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WO2005045028A1 - セル・フリー・Ｎｏｔｃｈ切断分析方法及び薬剤スクリーニング方法 - Google Patents

セル・フリー・Ｎｏｔｃｈ切断分析方法及び薬剤スクリーニング方法 Download PDF

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WO2005045028A1
WO2005045028A1 PCT/JP2004/016685 JP2004016685W WO2005045028A1 WO 2005045028 A1 WO2005045028 A1 WO 2005045028A1 JP 2004016685 W JP2004016685 W JP 2004016685W WO 2005045028 A1 WO2005045028 A1 WO 2005045028A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
notch
cell
cleavage
free
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2004/016685
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masayasu Okochi
Masatoshi Takeda
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Osaka Industrial Promotion Organization
Original Assignee
Osaka Industrial Promotion Organization
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka Industrial Promotion Organization filed Critical Osaka Industrial Promotion Organization
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Priority to EP04799583A priority patent/EP1693449A4/en
Publication of WO2005045028A1 publication Critical patent/WO2005045028A1/ja
Priority to US11/417,262 priority patent/US20060275856A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Definitions

  • the present invention relates to a cell-free method for analysis of ⁇ cleavage and a drug screening method which can be used for drug screening of ⁇ -secretase inhibitors and modifiers effective for treatment of Alzheimer's disease and cancer.
  • ⁇ -secretase inhibitors are extremely essential as therapeutic agents for Aluno and Ima disease. That is, it is said that the onset of the pathological process of Aluno-Ima disease is in the process of agglutinating and accumulating amyloid j8 protein (A
  • A amyloid j8 protein
  • a j8 is a peptide of about 40 amino acid residues generated by the stepwise proteolysis of j8-Amyloid Precursor Protein ( ⁇ APP) (FIG. 1).
  • ⁇ APP j8-Amyloid Precursor Protein
  • 42 and A ⁇ 43 are present in small amounts.
  • a ⁇ 42 and ⁇ 43 with 2-3 carboxyl-terminal extensions of A ⁇ 42 and ⁇ ⁇ 43 have been converted to ⁇ ⁇ 40 due to Alunno and ima pathogenic preserin sudden mutants found in familial Alzheimer's disease (FAD).
  • FAD familial Alzheimer's disease
  • ⁇ 42 and ⁇ 43 are considered to cause familial Alzheimer's disease because of their particularly toxic aggregation and accumulation. Importantly, the accumulation of this long length !, ⁇ 42 and ⁇ 43 is evident in all sporadic Alzheimer's disease histopathology. Therefore, an agent that inhibits extracellular secretion of ⁇
  • ⁇ -cleavage The cleavage at the carboxyl terminus that determines the toxicity of A
  • J88 a transmembrane protein, is triggered by the extracellular portion of the protein, Serine ⁇ ⁇ secretase-dependent intramembrane proteolysis occurs, and among the resulting fragments, one AICD (j8 APP intracellular cytoplasmic domain) goes to the cytoplasm and the other A
  • This intra-membrane proteolysis consists of proteolysis at two different locations in the membrane (“dua cleavage j ( ⁇ 40 / ⁇ 49) in the membrane).
  • Notch receptor protein sometimes referred to simply as Notch or Notch protein
  • Nj8 Notch-1 A jS -like peptide
  • Nj8 Notch-1 A jS -like peptide
  • NICD Notch intracellular cytoplasmic domain
  • the cleavage that produces Nj8 and NICD consists of two different proteolytic cleavages (“dua cleavage” at S3 and S4 sites). Furthermore, cleavage of S4 releases the N-terminal fragment ⁇
  • Notch is a type 1 transmembrane protein present on the cell surface, has EGF repeats in the extracellular part, and NICD (Notch intracellular cytoplasmic domain) which is a transcriptional regulator containing ankyrin repeat in the intracellular part.
  • Notch is known to be involved in cell-to-cell communication related to cell division. For example, in the developmental process of the cerebral nervous system, some ectodermal cells are converted into neural progenitor cells (stem stem cells). In this process, intercellular communication via Notch is important. First, Notch is expressed as a receptor on cells that receive Notch signal transmission.
  • Notch transported to the cell surface is cleaved by a protease such as furin at the S1 site in the extracellular region to form a heterodimer, which remains on the cell surface as it is in an SS bond .
  • a protease such as furin at the S1 site in the extracellular region
  • a heterodimer which remains on the cell surface as it is in an SS bond .
  • Notch is cleaved at the S2 site near the cell membrane surface, and this cleavage triggers cleavage at the cell membrane or at S3, which is very close to the cell membrane inside the cell, resulting in a fragment inside the cell.
  • NICD is thought to be released into cells and translocated directly to the nucleus to regulate gene transcription.
  • the cleavage at the S2 site is an extracellular cleavage by TACE (TNFa-Converting Enzyme), and the subsequent cleavage at the S3 site is preserine-secretase-dependent.
  • Notch signal transduction mechanism is extremely important for intercellular signal transduction in cell sorting.
  • Notch signaling such as tumor apoptosis
  • fetal life but also in adulthood. It has been reported that they have been playing various roles since they began to work (for example, Non-Patent Documents 3, 4, and 5). Therefore, analysis of Notch cleavage is an important technique for studying cell differentiation, cell tumorigenesis, apoptosis, and the like.
  • Non-patent document l Inga Pinnix et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL
  • Non-patent Document 2 CHRIS MCLENDON et al., The FASEB Journal, Vol. 14, pp. 2383-2386, 2000
  • Non-patent Document 3 Okochi et al. “Alzheimer's disease and preserine biology”, Molecular Psychiatry Vol.1 No.3 2002
  • Non-patent document 4 Kageyama et al. “Regulation of neural differentiation by Notch” Protein Enzyme Nucleic acid Vol.45 No.3 2000
  • Non-patent document 5 Brian et al, Blood Vol. 96 No. 5 pl906 1913 sep.l 2000
  • Non-patent document 6 Okochi et al., The EMBO Journal Vol. 21 No. 20
  • An object of the present invention is to solve the above conventional problems and achieve the following objects. That is, the present invention provides a cell 'free' Notch cleavage analysis method which can be used for a drug screening of a ⁇ -secretase inhibitor and a modifier effective for treating Alzheimer's disease and the like, and a method for screening the drug. Aim.
  • Preserin Z-secretase is involved in the intramembrane proteolysis of dozens of proteins, including Notch protein, which is not limited to 13 APP alone. ⁇
  • the failure to develop a secretase inhibitor was considered to be a problem with its screening method based solely on its effect on j8 APP. For example, if the inhibitor inhibits all of these proteins, it is likely that side effects due to inhibition of proteins other than ⁇ APP will appear.
  • Presserin knock-out mouse force As indicated by the power to exhibit the SNotch phenotype, the action of Notch among these proteins is extremely important for living organisms, so the process of compound screening is important. Therefore, it was important to understand the detailed effects of the compound on Notch, and based on this idea, we devised a strategy to obtain this.
  • the inventors also conclude that the effect of the same drug on intramembrane dual cleavage differs between substrates (eg, between the Notch protein and the / 3 APP) rather than within the substrate (eg, cleavage of the S3 site in the Notch protein and S4 (Fig. 9A, B and Fig. 10).
  • substrates eg, between the Notch protein and the / 3 APP
  • cleavage of the S3 site in the Notch protein and S4 eg, cleavage of the S3 site in the Notch protein and S4 (Fig. 9A, B and Fig. 10).
  • the effect on the non-carboxyl terminus of Aj8, that is, the effect on the amino terminus of AICD, the carboxyl terminus of Nj8, and the amino terminus of NICD (mainly the effect on the accuracy of cleavage) ) was considered necessary.
  • NSAIDs have the potential for side effects that are not found in ⁇ -secretase inhibitors, and require an Atsey system that recognizes subtle changes at the cleavage site with high sensitivity.
  • ⁇ 1> a cell-free cleavage reaction step of contacting a test substance with a crude membrane fraction of cells expressing a Notch protein mutant
  • the Notch protein mutant has at least a putative transmembrane domain of the Notch protein, has at least a part of the amino acid sequence closer to the amino terminal than the putative transmembrane domain, and has an amino terminal and a carboxyl terminal from the putative transmembrane domain.
  • a cell 'free' Notch cleavage analysis method characterized by having an antibody recognition site on each side.
  • ⁇ 2> The cell 'free' Notch cleavage analysis method according to ⁇ 1>, wherein the effect of the detection step on the amount of in-membrane proteolysis of the analyte substance Notch protein mutant is analyzed.
  • the detection step is a step of detecting the amino-terminal fragment and the carboxyl-terminal fragment using mass spectrometry, and comprises the step of detecting the intramembrane proteolytic site of the SNotch protein mutant
  • the method further comprises a detection step for detecting an amino-terminal fragment and a carboxyl-terminal fragment generated by in-membrane proteolysis of the jS APP protein mutant in the step.
  • a cell 'free' Notch cleavage assay for analyzing the effect of APP protein mutants on intramembrane proteolysis.
  • the j8 APP protein mutant has at least the putative transmembrane domain of the APP protein, and is located at the amino terminal side and the carboxyl terminal side of the putative transmembrane domain, respectively.
  • the cell 'free' Notch cleavage analysis method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> above, which has an antibody recognition site.
  • ⁇ 5> The method for analyzing cleavage of a cell 'free' Notch according to any of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the mutant Notch protein is any one of (1) and (2).
  • polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 FLAG-NEXT
  • the Notch protein mutant is the polypeptide of the above (2), and the polypeptide of the above (2) is capable of mass spectrometry when the polypeptide is cleaved by a cell-free cleavage reaction step. 5.
  • FLAG-NEXT FLAG-NEXT
  • ⁇ 5> and ⁇ 6> which is a polypeptide in which a part of the amino acid sequence at the carboxyl terminal side of the putative transmembrane domain is deleted.
  • amino acid sequence of FLAG-NEXT AC one or several amino acids are deleted, substituted or added, and the amino acid sequence is composed of FLAG-NEXT ⁇ C.
  • a recombinant protein comprising an amino acid sequence that is substantially the same.
  • a recombinant vector comprising a gene encoding the recombinant protein according to ⁇ 9>.
  • a transformant comprising a recombinant vector containing a gene encoding the recombinant protein according to ⁇ 9>.
  • a cell 'free' Notch cleavage analysis method which can solve the conventional problems and can be used for drug screening of a ⁇ secretase inhibitor effective for the treatment of Alzheimer's disease and the like, and The drug screening method can be provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing the stepwise cleavage of Notch protein and
  • FIG. 2A shows that F-NEXT AC undergoes intramembrane protein degradation by preserine / ⁇ -secretase, that is, is cleaved at S4 and S3, and secretes FN
  • FIG. 2B is a diagram showing how F-NEXT was modified to create a Notch protein mutant, F-NE XTAC.
  • the amino acid sequence is a sequence before undergoing cleavage of a peptide secreted into and out of a cell.
  • FIG. 3A shows a procedure for preparing a crude purified membrane fraction (CMF) by homogenizing cells.
  • FIG. 3B shows an experimental procedure for performing cell-free “Notch cleavage” access using crude purified membrane fractionation (CMF).
  • CMF crude purified membrane fractionation
  • FIG. 4A shows the results of a chase label experiment using wild-type PS1.
  • Figure 4B examined how much of the radiolabeled molecule was released as F-N ⁇ during the 2 hour chase after 30 minutes labeling.
  • FIG. C shows the results of a chase label experiment using PS1 D385N, which is known as a dominant 'negative mutation of preserine.
  • FIG. 4D shows the results of an inhibition experiment when L685,458 was pretreated for 2 hours.
  • FIG. 5A-1 is a spectrum of MALDI-TOF MS mass spectrometry of F-Nj8 secreted from F-NEXT expressing cells.
  • FIG. 5A-2 is a spectrum of F-Nj8 secreted from F-NEXT ⁇ C-expressing cells by MALDI-TOF MS mass spectrometry.
  • FIG. 5B lists the molecular weight of each peak and its peptide sequence.
  • FIG. 5C is an illustration showing where cleavage in the amino acid sequence in the membrane of Notch-1 releases F-N
  • FIG. 6A is a diagram comparing the mechanism of stepwise proteolysis of wild-type Notch and F-NEXT ⁇ C.
  • Fig. 6B shows that, from a mutant of Notch-1 protein (NILNG COSS) that undergoes gradual proteolysis of Sl, S2, and S3 in the same manner as wild-type Notch, the untagged! This is the mass spectrometry spectrum of the identified substance.
  • NILNG COSS Notch-1 protein
  • FIG. 6C is a list of amino acid sequences of the
  • Fig. 7 ⁇ shows de novo NTF produced as a result of cell-free and Notch cleavage analysis. It is a mass spectrometry spectrum of FN ⁇ .
  • Fig. 7 ⁇ -1 shows the mass spectrometry spectrum of de novo F-NEXT ⁇ C, which is a CTF for cell-free Notch cleavage analysis.
  • FIG. 7B-2 shows the amino acid sequence of the peak in FIG. 7B-1.
  • FIG. 7C shows the S4 and S3 cleavage sites found in FIGS. 7B-1 and B-2.
  • FIG. 8 shows a multi-substrate cell combining 13APP and Notch-1. Mass spectrometry spectra of four fragments of N ⁇ , ⁇ ⁇ NICD ⁇ C, AICD and S4, The y40, S3, and y49 cleavage sites are indicated.
  • FIG. 9A shows the results of a four-step evaluation on the activities of S4, ⁇ 40, S3, and ⁇ 49 cleavage when the concentration of L685,458 was changed.
  • FIG. 9 ⁇ shows the results of a four-point evaluation on the activities of S4, ⁇ 40, S3, and ⁇ 49 cleavage when DAPT concentration was changed.
  • FIG. 10 is a graph showing the inhibition rates of ⁇ -cleavage for production of ⁇ and ⁇ and AICD and NICD.
  • FIG. 11A is a diagram showing the construction of F-NEXT and its variants, F-NEXT V1744G and F-NEXT VI 744L.
  • FIG. 11B is a diagram showing degradation of F-NEXT and its mutants, F-NEXT V1744G and F-NEXT V1744L, and production of NICD.
  • FIG. 11C is a diagram showing the production of Nj8 by the degradation of F-NEXT and its mutants, F-NEXT V1744G and F-NEXT V1744L.
  • FIG. 12A-1 is a view showing the results of analysis of a fragment produced by cleavage of the S3 site of F-NEXT AC by the IP-MS method.
  • FIG. 12A-2 is a view showing the results of analysis of a fragment produced by cleavage of the S3 site of F-NEXT AC V1744G by the IP-MS method.
  • Fig. 12B is a view showing a fragment produced by cleavage of the S3 site of F-NEXT AC and F-NEXT AC V1744G.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of an NSAID cell 'free' notch cleavage analysis method.
  • the cell-free Notch cleavage analysis method of the present invention comprises a cell-free cleavage reaction step of contacting a crude substance fraction of cells expressing a Notch protein mutant with a test substance; Detecting a fragment at the amino terminal side and a fragment at the carboxyl terminal side generated by in-membrane proteolysis of the Notch protein mutant in the free cleavage reaction step, wherein the test substance is in the membrane of the Notch protein mutant. It analyzes the effect on proteolysis.
  • the Notch protein mutant has at least a putative transmembrane domain of the Notch protein, lacks at least a part of the amino acid sequence closer to the amino terminus than the putative transmembrane domain, and It has an antibody recognition site on each carboxyl terminal side.
  • Notch proteins are widely conserved across biological species and have no limitations on their origin. Humans, mice, rats, penguins, goats, pigs, penguins, Drosophila, nematodes, etc. When used for screening drugs against humans, it is preferable to have an amino acid sequence derived from a vertebrate such as human to mouse, and human or mouse Notchl-4, etc., and typically human Or mouse Notch-1.
  • the putative transmembrane domain refers to a portion where the Notch protein is presumed to penetrate the membrane, and is SEQ ID NO: 3 for human Notch-1 and SEQ ID NO: 4 for mouse Notch-1. This is the array part represented by.
  • This transmembrane domain (TM) contains S3 and S4 cleavage sites, and the production of fragments resulting from cleavage at these sites will be analyzed. That is, “intramembrane proteolysis of Notch protein mutant” refers to two-step cleavage of S3 and S4 in the putative transmembrane domain.
  • the Notch protein mutant can have a tag or a flag for detecting a fragment after cleavage, as long as it does not affect the amount of cleavage and the tendency of the cleavage site.
  • the tags and flags are designed to be recognized by specific antibodies or the like.
  • the mutant Notch protein is a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1.
  • FLAG-NEXT (FIG. 2B, upper panel) and polypeptides whose cleavage position and amount of cleavage by ⁇ -secretase are substantially the same as those of the wild-type Notch receptor or FLAG-NEXT (FIG. 6B).
  • NEXT (Notch Extra cellular Truncation) is the force representing the polypeptide remaining after cleavage at the S2 site, which is an extracellular cleavage site.
  • FLAG-NEXT is modified near the amino end of the NEXT to add a FLAG sequence.
  • FLAG-NEXT also substantially retains the tendency of the cleavage position and the amount of cleavage of wild-type NEXT without the FLAG sequence by ⁇ -secretase (Fig. 5A -1 and Fig. 6 II).
  • the tendency of the cleavage position and the amount of cleavage by ⁇ -secretase is substantially the same as that of the wild-type Notch receptor or FLAG-NEXT, it can be used as the mutant Notch protein of the present invention.
  • the fact that the tendency of the cleavage position and the amount of cleavage by ⁇ -secretase is substantially the same as that of the wild-type Notch receptor or FLAG-NEXT means that the cleavage position of FLAG-NEXT or unflagged NEXT by ⁇ -secretase and This means that the tendency of the cutting amount (Fig. 6 ⁇ ) is substantially maintained. This is to reflect the cleavage of Notch protein in the body.
  • ⁇ substantially the same '' means that the cleavage position, etc., is maintained to such an extent that the effect of Notch protein cleavage in the body, for which the effect of the test substance needs to be considered, can be estimated. No, the cutting amounts do not need to be exactly the same.
  • a polypeptide include a polypeptide in FLAG-NEXT in which a part of the amino acid sequence at the carboxyl terminal side of the putative transmembrane domain has been deleted, such as the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 2 One example is the peptide FLAG-NEXT AC (FIG. 2B, lower panel).
  • FLAG-NEXT AC has an amino acid sequence in which most of the FLAG-NEXT NICD sequence has been deleted six times from the c-myc sequence that is six times in a row, and the cleavage position and cleavage by ⁇ -secretase A polypeptide whose quantity trend is substantially the same as that of FLAG- ⁇ or FLAG sequence-free V, wild-type NEXT.
  • FLAG-NEXT ⁇ C enables accurate analysis of the cutting position of S3 for the first time by shortening the FLAG-NEXT sequence on the NICD side.
  • the nucleotide sequence of FLAG-NEXT ⁇ C is represented by SEQ ID NO: 5.
  • the Notch protein mutant can be obtained by shortening the FLAG-NEXT or the FLAG-NEXT as long as the cleavage position and the tendency of the amount of cleavage by ⁇ -secretase are substantially the same as those of FLAG-NEXT.
  • the peptide may contain a mutation that alters a flag or an antibody recognition site, or further deletes, substitutes, or adds one or several amino acids.
  • Examples of cells expressing the Notch protein mutant include cells into which a gene has been introduced so that the polypeptide is forcibly expressed.
  • There is no particular limitation on the method of introduction and the host cell and known methods can be selected and used.
  • host cells for example, human fetal kidney 293 cells (K293 cells) that stably express preserin and the like can be used.
  • a crude purified membrane fraction (CMF) of the cell can be used, and a known method can be appropriately used as a method for obtaining the crude purified membrane fraction. Specifically, after culturing the transfected cells for a certain period of time or more, disrupting the cells and centrifuging at about 1,000 X g, the supernatant obtained is further centrifuged at about 100,000 X g. Obtained by collecting the precipitation fraction. It is preferable that the buffer contains a protease inhibitor other than aspartyl protease that inhibits proteases.
  • the cell 'free' Notch cleavage analysis is performed by thoroughly washing the crude purified membrane fraction (CMF), suspending it in a buffer, and culturing at 37 ° C for about 40 minutes in the presence of a test substance. ( Figure 3B).
  • the reaction time can be appropriately adjusted. Also, depending on the mechanism of action of the compound, Before extracting the image, a pretreatment step of culturing in the presence of the test substance may be performed. Above
  • the test substance is brought into contact with the crude membrane fraction obtained by the above-described method from a cell tube expressing FLAG-NEXT ⁇ C, and the reaction is performed.
  • the supernatant was centrifuged at 100,000 X g for about 15 minutes, and the Sl-40min fraction (Fig. 3B) was immunoprecipitated with a specific antibody in the intracellular portion. If S3 cleavage had occurred, NICD ⁇ C ( That is, the “fragment on the carboxyl terminal side” is recognized.
  • the molecular weight of this NICD ⁇ C is analyzed with a MALDI-TOF mass spectrometer, the diversity of the S3 cleavage site, which is the amino terminal of NICD ⁇ C, can be analyzed.
  • the diversity of the S3 site could be clarified for the first time by the analysis method of the present invention, which has not been reported so far.
  • the precipitate fraction obtained after collecting the Sl-40min fraction was sonicated for a short time, and the supernatant fraction centrifuged at 100,000 X g for 15 minutes was collected as the S2-40min fraction.
  • N ⁇ that is, the “amino-terminal fragment”
  • the diversity of the S4 cleavage site which is the carboxyl terminal of ⁇ , can be analyzed.
  • F-Nj8 which has a relatively small mass spectrometry peak in the S2-40min fractionation, a fraction cultured overnight at 37 ° C for 12 hours can be collected to examine the diversity pattern in detail.
  • the effect of the test substance on the cleavage amount of y-secretase can be detected by immunostaining or the like, and the present invention includes any of these methods.
  • cleavage by ⁇ -secretase is different from ordinary proteolysis, and involves a major cleavage site that is characteristic of intramembrane proteolysis and a group of minor cleavage sites around it.
  • mass spectrometry it is necessary to use mass spectrometry.
  • mass spectrometry for example, Wang R, Sweeney D, Gandy SE, Sisodia SS.
  • the profile of soluble amyloid beta protein in cultured cell media Detection and quantification of amyloid beta protein and variants by immunoprecipitation— mass spectrometry. J Biol Chem. 1996 Dec
  • the advantages of using mass spectrometry include (1) the ability to accurately determine the stumps of cell-free-produced protein fragments, and (2) the fact that the abundance ratios of fragments with different stumps are simultaneously evident from the mass spectrum. (3) The abundance ratio reflects the direct effect of the drug on “the main cleavage sites characteristic of intramembrane proteolysis and the minor cleavage sites surrounding them”.
  • the cell 'free' Notch cleavage analysis method of the present invention can be used for screening for a preserine ⁇ secretase inhibitor that can control Notch signaling, for various research uses regarding Notch,
  • the present invention relates to a preserine- ⁇ -secretase inhibitor or modulator effective for disease, which can be used for compound screening in consideration of the effect on the amount and accuracy of Notch protein cleavage.
  • the drug screening method of the present invention uses the cell 'free' Notch cleavage analysis method of the present invention to detect and increase the amount of Notch cleavage by a test substance and the change in the Notch cleavage site as an index. It is characterized by selecting an active ingredient. As a result, it has become possible to screen a compound in consideration of the effect on Notch protein, particularly for a preserine-secretase inhibitor that is effective for Alheimer's disease. This makes it possible to screen for! / ⁇ priserin Z ⁇ secretase inhibitors, which have a low possibility of side effects due to the action on Notch proteins.
  • the crude membrane fraction in the cell's free cleavage reaction step is a crude membrane fraction of cells in which the Notch protein mutant and the
  • Free cutting anti A detection step for detecting an amino-terminal fragment and a carboxyl-terminal fragment produced by in-membrane proteolysis of the ⁇ protein mutant in the reaction step, wherein the test substance has a SNotch protein mutant and a It is preferable to use a cell 'free' Notch cleavage analysis method for analyzing the effect of APP protein mutants on intramembrane protein degradation.
  • the ⁇ APP protein mutant has at least the putative transmembrane domain of the / 3APP protein, and has an antibody recognition site on each of the amino-terminal side and the carboxyl-terminal side of the putative transmembrane domain.
  • the antibody recognition site may be tagged by artificially designing the sequence of the protein mutant, or by preparing a specific antibody against the natural sequence. May be.
  • a membrane fraction of cells in which jSAPP is co-expressed with the above Notch protein mutant As a method for performing these simultaneously, it is preferable to use a membrane fraction of cells in which jSAPP is co-expressed with the above Notch protein mutant.
  • a cell expressing ⁇ APP a cell transfected with the Swedish mutant ⁇ APP (sw ⁇ APP) represented by SEQ ID NO: 6 is preferably used.
  • the Swedish mutant j8APP can be obtained by introducing the KM / 594595 / NL mutation (Swedish mutation) into the wild-type gene of a human cDNA library.
  • the Swedish mutation can be introduced by a known two-step PCR method. For obtaining a membrane fraction or detecting a fragment produced by ⁇ -cleavage, the same method as in the case of the Notch protein can be used.
  • ⁇ 8APP is originally shorter at the carboxyl terminus than the putative transmembrane site (SEQ ID NO: 7), and therefore, it is possible to detect the cleavage position by mass spectrometry without making a short modification like Notch protein. it can.
  • the use of a cell-free system does not cause degradation of protein fragments produced by in-membrane proteolysis, and enables accurate analysis. It is also advantageous in that screening can be performed widely even when the Reedy conjugate is toxic. Such toxicities may be eliminated by subsequent optimization and may be useful drugs.
  • the recombinant protein of the present invention comprises FLAG-NEXT ⁇ C and an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of FLAG-NEXT ⁇ C,
  • the position and amount of cleavage by y-secretase are substantially the same as those of FLAG-NEXT ⁇ C. As described above, these are preferably used in the cell 'free' Notch cleavage analysis method of the present invention.
  • the expression gene of the present invention encodes the above-mentioned recombinant protein.
  • a recombinant vector is required. And used to introduce into host cells.
  • the recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains a gene encoding the recombinant protein of the present invention.
  • the transformant of the present invention includes a recombinant vector containing a gene encoding the recombinant protein of the present invention, and if it is one that forcibly expresses the recombinant protein of the present invention, the transformant or host cell may be used in any method.
  • Preferred host cells are those that stably express presenilin, such as human fetal kidney 293 cells (K293 cells). It is. Such a transformant can be used for the cell 'free' Notch cleavage analysis method of the present invention.
  • L685,458 and DAPT which are ⁇ -secretase inhibitors
  • PMA phorbo 12-myristate-13-acetate
  • Human fetal kidney 293 cells (K293 cells) were transformed with 10% fetal calf serum, 1% penicillin Z streptomycin, 500 / z gZml neomycin (neomycin; to select j8 APP expression) 200 ⁇ g Zml zeocin (PS).
  • PS penicillin Z streptomycin
  • 500 / z gZml neomycin 500 / z gZml neomycin (neomycin; to select j8 APP expression) 200 ⁇ g Zml zeocin (PS).
  • PS Zml zeocin
  • ⁇ -terminal fragments (NTF: F_N ⁇ ) are released from cells expressing F-NEXT ⁇ C or F-NEXT as a result of proteolysis by preserin / ⁇ -secretase
  • F-NEXT AC or F-NEXT stably expressing cells ( ⁇ 293) were cultured in a 10 cm dish to a confluent state. The cells were converted to methionine-deficient DMEM (G3 ⁇ 4co Was modified for 45 minutes in a solution and starved for methionine.
  • the culture medium was exchanged using the same methionine-deficient DMEM solution, and at the same time, the pulse label was metabolically metabolized in a culture medium supplemented with 300 Ci [35S] methionine 'cysteine (Pro-mix, Amersham). Performed for 30 minutes. Then, the cells were chased with 10% FCS / DMEM for 2 hours.
  • the sample was subjected to immunoprecipitation using 4G8 antibody or anti-FLAG-M2-agarose (Sigma), and three times with RIPA buffer containing 0.1% SDS, 0.5% deoxycholic acid and 1% TritonX-100. Washed. Thereafter, SDS-PAGE was performed using a Tris-tricine 10-20% gradient gel (Invitrogen). Cells were harvested in ice-cold PBS, separated from the culture by centrifugation at 1500 ⁇ g, and lysed with the RIPA at a 10-fold concentration of 100 1. Then, 9001 PBS containing a protease inhibition mixture (1: 500; Sigma) was added to the lysed cells.
  • the insoluble fraction was separated by centrifugation at 15,000 X g, and the supernatant (RIPA soluble fraction) was used for the immunoprecipitation reaction.
  • Samples for immunoprecipitation were pretreated with protein A sepharose (protein A) and immunoprecipitated with 6336, 9E10, 6618 or M2 agarose.
  • washed protein samples were separated by 8% or Tris-Tricine SDS-PAGE. After the gel was fixed, it was shaken in amplified fluorography reagent (Amplify Fluorographic Reagent, Amersham), then dried and finally subjected to autoradiography.
  • amplified fluorography reagent Amersham
  • Sl, S2, S3 and S4 sites have been identified as stepwise proteolytic sites for Notch-1 protein.
  • Proteolysis at the S1 site followed by heterodimer formation on the membrane surface of the Notch protein may be essential modifications for Notch to function as a receptor.
  • This Notch receptor binds to Notch ligand expressed on nearby cells, it triggers further cleavage at the S2 site (extracellular shedding).
  • the carboxyl terminal fragment after cleavage at S2 is called NEXT (Notch extra cellular truncation).
  • NEXT becomes a substrate for preserine / ⁇ -secretase and undergoes intramembrane proteolysis to release Notch-18 and NICD into and out of the cell, respectively.
  • Functional analysis of NICD has been advanced, and it has been clarified that it translocates directly to the nucleus and functions as a signaling molecule.
  • FIG. 2A Suitable for examining the details of intramembrane proteolysis of Notch proteins F-NEXT ⁇ C was created (FIG. 2A).
  • Figure 2B shows the configuration of FLAG-NEXT (F-NEXT) and FLAG-NEXT ⁇ C (F-NEXT ⁇ C).
  • the animal cell expression plasmid incorporated into pcDNA3 was prepared by the method of Okochi et al. (Okochi'M., Sterner, H., Fuumon.A., Tanu'H., Tomita'T., Tanaka ' T., Iwatsubo'T., Kudo, T., Takeda'M., Haass, C. Presenilins mediate a dual intramembranous gamma- secretase cleavage of Notch-1 EMBO J (2002) 21,
  • F-NEXT AC Compared to F-NEXT, F-NEXT AC has a largely deleted NICD portion that is released into cells and translocated to the nucleus after intramembrane protein degradation.
  • the artificial 6-consecutive c-myc tag added to the carboxyl terminus by F-NEXT has been reduced to only one.
  • FN ⁇ secreted extracellularly by preseurin / ⁇ -secretase is recognized by an anti-FLAG tag antibody (M2 agarose), and NICD AC released into cells is recognized by a 6336 antiserum designed to specifically identify it. This construct is designed to be recognizable.
  • NICD force is also as short as NICD ⁇ C !, which consists of (1) immunoprecipitation of NICD ⁇ C, a preserine / ⁇ -secretase that directly produces NICD by mass spectrometry Force to accurately identify the cleavage site (2) Consideration is also given to preventing NICD from translocating to the nucleus and exerting its function.
  • the polyclonal antibody (6336) is an antibody against the following synthetic polypeptide (SEQ ID NO: 10).
  • SEQ ID NO: 10 The polypeptide serving as an antigen was prepared.
  • the peptide was obtained by chemically cross-linking the amino-terminal Cys residue of the peptide to the KLH protein.
  • the polyclonal antibody (6521) was obtained by chemically cross-linking the carboxyl-terminal Cys residue of the following polypeptide (SEQ ID NO: 11) to KLH protein as an antigen.
  • An anti-C-myc monoclonal antibody (9E10) was used to recognize six consecutive C-myc sequences, and M2-agarose, a reagent obtained by covalently binding an anti-FLAG monoclonal antibody to agarose, was used to recognize the FLAG sequence.
  • 4G8 was purchased from Senetec.
  • ⁇ 293 cells stably expressing F-NEXT ⁇ C or F-NEXT were confluent on a 10-cm dish, pulsed with [35S] methionine for 30 minutes, and chased and labeled for 2 hours (see above). ).
  • the lysate of the F-NEXT ⁇ C-expressing cells after pulse labeling was immunoprecipitated with 6336, separated by 10-20% Tris' tricine SDS-PAGE, and detected by autoradiography (Fig. 4A).
  • the lysate of the F-NEXT expressing cells was treated with the 9E10 antibody and then separated by 8% Tris'glycine SDS-PAGE.
  • the j8 dose released from the F-NEXT ⁇ C and F-NEXT protein bands was measured, and the protein expression level was measured.
  • FIG. 4A it became clear that almost the same amount of F-NEXT ⁇ C and F-NEXT protein was produced in each cell! (FIG. 4A).
  • the secretion of isotope-labeled F-N ⁇ was identified in the cell supernatant that was chased for 2 hours after the pulse, and the amount thereof was measured (Fig. 4, bottom).
  • the substrate cleavage site is strictly defined.
  • minor cleavage sites are present at and around the main cleavage site. It is known to have a cleavage site.
  • pathogenic mutations in patients with familial Alheimer's disease directly affect the disease by affecting the accuracy of cleavage at minor cleavage sites at and around the major cleavage site. It is thought that it becomes.
  • the cells expressing F-NEXT AC and F-NEXT were made confluent in a 20 cm dish, the culture supernatant was replaced, and the cells were collected after culturing for 3 hours.
  • 8 mixture was drawn with a MALDI-TOF mass spectrometer (Fig. 5 ⁇ -1 and ⁇ -2).
  • the pattern of the mass spectrometry spectrum of F-NEXT ⁇ C and F-N ⁇ secreted from F-NEXT expressing cells and the molecular weight of each molecular species were completely identical (Fig. 5 ⁇ -1, 1-2 and ⁇ ).
  • S4 which is an intramembrane proteolytic site of Notch-1 by preserine / ⁇ -secretase, also has a major cleavage site and some minor cleavage site forces around it (Fig. 5C). Then, the accuracy of the S4 cleavage of Notch-1 was changed in the case of F-NEXT AC in which Notch-1 was significantly modified, and it was next examined (FIG. 6A). (Example 3)
  • the S4 cleavage pattern of F-NEXT ⁇ C expressing cells is very similar to that of Notch-1 (in vivo experiment) o
  • Notch-1 binding is essential for Notch-1 cleavage of S2 and subsequent transmembrane proteolysis (S3 / S4). Therefore, an artificial mutant of mouse Notch-1 mNl-LNG CO SS cDNA (Mumm Jb, bchroeter EH, Saxena MT, Gnesemer A, Tian X, Pan
  • Pattern of S4 cleavage site during stepwise proteolysis of mNl-LNG CC> SS having untagged wild-type Notch-1 sequence and F-NEXT ⁇ C directly as a substrate for S4 cleavage We examined whether the pattern of S4 cleavage did not differ.
  • the composition of several types of mixtures, Nj8, generated from the mNl-LNG CC> SS mutant is generated from F-NEXT AC! 7 , We examined whether the composition was the same as that of ⁇ . .
  • the mNl-LNG CC> SS-expressing cells were made confluent in a 20-cm dish, and PMA as a phorbol ester was added to the culture supernatant at a concentration of 100 ng / ml, followed by culturing for 2 hours. Subsequently, the culture supernatant was exchanged and collected after culturing for 6 hours. After immunoprecipitation with 6521
  • the molecular weight spectrum of the N ⁇ mixture was drawn with a MALDHTOF mass spectrometer (Fig. 6 ⁇ ).
  • the pattern of the mass spectrometry spectrum of wild-type Nj8 secreted from mNl-LNG CC> SS-expressing cells is very similar to that of F-N ⁇ secreted from F-NEXT ⁇ C-expressing cells! / (FIG. 6B, C, FIG. 5A-1, A-2 and B).
  • Example 4 It has been known that changes in the accuracy of the ⁇ 40 and ⁇ 49 intramembrane proteolytic sites of the ⁇ APP protein cause the onset of familial Alzheimer's disease! /.
  • membrane fractionation of K293 cells expressing F-NEXT ⁇ C A cell “free” Atsushi system> that reproduces intracellular proteolysis by Notch-1 preserine / ⁇ -secretase was prepared.
  • AICD The CTF released into cells after proteolysis of ⁇ 8 APP protein by ⁇ -secretase is called AICD. It is difficult to identify AICD in cell lysates, compared to F
  • the inventors confirmed expression of F-NEXT AC in the lysate of F-NEXT AC expressing cells, and at the same time, extracellular release of F-N
  • the inventors extracted the membrane fraction of F-NEXT AC-expressing cells, washed well, and then cut the cell “free” Notch. Atsui (cell “free” Notch cleavage) Analysis)) to establish an Atsushi system (methods are shown in Figs. 3A and B, and results are shown in Figs. 7A, B-1, B-2 And c).
  • F-NEXT ⁇ C-expressing cells were cultured in a 20-cm dish, 15 cells, until they became confluent. The following steps were performed exactly at 4 ° C. After washing twice with ice-cold PBS to eliminate the contamination of the cell culture supernatant, the cells were vigorously collected with a cell scraper, and then separated from the PBS by centrifugation at 1,500 ⁇ g and collected.
  • reaction buffer 150 mM citrate buffer (pH 6.4), recommended in the instructions for use !, 4 times the concentration of Roche protease inhibitor, 5 mM l, 10-Phenanthroline (Sigma).
  • the suspension was centrifuged again at 100,000 ⁇ g for 30 minutes, and the precipitate was washed three times, and the sedimented fraction was used as a crude purified membrane fraction (CMF) (FIG. 3A).
  • F-NEXT ⁇ C expression Roughly purified membrane fraction of K293 cells (CMF: Fig. 3A) was converted to a reaction buffer (150 mM citrate buffer (pH6.4), 4 times the concentration recommended in the instruction manual by Roche). Was resuspended in 5 mM 1,10-Phenanthroline (Sigma), and the suspension was cultured at 37 ° C. as a cell-free cleavage reaction step.
  • Figure 3B The supernatant was centrifuged at 100,000 X g for 15 minutes, and the SI-40min fraction ( Figure 3B) was immunoprecipitated with 6336, and NICD AC was recognized.
  • 8 released by presenilin / ⁇ -secretase cleavage during cell survival and FN ⁇ released by cell 'free' Notch cleavage assay have approximately the same composition of several FN ⁇ species. It was a mixture that helped.
  • FIG. 7C shows the diversity of the S3 and S4 cleavage sites identified by the cell-free / Notch cleavage analysis.
  • the properties of the y-secretase inhibitor include "gamma 40 cleavage of j8 APP and The difference between the cleavage of the central part of the membrane, such as Notch S4 cleavage, and the effect on the cleavage of the membrane close to the cell, such as ⁇ 49 cleavage of 13APP and S3 cleavage of Notch, was revealed (Figure 9). A, B and Figure 10).
  • F-NEXT ⁇ C and sw ⁇ ⁇ co-expression ⁇ A crudely purified membrane fraction of 293 cells was used. A Sl-40min fraction was collected from the crude purified membrane fraction. After collecting the Sl-40min fraction, the precipitated fraction was suspended again in the reaction buffer and then sonicated for a short time. Subsequently, the supernatant fraction centrifuged at 100,000 X g for 15 minutes was collected as the S2-40min fraction.
  • the polyclonal antibody (6618) for efficiently recognizing AICD which is a C-terminal fragment after intramembrane proteolysis of / 3 APP by preserin / ⁇ -secretase, comprises the following synthetic polypeptide (sequence: No. 12), which was prepared as follows. First, the polypeptide serving as an antigen was prepared. Furthermore, the amino acid-terminal Cys residue of the peptide was chemically cross-linked to the KLH protein and used as the antigen.
  • the alkaline washing buffer was washed away by repeating the resuspension and centrifugation three times in the reaction buffer. Most of the ⁇ -secretase inhibitors contained in CMF up to this point are considered to have been washed away. Finally, after suspending once again in the reaction buffer, a cell-free reaction was carried out. The amount of AICD / NICD ⁇ C in the Sl-40min fraction and the amount of A ⁇ / N ⁇ in the S2-40min fraction were semi-quantified based on the relative height of the MALDI-TOF MS peak. Evaluation was made in four stages.
  • S4 / ⁇ 40 may be more sensitive to L685,458 than S3 / ⁇ 49 among the two cleavages that make up ⁇ -cleavage.
  • S4 / ⁇ 40 activity was reduced by using a preserine / ⁇ -secretase inhibitor, the S3 / ⁇ 49 activity was not necessarily inhibited. You are not considered when you are.
  • FIG. 10 schematically shows the result.
  • the effect of the inhibitor on the production of A ⁇ and ⁇ ⁇ shows the tendency of the curve 1 and the effect of the inhibitor on the production of AICD and NICD shows the tendency of the curve 2.
  • VI 744G and F-NEXT V1744L were created ( Figure 11A). After confirming protein expression with a 30-minute pulse, chasing was performed for 2 hours, and the degradation of the F-NEXT derivative was examined (Fig. 11B). First, the S3 cutting efficiency was examined. According to the upper column in Figure 11B, F-NEXT V1744G and F-NEXT V1744L degraded and decreased during the 2-hour chase in the same manner as F-NEXT in the background of wild-type preserin. I understand. However, according to the upper column of FIG. 11B, the amount of NICD produced from F-NEXT V1744G and F-NEXT V1744L was much less than that produced from F-NEXT.
  • VI 744G cell extract extracted and purified NICD was mixed with the intracellular solution to examine the stability of the NICD fragment.
  • the NICD of F-NEXT V1744G cells was more unstable than the F-NEXT NICD. Was.
  • V1744G a mutant of Notch's S3 cleavage site, impairs Notch signaling in mice with that mutation.
  • the intracellular NICD amount was reduced although the cleavage efficiency at the S3 or S4 cleavage site was not reduced. This is thought to be because the amino acid at the amino terminal of NICD was changed as a result of the shift of the S3 cleavage site due to this mutation, and the stability of NICD itself was reduced. This result suggested that the change in the accuracy of S3 cleavage reduced the amount of signal transduction.
  • 838 production enhancement effect were observed by cell 'free' attest.
  • the test substance was treated for 24 hours before collecting the progenitor fraction of the cells, and the test substance was added to all culture solutions and buffers until the end of the experiment.
  • an increase in ⁇ 38 production accompanied by a decrease in A ⁇ 42 was observed (FIG. 13).
  • the effect of this drug was not observed at the amino terminal of AICD (Fig. 13). Furthermore, this effect was not observed for Notch! / (Fig. 13).
  • the present invention can be used for the manufacture of a drug, a screening agent of a ⁇ -secretase inhibitor effective for the treatment of Alzheimer's disease and the like, and a composition used therefor.

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Abstract

　本発明は、アルツハイマー病の治療等に有効なγセクレターゼ阻害薬の薬剤スクリーニング等に利用できるセル・フリー・Notch切断分析方法、及び、該薬剤スクリーニング方法を提供するものであり、Notchタンパク質変異体を発現させた細胞の粗膜分画と被検物質とを接触させるセル・フリー切断反応工程と、前記セル・フリー切断反応工程におけるNotchタンパク質変異体の膜内蛋白分解（推定膜貫通ドメインにおける２段階の切断）により生じたアミノ末端側の断片とカルボキシル末端側の断片とを検出する検出工程とを有し、被検物質がNotchタンパク質変異体の膜内蛋白分解に与える影響を分析するセル・フリー・Notch切断分析方法であって、前記Notchタンパク質変異体が、Notchタンパク質の少なくとも推定膜貫通ドメインを有し、少なくとも推定膜貫通ドメインよりもアミノ末端側のアミノ酸配列の一部を欠失し、かつ推定膜貫通ドメインよりアミノ末端側およびカルボキシル末端側のそれぞれに抗体認識部位を有することを特徴とするセル・フリー・Notch切断分析方法である。

Description

明 細 書
セル ·フリー' Notch切断分析方法及び薬剤スクリーニング方法
技術分野
[0001] アルツハイマー病やがん治療等に有効な γセクレターゼ阻害薬及び修飾薬の薬 剤スクリーニング等に利用できるセル ·フリー法による Ί切断の分析及び薬剤スクリー ユング方法に関する。
背景技術
[0002] アルッノ、イマ一病治療薬として γセクレターゼ阻害薬は極めて本質的である。即ち 、アルッノ、イマ一病の病理過程の始まりは生理的に細胞外に分泌されるアミロイド j8 タンパク質 (A |8 )が凝集及び蓄積する過程にあるとされており、この A が不溶ィ匕し集 積及び蓄積する過程にアルッノ、イマ一病の本質があるとする考え方が一般的である
[0003] A j8は、 j8 -アミロイド前駆体タンパク質（j8 - Amyloid Precursor Protein( β APP)) の段階的なタンパク分解により生成される約 40アミノ酸残基のペプチドである（図 1) 。主要な生成物である 40アミノ酸残基の A |8 40に対して、その切断部位の多様性の ため、 A j8 37、 A j8 38、 A j8 39、 A j8 40、 A j8 41、 A j8 42及び A β 43などが少量存在す る。家族性アルッノヽイマ一病（FAD)に見られるアルッノ、イマ一病原性プレセ-リン突 然変異体により、カルボキシル末端が 2— 3残基延長した A β 42や Α β 43が Α β 40に 対して相対的に増えることも知られて 、る (図 1)。これらの Α β 42や Α β 43は特に毒性 が強ぐ凝集、蓄積もしゃすいため家族性アルツハイマー病の原因とされている。重 要なことにこの長さの長!、Α β 42や Α β 43の蓄積は一般の孤発性アルツハイマー病 の病理組織上で例外なく認められるものである。したがって、 Α |8の細胞外分泌を阻 害したり、このペプチドの切断部位に影響を与えたりする薬剤は根本的なアルッノヽィ マー病治療薬になると考えられて 、る。
[0004] A |8の毒性を決定づけるカルボキシル末端側の切断は、 γ切断と呼ばれ、プレセ- リン/ γセクレターゼによるタンパク質分解であることがわ力 ている。膜貫通タンパ ク質である j8 ΑΡΡは、該タンパク質の細胞外部分のシ デイングが引き金となり、プレ セ-リン ζ Ύセクレターゼ依存的な膜内タンパク分解が起こり、その結果生じたフラグ メントのうち、一方の AICD( j8 APP intracellular cytoplasmic domain)が細胞質へ、も う一方の A |8が細胞外へ、それぞれ膜から分離されて放出される。この膜内タンパク 分解は、膜内の異なる 2箇所の蛋白分解 (膜内における「duaト cleavagej ( γ 40/ γ 49))からなる。
[0005] これらのことから、プレセ-リン Ζ Ύセクレターゼ阻害薬による Α β産生阻害を利用 してアルッノヽイマ一病治療薬の開発が進められている。しかし、副作用の報告により 現在頓挫しており、未だ実用化に至っていない。
[0006] Α β産生を阻害するプレセ-リン Ζ Ύセクレターゼ阻害薬のスクリーニングには、 13 ΑΡΡやその変異体を強制発現させた細胞の上清中の Α β量を測定する系が使用さ れてきた。また、最近、 iS APPやその変異体を強制発現させた細胞の膜分画を 37°C で培養することでプレセ-リン Z Ύセクレターゼによる膜内タンパク質分解の結果とし て生じるカルボキシル末端フラグメントである AICDの産生を観察するセル'フリー γ セクレターゼ'アツセィ系が確立された (例えば、非特許文献 1及び 2)。しかし、 Α |8産 生と AICD産生を異なるアツセィ系で測定した場合、薬剤の Α |8産生阻害と AICD産生 との阻害濃度の違いは実際上測定不可能であった。
[0007] ところで、前記 β ΑΡΡの膜内タンパク分解と同一の γセクレターゼ 'メカニズムが、
Notchレセプタータンパク質（単に Notch又は Notchタンパク質と!/、うことがある）の膜内 タンパク分解を起こすことを発明者らは最近明らかにした (例えば非特許文献 6)。す なわち Notchの段階的蛋白分解の過程で γセクレターゼ 'メカニズムによる膜内蛋白 分解が起こり細胞外フラグメントとして N j8 (Notch-1 A jS -like peptide)が産生され、 細胞内フラグメントとしてアンキリンリピートを含む転写調節因子である NICD (Notch intracellular cytoplasmic domain)が産生される（図 1)。そしてこの N j8と NICDを産 生する切断は異なる 2つの蛋白分解 (S3部位と S4部位における「duaト cleavage」)から なる。さらに、 S4の切断により N末端フラグメントである Ν |8が細胞外に放出される。
Notchは、細胞表面に存在するタイプ 1膜貫通型タンパク質であり、細胞外部分に EGFリピートを持ち、細胞内部分にアンキリンリピートを含む転写調節因子である NICD (Notch intracellular cytoplasmic domain) 持つ。 [0008] また、 Notchは、細胞分ィ匕に関する細胞間情報伝達に関与することが知られており 、例えば、脳神経系の発生過程では、外胚葉系の細胞の一部が神経前駆細胞 (幹 細胞）に分ィ匕し、さらに-ユーロン細胞ゃグリア細胞へと分ィ匕するが、この過程におい て、 Notchを介した細胞間情報伝達が重要である。まず、 Notchは、 Notchシグナル伝 達の受け手側細胞のレセプターとして発現される。細胞表面に輸送された Notchは、 フリン等のプロテアーゼで細胞外部分領域の S1部位で切断されてへテロ 2量体にな つているが、これらは S-S結合した状態で、そのまま細胞表面に存在する。次に、細胞 表面に Notchリガンドであるデルタや Jaggedを発現する Notchシグナルの送り手側の 細胞が近接して存在すると、細胞表面で Notchリガンドカ Notchレセプターと相互作用 し、段階的なタンパク質分解が誘導され、シグナル伝達が開始される。即ち、 Notchは 細胞膜表面付近の S2部位で切断され、さらにこの切断が引き金となって細胞膜内あ るいは細胞内側の細胞膜の極めて近傍 S3で切断が起こり、その結果生じる細胞内部 分の断片である NICDは細胞内に放出され、直接核に移行して遺伝子の転写を制御 すると考えられている。前記 S2部位の切断は TACE(TNFa-Converting Enzyme)によ る細胞外切断であり、それに続く S3部位の切断はプレセ-リン Ζ Ύセクレターゼ依存 的である。
[0009] このように、 Notchシグナル伝達機構は細胞分ィ匕における細胞間情報伝達に極め て重要であるが、近年の研究により、細胞の腫瘍ィ匕ゃアポトーシスなど、胎生期のみ ならず、成人になつてからも様々な役割を担っていることが報告されている（例えば非 特許文献 3、 4及び 5)。したがって、 Notch切断の解析は細胞分化、細胞腫瘍化、ァ ポトーシス等の研究のために重要な技術である。
[0010] 前述のように、発明者らは、 S4の切断により N末端フラグメントである N βが細胞外 に放出されていることを報告した。しかし、 NICDの放出と Ν |8の放出を同時に解析で き、かつ、その切断部位を詳細に解析できるような、 Notchに関するプレセ-リン Ζ Ύ セクレターゼ依存的膜内タンパク分解の解析方法にっ ヽては、未だ確立されて 、な かった。
[0011] 非特許文献 l : Inga Pinnix et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL
CHEMISTRY, Vol.276, No.l, pp.481— 487, 2001 非特許文献 2 : CHRIS MCLENDON et al.， The FASEB Journal, Vol.14, pp.2383 - 2386, 2000
非特許文献 3：大河内等「アルツハイマー病とプレセ-リンの生物学」分子精神医学 Vol.1 No.3 2002
非特許文献 4:影山等「Notchによる神経分化制御」タンパク質 酵素 核酸 Vol.45 No.3 2000
非特許文献 5 : Brian et al, Blood Vol.96 No.5 pl906 1913 sep.l 2000 非特許文献 6 : Okochi et al., The EMBO Journal Vol.21 No.20
pp.5408- 5416, 2002
発明の開示
[0012] 本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題と する。即ち、本発明は、アルツハイマー病の治療等に有効な γセクレターゼ阻害薬 及び修飾薬の薬剤スクリ一ユング等に利用できるセル 'フリー' Notch切断分析方法、 及び、該薬剤スクリーニング方法を提供することを目的とする。
[0013] プレセ-リン Z Ύセクレターゼが 13 APPだけではなぐ Notchタンパク質をはじめとす る十数種のタンパク質の膜内タンパク質分解に関わって 、ることから、アルッノヽイマ 一病の治療薬としての Ίセクレターゼ阻害薬開発の頓挫は、 j8 APPに対する作用の みを手がかりとするそのスクリーニング方法の問題であると考えられた。例えば、その 阻害薬がそれらのタンパク質をおしなべて阻害すれば、 β APP以外のタンパク質に 対する阻害による副作用が出現すると考えられる。プレセ-リンのノック'アウトマウス 力 SNotch表現型を呈すること力 も示唆されるように、これらのタンパク質のなかでも Notchの作用は、生体にとって極めて重要なものであるため、コンパウンドのスクリー ユングの過程で、コンパウンドの Notchに関する詳細な作用を把握することは重要で あると 、う考えに基づき、これを得る戦略にっ 、て考案した。
この問題を解決するために A |8産生を阻害するが NICD産生を阻害しない物質を、 iS APP発現細胞から A |8産生をしない物質をスクリーニングし、その物質が NICD産生 を阻害するかどうか生細胞を用いて検査することが検討されている。しかし、このよう に Notchタンパク質と A j8との 2つの基質について、別々のアツセィ系を用いて分析し た場合、種々の要因が影響するため、 γセクレターゼによる膜内蛋白分解への基質 の違いによる被検物質の影響の差を直接比較することは困難である。また、発明者ら は同一薬剤の膜内 dual切断への効果が基質間（例えば、 Notchタンパク質と /3 APPと の間）で異なるよりも基質内（例えば、 Notchタンパク質における S3部位の切断と S4部 位の切断との間）で異なるとの知見を得た（図 9A、 B及び図 10)。この事実は、 dual切 断の一方だけを分析していたり、 dual切断を別々のアツセィ系によって分析している 既存のアツセィ系では γセクレターゼ阻害薬のスクリーニング方法として不十分であ ることを示して ヽる。
さらに、アスピリンやその誘導体に代表されるステロイド以外の抗炎症薬 (NSAID : non-steroidal anti-inflammatory drugs)などの薬剤により A j8産生の正確さを変化さ せ A 42産生を阻害することで治療薬を開発しょうとする試みも行われている。発明 者らはこの NSAIDのような γセクレターゼ修飾薬の、 NICDあるいは AICDのァミノ末端 の正確さへの γ切断の効果がシグナル伝達量に影響を及ぼしている可能性があると の知見を得た（図 11A— C及び図 12A-1—図 12Β)。したがって、 γセクレターゼ修 飾薬については、 A j8のカルボキシル末端以外への効果、すなわち AICDのァミノ末 端、 N j8のカルボキシル末端、 NICDのァミノ末端への効果（主に切断の正確さへの 効果)を検討する必要があると考えた。つまり NSAIDには γセクレターゼ阻害剤にな い副作用の可能性があり、切断部位に微妙な変化を高感度に認識するアツセィ系が 必要である。また、これらのことから、 Notchシグナルの調節を目的とした Notchタンパ ク質をターゲットとする γセクレターゼ阻害薬及び修飾薬等の開発においても、 S3部 位の切断と S4部位の切断について、切断量及び切断の正確さへの効果が問題とな ることが示唆された。
そこで、発明者らは、 Notchに対する作用を正確に解析するために、 F-NEXT A Cを 開発し質量分析解析とウェスタンプロット法を組み合わせることで、 Notch-1の S3/S4 切断を正確に再現するセル'フリー ·アツセィ系を開発した。さらにそれを jS APPのセ ル 'フリ一.アツセィと組み合わせることにより、 β APPタンパク質の γ 40/ γ 49切断と Notch-1の S3/S4切断の 4つの切断同時に再現するセル.フリ一.アツセィ系を開発し た。 即ち、前記課題を解決するための手段は以下の通りである。
< 1 > Notchタンパク質変異体を発現させた細胞の粗膜分画と被検物質とを接触さ せるセル'フリー切断反応工程と、
前記セル'フリー切断反応工程における Notchタンパク質変異体の膜内蛋白分解に より生じたァミノ末端側の断片とカルボキシル末端側の断片とを検出する検出工程と を有し、
被検物質が Notchタンパク質変異体の膜内蛋白分解に与える影響を分析するセル' フリ一 · Notch切断分析方法であつて、
前記 Notchタンパク質変異体力 Notchタンパク質の少なくとも推定膜貫通ドメインを 有し、少なくとも推定膜貫通ドメインよりもァミノ末端側のアミノ酸配列の一部を欠失し 、かつ推定膜貫通ドメインよりァミノ末端側およびカルボキシル末端側のそれぞれに 抗体認識部位を有することを特徴とするセル 'フリー' Notch切断分析方法である。
< 2> 前記検出工程が、被検物質力 Notchタンパク質変異体の膜内蛋白分解の量 に与える影響を分析する前記く 1 >に記載のセル'フリー 'Notch切断分析方法であ る。
< 3 > 前記検出工程が、質量分析法を用いて前記アミノ末端側の断片とカルボキ シル末端側の断片とを検出する工程であり、被検物質力 SNotchタンパク質変異体の 膜内蛋白分解部位の正確さに与える影響を分析する前記 < 1 >に記載のセル'フリ 一 · Notch切断分析方法である。
<4> セル'フリー切断反応工程における粗膜分画力 Notchタンパク質変異体と APPタンパク質変異体とを共発現させた細胞の粗膜分画であり、検出工程におい て、前記セル'フリー切断反応工程における jS APPタンパク質変異体の膜内蛋白分 解により生じたァミノ末端側の断片とカルボキシル末端側の断片とを検出する検出ェ 程をさらに有し、被検物質力 SNotchタンパク質変異体のおよび /3 APPタンパク質変異 体の膜内蛋白分解に与える影響を分析するセル'フリー 'Notch切断分析方法であつ て、
前記 j8 APPタンパク質変異体力 APPタンパク質の少なくとも推定膜貫通ドメインを 有し、推定膜貫通ドメインよりァミノ末端側およびカルボキシル末端側のそれぞれ〖こ 抗体認識部位を有する前記 < 1 >から < 3 >のいずれかに記載のセル 'フリー' Notch切断分析方法である。
< 5 > Notchタンパク質変異体が、（1)及び（2)のいずれかである前記 < 1 >から < 4 >の!、ずれかに記載のセル 'フリ一' Notch切断分析方法である。
(1)配列番号 1で表されるポリペプチド（FLAG-NEXT)
配列番号 1：
Figure imgf000009_0001
Kし ISEEDし し ISEEDし
(2) γ -セクレターゼによる膜内蛋白分解の部位及び膜内分解の量の傾向が配列番 号 1で表されるポリペプチド（FLAG-NEXT)と実質的に同じであるポリペプチド
< 6 > Notchタンパク質変異体が前記（2)のポリペプチドであり、前記（2)に記載の ポリペプチドが、セル'フリー切断反応工程により切断されたときに、質量分析可能な Notchタンパク質変異体である前記く 5 >に記載のセル'フリー 'Notch切断分析方法 である。
< 7> Notchタンパク質変異体力 配列番号 1で表されるポリペプチド（
FLAG-NEXT)にお 、て推定膜貫通ドメインよりもカルボキシル末端側のアミノ酸配列 の一部を欠失させたポリペプチドである前記 < 5 >及びく 6 >の 、ずれかに記載の セル 'フリ一' Notch切断分析方法である。
< 8 > 請求項 1から 7の 、ずれかに記載のセル'フリー 'Notch切断分析方法により 検出される、被検物質による Notch切断量の増減及び Notch切断部位の正確さの変 化を指標として、薬剤の有効成分を選択することを特徴とする薬剤スクリーニング方 法である。
< 9 > 配列番号 2で表されるポリペプチド（FLAG- NEXT Δ C)、及び、
前記 FLAG-NEXT A Cのアミノ酸配列において 1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列カゝらなり、 y -セクレターゼによる切断位置及び 切断量の傾向が FLAG-NEXT Δ Cと実質的に同じであるアミノ酸配列、からなることを 特徴とする組換えタンパク質である。
配列番号 2:
AAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQHGQLWFPEGFKVSEAEQKLISEEDL
く 10 > 前記く 9 >に記載の組換えタンパク質をコードすることを特徴とする発現用 遺伝子である。
く 11 > 前記 < 9 >に記載の組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有することを 特徴とする組換えベクターである。
く 12 > 前記く 9 >に記載の組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換 えベクターを含むことを特徴とする形質転換体である。
[0016] 本発明によると、従来における問題を解決することができ、アルツハイマー病の治 療等に有効な Ίセクレターゼ阻害薬の薬剤スクリーニング等に利用できるセル'フリ 一 'Notch切断分析方法、及び、該薬剤スクリーニング方法を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0017] [図 1]図 1は、 Notchタンパク質と |8 ΑΡΡタンパク質における段階的切断を表す図であ り、細胞外へ放出されるポリペプチドのカルボキシル末端がアルッノヽイマ一病原性プ レセ-リン突然変異体により変化することを説明する図である。
[図 2A]図 2Aは、 F-NEXT A Cがプレセ-リン/ γセクレターゼによる膜内タンパク質分 解を受け、即ち、 S4及び S3で切断され、 F-N |8及び NICD A Cを分泌することを示した 図である。 [図 2B]図 2Bは、 F-NEXTをどのように改変して Notchタンパク質変異体である F-NE XT A Cを作成したかを示した図である。アミノ酸配列は、細胞内外に分泌されるぺプ チドの切断を受ける前の配列である。
[図 3A]図 3Aは、細胞をホモジネートして粗精製膜分画 (CMF)を調製する手順を示 した。
[図 3B]図 3Bは、粗精製膜分画 (CMF)を用いて、セル'フリー 'Notch切断'アツセィを 行う実験手順を示した。
[図 4A]図 4Aは、野生型 PS1を用いたチェイスラベル実験の結果を示す。
[図 4B]図 4Bは 30分間ラベリング後の 2時間チェイスの間に放射線標識をされた分子 のうちどれくらいが F-N βとして放出されたか検討した。
[図 4C]図 Cは、プレセ-リンのドミナント 'ネガティブ変異として知られている PS1 D385Nを用いたチェイスラベル実験の結果を示す。
[図 4D]図 4Dは、 L685,458で 2時間の前処理を加えた場合の阻害実験の結果を表す
[図 5A-1]図 5A— 1は、 F- NEXT発現細胞から分泌される F- N j8の MALDI-TOF MS 質量分析のスペクトラムである。
[図 5A-2]図 5A— 2は、 F- NEXT Δ C発現細胞から分泌される F- N j8の MALDI-TOF MS質量分析のスペクトラムである。
[図 5B]図 5Bは、各ピークの分子量とそのペプチド配列を列挙した。
[図 5C]図 5Cは、 Notch-1の膜内アミノ酸配列の中でどの部分での切断が F-N |8を放 出して 、るか図示したものである。
[図 6A]図 6Aは、野生型 Notchと F-NEXT Δ Cとの段階的タンパク質分解の仕組みを 比較した図である。
[図 6B]図 6Bは、野生型 Notchと同様に Sl、 S2、 S3の段階的タンパク質分解を受ける Notch-1タンパク質の変異体（NILNG COSS)から、タグのな!、野生型の N βを同定 したものの質量分析スペクトラムである。
[図 6C]図 6Cは、図 6Βの Ν |8断片のアミノ酸配列を列挙した図である。
[図 7Α]図 7Αは、セル'フリ一 · Notch切断分析の結果産生された NTFである de novo F-N βの質量分析スペクトラムである。
[図 7Β- 1]図 7Β— 1は、セル 'フリ^ ~ · Notch切断分析の CTFである de novo F- NEXT Δ Cの質量分析スペクトラムを表す。
[図 7B- 2]図 7B— 2は、図 7B— 1のピークのアミノ酸配列を表す。
[図 7C]図 7Cは、図 7B— 1及び B— 2で認められる S4及び S3切断部位を示した。
[図 8]図 8は、 13 APP及び Notch-1を組み合わせた多基質セル.フリ一.アツセィ系で 認められる N β、 Α βヽ NICD Δ C、 AICDの 4フラグメントの質量分析スペクトラムと S4、 y 40、 S3、 y 49切断部位を示した。
[図 9A]図 9Aは、 L685,458の濃度を変化させたときの S4、 γ 40、 S3、 γ 49切断の活性 につ!/ヽて 4段階評価で評価した結果を表す。
[図 9Β]図 9Βは、 DAPTの濃度を変化させたときの S4、 γ 40、 S3、 γ 49切断の活性に つ!、て 4段階評価で評価した結果を表す。
[図 10]図 10は、 Α β及び Ν βと、 AICD及び NICDとの産生に関する γ切断の阻害率 を表す図である。
[図 11A]図 11Aは、 F- NEXTとその変異体である F- NEXT V1744Gおよび F- NEXT VI 744Lの構築を表す図である。
[図 11B]図 11Bは、 F- NEXTとその変異体である F- NEXT V1744Gおよび F- NEXT V1744Lの分解と、 NICDの産生を表す図である。
[図 11C]図 11Cは、 F- NEXTとその変異体である F- NEXT V1744Gおよび F- NEXT V1744Lの分解による、 N j8の産生を表す図である。
[図 12A- 1]図 12A— 1は、 F- NEXT A Cの S3部位の切断により産生される断片の IP-MS法による解析結果を表す図である。
[図 12A- 2]図 12A— 2は、 F- NEXT A C V1744Gの S3部位の切断により産生される断 片の IP-MS法による解析結果を表す図である。
[図 12B]図 12Bは、 F- NEXT A C及び F- NEXT A C V1744Gの S3部位の切断により産 生される断片を表す図である。
[図 13]図 13は、 NSAIDのセル 'フリー' notch切断分析方法による結果を表す図であ る。 発明を実施するための最良の形態
[0018] 本発明のセル.フリ一. Notch切断分析方法は、 Notchタンパク質変異体を発現させ た細胞の粗膜分画と被検物質とを接触させるセル'フリー切断反応工程と、前記セル •フリー切断反応工程における Notchタンパク質変異体の膜内蛋白分解により生じた ァミノ末端側の断片とカルボキシル末端側の断片とを検出する検出工程とを有し、被 検物質が Notchタンパク質変異体の膜内蛋白分解に与える影響を分析するものであ る。
前記 Notchタンパク質変異体は、 Notchタンパク質の少なくとも推定膜貫通ドメインを 有し、少なくとも推定膜貫通ドメインよりもァミノ末端側のアミノ酸配列の一部を欠失し 、かつ推定膜貫通ドメインよりァミノ末端側およびカルボキシル末端側のそれぞれに 抗体認識部位を有する。
[0019] Notchタンパク質は、生物種を超えて広く保存されており、その由来に制限はなぐ ヒト、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ブタ、ゥシ、ショウジヨウバエ、線虫等であってもよい 力 ヒトに対する薬剤のスクリーニングに用いる場合には、ヒトゃマウスなどの脊椎動 物に由来するアミノ酸配列を有することが好ましく、ヒト又はマウスの Notchl— 4などが 挙げられ、代表的にはヒト又はマウスの Notch-1が挙げられる。
[0020] また、推定膜貫通ドメイン (TM)とは、 Notchタンパク質が膜を貫通して 、ると推定さ れる部分をいい、ヒト Notch-1では配列番号 3、マウス Notch-1では配列番号 4で表さ れる配列部分である。この膜貫通ドメイン (TM)は、 S3及び S4切断部位を含み、この 部位における切断により生じる断片の産生が分析されることになる。すなわち、「 Notchタンパク質変異体の膜内蛋白分解」とは、推定膜貫通ドメインにおける S3及び S4の 2段階の切断をいう。
[0021] LHFMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS (配列番号 3)
LHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS (配列番号 4)
[0022] 前記 Notchタンパク質変異体としては、その切断量及び切断部位の傾向に影響を 与えない限り、切断後の断片の検出のためのタグやフラッグ部分を有することができ る。前記タグやフラッグは特異的抗体等により認識されるよう設計される。
[0023] 前記 Notchタンパク質変異体としては、配列番号 1で表されるポリペプチドである FLAG- NEXT (図 2B上段)や、 γ -セクレターゼによる切断位置及び切断量の傾向が 野生型 Notch受容体又は FLAG-NEXTと実質的に同じである（図 6B)ポリペプチドが 挙げられる。ここで、 NEXT (Notch Extra cellular Truncation)は、細胞外切断部位 である S2部位で切断後に残ったポリペプチドを表す力 FLAG- NEXTは、前記 NEXT のァミノ末端付近を改変して、 FLAG配列を付加し、カルボキシル末端に 6回連続す る c-myc配列を付加したポリペプチドであり、細胞外部分の断片は FLAG配列により 検出でき細胞内部分の断片は c-myc配列により検出できるように設計されている。ま た、 FLAG- NEXTは、 FLAG配列の付カ卩されていない野生型の NEXTの γ -セクレタ ーゼによる切断位置及び切断量の傾向を実質的に保持して!/ヽる（図 5 A- 1及び図 6 Β)。
また、 γ -セクレターゼによる切断位置及び切断量の傾向が野生型 Notch受容体又 は FLAG-NEXTと実質的に同じであれば、本発明の Notchタンパク質変異体として用 いることができる。 γ -セクレターゼによる切断位置及び切断量の傾向が野生型 Notch受容体又は FLAG- NEXTと実質的に同じであるとは、 FLAG- NEXT又はフラッ グ化されていない NEXTの γ -セクレターゼによる切断位置及び切断量の傾向（図 6Β )を実質的に保持していることをいう。体内における Notchタンパク質の切断を反映さ せるためである。したがって、「実質的に同じである」とは、被検物質の影響を考慮す る必要のある、体内における Notchタンパク質の切断に関する影響を推定できる程度 に、切断位置等が保持されていることをいい、切断量等が全く一致している必要はな い。このようなポリペプチドとしては、前記 FLAG-NEXTにおいて推定膜貫通ドメイン よりもカルボキシル末端側のアミノ酸配列の一部を欠失させたポリペプチドが挙げら れ、例えば、配列番号 2で表されるポリペプチドである FLAG- NEXT A Cが挙げられる (図 2B下段)。 FLAG- NEXT A Cは、 FLAG- NEXTの NICD配列の大部分と 6回連続す る c-myc配列のうち 5回分を削除したアミノ酸配列を有し、かつ、 γ -セクレターゼによ る切断位置及び切断量の傾向が FLAG- ΝΕΧΤ、又は、 FLAG配列の付加されていな V、野生型の NEXTと実質的に同じであるポリペプチドである。 FLAG-NEXT Δ Cは、 FLAG- NEXTの NICD側の配列を短くすることにより、始めて S3の切断位置の正確な 解析を可能にしたものである。 FLAG-NEXT Δ Cの塩基配列を配列番号 5に表す。
配列番号 5 :
Figure imgf000015_0001
G
[0025] また、前記 Notchタンパク質変異体は、 γ -セクレターゼによる切断位置及び切断量 の傾向が FLAG- NEXTと実質的に同じである限り、その前記 FLAG-NEXTや前記 FLAG-NEXTを短縮したポリペプチドにお 、て、フラッグや抗体認識部位を改変した り、さらに 1個若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加する変異を含んでい てもよい。
[0026] 前記 Notchタンパク質変異体を発現する細胞としては、前記ポリペプチドが強制発 現するように遺伝子導入された細胞が挙げられる。導入方法や宿主細胞には特に制 限はなく公知の方法力も選択して用いることができる。宿主細胞としては例えばプレ セ-リンを安定に発現するヒト胎児腎臓 293細胞 (K293細胞)などを用いることがで きる。
[0027] 粗膜分画としては該細胞の粗精製膜分画 (CMF)を用いることができ、該粗精製膜 分画の取得方法は公知の方法を適宜用いることができる。具体的には、遺伝子導入 された細胞を一定時間以上培養した後、細胞を破砕して 1,000 X g程度で遠心分離し て得られた上清を、さらに 100,000 X g程度で遠心分離した場合の沈查分画を採るこ とにより得られる。バッファーにはァスパルチルプロテアーゼ以外のプロテア一ゼを阻 害するプロテアーゼ阻害剤を入れておくことが好ましい。
[0028] セル'フリー 'Notch切断分析は、前記粗精製膜分画 (CMF)をよく洗浄してバッファ 一中に懸濁し、被検物質存在下において 37°Cで 40分間程度培養して行う（図 3B)。 反応時間は、適宜調節することができる。また、化合物の作用機序によっては、膜分 画を抽出する前に、被検物質存在下で培養する前処理工程を行ってもよい。前記
FLAG-NEXT A Cを基質として用いる場合を例にとって説明すると、被検物質と FLAG-NEXT Δ Cを発現させた細胞カゝら前記の手法により取得した粗膜分画とを接 触させ、該反応物を 100,000 X gで 15分間程度遠心分離した上清である Sl-40min分 画（図 3B)を細胞内部分の特異的抗体で免疫沈降すると S3切断が起こっている場合 には NICD Δ C (即ち、前記「カルボキシル末端側の断片」にあたる）が認識される。こ の NICD Δ Cの分子量を MALDI-TOF型質量分析装置で解析すると、 NICD Δ Cのアミ ノ末端である S3切断部位の多様性が解析できる。この S3部位の多様性は、現在まで 報告がなぐ本発明の解析方法によりはじめて明らかにすることができた。
[0029] また、 Sl-40min分画を採取後の沈查分画を短時間超音波破砕し、さらに 100,000 X gで 15分間遠心分離した上清分画を S2-40min分画として採取し、この S2-40min分画 を細胞外部分に特異的な抗体で免疫沈降すると、 S4切断が起こっている場合には N β (即ち、前記「ァミノ末端側の断片」にあたる）が認識される。これを MALDHTOF型 質量分析装置で解析すると Ν βのカルボキシル末端である S4切断部位の多様性が 解析できる。 S2-40min分画で質量分析ピークの比較的小さい F-N j8については、そ の多様性パターンを詳細に検討するため、さらにオーバーナイト 12時間 37°Cで培養 した分画を採取することもできる。
[0030] yセクレターゼの切断量に対する被検物質の影響は、免疫染色等によって検出す ることができ、本発明はこれらのいずれの方法も含むものである。しかし、 γセクレタ ーゼによる切断は、通常の蛋白分解とは異なり膜内蛋白分解の特徴である主な切断 部位とその周囲のマイナーな切断部位群を伴う。この切断の正確さに対する薬剤の 影響を見るためには、質量分析方法を用いる必要がある。質量分析方法としては、 公知の手法を用いることができる（例えば Wang R, Sweeney D, Gandy SE, Sisodia SS. The profile of soluble amyloid beta protein in cultured cell media. Detection and quantification of amyloid beta protein and variants by immunoprecipitation— mass spectrometry. J Biol Chem. 1996 Dec
13;271(50):31894-902.) oただし、正確な質量分析を可能にするためには、産生され るフラグメントの長さを短くする必要があり、 FLAG- NEXT A Cのような、 γ -セクレター ゼによる切断位置及び切断量の傾向が野生型の Notch及び FLAG- NEXTと実質的 に同じであり、かつ、産生されるフラグメントの長さを精度よく質量分析できる程度の 長さに短くデザインした変異体を用いることが好ま 、。
質量分析を用いる利点は、（1)セル'フリー産生された蛋白フラグメントの断端を正 確に決定できること、 (2)同時に質量分析スペクトラムから断端の異なるフラグメントの 存在比率が一目瞭然となること、（3)その存在比率は「膜内蛋白分解の特徴である 主な切断部位とその周囲のマイナーな切断部位群」に対する薬剤の直接的効果を 反映しているころである。
本発明のセル'フリー 'Notch切断分析方法は、 Notchシグナリングを制御し得るプリ セ-リン Ζ γセクレターゼ阻害剤のスクリーニングや、 Notchに関する各種研究的利 用に用いることができる他、アルッノヽイマ一病に有効なプリセ-リン Ζ Ύセクレターゼ 阻害剤や修飾剤に関し、 Notchタンパク質の切断の量や正確さへの影響を考慮した コンパウンドのスクリーニング等に利用することができる。
[0031] 本発明の薬剤スクリーニング方法は、前記本発明のセル'フリー 'Notch切断分析方 法により検出される、被検物質による Notch切断量の増減及び Notch切断部位の変化 を指標として、薬剤の有効成分を選択することを特徴とする。これにより、特にアルッ ハイマー病に有効なプリセ-リン Ζ Ύセクレターゼ阻害剤に関し、 Notchタンパク質へ の影響を考慮したコンパゥンドのスクリーニングが可能となった。これにより、 Notchタ ンパク質への作用による副作用の可能性の少な!/ヽプリセ-リン Z Ύセクレターゼ阻害 剤のスクリーニングが可能となる。
[0032] アルツハイマー病に有効なプリセ-リン Z Ύセクレターゼ阻害剤のスクリーニングに 関しては、前記セル'フリー 'Notch切断分析方法と共に、 jS APP切断分析を実施する ことが好ましい。プリセ-リン/ γセクレターゼ阻害剤の両タンパク質に対する作用を 正確に比較分析することが上記のように γセクレターゼ阻害薬の開発のためには必 須であり、本発明のセル 'フリ一' Notch切断分析方法と同一の系において、セル'フリ 一' jS APP切断分析を同時に実施することが好ましい。即ち、前記セル'フリー切断反 応工程における粗膜分画が、 Notchタンパク質変異体と |8 ΑΡΡタンパク質変異体とを 共発現させた細胞の粗膜分画であり、検出工程において、前記セル'フリー切断反 応工程における β ΑΡΡタンパク質変異体の膜内蛋白分解により生じたァミノ末端側 の断片とカルボキシル末端側の断片とを検出する検出工程をさらに有し、被検物質 力 SNotchタンパク質変異体のおよび /3 APPタンパク質変異体の膜内蛋白分解に与え る影響を分析するセル'フリー 'Notch切断分析方法であることが好ましい。前記 β APPタンパク質変異体は、 /3 APPタンパク質の少なくとも推定膜貫通ドメインを有し、 推定膜貫通ドメインよりァミノ末端側およびカルボキシル末端側のそれぞれに抗体認 識部位を有する。なお、 Notchタンパク質変異体の場合と同様に、抗体認識部位は、 タンパク質変異体の配列を人工的にデザインしてタグ化して 、てもよ 、し、天然の配 列に対する特異的抗体を作成してもよい。
これらを同時に行う方法としては、 jS APPを前記 Notchタンパク質変異体と共発現し て 、る細胞の膜分画を用いることが好まし 、。 β APPを発現する細胞としては、配列 番号 6で表されるスウェーデン型突然変異体 β APP (sw β APP)を遺伝子導入した細 胞が好適に用いられる。
配列番号 6 :
Figure imgf000018_0001
IHHGWEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQN 前記スウェーデン型突然変異体 j8 APPは、ヒトの cDNAライブラリ一力 クローユング した野生型遺伝子に、 KM/594595/NL変異 (スウェーデン変異）を導入することにより 、得ることができる。スウェーデン変異は、公知の 2ステップ PCR法により導入できる。 また、膜分画の取得や、 γ切断により産生される断片の検出には、前記 Notchタンパ ク質の場合と同様の手法を用いることができる。なお、 ι8 APPは、推定膜貫通部位（ 配列番号 7)よりカルボキシル末端側の配列はもともと短 、ため、 Notchタンパク質の ように短く改変しなくても、質量分析により切断の位置を検出することができる。
配列番号 7 :
GAIIGLMVGGWIATVIVITLVML
本発明の分析方法は、セル'フリー系を用いることにより、膜内蛋白分解により産生 された蛋白フラグメントの分解が起こらず、正確な解析が可能である。また、リードィ匕 合物に毒性がある場合でも広くスクリーニングが可能である点でも有利である。このよ うな毒性は後の最適化により除去できる場合もあり、有用な薬剤となる場合もあるから である。
[0034] 本発明の組換えタンパク質は、 FLAG- NEXT Δ C、及び、 FLAG- NEXT Δ Cのァミノ 酸配列において 1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸 配列からなり、 y -セクレターゼによる切断位置及び切断量力 FLAG-NEXT Δ Cと実 質的に同じであるアミノ酸配列、力もなることを特徴とする。これらは、前述の通り、本 発明のセル'フリー 'Notch切断分析方法において好ましく用いられる。
[0035] 本発明の発現用遺伝子は、前記組換えタンパク質をコードすることを特徴とするが 、本発明のセル'フリー 'Notch切断分析方法に用いる膜分画を製造するために、組 換えベクターに導入し、宿主細胞に導入するために用いられる。
[0036] 本発明の組換えベクターは、本発明の組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有 するものであれば特に制限はな 、。
本発明の形質転換体は、本発明の組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有す る組換えベクターを含み、本発明の組換えタンパク質を強制発現するものであれば、 導入方法や宿主細胞には特に制限はない。宿主細胞としては、プレセ二リンを安定 に発現するものが好ましぐ例えばヒト胎児腎臓 293細胞 (K293細胞)などが挙げら れる。このような、形質転換体は、本発明の前記セル'フリー ' Notch切断分析方法に 用!/、ることができる。
実施例
[0037] 以下、本発明の実施例について説明する力 本発明はこの実施例に何ら限定され るものではない。なお、実施例における試薬、材料及び実験手法は、以下のとおりで める。
[0038] (試薬）
γ -セクレターゼ（ γ -Secretase)阻害剤である、 L685,458及び DAPT、そしてフオル ボールエステルである PMA (phorbo卜 12— myristate— 13— acetate)は、 Calbiochem社力 ら 人した。
[0039] (培養細胞及び細胞株）
ヒト胎児腎臓 293細胞 (K293細胞）を、 10%ゥシ胎仔血清、 1 %ペニシリン Zストレ プトマイシン、 500 /z gZmlネオマイシン（neomycin ; j8 APP発現を選択するため） 20 0 μ gZmlゼォシン（zeocin； PS 1発現を選択するため）及び 100 μ gZmレヽィグロマ イシン（hygromycin； F-NEXT Δ C及び F-NEXT発現を選択するため）を添カ卩した DM EM培地にて培養した。
細胞への 13 APP、 F-NEXT Δ C、 mNlLNG CC〉SS及び F- NEXT導入は、商品名 Lipofectamine 2000 (Invitrogen社)を用いて行った。約 20日の抗生物質によるセレ クシヨンの後、安定的に導入タンパク質を発現する細胞株を単離培養しシングル ·セ ル ·クローンとして使用するか、又は数十のシングル ·セル ·クローンを混ぜたプール · セル ·クローンを実験に使用した。 psi wt又は PS1 D385Nを安定的に発現する K29 3細胞は大河内ら及びシュタイナーらの方法により作成した（Okochi et al, 2000, Steiner et al, 1999)。
[0040] (パルス-チェイス実験）
F-NEXT Δ C又は F- NEXTを発現する細胞から、プレセ-リン/ γセクレターゼによ るタンパク質分解の結果、 Ν末端フラグメント (NTF : F_N β )が放出されるかを判断す るために、 F-NEXT A C又は F-NEXT安定発現細胞（Κ293)を、 10cmディッシュ中 で、コンフルェントな状態まで培養した。その細胞をメチォニン欠乏 DMEM(G¾co社 の市販品を改変)溶液中で 45分間培養しメチォニン飢餓状態にした。引き続いて同 じメチォニン欠乏 DMEM溶液を用いて培養液を交換し、同時に 300 Ci [35S]メチォ ニン 'システィン（Pro-mix, Amersham社）をカ卩えた培養液中で、代謝的にパルスラベ ルを 30分間行った。その後、 10%FCS/DMEMで 2時間チェイスした。
[0041] (パルスチヱイス実験における免疫沈降/ SDS- PAGE)
チェイス期間の終了後、培地を集めて直ちに氷上においた。ついで、 3,000 X gで 遠心分離を行い、細胞残屑を排除した。次に、プロテアーゼ阻害剤カクテル (1:1000;
Sigma社)及び 0.025%のアジ化ナトリウムをカ卩えた。その試料を、 4G8抗体、あるいは 抗 FLAG- M2-ァガロース (Sigma社)を用いてー晚免疫沈降を行 、、 0.1%SDS、 0.5%deoxycholic acid及び 1% TritonX-100を含む RIPAバッファーで三回洗浄した。 そのあとトリス-トリシン 10— 20%勾配ゲル (Invitrogen社)を使用して SDS-PAGEを行つ た。細胞は、氷冷 PBS中で力き集め、 1500 X gの遠心分離によって培養液と分離 '収 集し、 100 1の 10倍濃度の前記 RIPAで溶解した。そして、プロテアーゼ阻害混合液 (1:500; Sigma社)を含む 900 1の PBSを、前記溶解した細胞に加えた。
[0042] 不溶画分は、 15,000 X gの遠心分離で分離し、その上清 (RIPA可溶分画)を免疫沈 降反応に使用した。免疫沈降用の試料は、プロテイン Aセファロース (protein A sepharose; Sigma社)で前処理し、 6336、 9E10、 6618又は M2ァガロースで免疫沈降し た。
次に、洗浄したタンパク質試料を、 8%若しくはトリス-トリシン SDS- PAGEにて分離し た。ゲルを固定した後、増幅蛍光写真撮影法試薬 (Amplify Fluorographic Reagent 、 Amersham社）中で振とうし、ついで乾燥し、最後にオートラジオグラフィーを行った
[0043] (免疫沈降/ MALDI-TOF MS解析）
培養上清の場合、 F-NEXT及びその派生物を安定に発現する細胞をコンフルェン トな状態まで 20cmディッシュで培養した後、培養培地を新しい 10% FCS/DMEMと取 り替えた。 COインキュベータ一中で 3時間培養した後、培養上清を集めてすぐに氷
2
上におき、続いて遠心分離で細胞残屑を除去した。 50mMトリス。ノ ッファー (pH7.6) 、 5mM EDTA、プロテアーゼ阻害混合液 (Sigma社； 1:1000)及び 0.025%アジ化ナトリ ゥムを添カ卩した後、その培地を、 4G8あるいは M2ァガロースを使用して、 4時間、 4°C で免疫沈降した。
[0044] セル'フリ一' γセクレターゼ 'アツセィの場合、アツセィ後の超遠心上清である S1又 は S2分画に 4倍量以上の 0.1% n-octylglucoside, 140mM NaCl、 10mM Tris (pH8.0)及び 0.025%アジ化ナトリウム力 成る MS洗浄バッファーを添カ卩した。その混 合物を 6636、 6618、 4G8あるいは M2ァガロースを使用して、 4時間、 4°Cで免疫沈降 した。免疫沈降後は MS洗浄バッファーを使用し、 10分間、 4°Cで 3回洗浄した。そし て、さらに一回、 0.025%アジ化ナトリウムを含む 10mM Tris(pH8.0)で洗浄した後、さら にもう一回水で簡単に洗浄した。その結果得られた沈殿物中の特異抗体に結合した ペプチドを、 α - cyano- 4hydroxy cinnamic acidで飽和した TFA/ァセトニトリル/水 (TFA:ァセトニトリル:水 =1:20:20)で溶出した。可溶化した試料を、ステンレスプレート 上で乾燥させ MALDI-TOF MS解析した。 MSピークは、アンギオテンシン（Sigma社） 及びインシュリン β鎖 (Sigma社)で較正した。
[0045] (実施例 1)
Notch-1タンパク質の段階的タンパク質分解部位として Sl、 S2、 S3及び S4部位が同 定されている。 S1部位でのタンパク質分解とそれに引き続く Notchタンパク質の膜表 面上でのヘテロ 2量体形成は Notchが受容体として機能するのに必須の修飾であると 考えられる。この Notch受容体は近接する細胞に発現された Notchリガンドと結合する とそれが契機となり S2部位でさらに切断を受ける（細胞外シェデイング)。 S2で切断を 受けた後のカルボキシル末端フラグメントを NEXT (Notch extra cellular truncation )と呼ぶ。 NEXTはプレセ-リン/ γセクレターゼの基質となり膜内タンパク質分解を受 け Notch- 18と NICDを各々細胞外と細胞内に放出する。 NICDについては機能解析 が進んでおり直接核に移行してシグナル伝達分子として機能することが明らかになつ ている。
[0046] 発明者らは Notchタンパク質のプレセ-リン/ γセクレターゼによる分解をより直接的
、高感度且つ正確に観察するために NEXTの変異類縁体を工夫作製した。
[0047] F- NEXT A Cの開発
Notchタンパク質の膜内タンパク質分解の詳細について検討するのに適した F- NEXT Δ Cを作成した（図2A)。図 2Bに FLAG- NEXT (F- NEXT)及び FLAG-NEXT Δ C (F- NEXT Δ C)の構成を示す。
[0048] (プラスミド）
まず、 N末端に FLAG配列を付カ卩した NEXT (C末端にさらに 6回連続する c-myc配 列を付力卩してある）、即ち FLAG- NEXT(F- NEXT)をコードする cDNAを
pcDNA3(Hygro)に組み込んだ動物細胞発現プラスミドは大河内らの方法により調整 し 7こ (Okochi'M., Sterner, H., Fu umon.A., Tanu'H., Tomita'T., Tanaka'T., Iwatsubo'T., Kudo,T., Takeda'M., Haass, C. Presenilins mediate a dual intramembranous gamma- secretase cleavage of Notch- 1 EMBO J (2002) 21,
5408-5416.) o
[0049] F-NEXT力 細胞内部分のアミノ酸配列を大幅に取り除!/、た F-NEXT Δ C発現プラ スミドは部位特的突然変異誘発キット（ExSite PCR- Based Site-Directed
Mutagenesis Kit, Stratagene社）を用いて F- NEXTを铸型として製造した。その際、 下記の 2つのプライマー 1、 2 (配列番号 8、 9)を調製した。
[0050] プライマー 1 :
5— p— gag— caa— aag— etc— att— tct— gaa— gag— gac— ttg— tag— tec— tgc— age— ccg— ggg— gat— cca -c-3' (55 mers) (配列番号 8)
プライマー 2 :
5し p- ggc- etc- tga- cac- ttt- gaa- acc- etc- agg- gaa- cca- gag- ctg- gcc- 3, (42 mers) ( 配列番号 9)
[0051] これらの変異体について、塩基配列を決定 (シーケンス)し、突然変異誘発が成功 したことを確かめた。
[0052] F-NEXTと比較すると F-NEXT A Cは膜内タンパク質分解後に細胞内に放出され核 移行する NICD部分が大きく削除されている。さらに F-NEXTでカルボキシル末端に 付加された人工的な 6回連続する c-mycタグも 1回のみに減少させてある。プレセユリ ン / γセクレターゼで細胞外分泌された F-N βは抗 FLAGタグ抗体 (M2ァガロース）で 認識し、細胞内に放出された NICD A Cはそれを特異的に同定するように設計された 6336抗血清で認識できるようにこのコンストラクトは設計されて ヽる。カルボキシル末 端フラグメントが NICD力も NICD Δ Cと短くなるように設計されて!、るのは、 (1) NICD Δ Cを免疫沈降、質量分析システムに適用し NICDを直接産生するプレセ-リン/ γセ クレターゼ切断部位を正確に同定するためである力 （2) NICDが核移行して機能を 発揮することを防ぐことも考慮して 、る。
[0053] (抗体）
細胞に発現させた F-NEXT Δ Cの細胞内部分は抗 c-myc抗体で認識され難カゝつた ため、これを効率よく認識及び同定するためにゥサギ抗血清を作成した。ポリクロー ナル抗体 (6336)は、下記の合成ポリペプチド (配列番号 10)に対する抗体である。ま ず、抗原となる前記ポリペプチドを準備した。さらにそのペプチドのァミノ末端の Cys 残基を KLHタンパク質に化学的に架橋結合させたものを抗原とした。
[0054] また、マウス N βを特異的に認識する抗血清を作成した。ポリクローナル抗体 (6521 )は下記のポリペプチド（配列番号 11)のカルボキシル末端の Cys残基を KLHタンパ ク質に化学的に架橋結合させたものを抗原として得られたものである。
6回連続する C- myc配列の認識には抗 C- mycモノクローナル抗体（9E10)を、また FLAG配列の認識には抗 FLAGモノクローナル抗体をァガロースに共有結合させた 試薬である M2-ァガロースを使用した。 4G8は Senetecから購入した。
[0055] 配列番号 10 :
NH2-CEGFKVSEAEQKLISEEDL-COOH
配列番号 11 :
NH2-VKSEPVEPPLPSC-COOH 膜分画の調整
[0056] F-NEXT Δ Cで起こって!/、るプレセ-リン/ γセクレターゼによる膜内タンパク質分解 は F-NEXTで起こるそれと同一のものであるかどうか詳細に検討した。
まず、実施例 2、 3では細胞外に分泌されるァミノ末端フラグメント (NTF)のカルボキ シル末端の切断の性質と部位の差異について検討した。
[0057] (実施例 2)
F-NEXT Δ C発現細胞から分泌される F-N βの種類と量は F-NEXT発現細胞からの それと異ならな 、ことを実証した (in vivo実験)。
F-NEXT Δ C又は F-NEXTを安定的に発現する Κ293細胞を 10cmディッシュ上でコ ンフルェントな状態にし、 [35S]メチォニンで 30分間のパルスそして 2時間のチエース •ラベリング実験を行った (前述)。パルスラベル後の F-NEXT Δ C発現細胞のライセ ートを 6336で免疫沈降したあと 10— 20%トリス'トリシン SDS-PAGEにて分離しオートラ ジオグラフィー法で検出した（図 4A)。
[0058] 同様に F-NEXT発現細胞のライセートは 9E10抗体で処理したあと 8%トリス'グリシン SDS-PAGEにて分離した。 F-NEXT Δ C及び F-NEXTタンパク質のバンドから放出さ れる j8線量を測定しタンパク質発現量を測定した。図 4Aに示したとおりほぼ同じ量 の F-NEXT Δ C及び F-NEXTタンパク質がそれぞれの細胞で産生されて!、ることが明 らかになつた（図 4A上)。同時に、パルス後 2時間チェイスを行った細胞上清につい てアイソトープ標識された F-N βの分泌を同定しその量を測定した（図 4Α下)。
F-NEXT Δ C及び F-NEXTタンパク質発現量に比した F-N βの分泌量を測定しプロッ トしたところ F-NEXT Δ C及び F-NEXT発現細胞からの F-N β分泌効率には違 、がな かった（図 4Β)。
[0059] さらに我々の観察しているタンパク質分解がプレセ-リン依存的タンパク質分解で あるかどう力、プレセ-リンのドミナント 'ネガティブ変異として知られている PS1 D385Nを用いて検討した。 PS1 D385N発現細胞にさらに F- NEXT Δ C又はF-NEXT を発現させて同様の実験を行ったところ、ノ ルスラベル後の細胞ライセート中にアイソ トープ標識された F-NEXT Δ C又は F-NEXTが存在するにもかかわらず（図 4C上）、 チェイス後の上清に F-N j8の分泌は認められなかった（図 4C下）。このことは D385N 突然変異により、 F-NEXT Δ C及び F-NEXTの膜内タンパク質分解が阻害されたこと を示唆している。
[0060] さらに、 γセクレターゼによる β ΑΡΡの膜内タンパク質分解とその結果生じる Α βの 細胞外分泌を特異的に阻害する L685,458を F-NEXT Δ C及び F-NEXT発現細胞に 添加し、 F-N βの分泌が阻害されるかどうか検討した（図 4D)。
F-NEXT Δ C及び F- NEXT発現細胞からの F-N βの分泌は 1 μ Μの L685,458でほ ぼ完全に阻害された（図 4D下)。この結果は、 Α |8と F-N |8産生が共通するメカ-ズ ム（ γセクレターゼ）を介して起こって 、る可能性を示唆して 、る。
[0061] ここまでの結果を総合すると（1) F-NEXT Δ Cと F-NEXTから分泌される F-N β量か ら見て F-NEXT Δ Cと F-NEXTの膜内タンパク質分解効率に違いはな!/、、 (2)この膜 内タンパク質分解は 13 ΑΡΡから Α を産生させるプレセ-リン/ γセクレターゼ活性に よる、ことが分子レベルで明らかになった。
[0062] 一般的なタンパク質分解酵素の場合基質切断部位が厳密に定められているが、プ レセ-リン/ γセクレターゼ活性による膜内タンパク質分解の特徴として、主要な切断 部位とその周辺にマイナーな切断部位を持つことが知られている。実際、家族性アル ッハイマー病患者が持つ病原性突然変異はこの「主要な切断部位とその周辺にマイ ナ一な切断部位での切断の正確さに影響を及ぼす」ことが直接の病気を引き起こす 原因となって ヽると考えられて ヽる。
[0063] 発明者らは、次に F-N βを産生する S4切断の正確さが F-NEXT Δ Cと F-NEXTの間 で変化していないか検討した。 S4切断の正確さは F-N |8のカルボキシル末端に反映 されて!/、るはずである。 F-NEXT Δ C又は F-NEXTから生成される!、くつかの種類の 混合物である F-N j8の組成が同じかどうか検討した。 F-NEXT A C及び F-NEXT発現 細胞を 20cmディッシュでコンフルェントな状態にし、培養上清を交換し 3時間培養後 採取した。 M2ァガロースで免疫沈降した後 MALDI- TOF型質量分析器で F- Ν |8混合 物の分子量スペクトラムを描 、た（図 5Α— 1及び Α— 2)。 F-NEXT Δ C及び F-NEXT発 現細胞から分泌される F-N βの質量分析スペクトラムのパターン、各分子種の分子量 は完全に一致した（図 5Α— 1、 Α— 2及び Β)。
[0064] これらの結果から F-NEXT Δ Cで起こって!/、る切断は F-NEXTで起こる膜内切断と 同一であり、 F-NEXTのカルボキシル末端側（NICD部分）のアミノ酸配列を大部分削 除したことは、プレセ-リン/ γセクレターゼによるタンパク質分解に何の影響も与えて いないことが示唆された（図 5C)。
[0065] Notch-1のプレセ-リン/ γセクレターゼによる膜内タンパク質分解部位である S4は 主要な切断部位とその周辺の幾つかのマイナーな切断部位力も成り立つている（図 5 C)。そこで、この Notch-1の S4切断の正確さが Notch-1を著しく改変した F-NEXT A C の場合変化して 、な 、かを次に検討した（図 6A)。 [0066] (実施例 3)
F-NEXT Δ C発現細胞の S4切断のパターンは Notch-1のそれと極めて類似する（in vivo実験) o
Notch-1の S2切断とそれに引き続く膜内タンパク質分解 (S3/S4)には、 Notchリガン ドの結合が必須である。このためマウス Notch-1の人工変異体である mNl-LNG CO SS cDNA (Mumm Jb, bchroeter EH, Saxena MT, Gnesemer A, Tian X, Pan
DJ, Ray WJ, Kopan R. A ligand— induced extracellular cleavage regulates gamma- secretase- like proteolytic activation of Notch 1. Mol Cell. (2000) 5: 197-206.)を Rafael Kopan博士から供与をうけた。 mNl-LNG CC〉SS変異体はリガ ンド結合の刺激なしに S2、 S3で段階的タンパク質分解を受け、 NICDを細胞外に放出 されることが報告されている。発明者らこの cDNAを pcDNA3.1 (hygro) (Invitrogen社 )に組み込んだ。そしてその mNl-LNG CC〉SS変異体発現プラスミドをを K293細胞に 安定的に感染させた。
[0067] タグのついていない野生型の Notch-1配列を持つ mNl-LNG CC〉SSの段階的タン パク質分解過程での S4切断部位のパターンと直接 S4切断の基質となる F-NEXT Δ C の S4切断のパターンが異ならないかどうか検討した。即ち、 mNl-LNG CC〉SS変異 体から生成される、いくつかの種類の混合物である N j8の組成が F-NEXT A Cから生 成される!7, βの組成と同じカゝどうか検討した。
[0068] mNl-LNG CC〉SS発現細胞を 20cmディッシュでコンフルェントな状態にし、培養 上清にフオルボールエステルである PMAを lOOng/mlの濃度で添カ卩し 2時間培養した 。続いて培養上清を交換し 6時間培養後採取した。 6521で免疫沈降した後
MALDHTOF型質量分析器で N β混合物の分子量スペクトラムを描 、た（図 6Β)。 mNl-LNG CC〉SS発現細胞から分泌される野生型 N j8の質量分析スペクトラムの パターンは F-NEXT Δ C発現細胞から分泌される F-N βのそれと極めて類似して！/、た (図 6B、 C、図 5A— 1、 A— 2及び B)。
[0069] 以上のように細胞外部分を人工的に改変した F-NEXT A Cの S4切断は野生型マウ ス Notch-1の S4切断と違いがないことが多面的に明らかとなった。
[0070] (実施例 4) β APPタンパク質の γ 40及び γ 49膜内タンパク質分解部位の正確さの変化が家族 性アルツハイマー病発症の原因となって!/、ることが知られて!/、る。同じプレセ二リン/ γセクレターゼによるタンパク質分解である Notch-1タンパク質の S3及び S4切断の効 率や正確さの変化を高感度に測定するために、 F-NEXT Δ C発現 K293細胞の膜分 画を用いたく Notch-1のプレセ-リン/ γセクレターゼによる膜内タンパク質分解を再 現するセル 'フリー'アツセィ系 >を作成した。
[0071] Notch-1の S3/S4切断を正確に再現するセル.フリ一.アツセィ系の作成
ι8 APPタンパク質の γセクレターゼによるタンパク質分解後細胞内に放出される CTFを AICDと呼ぶ。 NTFの Α |8が比較的簡単に培養上清中に認識できるのに比較 して、細胞ライセート中に AICDを同定することは難しい。これは A j8に比較して AICD のタンパク質分解の速度がきわめて速いためである。このため、 jS APPタンパク質の プレセ-リン/ yセクレターゼによるタンパク質分解で AICDを直接生成するタンパク 質分解を同定するためにセル 'フリー' Ίセクレターゼ 'アツセィが開発された (Pinnix
I, Musunuru U, Tun H, bndharan A, uolde T, Eckman C, Ziani— Cherif C, Onstead L, Sambamurti K. A novel gamma— secretase assay based on detection of the putative C— terminal fragment-gamma of amyloid beta protein precursor. J Biol Chem. (2001) 276:481—7. McLendon C, Xin T, Ziani— Cherif C, Murphy MP, Findlay KA, Lewis PA, Pinnix I, Sambamurti K, Wang R, Fauq A, Goide TE. Cell-free assays for gamma— secretase activity. FASEB J. (2000) 14:2383-6.)。そして AICDのァミノ末端を同定した結果 、 γ 49膜内タンパク質分解部位が報告された。
[0072] 発明者ら F-NEXT A C発現細胞のライセート中に F-NEXT A Cの発現、同時に培養 上清中に F-N |8の細胞外放出も確認した。続いて、 NICD A Cを細胞ライセート中に 認識しようと試みたが、 6336は F-NEXT Δ Cの発現を認識したにもかかわらず NICD Δ Cは全く認められな力つた (結果は図示せず)。
[0073] いくつかの方法を試行錯誤した後、発明者ら F-NEXT A C発現細胞の膜分画を抽 出し、よく洗浄した後くセル 'フリー' Notch切断 ·アツセィ (セル 'フリー' Notch切断分 析)〉を試みアツセィ系を確立した (方法は図 3A及び B、結果は図 7A、 B— 1、 B-2 及び c)。
[0074] (細胞のホモジナイズと膜分画の調整）
F-NEXT Δ C発現細胞を 20cmディッシュ、 15枚中でコンフルェントな状態になるま で培養した。以下の過程は厳密に 4°C下で行った。氷冷した PBSで 2回洗浄し細胞培 養上清の混入を排除した後、細胞をセル'スクレーパーで力き集めた後、 1,500 X gの 遠心分離によって PBSと分離し、回収した。
ホモジナイズ 'バッファー (0.25M シユークロース、 10mM HEPES (pH7.4)、使用説 明書において推奨されている濃度の 1倍のロッシュ社製プロテアーゼ阻害薬混合物（ protease inhibitor mix)をカ卩えテフロン (R) ·ホモジナイザーで 20ストローク上下させる ことで細胞をすりつぶした。核分画と細胞の破砕された滓を取り除くために細胞ホモ ジネートを 1000 X gで 5分間遠心し、その上清（PNS)を回収した。続いて、 PNSを 100,000 X gで 30分間遠心し沈查分画を採取した。
この沈查を反応バッファー (150mMクェン酸緩衝液 (pH6.4)、使用説明書において 推奨されて!、る濃度の 4倍のロッシュ社製プロテアーゼ阻害薬混合物、 5mM l,10-Phenanthroline(Sigma》で再懸濁し再び 100,000 X gで 30分間遠心し洗浄した。 この洗浄の過程を 3回繰り返したあとの沈查分画を粗精製膜分画 (CMF)とした（図 3 A)。
(セル'フリ^ ~ · yセクレターゼ 'アツセィ）
F-NEXT Δ C発現 K293細胞の粗精製膜分画（CMF：図 3A)を反応バッファー (150mMクェン酸緩衝液 (pH6.4)、使用説明書において推奨されている濃度の 4倍の ロッシュ社製プロテアーゼ阻害薬混合物、 5mM 1,10- Phenanthroline(Sigma》中で再 懸濁した。その懸濁液を 37°Cで培養することをセル'フリー切断反応工程とした。ここ では、 37°Cで 40分間培養した（図 3B)。反応物を 100,000 X gで 15分間遠心分離し た上清である SI- 40min分画（図 3B)を 6336で免疫沈降したところ NICD A Cが認識さ れた。この NICD A Cの分子量を MALDI-TOF型質量分析装置で解析した（図 7B—1) 。その結果、 NICD A Cのァミノ末端が報告どおり S3に由来することが明らかになった（ 図 7B— 2)。この S3切断部位の多様性にっ 、てはこれが始めての報告である。
[0075] Sl-40min分画を採取後の沈查分画を短時間超音波破砕し、さらに 100,000 X gで 1 5分間遠心分離した上清分画を S2-40min分画として採取した（図 3B)。この S2-40min 分画を M2ァガロースで免疫沈降し MALDI-TOF型質量分析装置で解析した（図 7A) 。その結果、培養上清を用いて同様の解析した場合とほぼ同じ F-N |8の質量分析ス ぺクトラムが得られた（図 7Aと図 5A— 1及び A— 2の比較)。したがって、細胞が生存 中にプレセ二リン/ γセクレターゼによる切断を受け放出された F-N |8とセル 'フリー' Notch切断分析で放出された F-N βは幾つかの F-N β分子種のほぼ同じ組成の混 合物であることが分力つた。
[0076] 図 7Cにセル ·フリ一 · Notch切断分析で同定される S3及び S4切断部位の多様性に ついて図示した。
上記の結果は今までの生きた細胞を使用した研究結果に反しな力つた。また、セル 'フリー 'Notch切断分析では S3及び S4切断部位の特徴である多様性の変化を同定 できる。これを利用して薬剤に対する「S3又は S4切断の多様性の変化」を正確に検討 できることがこのアツセィ系の特徴である。たとえばアルツハイマー病治療薬の可能 性が注目されて 、るイブプロフェンなどの一部の NSAIDは 13 APPのプレセ-リン/ γ セクレターゼによる切断の正確さに影響を及ぼす。これらの薬剤による Notchタンパク 質の切断に対する影響が詳細に検討できる。
[0077] また、同じくアルッノヽイマ一病治療薬として開発が進んで 、る γセクレターゼ阻害 薬はフェーズ 2治験も行われたが副作用の報告により現在頓挫している。この副作用 の原因は、プレセ-リン/ γセクレターゼ 'メカニズム力 SNotchタンパク質をはじめとす る十数種のタンパク質の膜内タンパク質分解に関わっており、その阻害薬がそれらを おしなべて阻害するために出現すると考えられている。なかでも Notchタンパク質の 作用は生体にとって極めて重要なものである。 A |8産生を阻害するプレセ-リン/ γセ クレターゼ阻害薬のスクリーニングには /3 ΑΡΡやその変異体を強制発現させた細胞 の上清中の Α β量を測定する系が使用されてきた。
[0078] 本発明の、セル'フリー 'Notch切断 ·アツセィの一態様である、多基質膜内同時アツ セィ系を利用することにより、 yセクレターゼ阻害薬の性質として「 j8 APPの γ 40切断 や Notchの S4切断といった膜中央部分の切断と 13 APPの γ 49切断や Notchの S3切断 といった膜の細胞内に近い部分での切断への効果が異なること」が解明された（図 9 A、 B及び図 10)。 したがって γセクレターゼ阻害薬スクリーニングの過程で Notch シグナル伝達阻害による副作用を未然に予測し、副作用のおこらない薬剤やその濃 度について始めて言及できる（図 10)と考えられる。さらに最近 NSAID効果を持つコ ンパウンドの一部が γセクレターゼ調節作用を持ち、 13 ΑΡΡの γ 40切断の正確さに 影響を及ぼすことが知られてきた。これらのコンパウンドの他の 3切断の効率にっ ヽ ては検討されて 、るが、それぞれの正確さに対する効果につ!、ては検討されて!、な い。 われわれは最近 S3切断の正確さの変化が結果的に産生される NICDの安定性 に影響を及ぼすことを明らかにした (詳細提示せず)。したがって、 γセクレターゼ阻 害薬又は修飾薬のシグナル伝達阻害作用による副作用を防ぐために、これから開発 される第二世代 γセクレターゼ阻害薬又は修飾薬開発に際しては Α βを産生する γ 40以外の他の切断の正確さについても検討されなければならない。その際に本特許 の施行が不可欠であると考えられる。
[0079] (実施例 5)
次に、セル 'フリ一' Notch切断分析を 13 APPのセル 'フリ一'アツセィ系と結合させた 。この結果、プレセ-リン/ γセクレターゼによるタンパク質分解により生じた A |8、 AICD、 N |8、 NICDの 4フラグメント産生の効率を同時に測定できる系を作成した。こ れにより、全く新しい種類の γセクレターゼ阻害薬をスクリーニングすることができる。 なぜなら、プレセ-リン/ γセクレターゼによる 4つの異なるほぼ同時に起こるタンパク 質分解に対する薬剤の効果を別々に検討することで 4つの切断に対する効果のプロ ファイルの異なる薬剤が選別できる（第二世代 γセクレターゼ阻害薬)力もである。
[0080] β APPタンパク質の γ 40/ γ 49切断と Notch-1の S3/S4切断を再現するセル.フリ一. アツセィ系の作成
F-NEXT Δ C及びスウェーデン型突然変異体 13 APP (sw β APP)を恒常的に共発現 するヒト胎児腎臓 293細胞（K293細胞）は、 Lipofectamine 2000 (Invitrogen社)を用 いてスウェーデン型突然変異体 j8 APPを導入し、 G418でセレクションをかけ、その後 iS APPを発現している細胞に、 F-NEXT A Cを導入して作成した。そして、最初にこの 細胞のライセート中に F-NEXT Δ C及び sw β APPの発現があること、同時に培養上清 中に F-N |8及び Α |8の放出が起こっていることを確認した（図 5A— C)。また、この F-N β及び A βの分子種の組成にっ 、て検討しそれが今までの報告と矛盾しな!、こ とを確認した (結果は提示せず)。
[0081] その F-NEXT Δ C及び sw β ΑΡΡ共発現細胞の膜分画を用いてく β ΑΡΡ及び
Notch-1を組み合わせた多基質セル.フリ一.アツセィ系 >確立を試み、 A j8、 AICD、 Ν β、 NICDの 4フラグメント産生系を確立した。本実施例では、可逆的 γセクレターゼ 阻害薬であることが知られて 、る L685,458又は DAPTを被検物質として用いた。
[0082] ΙΟΟηΜの L685,458又は ΙΟΟηΜの DAPTで、膜分画抽出前に 2時間前処理した
F-NEXT Δ C及び sw β ΑΡΡ共発現 Κ293細胞の粗精製膜分画を用いた。この粗精製 膜分画から Sl-40min分画を採取した。 Sl-40min分画を採取後の沈查分画を再び反 応バッファ一中に懸濁した後短時間超音波破砕した。続いて、 100,000 X gで 15分間 遠心分離した上清分画を S2-40min分画として採取した。
[0083] 各フラグメントに対する特異的抗体 (A j8は 4G8、 AICDは 6618、 F-N jSは M2ァガロ ース、 NICD A Cは 6336を使用した。）で免疫沈降し MALDI-TOF型質量分析装置で 解析した（図 8)。 Sl-40min分画中には de novo NICD A C及び AICDが同定された。 S2-40min分画中には F-N j8及び A j8が同定された（図 8)。図 8ではその質量分析パ ターンを示した。 β ΑΡΡ及び Notch-1を組み合わせた多基質セル'フリ一'アツセィ系 へ変更をカ卩えても、プレセ-リン/ γセクレターゼによるタンパク質分解部位の多様性 は保存されていた。
S2-40min分画中の F-N |8について検討した結果、培養上清を用いて同様の解析し た場合とほぼ同じ質量分析スペクトラムが得られた（図 8と図 5A— 2の比較)。
[0084] なお、 /3 APPのプレセ-リン/ γセクレターゼによる膜内タンパク質分解後の C末端 フラグメントである AICDを効率よく認識するための前記ポリクローナル抗体 (6618)は 、下記の合成ポリペプチド (配列番号 12)に対する抗体であり、以下のように作成した 。まず、抗原となる前記ポリペプチドを準備した。さらにそのペプチドのァミノ末端の Cys残基を KLHタンパク質に化学的に架橋結合させたものを抗原とした。
配列番号 12 :
NH2-CKMQQNGYENPTYKFFEQMQN-COOH [0085] (実施例 6)
j8 APP及び Notch-1を組み合わせた多基質セル'フリ一'アツセィ系を用いた巿販 y セクレターゼ阻害剤（L685,458及び DAPT)の Notch-1切断への影響
F-NEXT Δ C及び 13 APPsw共発現細胞をコンフルェントな状態にした後、 3時間各 濃度の γセクレターゼ阻害剤で処理した。 γセクレターゼ阻害剤としてプレセ二リン/ yセクレターゼの活性中心に結合する transition-state類縁体の L685 ,458及び transition-state類縁体でな!、DAPTを用いた。処理後の細胞を氷冷 PBSで 2回洗浄 し回収した。この細胞ライセートをホモジナイズし CMFを抽出した。続いてこの膜分画 をアルカリ洗浄バッファ一中に懸濁し 30分間 4度で静置した。その後、反応バッファ 一中で 3回再懸濁'遠心を繰り返してアルカリ洗浄バッファーを洗い流した。ここまで の過程で CMFに含まれていた殆どの γセクレターゼ阻害剤は洗い流されていると考 えられる。最後にもう一度反応バッファーに懸濁後、セル'フリー反応を実施した。 Sl-40minフラクション中の AICD/NICD Δ C及び S2- 40minフラクション中の A β /N β 量を MALDI-TOF MSピークの相対的高さから半定量し一、 +、 ++、 +++の 4段階で評 価した。
[0086] まず L685,458で前処理した場合の F-N β、 Α βヽ NICD Δ C、 AICD産生への影響に ついて述べる。 1 Mの高濃度で前処理し、さらにホモジネート'バッファーや反応バ ッファーを含む全てのバッファーに 1 μ Μの L685,458をカ卩えると 4つのフラグメントはい ずれも認められな力つた。これは我々のアツセィ系で L685,458は報告どおり作用して いることを示唆している。
し力しながら、 1 /z Mの高濃度で前処理しても、よく洗浄した場合 γ切断の CTFであ る AICD/NICDの de novo 産生が認識された。即ち S3/ γ 49切断が起こっていること が明らかになった。これは L685,458が報告どおり可逆的阻害剤であり、プレセ二リン/ γセクレターゼへの結合が洗浄により解離したことを示唆している。面白いことに、こ の時、同時に γ切断の NTFである Α β /Ν βは認められなかった。この事実は γ切断 を構成する 2つの切断のうち S4/ γ 40の方が S3/ γ 49よりも L685,458に対する感受性 が高い可能性を示唆している。また、プレセ-リン/ γセクレターゼ阻害剤を用いて S4/ γ 40活性が低下しても S3/ γ 49活性は必ずしも阻害されな 、場合があることを示 しているとち考免られる。
[0087] さらに、前処理に用いた L685.458濃度を 100ηΜ、 ΙΟηΜと減少させて同様に実験し た。表のように阻害薬濃度の減少に伴い、 NICD A C/AICDに比較して 1 μ Μ
L685,458で阻害効果の強かった F-N jS /A jSの de novo産生が回復していくことが明 らかになつた。 L685,458 ΙΟηΜの前処理で 4フラグメントのピークの高さが平均して最 大であった。
[0088] 続いて、阻害薬の作用発現メカニズムがこの 4フラグメントに対する阻害プロフアイ ルに影響を及ぼす力どうか検討した。表のように同様の実験を DAPTを阻害剤として 用いて行った。図 9A及び 9Bに示したように L685,458及び DAPTの 4つの切断に与え る効果は極めて類似していた。したがって、 L685,458が示した 4つの切断に対する効 果は transition-state類縁体に特異的な阻害効果ではないことが明らかになった。 重要なことに、 A β及び Ν β産生に与える阻害剤の効果力AICD及び NICD産生に与 える効果と異なる場合、その違 、は β ΑΡΡと F-NEXT Δ Cの基質間で保存されて 、た 。たとえば、阻害剤の前処理により AICD産生に比較して F-N |8産生阻害が強いとき、 F-NEXT Δ Cでも NICD Δ C産生に比較して F-N β産生の阻害が強かった。このこと力 ら阻害薬の作用発現メカニズムが /3 ΑΡΡと Notch-1の間で共通している可能性が示 唆された。この結果を模式的に表したものが図 10である。 A β及び Ν β産生に与える 阻害剤の効果が 1の曲線の傾向を示し、 AICD及び NICD産生に与える阻害剤の効 果が 2の曲線の傾向を示す。
[0089] そしてそれを用いて今までに Α β産生でスクリーニングされた市販薬剤である
L685,458や DAPTが γ 40とそれに対応する S4切断に感受性高く作用するが、 γ 49や S3切断にはそれほど感受性が高くないことを明らかにした。このアツセィ系を用いるこ とにより、アルッノヽイマ一病治療薬として開発された γセクレターゼ阻害薬の Notchの 切断阻害作用による副作用発現の可能性にっ 、て始めて未然に言及できるようにな る。このアツセィ系は現在開発中の第二世代 γセクレターゼ阻害薬のスクリーニング に利用できると考えられる。
[0090] (実施例 7)
Notchの S3切断部位の変異体である VI 744Gを持った遺伝子改変マウスは Notch表 現型を呈し胎児性致死である（Huppert SS, Le A, Schroeter EH, Mumm JS, Saxena MT, Milner LA, Kopan R Embryonic lethality in mice homozygous for a processing— dencient allele of Notchl. Nature. 2000 Jun
22;405(6789):966-70.) o本実施例では、この S3部位の変異が S3および S4切断にどの ように関与する力検討した。
S3の変異を F- NEXTに導入した F- NEXT
VI 744Gおよび F-NEXT V1744Lを作成した（図 11A)。 30分パルスで蛋白発現を確 認した後 2時間チェイスしその F-NEXT誘導体の分解について検討した (図 11B)。 まず S3切断効率について検討した。図 11Bの上欄によれば、野生型プレセ-リン の背景で F- NEXT V1744Gおよび F- NEXT V1744Lは、 F- NEXTと同じように 2時間 チェイスの間に分解しその量が減少したことが分かる。ところが図 11Bの上欄によれ ば、 F-NEXT V1744Gおよび F- NEXT V1744Lから産生される NICD量は F- NEXTか ら産生されるそれよりもずっと少な力つた。また、プレセ-リン機能が阻害された PS1 D385N発現細胞の背景で動揺の実験を行った。この場合、図 11Bの下欄によれば、 NICD産生のみならず F-NEXTとその誘導体の減少も 2時間のチェイス時間後には認 められなかった。このチェイス時間での F-NEXTとその誘導体の減少はプレセ-リン による膜内蛋白分解の結果である。
次に S4切断効率につ ヽて検討した。図 11Cに示したように 2時間チェイス後の上清 中に認められるアイソトープ標識された F-N βは F-NEXTとその誘導体である F-NEXT V1744Gおよび F-NEXT V1744L変異体で変化がなかった（図 11C)。した がって、 S4切断効率は S3切断部位変異の影響を受けない。以上をまとめると S3変異 により S3および S4切断効率は変化しないが NICDの細胞内量が減少している可能性 が示唆された。
S3変異体の膜内蛋白分解の結果 NICD量が減少した理由を検証するため、次のよ うな実験を行った。プレセ-リンによる F-NEXTおよびその S3変異体である V1744Gの 切断部位を決定するために F- NEXT Δ Cおよび F- NEXT Δ C
V1744Gを作成し、粗膜分画のセル'フリー反応後 IP-MS法で NICD A Cフラグメントの 分子量を測定し S3切断部位を特定した (図 12A— 1及び A— 2)。その結果 V1744G変 異体が導入されると S3切断部位は通常の G1743と V1744の間ではなぐ G1744と L1745の間になることが明らかになった (図 12A— 1、 A— 2及び B)。この結果 F-NEXT Δ Cの場合に比較して F-NEXT Δ C V1744Gでは産生される NICD Δ Cのァミノ末端 のアミノ酸が 1残基ずれる。さらに F- NEXTおよび F- NEXT
VI 744G細胞カゝら抽出精製した NICDを細胞内液と混合し NICDフラグメントの安定性 につ 、て検討したところ F- NEXT V1744G細胞の NICDは F- NEXTの NICDよりもずつ と不安定であった。
以上のことから、次のことが分かった。 Notchの S3切断部位の変異体である V1744G はその変異を持つマウスで Notchシグナル伝達に障害を来たす。この原因にっ 、て 詳細に検討したところ、この変異の結果 S3や S4切断部位での切断効率は減少しな ヽ にもかかわらず細胞内の NICD量が減少した。これは S3切断部位がこの変異によりず れた結果 NICDのァミノ末端のアミノ酸が変化し NICD自体の安定性が低下したことが 原因であると考えられる。この結果は S3切断の正確さの変化がシグナル伝達量を減 少させたことを示唆したものである。
(実施例 8)
コンパゥンドの質量分析
被検物質として、 NSAIDの誘導体を用い、 Α |8 42産生抑制効果と Α |8 38産生増強効 果をセル'フリ一'アツセィにより観察した。 Notchと jS APPの共発現系においてセル' フリー反応工程後、 IP-MS法により検出して観察した。被検物質は、細胞の祖膜分画 を採取する前に 24時間処理し、実験終了時まで、すべての培養液とバッファ一中に 被検物質を加えた。その結果、 A β 42の減少を伴う Α β 38産生の増加が認められた ( 図 13)。また、 AICDのァミノ末端にはこの薬剤の効果は認められなかった（図 13)。さ らに、 Notchにつ!/、もこの効果は認められなかった（図 13)。
産業上の利用可能性
本発明は、アルッノヽイマ一病の治療等に有効な γセクレターゼ阻害薬の薬剤スクリ 一ユング、及びそれに用いる組成物の製造等に利用できる。

Claims

請求の範囲
[1] Notchタンパク質変異体を発現させた細胞の粗膜分画と被検物質とを接触させるセ ル 'フリー切断反応工程と、
前記セル'フリー切断反応工程における Notchタンパク質変異体の膜内蛋白分解に より生じたァミノ末端側の断片とカルボキシル末端側の断片とを検出する検出工程と を有し、
被検物質が Notchタンパク質変異体の膜内蛋白分解に与える影響を分析するセル' フリ一 · Notch切断分析方法であつて、
前記 Notchタンパク質変異体力 Notchタンパク質の少なくとも推定膜貫通ドメインを 有し、少なくとも推定膜貫通ドメインよりもァミノ末端側のアミノ酸配列の一部を欠失し 、かつ推定膜貫通ドメインよりァミノ末端側およびカルボキシル末端側のそれぞれに 抗体認識部位を有することを特徴とするセル'フリー 'Notch切断分析方法。
[2] 前記検出工程が、被検物質力 Notchタンパク質変異体の膜内蛋白分解の量に与える 影響を分析する請求の範囲第 1項に記載のセル'フリー 'Notch切断分析方法。
[3] 前記検出工程が、質量分析法を用いて前記アミノ末端側の断片とカルボキシル末端 側の断片とを検出する工程であり、被検物質力 SNotchタンパク質変異体の膜内蛋白 分解部位の正確さに与える影響を分析する請求の範囲第 1項に記載のセル，フリー.
Notch切断分析方法。
[4] セル'フリー切断反応工程における粗膜分画力 Notchタンパク質変異体と /3 APPタ ンパク質変異体とを共発現させた細胞の粗膜分画であり、検出工程において、前記 セル'フリー切断反応工程における ι8 APPタンパク質変異体の膜内蛋白分解により 生じたァミノ末端側の断片とカルボキシル末端側の断片とを検出する検出工程をさら に有し、被検物質力 SNotchタンパク質変異体のおよび /3 APPタンパク質変異体の膜 内蛋白分解に与える影響を分析するセル'フリー 'Notch切断分析方法であって、 前記 j8 APPタンパク質変異体力 APPタンパク質の少なくとも推定膜貫通ドメインを 有し、推定膜貫通ドメインよりァミノ末端側およびカルボキシル末端側のそれぞれ〖こ 抗体認識部位を有する請求の範囲第 1項力 第 3項のいずれかに記載のセル'フリ — Notch切断分析方法。
[5] Notchタンパク質変異体が、（1)及び (2)のいずれかである請求の範囲第 1項力も第 4項のいずれかに記載のセル'フリ一' Notch切断分析方法。
(1)配列番号 1で表されるポリペプチド（FLAG-NEXT)
配列番号 1：
Figure imgf000038_0001
Kし ISEEDし し ISEEDし
(2) γ -セクレターゼによる膜内蛋白分解の部位及び膜内分解の量の傾向が配列番 号 1で表されるポリペプチド（FLAG-NEXT)と実質的に同じであるポリペプチド
[6] Notchタンパク質変異体が前記（2)のポリペプチドであり、前記（2)に記載のポリぺプ チドが、セル'フリー切断反応工程により切断されたときに、質量分析可能な Notchタ ンパク質変異体である請求の範囲第 5項に記載のセル'フリー 'Notch切断分析方法
[7] Notchタンパク質変異体力 配列番号 1で表されるポリペプチド（FLAG- NEXT)にお いて推定膜貫通ドメインよりもカルボキシル末端側のアミノ酸配列の一部を欠失させ たポリペプチドである請求の範囲第 5項及び第 6項のいずれかに記載のセル 'フリー' Notch切断分析方法。
[8] 請求項 1から 7のいずれかに記載のセル'フリー 'Notch切断分析方法により検出さ れる、被検物質による Notch切断量の増減及び Notch切断部位の正確さの変化の少 なくともいずれかを指標として、薬剤の有効成分を選択することを特徴とする薬剤スク リーニング方法。
[9] 配列番号 2で表されるポリペプチド（FLAG- NEXT Δ C)、及び、
前記 FLAG-NEXT A Cのアミノ酸配列において 1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列カゝらなり、 y -セクレターゼによる切断位置及び 切断量の傾向力 SFLAG- NEXT Δ Cと実質的に同じであるポリペプチドのいずれかから なることを特徴とする組換えタンパク質。
配列番号 2:
AAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQHGQLWFPEGFKVSEAEQKLISEEDL
[10] 請求項 9に記載の組換えタンパク質をコードすることを特徴とする発現用遺伝子。
[11] 請求項 9に記載の組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有することを特徴とす る組換えベクター。
[12] 請求項 9に記載の組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクター を含むことを特徴とする形質転換体。
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