscopic objects, the diameter of which is typically less than 25 ⁇ m.
  • the measuring apparatus is equipped with a control device which is connected to the detector device and the switching device.
  • a control device which is connected to the detector device and the switching device.
  • the fluidic microsystem of the measuring apparatus is preferably equipped with a fluidic device with which the suspension and / or an additional treatment liquid can be moved through the examination area and which is also connected to the control device.
  • Another independent object of the invention is the use of a fluidic microsystem with a high-frequency field cage for the investigation of deformation and / or relaxation properties of biological cells and in particular for the separation or sorting of healthy cells and diseased cells, for example cancer cells, or the sorting of Stem cells from a cell sample.
  • the invention has the following further advantages.
  • an examination method is created with which the deformation and / or relaxation of biological cells can be detected in a fully automated manner.
  • the inventors have found that in cells held dielectrically in high-frequency field cages with high-frequency electrical fields, such high deformation forces can be exerted that the deformation fields only have to be generated for short times and with local limitation. This reduces the strain on the cells.
  • undesired heating of the electrode arrangement in the examination area is avoided or significantly reduced.
  • Beads or metal balls can be occupied. These beads or metal balls show a at a suitable capture frequency positive dielectrophoresis and can deform the particles or cells. Furthermore, it is also possible to have cells beads or metal spheres phagocytized.
  • a further advantageous possibility for deforming cells or particles is to use magnetic beads with which the cells are coated or which are phagocytized by the cells in order to deform the magnetic by an arrangement of switchable magnetic elements, for example electromagnets arranged outside the channel Beads and thus to reach the cells.
  • switchable magnetic elements for example electromagnets arranged outside the channel Beads and thus to reach the cells.
  • Another advantageous possibility of achieving a deformation of a cell or a particle is to excite the object to oscillate at a resonance frequency by quickly switching the deformation field on and off. This results in a repeated deformation with the resonance frequency, a measurement of the decay of the vibration allowing conclusions to be drawn about the mechanical properties of the cell.
  • the method according to the invention or the device according to the invention can also be used advantageously for pair separation.
  • pair separation the separation of two or else understood more each of attached particles may. If such a pair caught in an inventive electrode arrangement, and then separated by switching to the stretching mode, so as a function of the forces exerted by the dielectrophoresis separation of the objects can in Different flow paths are made possible by variation of the frequencies and / or deformation stress and / or deformation time further characterization of the bond between objects.
  • FIG. 1 a schematic representation of an embodiment of a measuring apparatus according to the invention
  • FIGS. 2, 3 schematic, enlarged illustrations of electrode arrangements used according to the invention
  • FIG. 4 shows a flow chart to illustrate an embodiment of a method according to the invention
  • FIG. 5 measurement and simulation results to illustrate the deformation of cells according to the invention
  • FIG. 6 shows a schematic illustration of the object deformation in an external electrical field
  • FIG. 7 schematic, enlarged illustrations of electrode arrangements used according to the invention.
  • FIG. 1 shows an embodiment of the measuring apparatus according to the invention with the fluidic microsystem 10, the detector device 20 and the field shaping device 30.
  • the fluidic microsystem 10 is only shown in part with an electrode arrangement of cage electrodes 1-4 and optionally provided deformation or impedance measurement electrodes 5, 6.
  • the electrodes 1-6 are microelectrodes known per se, which are attached to the bottom, side and / or top walls of a compartment, e.g. B. a channel 12 of the fluidic microsystem.
  • a suspension liquid flows through the channel 12 in the direction of the arrow A.
  • the examination area 11 is formed between the electrode ends (electrode tips) of the electrode arrangement 1-6, in which the positioning and deformation of the object 0 to be examined, which is explained below, is carried out.
  • the examination area 11 can be formed at a point of intersection of the channel 12 with another channel (not shown) of the microsystem in order to expose the object 0 in the held state, if necessary, to a treatment liquid which is supplied through the further channel
  • the detector device 20 comprises a microscope 21, a camera 22 and an image data memory 23, which interact in a known manner.
  • the microscope 21 is, for example, a 1X70, manufacturer: Olympus with a CCD camera 22 of the Sensicam Vision type, manufacturer: Photonics.
  • the field shaping device 30 contains a high-frequency generator 31 and a switching device 32. Both components can be integrated in a common circuit.
  • the high-frequency generator is a voltage source for generating high-frequency electrical voltages, typically in the voltage range from 0.1 to 10 Vrms and in the frequency range from 1 kHz to 100 MHz.
  • the output voltage values, phases and frequencies of the voltages generated by the high-frequency generator 31 can preferably be set manually or with the control device 40.
  • the frequency of the high-frequency voltage can advantageously be set as a function of the external conductivity so that the membrane of the cell under investigation is fully charged.
  • the frequency is chosen to be significantly lower than the reciprocal value of the membrane relaxation time ⁇ m (f «f m ).
  • the membrane relaxation time is related to the conductivities according to equation (2):
  • the cell can only be elongated according to equation (3).
  • a first operating mode is the hold or capture mode, in which the object O (e.g. the biological cell) in the
  • the schematically shown switching device 32 is used to select the currently desired operating mode in which the respective voltage is applied to the respective electrodes.
  • the switching device 32 can comprise a changeover switch or a phase shifter and / or can be integrated in the control of the high-frequency generator 31. In both variants, actuation with the control device 40 can be provided.
  • the reference numeral 50 refers to a fluidic device with which the suspension and / or treatment liquid is moved in the channel 12 of the fluidic microsystem 10.
  • the fluidic device 50 includes, for example, a pump that can be actuated with the control device 40, if necessary.
  • FIG. 2 shows the cage electrodes 1-4, l'-4 'in an enlarged perspective view.
  • the channel direction corresponds to the flow direction A of the suspension liquid.
  • the control mode "trap red” is used to capture the cells in the field cage and to rotate the cell in a predetermined orientation relative to the surrounding microsystem. In this case, deformations in certain directions can advantageously be examined.
  • the control modes “trap ac I” and “trap ac II” servee to capture the cell in the field cage without a specific orientation. By switching the relative phase position between the high-frequency voltages at the cage electrodes in accordance with the control types “stretch ac I" or “stretch ac II", a switch is made from the capture mode to the deformation mode.
  • the polarization of the cells to be examined makes deformation forces parallel to the direction of flow in the example of the control types specified A formed so that the cell deforms (see Figure 5).
  • stretch mode “stretch ac III” generates a deformation field in an octode cage with two opposite electrode pairs, the other electrodes being at ground.
  • a "trap-stretch” mode is specified, which demonstrates how a particle is simultaneously across different electrodes can be deformed at a frequency Fl and can be dielectrically focused with another frequency F2 in the direction weakened by the deformation field. It is particularly advantageous to use this type of control in connection with an electrode field cage with twelve or more electrodes, as shown for example in FIG. 7C. For example, the deformation with the narrow, central two pairs of electrodes can take place with simultaneous dielectric focusing of the particle by the outer electrodes of the remaining octode cage.
  • FIG. 3A shows cage electrodes 1, 2, 1 'and 2' which are used to form a dielectric open in the direction of flow A.
  • FIGS. 3B and 3C show the electrical potentials for the "trap ac” mode (FIG. 3B) and for the "stretch ac I" Mode (Figure 3C) for the cage electrode arrangement of Figure 3A shown.
  • FIGS. 3B and 3C are a sectional view of the channel with the electrodes shown in section, the direction of flow of the channel being perpendicular to the image plane.
  • 3B for the “trap ac I” mode the centered cell is drawn with polarization charges. It can clearly be seen that cells with this electrode arrangement can be deformed more easily than in the eight-electrode cage even without stretching fields because of the cell No forces act in the direction perpendicular to the plane, ie in the direction of flow ..
  • a further homogenization of the stretching field can be achieved by means of additional electrodes which are arranged in the plane between the existing electrodes.
  • step 200 the positioning of a particle in the dielectric field cage of the cage electrodes takes place, for example according to FIG by changing the electrode control, the cell deformation (step 300), the deformation (step 400) or the relaxation (step 500) being detected electrically or optically while the deformation forces are exerted and / or after the deformation forces have been switched off.
  • step 600 the evaluation and quantitative analysis of the deformation follows in step 600.
  • step 600 it can be provided that a further deformation with associated detection is carried out.
  • the object Before the further deformation, the object can optionally be rotated in step 200.
  • step 700 a decision is made as to whether another object is to be examined or the measurement is to be ended. If necessary, at step 800 the object is placed in a suitable container or on a substrate, e.g. B. provided in a microtiter plate.
  • FIG. 5 shows an example of the deformation of an erythrocyte in a field cage by switching from capture mode to deformation mode.
  • the examination area has a diameter of approx. 40 ⁇ m.
  • the frequency of the positioning and deformation fields is 700 kHz (3V rms ).
  • the conductivity of the suspension liquid is 0.3 S / m.
  • FIGS. 5A and B show microscopic images of erythrocyte 0 in the capture and deformation mode.
  • FIGS. 5C to D illustrate the field distribution in the horizontal central plane of the electrode arrangement according to FIG. 2 in the capture mode for the control protocols “trap red” or “trap ac II”.
  • FIG. 5E shows the course of E 2 in the stretching mode.
  • FIG. 5F shows the electrical potential f in the stretch mode when the “stretch ac I” type of control is implemented.
  • steps 400, 500 For example, images of the object 0, which were recorded with the detector device 20, are measured.
  • the object diameter is recorded before and during the deformation.
  • a corresponding time dependency is included to determine relaxation times. If, for example, a spherical cell is deformed into an ellipsoid, the semiaxes of the ellipsoid are measured.
  • the desired elastic properties are determined from the freshly measured values and / or the determined time function, depending on the model used.
  • a parameter optimization can be provided, for example in order to keep the object 0 as well as possible in the center of the examination area.
  • Detector device derived control signals with which the parameters of the output voltages of the high-frequency generator are set until the desired centering is given.
  • a corresponding control loop can be directed to the change in the field strength or frequency of the deformation fields in order to achieve a specific deformation result.
  • Field strength and / or frequency-dependent deformation measurements can be carried out.
  • a deformation in another direction e.g. B. be carried out in a vertical plane.
  • a directional stretching of the object 0 in the field cage to a needle shape can be provided.
  • the deformation fields can be generated simultaneously to form a permanently formed positioning field. According to equation (1), elongating or compressing fields can be formed.
  • Electrodes instead of the eight or four-electrode field cages, other electrode geometries can be realized, as are known per se from fluidic microsystem technology. For example, six-pole electrode arrangements can be implemented.
  • FIGS. 7A and 7B show electrode arrangements which correspond to those described above in connection with FIGS. 5A to 5F.
  • the direction of flow of the channel is marked with the arrow.
  • FIGS. 7C and 7D show electrode arrangements with a total of twelve electrodes, of which only the top six electrodes are shown.
  • the additional electrodes are preferably attached centrally on a plane between the eight electrodes, the additional electrodes cutting the channel perpendicular to the direction of flow.
  • the additional electrodes make the field near the capture point more homogeneous, so that a particle arranged there experiences lower dielectrophoretic forces (see FIGS. 7C and 7D).
  • the middle additional electrodes can be particularly advantageous since they focus in the flow direction.
  • the control is particularly easy to implement in the “stretch ac I” mode since no additional phases are required.
  • the additional electrodes are switched to either 0 ° or 180 ° in accordance with the two adjacent electrodes.
  • parallel outer boundaries of the electrode tips are suitable for producing more homogeneous stretching fields Stretching field in the case of parallel outer boundaries the electrode tips are shown in FIG. 7F for the “stretch ac I” mode.
  • Another possibility of achieving greater homogeneity is that the electrodes are not arranged equidistantly (not shown).

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Abstract

Es werden Verfahren zur Untersuchung von mindestens einem deformierbaren Objekt (0) in einer Suspensionsflüssigkeit beschrieben, mit den Schritten: Erzeugung eines elektrischen Positionierungs-Feldes und Positionierung des Objekts (0) in einem Potentialminimum des Positionierungs-Feldes, Erzeugung eines elektrischen Deformations-Feldes derart, dass eine Deformationskraft auf das Objekt (0) ausgeübt wird, und Detektion von mindestens einer Eigenschaft aus der Gruppe der dielektrischen, geometrischen und optischen Eigenschaften des Objekts (0), wobei das Positionierungs-Feld in einem Kompartiment (12) eines fluidischen Mikrosystems (10) erzeugt wird, und die Positionierung des Objekts (0) in frei suspendiertem Zustand berührungslos erfolgt. Es werden auch Messapparaturen zur Durchführung dieser Verfahren beschrieben.

Description

Verfahren und Vorrichtungen zur Untersuchung eines deformierbaren Objekts
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Untersuchung eines in einer Flüssigkeit suspendierten, deformierbaren Objekts, insbesondere zur Untersuchung von Deformationseigenschaften von biologischen Partikeln, wie zum Beispiel von biologischen Zellen, mit den Merkmalen der Oberbegriffs von Patentanspruch 1. Die Erfindung betrifft auch Vorrichtungen zur Umsetzung derartiger Verfahren und Anwendungen von Hochfrequenz-Feldkäfigen in fluidischen Mikrosystemen.
Es ist bekannt, dass geschädigte, transformierte oder entartete biologische Zellen häufig gegenüber gesunden Zellen abweichende mechanische Eigenschaften aufweisen, wobei sie üblicherweise weicher als gesunde Zellen sind (siehe B. Alberts et al. in "Lehrbuch der molekularen Zellbiologie", Wiley VCH, Weinheim, 1998; und J. M. Vasiliev et al . in "BBA" Bd. 780, 1985, S 21-65 "Spreading of non-transformed and transformed cells"). Außerdem unterscheiden sich verschiedene Zelltypen, wie zum Beispiel weiße und rote Blutzellen nach ihrer Verformbarkeit (siehe R. Glaser in „Biophysik", Spektrum Akade- mischer Verlag, Heidelberg, 1996) . Es wurde weiterhin festgestellt, dass Krebszellen zwischen 2- und 10-fach weicher als gesunde Zellen sein können und sich unter dem Einfluss von Kräften deutlich stärker als gesunde Zellen verformen (siehe J. Guck et al. in "Biophysical Journal", Bd. 81, 2001, S. 767 - 784) . Es ist bekannt, dass sich das Zytoskelett und damit die viskoelestischen Eigenschaften von Zellen durch die Zugabe von bestimmten Agenzien, z. B. Cytochalasin oder Colchezin verändern lassen (siehe B. Alberts et al.). B. Alberts et al. beschreiben auch, dass sich das Zytoskelett während der Zell- ontogenese/-differenzierung und des Zellzyklus ändert.
Ein Beispiel für geschädigte biologische Zellen, deren mecha- nische Eigenschaften sich durch die Schädigung ändern, sind bei Malaria durch Parasitenbefall geschädigte rote Blutkörperchen (siehe F.K. Glenister et al. in „Contribution of pa- rasite proteins to altered mechanical properties of malaria- infected red blood cells", BLOOD, Bd. 99, Nr. 3, 2002, S. 1060 bis 1063) .
Zur Unterscheidung von Krebszellen und gesunden Zellen wird von J. Guck et al . und in US 6 067 859 ein optischer Mikroma- nipulator vorgeschlagen, der als so genannter optischer Stre- cker (oder: Laserstrecker) wirkt. Der optische Strecker verwendet zwei gegenläufige, kaum fokussierte Laserstrahlen, um Zellen, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind, im Durch- fluss bei niedriger Lichtleistung (10 - 100 mW) einzufangen. Wenn die Lichtleistung erhöht wird (100 mW - 1.5 W) , werden die Zellen je nach Zelltyp unterschiedlich stark verzerrt (deformiert) . Gesunde Zelle ändern sich kaum, während sich Tumorzellen deutlich verformen.
Die Verwendung des optischen Streckers zur Erkennung von Krebszellen besitzt mehrere Nachteile. Ein Hauptnachteil besteht darin, dass der optische Strecker nur mit einzelnen Zellen sicher funktionieren kann, wobei jedoch keine Möglichkeit zur Selektion einzelner Zellen aus der Suspensionsflüssigkeit gegeben ist. Mehrere, zwischen den Laserstrahlen gefangene Zellen treten miteinander in Wechselwirkung, so dass die zu untersuchende Deformation beeinflusst wird. Zur Vermeidung dieses Problems muss mit extrem verdünnten Proben gearbeitet werden. Dadurch wird der Probendurchsatz beschränkt. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass die De- tektion der Deformation nicht zuverlässig automatisierbar ist. Schließlich besteht ein Nachteil des Laserstreckers auch darin, dass der Fangbereich aufgrund des geringen Durchmessers des Lichtleiters zur Einkopplung der Laserstrahlen nur eine geringe Größe von z. B. 5 μm besitzt.
In der Publikation "Reversible Electropermeabilization of mammalian cells by high-intensity, ultra-short pulses of sub- microsecond duration" von K. J. Müller et al. ("J. Membrane Biol." Bd. 184, 2001, S. 161-170) wird beschrieben, dass in einer Flüssigkeit suspendierte Zellen in elektrischen Gleichoder Wechselspannungsfeldern (E) deformiert werden können. In Abhängigkeit von den elektrischen Leitfähigkeiten σ der Suspensionsflüssigkeit (Index 1) und des Zellzytosol (Index c) können sowohl elongierende als auch komprimierende Drücke PD ausgeübt werden (siehe Fig. 6) . Für hochfrequente Felder ergibt sich für den Druck (Stress) PD (ε0: absolute Dielektrizitätskonstante, 8χ: relative Dielektrizitätskonstante der Suspensionsflüssigkeit, Θ: Winkel zwischen dem elektrischen Feld und der betrachteten Wirkungsrichtung des Druckes) :
PD = (1)
Figure imgf000005_0001
Die von K. J. Müller et al. beschriebene Deformation von Zel- len dient der Beeinflussung der Durchlässigkeit der Zellmembran bei der so genannten Elektropermeabilisierung. Aus dem folgenden Grund ist diese Deformationstechnik für die o. g. Erkennung gesunder oder kranker Zellen ungeeignet. In Abhängigkeit von den mechanischen und dielektrischen Eigenschaften der Zellen werden zur Deformation Feldstärken von einigen 10 kV/m bis in den MV/m-Bereich benötigt. Aufgrund der hohen Feldstärken wird nur in Lösungen niedriger Leitfähigkeit gearbeitet, um Ohm' sehe Verluste zu vermeiden. Dabei werden die Zellen über positive Dielektrophorese zusätzlich an die Elektroden zur Erzeugung der Gleich- oder Wechselspannungsfelder gezogen, so dass zwischen den Zellen und den Elektroden Wechselwirkungen auftreten, die eine reproduzierbare und quantitative Beobachtung der Deformation erschweren. Durch einen Elektrodenkontakt der Zelle wird deren Vitalität beein- flusst und die Zelle lässt sich oft nicht oder nicht zerstörungsfrei von den Elektroden ablösen.
Die Anwendung hochfrequenter elektrischer Felder zur Untersu- chung der viskoelastischen Eigenschaften von Erythrozyten wird von H. Engelhardt et al. in: „Nature", Bd. 307, 1984, S.
378-380, „Viscoelastic properties of erythrocyte embranes in high-frequency electric fields" beschrieben. In einer Küvette werden scharfkantige Elektroden mit einem Abstand von 50 μm angeordnet. Bei Beaufschlagung der Elektroden mit einer hochfrequenten elektrischen Spannung ordnen sich einzelne oder mehrere Erythrozyten zwischen den Elektroden an. Die Erythrozyten werden zu den Elektroden gezogen. Durch eine kurzzeiti- ge Feldstärkenerhöhung erfolgt eine Deformation, die optisch beobachtet und quantitativ ausgewertet werden kann. Die_ von H. Engelhardt beschriebene Technik besitzt mehrere Nachteile. Ein wesentliches Problem besteht darin, dass wie bei der oben beschriebenen Technik von K. J. Müller et al. die Erythrozy- ten die Elektroden berühren. Dadurch wird die Beobachtung der Deformation verfälscht. Außerdem können die Erythrozyten nicht in definierter Weise in verschiedenen Richtungen deformiert werden. Ein weiteres Problem besteht darin, dass bei den von H. Engelhardt et al . vorgeschlagenen Versuchsbedin- gungen mit einer extrem niedrigen Leitfähigkeit der Pufferlösung gearbeitet werden muss, die die Erythrozyten umgibt. Die Leitfähigkeit der Pufferlösung liegt im Bereich von 1 mS/m bis 10 S/m. Diese Leitfähigkeiten liegen jedoch erheblich unter den Leitfähigkeiten physiologischer Lösungen, so dass die untersuchten Erythrozyten einem zusätzlichen Stress ausgesetzt sind oder zerstört werden können.
Ein weiterer Nachteil der von H. Engelhardt et al. vorge- schlagenen Messung besteht darin, dass lediglich eine integrale Lichtmessung vorgesehen ist. Topographische Deformationsbilder können mit der herkömmlichen Technik nicht aufgenommen werden. Schließlich ist die von H. Engelhardt et al. beschriebene Technik nicht im Durchflusssystem realisierbar und für eine Automatisierung ungeeignet.
Des Weiteren ist bekannt, einzelne Zellen unter der Wirkung hochfrequenter elektrischer Felder in Feldkäfigen mittels negativer Dielektrophorese zu fangen und zu halten. Die Verwen- düng von Hochfrequenz-Feldkäfigen war bisher auf die möglichst schonende Manipulation der Zellen gerichtet, wobei einseitige Kraftwirkungen oder Deformationen der Zellen gerade unerwünscht waren. Beispielsweise beschreiben H. Wissel et al. in "American Journal of Physiology Lung Cell Mol. Physi- ol." (Bd. 281, 2001, L345-L360 "Endocytosed SP-A and surfac- tant lipids are sorted to different organelles in rat type II pneumocytes") , dass Zellen auch bei hohen Feldstärken schonend gehalten werden können, da sie sich zum einen in einem Feldminimum (Nullfeld) befinden und zum anderen das Heizen minimierende Mikroelektroden Verwendung finden.
T. Schnelle et al . beschreiben in "J. Electrostat . " (Bd. 50, 2000, S. 17-29, "Trapping in ac octode field cages") verschiedene Phasenansteuerungen dielektrischer Hochfrequenz- Feldkäfige. Durch eine geeignete Ansteuerung können Objekte stabil gehalten oder gezielt in eine Richtung aus dem Feldkäfig entlassen oder Bedingungen gefunden werden, unter denen mehrere Objekte im Käfig miteinander in Kontakt gebracht werden. Die Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Verfahren zur Untersuchung von Deformationseigenschaften von Objekten, insbesondere von biologischen Zellen bereitzustellen, mit denen die Nachteile der herkömmlichen Verfahren überwunden werden und die insbesondere eine Charakterisierung von Deformationseigenschaften mit erhöhter Genauigkeit und Reproduzierbarkeit ermöglichen. Erfindungsgemäße Verfahren sollen des Weiteren eine quantitative Charakterisierung der Deformationseigen- schaffen ermöglichen und mit vermindertem gerätetechnischen
Aufwand automatisierbar sein. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Vorrichtungen zur Untersuchung von Deformationseigenschaften von Objekten, insbesondere zur Umsetzung der erfindungsgemäßen Verfahren bereitzustellen.
Diese Aufgaben werden mit Verfahren und Vorrichtungen mit den Merkmalen der Patentansprüche 1 und 25 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Verfahrensbezogen beruht die Erfindung auf der allgemeinen technischen Lehre, zur Untersuchung eines in einer Flüssigkeit suspendierten Objekts nach dessen Positionierung in einem Potentialminimum eines hochfrequenten elektrischen Posi- tionierungs-Feldes in einem Untersuchungsbereich eines flui- dischen Mikrosystems auf das Objekt mit einem Deformations- Feld eine Deformationskraft auszuüben und eine Reaktion des Objekts auf die Deformationskraft durch eine Detektion mindestens einer Eigenschaft aus der Gruppe der elektrischen, geometrischen und optischen Eigenschaften des Objekts zu erfassen. Vorteilhafterweise ermöglicht die Verwendung des hochfrequenten elektrischen Positionierungs-Feldes eine berührungslose, dielektrische Positionierung einzelner Objekte mit hoher Stabilität und Ortsgenauigkeit. Die berührungslose Positionierung umfasst eine Halterung einzelner Objekte, wie z. B. einzelner biologischer Zellen in frei suspendiertem Zustand, d. h. freischwebend in der Suspensions- oder einer Behandlungsflüssigkeit ohne einen direkten mechanischen Kontakt (ohne eine unmittelbare Berührung) mit Komponenten des flui- dischen Mikrosystems. Das zu untersuchende Objekt befindet sich bei der Positionierung und der Deformation in freier Lösung, d. h. es ist allseitig von der Flüssigkeit umgeben, zu allen benachbarten Wandflächen oder Elektroden des Mikrosys- tems bestehen Abstände. Die Stabilität der Positionierung erlaubt es, dass ein Detektor präzise auf das Objekt justiert und zur Erfassung der gewünschten Eigenschaften eingerichtet werden kann.
Das Deformationsfeld wirkt gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens auf der Grundlage von negativer Dielektrophorese. Die mit der vorliegenden Erfindung erstmalig vorgeschlagene Kombination der Halterung mittels negativer Dielektrophorese mit der Wirkung des Defor- mationsfeldes besitzt den Vorteil, eine besonders schonende Untersuchung biologischer Objekte in fluidischen Mikrosyste- men zu ermöglichen, wie sie an sich zur Manipulierung, Behandlung, Sortierung und Analyse zum Beispiel von biologischen Zellen bereits verfügbar sind.
Vorzugsweise wird ein Fangfeld durch negative Dielektrophorese und alternierend oder gleichzeitig ein Deformationsfeld unter Verwendung positiver oder negativer Dielektrophorese erzeugt, wobei durch diese Kombination aus Fangfeld und De- formationsfeld ein Kontakt der Objekte mit den Elektroden vermieden werden kann.
Die Halterung der Objekte durch negative Dielektrophorese besitzt besondere Vorteile bei der Untersuchung biologischer Objekte. Die Leitfähigkeit der umgebenden Suspensions- oder Behandlungsflüssigkeit kann bspw. im Vergleich zu der von H. Engelhardt beschriebenen Technik erheblich, insbesondere in den Bereich physiologischer Bedingungen erhöht werden. Die Leitfähigkeit kann z. B. größer als 0.3 S/m und insbesondere entsprechend dem physiologischen Wert 1.5 S/m eingestellt werden. Insbesondere bei der Messung an biologischen Zellen, bei denen die Leitfähigkeit im Inneren der Zelle geringer als im Außenmedium ist, tritt vorteilhafterweise die negative Dielektrophorese im gesamten interessierenden Frequenzbereich insbesondere oberhalb von 1 kHz bis in den GHz-Bereich auf. Im Vergleich zu herkömmlichen Techniken ist für das Deformationsfeld ein vergrößerter Frequenzbereich verfügbar, wobei das Deformationsfeld für negative oder positive dielek- trophoretische Bedingungen erzeugt werden kann und bei verschiedenen Frequenzen verschiedene Deformationswirkungen einstellbar sind. Ein weiterer wichtiger Vorteil der Verwendung einer Suspensions- oder Behandlungsflüssigkeit mit einer erhöhten Außenleitfähigkeit besteht in der Verringerung Ohm' scher Heizwirkungen, z. B. bis zu einem Faktor 5, so dass die Zellphysiologie während der Messung kaum beeinflusst wird.
Gemäß einer alternativen Variante wirkt das Deformationsfeld auf der Grundlage von positiver Dielektrophorese, was für bestimmte Objekte zur berührungslosen Halterung von Vorteil sein kann.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung wird vorteilhafterweise generell ein Elektrodenkontakt vermieden. Dadurch wird insbesondere bei der Behandlung von Zellen eine mechanische Beschädigung der Zellen vermieden. Es kann durch eine geeignete zeitliche und geometrische Feldausbildung eine Deformation sowohl in homogenen, als auch in inhomogenen elektrischen Feldern erfolgen, entsprechend der parallelen oder antiparallelen Polarisation im externen elektrischen Feld.
Welche der elektrischen, geometrischen und/oder optischen Eigenschaften des Objekts detektiert wird, hängt von der konkreten Anwendung der Erfindung ab. Beispielsweise kann durch eine Impedanzmessung im Untersuchungsbereich festgestellt werden, ob und mit welcher Geschwindigkeit sich das Objekt deformiert und ggf. in den undeformierten Zustand relaxiert. Diese Variante kann für den Betrieb automatisierter Mikrosys- teme ohne eine optische Prozessbeobachtung von Vorteil sein. Eine Detektion der geometrischen Eigenschaften des Objekts bedeutet entsprechend, dass die äußere Form des Objekts zum Beispiel mit einer Kamera während der Deformation und/oder
Relaxation erfasst und anschließend ausgewertet wird. Die Detektion optischer Eigenschaften bezeichnet hier die Erfassung der Wechselwirkung des Objekts mit Licht, wie zum Beispiel eine Fluoreszenzmessung oder eine Streulichtmessung. Wenn die erfindungsgemäße Untersuchung bspw. an biologischen Zellen erfolgt, die auf mechanische Reize durch eine Veränderung der Membranstruktur reagieren und entsprechend Fluoreszenzmarker aktivieren können, umfasst die optische Detektion eine Fluoreszenzmessung während der Deformation und/oder Relaxation.
Weitere wichtige Vorteile der erfindungsgemäßen Verfahren bestehen darin, dass sie eine reproduzierbare, quantitative Auswertung der detektierten Eigenschaften zur Ermittlung elastischer Eigenschaften des Objektes wie z. B. der viskoela- stischen Eigenschaften biologischer Zellen ermöglichen. Das Verfahren ist vollständig automatisierbar. Die Detektion von Eigenschaften, die für die Deformation oder die Relaxation charakteristisch sind, kann im Echtzeitbetrieb oder nachträglich über gespeicherte Daten (zum Beispiel Videoauf- Zeichnung) mit an sich bekannten Algorithmen der Bildauswertung erfolgen. Es können statische oder dynamische elastische Eigenschaften der zu untersuchenden Objekte ermittelt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt vorteilhafterweise eine hohe Flexibilität in Bezug auf den Zeitpunkt der Deformationsmessung. Die Detektion kann gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung einfach oder mehrfach zu Zeitpunk- ten erfolgen, die im gesamten Zeitbereich während und nach der Deformation des Objekts gewählt sind. Entsprechend kann die Detektion eine Erfassung von Deformationseigenschaften oder bei kurzzeitiger Ausübung der Deformationskräfte von Relaxationseigenschaften des Objekts umfassen. Vorteile in Be- zug auf einen erweiterten Informationsgehalt der Detektion können sich ergeben, wenn eine Zeitabhängigkeit der jeweils gemessenen elektrischen, geometrischen und/oder optischen Größe erfasst wird.
Besondere Vorteile insbesondere bei der Untersuchung biologischer Proben können sich ergeben, wenn das Positionierungs- Feld mit einer Käfig-Elektrodenanordnung als Hochffequenz- Feldkäfig erzeugt wird, da mit der Gestaltung und der Ansteuerung von an sich bekannten Hochfrequenz-Feldkäfigen bereits Erfahrungen bestehen.
Gemäß einer Variante der Erfindung wird der Hochfrequenz- Feldkäfig als allseits geschlossener Feldkäfig mit einem im Wesentlichen punktförmigen, im Mikrosystem ortsfesten Poten- tialminimum betrieben. Vorteilhafterweise können die Deformation und Detektion am ruhenden Objekt durchgeführt werden. Gemäß einer alternativen Variante der Erfindung wird der Hochfrequenz-Feldkäfig als offener Feldkäfig mit einem li- nienförmigen Potentialminimum betrieben, das sich in Längs- richtung eines Kanals im fluidischen Mikrosystem erstreckt. Das Objekt bewegt sich mit der Suspen.sionsflüssigkeit durch die Käfig-Elektrodenanordnung, wobei der Feldkäfig lediglich für eine Positionierung des Objekts auf einer bestimmten Tra- jektorie durch den Kanal sorgt. Die Deformation und Detektion können dynamisch am bewegten Objekt durchgeführt werden, so dass die Erfindung auch im laufenden Betrieb von Hochdurchsatzsystemen realisiert werden kann.
Vorteilhafterweise kann der technische Aufwand bei der Umsetzung der Erfindung vermindert werden, wenn die zur Bildung des Positionierungs-Feldes vorgesehene Käfig-Elektrodenanordnung auch zur Erzeugung des Deformations-Feldes verwendet wird. Durch ein Umschalten von einem Fang- oder Positio- niermodus und zu einem Streck- oder Deformationsmodus können in an sich bekannter Weise dielektrische und/oder optische Eigenschaften und zusätzlich die gewünschten mechanischelastischen Eigenschaften des Objektes untersucht werden. Diese Variante ist besonders für Screening-Aufgaben von Vorteil, bei denen die mechanisch-elastischen Eigenschaften des Objektes mit anderen Messparametern in Beziehung gesetzt werden sollen. Alternativ kann eine separate Deformations- Elektrodenanordnung zur Erzeugung des Deformations-Feldes verwendet werden, wobei sich Vorteile für die Steuerung der Positionier- und Deformations-Felder ergeben können.
Wenn das Deformations-Feld gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung für eine Dauer von 1 ms bis 500 ms eingestellt wird, können sich Vorteile in Bezug auf eine re- lativ geringe mechanische, geringe elektrische und geringe thermische Belastung des Objektes ergeben. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Erzeugung des Deformations-Feldes im- pulsförmig erfolgt, da in diesem Fall das Zeitverhalten der Relaxation der Objektdeformation mit erhöhter Genauigkeit erfasst werden kann.
Wenn vor der Erzeugung des Deformations-Feldes eine Behand- lungsflüssigkeit in den Untersuchungsbereich geleitet wird, kann vorteilhafterweise ein zeitweiliger Lösungsaustausch erfolgen, beispielsweise um das Deformationsverhalten des Objekts in verschiedenen Medien zu untersuchen oder um zwischen Untersuchungen mit verschiedenen Deformationsrichtungen eine Objektbehandlung mit einer bestimmten Behandlungsflüssigkeit vorzunehmen. Die Positionierung des Objekts erfolgt in diesem Fall vorzugsweise an einer Kanaleinmündung oder -kreuzung im fluidischen Mikrosystem, an der die jeweilige Behandlungsflüssigkeit zugeführt wird.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt an einem bestimmten Objekt, wie zum Beispiel an einer zu untersuchenden biologischen Zelle eine Mehrfachmessung. Hierzu werden die Schritte Erzeugung des Deformations- Feldes und Detektion mehrfach aufeinanderfolgend durchgeführt. Die Mehrfach-Detektion kann beispielsweise darauf gerichtet sein, die Deformation mit identischen Verfahrensbedingungen zu wiederholen, um die Genauigkeit der Messung zu erhöhen. Alternativ oder zusätzlich können die Verfahrensbe- dingungen, wie zum Beispiel die ausgeübten Kräfte, die Feldstärken, Phasen und/oder Frequenzen der hochfrequenten elektrischen Felder, die Dauer der Krafteinwirkung oder der Zusatz der Behandlungsflüssigkeit variiert werden, um zusätzliche Informationen über das Objekt zu erhalten. Vorteilhafterweise kann insbesondere ein Regelkreis realisiert werden, in dem das Positionierungs-Feld und/oder das Deformations-Feld in Abhängigkeit vom Ergebnis der vorhergehenden Detektion eingestellt wird. Des Weiteren kann bei aufeinanderfolgenden Untersuchungen das Deformations-Feld so eingestellt und/oder das Objekt so gedreht werden, dass das Objekt in verschiedenen Richtungen deformiert wird. Diese Variante der Erfindung kann Vorteile für die Untersuchung von Objekten mit anisotropen elastischen Eigenschaften besitzen.
Wenn die Mehrfachmessung über einen längeren Zeitraum erfolgt, können vorteilhafterweise plastische Verformungen oder die Deformation in Abhängigkeit von der ausgeübten Kraft untersucht werden. Die Dauer der Mehrfachmessung beträgt hierzu vorzugsweise mindestens eine Sekunde.
Bei der Umsetzung der Erfindung in der Praxis, insbesondere bei der Untersuchung biologischer Zellen ist bevorzugt, aus den detektierten elektrischen, geometrischen und/oder opti- sehen Eigenschaften elastische Eigenschaften des Objekts zu ermitteln. Als Deformationseigenschaft können beispielsweise eine oder mehrere der folgenden Größen als integrale oder strukturselektive Parameter erfasst werden: Elastizitätsmodul, Schermodul, Viskosität, Federkonstante, Steifigkeitskon- stante und Relaxationszeit. Des Weiteren kann eine Anpassung auf der Grundlage an sich bekannter Modelle erfolgen, wie sie bspw. von H. Engelhardt et al. (siehe oben) beschrieben werden. Die Erfindung ist nicht auf die Messung elastischer Eigenschaften beschränkt. Es können auch plastische Deformati- onseigenschaften oder Zwischenformen zwischen elastischem und plastischem Verhalten ermittelt werden.
Weitere Vorteile bei der Untersuchung von Proben mit einer Vielzahl von Objekten, von denen ein oder mehrere Objekte einzeln untersucht werden sollen, ergeben sich bei der Kombination des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem dielektrischen Zellsortierer, der zur Aufreihung und ggf. Sortierung der Objekte eingerichtet ist. Wenn vor dem Positionierungs- Schritt ein bestimmtes Objekt aus der Probe ausgewählt wird, die einer dielektrischen Aufreihung unterzogen worden ist, kann die Selektivität der erfindungsgemäßen Deformationsuntersuchung erhöht werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann allgemein mit jedem nachgiebigen, insbesondere elastisch oder plastisch deformierbaren Objekt durchgeführt werden, das kleiner als der jeweilige Untersuchungsbereich ist. Für die bevorzugte Anwendung in fluidischen Mikrosystemen besitzen zu untersuchende Objekte typischerweise Größen im Bereich von 1 μm bis 50 μm. Das Objekt kann mit einer regelmäßigen oder unregelmäßigen Form und insbesondere kugelförmig gebildet sein. Das Objekt kann ein synthetisches Objekt aus einem deformierbaren, kompakten oder hohlen Material sein. Erfindungsgemäß können beispielsweise Membran-Vesikeln, die mit einer Flüssigkeit gefüllt sind, untersucht werden, um die Struktur der Membranhülle zu untersuchen. Bevorzugte Anwendungen der Erfindung sind gegeben, wenn das zu untersuchende Objekt mindestens eine biologische Zelle, eine Zellgruppe, ein Zellbestandteil oder ein derartiges Objekt im Verbund mit einem synthetischen Partikel umfasst. Das zu untersuchende Objekt kann auch porös sein und die Objekte selbst können Zellen, Zellenpaare, Zellaggregate/Zellgruppen oder Zellbestandteile sein. Weiterhin ist es möglich, dass auch synthetische Partikel, beispielsweise meh- rere Beads, aggregieren.
Es ist auch möglich, durch eine Standardansteuerung eines dielektrophoretische'n Feldkäfigs eine symmetrische Deformation von Objekten zu erreichen, die nicht klein sind im Ver- hältnis zum Käfig (Größenverhältnis beispielsweise etwa 1/2) und relativ leicht deformierbar sind. Zellen, die in einem Käfig zentral gefangen werden und klein sind im Verhältnis zu den Elektrodenabmessungen des Käfigs (beispielsweise 1/8) können normalerweise nicht deformiert werden. Die Zelle er- fährt keine Dipolpolarisation im Fangpunkt. Um durch Multipole dennoch eine Deformation zu erzeugen, ist es bevorzugt, dass das Fangfeld nicht geschlossen ist, wie beispielsweise in den Abbildungen 3A und 3B gezeigt.
Die bevorzugte Anwendung der Erfindung in der Biotechnologie und Pharmazie beruht auf der Idee, einzelne Zellen in dielektrischen Feldkäfigen zu fangen und für kurze Zeit das Feld an den Elektroden derart zu verändern, dass hinreichend hohe De- formationskräfte erzeugt werden. Anschließend kann das elektrische Feld wieder in den Fangmodus versetzt und die Relaxation der Zelldeformation im Bereich niedriger Feldstärke beobachtet werden. Alternativ kann das Feld zwischen den Modi kurzzeitig auch ganz abgeschaltet werden. Dieser Prozess kann vorteilhafterweise an einer Zelle mehrfach wiederholt werden. Gemäß einer bevorzugten Variante der Erfindung wird in Abhängigkeit von den detektierten dielektrischen, geometrischen und/oder optischen Eigenschaften zwischen normalen und veränderten Zellen oder zwischen normalen Zellen mit verschiedenen physiologischen Eigenschaften, zum Beispiel während ihres Zellzyklus unterschieden. Des Weiteren kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zwischen normalen differenzierten Zellen und Stammzellen unterschieden werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann insbesondere zur Erkennung und Sortierung von Stammzellen aus einer Vielzahl von Zellen verwendet werden. Zusätzliche Informationen über die untersuchten Zellen können gewonnen werden, wenn die dielektrischen, geometrischen und/oder optischen Eigenschaften der Zelle in Abhängigkeit von der Frequenz und/oder Spannung des Positio- nierungs-Feldes und/oder des Deformations-Feldes detektiert werden. Des Weiteren können Abhängigkeiten von der Umgebungstemperatur, von der stofflichen Zusammensetzung, der Umgebungsflüssigkeit und/oder der Dauer einzelner Deformationen oder der Dauer von Mehrfachmessungen durchgeführt werden. Wenn erfindungsgemäß eine Vermessung von Zellpaaren oder Zeil-Aggregaten erfolgt, die ggf. erst im Positionierungs- Feld zusammen geführt oder verbunden werden, ergeben sich Vorteile im Vergleich zum Laser-Stretcher, mit dem nur einzelne Partikel deformiert werden können
Vorrichtungsbezogen wird die oben genannten Aufgabe der Erfindung mit einer Messapparatur zur Untersuchung von mindes- tens einem Objekt gelöst, die ein fluidisches Mikrosystem mit einem Untersuchungsbereich mit mindestens einer Elektrodenanordnung, eine Detektoreinrichtung zur elektrischen und/oder optischen Messung von Objekteigenschaften, und eine Feldformungseinrichtung mit mindestens einem Hochfrequenzgenerator und einer Schalteinrichtung enthält, mit der zwischen dem
Fangmodus, in dem im Untersuchungsbereich mit der mindestens einen Elektrodenanordnung ein hochfrequentes Positionierungs- Feld erzeugt wird, und dem Deformationsmodus umgeschaltet werden kann, in dem im Untersuchungsbereich mit der indes- tens einen Elektrodenanordnung ein Deformations-Feld erzeugt wird.
Wenn die Detektoreinrichtung ein Mikroskop mit einer Kamera aufweist, können sich Vorteile in Bezug auf die Genauigkeit der Detektion an mikroskopisch kleinen Objekten, deren Durchmesser typischerweise geringer als 25 μm ist, ergeben.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Messapparatur mit einer Steuereinrichtung ausgestattet, die mit der Detektoreinrichtung und der Schalteinrichtung verbunden ist. Diese Verbindung ermöglicht vorteilhafterweise die Realisierung eines Regelkreises, in dem Parameter der Positi- onierungs- und/oder Deformations-Felder und/oder der Suspen- sionsflüssigkeit in Abhängigkeit vom Ergebnis einer Detektion eingestellt oder verändert werden können.
Das fluidische Mikrosystem der Messapparatur ist vorzugsweise mit einer Fluidikeinrichtung ausgestattet, mit der die Suspensions- und/oder eine zusätzliche Behandlungsflüssigkeit durch den Untersuchungsbereich bewegt werden kann und die ebenfalls mit der Steuereinrichtung verbunden ist.
Ein weiterer, unabhängiger Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines fluidischen Mikrosystems mit einem Hochfrequenz-Feldkäfig zur Untersuchung von Deformations- und/oder Relaxationseigenschaften biologischer Zellen und insbesondere zur Trennung oder Sortierung von gesunden Zellen und kranken Zellen, bspw. Krebszellen, oder die Sortierung von Stammzellen aus einer Zellprobe.
Die Erfindung besitzt die folgenden weiteren Vorteile. Es wird erstmalig ein Untersuchungsverfahren geschaffen, mit dem die Deformation und/oder Relaxation biologischer Zellen vollständig automatisierbar detektiert werden kann. Die Erfinder haben festgestellt, dass bei dielektrisch in Hochfrequenz- Feldkäfigen gehaltenen Zellen mit hochfrequenten elektrischen Feldern derart hohe Deformationskräfte ausgeübt werden kön- nen, dass die Deformation-Felder nur für kurze Zeiten und mit lokaler Begrenzung erzeugt werden müssen. Damit wird die Belastung der Zellen vermindert. Des Weiteren wird ein unerwünschtes Aufheizen der Elektrodenanordnung im Untersuchungsbereich vermieden oder deutlich reduziert.
Die Deformation von Partikeln, insbesondere von Zellen, kann dadurch unterstützt oder erreicht werden, dass Zellen mit _
Beads oder Metallkügelchen (Au) belegt werden. Diese Beads oder Metallkügelchen zeigen bei geeigneter Fangfrequenz eine positive Dielektrophorese und können so die Partikel oder Zellen deformieren. Weiterhin ist es auch möglich, Zellen Beads oder Metallkügelchen phagozytieren zu lassen.
Eine weitere vorteilhafte Möglichkeit zum Deformieren von Zellen oder Partikeln ist, magnetische Beads zu verwenden, mit denen die Zellen belegt werden oder welche von den Zellen phagozytiert werden, um durch eine Anordnung schaltbarer magnetischer Elemente, beispielsweise außerhalb des Kanals angeordnete Elektromagnete, eine Deformation der magnetischen Beads und damit der Zellen zu erreichen.
Eine weitere vorteilhafte Möglichkeit, eine Deformation einer Zelle oder eines Partikels zu erreichen, ist durch schnelles An- und Ausschalten des Deformationsfeldes das Objekt bei einer Resonanzfrequenz zum Schwingen anzuregen. Dadurch wird eine wiederholte Deformation mit der Resonanzfrequenz erreicht, wobei ein Messen des Abklingens der Schwingung Rückschlüsse auf mechanische Eigenschaften der Zelle zulässt.
Das erfindungsgemäße Verfahren oder die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch vorteilhaft zur Pärchentrennung eingesetzt werden. Unter Pärchentrennung wird( die Trennung zweier oder unter Umständen auch mehrerer aneinander angelagerter Partikel verstanden. Wird ein solches Pärchen in einer erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung gefangen und anschließend durch Umschalten auf den Streckmodus getrennt, so kann in Abhängigkeit der durch die Dielektrophorese ausgeübten Kräfte eine Trennung der Objekte in verschiedene Strömungspfade vorgenommen werden. Durch Variation der Frequenzen und/oder Deformationsspannung und/oder Deformationszeit wird zudem eine weitergehende Charakterisierung der Bindung zwischen Objekten ermöglicht. Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden aus der Beschreibung der beigefügten Zeichnungen ersichtlich. Es zeigen:
Figur 1 : eine schematische Darstellung einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Messapparatur,
Figuren 2, 3: schematische, vergrößerte Illustrationen erfindungsgemäß verwendeter Elektrodenanordnungen,
Figur 4 ein Flussdiagramm zur Illustration einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens,
Figur 5 Mess- und Simulationsergebnisse zur Illustration der erfindungsgemäßen Deformation von Zellen,
Figur 6 eine schematische Illustration der Objektdeformation in einem äußeren elektrischen Feld, und
Figur 7: schematische, vergrößerte Illustrationen erfindungsgemäß verwendeter Elektrodenanordnungen.
Die Erfindung wird im Folgenden beispielhaft unter Bezug auf die Untersuchung biologischer Zellen in einem fluidischen
Mikrosystem beschrieben. Es wird betont, dass die Umsetzung der Erfindung nicht auf die Untersuchung von biologischen Zellen beschränkt, sondern entsprechend, insbesondere mit den oben genannten Objekttypen möglich ist. Fluidische Mikro- Systeme mit Elektrodenanordnungen zur dielektrischen Manipulierung von suspendierten Partikeln sind an sich bekannt, so dass hier nur die zur Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlichen Einzelheiten erläutert werden.
Figur 1 zeigt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Messapparatur mit dem fluidischen Mikrosystem 10, der Detektoreinrichtung 20 und der Feldformungseinrichtung 30. Das fluidische Mikrosystem 10 ist nur ausschnittsweise mit einer Elektrodenanordnung von Käfigelektroden 1-4 und optional vorgesehenen Deformations- oder Impedanzmesselektroden 5, 6 gezeigt. Die Elektroden 1-6 sind an sich bekannte Mikroelektroden, die an Boden-, Seiten- und/oder Deckwänden eines Kompartiments, z. B. eines Kanals 12 des fluidischen Mikrosystems angeordnet sind. Der Kanal 12 wird in Pfeilrichtung A von einer Suspensionsflüssigkeit durchströmt. Zwischen den Elektrodenenden (Elektrodenspitzen) der Elektrodenanordnung 1-6 ist der Untersuchungsbereich 11 gebildet, in dem die unten erläuterte Positionierung und Deformation des zu untersuchenden Objekts 0 durchgeführt werden. Der Untersuchungsbereich 11 kann an einem Kreuzungspunkt des Kanals 12 mit einem weiteren Kanal (nicht dargestellt) des Mikrosystems gebildet sein, um das Objekt 0 im gehalterten Zustand ggf. einer Behandlungsflüssigkeit auszusetzen, die durch den weiteren Kanal zugeführt wird.
Die Detektoreinrichtung 20 umfasst ein Mikroskop 21, eine Kamera 22 und einen Bilddatenspeicher 23, die in bekannter Weise zusammenwirken. Das Mikroskop 21 ist beispielsweise ein 1X70, Hersteller: Olympus mit einer CCD-Kamera 22 vom Typ Sensicam Vision, Hersteller: Photonics.
Die Feldformungseinrichtung 30 enthält einen Hochfrequenzgenerator 31 und eine Schalteinrichtung 32. Beide Komponenten können in einer gemeinsamen Schaltung integriert sein. Der Hochfrequenzgenerator ist eine Spannungsquelle zur Erzeugung hochfrequenter elektrischer Spannungen, typischerweise im Spannungsbereich von 0.1 bis lOVrms und im Frequenzbereich von 1 kHz bis 100 MHz. Die Ausgangsspannungswerte, Phasen und Frequenzen der vom Hochfrequenzgenerator 31 generierten Spannungen sind vorzugsweise manuell oder mit der Steuereinrichtung 40 einstellbar.
Zur Manipulation, insbesondere Deformation, biologischer
Zellen mittels negativer Dielektrophorese kann die Frequenz der Hochfrequenzspannung vorteilhafterweise in Abhängigkeit von der Außenleitfähigkeit so eingestellt werden, dass die Membran der untersuchten Zelle vollständig geladen wird. Hierzu wird die Frequenz wesentlich geringer als der reziproke Wert der Membranrelaxationszeit τm gewählt (f«fm) . Die Membranrelaxationszeit hängt mit den Leitfähigkeiten gemäß Gleichung (2) zusammen:
Figure imgf000023_0001
In diesem Fall kann die Zelle gemäß Gleichung (3) lediglich elongiert werden.
PD = ^ε0εmE2 cos2 [®] (3) λ n
Bei hohen Frequenzen f»fm ist die Zellmembran kapazitiv überbrückt, so dass die Zelle in Abhängigkeit von den Außen- und Innenleitfähigkeiten entweder elongiert oder komprimiert wird (siehe Gleichung (1) , oben) . Der Hochfrequenzgenerator 31 ist zur Erzeugung von Spannungsverläufen entsprechend verschiedener Betriebsmodi der Messapparatur eingerichtet, die unten beispielhaft illustriert sind. Ein erster Betriebsmodus ist der Halte- oder Fangmodus, in dem das Objekt O (z. B. die biologische Zelle) im
Potentialminimum des von den Käfig-Elektroden 1-4 erzeugten dielektrischen Feldkäfigs gehaltert wird. Die Zelle 0 befindet sich trotz strömender , Suspensionsflüssigkeit (Pfeil A) im ruhenden Zustand. Die Ansteuerprotokolle der Käfig- Elektroden (Spannungen, Frequenzen, Phasen) sind aus der fluidischen Mikrosystemtechnik an sich bekannt. Im zweiten Betriebsmodus, nämlich dem Deformations-Modus werden derartige Spannungen erzeugt, dass auf die gehalterte Zelle 0 gerichtete Deformationskräfte ausgeübt werden (siehe unten) , wobei in diesem Zustand die Flüssigkeitsströmung gestoppt ist.
Mit der schematisch gezeigten Schalteinrichtung 32 wird der aktuell gewünschte Betriebsmodus ausgewählt, in dem die jeweiligen Elektroden mit der gewünschten Spannung beaufschlagt werden. Die Schalteinrichtung 32 kann einen Umschalter oder einen Phasenschieber umfassen und/oder in die Steuerung des Hochfrequenzgenerators 31 integriert sein. Bei beiden Varianten kann eine Betätigung mit der Steuerein- richtung 40 vorgesehen sein.
Das Bezugszeichen 50 verweist auf eine Fluidikeinrichtung, mit der die Suspensions- und/oder Behandlungsflüssigkeit im Kanal 12 des fluidischen Mikrosystems 10 bewegt wird. Die Fluidikeinrichtung 50 umfasst beispielsweise eine Pumpe, die ggf. mit der Steuereinrichtung 40 betätigbar ist.
Figur 2 zeigt die Käfigelektroden 1-4, l'-4' in vergrößerter Perspektivansicht. Die unteren vier Elektroden l'-4' sind auf dem Boden 13 des fluidischen Mikrosystems 10 angeordnet, während die Elektroden 1-4 an der Deckfläche (nicht dargestellt) angeordnet sind. Die Kanalrichtung entspricht der Strömungsrichtung A der Suspensionsflüssigkeit. Bei Beaufschlagung der Käfigelektroden mit hochfrequenten elektrischen Spannungen entsprechend einer der in der folgenden Tabelle angegebenen Ansteuerarten „trap rot", „trap ac I" oder „trap ac II" wird ein dielektrischer Feldkäfig mit einem punktförmigen Potentialminimum in der Mitte zwischen den Enden der Elektroden gebildet, an dem die zu untersuchende Zelle lokalisiert wird.
Elektrode/ 1 2 3 4 r 2' 3' 4'
Modus trap rot 0° 90° 180° 270° 180° 270° 90° 180° trap ac 1 0° 180° 0° 180° 180° 0° 180° 0° trap ac II 0° 180° 0° 180° 0° 180° 0° 180°
Stretch ac 1 0° 0° 180° 180° 0° 0° 180° 180°
Stretch ac II 0° 0° 0° 0° 180° 180° 180° 180°
Stretch ac III 0° Masse 180° Masse 0° Masse 180° Masse trap-stretch F^O0 F2/0° F-,/1800 F2 /180° Fi /0° F2 /180° Fι /180° F2 / 0°
Die Ansteuerart „trap rot" dient dem Einfangen der Zellen im Feldkäfig und einer Drehung der Zelle in eine vorbestimmte Ausrichtung relativ zum umgebenden Mikrosystem. Vorteilhafterweise können in diesem Fall Deformationen in bestimmten Richtungen untersucht werden. Die Ansteuerarten „trap ac I„ und „trap ac II" dienen dem Einfangen der Zelle im Feldkäfig ohne eine bestimmte Orientierung. Durch Umschalten der relativen Phasenlage zwischen den hochfrequenten Spannungen an den Käfig-Elektroden entsprechend den Ansteuerarten „stretch ac I" oder „stretch ac II" wird vom Fangmodus zum Deformationsmodus gewechselt. Durch die Polarisation der zu untersu- chenden Zellen werden bei den beispielhaft angegebenen Ansteuerarten Deformationskräfte parallel zu Strömungsrichtung A gebildet, so dass sich die Zelle deformiert (siehe Figur 5) . Ein weiterer Streckmodus „stretch ac III" erzeugt ein Deformationsfeld in einem Oktodenkäfig mit zwei gegenüberliegenden Elektrodenpaaren, wobei sich die anderen Elektroden auf Masse befinden. Außerdem ist ein „trap-stretch"-Modus angegeben, der demonstriert, wie gleichzeitig über verschiedene Elektroden ein Partikel bei einer Frequenz Fl deformiert werden kann und mit einer anderen Frequenz F2 in der vom Deformationsfeld geschwächten Richtung dielektrisch fokussiert werden kann. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung dieser Art der Ansteuerung im Zusammenhang mit einem Elektrodenfeld- käfig mit zwölf oder mehr Elektroden, wie beispielsweise in Figur 7C gezeigt. Dabei kann beispielsweise die Deformation mit den schmalen, zentralen beiden Elektrodenpaaren bei gleichzeitiger dielektrischer Fokussierung des Partikels durch die äußeren Elektroden des verbleibenden Oktodenkäfigs erfolgen.
Figur 3A zeigt Käfig-Elektroden 1, 2, 1 ' und 2 ' , die zur Bil- düng eines in Strömungsrichtung A offenen dielektrischen
Feldkäfigs eingerichtet sind. In der folgenden Tabelle sind entsprechend die Ansteuerarten für den Fangmodus „trap ac", in dem die Zellen in der Kanalmitte fokussiert werden, und dem Deformationsmodus „stretch ac I" oder „stretch ac II" zu- sammengestellt .
Elektrode/ 1 2 r 2' Modus trap ac 0° 180° 180° 0° stretch ac 1 180° 0° 180° 0° stretch ac II 180° 180° 0° 0°
In den Figuren 3B und 3C sind die elektrischen Potentiale für den „trap ac"-Modus (Figur 3B) und für den „stretch ac I"- Modus (Figur 3C) für die Käfigelektroden-Anordnung der Figur 3A dargestellt. Die Figuren 3B und 3C sind eine Schnittansicht des Kanals mit den geschnitten dargestellten Elektroden, wobei die Fliessrichtung des Kanals senkrecht zur Bild- ebene ist. In Figur 3B ist für den „trap ac I"-Modus die zentriert gehaltene Zelle mit Polarisationsladungen gezeichnet. Deutlich ist zu sehen, dass Zellen bei dieser Elektrodenanordnung auch ohne Streckfelder leichter als im Acht- Elektroden-Käfig deformiert werden können, da auf die Zelle in der auf der Ebene senkrecht stehenden Richtung, also in Strömungsrichtung, keine Kräfte wirken. Vorteilhafterweise kann eine weitere Homogenisierung des Streckfeldes (Figur 3C) mittels Zusatzelektroden, die in der Ebene zwischen den vorhandenen Elektroden angeordnet werden, erreicht werden.
In Figur 4 ist die Schrittfolge zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens schematisch illustriert. Nach einer Aufreihung (Schritt 100) , bei der eine Probe aus einer Vielzahl von Zellen in an sich bekannter Weise stromaufwärts vom Untersuchungsbereich 11 dielektrisch aufgereiht wird, erfolgt bei Schritt 200 die Positionierung eines Partikels im dielektrischen Feldkäfig der Käfigelektroden beispielsweise gemäß Figur 2. Anschließend folgt durch Änderung der Elektro- denansteuerung die Zelldeformation (Schritt 300) , wobei wäh- rend der Ausübung der Deformationskräfte und/oder nach Abschalten der Deformationskräfte die Deformation (Schritt 400) oder die Relaxation (Schritt 500) elektrisch oder optisch er- fasst wird. Anschließend oder zeitgleich (online) folgt bei Schritt 600 die Auswertung und quantitative Analyse der De- formation. In Abhängigkeit vom Ergebnis von Schritt 600 kann vorgesehen sein, dass eine weitere Deformation mit zugehöriger Detektion durchgeführt wird. Vor der weiteren Deformation kann ggf. eine Drehung des Objekts bei Schritt 200 vorgesehen sein. Schließlich folgt bei Schritt 700 die Entscheidung, ob ein weiteres Objekt untersucht oder die Messung beendet werden soll. Gegebenenfalls ist bei Schritt 800 die Ablage des Objekts in einem passenden Behälter oder auf einem Substrat, z. B. in einer Mikrotiterplatte vorgesehen.
Figur 5 zeigt beispielhaft die Deformation eines Erythrozyten in einem Feldkäfig durch Umschalten vom Fang- in den Deformationsmodus. Der Untersuchungsbereich besitzt einen Durchmesser von rd. 40 μm. Die Frequenz der Positionierungs- und Deformationsfelder beträgt 700 kHz (3Vrms) . Die Leitfähigkeit der Suspensionsflüssigkeit beträgt 0.3 S/m. Die Figuren 5A und B zeigen mikroskopische Abbildungen des Erythrozyten 0 im Fang- und Deformationsmodus. Die Figuren 5C bis D illustrieren die Feldverteilung in der horizontalen Zentralebene der Elektrodenanordnung gemäß Figur 2 im Fangmodus für die Ansteuerprotokolle „trap rot" oder „trap ac II". Es sind jeweils als Äquipotentiallinien die Verläufe der zeitlich gemittelten Werte des Quadrates des elektrischen Feldes (E2) in der zentralen horizontalen Ebene zwischen den Elektroden zu einem bestimmten Zeitpunkt dargestellt. Die auf das Objekt wirkenden Polarisationskräfte sind proportional zur Größe E2. Die Figur 5E zeigt den Verlauf von E2 im Streckmodus. Die Figur 5F zeigt das elektrische Potential f im Streckmodus bei Realisierung der Ansteuerart „stretch ac I".
Wie aus den Feldsimulationen hervorgeht, befindet sich eine Zelle, die zunächst zentral im Käfig gefangen war (Figur 5A, Nullfeld) bei Umschalten auf den Streckmodus in einem starken relativ homogenen (sattelförmigen) elektrischen Feld. Ohne äußere Störungen verbleibt die Zelle im Zentralbereich, wo sie deformiert wird (Figur 5B) . Experimentell verbleibt die Zelle bei gut äquilibrierter Fluidik bis zu einigen Sekunden im Zentralbereich, wo nach Um- bzw. Abschalten die Relaxation beobachtet werden kann. Diese Untersuchungen können im Fluss (siehe Figur 3) und ggf. an mehreren z. B. über mit trichterförmigen Feldbarrieren (durch „Trichter-Elektroden" oder sog. Funnel) aufgereihten Zellen parallel ausgeführt werden.
Bei der Messung der Deformation und/oder Relaxation (Schritte 400, 500) werden bspw. Bilder des Objekts 0, die mit der Detektoreinrichtung 20 aufgenommen wurden, vermessen. Es wird bspw. der Objektdurchmesser vor und während der Deformation erfasst. Zur Ermittlung von Relaxationszeiten wird eine entsprechende Zeitabhängigkeit aufgenommen. Wenn bspw. eine kugelförmige Zelle zu einem Ellipsoid deformiert wird, erfolgt eine Messung der Halbachsen des Ellipsoids . Aus den geo e- frischen Messwerten und/oder der ermittelten Zeitfunktion werden in Abhängigkeit vom angewendeten Modell die gewünschten elastischen Eigenschaften ermittelt.
Abweichend von der oben beispielhaft beschriebenen Verfah- rensweise können bei der Realisierung der Erfindung die folgenden Modifizierungen vorgesehen sein.
Es kann eine Parameteroptimierung vorgesehen sein, bspw. um das Objekt 0 möglichst gut im Zentrum des Untersuchungs- bereiches zu halten. Hierzu werden aus den Bilddaten der
Detektoreinrichtung Steuersignale abgeleitet, mit denen die Parameter der Ausgangsspannungen des Hochfrequenzgenerators eingestellt werden, bis die gewünschte Zentrierung gegeben ist. Ein entsprechender Regelkreis kann auf die Veränderung der Feldstärke oder Frequenz der Deformations-Felder gerichtet sein, um ein bestimmtes Deformationsergebnis zu erzielen. Es können feldstärke- und/oder frequenzabhängige Deformationsmessungen durchgeführt werden. Alternativ oder zusätzlich zum oben beschriebenen Streckmodus in horizontaler Ebene kann eine Deformation in einer anderen Richtung, z. B. in vertikaler Ebene durchgeführt werden. Des Weiteren kann eine gerichtete Streckung des Objekts 0 im Feldkäfig zu einer Nadelform vorgesehen sein.
Zur Optimierung der Positionierungs- oder Deformations-Felder können sich deren Frequenzen unterscheiden. Die Deformations- Felder können gleichzeitig zu einem permanent gebildeten Positionierungs-Feld erzeugt werden. Gemäß Gleichung (1) können elongierende oder komprimierende Felder gebildet werden.
Generell ist es möglich, sowohl das Fang- als auch das Streckfeld gleichzeitig und nicht alternierend einzukoppeln (beispielsweise "trap-stretch"-Modus) . Dies kann beispielsweise vorteilhafterweise dadurch geschehen, dass das Fangfeld und das Streckfeld mit unterschiedlichen Frequenzen arbeiten.
Anstelle der Acht- oder Vier-Elektrodenfeldkäfige können andere Elektrodengeometrien realisiert werden, wie sie an sich aus der fluidischen Mikrosystemtechnik bekannt sind. Es können bspw. Sechs-Pol-Elektrodenanordnungen realisiert werden.
Es kann darüber hinaus von Vorteil sein, Mehrelektrodenanordnungen, insbesondere Elektrodenanordnungen mit zwölf Elektroden, zur Erzeugung homogener Streckfelder bei praktisch unverändertem Fangfeld zu verwenden. Fig 7 zeigt das Quadrat der gemittelten Feldstärke E2 in der horizontalen Ebene zwischen den Elektroden. In den Figuren 7A und 7B sind Elektrodenanordnungen gezeigt, die den oben in Zusammenhang mit den Figuren 5A bis 5F beschriebenen entsprechen. Mit dem Pfeil wird die Fließrichtung des Kanals gekennzeichnet. In den Figuren 7C und 7D sind Elektrodenanordnungen mit insgesamt zwölf Elektroden gezeigt, von denen nur die oberen sechs Elektroden dargestellt sind. Vorzugsweise werden die zusätzlichen Elektroden mittig auf einer Ebene zwischen den acht Elektroden angebracht, wobei die zusätzlichen Elektroden den Kanal senkrecht zur Strömungsrichtung schneiden. Durch die Zusatzelektroden wird im Streckmodus das Feld in der Nähe des Fangpunktes homogener, so dass ein dort angeordnetes Partikel geringere dielektrophoretische Kräfte erfährt (siehe Figuren 7C und 7D) . Gerade dann, wenn sich die Strömung in Kanalrichtung nicht vollständig beruhigt hat, können die mittleren zusätzlichen Elektroden besonders vorteilhaft sein, da sie in Strömungsrichtung fokussieren. Die Ansteuerung ist im „stretch ac I"-Modus besonders einfach realisieren, da keine zusätzlichen Phasen benötigt werden. Die zusätzlichen Elektroden werden entsprechend der jeweils beiden benachbarten Elektroden entweder auf 0° oder 180° geschaltet.
Sowohl im Fall der acht Elektroden als auch im Fall der zwölf Elektroden ergibt sich im „stretch ac I"-Modus ein Sattel in der Mitte des Fangfeldes (siehe Fig. 7B und 7D) . Um dies zu vermeiden, kann es vorteilhaft sein, wenn die äußeren Grenzen der Elektrodenspitzen der schräg angeordneten Elektroden parallel zueinander verlaufen, wie dies in den Figuren 7E und 7F dargestellt ist. In den Figuren 7E und 7F sind die parallel verlaufenden äußeren Grenzen der Elektrodenspitzen im Zusammenhang mit einer Zwölf-Elektrodenanordnung gezeigt. Die parallel verlaufenden äußeren Grenzen der Elektrodenspitzen können jedoch auch im Fall einer Acht-Elektrodenan- Ordnung, wie sie in den Figuren 7A und 7B gezeigt ist, vorteilhaft angewendet werden. Allgemein sind parallel verlaufende äußere Grenzen der Elektrodenspitzen dazu geeignet, homogenere Streckfelder zu erzeugen. Das verbesserte homogene Streckfeld im Falle der parallel verlaufenden äußeren Grenzen der Elektrodenspitzen ist in der Figur 7F für den „stretch ac I"-Modus dargestellt. Eine andere Möglichkeit, eine höhere Homogenität zu erreichen, ist, dass die Elektroden nicht äquidistant angeordnet werden (nicht dargestellt) .
Die in der bevorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Untersuchung von mindestens einem deformierbaren Objekt (0) in einer Suspensionsflüssigkeit, mit den Schritten:
- Erzeugung eines elektrischen Positionierungs-Feldes und Positionierung des Objekts (0) in einem Potentialminimum des Positionierungs-Feldes,
- Erzeugung eines elektrischen Deformations-Feldes derart, dass eine Deformationskraft auf das Objekt (0) ausgeübt wird, und
- Detektion von mindestens einer Eigenschaft aus der Gruppe der dielektrischen, geometrischen und optischen Eigenschaften des Objekts (0) , dadurch gekennzeichnet, dass
- das Positionierungs-Feld in einem Kompartiment (12) eines fluidischen Mikrosystems (10) erzeugt wird, und - die Positionierung des Objekts (0) ohne Elektrodenkontakt oder in frei suspendiertem Zustand berührungslos erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Positionierung des Objekts (0) unter der Wirkung negativer Dielektrophorese oder unter der Wirkung positiver Dielektrophorese erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Erzeugung der Deformationskraft unter Wirkung negativer Dielektrophorese oder unter der Wirkung positiver Dielektrophorese er- folgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem die Detektion während oder nach der Deformation des Objekts (0) erfolgt und entsprechend eine Erfassung von Deformations- oder Relaxationseigenschaften des Objekts (0) umfasst.
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das Positionierungs-Feld als ein Hochfrequenz-Feldkäfig mit einer Käfig-Elektrodenanordnung (1-4, l'-4') erzeugt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der Hochfrequenz- Feldkäfig als geschlossener Feldkäfig mit einem punktförmigen Potentialminimum betrieben wird, in dem das Objekt (0) ruht.
7. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der Hochfrequenz- Feldkäfig als offener Feldkäfig mit einem linienförmigen Po- tentialminimum betrieben wird, durch das sich das Objekt (0) mit der Suspensionsflüssigkeit bewegt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, bei dem die Käfig-Elektrodenanordnung (1-4, l'-4') zur Erzeugung des De- formations-Feldes verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, bei dem eine separate Deformations-Elektrodenanordnung (5, 6) zur Erzeugung des Deformations-Feldes verwendet wird.
10. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Deformations-Feld für eine Dauer von 1 ms bis 500 ms eingestellt wird.
11. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Erzeugung des Deformations-Feldes im- pulsförmig erfolgt.
12. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Objekt (0) vor oder während der Erzeugung des Deformations-Feldes einer Behandlungsflüssigkeit ausgesetzt wird.
13. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, mit einer Mehrfachmessung, bei der die Schritte Erzeugung des Deformations-Feldes mit der Detektion und die Erzeugung des Positionierungs-Feldes abwechselnd mehrfach auf- einander folgend durchgeführt werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Mehrfachmessung für die Dauer von mindestens einer Sekunde durchgeführt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, bei dem das Positionierungs-Feld und/oder das Deformations-Feld in Abhängigkeit vom Ergebnis der jeweils vorhergehenden Detektion eingestellt oder verändert wird.
16. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 15, bei dem das Deformations-Feld und/oder das Positionierungs- Feld mehrfach so eingestellt wird, dass das Objekt (0) jeweils in verschiedenen Richtungen deformiert wird.
17. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem aus den detektierten dielektrischen, geometrischen und/oder optischen Eigenschaften viskoelastische Eigenschaften des Objekts (0) ermittelt werden.
18. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem vor dem Positionierungs-Schritt das Objekt (0) aus einer Probe ausgewählt wird, die einer dielektrischen Aufreihung unterzogen worden ist.
19. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Objekt (0) mindestens eine biologische Zelle, eine Zellgruppe, ein Zellbestandteil oder ein synthetisches Partikel umfasst.
20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem in Abhängigkeit von den detektierten dielektrischen, geometrischen und/oder optischen Eigenschaften zwischen normalen und veränderten Zellen oder zwischen normalen Zellen mit verschiedenen physiologi- sehen Eigenschaften unterschieden wird.
21. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem in Abhängigkeit von den detektierten dielektrischen, geometrischen und/oder optischen Eigenschaften Stammzellen erkannt werden.
22. Verfahren nach Anspruch 19, 20 oder 21, bei dem die dielektrischen, geometrischen und/oder optischen Eigenschaften der Zelle in Abhängigkeit von mindestens einem der folgenden Parameter detektiert werden: - Frequenz des Positionierungs-Feldes
- Frequenz des Deformations-Feldes,
- Spannung des Positionierungs-Feldes
- Spannung des Deformations-Feldes,
- Temperatur der Suspensions- oder Behandlungsflüssigkeiten, - stoffliche Zusammensetzung der Suspensions- oder Behandlungsflüssigkeiten,
- Dauer der einzelnen Deformation, und
- Dauer von mehreren Deformationen.
23. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 22, bei dem eine Vermessung von Zellpaaren oder Zeil-Aggregaten und/oder eine Trennung von Zellpaaren erfolgt.
24. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die Zellpaare oder Zeil-Aggregate im Positionierungs-Feld zusammen gebracht werden.
25. Messapparatur zur Untersuchung von mindestens einem Objekt, die umfasst:
- ein fluidisches Mikrosystem (10), das ein Kompartiment (12) mit mindestens einer Elektrodenanordnung (1-4, l'-4') aufweist, - eine Detektoreinrichtung (20), die zur elektrischen, geometrischen und/oder optischen Messung von Objekteigenschaften eingerichtet ist, und
- eine Feldformungseinrichtung (30) mit mindestens einem Hochfrequenzgenerator (31) , dadurch gekennzeichnet, dass
- die Feldformungseinrichtung (30) zwischen einem Betriebszustand, in dem im Kompartiment (12) mit der mindestens einen Elektrodenanordnung (1-4, l'-4') ein hochfrequentes Positionierungs-Feld erzeugt wird, und einem Betriebszustand umge- schaltet werden kann, in dem im Untersuchungsbereich (11) mit der mindestens einen Elektrodenanordnung ein Deformations- Feld erzeugt wird.
26. Messapparatur nach Anspruch 25, bei der die Feldformungs- einrichtung (30) eine Schalteinrichtung (32) enthält, mit der zwischen den Betriebszuständen umgeschaltet werden kann.
27. Messapparatur nach Anspruch 25 oder 26, bei der die Detektoreinrichtung (20) ein Mikroskop (21) mit einer Kamera (22) aufweist.
28. Messapparatur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche 25 bis 27, bei der das fluidische Mikrosystem (10) mit einer Fluidikeinrichtung (40) zur Bewegung einer Suspen- sions- und/oder einer Behandlungsflüssigkeit durch den Untersuchungsbereich (11) ausgestattet ist.
29. Messapparatur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche 25 bis 28, bei der eine Steuereinrichtung (50) vorgesehen ist, die mit der Detektoreinrichtung (20) und der Schalteinrichtung (32) verbunden ist.
30. Messapparatur nach Anspruch 29, bei der mit der Steuer- einrichtung (50) ein Regelkreis gebildet wird, in dem das Positionierungs-Feld und/oder das Deformations-Feld in Abhängigkeit vom Ergebnis der vorhergehenden Detektion eingestellt oder verändert werden kann.
31. Messapparatur nach mindestens einem der vorhergehenden
Ansprüche 25 bis 30, bei der die Elektrodenanordnung Elektroden mit Elektrodenspitzen umfasst, wobei die Elektrodenspitzen benachbarter Elektroden zumindest abschnittsweise parallel verlaufende Ränder aufweisen.
32. Messapparatur nach Anspruch 31, bei der die parallel verlaufenden Ränder parallel oder senkrecht zu einer Längsrichtung des Kompartiments des fluidischen Mikrosystems ausgerichtet sind.
33. Messapparatur nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche 25 bis 32, bei der im zweiten Betriebszustand das Positionierungsfeld und das Deformationsfeld gleichzeitig eingeschaltet sind.
34. Verwendung eines fluidischen Mikrosystems mit einem Hochfrequenz-Feldkäfig zur Untersuchung von Deformationsund/oder Relaxationseigenschaften biologischer Zellen.
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