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WO2005045033A1 - 遺伝子多型の検出方法 - Google Patents

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WO2005045033A1
WO2005045033A1 PCT/JP2004/016715 JP2004016715W WO2005045033A1 WO 2005045033 A1 WO2005045033 A1 WO 2005045033A1 JP 2004016715 W JP2004016715 W JP 2004016715W WO 2005045033 A1 WO2005045033 A1 WO 2005045033A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleotide
oligonucleotide
nucleotides
complementary
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2004/016715
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Makoto Koizumi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sankyo Co Ltd
Original Assignee
Sankyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sankyo Co Ltd filed Critical Sankyo Co Ltd
Priority to DE602004015832T priority Critical patent/DE602004015832D1/de
Priority to EP04799608A priority patent/EP1688493B1/en
Priority to US10/577,982 priority patent/US7906639B2/en
Priority to DK04799608T priority patent/DK1688493T3/da
Publication of WO2005045033A1 publication Critical patent/WO2005045033A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a ⁇ ? Polymorphism using PCR using an oligonucleotide containing an ENA unit, an oligonucleotide for detecting a gene polymorphism, and a gene polymorphism containing the oligonucleotide.
  • a method for detecting a ⁇ ? Polymorphism using PCR using an oligonucleotide containing an ENA unit, an oligonucleotide for detecting a gene polymorphism, and a gene polymorphism containing the oligonucleotide is about the kit. Background technology
  • polymorphisms and medicinal properties or polymorphisms and side effects has become a powerful ability to predict the effects and side effects of drugs on individual patients by diagnosing the disease.
  • Such an example includes a polymorphism of a drug metabolizing enzyme.
  • drug metabolizing enzymes whose activity increases or decreases due to polymorphism include cytochrome P4501A2, cytochrome P4502A6, cytochrome P4502C9, cytochrome P4 502C19, cytochrome P4502D6, and cytochrome P4502E1.
  • conjugating enzymes such as thiopurine methyltransferase, N-acetyltransferase, UDP-glyreuronosilyltransferase, and glutathione S-transranferase
  • conjugating enzymes such as thiopurine methyltransferase, N-acetyltransferase, UDP-glyreuronosilyltransferase, and glutathione S-transranferase
  • HLA ulcerative colitis
  • TCRa a cause of rheumatoid arthritis
  • APOE 4 a cause of Alzheimer's disease
  • dopamine D3 receptor as a cause of schizophrenia
  • Tributophan hydroxylase as a cause of manic depression
  • angiotensin precursor as a cause of albuminuria
  • blood coagulation factor VII as a cause of myocardial infarction
  • lebutin as a cause of obesity ⁇ ⁇ (Nature Genetics, 1999, Vol. 22, p. 139-144).
  • PCR polymerase chain reaction
  • SSCP Single-strand conformation ion polymorphism
  • the PCR—RFLP method is hard to say is an advanced method because the inspection process involves a treatment of 3 to 24 hours.
  • the SSCP method is excellent in that it can detect a solid or a plurality of mutations at high sensitivity somewhere in the target sequence.
  • the experimental conditions must be strictly controlled in order to detect a small difference in mobility, this method is very time-consuming and cannot identify the position of the mutation.
  • the SSCP method in order to carry out the SSCP method from an actual sample, for example, blood fibers, it is necessary to prepare a predetermined amount of nucleic acid in advance by using the cloning-inning-PCR method, so that a large number of samples can be efficiently processed. This is an appropriate training method.
  • the AS-PCR method is a method that applies PCR and does not require the preparation of a large amount of nucleic acid in advance, and is based on the fact that an amplified product can be obtained only when a primer with no mismatch near the 3 'end is used. This is a method suitable for efficiently providing a large number of samples. However, there is a mismatch in the primer in normal PCR :! ⁇ Even though there are amplification products, strictly '[There was a problem with the raw.
  • the 3 'end of the polymorphic portion to be detected is set at the 3' end, having a nucleoside having a Le base not complementary to the target gene
  • nucleotides 2'-0, 4 'ethylene nucleotides (hereinafter also referred to as " ⁇ nucleotides”) are non-natural nucleotides. Oligonucleotides into which nucleotides have been introduced have a high binding ability to complementary strand RNA (Japanese Patent No. 3420984 (Japanese Patent Publication No. JP-A-12-297097) and Bioorganic & Medical Chemistry , 2003, Vol. 11, p. 2211-2226.).
  • ENA nucleotides are It is characterized by having higher resistance to nucleases than LNA nucleotides (2'-0,4, methylene nucleotides (Japanese published special edition Matsuho, Japanese Patent Laid-Open No. 10-304889)), which are nucleotides cross-linked by a methylene chain. (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2002, Vol. 12, p. 73-76) However, it is unclear whether the accuracy of AS-PCR measurement can be improved by using ENA nucleotides as primers. And seven.
  • the present inventors conducted an investigation to solve the above-mentioned problems of the polymorphism detection method, and found that the polymorphic site was at the 3 ′ end, and that the ENA modification was added third from the 3 ′.
  • oligonucleotides were used as PCR primers, it was found that the amount of amplification products produced due to mismatches was reduced, and that gene polymorphisms could be detected with high accuracy. did.
  • the present inventors set the polymorphism site to 3 ′, set the second nucleotide from 3 ′ to a nucleotide having a base not complementary to the target feline to be detected, and set the third nucleotide from 3 ′ to
  • oligonucleotides to which ENA ii was added were used as PCR primers, it was found that the amount of amplification product generated due to mismatch was reduced, and that the 5-5 polymorphism could be detected with high accuracy.
  • the present invention provides a kit which can be used. Disclosure of Invention ''
  • An object of the present invention is to provide an oligonucleotide that can be used in a method for detecting a polymorphism and a »method, and further provide a kit for detecting a gene polymorphism containing the oligonucleotide.
  • the nucleotide at the 3 'end of the synthetic oligonucleotide primer is complementary to the nucleotide of type III.
  • the primer extension reaction by DNA polymerase does not proceed when the nucleotide is not targeted, and when a synthetic oligonucleotide primer that is completely complementary to the nucleotide sequence of the nucleic acid that becomes ⁇ is used, primer extension by DNA polymerase is used.
  • the present invention relates to a method of detecting a polymorphism in which a reaction occurs.
  • the present invention provides a polymorphic site at the 3 'end of the nucleotide sequence of a synthetic ligated nucleotide, and 2'-ft 4'-ethylene nucleotide as the third nucleotide from the 3' end.
  • the present invention relates to a method for detecting a polymorphism using an oligonucleotide using a nucleotide (ENA) unit as a primer.
  • ENA nucleotide
  • the present invention provides that the 3 'of the nucleotide sequence of the synthetic oligonucleotide is a polymorphic site, the second to third nucleotides are nucleotides having a don't complement to the target to be detected, and the third from the 3' end.
  • the present invention relates to a method for detecting a polymorphism, characterized in that an oligonucleotide using 2′-OA ′ ethylene nucleotide (ENA) unit as a nucleotide is used as a primer.
  • EDA 2′-OA ′ ethylene nucleotide
  • the ism of the present invention is a solution.
  • Oligonucleotides or salts thereof having the following characteristics (a) and (b): (a) the third nucleotide from the 3 'end of the oligonucleotide is 2'- ⁇ ,'-C-ethylene nucleotide ( ⁇ ⁇ ) consists of units, and the other nucleotides consist of naturally occurring nucleotides;
  • nucleotides complementary to the reference nucleotide of the target gene at the end, nucleotides complementary to the reference nucleotide of the target gene, and at other positions, nucleotides complementary to the nucleotide sequence of the target gene;
  • the third nucleotide from the 3 'end of the oligonucleotide consists of a 2'-OA'-ethylene nucleotide (ENA) unit, and the other nucleotides consist of naturally occurring nucleotides;
  • oligonucleotide 3 consisting of a nucleotide complementary to the reference nucleotide of the gene of interest
  • the second nucleotide from the 3'-end of the oligonucleotide (the second nucleotide with the 3'-terminal nucleotide as the first nucleotide) consists of nucleotides that are not complementary to the reference nucleotide;
  • the third to third nucleotides of the oligonucleotide are composed of 2'-OA' ethylene nucleotide (ENA) units, and the other nucleotides are naturally occurring nucleotides. Consisting of nucleotides, (4) An oligonucleotide having the following (a) to (d) or a salt thereof:
  • position 3 of the oligonucleotide consists of a nucleotide complementary to the mutant nucleotide of the gene of interest;
  • the second to third nucleotides of the oligonucleotide are nucleotides that are not complementary to the reference nucleotide;
  • the 3rd to 3rd nucleotides of the oligonucleotide (the 3rd nucleotide is the 1st and the 3rd nucleotide) consist of 2'-ft 4'-ethylene nucleotide (ENA) units, and the other nucleotides are natural. Consisting of nucleotides of the type
  • a method for detecting a feT polymorphism which comprises using the oligonucleotide according to any one of (1) to (5).
  • a method for determining the nucleotide sequence of a polymorphic site comprising: shelving the oligonucleotide according to any one of (1) to (5).
  • a method for detecting a gene polymorphism comprising the following steps (a) and (b):
  • nucleic acid containing the polymorphic site is defined as type III, and the oligonucleotide described in any one of (1) to (5), and the target sequence portion is paired with the oligonucleotide by PCR. Performing PCR using an oligonucleotide that can be amplified;
  • step (b) a step of judging the presence or absence of a gene polymorphism in the nucleic acid based on whether or not a reaction product is generated in the step (a);
  • step (b) determining the nucleotide sequence of the polymorphic site in the nucleic acid depending on whether or not a reaction product is produced in step (a);
  • a kit for detecting a gene polymorphism comprising the following (a) to (d):
  • the 3rd to 3rd nucleotides of the oligonucleotide consist of 2'-0,4'-C-ethylene nucleotide (ENA) units, and the other nucleotides consist of natural nucleotides and are targeted at position 3.
  • a kit for detecting a gene polymorphism comprising the following (a) to (d):
  • the 3rd to 3rd nucleotides of the oligonucleotide consist of 2'-ft 4 'ethylenic nucleotide (ENA) units, and the other nucleotides consist of natural nucleotides.
  • Nucleotides complementary nucleotides, or oligonucleotides having nucleotides at other positions complementary to the nucleotide sequence of the gene of interest;
  • a kit for detecting a gene polymorphism comprising the following (a) to (e):
  • the third to third nucleotides of the oligonucleotide consist of 2'-0,4'-ethylen nucleotide (ENA) units, the other nucleotides consist of natural nucleotides, and the target nucleotide at position 3
  • the third nucleotide from the 3'3 ⁇ 4 of the oligonucleotide consists of 2, -0,4'-ethylen nucleotide (ENA) units, and the other nucleotides consist of natural nucleotides, and are located at the 3 ' « ⁇ position.
  • Kit for detecting residual ⁇ ? Polymorphism including the following (a) to (d):
  • the 3 '* 3 ⁇ 43 ⁇ 4 position of the oligonucleotide consists of a nucleotide complementary to the reference nucleotide of the gene of interest;
  • the second nucleotide from the 3'-end of the oligonucleotide (ii) consists of a nucleotide that is not complementary to the nucleotide of the reference gene;
  • the third nucleotide from the 3 'of the oligonucleotide is ⁇ -. , 4, Ethylene nucleotides ( ⁇ ) unit; other nucleotides consist of natural nucleotides;
  • a kit for detecting a gene polymorphism comprising the following (a) to (d):
  • the 3'-end of the oligonucleotide consists of a nucleotide complementary to the mutant nucleotide of the target gene
  • the 3rd to 3rd nucleotides of the oligonucleotide are 2'-0,4, ethylene nucleotide (ENA) units, and the other nucleotides are natural Consisting of the nucleotides of
  • a kit for detecting a gene polymorphism comprising the following (a) to (e):
  • the 3'-position of the oligonucleotide consists of a nucleotide complementary to the »nucleotide of the gene of interest;
  • the second to third nucleotides of the oligonucleotide (the second nucleotide with the 3 'nucleotide as the first) comprise a nucleotide that is not complementary to the reference nucleotide;
  • the third nucleotide from the 3 ' ⁇ of the oligonucleotide (the third nucleotide with the 3' terminal nucleotide as the first nucleotide) becomes 2'-0,4 'ethylene nucleotide (ENA) unit, and the other nucleotides Consisting of naturally occurring nucleotides;
  • the second to third nucleotides of the oligonucleotide (the second nucleotide with the 3 'nucleotide as the first) comprise a nucleotide that is not complementary to the nucleotide of ⁇ P;
  • the 3rd to 3rd nucleotides of the oligonucleotide are 2'-0A, ethylene nucleotide (ENA) units, and the other nucleotides are natural nucleotides. Become.
  • the oligonucleotide and the salt fi of the oligonucleotide capable of amplifying the target sequence portion in combination with the oligonucleotide have a length of 18 to 25 bases;
  • One S of the method for detecting polymorphism in the present invention is as follows.
  • Figure 1 shows that there is no mutation (polymorphism) in the nucleic acid sequence: ⁇ .
  • ⁇ is the target nucleic acid to be examined for mutation (polymorphism) in the nucleic acid sequence, and has a 3′-ATGC-5 ′ sequence as a part of the seed sequence.
  • the ⁇ -nucleic acid and the third from the 3 'to the third ⁇ (the oligonucleotide (ii) to which the gene was added (2'-ft 4'-CX.
  • Tylene-5-methylperidine unit is referred to as eT)
  • eT Tylene-5-methylperidine unit
  • 2 at least 3,53 ⁇ 4 of the base sequence (ii) is complementary to the corresponding: ⁇ , and (11) and (1) are double-stranded.
  • Nucleic acid synthase (iii) recognizes the 3-terminal portion of the oligonucleotide (ii) forming the double strand, and the nucleic acid synthesis reaction continues.
  • the specific donkey sequence shown here is for explanation, and does not mean that it is effective only for this nucleotide sequence.
  • Figure 2 shows mutations in the nucleic acid sequence (there is a large number: ⁇ .)
  • (I) Mutations in the nucleic acid sequence (a type I nucleic acid of which the number is to be examined, and 3'-ATAC-5 This type III nucleic acid and an oligonucleotide with a 3rd ENA modification added from 3 '(ii) (2'-OA'-C-ethylene-5-methylperidine unit is denoted as eT
  • at least three of the base sequences in (ii) are not complementary to the corresponding base, and the 3′-terminal C in (ii) Does not form a Watson one-click pair with A in (i), and the nucleic acid synthetase (iii) replaces the 3 'terminal portion of the oligonucleotide (ii) that does not form a Watson one-click base pair.
  • the nucleic acid synthesis reaction cannot proceed because the recognition is not possible. It does not mean that it is effective only
  • Another pressure in the method for detecting polymorphism in the present invention is as follows. ,
  • the age at which the bases at the 3rd end are complementary is 13 nucleic acid synthesis reactions, and when they are not complementary, nucleotide sequence mutations can be detected by taking advantage of the difference that no nucleation reaction occurs. it can. This i a will be described with reference to FIGS. 3 and 4.
  • FIG. 3 shows a case where there is no mutation (polymorphism) in the nucleic acid sequence.
  • ⁇ is the nucleic acid to be examined for mutation (polymorphism) in the nucleic acid sequence, and has a 3′-ATGC-5 ′ sequence as a part of the sequence.
  • (Ii) is the primer.
  • the 3 'to 2nd nucleoside is changed to a nucleoside that is not complementary to the gene to be detected (guanine (G) in the figure), and the other nucleosides are nucleosides that are complementary to the target ⁇ ? It is.
  • the third from the 3 ' is a modified oligonucleotide (2'-ft 4' ethylene-5-methylperidine unit).
  • nucleotide sequence other than the second from 3 ′ in the nucleotide sequence of (ii) is complementary to the corresponding nucleotide sequence in (i), and the 3 ′ nucleotide sequence in (ii) Although it is the second mismatch, the nucleic acid and polymorphism detection J-primer form a double-stranded chain.
  • the nucleic acid synthase ⁇ recognizes the portion 3 of the oligonucleotide ⁇ i) forming the complementary strand, and the nucleation reaction continues.
  • nucleotide sequence shown here is merely an example for explanation, and does not mean that the present invention is effective only for this nucleotide sequence.
  • FIG. 4 shows a case where there is a mutation (polymorphism) in the nucleotide sequence.
  • (0 is the nucleotide sequence of the nucleotide sequence that is to be examined for mutation (multi-shift), and has a 3′-ATAC-5 ′ sequence in the nucleotide sequence.
  • (Ii) is a primer.
  • the 3 'and 3' end nucleosides are changed to nucleosides that are not complementary to the gene to be detected (guanine (G) in the figure), and the other nucleosides are nucleosides that are complementary to the gene to be detected.
  • the third from the 3 ' is an oligonucleotide to which ⁇ »is added (2'-ft 4'-C-ethylene-5-methylperidine unit is referred to as eT).
  • eT an oligonucleotide to which ⁇ »is added
  • the second nucleoside from 3, «and 3 ' is not a pair.
  • the nucleoside complementary to the nucleoside of Sf is not formed, and the 3' terminal of (ii) is a Watson one-click base pair.
  • Origonuku Reochido (i i) of 3 not forming a Sonkuritsuku pair, can not recognize the portion of the terminal KakuyowaiNaru enzyme (i i i) is a nucleic acid synthesis reaction have a progress.
  • nucleotide sequence shown here is merely an example for explanation, and does not mean that the present invention is effective only for this nucleotide sequence.
  • a novel method for detecting a gene polymorphism has been provided.
  • a natural oligonucleotide is used: Polymorphisms can be detected more accurately than ⁇ .
  • oligonucleotides for detecting ⁇ -polymorphism and kits for detection of ⁇ -polymorphism containing the oligonucleotide, which can be used in the 3 ⁇ 4 ⁇ method.
  • ⁇ type ⁇ means that in a certain site, (a) (Single nucleotide polymorphism (S NP)) and Z or (b) 1 to several tens: ⁇ (sometimes several thousand bases) deleted or inserted (inserted / Deletion polymorphism).
  • S NP Single nucleotide polymorphism
  • ⁇ sometimes several thousand bases
  • the ass polymorphism is also referred to as SNP (single nucleotide polymorphism) and refers to a difference of 1: K in a nucleotide sequence between individuals.
  • the target ⁇ 3 ⁇ 4 refers to a target whose gene polymorphism is to be detected.
  • a sequence containing a nucleotide having a high occurrence among two types of mutations at a single nucleotide polymorphism site of a target gene is defined as a reference sequence, and a nucleotide having a single nucleotide polymorphism substitution in the reference sequence is used as a reference sequence.
  • a sequence containing a nucleotide having a low occurrence » is defined as a mutant sequence
  • a nucleotide at a single nucleotide polymorphism site in the mutant sequence is defined as a mutant nucleotide.
  • a sequence without deletion is used as a reference sequence, and a sequence with deletion is referred to as a mutant sequence.
  • polymorphism is an insertion polymorphism: In the case of t, the sequence without insertion is used as a reference sequence, and the sequence with insertion is used as a mutant sequence.
  • the phrase “having a polymorphism” means that the sequence containing the target polymorphism of the subject has an inversion sequence, and the phrase “having no polymorphism” means that the sequence does not have the polymorphism. It means that the sequence containing the target polymorphism of the gene is the reference sequence.
  • natural nucleotide refers to adenine nucleotide, guanine nucleotide, cytosine nucleotide, peracil nucleotide, or thymine nucleotide.
  • natural oligonucleotide J refers to an oligonucleotide composed of natural nucleotides such as adenine nucleotide, guanine nucleotide, cytosine nucleotide, peracyl nucleotide, thymine nucleotide and the like.
  • adenine nucleotides ⁇ A P guanine nucleotides may be denoted by G p
  • cytosine nucleotides may be denoted by C p
  • thymine nucleotides may be denoted by T p .
  • the nucleoside at the 3 'end of the natural type oligonucleotide, adenine nucleoside can be expressed as A guanine nucleoside, G cytosine nucleoside as Ct, and thymine nucleoside as Tt.
  • ENA nucleotide is a nucleotide obtained by crosslinking the 2 ′ oxygen atom and the 4 ′ carbon atom of crane ⁇ with an ethylene chain (Japanese Patent No. 3420984). No.
  • ⁇ 2, -0,4 'ethylene nucleotide units and units'' means A e2p , G e2p , C e2p , 5C e2p , T e2p , or at the 3 ′ end of the oligonucleotide: ⁇ ,
  • ENA When ENA is treated as a nucleoside, it means a group selected from C e2t , 5C e2t , and T e2t , and its structure is as shown below. Also shows the structure of a C elp as LNA Yuni' bets.
  • the term "complementary nucleotide” refers to a nucleotide in which the base portion of the nucleotide is the same, and specifically, the base portion is adenine and thymine, guanine and cytosine, and adenine and peracil. Certain nucleotides are complementary to each other.
  • the compound of the present invention can be converted into a salt, and refers to a salt thereof.
  • a salt is preferably a sodium salt, a potassium salt, a lithium salt or the like.
  • Metal salts such as alkaline earth metal salts, potassium salts, magnesium salts, alkaline earth metal salts, arylene salts, iron salts, copper salts, nickel salts, cobalt salts, etc .; inorganic salts such as ammonium salts , T-octylamine, dibenzylamine, morpholine, dalcosamine, phenyldaricin alkyl ester, ethylenediamine, N-methyldalkamine, guanidine, getylamine, triethylamine, dicyclohexylamine, N, N, Dibenzylethylenediamine salt, black mouth pro-force salt, pro-force salt, jetanol Ami, such as organic salts such as 3 ⁇ 4, N-benzyleneethylamine salt, piperazine salt, tetramethylammonium salt, tris (hydroxymethyl) amino methane salt, etc.
  • inorganic salts such as ammonium salts , T-o
  • Is a halogen atom such as citrate, hydroiodide; inorganic acid salts such as nitrate, perchlorate, sulphate, and phosphate; methanesulfonate, methanesulfone m Lower aryl sulfonates such as ethanesulfonate, aryl sulfonates such as benzene sulfonate, p-toluene sulfonate, acetate, lincoate, fumarylate, succinate, Organic salts such as citrate, m ⁇ , »salt, maleate; and amino acids such as darich, lysine, arginine, ornithi, daltamate, aspartate ? .
  • the compounds of the present invention and salts thereof can also exist as hydrates, and the present invention also includes those oral products.
  • a sample containing a nucleic acid can be used as a sample for detecting a polymorphism.
  • the nucleic acid include, but are not limited to, genomic DNA.
  • genomic DNA can easily be obtained by the ⁇ 0 method.
  • genomic DNAs derived from other organisms can be obtained in the same manner.
  • any cells (excluding ⁇ m cells) and ⁇ collected from the sheath can be used, and preferably, leukocytes or «spheres isolated from the peripheral blood of sisters are used. Yes, most white blood cells. These materials can be collected by methods commonly used in clinical tests.
  • genomic DNA including RNA
  • SDS dodecyl sodium
  • RNA can be recruited by RNAse if necessary.
  • the present invention is not limited to this.
  • a method known in the sickle field of the present invention that is, 3 ⁇ 41 (for example, see Sambrook, J. et al. (1989): “Molecular Cloning: ALaboratory Manual (2nd Ed.)", Cold Spring Harbor Laboratory, NY), or a method using a commercially available DNA extraction kit is also preferably used. it can.
  • a specimen containing DNA can be used for PCR.
  • An exudate, a purified product, etc. from a sample can be used. 3. Selection of target ⁇ ?
  • the gene for which a gene polymorphism is to be detected may be any gene as long as at least the nucleotide sequence of " ⁇ " is already known and a polymorphism is present in that portion.
  • ⁇ ⁇ ⁇ Cytochrome P 4 5 0 1 which is a drug metabolic residue ⁇ 5 ⁇ involved in side effects of drugs
  • cytochrome ⁇ 450 0 2 ⁇ 6, cytochrome ⁇ 450 0 2 C9, cytochrome P 450 2C 19, cytochrome ⁇ 450 02 D6, cytochrome P 450 0 2E 1 Etc. are known.
  • thiopurine methyltransferase, N-acetyltransferase, UDP-darkuuronosyltransferase, and daltathione S-transferase ⁇ which are associated with the disease HLA as a causative gene
  • TCR ⁇ as a causative gene for rheumatoid arthritis
  • APOE.4 as a causative gene for Alzheimer's disease
  • dopamine D3 receptor as a causal gene for schizophrenia
  • manic depression As a causative gene in rice Examples include tofu hydroxylase, angiotensin precursor as a causative gene for albuminuria, blood coagulation factor VII as a causative gene for myocardial infarction, and lebutin as a causative gene for obesity.
  • Other examples include human prothrombin.
  • mouse genomic DNA When mouse genomic DNA is used as a sample, polymorphisms and deletions on the promoter of mouse Angiopoietin-1 ike 3 can also be mentioned.
  • the position of the polymorphism in the gene may be any one of a regulatory region such as a translation region, a non-translation region promoter, an intron, and other regions. 4. Oligonucleotide primer
  • oligonucleotides can be synthesized using a nucleic acid automated male.
  • Natural oligonucleotides can be synthesized using natural phosphoramidites.
  • 2′-ft 4 ′ ethylene nucleotide see Example 14 of Patent No. 342098 (5′-0-dimethoxytrityl-2, -0, 4′-C-ethylene-6-N-benzoyladenosine-3, -0-(2-cyanoethyl N, N-diisopropyl) phosphoramidite), male 27 (5, -0-dimethoxytrityl -2 '-0, 4' -C -ethylene-2-N-isobutyrylguanosine -3'-0- (2-Cyanethyl ⁇ , ⁇ -diisopropyl) phosphoramidite), Example 5 (5'-0-dimethoxytrityl-2'-0, 4'-C-ethylene-4-4--- -Benzylcytidine-3'-0- (2-cyanoethyl ⁇ , ⁇ -diiso
  • Example 9 (5'-0-dimethoxytriti-0 , 4,-C-E Len - 5 main Chiruurijin - 3 '- 0 - (2-Shianoechiru New, New - diisopropyl) can be synthesized by using the I ⁇ product according to phosphoramidite).
  • Oligonucleotides for detecting polymorphisms used in the present invention include the following (a) and (b).
  • the third nucleotide from the 3 ' ⁇ ⁇ ⁇ of the oligonucleotide comprises a 2'-0-ethylene nucleotide (ENA) unit;
  • EAA 2'-0-ethylene nucleotide
  • the nucleotide length of the oligonucleotide primer is not particularly limited as long as the nucleic acid can be amplified by PCR, preferably from 15 to 40 nucleotides, more preferably from 18 to 35 nucleotides, and still more preferably from 18 to 25 nucleotides. It is an oligonucleotide.
  • oligonucleotide having such a body is hereinafter referred to as “X_PRIMER”.
  • the third nucleotide from the 3 'of the oligonucleotide is a 2'- ⁇ , ⁇ '-ethylene nucleotide ( ⁇ ) unit, and the other nucleotides are Consisting of the nucleotides of
  • the nucleotide length of the oligonucleotide is not particularly limited as long as the nucleic acid can be amplified by PCR, but is preferably from 15 to 40 nucleotides, more preferably from 18 to 35 nucleotides, and still more preferably from 18 to 25 nucleotides. Oligonucleotide.
  • the 3rd to 3rd nucleotide of the oligonucleotide is a 2′-ft 4 ′ ethylene nucleotide (ENA) unit, which means that the 3rd nucleotide is a natural nucleotide. It means that it is an ENA nucleotide, not a type nucleotide.
  • ENA ethylene nucleotide
  • Y-PRIMERJ An oligonucleotide having such a ⁇ is hereinafter referred to as “Y-PRIMERJ”.
  • the 3 'position of the 0 oligonucleotide consists of a nucleotide complementary to the reference nucleotide of the gene of interest
  • nucleotide consisting of a nucleotide which is not complementary to the nucleotide of the 3 'to 2nd nucleotide (the second being the 3' nucleotide as the first nucleotide) of the oligonucleotide reference gene,
  • the 3rd to 3rd nucleotides are 2'-ft 4'-ethylene nucleotide (ENA) units, and the other nucleotides are Consisting of nucleotides,
  • the nucleotide length of the oligonucleotide is not particularly limited as long as the nucleic acid can be amplified by PCR, but is preferably 15 to 40 nucleotides, more preferably 18 to 35 nucleotides, and still more preferably It is an oligonucleotide consisting of 18 to 25 nucleotides.
  • An oligonucleotide having such a body is hereinafter referred to as "N-PRIMERJ.”
  • the third nucleotide from the third is ⁇ ⁇ ⁇ an oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the self-transition sequence '
  • oligonucleotide (0,3 of the oligonucleotide consists of a nucleotide complementary to the target mutant nucleotide
  • the second to third nucleotides of the oligonucleotide are nucleotides that are not complementary to the reference nucleotide;
  • the other site has a nucleotide complementary to the nucleotide of the gene of interest.
  • the 3rd to 3rd nucleotide (3rd nucleotide is 1st and 3rd nucleotide) of the oligonucleotide is 2'-ft 4 'Ethylene nucleotide (ENA) unit, other nucleotides are ⁇ ⁇ nucleotides,
  • the nucleotide length of the oligonucleotide is not particularly limited as long as the nucleic acid can be amplified by PCR, but is preferably 15 to 40 nucleotides, more preferably 18 to 35 nucleotides, and still more preferably It is an oligonucleotide consisting of 18 to 25 nucleotides.
  • P—PRIMERJ Such an oligonucleotide having a is hereinafter referred to as “P—PRIMERJ”.
  • the 3rd to 3rd nucleotide of the oligonucleotide is a 2′-ft 4 ′ ethylene nucleotide (ENA) unit, which means that the 3rd nucleotide is a natural nucleotide. This means that it is an ENA nucleotide that is different from that of the nucleotide. For example, it means that instead A e2p of A p, G e2p instead of G p, 5C e2p or C e 2 p instead of C p, is T e 2 p instead of T p is used.
  • ENA ethylene nucleotide
  • oligonucleotides (a) to (d) may be referred to as forward primers for PCR (Forward primer).
  • the nucleotide sequence of the oligonucleotide used as a pair with the oligonucleotide according to any one of (a) to (d) described in (1) above is the nucleotide of the gene for which a gene polymorphism is to be detected:
  • the sequence as long as the target sequence in the target gene can be amplified by PCR in combination with the oligonucleotide for detecting a gene polymorphism in any of (a) to (d) in (1) above.
  • the sequence is not particularly limited, but specifically, 15 to 40 consecutive nucleotides in the sequence of the complementary strand, which is located at the 5 'end region further from the most 5' end position in the sequence corresponding to the complementary strand, preferably Consists of any partial sequence of 18 to 35 nucleotides, more preferably 18 to 25 nucleotides.
  • oligonucleotides used in pairs with oligonucleotides for detecting polymorphisms have complementary sequences to each other, non-specific sequences are amplified by annealing with each other, resulting in specific gene multiplication. It is preferable to design oligonucleotides and paired oligonucleotides avoiding such a combination because they may hinder detection of the type.
  • a paired oligonucleotide may be referred to as a reverse primer (Reverse primer).
  • the oligonucleotide for detecting 3 ⁇ 4 ⁇ polymorphism (TaqMan PCR) used in TaqMan PCR is labeled at the 5 'end with a fluorescent reporter dye such as FAM or VIC, and at the same time, labeled at the 3' end with quencher.
  • a fluorescent reporter dye such as FAM or VIC
  • the sequence of the TaqMan probe used in combination with any one of the oligonucleotides (a) to (d) described in (1) above is the nucleotide of the target for which a polymorphism is to be detected.
  • the target sequence in the target There is no particular limitation as long as amplification is possible, but specifically, the most continuous sequence in the sequence corresponding to the 5'-most region of the sequence corresponding to the complementary strand and the 5'-most region from the position of the terminal ⁇ J.
  • oligonucleotides for detection of ⁇ -polymorphism and the Ta QM a ⁇ probe have complementary sequences, annealing to each other will amplify non-specific sequences, resulting in amplification of non-specific sequences. It is preferable to design oligonucleotides and TaqMan probes avoiding such a combination because they may hinder detection of the type. 5. Detection of ⁇ ? Polymorphism
  • Oligonucleotide primers any of (a) to (d) designed in (4) Oligonucleotide primers, (1) Oligonucleotides for detecting polymorphisms in the section (1) Oligonucleotides for detecting polymorphisms
  • Oligonucleotides for detecting polymorphisms By performing a PCR reaction using the oligonucleotide and an oligonucleotide used in combination with the nucleotide, a polymorphism at a predetermined position of the fiber ⁇ ? Can be detected.
  • PCR is used for (i) a combination of "X-PR IMER ⁇ " and an oligonucleotide used in combination with the primer, and (ii) a combination of "Y-PR IMER" and the primer.
  • the PCR reaction conditions are not particularly limited as long as the desired nucleic acid sequence can be amplified, and the PCR can be performed under conditions that are well known to those skilled in the art.For example, the PCR can be performed as follows.
  • the nuclease depending on the type of the nucleic acid in (1), it is possible to use one selected from DM polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase.
  • examples of the DNA polymerase include Taq DNA polymerase derived from Thermus aquaticus, Tth DNA polymerase derived from Thermus thermophilus, K0D derived from Pyrococcus, Pfu or PTO DNA polymerase, or a mixture of the above-mentioned Oki I raw polymerase.
  • the present invention is not limited to these. Since Tth DNA polymerase also has RT activity, when RT-PCR is performed in one tube-one ste, it has the characteristic that it can be covered by one type of enzyme.
  • Reverse transcriptase refers to an enzyme that can reverse transcribe RNA into cDNA.
  • Reverse transcriptase includes reverse transcriptase derived from avian retrovirus such as Rous associated virus (RAV) and Avian myeloblastosis virus (AMV), and reverse transcriptase derived from mouse retrovirus such as Moloney murine leukemia virus (MMLV) Alternatively, it includes, but is not limited to, an abominable Tth DNA polymerase.
  • the PCR reaction is, for example, as follows.
  • reaction fibers examples include:
  • Taq polymerase 1 to 2.5 units of Taq polymerase (preferably 2.5 units);
  • Reaction? Conditions First heat at 94 ° C for 2 minutes, then at 90-95, preferably 94 ° C) for 30 seconds, at 40-65 ° C or more preferably, calculated from the characteristics of the primer ( ⁇ fi) cycle of 70 minutes to 75 (preferably 72 ° C) for 1.5 seconds, 28 to 50 cycles, preferably 30 cycles, in the range from m) to 20 degrees lower than that. Repeat, then cool to room temperature.
  • reaction solution is subjected to electrolysis to detect whether a band having the size of the target sequence has been amplified.
  • the oligonucleotide in the polymorphic portion is X-
  • the nucleotide can be determined to be a nucleotide complementary to the 3'-terminal oligonucleotide of PRIMER, and it can be determined that there is no polymorphism.
  • the oligonucleotide of the polymorphic portion is not a nucleotide complementary to the oligonucleotide at the 3 ′ end of X-PR ⁇ ER, and is determined to have the polymorphism. can do.
  • the oligonucleotide of the polymorphic portion was Y—PRIMER 3 'It can be determined that it is a nucleotide complementary to the oligonucleotide at the terminal, and that it has a polymorphism.
  • the target sequence when the target sequence is not amplified, it can be determined that the oligonucleotide at the polymorphic portion is not a nucleotide complementary to the oligonucleotide at the 3 'end of Y-PRIMER, and the ⁇ -polymorphism is present. Otherwise, you can decide.
  • Amplification of the target sequence was confirmed by PCR using the combination of X-PR IMER and the oligonucleotide used in combination with the primer, and used in combination with Y-PR IMER and the primer.
  • the amplification of the target sequence by PCR in combination with the oligonucleotide to be obtained cannot be recognized as IS: ⁇ can be determined to have no genetic polymorphism.
  • the amplification range of the target sequence could not be recognized by PCR due to the combination of X-PR IMER and the oligonucleotide used as a pair with the primer, and Y-PRIME
  • amplification of the target sequence can be confirmed by PCR using a combination of R and the oligonucleotide used as a pair with the primer, it is determined to have a genetic polymorphism. be able to.
  • the oligonucleotide of the polymorphic portion was identified as “N-PRIMER”. Can be determined as a nucleotide complementary to the 3 ′ oligonucleotide, and no polymorphism can be determined.
  • the target sequence is not amplified, it is possible to judge that the oligonucleotide at the polymorphic portion is not a nucleotide complementary to the oligonucleotide at the terminal 3 of “N-PRI MER”. It can be understood that the
  • the oligonucleotide of the polymorphic portion was identified as “P— PRIMER ”can be judged as a nucleotide complementary to the 3′-terminal oligonucleotide, and can be judged as having a polymorphism.
  • the target sequence when the target sequence is not amplified, it can be judged that the oligonucleotide of the polymorphic portion is not a nucleotide complementary to the 3 ′ oligo nucleotide of “P—PRI MER”, and If you do not have it, you can judge it.
  • Amplification of the target sequence was confirmed by PCR using a combination of “N-PR IMER” and the oligonucleotide used as a pair with the primer, and “P-PRIMERJ was used in combination with the primer. If amplification of the target sequence cannot be confirmed by PCR in combination with the oligonucleotide to be used, it can be determined that there is no gene polymorphism.
  • the amplification of the target sequence by PCR using the combination of N-PRIMERJ and the oligonucleotide used as a pair with the primer was not recognized, and "P-PRIMER" was used in combination with the nucleotide. If amplification of the target sequence is confirmed by PCR using the combination with the oligonucleotide to be used, it can be determined to have a genetic polymorphism.
  • the oligonucleotide in the polymorphic portion is X—PRIMER 3 , It can be determined that the nucleotide is complementary to the terminal oligonucleotide and that there is no polymorphism.
  • the oligonucleotide of the polymorphic portion is not a nucleotide complementary to the oligonucleotide at the 3 ′ end of X-PR PRER. It can be determined to have a polymorphism.
  • the oligonucleotide of the polymorphic portion will be ⁇ —PRIME It can be determined to have polymorphism, including the ability to determine that it is a nucleotide complementary to the 3 ′ oligonucleotide of R.
  • the target sequence when the target sequence is not amplified, it can be determined that the oligonucleotide at the polymorphic portion has no nucleotide sequence complementary to the oligonucleotide at the 3 'end of Y-PRIMER, and has no polymorphism. You can say 3 ⁇ 4T Ruko '.
  • X—Amplification of the target sequence can be confirmed by the increase in fluorescence intensity by PCR using the combination of PRIMER and TaqMan probe, and the target sequence by PCR using the combination of Y-PRIMER and TaqMan probe. If it cannot be recognized, it can be determined that the patient has no polymorphism. ' On the other hand, amplification of the target sequence could not be detected by PCR with the combination of X-PRIMER and TaqMan probe, and the increase in the number of fluorescent bows by PCR with the combination of Y_PRIMER and TaqMan probe The age at which the right to amplify the sequence can be determined to have no polymorphism.
  • the oligonucleotide can be determined to be a complementary nucleotide to the oligonucleotide at the 3 'end of "N-PRIMER", and it can be determined that there is no polymorphism.
  • the oligonucleotide of the polymorphic portion can be judged to be a nucleotide that is not complementary to the oligonucleotide at the 3 'end of N-PRI MERJ. You have enough power to have it.
  • the oligonucleotide of the polymorphic portion was identified as“ P—PRIME R ”. 'It can be determined that the nucleotide is complementary to the oligonucleotide at the terminal, and that it has a genetic polymorphism.
  • the oligonucleotide of the polymorphic portion is “P—PRI
  • nucleotide is not complementary to the 3 'oligo nucleotide of MERJ, and that it has no residual polymorphism.
  • PCR with the combination of “N—PR IMER” and the TaqMan probe increases the fluorescence intensity and amplifies the target sequence.
  • 3 ⁇ 41 PCR with the combination of “P—PRIMER” and the TaQMan probe By the age at which amplification of the target sequence cannot be achieved, it can be determined that the patient has no polymorphism.
  • amplification of the target sequence could not be detected by PCR using a combination of “N—PRIME R” and TaqMan probe. It can be seen that tj ⁇ , for which amplification of the target sequence was confirmed by an increase in the fluorescent bow t3 ⁇ 4 by PCR in combination, did not have a gene polymorphism.
  • MALD I Detection of polymorphism by TOF / MS
  • MALD I Detection of polymorphism by TOF / MS method (described in “SNP residue ⁇ polymorphism strategy” (Middle ⁇ 3 ⁇ 4m, Nakayama Shoten, (2000), p. 106-117) Part of the method can be used to detect polymorphisms.
  • dNTP remaining in the PCR reaction system and oligonucleotide used as a primer are
  • the oligonucleotide described in “(1) Remaining» polynucleotide detection oligonucleotide ”in“ 4. ”above is more than 10-fold more than the type 3 ⁇ 4 * 3 ⁇ 4].
  • a thermal cycle reaction is performed.
  • the thermal cycle reaction is not particularly limited as long as the extension reaction of the oligonucleotide is recognized. For example, an appropriate 51% elongation can be obtained by performing the reaction 25 times at 94 ° C. and 37 2 .
  • the obtained extension reaction product is purified, and salts, buffers, surfactants, and proteins are removed.
  • the purified product is spotted on a MALD I plate and analyzed for mass by MALD I TO FZMS.
  • the polymorphic site of the target is an oligonucleotide complementary to the oligonucleotide for detecting the polymorphism
  • accumulation of an extension reaction product in which ddNTP has been added to the oligonucleotide for detecting the polymorphism is observed. If the polymorphic site is not complementary to the oligonucleotide for gene polymorphism detection, the extension
  • the product of the extension reaction is 3 ⁇ 4
  • the polymorphic portion is a mutant nucleotide, and it can be determined that the polymorphism has a polymorphism.
  • the portion is a reference nucleotide and can be determined to have no polymorphism.
  • the polymorphic portion is a mutant nucleotide, and can be determined to have a polymorphism. If the extension reaction product is not recognized, the polymorphic portion can be determined. Is a reference nucleotide and can be determined to have no polymorphism. It is also used to detect the presence or absence of PCR products generated by applying it to the Qiagen LightCycler system and a kit for detecting PCR products using it (Quantitet SYBR Green PCR Kit). It is also possible to measure PCR products. 6. Confirmation of the remains of 5?
  • a polymorphism in a nucleic acid to be type II is heterozygous or homozygous. Specifically, it can be determined by any of the following methods (a) to (f).
  • the target is compared to the sample known to be homozygous.
  • the amount of the appearing band is about half, it can be determined that the polymorphism is heterozygous between the S subnucleotide and the mutant nucleotide.
  • Amplification of the target sequence was confirmed by PCR using a combination of X-PRIMER and the oligonucleotide used in combination with the primer, and Y-PRIMER was used in combination with the nucleotide. If amplification of the target sequence can be confirmed by 1 ft even by PCR using the combination with the oligonucleotide, the polymorphism can be judged to be heterozygous.
  • the target when the amplification of the target sequence can be achieved by PCR, the target is higher than that of a sample known to be homologous. In the case where the appearance amount of the band appears to be about half, it can be determined that the polymorphism is heterozygous between the male nucleotide and the mutant nucleotide.
  • Amplification of the target sequence was confirmed by PCR using a combination of "N-PR IMER” and the oligonucleotide used in combination with the primer, and "P-PR IMERJ was used in combination with the primer. If amplification of the target sequence can be achieved even by PCR using a combination with the oligonucleotide, the polymorphism can be determined to be heterozygous.
  • the primers and trends for performing the method of the present invention can be provided as a gene polymorphism detection kit.
  • a gene polymorphism detection kit includes:
  • Kit 1 (a) The third nucleotide from the 3 'end of the oligonucleotide consists of 2'-ft' ethylene nucleotide (ENA) units, and the other nucleotides consist of naturally occurring nucleotides, located at the 3, terminal A nucleotide complementary to the reference nucleotide of the target gene, and an oligonucleotide having a nucleotide complementary to the nucleotide sequence of the target gene at other positions;
  • ENA 2'-ft' ethylene nucleotide
  • a kit for detecting polymorphisms including:
  • the third nucleotide from the 3 'of the oligonucleotide consists of 2'- ⁇ ?, 4'-ethylene nucleotide ( ⁇ ) units, and the other nucleotides consist of heavenly ⁇ nucleotides and are targeted at position 3.
  • Oligonucleotide F which has a nucleotide complementary to the mutant nucleotide of the subject, and a nucleotide complementary to the nucleotide sequence of the target gene at other positions;
  • the 3rd to 3rd nucleotides of the oligonucleotide consist of 2'-0,4'-ethylene nucleotide (ENA) units, and the other nucleotides consist of natural nucleotides and are targeted at positions 3 and 5 Oligonucleotides having nucleotides complementary to the reference nucleotides of the gene, and nucleotides complementary to the nucleotide sequence of the target gene in other positions;
  • the third nucleotide from the 3 'end of the oligonucleotide is composed of 2'-ft 4'-ethylene nucleotide (ENA) units, and the other nucleotides are composed of heavenly nucleotides and are targeted at the 3rd and final positions.
  • terminal of the oligonucleotide consists of a nucleotide complementary to the reference nucleotide of the gene of interest
  • the second to third nucleotides of the oligonucleotide are nucleotides that are not complementary to the nucleotides of the reference residue;
  • the third nucleotide is composed of 2'-OA'-C-ethylene nucleotide (ENA) units, and the other nucleotide is composed of natural nucleotides;
  • the nucleotide length of the oligonucleotide should be as long as the nucleic acid can be amplified by PCR. Although it is not particularly limited, it is preferably an oligonucleotide consisting of 15 to 40 nucleotides, more preferably 18 to 35 nucleotides, and still more preferably 18 to 2.5 nucleotides.
  • position 3 of the oligonucleotide consists of a nucleotide complementary to the mutant nucleotide of the target gene
  • the second nucleotide from the 3 'end of the oligonucleotide is a nucleotide which is not complementary to the reference nucleotide;
  • the other site has a nucleotide complementary to the nucleotide of the target gene.
  • the 3rd nucleotide from the 3 ' ⁇ of the oligonucleotide is 2 '.
  • -Consists of 0, 4, -C-ethylene nucleotide (ENA) units, and other nucleotides consist of natural nucleotides,
  • the length of the nucleotide of the oligonucleotide is not particularly limited as long as the nucleic acid can be amplified by PCR, but is preferably 15 to 40 nucleotides, more preferably 18 to 35 nucleotides, and still more preferably An oligonucleotide consisting of 18 to 25 nucleotides.
  • kits 1 to 4 of the present invention may optionally contain various dNTPs for electrophoresis, markers for electrophoresis, and the like.
  • Figure 1 is a diagram showing the principle of the method for detecting polymorphism, and shows the case where there is no polymorphism.
  • Figure 2 shows a diagram of the method for detecting ⁇ ? Polymorphisms. Indicates ⁇ .
  • Fig. 3 is a diagram showing the principle of the method for detecting polymorphism 5 and showing the case where the polymorphism is not found.
  • FIG. 4 is a diagram showing the principle of the polymorphism detection method, showing a case where there is a polymorphism.
  • FIG. 5 shows the results of PCR using various primers using Premix Taq.
  • FIG. 6 shows the results of PCR using various primers using Premix EX Taq.
  • FIG. 7 is a diagram quantifying the fluorescent bow of a band detected by PCR.
  • FIG. 8 is a diagram showing polymorphisms within one of the angiopoietin-related three gene promoters.
  • Figure 9-A shows the results of PCR using genomic DNA (AKR) derived from mouse AKR strain as type II.
  • Figure 9-B is a diagram showing the results of PCR using genomic DNA (K Nga) derived from KK mouse Nga strain as type II.
  • FIG. 10 shows cliff genomic DNA, KK / Nga genomic DNA, KK mouse Snk strain (KK / Snk) genomic DNA, and DNA obtained by mixing equal amounts of AKR and KK / Nga genomic DNA.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of PCR performed.
  • FIG. 11 is a diagram showing polymorphisms in angiopotechin-related three gene promoters.
  • FIG. 12 shows the results of PCR using various primers using Premix Taq. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the protected oligonucleotide analog having the target sequence was treated with concentrated aqueous ammonia to remove oligosaccharides from the book, and the protecting group on the phosphorus atom and the protecting group on the nucleobase were removed.
  • the solvent was distilled off under S, and the remaining residue was subjected to reversed-phase HP LC (LC-10VP, Shimadzu Seisakusho, column (Merck, Chromith Performance RP-18e (4.6 x 100 mm)), A solution: 5% Acetonitrile, 0.1 M aqueous solution of triethylamine acetate (TEM), H 7.0, B solution: acetonitrile, B%: 103 ⁇ 4 ⁇ 50% (10 min, inear gradient); 60.
  • sequence of this compound is a sequence complementary to nucleotide numbers 26784-26803 of the human prothrombin gene (GenBank accession No. Ml 7262).
  • Example 2 The compound of Example 2 was synthesized in the same manner as in Difficult Example 1 (21 A 260 units). The compound is a negative ion
  • the ⁇ sequence of this compound is the nucleotide sequence of the human prothrombin gene (GenBank accession No. Ml 7262), nucleotide number 26784-26803, which is complementary to that in which nucleotide number 26784 is mutated from G to A.
  • Example 3 The compound of Example 3 was synthesized in the same manner as in Example 1 (8.9 A 260 units). The compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (calculated value: 8530.67, measured value: 8530.75).
  • nucleotide sequence of this compound is the nucleotide number described in GenBank accession NO. AL935325. It is a sequence of 60529-60556, wherein C at nucleotide number 60556 is T. Difficult case 4)
  • Example 4 Compound of Example 4 was synthesized in the same manner as flame Example 1 (10. 1 A 26. Uni ts :). This compound was identified by negative ion ESI quality (calculated value: 8515.66, measured value: 8515.56).
  • the nucleotide sequence of this compound is the sequence of nucleotide numbers 60529-60556 described in GenBank accession NO. AL935325.
  • Example 1 The compound of Example 1 was synthesized by a conventional method using a difficult automatic alloy.
  • ⁇ sequence of the present compound is a sequence complementary to nucleotide numbers 26784-26803 of the human prothrombin gene (GenBank accession No. Ml 7262), and is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. 'Instantaneous example 2)
  • Example 2 The compound of Example 2 was synthesized by a conventional method using nucleic acid automatization.
  • sequence of this product is the nucleotide sequence of the human prothrombin gene (GenBank accession No. Ml 7262), nucleotide number 26784-2680 ⁇ , which is complementary to the nucleotide number 26784 mutated from G to A. And is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • Example 3 The compound of Reference Example 3 was synthesized in the same manner as in Example 1 (0.3 A 260 units).
  • Examples of non-sky-key phosphoramidites include Example 5 of Patent No. 3420984 (5′-0-dimethoxytrityl-2′-0,4′-C-ethylene-4-N-benzoyl). Cytidine-3'-0- (2-cyanoethyl ⁇ , ⁇ -diisopropylpyrrole) phosphoramidite) compound, and the solid-phase carrier used was universal-Q 500 CPG (Glen Research) about ⁇ . ⁇ ⁇ ⁇ . The compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (calculated value: 6200.08, measured value: 6200.25).
  • nucleotide sequence of this compound is a sequence complementary to nucleotide numbers 26784-26803 of the human prothrombin gene (GenBank accession No. Ml 7262). (Binding example 4)
  • Example 4 The compound of Example 4 was synthesized in the same manner as in Difficult Example 1 (0.94 A 26. Unit).
  • the non-natural type phosphoramidite is exemplified by Example 9 of Patent No. 3420984 (5′-0-dimethoxytrityl-2, -0,4′-C-ethylene-5-methylperidine-3′-0 -(2-cyanoethyl N, N-diisopropyl) phosphoramidite), and a solid-phase carrier of about O. l ⁇ mol of universal-Q 500 CPG (Glen Research). This compound was identified by negative ion ESI quality * ⁇ p (calculated value: 6215.09, ij fixed value: 6215.06).
  • sequence of this compound is the nucleotide sequence of human prothrombin gene (GenBank accession No. M17262), nucleotide number 26784-26803, which is complementary to the nucleotide number 26784 mutated from G to A.
  • Example 5 The compound of Example 5 was synthesized in the same manner as in Sickle Example 1 (2.28 A 26. Unit ts).
  • Examples of non-natural phosphoramidites include Example 9 of Patent No. 342098 (5′-0-dimethoxytrityl-2, -0,4′-C-ethylene-5-methylperidine-3′- 0- (2-cyanoethyl N, N-diisopropyl) phosphoramidite). This compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (calculated value: 6200.08, measured value: 6200.26).
  • sequence is complementary to nucleotide numbers 26784-26803 of the human prothrombin gene (GenBank accession No. M17262).
  • Example 9 of Patent No. 342098 (5′-0-dimethoxytrityl-2′-0,4′-C-ethylene-5-methylperidine-3, -0 -(2-cyanoethyl N, N-diisopropyl) phosphoramidite). This compound was identified by negative ion ESI quality * ⁇ p (calculated value: 6215.09, measured value: 6215.26).
  • nucleotide sequence of the present conjugate is nucleotide No. 26784-26803 of the human prothrombin gene (GenBank accession No. M17262), and is a sequence complementary to that in which nucleotide No. 26784 is mutated from G to A.
  • Instantaneous example 7 is nucleotide No. 26784-26803 of the human prothrombin gene (GenBank accession No. M17262), and is a sequence complementary to that in which nucleotide No. 26784 is mutated from G to A.
  • Example 7 The compound of Example 7 was synthesized in the same manner as in Example 1 (4. 32.A 26 .uni ts) .
  • the non-natural phosphoramidite is the same as in Example 27 of Patent No. 3420984 (5′-0-dimethoxytrityl_2, -0,4′-C-ethylene-2-N-isobutyrylguanosine-).
  • the compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (calculated value: 620.008, measured value: 6199.95).
  • the rooster sequence of the hon-dani daigo is a sequence complementary to nucleotide numbers 26784-26803 of the human prothrombin gene (GenBank accession No. Ml 7262).
  • ⁇ Hai ⁇ 1 j is a nucleotide numbers 26784-26803 of human prothrombin gene (GenBank accession No. M17262 ), a sequence complementary to that nucleotide number 26784 has been mutated to A from G It is.
  • Example 9 The compound of Reference Example 9 was synthesized in the same manner as in Example 1 (13.28 A 260 units).
  • non-natural phosphoramidites include 5'-0-dimethoxytrityl-2'-0,4'-C-methylene-4-N-benzoy described in Tetrahedron (1998) 54, 3607-3630.
  • the compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (calculated value: 6186.05, measured value: 6186.45).
  • sequence U in the present compound is a sequence complementary to nucleotide numbers 26784-26803 of the human prothrombin gene (GenBank accession No. Ml 7262).
  • ⁇ sequence of this compound is the nucleotide sequence of nucleotide sequence 26784-26803 of the human prothrombin gene (GenBank accession No. M17262), which is complementary to the nucleotide sequence 26784 in which G is mutated to A.
  • nucleotide sequence of this compound is the nucleotide number described in GenBank accession No. AL935325.
  • the nucleotide sequence of this compound is the sequence of nucleotide numbers 60529-60556 described in GenBank accession No. AL935325, and is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • Example 13 The compound of Example 13 was synthesized in the same manner as in Example 1 (7.8 A 26. Units). However, as the non-Tera phosphoramidite, Example 9 of Patent No. 3420984 (5′-0-dimethoxytrityl-2′-0,4′-C-ethylene-5-methylperidine-3, -0- (2-cyanoethyl ⁇ ⁇ ⁇ , ⁇ -diisopropyl) phosphoramidite), and about 0.1 mol of universal-Q 500 CPG (Glen Research) as a solid phase carrier. This compound was identified by the negative ion ESI * ⁇ prayer (calculated value:
  • nucleotide sequence of this compound is the sequence of nucleotide numbers 60529 to 60556 described in GenBank accession No. AL935325, wherein C in nucleotide number 60556 is T. ( 14)
  • the compound of Poetry Example 14 was synthesized in the same manner as in Example 1 (7.4 A 26. Unit ts). However, solid support, using universal-Q 500 CPG (Glen Research W about 0. 1 x mol This compound was identified by negative-ion ESI mass spectrometry (calculated value:. 8516.66, measured value: 8516.00) 0
  • the nucleotide sequence of this compound is the sequence of nucleotide numbers 60529-60556 described in GenBank accession NO. AL935325.
  • the compound of Reference Example 15 was synthesized in the same manner as in Example 1 (8.4 A 260 units) 0 However, as a non-natural type phosphoramidite, the compound of Example 14 (5′- 0-Dimethoxytrityl-2'-0,4'-C-ethylene-6-N-benzoyladenosine-3'-0- (2-cyanoethyl N, N-diisopropyl) phosphoramidite) was. This compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (calculated value: 8516.64, measured value: 8516.32).
  • nucleotide sequence of this compound is the sequence of nucleotide numbers 60529-60556 described in GenBank accession No. AL935325, and is a rooster sequence in which C of nucleotide number 60556 is T.
  • Example 16 The compound of Example 16 was synthesized in the same manner as in Example 1 (7.9 A 260 units). However, as the non-natural type phosphoramidite, Example 14 of Patent No. 342098 (5′-0-dimethoxytrityl-2′-0,4′-C-ethylene-6-N-benzoyladenosine- 3, -0- (2-cyanoethyl ⁇ , ⁇ -diisopropyl) phosphoramidite) was used. This compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (calculated value: 8501.63, measured value: 8500.70).
  • the nucleotide sequence of this compound is the sequence of nucleotide numbers 60529-60556 described in GenBank accession No. AL935325.
  • the compound of Reference Example 17 was synthesized in the same manner as in Example 1 (9.7 A 260 units), and as a non-sky key phosphoramidite, the compound of Example 14 (5′-0-dimethoxypropyl) of Patent No. 342098 was used. Lityl -2 '-0,4, -C -ethylene-6-N-benzoyladenosine-3, -0_ (2-cyanoethyl N, N-diisopropyl) phosphoramidite) was used. This compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (calculated value: 8516.64, measured value: 8517.14).
  • nucleotide sequence of this compound is the sequence of nucleotide numbers 60529-60556 described in GenBank accession NO.AL935325, wherein C at nucleotide number 60556 is T.
  • Example 18 Compound of Example 18 was synthesized in the same manner as in Example 1 (7.2 A 26. Units) 0
  • Example 14 of Japanese Patent No. 3420984 (5 '-0- dimethoxytrityl -2'-0,4, -C-ethylene-6-N-benzoyladenosine-3'-0- (2-cyanoethyl N, N-diisopropyl) phosphoramidite) was used.
  • This compound was identified by negative ion ESI analysis (calculated value: 8501.63, measured value: 8501.65).
  • the nucleotide sequence of this compound is the sequence of nucleotide numbers 60529-60556 described in GenBank accession No. AL935325.
  • reverse primer and human DNA were prepared from Proligo's TrueS P Demo Kit according to the same protocol. used.
  • the nucleotide sequence of the reverse primer corresponds to nucleotide numbers 26588-26605 of GenBank accession No. M17262), and is as follows.
  • Reverse primer 1.3 ⁇ L, Premix Taq (S 3i3 ⁇ 4) 12.5 u Human DNA solution 1 ⁇ !, sterile water
  • the solution containing 5.2 ill was subjected to a PCR reaction (Hot Start method) using Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL (TP240).
  • the reaction cycle consists of 94 ° C for 10 minutes, 94 ° C for 1 minute, 63 ° C1
  • the reaction at 72 ° C. for 1 minute was repeated 31 cycles.
  • Add 1 zL of loading solution to Anti] ⁇ Solution 5 perform 10% polyacrylamide gel electrophoresis (lxTBE; constant voltage of 200V, about 1 hour), and use SYBR Green I (Cambrex®). After staining, bands were visualized using Molecular Imager FX Fluoresent Imager system (Bio-Rad) and quantified using Quantitative One software (Bio-Rad).
  • Figure 5 shows the results.
  • the compound described in Example 1 was able to sculpt the target residue (216 bp) 0-fold amplification. With the compound described in Example 2, no amplification residue of the desired residue (216 bp) was found.
  • the compound described in Example 2 is used as a forward primer, the compound described in Reference Example 2 is not only the compound described in Example 1 but the compound described in Reference Example 2 is a natural gene. The amplified pigeon was recognized, and gene amplification due to mismatch occurred.
  • Fig. 6 shows an example of using Premix EX Taq (Takara Shuzo) instead of Premix Taq (Takara Shuzo $ 1).
  • Premix EX Taq Takara Shuzo
  • the fluorescence intensity of the detected band was digitized and plotted as shown in FIG.
  • the compounds described in Examples 9 and 10 were obtained when the LNA unit was introduced from the third position to the third position.
  • the conjugate of Example 10 was used as the forward primer, amplification of the residual ⁇ ?
  • the compound of Example 2 was used as the forward primer, in which the unit was introduced third from the 3 'end, the amplification of the residue due to mismatch was only 6%, and the It became clear that there was little mismatch and no selectivity.
  • the solution was analyzed in minutes) by a meter (U-3000, manufactured by Hitachi, Ltd.). The absorbance at a wavelength of 260 nm was measured with), and the concentration was adjusted to 25 ng / ⁇ 1 by adding sterile water to obtain a genome DNA.
  • the polymorphism within the promoter of the Angiopoietin-like protein 3 gene has a polymorphism as shown in Figure 8 based on the results of direct sequence.
  • FIG. 8 shows that the mouse AKR strain has a polymorphism in which two assaults (CA) indicated by “:” are deleted, as compared with the mouse KK / Nga strain and KR / Snk strain.
  • CA assaults
  • the reverse primer in PCR has the following sequence:
  • the nucleotide sequence of this compound is a sequence complementary to nucleotide numbers 60658-60682 described in GenBank accession No. AL935325.
  • Reverse primer 1.25 ⁇
  • 5 UL Premix Taq (Takara Shuzo Genomic DNA solution (100 ng / 1 L) 0.125 Sterile water 2.38 L using TakaraPCR'Thermal Cycler PERSONAL (TP240) for PCR reaction (Hot Start method) After a heat treatment at 94 ° C for 10 minutes, a cycle of 94 ° C, 631 minutes, and 72 ° C 1 minute was repeated 30 times.
  • Fig. 9-A shows the results of using genomic DNA (AKR) derived from mouse AKRstrain as an indicator.
  • the compound (Example 3) used as the forward primer was able to selectively amplify the gene (152 bp). I found out. '
  • FIG. 91 shows the case where genomic DNA (KK / Nga) derived from KK mouse Nga strain was used for ⁇ .
  • genomic DNA KK / Nga
  • the compound described in Example 4 was most efficiently and selectively used as the forward primer. It was found that the gene (154 bp) could be amplified.
  • genomic DNA of AKR genomic DNA of KK / Nga
  • genomic DNA of KK mouse Snk strain KK / Snk
  • AKR uses the compound described in Difficult Example 3 as a forward primer and is selectively amplified.
  • KK / Nga and KK Snk the compound described in Example 4 is used. When the compound was used as a forward primer, significant gene amplification was observed.
  • oligomers were excised from the book by treating protected oligonucleotides having the target sequence with concentrated aqueous ammonia, and the protecting group on the phosphorus atom and the protecting group on the nucleus were removed.
  • the nucleotide sequence of this compound (primer A) is the sequence of nucleotide numbers 60499-60523 described in GenBank accession No. AL935325.14, wherein C of nucleotide number 60522 is T, and A of nucleotide number 60523 is G It is an array that is.
  • the donkey sequence of the present compound is the sequence of nucleotide number 60499-60523 described in GenBank accession No. AL935325.14, and is a sequence in which C of nucleotide number 60522 is T. '
  • Primer C (Hereinafter, referred to as “Primer C”) was synthesized in the same manner as in Example 1 and identified by MALDI-T0F mass spectrometry (calculated value: 765.0, measured value: 765.4).
  • the nucleotide sequence of this compound (primer C) is the sequence of nucleotide numbers 60499-60523 described in GenBank accession No. AL935325.14, wherein C of nucleotide number 60522 is G and A of nucleotide number 60523 is G The array is G.
  • nucleotide sequence of this compound is the sequence of nucleotide number 60499-60523 described in GenBank accession No. AL935325.14, wherein C in nucleotide number 60522 is G.
  • Primer I E (Hereinafter referred to as “Primer I E”) was synthesized by a conventional method using a nucleic acid automatic synthesis method.
  • the nucleotide sequence of the present compound (primer E) is the sequence of nucleotide number 60499-60523 described in GenBank accession No. AL935325.14, wherein C of nucleotide number 60522 is T, and the nucleotide number is 60523 is a sequence in which A is G, and is shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
  • plug one more F was synthesized by a conventional method using a nucleic acid automatic synthesizer did.
  • the nucleotide sequence of this compound (primer-F) is the sequence of nucleotide number 60499-60523 described in GenBank accession No. AL935325. It is shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
  • Primer G The M sequence is the sequence of nucleotide numbers 60499 to 60523 described in GenBank accession No.AL935325.14, wherein C at nucleotide number 60522 is G and A at nucleotide number 60523 is G And is shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing. (Binding example 22)
  • the 3 ⁇ 4S sequence of primer H is the sequence of nucleotide number 60499-60523 described in GenBankaccession No.AL935325.14, in which C of nucleotide number 60522 is G, and is shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing. Have been.
  • a tail (1.5 cm) collected from a mouse fiber strain (strain) and a KK mouse Nga strain (strain) derived from a mouse (4 weeks old) was treated with 8401 scythe (7201 1XSSC, 801 10% SDS, (Containing 1 l of OmgZml proteinase K), and the mixture was shaken for 1 Bj while keeping the temperature at 50 ° C.
  • 8401 scythe 7201 1XSSC, 801 10% SDS, (Containing 1 l of OmgZml proteinase K)
  • 20 mg of 1 mgZm 1 ribonuclease A was added, and the mixture was incubated at 50 ° C for 1 hour.
  • phenol-form extraction with chloroform was performed twice, and ethanol operation was performed once, to obtain 1 OmM tris: «(pH 7.5), ImM E
  • the nucleotide sequence of Reno's Primer is:
  • nucleotide sequence of this compound is a sequence complementary to the nucleotide numbers 60658-60682 described in GenBank accession NO.AL935325.
  • genomic DNA derived from the mouse AKR strain was amplified when primer A was used as the primer.
  • gene amplification was observed when primer B was used as the primer.
  • the target gene product was amplified in the genomic DNA derived from the mouse AKR strain when primer G was used as the primer, but primer H was not used.
  • primer was used as the primer, an amplification product which was considered to be a by-product smaller than the target size was obtained.
  • genomic DNA derived from the KK mouse Nga strain when Primer-H is used as Primer, it is considered that not only the target gene product but also a by-product with a smaller chain length than the target An amplification product was obtained.
  • genomic DNA derived from mouse AKR strain was amplified using primer C as a primer, and genomic DNA derived from KK mouse Nga strain. In, the amplification of this product using Primer D as a primer was enigmatic.
  • polymorphism detection capability is provided.
  • the use of the method for detecting a 5 ′ polymorphism of the present invention makes it possible to more accurately detect the polymorphism as compared with the case where a natural oligonucleotide is used.
  • various gene polymorphisms can be detected by an oligonucleotide for detecting a ⁇ -polymorphism and a kit for detecting a polymorphism containing the oligonucleotide, which can be used in the method.
  • the present invention can be used in various industries such as medical care, difficulties, foods, and industries, but the industrial field is not limited as long as it requires detection of a genetic polymorphism. '

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Abstract

　本発明は、オリゴヌクレオチドの３'末端から3番目のヌクレオチドが2'-O,4'-C-エチレンヌクレオチド(ENA)ユニットからなり、他のオリゴヌクレオチドは天然型のオリゴヌクレオチドからなり、３'末端部位に対象遺伝子の多型部位の基準配列のヌクレオチドに相補的なヌクレチド、その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の３'末端を多型部位にし、３'末端から２番目のヌクレオチドを検出対象の遺伝子と相補的ではない塩基を持つヌクレオチドにし、３'末端から３番目のヌクレオチドとして2'-O,4'-C-エチレンヌクレオチド（ENA）ユニットを用いたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲを利用した､遺伝子多型の検出方法､遺伝子多型の検出用のオリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドを含有する遺伝子多型検出用キットに関する｡

Description

明 細 書 遺伝子多型の検出方法
技 術 分 野
本発明は、 ENAュニットを含むオリゴヌクレオチドを用いた PCRを利用した、遺 β? 多型の検出方法、遺伝子多型の検出用のォリゴヌクレオチド及び該ォリゴヌクレオチドを 含有する遺伝子多型検出用キットに関する。 背 景 技 術
ファーマコジエノミクス職の醒により、 遺 ^多型と薬効、 あるいは遺 多型と 副作用の関係から、 個々の患者に対する薬物の効果や副作用を、 遺 診断で予測するこ と力河能になりつつある。このような例としては、薬物代謝酵素の遺 多型の例が挙げら れる。 多型により活性が増加、 あるいは、 減少する薬物代謝酵素としては、 シトクロム P 4501A2、 シトクロム P4502A6、 シトクロム P 4502 C 9、 シトクロム P4 502C19, シトクロム P4502D6、 シトクロム P 4502E 1など力知られてい る。 また、 チォプリンメチルトランスフエラ一ゼ、 N -ァセチルトランスフエラ一ゼ、 U DP—グリレクウロノシリレトランスフェラーゼ、 および、 グルタチ才ン S—卜ランスフェラ —ゼなど抱合酵素と呼ばれる一群の酵素群にも遺伝子多型が存在し、 多型により活性が減 少することが報告されている （中ネ嫩機扁、 「SNP遺eΐ多型の戦略」、 中山書店、 2000 年 6月 5曰）。
また、 遺伝子多型と疾患との関係を調べることにより、 ^^の疾患の事 ^予後の 判定も可能になりつつあり、 多型角斜斤¾«から見出された疾患原因遺 が多辦艮告され ている。 例えば、 潰瘍性大腸炎の原因遺 としての HLA、 慢性関節リウマチの原因遺 伝子としての TCRa、 アルツハイマー病の原因遺伝 としての APOE 4、 精神分裂症 の原因遺 としてのド一パミン D 3受容体、 躁鬱病の原因遺^としてのトリブトファ ン水酸化酵素、 アルブミン尿症の原因遺 としてのアンジォテンシン前駆体、 心筋梗塞 の原因遺 としての血液凝固因子 VII、 肥満の原因遺 β÷としてのレブチンなどが ¾告 されている （Nature Genetics, 1999年、 第 22巻、 p.139- 144)。
遺 多型の検出方法として、 ポリメラーゼチェインリアクション （PCR) 法と制限 '酵素による切断とを組み合わせた PCR— RFL,P法 （Science, 1991 年、 第 252巻、 p. 1643-)、 配列の異なる一本鎖の DNAもしくは RNAはポリァクリルアミドゲル中で異 なる移動度を示すという原理に基づいた S S C P (s ingle-strand conformat ion polymorphism)法、または、オリゴヌクレオチドプライマーの 3 ' 末端付近にミスマッチが あるとプライマ一の伸長反応が阻止されるという原理に基づいた A S - P C R (al lele-speci f ic PCR)法などが開発されている。
P C R— R F L P法は、 検査工程に 3〜 2 4時間の制限瞧処理を含むために、 進な 方法とは言い難い。 S S C P法は^ ¾象となる麟配列のどこかに、 固もしくは複数 の変異が^ ffiする に、 その雜を高感度に検出できる点で優れている。 しかし、 徹少 な移動度の差を検出するために実験条件を厳密にコント口一ルしなければならないので、 非常に手間がかかる方法であり、 かつ変異の位置を同定できない。 また、 実際の検体、 た とえば血液ゃ繊から S S C P法を行うには、 ク口一ニングゃ P C R法を用いて、 事前に 夫量の核酸を調製する必要があり、 多数の検体を効率よく猶するには適さなレ访法であ る。
A S - P C R法は P C Rを応用した方法であり、 事前に大量の核酸を調製する必要はな く、 3 ' 末端付近にミスマッチのないプライマ一を使用したときのみ増幅産物が得られる ことを応用したもので、多数の検体を効率よく猶するために適した方法である。しかし、 通常の P C Rではプライマ一にミスマッチが存¾^る：！^でも増幅産物が得られる が あり、 厳密 '[生に問題が、あった。
また、 AS— P C R法を ¾し、 3' ¾から 2番目に対象遺伝子とは相補的ではなレ塩 基を持つヌクレオシドを持ち、 3' に検出したい多型部分を設定した場合、 3' 末端か ら 1番目に対象遺^と相補的である ¾を持つヌクレオシドをもつプライマーに比べ、 3' 末端に存在する多型部位の検出が改善される報告がある （Bioorganic & Medical Chemistry, 2003年、 第 11巻、 . 2211-2226) 0 しかし、 この方法を用いた でもプライ マーの 3' 末端にミスマッチが しても増幅産物が得られることがあり、 より検出感度 の高い遺 多型の検出方法の開発が求められていた。
2' -0, 4' エチレンヌクレオチド （以下、 「ΕΝΑヌクレオチド」 ともいう。） は非天 のヌクレオチドである。 ΕΝΑヌクレオチドを導入したオリゴヌクレオチドは、 相補 鎖 RNAに対して高い結合能を有している （日本国特許第 3420984号公報 （日本国公開特 言松報 特開平 12- 297097) 及び Bioorganic & Medical Chemistry, 2003年、 第 11巻、 p . 2211-2226。）。 また、 ENAヌクレオチド の 2' 位酸素原子と 4' 位炭素原子を メチレン鎖で架橋したヌクレオチドである LNAヌクレオチド （2' -0, 4， メチレンヌク レオチド （日本国公開特言松報 特開平 10-304889号） よりもヌクレアーゼに対して高い 抵抗性を有するという特徴を持っている （Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2002年、 第 12巻、 p. 73-76) しかしながら、 ENAヌクレオチドをプライマ一として 用いることによって A S— P C Rの測定精度を向上させることが きるか否かは不明であ つ 7こ。
本発明者らは、上記、多型の検出方法の問題点を解決すベぐ検討を行ったところ、多型部 位を 3' 末端にし、 さらに 3 ' から 3番目に ENA修飾が加えられたオリゴヌクレオチ ドを P CRプライマーとして用いた場合、 ミスマッチによる増幅産物の生成量が減少し、 精度カ搞く遺伝子多型が検出できることを見出し、更に難出方法に用いることができる キッ卜を ill共した。 ， 更に本発明者らは、多型部位を 3 ' にし、 3 ' から 2番目のヌクレオチドを検出 対象の遺 fe?と相補的ではなレ ^塩基を持つヌクレオチドにし、 3 ' ¾から 3番目に ENA i iが加えられたォリゴヌクレオチドを P C Rプライマーとして用レた 、 ミスマッチ による増幅産物の生成量が減少し、精度が く遺ィ5?多型が検出できることを見出し、更に 出方法に用いることができるキットを提供し、本発明を させた。 発 明 の 開 示 '
本発明の課題は、 遺 多型を検出する方法及び »法に使用することができるオリゴ ヌクレオチドを提供し、 さらに、 該オリゴヌクレオチドを含む遺伝子多型検出用キットを 提供することである。
本発明は铸型となる核酸のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなる合 成ォリゴヌクレオチドプライマーを合成する際に、合成ォリゴヌクレオチドプライマ一の 3 ' 末端のヌクレオチドを錶型のヌクレオチドと相補的ではないヌクレオチドにすると DNAポリメラーゼによるプライマーの伸張反応が こらず、 βとなる核酸のヌクレオチ ド配列と完全に相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマ一を用いた場合には DNAポリメ ラーゼによるプライマ一の伸張反応が起きる現象を禾,した遺 多型の検出方法に関す る。
さらに詳しくは、 本発明は、 合成才リゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の 3， 端を 多型部位にし、さらに 3 ' 末端から 3番目のヌクレオチドとして 2' -ft 4' -エチレンヌ クレオチド（ENA)ユニットを用いたオリゴヌクレオチドをプライマ一として用いることを 樹! [とする遺 多型の検出方法に関する。
さらに本発明は、 合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の 3' を多型部位に し、 3， から 2番目のヌクレオチドを検出対象の遺 と相補的ではない驢を持つ ヌクレオチドにし、 3' 末端から 3番目のヌクレオチドとして 2' -OA' エチレンヌク レオチド（ENA)ュニットを用いたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることを特 徴とする遺 多型の検出方法に関する。
本発明の ismを解決手段としては具体的には、
( 1 ) 以下の （ a) 及び（b) の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩： (a)オリゴヌクレオチドの 3' 末端から 3番目のヌクレオチドが 2' -Ο, ' - C-ェチレ ンヌクレオチド (Ε Α) ユニットからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチド からなる；
(b) 3， 末 位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、 その他の 部位には対象遺 のヌクレ才チド配列に相補的なヌクレ才チドを有する、
(2) 以下の （a) 及び (b) の鎌を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
(a)オリゴヌクレオチドの 3' 末端から 3番目のヌクレオチドが 2' -OA' - ェチレ ンヌクレオチド (ENA) ユニットからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチド からなる；
(b) 3， 末¾¾位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、 その他の 部位には文豫遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する、
^ (3) 以下の （a) 乃至 （d) の樹敷を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
(a) オリゴヌクレオチドの 3, が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的な ヌクレオチドからなる；
(b) オリゴヌクレオチドの 3' «から 2番目 （3' 末端のヌクレオチドを 1番目と 'して 2番目） のヌクレオチドが基準遺 のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド からなる；
( c ) その他の音 15位には対象遺 のヌクレ才チドと相補的なヌクレ才チドを有-する；
(d) オリゴヌクレオチドの 3' から 3番目 （3' のヌクレオチドを 1番目と して 3番目） のヌクレオチドが 2' -OA' エチレンヌクレオチド （ENA) ユニットか らなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、 (4) 以下の （a) 乃至（d) の を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
(a) オリゴヌクレオチドの 3， 位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的な ヌクレオチドからなる；
(b) オリゴヌクレオチドの 3' から2番目 （3' のヌクレオチドを 1番目と して 2番目） のヌクレオチドが基準遺 のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド からなる；
(c) その他の部位に « ^象遺 β?のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを る；
(d) オリゴヌクレオチドの 3' から 3番目 （3' のヌクレオチドを 1番目と して 3番目） のヌクレオチドが 2' -ft 4' -エチレンヌクレオチド （ENA) ユニットか らなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(5) 18乃至 25 長からなることを赚とする、 (1)乃至（4) のいずれか 1項, に記載のオリゴヌクレオチド又はその塩、
(6) (1) 乃至 (5) のいずれか 1項に記載のオリゴヌクレオチドを使用することを 特徴とする、遺 feT多型の検出方法、
(7) ( 1 ) 乃至（ 5 ) のいずれか 1項に記載のォリゴヌクレオチドを棚することを 特徴とする、遺 ί¾ 多型部位のヌクレオチド配列の決^法、
(8) 以下の工程 (a) 及び（b) を含む、遺伝子多型の検出方法：
(a) 遺伝子多型部位を含む核酸を铸型として、 (1) 乃至 （5) のいずれか 1項に記 載のオリゴヌクレオチド、 及び該オリゴヌクレオチドと対になって P C Rで目的配列部 分を増幅できるオリゴヌクレオチドを用いて PCRを行う工程；
(b) 工程 (a) によって反応産物が生成するか否かによって、核酸中の遺伝子多型の 有無を判 ¾Tる工程、
(9) 以下の工程（a)及び（b) を含む、遺イ^?多型舰立のヌクレオチド配列の決 法：
(a) 遺伝子多型部位を含む核酸を画として、 (1) 乃至 （5) のいずれか 1項に記 載のオリゴヌクレオチド、 及び該オリゴヌクレオチドと対になって P C Rで目的配列部 分を増幅できるオリゴヌクレオチドを用いて P C Rを行う工程；
(b) 工程 （a) によって反応産物が生成するか否かによって、 核酸中の遺伝子多型部 位のヌクレオチド配列を決^る工程、
(10) 反応産物の生成の有無の検出に、 電 永動、 TaqMan PC R及び ALDI 一 TOF/MS法からなる群から選択される少なくともいずれか一つを用いることを ^とする （8) 又は （9) に記載の方法、
(11) 遺 多型が一塩基多型であることを憶とする、 (6)乃至 (10)のいずれ か 1項に記載の方法、
(12) 以下の （a) 乃至 （d) を含む、 遺伝子多型検出用キット：
(a)オリゴヌクレオチドの 3' から 3番目のヌクレオチドが 2' -0,4' -C -ェチレ ンヌクレオチド (ENA) ユニットからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチド からなり、 3， 位に対象遺 ί¾ΐの基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、 そ の他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリ ゴヌクレオチド；
(b) (a) に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリ ゴヌクレオチド；
(c) DNAポリメラーゼ；
(d) PCR緩衝液、
(13) 以下の （a) 乃至 （d) を含む、 遺伝子多型検出用キット：
(a)オリゴヌクレオチドの 3' から 3番目のヌクレオチドが 2' -ft 4' ェチレ ンヌクレオチド （ENA) ユニットからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチド からなり、 3， 位に対象遺^の変異ヌクレオチド〖こ相補的なヌクレオチド、 そ の他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリ ゴヌクレ才チド；
(b) (a) に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るブラ イマ一；
(c) DNAポリメラ一ゼ；
(d) PCR緩衝液、
(14) 以下の （a) 乃至 （e) を含む、 遺伝子多型検出用キット：
(a)オリゴヌクレオチドの 3， から 3番目のヌクレオチドが 2' -0,4' - ェチレ ンヌクレオチド （ENA) ユニットからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチド からなり、 3， 位に対象遺 の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、 そ の他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリ ゴヌクレ才チド； (b)オリゴヌクレオチドの 3' ¾から 3番目のヌクレオチドが 2， -0,4' -ェチレ ンヌクレオチド （ENA) ユニットからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチド からなり、 3' « ^位に対象遺 の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、 そ の他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリ ゴヌクレオチド；
(c) (a) 又は （b) に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅 し得るオリゴヌクレオチド；
(d) DNAポリメラーゼ；
(e) PCR緩衝液、
(15) 以下の （a) 乃至 (d) を含む、 遺 β?多型検出用キット：
(a) 以下の （i) 乃至 (iv) の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
(i)オリゴヌクレ才チドの 3' *¾¾位が対象遺伝子の基準ヌクレ才チドに相補的な ヌクレオチドからなる；
(ii) オリゴヌクレオチドの 3' «から 2番目 （3' 末端のヌクレオチドを 1番目 として 2番目） のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオ チドからなる；
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有す る；
(iv) オリゴヌクレオチドの 3' から 3番目 （3' のヌクレオチドを 1番目 として 3番目） のヌクレオチドが ΐ -。,4， エチレンヌクレオチド （ΕΜ) ュニッ 卜からなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる；
(b) (a) に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリ ゴヌクレ才チド；
(c) DN Aポリメラーゼ;
(d) PCR緩衝液、
(16) 以下の （a) 乃至 (d) を含む、 遺伝子多型検出用キット：
(a) (i) 乃至 (iv) の體を有するオリゴヌクレオチド又はその塩；
(i)オリゴヌクレオチドの 3'末 ¾ ^位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的な ヌクレオチドからなる；
(ii) オリゴヌクレオチドの 3' から 2番目 （3' 末端のヌクレオチドを 1番目 として 2番目） のヌクレオチドが »遺 のヌクレオチドと相補的でないヌクレオ チドからなる；
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有す る；
(iv) オリゴヌクレオチドの 3' から 3番目 （3' のヌクレオチドを 1番目 として 3番目） のヌクレオチドが 2' -0,4， エチレンヌクレオチド （ENA) ュニッ トカゝらなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる；
(b) (a) に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリ ゴヌクレオチド；
(c) DNAポリメラ一ゼ；
(d) PCR緩衝液、
(17) 以下の （a) 乃至 （e) を含む、 遺伝子多型検出用キット：
(a) 以下の （i) 乃至 (iv) の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩；
(i)オリゴヌクレオチドの 3' ¾^位が対象遺伝子の »ヌクレオチドに相補的な ヌクレオチドからなる；
(ii) オリゴヌクレオチドの 3' から 2番目 （3' のヌクレオチドを 1番目 として 2番目） のヌクレオチドが基準遺 のヌクレオチドと相補的でないヌクレオ チドからなる；
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有す る；
(iv) オリゴヌクレオチドの 3' ^から 3番目 （3' 末端のヌクレオチドを 1番目 として 3番目） のヌクレオチドが 2' -0,4' エチレンヌクレオチド （ENA) ュニッ トカゝらなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる；
(b) (i) 乃至 （iv) の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩；
(i)オリゴヌクレオチドの 3' 啦が対象遺 β?の変異ヌクレオチドに相補的な ヌクレオチドからなる；
(ii) オリゴヌクレオチドの 3' から 2番目 （3' のヌクレオチドを 1番目 として 2番目） のヌクレオチドが^ P遺 のヌクレオチドと相補的でないヌクレオ チドからなる；
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有す る；
(iv) オリゴヌクレオチドの 3' から 3番目 （3' のヌクレオチドを 1番目 として 3番目） のヌクレオチドが 2' - 0A， エチレンヌクレオチド （ENA) ュニッ トからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる。
(c) (a) 又は （b) に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅 し得るオリゴヌクレオチド；
(d) DNAポリメラーゼ；
(e) PCR緩衝液、
(18) オリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増 幅し得るオリゴヌクレオチドの塩 ¾fiが 18乃至 25塩基長であることを とする、
(12) 乃至 (17) のいずれか 1項に記載の遺 多型検出用キット、
(19) 遺 多型が一塩基多型であることを ^とする、 （12)乃至（18) のいず れか 1項に記載のキット、
からなる。
本発明における、 遺 多型の検出方法の 1つの Sは以下の通りである。
(1) 遺 多型を検出したレ 列（目的配列)の多型部分にプライマ一の 3' 末端を設 定し、 かつプライマーの 3' «から 3番目に 2' -0,4' -C-エチレンヌクレオチド （ΕΝΑ) ュニットの修飾を加える。 このプライマーと遺 多型検出対象のヌクレオチド配列を含 む核酸を反応液中で核 成酵素の混合物と作用させると、 プライマ一の 3' がー致 する （塩基が相補的である） 齢は、 核酸合成反応が起こる。 これに対して、 3， *¾が 一致しない場合は、 核 成反応が こらない。 このように 3' がー致する場合は核 酸合成反応が起こり、 一致しない場合は核 成反応が こらなレ違いを利用して、 ヌク レオチド配列の変異を検出すること力 きる。 この原理を図 1と図 2で説明する。
図 1は、核酸配列に変異（多型）がない:^を示す。 ωは核酸配列の変異 (多型)を調べ ようとする対象の画核酸で、種配列の一部に 3' -ATGC-5'の配列をもつ。 この β核酸 と 3' から 3番目に ΕΝΑ (謹が加えられたオリゴヌクレオチド（ii) (2' -ft 4' -C-X. チレン- 5-メチルゥリジン ュニットを eTと表記する） とがァニーリングして 2本鎖を形 する。 この場合、 （ii)の塩基配列の内少なくとも 3， 5 ¾は対応するの:^と相補な構 成になっており、（11)と（1)とは2本鎖を形 る。この 2本鎖を形成しているオリゴヌク レオチド（ii)の 3， 末端の部分を核酸合成酵素 (iii)が認識し、 核酸合成反応が続行する。 ここに示した具体的な驢配列は説明のためのものであり、 この塩基配列のみに有効であ ることを意味するものではない。
図 2は核酸配列に変異 (多勢がある:^を示す。 (i) ¾ 酸配列の変異 (多 を調べよう とする対象の鎵型核酸で、 塩基配列の一部に 3' - ATAC - 5'の配列をもつ。 この铸型核酸と 3 ' から3番目に ENA修飾が加えられたオリゴヌクレオチド（i i) (2 ' -OA' - C -ェチ レン- 5-メチルゥリジン ュニットを eTと表記する) とがァニーリングして 2本鎖を形成 する。 この場合、 （i i)の塩基配列の内少なくとも 3， は対 る塩基と相補な構成に なっておらず、 （i i)の 3' 末端の Cが (i)内の Aとワトソン一クリック 対を形成してい ない。，このワトソン一クリック塩基対を形成していないオリゴヌクレオチド（i i)の 3 ' 末 端の部分を核酸合成酵素 (i i i)が認識できず、核酸合成反応が続行することができない。こ こに示した具体的な驢配列は説明のためのものであり、 この驢配列のみに有効である ことを意味するものではない。
本発明における、 遺 多型の検出方法の他の 1つの壓は以下の通りである。，
( 2 ) 遺 β?多型を検出したい配列（目的配列)の多型部分にプライマ一の 3 ' を 設定し、 3 ' から 2番目のヌク オチドを検出対象の遺伝子と相補的ではなレ^^を 持つヌクレオチドにし、 かつプライマ一の 3 ' から 3番目に ΕΝΑユニットの ί«を加 える。 このプライマ一と遺伝子多型検出対象のヌクレオチド配列を含む核酸及び該プライ マーと対になって P C Rで目的配列部分を増幅できるオリゴヌクレオチドを反応液中で核 酸合成酵素の混合物と作用させると、 プライマ一の 3 ' 末端が一致する （塩基が相補的で ある） 場合は、 核酸合成反応が起こり、 遺 が増幅される。 これに対して、 3 ' «が 一致しない：！^は、核齢成反応が こらず、遺伝子の増幅は見られない。このように 3， 末端の塩基が相補する齢は核酸合成反応が 13こり、 相補しなレ場合は核 ^^成反応が起 こらない違いを利用して、 ヌクレオチド配列の変異を検出することができる。 この i aを 図 3と図 4で説明する。
図 3は、核酸配列に変異（多型）がない場合を示す。 ωは核酸配列の変異 (多型)を調べ ようとする対象の 核酸で、 配列の一部に 3' - ATGC - 5'の配列をもつ。 （i i)はプライ マ一である。 このプライマーでは、 3 ' から 2番目のヌクレオシドを検出対象の遺伝 子と相補的ではないヌクレオシドにし（図ではグァニン（G)。）、それ以外のヌクレオシド は検出対象の遺 β?と相補的なヌクレオシドである。 また、 3 ' から 3番目は Ε ΝΑ 修飾が加えられたォリゴヌクレ才チド（2 ' -ft 4' エチレン- 5-メチルゥリジン ュニッ トを eTと表記する）にしている。 この場合、 （i i)のヌクレオチド齊己列のうち 3 ' から 2番目以外のヌクレオチド配列は対応する（i)のヌクレオチド配列と相補な配列になつて おり、 （ii)のヌクレオチド配列のうち 3 ' から 2番目でミスマッチするものの、 顯 核酸と多型検出 J プライマ一がァ二一リングして 2本鎖を形成する。 この相補鎖を形成し ているオリゴヌクレオチド α i)の 3， の部分を核酸合成酵素 ΐ οが認識し、核^ er成 反応が続行する。
なお、ここに示した具体的なヌクレオチド配列は説明のための例示に過ぎず、本発明が、 このヌクレオチド配列のみに有効であることを意味するものではない。
図 4はヌクレオチド配列に変異 (多型)が'ある場合を示す。 (0はヌクレオチド配列の変異 (多勤を調べようとする赚の顯核酸で、ヌクレオチド配列の に 3' -ATAC-5'の配列 をもつ。 （i i)はプライマ一である。 このプライマーでは、 3 ' 及び 3 ' 末端から 2番 目のヌクレオシドを検出対象の遺伝子と相補的ではないヌクレオシドにし （図ではグァニ ン （G)。）、 それ以外のヌクレオシドは検出対象の遺伝子と相補的なヌクレオシドである。 また、 3 ' から 3番目は ΕΝΑί»が加えられたオリゴヌクレオチド （2' -ft 4' -C- エチレン- 5-メチルゥリジン ユニットを eTと表記する） にしている。 この場 、 (i i)の ヌクレオォチド配列のうち、 3， «及び 3 ' から 2番目のヌクレオシドは対 )Sfる ヌクレオシドと相補なヌクレオシドになっておらず、 (i i)の 3' 末¾分がワトソン一ク リック塩基対を形成しない。 このワトソンークリツク 対を形成していないオリゴヌク レオチド（i i)の 3， 末端の部分を核齢成酵素 (i i i)が認識できず、核酸合成反応は進まな い。
なお、ここに示した具体的なヌクレオチド配列は説明のための例示に過ぎず、本発明が、 このヌクレオチド配列のみに有効であることを意味するものではない。
本発明により、新規な遺伝子多型の検出方法が提供された。本発明の遺伝子多型の検出方 法を用いることにより、 天然型のオリゴヌクレオチドを用いる：！^に比べより正確に多型 を検出できるようになった。
また、 ¾ ^法に用いること力 きる、遺 β?多型の検出用オリゴヌクレオチド及び該オリ ゴヌクレオチドを含有する遺 β?多型の検出用キットも提供された。
1. 用語の説明
本明細書中において 「遺 β¾型」 とは、ある遺 座において、 (a) 1個の纏が他 の塩基に置き換わっているもの（一塩基多型 (S NP))及び Z又は（b) 1から数十： ^ (数千塩基のこともある） が欠失や挿入をしているもの （挿入/欠失多型） を意味する。 本明細書において、ー驢多型とは SNP (single nucleotide polymorphism)ともいい、 個人 間におけるヌクレオチド配列中の一: Kの違いをいう。
一:^多型部分のヌクレオチドとしては 2種類のヌクレオチドの変異が^することが 知られており（例えばアデニンかグァニン、チミンかシトシン等)、その変異の割合は対象 となる遺 β?によって異なつている。本明細書中において、 「対象遺 β¾ とは、 遺伝子多 型を検出する対象とする遺 のことをいう。
本明細書においては、対象遺伝子の一塩基多型部位の 2種類の塩基の変異のうちで出現 «の高いヌクレオチドを含む配列を基準配列とし、 基準配列中の一塩基多型讓立のヌク レオチドを基準ヌクレオチドとし、 出現 »の低いヌクレオチドを含む配列を変異配列と し、 変異配列中の一塩基多型部位のヌクレオチドを変異ヌクレオチドとする。
また、 多型が欠失多型の には欠失がない配列を基準配列とし、 欠失がある配列を変 異配列とする。
さらに、 多型が挿入多型の： t給には挿入がなレ 己列を基準配列とし、 挿入がある配列を 変異配列とする。
また、 本明細書中において、 「多型を^ る」 とは対象遺 の目的とする多型を含む 配列が 翻己列を有することを意味し、 「多型を有さない」とは対象遺伝子の目的とする多 型を含む配列が基準配列であることを意味する。
本明細書中において、 「天醒のヌクレオチド」 とは、 アデニンヌクレオチド、グァニン ヌクレオチド、シトシンヌクレオチド ゥラシルヌクレオチド，チミンヌクレオチドをいう。 また、 「天然型のォリゴヌクレ才チド J とは、 アデニンヌクレ才チド、グァニンヌクレ才チ ド、 シトシンヌクレオチド、ゥラシルヌクレオチド、チミンヌクレオチド等の天 «ヌクレ ォチドから構成されるオリゴヌクレオチドのことを示す。
本明細書においてはアデニンヌクレオチド ¾AP、 グァニンヌクレオチドを Gp、 シトシ ンヌクレ才チドを C p及びチミンヌクレ才チドを T pと表記することもある。また天然型の オリゴヌクレオチドの 3 ' 末端のヌクレオシド、 アデニンヌクレオシドは A グァニン ヌクレオシドは G シトシンヌクレオシドは C t及びチミンヌクレオシドは T tと表わす ことができる。
天然型のヌクレオチドの構造式を以下に示す。 εχ
Figure imgf000015_0001
dO
Figure imgf000015_0002
d
Figure imgf000015_0003
SlL9l0/t00Zdr/∑Jd εεο o/sooz OAV 本明細書中において、 「ENAヌクレオチド」 （以下、 「ENA」 ともいう。） とは、 鶴 βの 2' 位酸素原子と 4' 位炭素原子をエチレン鎖で架橋したヌクレオチドである (特許第 3420984 号参照
本明細書において 2， -0,4' エチレンヌクレオチド ユニット及び ΓΕΝΑュニッ ト」 とは Ae2p、 Ge2p、 Ce2p、 5Ce2p、 Te2p、 または、 オリゴヌクレオチドの 3' 末 端に有する:^、 ENAをヌクレオシドとして扱う場合は、 Ce2t、 5Ce2t、 Te2t、 から 選択されるレずれかの基を意味し、その構造は下記に示すとおりである。また LNAュニッ トとして Celpの構造も示す。
ex
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0002
Figure imgf000017_0003
Figure imgf000017_0004
ζΙί910/ 00Ζάΐ/13ά εεο o/sooz OAV 本明細書中における、 「相補的なヌクレオチド」 とば、ヌクレオチドの塩基部分が相 ¾Τ るヌクレオチドのことをいい、 具体的には、 塩基部分がアデニンとチミン、 グァニンとシ トシン及びアデニンとゥラシルであるヌクレオチドが互いに相補的なヌクレオチドである。 本明細書中における、 「その とは、 本発明の化合物は、 塩にすることができるので、 その塩をいい、 そのような塩としては、 好適にはナトリウム塩、 カリウム塩、 リチウム塩 のようなアル力リ金属塩、 カリレシゥム塩、 マグネシウム塩のようなアル力リ土類金属塩、 ァリレミニゥム塩、 鉄塩、 銅塩、 ニッケル塩、 コバルト塩等の金属塩；アンモニゥ ム塩のような無機塩、 tーォクチルァミン塩、 ジベンジルアミ ¾、 モルホリ ¾、 ダル コサミン塩、 フエニルダリシンアルキルエステル塩、 エチレンジァミン塩、 N—メチルダ ルカミン塩、 グァニジン塩、 ジェチルァミン塩、 トリェチルァミン塩、 ジシクロへキシル アミン塩、 N, N， ージベンジルエチレンジァミン塩、 クロ口プロ力イン塩、 プロ力イン 塩、 ジェタノールアミ ¾、 N—べンジルーフエネチルァミン塩、 ピぺラジン塩、 テトラ メチルアンモニゥム塩、 卜リス （ヒドロキシメチル） ァミノメタン塩のような有機塩等の アミ u は素酸塩、 m^ ^は素酸塩、 ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子 ィ匕水素酸塩、硝酸塩、過鶴酸塩、鍾塩、 リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、 トリフジレ才ロメタンスルホン m 、 エタンスレホン酸塩のような低級ァレ力ンスルホン酸 塩、ベンゼンスルホン酸塩、 p—トルエンスルホン酸塩のようなァリ—ルスルホン酸塩、酢 酸塩、 リンコ 塩、 フマーリレ酸塩、 コハク酸塩、 クェン酸塩、 m ^, »塩、 マレイ ン酸塩等の有機酸塩；及び、 ダリシ ¾、 リジ^、 アルギニン塩、 オルニチ ¾、 ダル タミン酸塩、 ァスパラギン酸塩のようなァミノ を挙げること力 ?きる。
なお、 本発明の化合物及びその塩は、 水和物としても存 a "ることが き、 本発明は、 それらのフ 口物をも包含する。 2. 検体
本発明 多型を検出する対象となる検体としては、 核酸を含む を用いること が きる。核酸としては一例として、ゲノム DNAを挙げることができるが、 これに限定さ れない。
例えば;ヒトの遺伝子の多型を検出するためにはヒトゲノム DNAを含む検体を用いる ことが き、マウスの遺 の多型を検出するためには、マウスゲノム DNAを用いること ができる。ゲノム DNAは当難に^ 0の方法で取得すること力 きる。以下、ヒ卜のゲノ ム DNAを例にして説明するが、他の生物由来のゲノム DN Aも同様に取得することがで きる。
ゲノム D N Aを得るための材料としては、 被!^から採取されたあらゆる細胞 (^ m 胞を除く）、 β を使用することができるが、好ましく〖妹梢血から分離した白血 球または «球であり、 最も ¾ιには白血球である。 これらの材料は、 臨床検査において 通常用レ ¾られる方法によって採取され得る。
例えば白血球を用いる場合、 ま より採取した末梢血から周知の方法で白血球を 分离 t る。 次いで、 得られた白血球にプロティナーゼ κとドデシル«ナトリウム （S D S) を加えてタンパク質を適、 変性させた後、 フエノール/クロ口ホルム抽出を行うこ とによりゲノム DNA (RNAを含む） を得る。 RNAは、 必要に応じ RN a s eにより ^すること力 きる。 ただし、 本発明はこれに限定されず、 ヒトゲノム DNAを含む試 料からのゲノム DNAの抽出にあたっては、 本発明の鎌分野において周知の方法、 すな わち; ¾1 (例えは、 Sambrook, J. et al. (1989)： "Molecular Cloning: ALaboratory Manual (2nd Ed. )" Cold Spring Harbor Laboratory, NY参照） に記載されている方法や、 市販の D N A抽出キット等を利用する方法も好ましく用いることができる。
DN Aを含む検体は、 P C Rに用いることができる [¾Sにおいてその Sは問わず、試料 よりの 出物、 精製物等を用いることができる。 3. 対象遺 β?の選択
遺伝子多型を検出する対象となる遺伝子は、少なくとも"^のヌクレオチド配列が既に 知られており、その部分に多型が るものであればいずれでもよい。そのような遺 β? の一例として、麵ゃ薬の副作用に関与する薬物代謝遺 ί5ΐである、シトクロム P 4 5 0 1
Α 2、 シ卜クロム Ρ 4 5 0 2 Α 6、 シトクロム Ρ 4 5 0 2 C 9、 シトクロム P 4 5 0 2 C 1 9，シトクロム Ρ 4 5 0 2 D 6、シトクロム P 4 5 0 2 E 1などが知られている。また、 チォプリンメチルトランスフェラ一ゼ、 N—ァセチルトランスフエラーゼ、 UD P—ダル クウロノシルトランスフェラーゼ、 および、 ダルタチオン S—トランスフェラーゼゃ、 疾 患との関連遺 fe?として、潰瘍 &¾昜炎の原因遺^としての HL A、慢性関節リゥマチの 原因遺伝子としての T C R α、 ァルツハイマー病の原因遺伝子としての A P O E .4、 精神 分裂症の原因遺^としてのド一パミン D 3受容体、 躁鬱病の原因遺伝子としてのトリプ トフアン水酸化酵素、 アルブミン尿症の原因遺伝子としてのアンジォテンシン前駆体、 心 筋梗塞の原因遺伝子としての血液凝固因子 VI I及び肥満の原因遺伝子としてのレブチンな どを挙げることが" Cきる。その他 human prothrombin等を挙げることもできる。
また、 マウスのゲノム DNAを検体として用いる場合にはマウスのアンジォポェチン関 連 3 (Angiopoietin-1 ike 3)遺 のプロ一モーター上の多型及び、欠^ 型も挙げること ができる。
なお、遺伝子中の多型の位置は翻訳領 非翻訳領 プロモータ一、イントロン等の調節 領域及びその他の領域のいずれであつてもよい。 4. オリゴヌクレオチドプライマー
以下のオリゴヌクレオチドは、 核酸自動合雄を用いて合成することができる。
天然のオリゴヌクレオチドについては天然のホスホロアミダイドを使用して合成するこ とができる。 2' -ft 4' エチレンヌクレオチドについては特許第 342098 号の実施例 14 (5 ' - 0-ジメトキシトリチル -2， -0, 4' -C -エチレン - 6- N-ベンゾィルアデノシン -3， -0 - (2—シァノエチル N，N -ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、 雄例 27 (5， - 0 - ジメトキシトリチル -2' -0, 4' -C -エチレン- 2-N-イソプチリルグアノシン - 3' -0-(2-シァ ノエチル Ν, Ν -ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、実施例 5 (5' -0 -ジメトキシトリチ ル- 2' -0, 4' -C -エチレン - 4- Ν-ベンゾィルシチジン- 3' -0 - (2-シァノエチル Ν, Ν-ジイソ プロピル)ホスホロアミダイト）、 実施例 22 (5， -0-ジメ卜キシ卜リチリ！/" 2' -0, 4' -C-X チレン -4-Ν -べンゾィル- 5 -メチルシチジン - 3' -0- (2-シァノエチル Ν, Ν-ジイソプロピル） ホスホロアミダイト）、実施例 9 (5' - 0-ジメトキシトリチ -0, 4， - C-エチレン- 5-メ チルゥリジン- 3' - 0 - (2-シァノエチル Ν，Ν -ジイソプロピル)ホスホロアミダイト） に記載 のィ匕合物を用いることによって合成することができる。
( 1 ) 遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチド
( 1 ) - 1 本発明で用いる遺 多型検出用のオリゴヌクレオチドとしては、 以下の ( a) 及び (b) を挙げることができる。
( a) »配列に相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド： 以下の (i)乃至 (i i i)の體を^ Tる；
(i)オリゴヌクレオチドの 3 ' ¾から 3番目（3 ' のヌクレオチドを 1番目として 3 番目） のヌクレオチドが 2' -0 -エチレンヌクレオチド （ENA) ユニットからなり、 他のヌクレオチドは天 ¾のヌクレオチドからなる、
(ϋ) 3'末 位に対象遺 の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部 位には対象遺^のヌクレ才チド配列に相補的なヌクレ才チドを有する、
(iii)オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチドの長さは PCRによって核酸を増幅で きる限りにおいて特に制限はないが、好ましくは 15〜40ヌクレオチド、より好ましくは 18〜35ヌクレオチド、 更に好ましくは 18〜25ヌクレオチドからなるオリゴヌクレ 才チドである。
このような體を有するオリゴヌクレオチドを、以下、 「X_PRIMER」 と呼ぶこと にする。
(b) 変異配列に相補的なヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド
(i)オリゴヌクレオチドの 3' «から 3番目（3' のヌクレオチドを 1番目として 3 番目） のヌクレオチドが 2' -Ο,Α' -エチレンヌクレオチド （ΕΝΑ) ユニットからなり、 他のヌクレオチドは天 βのヌクレオチドからなる、
(ii) 3 ' 5(¾啦に対象遺 の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、その他の部 位には対象遺 のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する、
(i i i)オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの長さは PCRによって核酸を増幅できる限りに おいて特に制限はないが,好ましくは 15〜40ヌクレオチド、より好ましくは 18〜 35 ヌクレオチド、 更に好ましくは 18〜25ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであ る。
上記 (a)及び（b) 中の（i)において、 オリゴヌクレオチドの 3' から 3番目のヌ クレオチドが 2' - ft 4' エチレンヌクレオチド （ENA) ユニットであるとは、 3番目の ヌクレオチドを天然型のヌクレオチドではなく、 E N Aヌクレオチドであることをするこ とを意味する。例えば Apの代わりに Ae2p、 Gpの代わりに Ge2p、 Cpの代わりに 5Ce2 pまたは C 62 p、 T Pの代わりに T e 2 pを用いることを意味する。
このような赚を有するオリゴヌクレオチドを、以下、 「Y— PRIMERJ と呼ぶこと にする。
(1) -2 本発明で用いる遺 多型検出用のオリゴヌクレオチドとしては、 更に以 下の （c) 及び (d) を挙げることができる。
(c) 3' 啦から 2番目のヌクレオチド が基準配列に相補的なヌクレオチド 配列からなるオリゴヌクレオチド 以下の (i)乃至 (v)の特徴を有する；
(0 オリゴヌクレオチドの 3 ' 位が対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌク レオチドからなる、
(i i) オリゴヌクレオチドの 3 ' から 2番目（3 ' のヌクレオチドを 1番目として 2番目） のヌクレオチドカ基準遺伝子のヌクレ才チドと相補的でないヌクレ才チドからな る、
(i i i) その他の部位には対象遺 ί¾ΐのヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを る、
(iv) オリゴヌクレオチドの 3 ' から 3番目（3 ' «のヌクレオチドを 1番目として 3番目）のヌクレオチドが 2' -ft 4' - エチレンヌクレオチド（ENA)ュニットからなり、 他のヌクレオチドは天 «のヌクレオチドからなる、
(v) オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの長さは PCRによって核酸を増幅できる限りにお いて特に制限はないが、好ましくは 1 5〜4 0ヌクレオチド、より好ましくは 1 8〜3 5ヌ クレオチド、更に好ましくは 1 8〜 2 5ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。 このような體を有するオリゴヌクレオチドを、以下、 「N— P R I MERJ と呼ぶこと にする。
(d) 3， 立から 2番目のヌクレオチド が ¾翻己列に相補的なヌクレオチド 配列からなるオリゴヌクレオチド '
以下の（i)乃至 (V)の特徴を有する；
(0 オリゴヌクレオチドの 3， 末 位が対象遺 の変異ヌクレオチドに相補的なヌク レオチドからなる、
(i i) オリゴヌクレオチドの 3 ' から 2番目（3 '末端のヌクレオチドを 1番目として 2番目） のヌクレオチドが基準遺 のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからな る、
(i i i) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する、 (iv) オリゴヌクレオチドの 3 ' から 3番目（3 ' のヌクレオチドを 1番目として 3番目）のヌクレオチドが 2' - ft 4' エチレンヌクレオチド（ENA)ュニットからなり、 他のヌクレオチドは天^ Mのヌクレオチドからなる、
(V) オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの長さは PCRによって核酸を増幅できる限りにお いて特に制限はないが、好ましくは 1 5〜4 0ヌクレオチド、より好ましくは 1 8〜3 5ヌ クレオチド、更に好ましくは 1 8〜 2 5ヌクレオチドカゝらなるオリゴヌクレオチドである。 このような を有-するオリゴヌクレオチドを、以下、 「P— PRIMERJ と呼くことに する。
上記 (a) 乃至 （d) 中の（iv)において、 オリゴヌクレオチドの 3' から 3番目の ヌクレオチドが 2' -ft 4' エチレンヌクレオチド （ENA) ユニットであるとは、 3番目 のヌクレオチドが 然型のヌクレオチドではなぐ EN Aヌクレオチドであることを意味 する。例えば、 Apの代わりに Ae2p、 Gpの代わりに Ge2p、 Cpの代わりに 5Ce2pまたは C e 2 p、 Tpの代わりに T e 2 pが用いられることを意味する。
なおこれらの（a)乃至 (d) のオリゴヌクレオチドを PCR用フォワード ·プライマ 一 (Forward primer) と呼ぶこともある。
(2) 対になって用いられるオリゴヌクレオチド
(a) PCR用オリゴヌクレオチド
PCRにおいて上記 (1) に記載の （a) 乃至 （d) のいずれかのオリゴヌクレオチド と対になって用いられるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、 遺伝子多型を検出す る対象となる遺伝子のヌクレオチド:配列において、 上記 (1) の （a) 乃至 (d) のいず れかの遺伝子多型検出用のオリゴヌクレオチドと対になって P CRによって対象の遺伝子 中の目的の配列を増幅できる限りにおいて に制限されないが、具体的には相補鎖にあた る配列中の最も 5， 末端側の位置よりもさらに 5' 末端側領域に ¾Tる相補鎖の配列中 の連続した 15〜40ヌクレオチド、好ましくは 18乃至 35ヌクレオチド、更に好ましく は 18乃至 25ヌクレオチドの任意の部分配列からなる。ただし、遺 ^多型検出用のオリ ゴヌクレオチドと対になって用いられるオリゴヌクレオチドに互いに相補的な配列が存在 すると、お互いにァニーリングすることにより非特異的な配列が増幅され特異的な遺伝子 多型の検出の妨げとなるおそれがあるので、そのような組み合わせを避けたオリゴヌクレ ォチド及び対になるオリゴヌクレオチドの設計を行うことが、好ましい。
なお、本明細書においては、対になるオリゴヌクレオチドをリバース ·プライマ一 (Reverse primer; と呼ぶこともある。
(b) TaqManプローブ
TaqMan PCRで用いる ¾βΐ多型検出用オリゴヌクレオチド （TaqManプ 口一フ)は 5 '末端は F AMや V I Cなどの蛍光レポーター色素によって標識されており、 同時に 3' 末端はクェンチヤ一で標識されており 〔ジエネテイク ·アナリシス (Genet. Anal.), 14, pl43-149 (1999), ジャーナル'ォブ.クリニカル'マイクロバイオロジー（J, Clin. Microbiol.), 34, p2933-2936 (1996)〕。
上記 (1) に記載の (a) 乃至 (d) のレ fれかのオリゴヌクレオチドと対になって用 いられる TaqManプローブの配列は、 遺 ί5 多型を検出する対象となる遺 のヌク レオチド配列において、 上記 (1) に記載の （a) 乃至 （d) のいずれかの遺 β?多型検 出用のオリゴヌクレオチドと対になって P CRによって対象の遺^中の目的の配列を増 幅できる限りにおレ T特に制限されないが、具体的には相補鎖にあたる配列中の最も 5，末 端彻 Jの位置よりもさらに 5' «側領域に ETる配列中の連続した 15〜40ヌクレ才 チド、好ましくは 18〜35ヌクレオチド、更に好ましくは 18〜25ヌクレオチドの任意 の部分配列からなる'。ただし、遺 β?多型検出用のオリゴヌクレオチドと T a QM a ηプロ —ブに互いに相補的な配列力 在すると、お互いにアニーリングすることにより非特異的 な配列が増幅され特異的な遺 多型の検出の妨げとなるおそれがあるので、そのような 組み合わせを避けたオリゴヌクレオチド及び T aqManプローブの設計を行うことが好 ましい。 5. 遺 β?多型の検出方法
A. PCRによる遺伝子多型の検出
(1) PCR
上記「4.オリゴヌクレオチドプライマー」 の項の「（1)遺 β?多型検出用オリゴヌク レオチド」 の項目で設計した （a) 乃至 （d) のいずれかの遺 ί¾Τ多型検出用のオリゴヌ クレオチド及び該ヌクレオチドと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとを用いた P CR反応を行うことにより、纖遺 β?の所定の位置の多型を検出することが きる。ここ で PCRは (i) 「X— PR IMER丄及び該プライマ一と対になって用いられるオリゴヌ クレオチドとの組み合わせ、 (ii) 「Y— PR IMER」及び該プライマ一と対になって用 いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、 (i i i) 「N— P R I ME R」及び該プライ マーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、 （iv) 「P— PRIME R」 及び該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、 （V) (i)と（i i)の組み合わせ、 (vi) (i i i)と（iv)の組み合わせのいずれかの組み合わせで行うこ とがでさる。
P CRの反応条件は所望の核酸配列を増幅できる限りにおいて特に制限されず、当業者 が通新う条件で PCRを行うことができるが、例えば以下のようにして行うことができ る。
(a) 核酸合成酵素
核 ^^成酵素としては、 麵の核酸の種類に応じて、 DMポリメラーゼ、 RNAポリメラ一 ゼおよび逆転写酵素 (reverse transcriptase)から 択して用いること力 きる。ここ で、 DNAポリメラーゼとしては、例えば、 Thermus aquaticus由来の TaqDNAポリメラ一ゼ、 Thermus thermophilus由来の Tth DNAポリメラーゼ、 Pyrococcus由来の K0D、 Pfuあるい は PTODNAポリメラーゼ、あるいは前記の隱 I生ポリメラ一ゼの混合等があるが、これらに のみ限定されるものではない。 なお Tth DNAポリメラ一ゼは RT活性も有しているため、 RT-PCRを One tube-One ste で行うときに、 1種類の酵素で賄うことが出来る特徴を有し ている。逆転写酵素は、 RNAを cDNAに逆転写出来る酵素を意味する。逆転写酵素としては、 Rous associated virus(RAV)や Avian myeloblastosis virus (AMV)等のトリのレトロウイ ルス由来の逆転写酵素、 Moloney murine leukemia virus (MMLV)等のマウスのレトロウィル ス由来の逆転写酵素あるいは嫌己の Tth DNAポリメラ一ゼ等があるが、 これらにのみ限定 されるものではない。
(b) PCR反応
P C R反応は例えば以下のとおりである。
, 反応繊贓の例：
塩化マグネシウム 2乃至 2. 5mM Offましくは 2. 5mM)；
1 XPCR緩衝液 （1 OmM 卜リス一;^ (25°Cにおける pH8. 3乃至 9. 0 ($f ましくは 8. 3))、 5 OmM 塩化カリウム；
dNTPs 0. 2乃至 0. 25mM ¾jfましくは 0. 25mM)； ,
遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチド及び該ヌクレオチドと対になって用いられるオリゴ ヌクレオチド 0. 2乃至 0. 5 (^ましくは 0. 2 U)；
Taqポリメラ一ゼ 1乃至 2. 5単位 （好ましくは 2. 5単位）；
滅菌水を加えて^ Mを 80 n 1に調整し、 その^ *を、 逆転写反応を終了した反応液全量 に加えてから P C Rを開始する。
反応? 条件： まず 94°Cで 2分間加熱した後、 90乃至 95 ましくは 94°C) で 30秒間、 40乃至 65°C ?ましくは、プライマーの特性から算出される角灘 (Τ m) からそれより 20度低レ^ までの範囲内で 30秒間、 70乃至 75 （^ましくは 72 °C)で 1. 5分間の fi¾サイクルを 28乃至 50サイクル ましくは 30サイクル） 繰り返してから、 に冷却する。
(2)遺 多型の検出
PCR終了後、 反応液を電 永動し、 目的配列の大きさのバンドが増幅されているか否 かを検出する。
(a) 「X— PRIMERJ を用いた場合
X-PR I MER及び該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組 み合わせによる P C Rによって目的とする配列の増幅が ϋ認できた場合には、多型部分の ォリゴヌクレオチドは X— P R I M E Rの 3 ' 末端のォリゴヌクレオチドと相補的なヌク レオチドと判断することができ、多型はないと判定することができる。
一方目的の配列が増幅されないときは、 多型部分のオリゴヌクレオチドは X— PR ΙΜ ERの 3 ' 末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドではないと判断することが でき、 遺 多型を有すると判定することが、できる。
(b) 「Y— PRIMERJ を用いた場合
Y-PR IMERと プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドの組み 合わせによる P CRによって目的とする配列の増幅カ擁認できた場合には、多型部分のォ リゴヌクレオチドは Y— PRIMERの 3' 末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレ ォチドと判断することができ、遺 ^多型を ると判定することが きる。
一方目的の配列が増幅されないときは、 多型部分のオリゴヌクレオチドは Y— PR IM ERの 3 ' 末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドではないと判断することが でき、 遺 β?多型を有さないと判 ¾Tることができる。
(c) 「X— PRIMERJ 及び「Y— PRIMERJ の両方を用いた場合
X-PR IMERと該プライマ一と対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み 合わせによる PCRによって目的とする配列の増幅が ¾認でき、 Y— PR IMERと該プ ライマ一と対になつて用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによる P C Rによつ て目的とする配列の増幅が IS認できない: ^には、遺伝子多型はないと判定することがで きる。
一方、 X— PR IMERと該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドと の組み合わせによる P CRによって目的とする配列の増幅カ域認できず、 Y-PRIME
Rと該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによる P C Rによって目的とする配列の増幅が H雀認できた場合には、遺伝子多型を有すると判定する ことができる。
(d) 「N— PRIMERJ を用いた場合
「N— PR IMER」 及び該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドと の組み合わせによる PCRによって目的とする配列の増幅が 認できた場合には、多型部 分のオリゴヌクレオチドは 「N— PRIMER」 の 3' のオリゴヌクレオチドと相補 的なヌクレオチドと判断することができ、多型はないと判定することができる。
一方目的の配列が増幅されないときは、 多型部分のオリゴヌクレオチドは 「N— PRI MER」 の 3， 末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドではないと判断するこ と力 き、 遺 fe?多型を有すると判 ることが きる。
(e) 「P— PRIMERJ を用いた場合
「P— PR IMER」 と該プライマ一と対になって用いられるオリゴヌクレオチドの組 み合わせによる P C Rによって目的とする配列の増幅カ 認できた場合には、多型部分の オリゴヌクレオチドは 「P— PRIMER」 の 3' 末端のオリゴヌクレオチドと相補的な ヌクレオチドと判断すること力 き、遺 ^多型を有すると判定すること力 きる。
一方目的の配列が増幅されないときは、 多型部分のオリゴヌクレオチドは 「P— PRI M E R」 の 3 ' のォリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドではなレ ^と判断するこ とができ、 遺 多型を有さないと判 ¾Tることができる。
(f) 「N— PRIMERJ 及び「P— PRIMERJ の両方を用いた場合
「N— PR IMER」 と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの 組み合わせによる PCRによって目的とする配列の増幅が ϋ雀認でき、 「P— PRIMERJ と該プライマ一と対になつて用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによる P C R によって目的とする配列の増幅が ϋ認できない場合には、遺伝子多型はないと判定するこ とができる。
一方、 「N— PRIMERJと該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチド との組み合わせによる PCRによって目的とする配列の増幅カ鳩認できず、「 P— P R I M E R」 と該ヌクレオチドと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによ る P CRによって目的とする配列の増幅カ擁認できた場合には、遺伝子多型を有すると判 定することが、できる。
上記（a)乃至（f)のいずれかと同様の実験を ENAオリゴヌクレオチドを含まない、 オリゴヌクレオチドで行うと本 |ξΑ、ンドが出ないはずの铸型となる核酸に対してもミスマ ツチによるバンドの出現が ϋ認され本方法は »の方法に比^^度よく遺伝子多型を検 出できることカ雕認できる。また、 ΕΝΑュニッ卜の代わりに LNAを用いた場合もミスマ ツチカ 認されるが遺 多型の検出の精度は低下する。
また、 ΕΝΑュニッ卜の位置をオリゴヌクレオチドの 3 ' から 3番目!^ Μこしたォ リゴヌクレオチドを用いた^には、遺 ί5ί多型の検出の精度及 «度が低下する。
B. TaqMan P CRによる遺 β?多型の検出 '
上記、 「Α.」の項目において遺 多型検出用オリゴヌクレオチドと上記「4.」 の項目 に記載の Ta qManプローブを用い、 ΑΒΙ社 ABI PRISM等を用い、 その添付プロトコ一ル に従って T aaMan P C Rを行うことによって遺 fe?多型を検出することができる。
(a) 「X— PRIMERj を用いた場合
「X— PRIMER」 と TaqManプローブとの組み合わせによる TaqMan P CRによって蛍光強度の増カロによって目的とする配列の増幅が ϋ認できた場合には、多型 部分のォリゴヌクレオチドは X— P R I M E Rの 3， 末端のォリゴヌクレオチドと相補的 なヌクレオチドと判断することができ、遺 ί¾Τ多型はないと判定することができる。
一方目的の配列が増幅されないときは、 多型部分のオリゴヌクレオチドは X— PR ΙΜ E Rの ·3 ' 末端のォリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドではないと判新することが でき、 遺ィ¾?多型を有すると判定することができる。 '
(b) 「Y— PRIME R」 を用いた^
Y_ P R I ME Rと T a QM a nプローブとの組み合わせによる P C Rによって^1 ά強 度の増加によって目的とする配列の増幅が ϋ認できた場合には、多型部分のオリゴヌクレ ォチドは Υ— P R I ME Rの 3 ' のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドと判 断すること力 含、遺 多型を有すると判定することができる。
一方目的の配列が増幅されないときは、 多型部分のオリゴヌクレオチドは Y— PR IM ERの 3 ' 末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドャはないと判断することが でき、 遺 多型を有さないと判 ¾Tるこ'とができる。
(c) 「X— PRIMERJ 及び「Y— PRIME R」 の両方を用いた場合
X— PRIMERと TaqManプローブとの組み合わせによる P C Rによって蛍光強 度の増加によって目的とする配列の増幅が ¾認でき、 Y-PRI MERと T a qMa nプ ローブとの組み合わせによる P C Rによって目的とする配列の増幅力 ¾|認できない場合に は、遺 »多型を有さないと判 ること力 きる。 ' 一方、 X— PR IMERと TaqManプローブとの組み合わせによる PCRによって 目的とする配列の増幅カ 認できず、 Y_ P R I ME Rと T a qM a nプローブとの組み 合わせによる PCRによって蛍光弓艘の増加によって目的とする配列の増幅カ權認できた 齢には、遺 多型を有さないと判 ¾Tることができる。
(d) 「N— PRIMER」 を用いた場合
「N—PR IMER」 と T a QM anプローブとの組み合わせによる T a qM an P C Rによつて蛍光強度の増加によつて目的とする配列の増幅が H認できた場合には、多型 部分のオリゴヌクレオチドは「N— P R I ME R」 の 3 ' 末端のオリゴヌクレオチドと相 補的なヌクレオチドと判断することができ、遺ィ¾÷多型はないと判 ることができる。 一方目的の配列が増幅されないときは、 多型部分のオリゴヌクレオチドは「N— PRI MERJ の 3 ' 末端のォリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドではなレ と判断するこ と力 sでき、 遺 多型を有すると半 ること力 ?きる。
(e) 「P— PRIMERJ を用いた場合
「P— PR IMERJ と TaqManプローブとの組み合わせによる PCRによって蛍 光強度の増加によって目的とする配列の増幅が ϋ認できた場合には、多型部分のオリゴヌ クレオチドは 「P— PRIME R」 の 3' 末端のオリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオ チドと判断することができ、遺伝子多型を有すると判 ることができる。
一方目的の配列が増幅されないときは、 多型部分のオリゴヌクレオチドは 「P— PRI
MERJ の 3 ' のォリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチドではないと判断するこ とができ、 遺 ί5ΐ多型を有さないと判 ¾Tることができる。
(f ) 「N - PR IMERJ 及び「P— PR I MERJ の両方を用いた
「N— PR IMER」 と TaqManプローブとの組み合わせによる PCRによって蛍 光強度の増加によって目的とする配列の増幅力 ¾1認でき、 「P— P R I ME R」と T a QM a nプローブとの組み合わせによる P C Rによって目的とする配列の増幅が歸忍できない 齢には、遺 多型を有さないと判 ¾Tることができる。
一方、 「N— PRIME R」と T a qM anプローブとの組み合わせによる PC Rによつ て目的とする配列の増幅が ϋ認できず、 「P ~ PR IMER」と T a dM anプローブとの 組み合わせによる PCRによって蛍光弓 t¾の増加によって目的とする配列の増幅が 認で きた tj^には、遺伝子多型を有さないと判 ること力 きる。
C. MALD I—TOF/MS法による遺 多型の検出 MALD I— TOF/MS法による多型の検出法 （「S NP遺βΐ多型の戦略」 （中†¾ m , 中山書店， (2000)、 p. 1 0 6 - 1 1 7) に記載の方法を一部 «するこ とによって遺 多型を検出すること力 きる。 以下、具体的に説明する。
多型部位を含む P CR産物をゲノム DNAより増幅する。その際、多型部位の驢と P C Rプライマ一«S複しないように設計する。
次に P C R反応系に残存している d NT Pとプライマーとして用レたォリゴヌクレオチ ドを |5鉄し、精製 P CR産物とする。
精製 P C R産物を麵として、上記「4.」の「（1 )遺 »多型検出用オリゴヌクレオチ ド」に記載のオリゴヌクレオチドを铸型に対して 1 0倍以上の過剰 *¾]え、 9 0乃至 9 5°C でァニールさせ、サ一マルサイクル反応を行う。サーマルサイクル反応はオリゴヌクレオチ ドの伸張反応が ϋ認される限りにおいて特に制限されないが、例えば 9 4 °Cと 3 7 の 2 間で2 5回の反応で適当な伸 51¾率が得られる。
得られた伸張反応産物を精製し、塩、 緩衝液、界面活性剤、 蛋白を! ^する。 この精製物 を MALD Iプレートにスポットし、 MALD I一 TO FZMSによって質量を分析する。 対象遺^の多型部位が 多型検出用オリゴヌクレオチドと相補的なォリゴヌクレ ォチドであるときには遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチドに d d NT Pが付加された伸 張反応産物の蓄積が ¾認されるが、多型部位が遺伝子多型検出用オリゴヌクレオチドと相 補的でないときは伸張反応産物は薪貴されなレ
「X— P R I MERJを用いた場合に伸張反応産物力 ¾|認さ； n ば多型部分 ヌク レオチドであり、多型を有さないと判^ることができ、伸張反応産物カ權認されなければ、 多型部分は変異ヌクレオチドであり、 遺伝子多型を有すると判断できる。
「Y— P R I ME R」を用いた齢に伸張反応産物力鳩認されれば多型部分は変異ヌク レオチドであり、多型を有すると判断でき、伸張反応産物カ赚認されなければ多型部分は 基準ヌクレオチドであり、 遺 多型を有さないと判断できる。 · 「Ν— P R I MERJを用いた ±船に伸贩応産物力 認さ池ば、多型部分 ヌク レオチドであり、多型を有さないと判 ること力 き、伸張反応産物が1認されなければ、 多型部分は変異ヌクレオチドであり、 遺 多型を有すると判断できる。
「P— P R I MER」を用いた ±胎に伸 魅物力 認さ ば、多型部分は変異ヌク レオチドであり、多型を有すると判断でき、伸張反応産物カ橢認されなければ、多型部分は 基準ヌクレオチドであり、 遺 多型を有さないと判断できる。 また、 キアゲン社 (Qiagen) の LightCycler systemとそれを用いて PCR産物を検出する キット （Quant i tec t SYBR Green PCR Kit) 等に応用することによって生成する PCR産物の 有無を検出することなどを用 ^て、 PCR産物を測定することも可能である。 6. 遺ィ5?多型の細犬態の確認
本発明の方法によると铸型となる核酸中の多型がヘテロで るかホモで存 るか を判 ることができる。具体的には以下の（a)乃至 (f)のいずれかの方法によって判 定することができる。
(a) 「X_PRIMER」 を用いた： t給
「X— PRIMER」 と該プライマ一と対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの 組み合わせによる P C Rによって目的とする配列の増幅が ϋ認できた場合にホモであるこ とが分かっている検体に比べ目的とするバンドの出現量が約半分になっている場合には、 多型 «S準ヌクレオチドと変異ヌクレオチドのヘテロであると判定することができる。
(b) 「Y— PRIME R」 を用いた場合
Y— PR I ME Rと該プライマ一と対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み 合わせによる PCRによって目的とする配列の増幅が ¾認できた場合にホモであることが 分かっている検体に比べ目的とするバンドの出現量が約半分になっている場合には、多型 準ヌクレ才チドと変異ヌクレ才チドのヘテロであると判定することができる。
(c) 「X— PRIMERJ 及び「Y - PRIMERJ の両方を用いた場合
X— PR IMERと該プライマ一と対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み 合わせによる P CRによって目的とする配列の増幅が 認でき、 Y— PR I MERと該ヌ クレオチドと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによる P C Rによ つても目的とする配列の増幅が 1ft認できる場合には、多型はへテロであると判定すること 力 きる。
(d) 「N— PRIMERJ を用いた場合
ΓΝ-PR IMERJ と該プライマ一と対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの 組み合わせによる P C Rによって目的とする配列の増幅力 歸忍できた場合に、 ホモである ことが分かっている検体に比べ目的とするバンドの出現量が約半分になっている場合には、 多型〖雄準ヌクレオチドと変異ヌクレオチドのヘテロであると判定することができる。
(e) 「P— PRIMERJ を用いた ¾^ 「P— PRIMER」 と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの 組み合わせによる P C Rによって目的とする配列の増幅力 崔認できた場合に、 ホモである ことが分かっている検体に比べ目的とするバンドの出現量が約半分になっている場合には、 多型 ヌクレオチドと変異ヌクレオチドのヘテロであると判定することが きる。
(f) 「N— PRIMER」 及び「P— PRIMER」 の両方を用いた場合
「N— PR IMER」 と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの 組み合わせによる PC Rによって目的とする配列の増幅が ¾認でき、 「P— PR IMERJ と該プライマーと対になって用いられるオリゴヌクレオチドとの組み合わせによる P CR によっても目的とする配列の増幅が歸忍できる場合には、多型はへテロであると判定する ことができる。
7. 遺伝子多型検出用キット
本発明の方法を行うために™するプライマー及び趨類を遺伝子多型検出用キットと して提供すること力 きる。そのようなキットは以下の物を含む。
キット 1 ： (a) オリゴヌクレオチドの 3 ' 末端から 3番目のヌクレオチドが 2' -ft ' エチレンヌクレオチド（ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型 のヌクレオチドからなり、 3， 末 ¾ ^位に対象遺 ί¾Τの基準ヌクレオチドに相補的なヌク レオチド、 その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有 するオリゴヌクレオチド；
(b) (a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリゴヌ クレ才チド；
(c) DNAポリメラーゼ；
(d) PCR緩衝液、
(13) 以下のものを含む、 遺 多型検出用キット：
(a)オリゴヌクレオチドの 3' «から 3番目のヌクレオチドが 2' -ί?,4' -エチレン ヌクレオチド (ΕΝΑ)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天 βのヌクレオチドからな り、 3， 位に対象遺^の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、 その他の部 位には対象遺伝 のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを するオリゴヌクレオチ F；
(b) (a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るプライマ (c) DNAポリメラ一ゼ；
(d) PCR緩衝液。
キット 2：
(a)オリゴヌクレオチドの 3' から 3番目のヌクレオチドが 2' -0,4' - エチレン ヌクレオチド (ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからな り、 3， 末 ¾¾5位に対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、 その他の部 位には対象遺伝チのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチ ド；
(b)オリゴヌクレオチドの 3' 末端から 3番目のヌクレオチドが 2' -ft 4' - エチレン ヌクレオチド（ENA)ユニットからなり、他のヌクレオチドは天^ のヌクレオチドからな り、 3， 末¾¾位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、 その他の部 位には対象遺^のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチ ド；
(c) (a)又は（b) に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得 るオリゴヌクレオチド；
(d) DNAポリメラ一ゼ；
(e) PCR緩衝液。
キット 3：
(a) 以下の（i)乃至 (V)の特徴を有するオリゴヌクレオチド：
(0 オリゴヌクレオチドの 3， 末¾¾位が、対象遺伝子の基準ヌクレオチドに相補的なヌク レオチドからなる、 ,
(ii) オリゴヌクレオチドの 3' から 2番目（3' のヌクレオチドを 1番目として 2番目） のヌクレオチドが基準遺 ί¾ΐのヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからな る、
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する、
(iv) オリゴヌクレオチドの 3' から 3番目（3'末端のヌクレオチドを 1番目として
3番目）のヌクレオチドが 2' -OA' -C-ェチレンヌクレオチド（ENA)ユニットからなり、 他のヌクレオチドは天 «のヌクレオチドからなる、
(V) オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの長さは PCR.によって核酸を増幅できる限りにお いて特に制限はないが、好ましくは 1 5〜4 0ヌクレオチド、より好ましくは 1 8〜3 5ヌ クレオチド、更に好ましくは 1 8〜 2.5ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
(b) ( a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るプライマ (c ) DNAポリメラーゼ；
(d) P C R纖液。
キット 4：
(a) 以下の を有するオリゴヌクレ才チド：
(i) オリゴヌクレオチドの 3， 位が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌク レオチドからなる、
(i i) オリゴヌクレオチドの 3 ' 末端から 2番目（3 '末端のヌクレオチドを 1番目として 2番目） のヌクレオチドが基準遺 のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチドからな る、
(i i i) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する、 (iv) オリゴヌクレオチドの 3 ' ^から 3番目 ( 3 '末端のヌクレオチドを 1番目として 3番目）のヌクレオチドが 2' - 0, 4， -C -エチレンヌクレオチド（ENA)ュニットからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる、
(v) オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの長さは PCRによって核酸を増幅できる限りにお いて特に制限はないが、好ましくは 1 5〜4 0ヌクレオチド、より好ましくは 1 8〜3 5ヌ クレオチド、更に好ましくは 1 8〜2 5ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。
(b) (a)に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るプライマ
( c ) DNAポリメラ一ゼ；
(d) P CR緩衝液。
本発明のこれらのキット 1乃至 4には、場合によっては電気泳動用の各種 dNTP、 電気 働用マーカー等を含ませることもできる。 図面の簡単な説明
図 1は遺 多型の検出方法の原理を示す図であり、 多型がない場合を示す。
図 2は遺 β?多型の検出方法の を示す図であり、 多型がある:！^を示す。 図 3は遺ィ 5?多型の検出方法の原理を示す図であり、 多型がなレ場合を示す。
図 4は遺ィ ¾ΐ多型の検出方法の原理を示す図であり、 多型がある場合を示す。
図 5は Premix Taqを用いて各種プライマーを用いた P C Rの結果を示す図である。 図 6は Premix EX Taqを用いて各種プライマ一を用いた P C Rの結果を示す図である。 図 7は P C Rによって検出されたパンドの蛍光弓 を数値化した図である。
図 8はアンジォポェチン関連 3遺伝子プロモータ一内の多型を示す図である。
図 9— Aはマウス AKR strain由来のゲノム DNA (AKR) を錶型とした P C Rの結果を示 す図である。
'図 9— Bは KKマウス Nga strain由来のゲノム DNA (K Nga) を铸型とした P C Rの結 果を示す図である。
図 1 0は崖のゲノム DNA、KK/Ngaのゲノム DNA 、 KKマウス Snk strain (KK/Snk) のゲノム DN A、並びに、 AKRと KK/Ngaのゲノム DNAを等量づっ混ぜた DNAを麵とした P C Rの結果を示す図である。
図 1 1はアンジォポ工チン関連 3遺伝子プロモーター内の多型を示す図である。
図 1 2は Premix Taqを用いて各種プライマーを用いた P C Rの結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、難例、 例及ぴ 験例にて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれ らに限定されるものではない。 なお、 下記雄例において、 遺 β?操作に関する各操作は 特に明示がない限り、 「モレキュラークロ一ニング （Molecular Cloning) 」 [Sambrook, J. , Fri tsch, E. F.および Maniat is, T. 著、 Cold Spring Harbor Laboratory Press より 1989年に発刊] に記載の方法により行う力、、 または、市販の言纖ゃキットを用いる齢に は市販品の指示書に従つて使用した。
(難例 1 )
H0-Cp— Ap— Cp - Tp-Gp-Gp— Gp— Ap— Cp-Ap— Γ - Tp— Gp— Ap-Gp- Gp - 5Ce2p—Tp - C1の合成
核酸自動合謹 （パーキンエルマーネ懷 ABI model 394 DNA/RNA synthes izer) を用い、
40 nmol のプログラムで行った。 各合成サイクルにおける溶媒、 Ϊ趨、 ホスホロアミダイ トの は天然オリゴヌクレオチド合成の齢と同じものを用いた。 CPGは、 約 0. 1 mol 用いた。非天然型のホスホロアミダイトとしては、特許第 3420984号の実施例 22 (5' - 0- ジメトキシトリチル- 2' -0, 4' - C-ェチレン- 4- N-ベンゾィル- 5-メチルシチジン -3' -0 - (2 -シァノエチル N，N -ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、 の化合物を用いた。 目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を濃アンモニア水で処理すること によってォリゴマ一を 本から切り出すとともに、 リン原子上の保護基シァノェチル基 と核酸塩基上の保護基をはずした。 溶媒を S下留去し、 残った残渣を逆相 HP L C (島 津製作所製 LC— 10VP、 カラム （Merck, Chromol i th Performance RP-18e (4. 6 X 100mm) ) , A溶液： 5%ァセトニトリル、 0. 1M酢酸トリェチルアミン水溶液 (TEM) , H 7. 0、 B溶液： ァセトニトリル、 B%： 10¾→ 50% (10min, l inear gradient)； 60。C； 2 ml/mi n； 254 nm) に て精製し、 ジメトキシトリチル基を有する目的物のピークを集めた。水を加え、減圧下留 去することで、 TEMを除いた。 80%酢 溶液 (200 ^ 1) を加え、 20分放置することで、 ジメトキシトリチル基の脱保護を行った。 溶媒を留去したのち遡目 HP L C (島津製作所 製 LC— 10VP、 カラム （Merck, Chromol i th Performance RP-18e (4. 6X 100腿)）、 A溶液： 5%ァセトニトリル、 0. 1M TEAA, pH 7. 0、 B溶液： 25%ァセトニトリル， 0. 1M TEAA、 B%： 0% → 40¾ (10min, l inear gradient) ； 60°C； 2 ml/min； 254 nm) にて精製し、 目的物のピー クを集めた。減圧下溶媒を留去後、水 lmlに溶かし、 (9. A260 uni ts) oまた、本化合物は、 負イオン ESI質量分析により同定した （計算値： 6214. 11、 測定値： 6214. 62)。
本化合物の 配列は、 human prothrombin gene (GenBank access ion No. Ml 7262 ) の ヌクレオチド番号 26784-26803に相補的な配列である。
(難例 2 )
HO— Cp— Ap—Cp— Tp- Gp—Gp— Gp— Ap - Gp- Cp— Ap- Tp— Tp-Gp - Ap-Gp-Gp-5Ce2p— Tp - T1の合成
実施例 2の化合物は、 難例 1と同様に合成した （21 A260 uni ts)。 本化合物は、 負イオン
ESI質量分析により同定した （計算ィ直： 6229· 12、 測定値： 6229. 21)。
本化合物の;^配列は、 human prothrombin gene (GenBank access ion No. Ml 7262 ) の ヌクレオチド番号 26784- 26803であって、ヌクレオチド番号 26784が Gから Aに変異した ものに相補的な配列である。
(雄例 3 )
H0 - Ap- Tp - Cp-Tp- Gp - Tp-Cp-Tp- Ap - Cp-Ap - Γ- Ap- Tp- Ap- Tp- Ap - Γ - Ap - Cp - Ap - Cp- Ap- Cp-Ap-5Ce2p - Ap- T1の合 成の合成
実施例 3の化合物は、 実施例 1と同様に合成した （8. 9 A260 uni ts)。 本化合物は、 負ィ オン ESI質量分析により同定した （計算値： 8530. 67、 測定値： 8530. 75)。
本化合物の塩基配列は、 GenBank access ion NO. AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529- 60556の配列であって、ヌクレオチド番号 60556の Cが Tになっている配列である。 難例 4)
の合 成の合成
実施例 4の化合物は、 難例 1と同様に合成した （10. 1 A26。 uni ts：)。 本化合物は、 負ィォ ン ESI質 ¾ ^祈により同定した （計算値： 8515. 66、 測定値： 8515. 56)。
本化合物の塩基配列は、 GenBank accession NO. AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列である。
瞬例 1 )
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Cp-Tp-Cl
#例 1の化合物は、 難自動合雄を用いて常法により合成した。
本ィ匕合物の:^配列は、 human prothrombin gene (GenBank accession No. Ml 7262 ) の ヌクレオチド番号 26784-26803に相補的な配列であり、配列表の配列番号 1に示されてい る。 ' 瞬例 2 )
HO-Cp-Ap-Cp-Tp-Gp-Gp-Gp-Ap-Gp-Cp-Ap-Tp-Tp-Gp-Ap-Gp-Gp-Cp-Tp-Tl
例 2の化合物は、 核酸自動合扁を用いて常法により合成した。
本ィ匕合物の:^配列は、 human prothrombin gene (GenBank access ion No. Ml 7262 ) の ヌクレオチド番号 26784-2680^であって、ヌクレオチド番号 26784が Gから Aに変異した ものに相補的な配列であリ、配列表の配列番号 2に示されている。
瞬例 3 )
HO- Cp—Ap - Cp-Tp - Gp-Gp-Gp—Ap-Gp-Cp-Ap-TP_TP-Gp-Ap-Gp-Gp-Cp-Tp-Ce2tの合成
参考例 3の化合物は、 実施例 1と同様に合成した （0. 3 A260 uni ts)。 伹し、 非天鍵のホ スホロアミダイトとしては、 特許第 3420984号の実施例 5 (5' -0-ジメトキシトリチル -2' -0, 4' - C -ェチレン -4-N-ベンゾィルシチジン - 3 ' - 0- (2 -シァノエチル Ν, Ν -ジイソプ 口ピル)ホスホロアミダイト） の化合物を用い、 固相担体は、 universal-Q 500 CPG(Glen Research ) 約 Ο. Ι ΠΙΟΙを用いた。 本化合物は、 負イオン ESI質量分析により同定した (計算値： 6200. 08、 測定値： 6200. 25)。
本化合物の塩基配列は、 human prothrombin gene (GenBank accession No. Ml 7262 ) の ヌクレオチド番号 26784-26803に相補的な配列である。 (縛例 4)
HO- Cp- Ap- Cp- Tp- Gp- Gp- Gp- Ap- Gp-Cp- Ap- Tp- Tp- Gp-Ap- Gp- Gp- Cp-Tp- Te2!の合成
»例 4の化合物は、 難例 1と同様に合成した （0. 94 A26。uni ts)。但し、 非天然型のホ スホロアミダイトとしては、 特許第 3420984号の実施例 9 (5' - 0-ジメトキシトリチル -2， -0, 4' -C -エチレン- 5-メチルゥリジン - 3' - 0- (2-シァノエチル N，N -ジイソプロピル） ホスホロアミダイト）、 の化合物を用い、 固相担体は、 universal-Q 500 CPG (Glen Research ) 約 O. l ^molを用いた。本化合物は、負イオン ESI質 * ^祈により同定した（計算値： 6215. 09, ij定値： 6215. 06)。
本化合物の 配列は、 human prothrombin gene (GenBank accession No. M17262 ) の ヌクレオチド番号 26784- 26803であって、ヌクレオチド番号 26784が Gから Aに変異した ものに相補的な配列である。
(誇例.5 )
HO- Cp-Ap- Cp- Tp- Gp- Gp-Gp-Ap- Gp-Cp- Ap- Tp- Tp- Gp - Ap-Gp- Gp-Cp— Te2p - C1の合成
例 5の化合物は、 鎌例 1と同様に合成した （2. 28 A26。uni ts)。伹し、 非天麵のホ スホロアミダイトとしては、 特許第 342098 号の実施例 9 (5' -0-ジメトキシトリチル -2， -0, 4' -C -エチレン- 5-メチルゥリジン - 3' - 0- (2-シァノエチル N，N -ジイソプロピル） ホスホロアミダイト)、の化合物を用いた。本化合物は、負イオン ESI質量分析により同定 した （ト算値： 6200. 08、 測定値： 6200. 26)。
本ィ匕合 4勿の;^配列は、 human prothrombin gene (GenBank accession No. M17262 ) の ヌクレオチド番号 26784-26803に相補的な配列である。
例 6)
HO- Cp- Ap- Cp- Tp- Gp- Gp-Gp- Ap- Gp- Cp-Ap- Τρ- Γ- Gp- Ap-Gp-Gp- Cp- Te2p- T1の合成
詩例 6の化合物は、 実施例 1と同様に合成した （4. 98 A26。uni ts)。但し、 非天鍵のホ スホロアミダイトとしては、 特許第 342098 号の実施例 9 (5 ' - 0-ジメトキシトリチル -2 ' -0, 4' - C—ェチレン- 5 -メチルゥリジン- 3， -0 - (2 -シァノェチル N， N -ジィソプロピル） ホスホロアミダイト)、の化合物を用いた。本化合物は、負イオン ESI質 * ^祈により同定 した （計算値： 6215. 09、 測定値： 6215. 26)。
本ィ匕合物の塩基配列は、 human prothrombin gene (GenBank accession No. M17262 ) の ヌクレオチド番号 26784- 26803であって、ヌクレオチド番号 26784が Gから Aに変異した ものに相補的な配列である。 瞬例 7)
H0-Cp- Ap- Cp- Tp-Gp- Gp-Gp - Ap- Gp - Cp- Ap-Tp-Tp-Gp- Ap- Gp-Ge2p- Cp- Tp-Clの合成
例 7の化合物は、 実施例 1と同様に合成した （4. 32.A26。uni ts)。 但し、 非天然型のホ スホロアミダイトとしては、 特許第 3420984号の実施例 27 (5' - 0-ジメトキシトリチル _2， -0, 4' -C -エチレン - 2- N -イソブチリルグアノシン- 3' -0-(2-シァノエチル Ν, Ν -ジィ ソプロピル)ホスホロアミダイト）、 の化合物を用いた。 本化合物は、 負イオン ESI質量分 析により同定した （計算値： 6200. 08、 測定値： 6199. 95)。
本ィ匕合物の 酉己列は、 human prothrombin gene (GenBank access ion No. Ml 7262 ) の ヌクレオチド番号 26784-26803に相補的な配列である。
例 8)
HO- Cp- Ap- Cp- Tp- Gp- Gp- Gp- Ap- GP_CP- Αρ- Γ- Tp-Gp- Ap- Gp-Ge2p- Cp-Tp- T1の合成
詩例 8の化合物は、 実施例 1と同様に合成した （8. 0 A26。 uni ts)。 但し、 非天然型のホ スホロアミダイトとしては、 特許第 342098 号の実施例 27 (5' -0 -ジメトキシトリチル _2， -0, 4' -C-エチレン - 2 - N-イソブチリルグアノシン- 3' -0-(2 -シァノエチル Ν, Ν -ジィ ソプロピル)ホスホロアミダイト)、 の化合物を用いた。 本化合物は、 負イオン ESI質量分 析により同定した （計算値： 6215. 09、 測定値： 6215. 06) .
本ィ匕合物の:^配歹1 jは、 human prothrombin gene (GenBank accession No. M17262 ) の ヌクレオチド番号 26784-26803であって、ヌクレオチド番号 26784が Gから Aに変異した ものに相補的な配列である。
例 9) '
H0 - Cp- Ap-Cp - Tp-Gp-Gp - Gp- Ap-Gp - Cp - Ap- Tp-Tp- Gp- Ap-Gp- Gp - Ceip - Tp- C1の合成
参考例 9の化合物は、 実施例 1と同様に合成した （13. 28 A260 uni ts)。 但し、 非天然型の ホスホロアミダイ卜としては、 文献 Tetrahedron (1998) 54, 3607-3630. 記載の 5' - 0 - ジメトキシトリチル- 2' -0, 4' -C -メチレン- 4-N-ベンゾィルシチジン- 3' -0- (2-シァノエ チル N，N -ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、 の化合物 (Celp) を用いた。 本化合物は、 負イオン ESI質量分析により同定した （計算値： 6186. 05, 測定値： 6186. 45)。
本化合物の:^配歹 Uは、 human prothrombin gene (GenBank accession No. Ml 7262 ) の ヌクレオチド番号 26784-26803に相補的な配列である。
例 10)
H0-Cp— Ap— Cp—Tp-Gp-Gp- Gp— Ap- Gp— Cp— Ap— Tp— Tp—Gp— Ap - Gp-Gp- Celp- Tp— T1の合成 誇例 10の化合物は、 実施例 1と同様に合成した （8.0 A26。uni ts)。 但し、 非天删のホ スホロアミダイトとしては、 文献 Tetrahedron (1998) 54, 3607-3630. 記載の 5' -0-ジメ トキシトリチフ 1/"2' -0, 4' -C-メチレン - 4 - N -べンゾィルシチジン- 3' - 0-(2-シァノエチル N，N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト、 の化合物 (Celp) を用いた。 本化合物は、 負ィ オン ESI質量分析により同定した （計算値： 6201.07、 測定値： 6201. 14)。
本化合物の:^配列は、 human prothrombin gene (GenBank accession No. M17262 ) の ヌクレオチド番号 26784- 26803であって、ヌクレオチド番号 26784が Gから Aに変異した ものに相補的な配列である。
( 例 1 1)
H0_Ap- Tp- Cp- Tp- Gp— Tp— Cp-Tp- Ap- Cp- Ap- Tp- Ap— Tp- Ap- Tp- Ap- Tp- Ap- Cp- Ap-Cp- Ap- Cp- Ap- Cp- Αρ-Τιの合成 誇例 1 1の化合物は、 核酸自動合雄を用いて常法により合成した。
本化合物の塩基配列は、 GenBank accession No. AL935325 記載のヌクレオチド番号
60529-60556の配列であって、ヌクレオチド番号 60556の Cが Tになっている配列であり、 配列表の配歹 ij番号 3に示されている。
(誇例 1 2)
H0_AP— TP一 CP一 TP一 GP_TP— CP一 TP_AP—CP一 AP— TP—AP— TP_AP— TP一 AP— TP_AP_CP— AP— CP一 AP一 CP— AP_CP一 AP—Ctの合成 例 1 2の化合物は、 核酸自動合鎌を用いて常法により合成した。
本化合物の塩基配列は、 GenBank accession No. AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列であり、配列表の配列番号 4に示されている。
(詩例 1 3)
HO- Ap- Tp-Cp- Tp- Gp- Tp- Cp-Tp- Ap- Cp- Ap-Tp- Ap-Tp- Ap- Tp- Ap- Tp-Ap-Cp- Ap- Cp- Ap- Cp- Ap- Cp- Ap-Te2t の合 成
例 1 3の化合物は、 実施例 1と同様に合成した （7. 8 A26。 units)。 但し、 非天羅の ホスホロアミダイトとしては、 特許第 3420984号の実施例 9 (5' -0-ジメトキシトリチル -2' -0, 4' -C-エチレン- 5-メチルゥリジン - 3， -0 - (2-シァノエチル Ν, Ν-ジイソプロピル） ホスホロアミダイト） の化合物を用い、 固相担体は、 universal-Q 500 CPG(Glen Research ) 約 0. 1 molを用いた。本化合物は、負イオン ESI質 * ^祈により同定した（計算値：
8516. 64、 測定値： 8515.88)。
本化合物の塩基配列は、 GenBank accession No. AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529- 60556の配列であって、ヌクレオチド番号 60556の Cが Tになっている配列である。 ( 1 4)
H0-Ap- Tp- CP_TP- Gp- Tp- Cp- Tp- Ap-Cp- Ap- Tp- Ap-Tp-Ap- TP_AP- Tp- Ap- Cp- Ap- Cp - Ap- Cp-Ap- Cp- Ap- 5Ce2tの合 成
詩例 1 4の化合物は、実施例 1と同様に合成した （7.4 A26。uni ts)。但し、 固相担体は、 universal-Q 500 CPG(Glen Research W 約 0. 1 xmolを用いた。本化合物は、負イオン ESI 質量分析により同定した （計算値： 8516.66、 測定値： 8516.00) 0
本化合物の塩基配列は、 GenBank accession NO. AL935325記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列である。
瞬例 1 5)
H0 - Ap- Tp- Cp- Tp-Gp - Tp- Cp- Tp- Ap-Cp- Ap-Tp-Ap - Tp- Ap- Tp- Ap- Tp-Ap- Cp- Ap- Cp - Ap- Cp-Ap-Cp - Ae2。- T1 の合 成
参考例 1 5の化合物は、 実施例 1と同様に合成した （8.4 A260 uni ts)0 但し、 非天然型の ホスホロアミダイトとしては、 特言午第 3420984号の実施例 14(5' -0-ジメトキシトリチル -2' -0, 4' -C-エチレン - 6-N -ベンゾィルアデノシン- 3' - 0 - (2 -シァノエチル N，N-ジイソ プロピル)ホスホロアミダイト）の化合物を用いた。 本化合物は、 負イオン ESI質量分析に より同定した （計算値： 8516. 64、 測定値： 8516.32)。
本化合物の塩基配列は、 GenBank accession No. AL935325記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列であって、ヌクレオチド番号 60556の Cが Tになっている酉己列である。
瞬例 1 6)
H0-Ap_Tp - Cp- Tp- Gp- Tp- Cp - Tp - Ap- CP_AP- Tp- Ap- Tp-Ap-Tp- Ap— Tp- Ap-Cp - Ap - Cp - Ap- Cp- AP_CP- Ae2p- C1 の合 成
例 1 6の化合物は、 実施例 1と同様に合成した （7. 9 A260 uni ts)。 但し、 非天然型の ホスホロアミダイトとしては、 特許第 342098 号の実施例 14(5' - 0-ジメトキシトリチル - 2' -0, 4' -C -エチレン- 6-N-ベンゾィルアデノシン- 3， - 0-(2-シァノエチル Ν, Ν-ジイソ プロピル)ホスホロアミダイト）の化合物を用いた。 本化合物は、 負イオン ESI質量分析に より同定した （計算値： 8501. 63、 測定値： 8500.70)。
本化合物の塩基配列は、 GenBank accession No. AL935325記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列である。
瞬例 1 7)
HO- Ap- Tp- Cp- Γ- Gp- Tp- 'Cp- Tp- Ap- Cp- Ap- Tp- Ap- Tp- Ap- Tp- Ap- Tp- Ap- Cp- Ap-Cp- Ap- Cp-Ae2p- Cp- Ap- の合 成
参考例 17の化合物は、 実施例 1と同様に合成した （9.7 A260 units) 伹し、 非天鍵の ホスホロアミダイトとしては、 特許第 342098 号の実施例 14(5' - 0-ジメトキシ卜リチル -2' -0,4， -C -エチレン- 6-N -ベンゾィルアデノシン - 3， -0_(2-シァノエチル N，N-ジィソ プロピル)ホスホロアミダイト)の化合物を用いた。 本化合物は、 負イオン ESI質量分析に より同定した （計算値： 8516.64、 測定値： 8517.14)。
本化合物の塩基配列は、 GenBank accession NO.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列であって、ヌクレオチド番号 60556の Cが Tになっている配列である。
瞬例 18)
H0-Ap - Tp- Cp- Tp-Gp-Tp-Cp- Tp- Ap- Cp- AP_TP-AP_TP-AP- Tp- Ap - Tp- AP-CP_AP-CP - Ap- Cp- Ae2p_Cp-Ap- C1 の合 成
例 18の化合物は、 実施例 1と同様に合成した （7.2 A26。 units)0 但し、 非天羅の ホスホロアミダイトとしては、 特許第 3420984号の実施例 14(5' -0-ジメトキシトリチル -2 ' -0,4， - C-ェチレン -6-N-ベンゾィルアデノシン- 3 ' -0- (2-シァノェチル N, N -ジィソ プロピル)ホスホロアミダイト）の化合物を用いた。 本化合物は、 負イオン ESI質 ¾析に より同定した （計算値： 8501.63、 測定値： 8501.65)。
本化合物の塩基配列は、 GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60529-60556の配列である。
(試験例 1 ) Human prothrombin geneの S Pの検出
human prothrombin gene (coagulation factor II), GenBank accession No. M17262) の SNP (F220210G-A)の検出のために、 Reverse primer, Human DNAは、 Proligo社の TrueS P Demo Kitを同プロトコールに従って調製したものを使用した。 Reverse primerのヌクレ ォチド配列は GenBank accession No.M17262 ) のヌクレオチド番号 26588— 266 05に相当し、以下のとおりである。
5' -GGGTGAAGGCTGTGACCG-3' (配列表の配列番号 5)
Forward primer として難例 1、 実施例 2、 »例 1、 例 2、 例 3、 例 4、 例 5、 例 6、 例 7及 例 8のいずれかに記載の化合物 (1.25 Μ) 5 μ!、
Reverse primer 1.3^L, Premix Taq(S 3i¾)12.5 u Human DNA溶液 1 μ!、 滅菌水
5.2 illを含む溶液を Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL (TP240)を使って、 PCR反応 (Hot Start法)を行った。 反応サイクルは、 94°C 10分間の処理の後、 94°C 1分、 63°C 1 分、 72°C 1分、の反応を 31サイクル繰り返した。反応後、反]^液 5 に 1 zLの loading solut ionを加え、 10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （lxTBE; 200V定電圧， 約, 1時間） を行い、 SYBR Green I (Cambrexネ ±®)で染色後、 Molecular Imager FX Fluoresent Imager system (Bio- Rad)を用いバンドを可視化し、 Quant i ty One sof tware (Bio-Rad)を使って定 量した。
その結果を図 5に示す。 ENAユニットを 3' 末端から 3番目に導入した化合物を Forwardprimerに用いた齢では、実施例 1に記載の化合物では目的の遺 ί¾ΐ (216 bp) 0増 幅カ雕認できたのに対し、 実施例 2に記載の化合物では目的の遺 (216 bp)の増幅力礫 認できなかつた。一方、天然型のォリゴヌ'クレオチドである誇例 1及! ^例 2に記載の 化合物を Forward primerに用いた場合では、 例 1に記載の化合物だけではなぐ参考例 2に記載の化合物でも遺伝子の増幅カ鳩認されミスマッチによる遺伝子の増幅が起きて いた。また、 ENAユニットを 3' に導入した 例 3及び 4の化合物、 並びに、 EN Aユニットを 3' から 2番目に導入した参考例 5及び 6の化合物では目的のバンドの 増幅は確認できなかつん このことから ENAュニットを 3' から 3番目に導入した化合 物をプライマ一に用いるとミスマッチがほとんどなく選択的な遺^ (216 bp)の増幅がで きることがわかった。
また、 図 6においては、 Premix Taq (宝酒造 $1)のかわりに、 Premix EX Taq (宝酒造勤 を用いた例を示す。この においても、 ENAユニットを 3' から 3番目に導入したプ ライマーにおいてミスマッチがほとんど起こらず、実施例 1のプライマーを用いたものが、 最も効率的に、 かつ、 選択的に遺 ί¾Τが増幅された。
検出されたバンドの蛍光強度を数値化し、 図 7のようにプロットした。 例 9、 10に 記載の化合物は、 LNAュニットを 3， から 3番目に導入した場合であり、 例 1 0の ィ匕合物を Forward primerに用いた場合、 ミスマッチによる遺 β?の増幅が 15%見られたの に対し、 ΕΝΑュニットを 3' 末端から 3番目に導入した、実施例 2の化合物を Forward primer に用いた場合では、 ミスマッチによる遺 の増幅が 6%に過ぎず、 ΕΝΑ体がミスマッチが 少なく選択性カ犒いことが明らかになつた。
(試験例 2 ) アンジォポェチン関連 3 (Angiopoietin-1 ike 3)遺伝子プロモ一夕一内 の多型の検出
( 1 ) マウスゲノム DN Aの調製
マウス AKR strain、 KKマウス Nga strain及び KKマウス Snk strainのマウス （4週齢） より採取した尾 （1. 5cm) を 840 / 1の溶解液（720 1の 1XSSC、 80 1の 10% SDS、 40^ 1の 1 OmgZm 1 プロティナ一ゼ Kを含む） に浸漬し、 50。(：で保温しながら一 した。 次いで、 lmg/m 1 リポヌクレア一ゼ Aを 20 l加えて、 50°Cで 1時間保温した。 その後、 フエノール'クロ口ホルム抽出を 2回、 エタノール請操作を 1回行い、沈殿を 1 OmM トリス一髓（pH7. 5)、 ImM E 0丁八を含む緩衝液150 1に溶解した。溶液を分)^度計（U— 3000、 （株） 日立 製作所製） で 260 nm波長における吸 «を測定し、 滅菌水を加えて濃度を 25ng/ β 1に調整してゲノム DN Aimとした。
(2) PCR
Angiopoietin-like protein 3遺伝子プロモ一夕一内の多型は、 direct sequenceの結果 から、 図 8のような多型を持つ。 図 8ではマウス KK/Nga strain, KR/Snk strainと比べ てマウス AKR strainでは 「：」 で示す 2驢 (CA) が欠失している多型を有すること を示している。
PCRにおける Reverse primerは以下の配列：
5， -GTCACTAGACTACTGCTTACTGTCC-3 ' (配列表の配列番号 6)
(本化合物の塩基配列は、 GenBank accession No.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60658-60682に相補的な配列である） のものを用いた。 Forward primerとして実施例 3、 実施例 4、 例 11、 例 12、 例 13、 例 14、 例 15、 例 16、 例 17 及 例 18のいずれかに記載の化合物 (1·25 M) 5 L、 Reverse primer (1.25 μΜ) 5 UL Premix Taq (宝酒造 ゲノム DNA溶液 (100 ng/1 L) 0.125 滅菌水 2.38 Lの溶液を、 TakaraPCR'Thermal Cycler PERSONAL (TP240)を使って、 PCR反応 (Hot Start法）を行った。反応サイクルは、 94°C 10分間の熱処理後、 94°C分、 63 1分、 72°C 1 分のサイクルを 30サイクル繰り返した。 反応後、 反応液 5 Lに 1 Lの loading solutionを加え、 10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (lxTBE, 200V定電圧， 約 1時間） を行い、 SYBR Green I (Cambrexネ ±¾)で染色後、 Molecular Imager FX Fluoresent Imager sys iem (Bi o-Rad)を用レ可視化した。
(3) 結果
マウス AKRstrain由来のゲノム DNA (AKR)を顯として用いた結果を図 9— Aに示す。
ENAユニットを 3 ' から 3番目に導入した難例 3及び 4に記載の化合物において、実 施例 3の化合物を forward primerに用いたものが、 選択的に遺伝子 (152 bp) を増幅でき ることがわかった。 '
KKマウス Nga strain由来のゲノム DNA(KK/Nga)を βに用いた場合を図 9一 Βに示す。 ΕΝΑュニットを 3 ' 絲から 3番目に導入した難例 3及び 4に記載の化合物において、実 施例 4に記載の化合物を Forward primerに用いたものが、最も効率的に、かつ、選択的に 遺伝子 (154bp)を増幅できることがわかつた。
図 1 0に、実施例 3及び 4に記載の化合物のいずれかを Forward primerとして用い、 AKR のゲノム DNA、 KK/Ngaのゲノム DNA、 KKマウス Snk strain (KK/Snk)のゲノム DN A、並びに、風と KK/Ngaのゲノム DNAを等量づっ混ぜた DNA (Mix) を麵とした P C R の結果を示した。 図 1 O Aに示したように、 AKRでは難例 3に記載の化合物を Forward primerとして用いたもので選択的な遺 の増幅カ雕認され また KK/Nga， KK Snkでは 実施例 4に記載の化合物を Forward primerとして用いたもので ¾的な遺伝子の増幅が ¾ 認された。 Mixでは、 難例 3及び 4に記載のレ れの化合物を Forward pr imerとして用 いた：！^にも遺伝子の増幅カ雕認され、 多型がヘテロである場合でも、 見分けがつくこと が示された。 また、 図 1 0 Bに示したように、 すべてが ^ DNAプライマーである 例 11及び 12に記載の化合物を Forward primerとして用いた場合、目的のバンドの増幅以 外に副生成物が見られ、 ENAュニットを 3' から 3番目に導入した実施例 3及び 4に記 載の化合物の組み合わせの方が遺 多型検出に優れていることがわかつた。
(実施例 5 ) H0—Cp— AP_TP - Gp— Tp-Cp— Γ - Ap-Cp— Tp-Gp-Cp - Tp— Ap— Cp-Tp— Tp— Cp— Ap - Cp - Ap - Τρ- 2ρ-Τρ-^ の合成
核酸自動合謹 （パーキンエルマ一標 ABI model 394 DNA/R A synthes izer) を用い、 40 nmolのプログラムで
HO- CP_AP- Tp- Gp- Tp - Cp - Tp- Ap-Cp - Tp-Gp-Cp- Tp- Ap- Cp-Tp - Tp- Cp - Ap-Cp- Ap-Tp- Ge2p-Tp-Glを合成した (以 下、 「プライマー A」 とする。各合成サイクルにおける溶媒、 $ , ホスホロアミダイトの 藤は天然オリゴヌクレオチド合成の： と同じものを用いた。 CPGは、約 0. 1 ^mol用い た。 非天 «のホスホロアミダイトとしては、 特許第 3420984号の 例 27 (5' - 0-ジメ トキシトリチリ!/" 2' -0, 4' -C-エチレン- 2- N-イソプチリルグアノシン- 3' -0- (2-シァノエ チル N，N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）の化合物を用いた。目的配列を有する保護 されたォリゴヌクレオチド類 体を濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを 本から切り出すとともに、 リン原子上の保護基シァノエチ 基と核^^上の保護基 をはずした。 溶媒を減圧下留去し、 残った残渣を逆相 HP L C (島津製作所製 LC— 10VP、 カラム （Merck, Chromol i th Performance RP-18e (4. 6 X 100mm) ) , A溶液： 5 ァセトニト リル、 0. 1M碰トリェチルアミン水溶液 (TEAA)， pH 7. 0、 B溶液：ァセトニトリル、 B%： 10¾→ 50% (10min, l inear gradient)； 60。C； 2 ml/min； 254 nm) にて精製し、 ジメトキ シトリチル基を有する目的物のピークを集めた。 水を加え、 減圧下留去することで、 TEAA を除いた。 80酉懒水溶液 (200 l) を加え、 20分放置することで、 ジメトキシトリチル 基の脱保護を行った。溶媒を留去したのち避目 HP L C (島津製作所製 LC—10VP、 カラム
(Merck, Chromol i th Performance RP-18e (4. 6X 100画)）、 A溶液： 5¾ァセトニトリル、 0. 1M TEAA, ρΗ 7· 0、 Β溶液： 25%ァセトニトリル， 0. 1Μ ΤΕΜ、 Β¾： 0%→ 40¾ (10min, l inear gradient) ； 60Τ ； 2 ml/min； 25 n ) にて精製し、 目的物のピークを集めた。 減圧下溶媒 を留 菱、 水 lmlに溶かし、 MALDHT0F質 析により同定した （計算値： 7625. 0、 測定 値： 7624. 1)。
本化合物 （プライマー A) の塩基配列は、 GenBank accession No. AL935325. 14記載のヌ クレオチド番号 60499- 60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522の Cが Tであって、 ヌクレオチド番号 60523の Aが Gになっている配列である。
(実施例 6 ) H0_Cp— Ap— Tp-Gp— Tp-Cp— Tp— Ap - Cp— Tp— Gp— Cp—Tp-Ap— Cp - Tp- Tp- Cp— Ap— Cp— Ap-Tp- Ge2p— Τρ—Αι の合成
HO - Cp— Ap— Tp- Gp-Tp— CP_TP—AP- Cp-Tp— Gp - Cp— Tp-Ap— Cp— Tp— Tp- Cp— Ap - Cp-Ap- Tp-Ge2p - Tp— Α'
(以下「プライマ一 Β」 とする。） を、 実施例 5と同様の方法で合成し、 MALDI- TOF質量分 析により同定した （計算値： 7609. 0、 測定値： 7609. 2)。
本化合物 （プライマ一 Β) の驢配列は、 GenBank accession No. AL935325. 14記載のヌ クレオチド番号 60499-60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522の Cが Tになって いる配列である。 '
(実施例 7 ) HO— Cp-Ap— Tp— Gp - Tp—Cp-Tp— Ap-Cp - Tp-Gp— Cp - Tp— Ap— Cp-Tp - Tp— Cp— Ap-Cp— Ap - Tp—Ge2p— Gp—Gl の合成
H0-Cp— AP_TP-GP - Tp-Cp- TP_AP- Cp- Tp- Gp-Cp- Tp— Ap- Cp - Tp— TP_CP— Ap- Cp- Ap- Tp-Ge2p- Gp-Gl
(以下、 「プライマ一 C」 とする。） を、 実施例 1と同様の方法で合成し、 MALDI-T0F質量 分析により同定した （計算値： 7650. 0、 測定値： 7649. 4)。
本化合物 （プライマー C) の塩基配列は、 GenBank access ion No. AL935325. 14記載のヌ クレオチド番号 60499- 60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522の Cが Gであって、 ヌクレオチド番号 60523の Aが Gになっている配列である。 (実施例 8 ) HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-^ の合成
HO- Cp- Ap- Tp- Gp- Tp- Cp- Tp- Ap- Cp- Tp- Gp- Cp-Tp-Ap- Cp-Tp-Tp- Cp- Ap-Cp- Ap-Tp-Ge2p-Gp-Al (以下、 「プ ライマ一 D」 とする。） を、 難例 5と同様の方法により合成し、 MALDI- T0F質量分析によ り同定した （計算値： 7634. 1、 測定値： 7634. 2)。
本化合物 （プライマ— D) の塩基配列は、 GenBank access ion No. AL935325. 14記載のヌ クレオチド番号 60499-60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522の Cが Gになって いる配列である。
( 例 1 9 ) HO- CP-AP—TP_GP— Tp - Cp— Tp— Ap-Cp - Tp-Gp-Cp - Tp—Ap— CP_TP - Tp— Cp - Ap— Cp— Ap - Tp— Gp_Tp_Gt の合成
HO-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Gp-Cp-Tp-Ap-Cp-Tp-Tp-Cp-Ap-Cp-Ap-Tp-Gp-Tp-G'
(以下、 「プライマ一 E」 とする。） を核酸自動合鍾を用いて常法により合成した。 本化 合物 （プライマ一 E) の塩基配列は、 GenBank access ion No. AL935325. 14記載のヌクレオ チド番号 60499-60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522の Cが Tであって、ヌク レオチド番号 60523の Aが Gになつている配列であり、配列表の配列番号 7に示されてい る。
(縛例 2 0 )
H0 - Cp- Ap- Tp- Gp- Tp-Cp-Tp- Ap- Cp- Tp- Gp- Cp- Tp- Ap- Cp- Tp-Tp-Cp-Ap- Cp- Ap- Tp-Gp- Tp- A1の合成
HO- CP- AP- TP- GP - TP-CP-TP- AP-CP-TP-GPTCP- TP- AP-CP-TP- TP- CP- AP-CP- AP- TP- GP- TP- AL (以下、 「プラ イマ一 F」 とする。） を核酸自動合成機を用いて常法により合成した。本化合物（プライマ — F ) の塩基配列は、 GenBank access ion No. AL935325. 14記載のヌクレオチド番号 60499-60523の配列であって、ヌクレオチド番号, 60522の Cが Tになっている酉己列であり、 配列表の配列番号 8に示されている。
(縛例 2 1 ) H0 - Cp—Ap - Tp - Gp— Γ - Cp-Tp— Ap- Cp-Tp - Gp-Cp - Tp— AP_CP- Tp— Tp - Cp— Ap-Cp— Ap - Tp - Gp— Gp— G1 の合成
HO- Cp- AP_TP-GP- Tp- Cp- Tp- AP-CP_TP- Gp-Cp- Tp- Ap-Cp- Tp-Tp- Cp- Ap- Cp- Ap- Tp- Gp- Gp- Gl本（以下、 「プ ライマ一 G」 とする。） は核酸自動合 «を用いて常法により合成した。
プライマ一 Gの: M配列は、 GenBank access ion No. AL935325. 14記載のヌクレオチド番 号 60499- 60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522の Cが Gであって、ヌクレオチ ド番号 60523の Aが Gになっている配列であり、 配列表の配列番号 9に示されている。 (縛例 22)
H0-Cp- Ap- Tp-Gp- Tp- Cp- TP_AP- Cp- Tp-Gp- Cp-Tp- Ap- Cp- Tp- Tp- Cp- Ap- Cp- Ap- Tp- Gp- Gp-A'
の合成
HO - Cp- Ap- Tp- Gp- Tp- Cp-Tp- Ap-Cp- Tp-Gp- Cp- Tp- Ap- Cp- Tp- Tp- Cp- Ap- Cp- Ap- Tp- Gp-Gp- Al本（以下、 「プ ライマー H」 とする。） を核酸自動合雌を用いて常法により合成した。
プライマー Hの ¾S配列は、 GenBankaccessionNo.AL935325.14記載のヌクレオチド番 号 60499-60523の配列であって、ヌクレオチド番号 60522の Cが Gになっている配列であ り、 配列表の配列番号 10に示されている。
(試験例 3) アンジォポェチン関連 3 (Angiopoietin- like3)遺伝子プロモータ一内 の SNPの検出
マウス纖系統 (strain) 及び KKマウス Nga系統 (strain) 由来マウス （4週齢） よ り採取した尾 （1. 5cm) を 840 1の溶鎌 （720 1の 1XSSC、 80 1 の 10% SDS、 40 1の l OmgZml プロティナ一ゼ Kを含む） に浸漬し、 5 0 °Cで保温しながら一 Bj ^盪した。 次いで、 1 mgZm 1 リボヌクレアーゼ Aを 20β 1加えて、 50 °Cで 1時間保温した。 その後、 フエノール'クロ口ホルム抽出を 2回、 ェ タノ一ル¾¾操作を 1回行い、 を 1 OmM 卜リス一： « (pH7. 5)、 ImM E
DTAを含む緩衝液 15 O 1に溶解した。その後、 ^ (u— 3 o o o、 （ネ朱） 日 立製作所製） で 260 nm波長における 度を測定し、 滅菌水を加えて髓を 25ng
/ii 1に調整してゲノム DN A試料とした。
^§1(^016 11-111^3遺伝子プロモ一夕ー内の3^は、 direct sequenceの結果から、 図
11のような SNPを持つ。
リノ一ス'プライマ一 （Reverse primer) のヌクレオチド配列は：
5， -GTCACTAGACTACTGCTTACTGTCC-3， （配列表の配列番号 6 )、
(本化合物の塩基配列は、 GenBank accession NO.AL935325 記載のヌクレオチド番号 60658-60682に相補的な酉己列である。） である。
PremixTaq (宝酒造 SSM2.5 ゲノム DM溶液 (100 ng/1 L) 0.125 fiU リバース' プライマー（1.25 ¾05 滅菌水2.38 βί、フォワード 'プライマ一（forward primer) として実施例または、 例に記載の化合物 （プライマ一 A、 プライマ一 B、 プライマ一
C、 プライマ一 D、 プライマ一 E、 プライマ一 F、 プライマー G及びプライマ一 H) (1.25 M)を 5 Uこなるように調製し、 Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL (TP240)を使つ て、 PCR反応（Hot Start法） を行った。反応サイクルは、 94°C、 10分後、 94°C 1分、 63°C 1分、 72°C 1分、 これを 30サイクル繰り返した。
反応後、 反 液 5 Lに 1 Lの添加液 (loading solut ion) を加え、 10%ポリアクリル アミドゲル電 永動 (lxTBE, 200V定電圧， 約 1 時間） を行い、 SYBR Green I (Cambrex ネ ±SS)で 後、 Molecular Imager FX Fluoresent Imager system (Bio-Rad)を用い可視化 した。
P C R反応が正確に行われた場合、 マウス纖系統 (strain) 由来のゲノム DNA (AKR) を用いた齢、 選択的に遺 (182 bp) が増幅され KKマウス Nga系統 (strain) 由来 のゲノム DNA (KK/Nga) を用いた &、 選択的に遺 β? (184 bp) が増幅されると予想さ れた。
結果を図 1 2に示す。 プライマー E又はプライマー Fをフォヮ一ド ·プライマーとして P C Rを行ったところ、マウス AKR系統由来のゲノム DNAでは、 プライマ一 Eをプライ マ一として用いた に遺 β?の増幅力 崔認された。一方、 KKマウス Nga系統由来のゲノ ム DNAにおいては、 プライマ一 Fをプライマ一として用いた場合及びプライマー Eをプ ライマーとして用いた:！^の両方で遺^の増幅が!^された。
またプライマ一 A又はプライマ一 Bをプライマ一として P CRを行ったところ、 マウス AKR系統由来のゲノム DN Aでは、 プライマ一 Aをプライマ一として用いた場合に遺 β? が増幅され、 ΚΚマウス Nga系統由来のゲノム DNAにおいては、プライマ一 Bをプライマ —として用いた場合に遺伝子の増幅が観察された。
プライマ一 G又はプライマー Hをプライマ一として用いた場合、マウス AKR系統由来の ゲノム D NAでは、 プライマ一 Gをプライマ一として用いた場合に目的の遺伝子産物が増 幅されたが、 プライマ一 Hをプライマ一とした場合には、 目的の大きさより小さい副生成 物と考えられる増幅産物が得られた。また、 KKマウス Nga系統由来のゲノム DNAにおい ては、 プライマ一 Hをプライマ一とした場合には、 目的の遺伝子産物だけでなく、 目的よ りも小さレ鎖長を持つ副生成物と考えられる増幅産物が得られた。
プライマ一 C又はプライマ一 Dをプライマ一として用いた場合、マウス AKR系統由来の ゲノム DNAでは、 プライマ一 Cをプライマーとして用いた に遺 が増幅され、 ざ らに、 KKマウス Nga系統由来のゲノム DNAにおいては、プライマ一 Dをプライマーとし て用いた こ遺 の増幅が謎された。
以上のことから ΕΝΑユニットを 3' から 3番目に導入したプライマ一を用いること により、 ENAユニットを導入していない、 従来のプライマ一と比べて検出効率が向上す ることが n認できた。 産業上の利用可能性
本発明の方法により、遺 多型の検出カ坷能となる。また、本発明の遺 ί5ΐ多型の検出 方法を用いることにより、 天然型のオリゴヌクレオチドを用いる場合に比べより正確に多 型を検出できるようになる。
また、 法に用いること力 ?きる、遺 β?多型の検出用ォリゴヌクレオチド及び該ォリ ゴヌクレオチドを含有する遺 ^多型の検出用キットによって、 種々の遺伝子多型を検出 できる。本発明は、医療、難、食品、工業等の種々の産業に利用することができるが、遺伝 子多型の検出を必要とする限りにおいて産業分野は制限されない。 '

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下の （a) 及び（b) の體を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
( a)オリゴヌクレオチドの 3 ' 末端から 3番目のヌクレオチドが 2' - 0, 4， - C-ェチレ ンヌクレオチド （ENA) ュニットからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチド からなる；
(b) 3， 末 位に対象遺 ί¾ΐの基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、 その他の 部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する。
2. 以下の （a) 及び (b) の mを有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
( a)オリゴヌクレオチドの 3 ' 末端から 3番目のヌクレオチドが 2' -ft 4' - ェチレ ンヌクレオチド (ENA) ユニットからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチド からなる；
( b) 3， 末 |5位に対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、 その他の 部位には対象遺^のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有する。
3. 以下の （a) 乃至 （d) の樹敫を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
( a) オリゴヌクレオチドの 3 ' 末 位が対象遺伝子の ヌクレオチドに相補的な ヌクレオチドからなる；
(b) オリゴヌクレオチドの 3 ' から 2番目 （3 ' 末端のヌクレオチドを 1番目と して 2番目） のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド からなる；
( c ) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する；
(d) オリゴヌクレオチドの 3 ' から 3番目 （3 ' 末端のヌクレオチドを 1番目と して 3番目） のヌクレオチドが 2' -0, 4' -(； -エチレンヌクレオチド （ENA) ユニットか らなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる。
4. 以下の （a) 乃至 （d) の體を有するオリゴヌクレオチド又はその塩：
( a) オリゴヌクレオチドの 3 ' 立が対象遺 の変異ヌクレオチドに相補的な ヌクレオチドからなる；
(b) オリゴヌクレオチドの 3 ' から 2番目 （3 ' 末端のヌクレオチドを 1番目と して 2番目） のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド からなる； (c)その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有する；
(d) オリゴヌクレオチドの 3 ' から 3番目 （3 ' ¾のヌクレオチドを 1番目と して 3番目） のヌクレオチドが 2' - 0, 4， エチレンヌクレオチド （ENA) ユニットか らなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる。
5. 1 8乃至 2 5ΐβ1からなることを »とする、請求項 1乃至 4のいずれか 1項に記 載のオリゴヌクレオチド又はその塩。
6. 請求項 1乃至 5のいずれか 1項に記載のォリゴヌクレオチドを使用することを赚 とする、遺伝子多型の検出方法。 '
7. 請求項 1乃至 5のレ ^ずれか 1項に記載のォリゴヌクレオチドを翻することを赚 とする、遺 ^多型部位のヌクレオチド配列の決^法。
8. 以下の工程 ( a) 及び (b) を含む、遺 β?多型の検出方法：
( a)遺 多型部位を含む核酸を麵として、 請求項 1乃至 5のレずれか 1項に記載 のォリゴヌクレ才チド、 及び該才リゴヌクレ才チドと対になって P C Rで目的配列部分 を増幅できるオリゴヌクレオチドを用いて P C Rを行う工程；
(b) 工程 ( a) によって反応産物が生成するか否かによって、核酸中の遺伝子多型の 有無を判^ る工程。
9. 以下の工程 ( a)及び（b)を含む、遺伝子多型部位のヌクレオチド配列の決 法：
( a ) 遺 多型部位を含む核酸を铸型として、請求項 1乃至 5のいずれか 1項に記載 のォリゴヌクレオチド、 及び該ォリゴヌクレオチドと対になって P C Rで目的配列部分 を増幅できるオリゴヌクレオチドを用いて P C Rを行う工程；
(b)工程 （a) によって反応産物が生成する力、否かによって、 核酸中の遺伝子多型部 位のヌクレオチド配列を決定する工程。
1 0. 反応産物の生成の有無の検出に、 電気泳動、 T a qM a n P C R及び MALDI― TO FZMS法からなる群から選択される少なくともいずれか一つを用いることを特 徴とする請求項 8又は 9に記載の方法。
1 1. 遺 多型が一塩基多型であることを難とする、晴求項 6乃至 1 0のいずれか 1 項に記載の方法。
1 2. 以下の （a) 乃至 (d) を含む、 遺伝子多型検出用キット：
( a)オリゴヌクレオチドの 3 ' «から 3番目のヌクレオチドが 2' -0, ， - ェチレ ンヌクレオチド (ENA) ユニットからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチド からなり、 3 ' ^^立に対象遺 の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、 そ の他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリ ゴヌクレ才チド；
(b) ( a) に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリ ゴヌクレ才チド；
(c ) DNAポリメラ一ゼ；
(d) P C R緩衝液。
3 . 以下の （a) 乃至 (d) を含む、 遺 多型検出用キット：
( a)オリゴヌクレオチドの 3 ' から 3番目のヌクレオチドが 2' -ft ' - C -ェチレ ンヌクレオチド （EM) ユニットからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチド からなり、 3， に対象遺 の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、 そ の他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリ ゴヌクレ才チド；
(b) ( a) に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るブラ イマ一； '
(c ) DNAポリメラーゼ；
(d) P C R緩衝液。
4. 以下の （a) 乃至 （e ) を含む、 遺伝子多型検出用キット：
( a)オリゴヌクレオチドの 3 ' ゝら 3番目のヌクレオチドが 2' -， 4' - ェチレ ンヌクレオチド (ENA) ユニットからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチド からなり、 3， 末端部位に対象遺ィ¾?の基準ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、 そ の他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリ ゴヌクレ才チド；
(b)オリゴヌクレオチドの 3 ' から 3番目のヌクレオチドが 2' -OA' - C-ェチレ ンヌクレオチド (ENA) ユニットからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチド からなり、 3， 末 ¾ ^位に対象遺^の変異ヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、 そ の他の部位には対象遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを有するオリ ゴヌクレオチド；
( c ) ( a) 又は （b) に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅 し得るオリゴヌクレオチド； •(d) DNAポリメラ一ゼ；
(e) PCR緩衝液。 '
15. 以下の （a) 乃至 (d) を含む、 遺 多型検出用キット：
(a) 以下の （i) 乃至 （iv) の を有するオリゴヌクレオチド又はその塩： - (i)オリゴヌクレオチドの 3' ¾^立が対象遺^の基準ヌクレオチドに相補的な ヌクレオチドからなる；
(ii) オリゴヌクレオチドの 3' から 2番目 （3' 末端のヌクレオチドを 1番目 として 2番目） のヌクレオチドが »遺 のヌクレ才チドと相補的でないヌクレオ チドからなる；
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有す る；
(iv) オリゴヌクレオチドの 3' から 3番目 （3' のヌクレオチドを 1番目 として 3番目） のヌクレオチドが 2' -OA' エチレンヌクレオチド （ENA) ュニッ トからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる；
(b) (a) に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリ ゴヌクレオチド；
(c) DNAポリメラーゼ；
(d) PCR緩衝液。
16. 以下の （a) 乃至 （d) を含む、 遺伝子多型検出用キット：
(a) (i) 乃至 （iv) の if ^を有するオリゴヌクレオチド又はその塩；
' (i)オリゴヌクレオチドの 3' ^位が対象遺 β?の変異ヌクレオチドに相補的な ヌクレオチドからなる；
(ii) オリゴヌクレオチドの 3' から 2番目 （3' 末端のヌクレオチドを 1番目 として 2番目） のヌクレオチドが基準遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオ チドからなる；
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレ チドを有す る；
(iv) オリゴヌクレオチドの 3' «から 3番目 （3' 末端のヌクレオチドを 1番目 として 3番目） のヌクレオチドが 2' -OA' エチレンヌクレオチド （ENA) ュニッ トからなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる； (b) (a) に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅し得るオリ ゴヌクレオチド； ·
. (c) DNAポリメラ一ゼ；
(d) PCR緩衝液。
17. 以下の （a) 乃至 (e) を含む、 遺伝子多型検出用キット：
(a) 以下の （i) 乃至 (iv) の特徴を有するオリゴヌクレオチド又はその塩； ωオリゴヌクレオチドの 3' 位が 像遺 の »ヌクレ才チドに相補的な ヌクレオチドからなる；
(ii) オリゴヌクレオチドの 3' から 2番目 （3' のヌクレオチドを 1番目 として 2番目） のヌクレオチドが ¾2遺伝？のヌクレオチドと相補的でないヌクレオ チドからなる；
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有す る；
(iv) オリゴヌクレオチドの 3' から 3番目 （3' のヌクレオチドを 1番目 として 3番目) のヌクレオチドが 2' -OA' エチレンヌクレオチド (ENA) ュニッ 卜からなり、 他のヌクレ才チドは天然型のヌクレオチドからなる；
(b) (i) 乃至 (iv) の S [を有するオリゴヌクレオチド又はその塩；
(i)オリゴヌクレオチドの 3'末 |^立が対象遺伝子の変異ヌクレオチドに相補的な ヌクレオチドからなる；
(ii) オリゴヌクレオチドの 3' から 2番目 （3' «のヌクレオチドを 1番目 として 2番目） のヌクレオチドが »遺伝子のヌクレオチドと相補的でないヌクレオ チドからなる；
(iii) その他の部位には対象遺伝子のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドを有す る；
(iv) オリゴヌクレオチドの 3' から 3番目 （3' 末端のヌクレオチドを 1番目 として 3番目） のヌクレオチドが 2' -OA' - -エチレンヌクレオチド （ENA) ュニッ 卜からなり、 他のヌクレオチドは天然型のヌクレオチドからなる。
(c) (a) 又は （b) に記載のオリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅 し得るオリゴヌクレオチド；
(d) DNAポリメラーゼ； (e ) P CR緩衝液。
1 8. オリゴヌクレオチド及び該オリゴヌクレオチドと対になって目的配列部分を増幅 し得るオリゴヌクレオチドの塩基長が 1 8乃至 2 5塩基長であることを糊敷とする、請 求項 1 2乃至 1 7のいずれか 1項に記載の遺伝子多型検出用キット。
1 9. 遺 多型が一塩基多型であることを 1敷とする、請求項 1 2乃至 1 8のいずれ力、 1項に記載のキット。
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