WO2004112860A1

WO2004112860A1 - 細胞接着・増殖性材料

Info

Publication number: WO2004112860A1
Application number: PCT/JP2003/007731
Authority: WO
Inventors: Yoshihito Osada; Jian Ping Gong
Original assignee: Hokkaido Technology Licensing Office Co Ltd
Current assignee: Hokkaido Technology Licensing Office Co Ltd
Priority date: 2003-06-18
Filing date: 2003-06-18
Publication date: 2004-12-29
Anticipated expiration: 2005-12-18
Also published as: AU2003242464A1

Abstract

　細胞培養に適した、好適には、細胞をコンフルエント又はサブコンフェルトの状態まで培養可能な、ポリアクリル酸ハイドロゲルからなる、細胞接着・増殖性材料。　

Description

明細書

細胞接着 ·増殖性材料技術分野

本発明は、細胞培養に適した、好適には、細胞をコンフルェント又はサブコンフェルトの状態まで培養可能な細胞接着，増殖性材料、特に、合成高分子を原料とするハイドロゲルからなる、生体材料等の医療具としても使用可能な前記材料に関する。背景技術

近年、ハイド口ゲルは、その重要な用途として、組織工学や再生医工学という先端医療分野における細胞培養支持体や組織再生支持体として注目を集めている。これらの用途に利用するためには、生体安全性や生体親和性が宴求されるため、主として生体由来のコラーゲンを中心としたハイドロゲルが利用されている。また、特開 2 0 0 2— 1 8 6 8 4 7公報には、同じく天然由来の絹フイブ口インタンパク質を原料としたハイドロゲルが提案されている。この絹フイブ口インタンパク質は、手術用縫合糸としても使用されている材料であり、生体親和性に優れた、蚕から生産される天然高分子である。

しかしながら、天然物を原料とする場合には、品質が不均一になったり、生産コストが嵩む等、工業生産上の問題が生じる。例えば、コラーゲンに関しては、動物組織からの抽出により生産され、かつォートクレーブ滅菌が不可能であることから、未知病原体による汚染等の可能性もあるといわれている。他方、合成高分子の利用も検討されてはいるが、これまで、合成高分子ゲル上で、内皮細胞がコンフルェント又はサブコンフェルトの状態まで培養された例は報告されていない。

本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、合成高分子を原料としたハイドロゲルからなる細胞接着 ·増殖性材料を提供することにある。発明の開示

本発明（1) は、ポリアクリル酸八イド口ゲルからなる、細胞接着，増殖性材料である。

本発明（2) は、架橋度が 0. 5〜2. 5mol%の範囲である、前記発明 ( 1 ) の細胞接着 ·増殖性材料である。

本発明（3) は、ポリアクリル酸ハイド口ゲルの膨潤度が 20〜30である、前記発明（1) 又は（2) の細胞接着 ·増殖性材料である。

本発明（4) は、前記発明（1) 〜（3) のいずれか一つの細胞接着 ·増殖性材料を用いた医療具である。

本発明（5) は、人工血管又は細胞培養用テンプレートである、前記発明

(4) の医療具である。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 1のポリアクリル酸ハイド口ゲル（架橋度 2mol%) と比較例 1のポリメタクリル酸ハイド口ゲル（架橋度 2mol%) について、ヒト血管内皮細胞を捲き 6時間経過した後の細胞の形態を示したものである。図中、黒色部分は伸展状態（細胞が基板のゲルにくっついていて伸ばされている状態）、灰色部分は弱い吸着（細胞は基板のゲルにくっついてはいるが形状が丸い状態）、白色部分は浮遊（細胞が基板のゲルにくっついていない状態）を示す。図 2は、実施例 1のポリアクリル酸ハイド口ゲル（架橋度 2mol%)、実施例 2のポリアクリル酸ハイド口ゲル（架橋度 3mol%) 及び比較例 1のポリメタクリル酸ハイドロゲル（架橋度 2mol%) の夫々にっき、ヒト血管内皮細胞を捲いた後、伸展状態にある細胞を経時的にカウントした結果を示したものである。図中、縦軸は伸展している細胞数を、横軸は時間（h) を示す。図 3は、実施例 1のポリアクリル酸ハイド口ゲル（架橋度 2mol%) にっき、ヒト血管内皮細胞を捲いてから 6時間後（a) 及び 192時間後（b) における、ゲル上の細胞の様子を撮影した電子写真である。図 4は、培養液中の膨潤度の異なる各種ポリアクリル酸ハイドロゲルについて、ヒト血管内皮細胞を捲き 6時間経過した後の、該細胞の伸展率を調ベたものである。図中、縦軸は伸展率 (%) を、横軸は膨潤度を示す。図 5は、実施例 3の B C— A Aダブルネットワークゲル（架橋度 2 mo 1 %) の細胞形態 ( 6時間後）である。尚、図中、黒色部分は伸展状態（細胞が基板のゲルにくつついていて伸ばされている状態）、灰色部分は弱い吸着（細胞は基板のゲルにくっついてはいるが形状が丸い状態）、斜線部分は浮遊（細胞が基板のゲルにくっついていない状態）を示す。図 6は、実施例 3の B C— A Aダブルネットワークゲル（架橋度 2 mol %) の内皮細胞増殖曲線である。図 7は、実施例 5及び 6 { A A— A Am— A Aのトリプル（T N、三重網目）ゲル } の細胞形態 ( 6時間後）である。尚、図中、灰色部分は伸展状態（細胞が基板のゲルにくつついていて伸ばされている状態）、黒色部分は弱い吸着（細胞は基板のゲルにくっついてはいるが形状が丸い状態）、白色部分は浮遊（細胞が基板のゲルにくっついていない状態）を示す。図 8は、実施例 6の AA— AAm— A Aのトリプル（T N) ゲルの内皮細胞増殖曲線である。発明を実施するための最良の形態

以下、具体的に本発明を説明する。本発明の特徴は、細胞接着 ·増殖性材料として、合成高分子であるポリアクリル酸を原料とした、ポリアクリル酸ハイド口ゲルに着目した点にある。即ち、このポリアクリル酸ハイド口ゲルは、合成高分子を原料としているにもかかわらず、他の合成高分子より得られるハイドロゲルと異なり、天然高分子同様、細胞接着，増殖性を有しているという特徴があり、この特徴は、本発明者らにより初めて見出されたのである。このゲルがなぜ故にそのような性質を有するかは現時点では不明であるが、.考えられる理由としては、このゲル表面が、細胞が伸展するのに最適な張力を与え、細胞の伸展や増殖に関係する接着タンパク（例えば、ラミニン、フイブロネクチンなど）の吸着が極めて高い可能性を挙げることができる。

本発明で用いられるポリアクリル酸八イド口ゲルは、好適には、架橋度が 1〜

4mol %、特に好適には、 0 . 5〜2 . 5 mol %の範囲であるものである。

ここで、「架橋度」とは、モノマーの仕込みモル濃度に対する架橋剤のモル濃度の比をパーセントで表した値をいう。なお、実際には、重合に関与しなかったモノマーや架橋に関与しなかった架橋剤も僅かにある場合があるが、この際も、本明細書におけるゲルの架橋度は、前記の通りとする。また、本発明で用いられるポリアクリル酸ハイド口ゲルは、好適には、膨潤度が 2 0〜3 0の範囲であるものである。ここで、「膨潤度」とは、以下の式：

膨潤度 =膨潤させたゲルの重量（W_w) /乾燥ゲルの重量（W_D) で求められる値をいう。尚、本明細書にいう「ハイド口ゲル」とは、溶媒が水であるゲルをいうが、影響しない程度の量、水可溶性溶媒 (例えばアルコール) 等 ' を含有していてもよい。

また、本発明で用いられるポリアクリル酸ハイド口ゲルは、強度を向上させる観点から、相互侵入網目構造ハイドロゲル又はセミ相互侵入網目構造ハイドロゲルであってもよい。例えば、相互侵入網目構造ハイド口ゲルの場合は、ベースとなる網目構造（ポリアクリル酸の架橋物）に、他の網目構造がゲル全体において均一に絡みついている態様である。また、セミ相互侵入網目構造ハイド口ゲルの場合は、ベースとなる網目構造（ポリアクリル酸の架橋物）に、直鎖状ポリマーが、ゲル全体において均一に絡みついている態様である。尚、他の網目構造及び直鎖状ポリマーは、生体適合性がある限り特に限定されず、コラーゲンやバクテリアセルロース（B C) のような天然物であってもよいし、 P N a S S (スチレンスルホン酸ナトリウムのポリマー）のような合成ポリマー（の架橋物）であつてもよい。また、「相互侵入網目構造八イド口ゲル」及び「セミ相互侵入網目構造ハイド口ゲル」は、ダブルネットワーク型のみでなく、三重や四重以上の網目構造を有するゲルをも含む概念である。

次に、前記ポリアクリル酸ハイド口ゲルの用途であるところの、細胞接着 ·増殖性材料とは、細胞接着性及び細胞増殖性が求められる、組織工学や再生医工学という先端医療分野における細胞培養支持体や組織再生支持体として用いられるような材料を指し、例えば、人工血管又は細胞培養用テンプレート等の医療具に用いられるものを挙げることができる。ここで、「細胞接着性」とは、足場依存性の細胞が付着できる性質を指し、また、「細胞増殖性」とは、増殖した細胞がコンフェルト又はサブコンフェルトの状態になることを意味する。

また、増殖の対象となる細胞は、足場依存性の細胞であれば、株化細胞、初代細胞を問わず、例えば、線維芽細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、上皮細胞を挙げることができる。

次に、本発明に係るポリアクリル酸八ィドロゲルの製造方法について説明する。本発明に係るポリアクリル酸ハイド口ゲルは、例えば、適当な溶媒（例えば、水）中に、アクリル酸、重合開始剤及び架橋剤を添加し、熱重合することにより製造することができる。重合開始剤としては、例えば、過硫酸カリウムなどの水溶性熱触媒、過硫酸力リウムーチォ硫酸ナトリウムなどのレドックス開始剤を用いることができる。また、架橋剤としては、例えば、 N， N ' —メチレンビスァクリルアミドを使用することができる。尚、最終的にゲル中に含まれる溶媒 (7J に関しては、製造段階から溶媒として水を使っても、或いは、製造後に溶媒交換を行うことで水に置換してもよい。

最後に、本発明に係るポリアクリル酸ハイドロゲルの使用方法にっき説明する。本発明に係るポリアクリル酸ハイドロゲルは、細胞接着'増殖性医療具として使用可能であり、特に、人工血管に適しているといえる。現在使われている人工血管は、血栓が生じやすく、血管外部への物質の透過性がないことがら、血管外部への影響が大きい。本発明に係るポリアクリル酸ハイドロゲルからなる材料は、柔軟性があり、選択的物質の透過性をも有し、かつ、細胞接着 ·増殖性を有するので、血管内部に抗血栓作用を有する内皮細胞が構築可能であることがその理由である。また、細胞培養用テンプレートとしての用途も適している。実施例

以下、実施例を参照しながら、本発明をより具体的に説明することとする。尚、本発明が実施例に限定されないことはいうまでもない。実施例 1 (架橋度 2 mol %の P AAゲルの製造例）

モノマーである 2 mol/Lのアクリル酸（AA) 水溶液 4 0 ml と、架橋剤である

0 . 4 mol/L の Ν， Ν ' ーメチレンビスアクリルアミド（Μ Β ΑΑ) 水溶液 4 ml と、開始剤である 0 . 1 mo 1/Lの 2—ォキソダルタル酸水溶液 l mlとを合わせ、水で調整して 8 0 ml の水溶液を得た。この水溶液を窒素ガスを用いて脱酸素した。つづいて、この脱酸素水溶液を、実施例 1と同様な重合容器の一方のガラス板に置かれたシリコン板の開口部に流し込み、シリコン板上に他方のガラス板を重ねて前記開口部周辺をシールした後、波長 3 6 5 nm の U Vランプ (22W, 0. 34 A) を用いて紫外線を常温で 6時間照射して重合させることにより、架橋度が 2mol%の PAAゲルを作製した。尚、得られた PAAゲルの膨潤度は 30であった。実施例 2 (架橋度 3mol%の PAAゲルの製造例）

実施例 1と同様の方法で、伹し、架橋剤の量を 0. 6mol/L変えることにより、架橋度が 3 mo 1 %の P A Aゲルを作製した。得られた P A Aゲルの膨潤度は 26であった。比較例 1 (架橋度 2mol%の PMAAゲルの製造例）

実施例 1と同様の方法で、但し、モノマーをメタクリル酸に変えることにより、架橋度が 2mol%の PMAAゲルを作製した。試験例 1 (ヒト血管内皮細胞の接着性試験）

実施例 1及び比較例 1のハイド口ゲル（膨潤したゲル）の夫々にっき、 HEP ES緩衝液、次に平衡塩溶液 (Earl e's balanced salt solution)で浸透圧を調節した。次いで、オートクレープで滅菌した後、この滅菌ゲルを無血清培地で、 37 °Cの C〇₂インキュベータ一内に入れて、再び平衡膨潤させた。このゲルをセルに敷き、血清を含む培地に懸濁した内皮細胞をゲル上に播種した（4 X 10⁴個のヒト血管内皮細胞/ 1. 9 lcm²のゲル）。そして、それから 6時間経過した後のゲル上の内皮細胞の形態を調べた。その結果を図 1に示す。この図より分かるように、実施例 1の PAAハイド口ゲルは、伸展状態の細胞が 80%近くであり、浮遊状態の細胞が殆ど存在しなかったのに対し、比較例 1の PMAA ハイドロゲルは、伸展状態の細胞が 50%にも満たないことが判明した。試験例 2 (ヒト血管内皮細胞の増殖性試験）

実施例 1及び 2並びに比較例 1 (膨潤したゲル）の夫々にっき、 HEPES緩衝液、次に平衡塩溶液 (Earl e's balanced salt solution)で浸透圧を調節した。次いで、オートクレープで滅菌した後、この滅菌ゲルを無血清培地で、 37°Cの C〇₂インキュベーター内に入れて、再び平衡膨潤させた。このゲルをセルに敷き、血清を含む培地に懸濁した内皮細胞をゲル上に播種した（4X 10⁴個のヒト血管内皮細胞 /1. 9 lcm²のゲル）。そして、その後の伸展している細胞の数を経時的にカウントした。その結果を図 2に示す。図 2より分かるように、実施例 1及び 2の PAAハイドロゲルは、時間の経過と共に伸展状態にある細胞が順調に増殖し、また、実施例 1の PAAハイド口ゲルについては、コンフェルト状態にまで移行したが、比較例 1の PMAAハイド口ゲルは、時間の経過と共に細胞数が減少し、 100時間経過後にはすべての細胞が死滅した。尚、実施例 1の PAAハイドロゲルについては、更に 192時間後（8日間）まで細胞の様子を観察した。図 3は、捲いてから 6時間後（a) と 192時間後（b) のゲル上の細胞の様子を撮影したものである。試験例 3 (膨潤度と伸展率との関係試験）

実施例 1に記載の方法に準じ、膨潤度の異なる各種 PAA八ィドロゲルを製造し、上記試験例 1と同様にして、捲いてから 6時間経過後のゲル上の内皮細胞の形態を調べた。その結果を図 4に示す。図 4からわかるように、膨潤度が 20〜 30の範囲において、特に高い伸展率が観察された。実施例 3 {架橋度 2mol%の BC - PAAゲル（DNゲル）の製造 }

〈バクテリアセルロースの製造〉

Bacto Pepton 0. 5 %, Yeast Extract 0. 5 %、リン酸水素ニナトリウム 0. 27%、クェン酸 0. 115%、.グルコース 2%、の仕込みで脱イオン水に溶解し HS培地を得た。次いで、この培地を三角フラスコに 15〜30ml 程度の分量で取分けた後、フラスコにキャップをし、そのままオートクレープ滅菌を 120°C、 20分間行った。その後、 — 80でに保存してある酢酸菌（ATCC 53582) を取り出して培地に移した。そして、 28〜30°Cの間で約 2〜 3日間静置をすると、培地の空気界面側からバクテリアセルロースが生産始め、更に厚さが約 2匪になるまで培養を続けた。得られたバクテリアセルロースについて、 1% &〇11水溶液にょる洗浄を1日、更に純水による溶媒交換を 2日行った。尚、このパクテリアセルロースの膨潤度は 46であった。

〈ダブルネットワーク化〉

モノマーである lmol/Lのアクリル酸 (AA) 水溶液 40ml と、架橋剤である

0. 2mol/L の N, Ν' —メチレンビスアクリルアミド（ΜΒΑΑ) 水溶液 4ml と、開始剤である 0. lmol/Lの 2—ォキソダルタル酸水溶液 lmlとを合わせ、水で調整して 80ml の水溶液を得た。この水溶液を窒素ガスを用いて脱酸素した。つづいて、バクテリアセルロースをこの脱酸素水溶液に含浸させ、波長 365nm の UVランプ（22W， 0. 34 A) を用いて紫外線を常温で 6時間照射して重合させることにより、架橋度が 2moI% {(MBAA量 0. 2mol/lX 4ml/AA量 lmol/lX 40ml) = 2mol } の B C— AAダブルネットワークゲルを作製した。尚、ゲルの重合に関しては、実施例 1と同じ容器及び手順に従つた。このダブルネットワークゲルの膨潤度は 17であった。試験例 4 (ヒト血管内皮細胞の接着性 ·増殖性試験）

実施例 3の DNゲルにつき、試験例 1及び 2と同様の手順に従い、 4 X 10⁴個のヒト血管内皮細胞をゲル上に播いてから 6時間経過した後の、ゲル上の内皮細胞の形態を調べた。その結果を図 5に示す。この図より分かるように、このゲル上で伸展している細胞が 30%も見られた。更に長時間観察を続けると、約 9日後にサブコンフルェントに達した。実施例 5 (AA— AAm AAのトリプル（TN) ゲルの製造）

<シングルネットワーク型ゲルの作製 >

面積 1 0 OmmX 1 00蘭、厚さ 2腿のシリコン板からカッターで外辺長

80mmX 80顏、幅 5rai の枠を切りだし、枠の 1箇所 3匪の溝を空けた。このシリコン枠を 2枚の 10 OmmX 100mm、厚さ 3誦のガラス板に挟み、重合容器を組み立てた。

モノマーである 2mol/Lのアクリル酸（AA) 水溶液 40mlと、架橋剤である 0. lmol/L の N, N' ーメチレンビスアクリルアミド（MBAA) 水溶液 4ml と、開始剤である 0. lmol/Lの 2 _ォキソダルタル酸水溶液 lmlとを合わせ、水で調整して 80ml の水溶液を得た。この水溶液を窒素ガスを用いて脱酸素した。つづいて、この脱酸素水溶液を、上記重合容器の一方のガラス板に置かれたシリコン板の開口部に流し込み、シリコン板上に他方のガラス板を重ねて前記開口部周辺をシールした後、波長 365nm の UVランプ（22W， 0. 34 A) を用いて紫外線を常温で 6時間照射して重合させることにより、架橋度が 0. 511101%の八八ゲルを作製した。

<ダブルネットワーク型ゲルの製造 >

モノマ一である 2mol/Lのアクリルアミド（AAm) 水溶液 50mlと、架橋剤である 0. lmol/L の Ν， Ν' —メチレンビスアクリルアミド（ΜΒΑΑ) 水溶液 lml と、開始剤である 0. lmol/L の 2—ォキソダルタル酸水溶液 lml とを合わせ、水で調整して 200ml の水溶液（浸漬溶液）を得た。この浸漬溶液を窒素ガスを用いて脱酸素した。

次いで、前記浸漬溶液と前記シングルネットワーク型ゲル 4 gを、そのゲルより十分に大きな容量のシ一ル容器に入れた。この容器を 4 °Cの冷蔵庫に 24時間設置し、前記浸漬溶液中のモノマー、架橋剤および開始剤を前記ゲルに拡散，浸透させた。この工程において、浸漬液の濃度を一様にする目的で時々容器を静かに振盪した。

次いで、前記浸漬液からゲルを取り出し、適当の大きさに裁断した後、このゲルを幅 100龍 X長さ 10 OmmX厚さ 3丽の 2枚のガラス板の間に気泡が混入しないように挟持した。この 2枚のガラス板の周囲 4辺をシールした後、波長 365nm の UVランプ（22W， 0. 34 A) を用いて紫外線を常温で 6時間照射した。このとき、前記ゲル中に拡散した AAmモノマーが重合してダブルネットワーク型ゲルが得られた。このダブルネットワーク型ゲルの第二の網目構造の架橋度は、 0. 1モル％であった。

<トリプル型ゲルの製造 >

モノマーである 2 mol/L のアクリル酸水溶液 2 0 ml と、架橋剤である 0. lmol/L の N， N' —メチレンビスアクリルアミド（MBAA) 水溶液 4ml と、開始剤である 0. 1 mo 1/Lの 2 _ォキソダルタル酸水溶液 lmlとを合わせ、水で調整して 200ml の水溶液（浸漬溶液）を得た。この浸漬溶液を窒素ガスを用いて脱酸素した。

次いで、前記浸漬溶液と前記ダブルネットワーク型ゲル 4 gを、そのゲルより十分に大きな容量のシール容器に入れた。この容器を 4°Cの冷蔵庫に 24時間設置し、前記浸漬溶液中のモノマー、架橋剤および開始剤を前記ゲルに拡散 ·浸透させた。この工程において、浸漬液の濃度を一様にする目的で時々容器を静かに振盪した。

次いで、前記浸漬液からゲルを取り出し、適当の大きさに裁断した後、このゲルを幅 10 OmmX長さ 100匪 X厚さ 3mm の 2枚のガラス板の間に気泡が混入しないように挟持した。この 2枚のガラス板の周囲 4辺をシールした後、波長 365nm の UVランプ（22W, 0. 34 A) を用いて紫外線を常温で 6時間照射した。このとき、前記ゲル中に拡散した A Aモノマーが重合してトリプル型ゲルが得られた。このトリプル型ゲルの第三の網目構造の架橋度は、 1モル％であった。実施例 6 (A A— A Am— A Aのトリプル（TN) ゲルの製造）

トリプル型ゲルの製造工程において、 MB AAを 6ml 甩ぃたことを除き、実施例 5と同様の方法で、標記ゲルを製造した。このトリプル型ゲルの第三の網目構造の架橋度は、 1. 5モル％であった。試験例 5 (ヒト血管内皮細胞の接着性 ·増殖性試験）

実施例 5及び 6の TNゲルにつき、試験例 1と同様の手順に従い、 4 X 10⁴個のヒト血管内皮細胞をゲル上に播いてから 6時間経過した後の、ゲル上の内皮細胞の形態を調べた。その結果を図 7に示す。この図より分かるように、このゲル上で伸展している細胞が 40%も見られた。更に、実施例 6の TNゲルにっき、試験例 2と同様の手順に従い、更に長時間観察を続けると、 144時間後にコンフルェントに達した。

Claims

請求の範囲

1. ポリアクリル酸ハイド口ゲルからなる、細胞接着 ·増殖性材料。

2. 架橋度が 0. 5〜2. 5mol%の範囲である、請求の範囲第 1項記載の細胞接着 ·増殖性材料。

3. ポリアクリル酸ハイド口ゲルの膨潤度が 20〜30である、請求の範囲第 1項又は第 2項記載の細胞接着 ·増殖性材料。

4. 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか一項記載の細胞接着 ·増殖性材料を用いた医療具。

5. 人工血管又は細胞培養用テンプレートである、請求の範囲第 4項記載の医療具。