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WO2004111203A1 - 哺乳動物培養細胞抽出液およびその調製方法、ならびに該抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法 - Google Patents

哺乳動物培養細胞抽出液およびその調製方法、ならびに該抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法 Download PDF

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Publication number
WO2004111203A1
WO2004111203A1 PCT/JP2004/008422 JP2004008422W WO2004111203A1 WO 2004111203 A1 WO2004111203 A1 WO 2004111203A1 JP 2004008422 W JP2004008422 W JP 2004008422W WO 2004111203 A1 WO2004111203 A1 WO 2004111203A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
extract
protein synthesis
cultured
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2004/008422
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takashi Suzuki
Toru Ezure
Masaaki Ito
Shoken Higashide
Koki Endo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shimadzu Corp
Original Assignee
Shimadzu Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shimadzu Corp filed Critical Shimadzu Corp
Priority to EP04745964A priority Critical patent/EP1634947A4/en
Priority to JP2005506975A priority patent/JP4389870B2/ja
Priority to US10/559,500 priority patent/US20060141559A1/en
Publication of WO2004111203A1 publication Critical patent/WO2004111203A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a cell-free protein synthesis method using a cultured mammalian cell extract, and a method for preparing the extract.
  • an expression system (hereinafter, sometimes referred to as a “cell system”) using living cells such as yeast or mammalian cultured cells by genetic recombination technology is widely used.
  • living cells maintain their self-function (there is a tendency to exclude foreign proteins, and expression of cytotoxin proteins in living cells makes many proteins difficult to express, such as cells not growing).
  • a genetic information translation system of an organism is prepared in a test tube by adding a substrate or an enzyme to the cell lysate / extract, and the target protein is encoded.
  • Cell-free protein synthesis is known in which an mRNA is used to reconstruct a synthetic system in which amino acids can be linked in a desired order to the required number of residues. In such a cell-free protein synthesis, under the constraints of the above-mentioned cell-based protein synthesis, it is possible to ⁇ Because no manipulation is required, protein synthesis can be performed in a shorter time than cell lines. Can be performed.
  • cell-free protein synthesis is expected to be a promising expression method because it enables mass production of proteins consisting of amino acid sequences not used by living organisms;
  • the use of various cell lysates or extracts for cell-free protein synthesis has been studied and research is under way.
  • the heron reticulocyte system involves a very complicated procedure of subcutaneously injecting an acetyl phenylhydrazine solution into the heron, and 4-5 days after administration, collecting blood from the ear of the heron and preparing a lysate therefrom.
  • the extract is prepared by crushing the cells by depressurizing the CHO under pressure in an atmosphere of an inert gas to prepare an extract. Equipment is required.
  • the protein synthesis ability in a cell-free system is greatly affected by the number of cells, gas pressure, and pressurization time during the preparation of the extract, complicated operations are required to set the conditions.
  • the amount of protein that can be synthesized is very small, and the protein synthesis activity can be measured only by incorporation of the radiolabeled amino acid. Therefore, development of an extract that is easy to prepare and has a high protein synthesis amount derived from mammalian cultured cells and a method for preparing the same has been desired.
  • the present invention has been made in order to solve the above-mentioned problems, and an object of the present invention is to prepare a mammalian culture for cell-free protein synthesis that is easy to prepare and has a higher protein synthesis amount than before.
  • An object of the present invention is to provide a method for preparing a cell extract, a mammalian cell extract, and a cell-free protein synthesis method using the mammalian cell extract.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, completed the present invention. That is, the present invention is as follows.
  • a method for preparing a cultured milk cell extract comprising at least a step of rapidly freezing mammalian cultured cells suspended in a liquid for extraction.
  • the preparation method according to claim 7, wherein the cultured mammalian cells are cultured cells derived from Chinese hamster ovary (GHO).
  • FIG. 1 is a graph showing the experimental results of Example 2 and shows a heat retention step with respect to the amount of synthesis (for a certain period of time before the synthesis reaction was carried out in a state where components other than foreign mRNA were contained in the cell-free protein synthesis reaction solution). The effect of the presence or absence of heat retention is shown.
  • FIG. 2 is a graph showing the experimental results of Example 2, and shows the influence of the composition of the reaction solution and the retention time in the heat retaining step on the synthesis amount.
  • the present invention relates to a method for preparing a cultured mammalian cell extract by extracting from cultured mammalian cells, wherein the cultured mammalian cells suspended in the extracting solution are rapidly frozen: Its major feature is that it is contained.
  • a cultured mammalian cell extract by such a method, cells can be crushed in a more relaxed state as compared with the conventional method described in Patent Document 1, and the cell-free Since essential components for system protein synthesis can be taken out of cells without destroying them, it is possible to easily prepare a mammalian cell culture extract with a higher protein synthesis amount in a cell-free system than before. Wear. Further, according to the method of the present invention, contamination of RNase or the like from used equipment or the like can be prevented.
  • rapidly freezing refers to freezing cultured mammalian cells for 10 seconds or less, preferably 2 seconds or less.
  • the temperature at which the cultured mammalian cells are rapidly frozen is usually ⁇ 80 ° C. or lower, preferably ⁇ 150 ° C. or lower. Rapid freezing at temperatures exceeding -80 ° C tends to inactivate the components essential for protein synthesis and reduce the protein synthesis ability.
  • the rapid freezing of the cultured mammalian cells can be achieved by using, for example, an inert gas such as liquid nitrogen or liquid helium, but is preferably performed using easily available and inexpensive liquid nitrogen.
  • an inert gas such as liquid nitrogen or liquid helium
  • thawing may be performed, for example, by thawing in a 10 ° C to 20 ° C water bath or an ice water bath, and at room temperature (25 ° C).
  • 0 ° C to 20 ° C (particularly 4 ° C
  • the thawing is preferably carried out in a water bath or an ice water bath at 110 ° C.).
  • Centrifugation of the thawed cultured mammalian cells is carried out under conditions commonly used in the art (10,000 X g to 50, OOO X g, 0 ° C to 10 ° C, 10 minutes to 60 minutes). Just go.
  • the cultured mammalian cells used in the present invention are not particularly limited, and for example, conventionally known cultured cells derived from appropriate mammals such as humans, rats, mice, and monkeys can be used.
  • the cultured mammalian cells of the present invention may be cells derived from any tissue, and include, for example, blood cells, gonad-derived cells, lymphoma (lymphoma) -derived cells, other tumor cells, and stem cells. Can be used without restriction. Among them, lymphoma-derived cells are preferably used because suspension culture is possible and culturing and subculture are easy. In addition, CHQ cells can be cultured not only in suspension culture but also in serum-free medium, which facilitates culture and passage. Furthermore, CHO cells are preferably used because they are widely used in cell systems, have high protein synthesis ability, and can expect the same in cell-free systems.
  • the extraction solution used in the preparation method of the present invention is not particularly limited, but preferably contains at least a protease inhibitor.
  • the use of an extract containing a protease inhibitor inhibits the activity of proteases contained in extracts derived from cultured mammalian cells, and prevents the protease from undesirably degrading active proteins in the extracts.
  • the protease inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of protease, for example, phenylmethanesulfonyl fluoride (hereinafter, may be referred to as rPMSFj), aprotinin, bestatin, and leudium.
  • rPMSFj phenylmethanesulfonyl fluoride
  • aprotinin bestatin
  • leudium leudium.
  • pepstatin A E-64 (L-trans-epoxysuccinylleucylamide-4-guanidine / butane), ethylenediaminetetraacetic acid, phosphoramidone, etc.
  • protease inhibitor which acts as an inhibitor having high specificity for the serine protease.
  • protease inhibitor cocktail a mixture of several kinds
  • the extraction solution used in the present invention preferably contains at least a potassium salt, a magnesium salt, dithiothreitol, and a buffer in addition to the protease inhibitor. ! The potassium salt is not particularly limited as long as it does not inhibit the action of the present invention.
  • potassium acetate, potassium carbonate, potassium hydrogen carbonate, potassium chloride, dipotassium hydrogen phosphate, dipotassium hydrogen citrate It can be used in a general form such as potassium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, potassium iodide, potassium phthalate, and among others, potassium acetate is preferred.
  • Potassium salts act as cofactors in protein synthesis reactions.
  • the content of the potassium salt in the extraction solution is not particularly limited, but from the viewpoint of storage stability, for example, in the case of a monovalent potassium salt such as potassium acetate, the content is preferably 10 mM to 500 mM. More preferably, the content is 20 mM to 300 mM.
  • the magnesium salt is not particularly limited as long as it does not inhibit the action of the present invention.
  • examples thereof include magnesium acetate, magnesium sulfate, magnesium chloride, magnesium citrate, magnesium hydrogen phosphate, magnesium iodide, and magnesium lactate. It can be used in a general form such as magnesium nitrate, magnesium oxalate, etc. Among them, it is preferable to use magnesium acetate.
  • Magnesium salts also act as cofactors in the protein synthesis reaction.
  • the content of the magnesium salt in the extraction solution is not particularly limited, but from the viewpoint of storage stability, for example, in the case of a divalent salt such as magnesium acetate, the content may be 0.1 mM to 1 OmM. More preferably, it is contained in the range of 0.5 mM to 5 m
  • the above dithiothreitol (hereinafter sometimes referred to as “DTT”) is compounded for the purpose of preventing oxidation, and is preferably contained in the extraction solution in a range of 0.1 mM to 10 mM. And more preferably 0.5 mM to 5 mM.
  • a buffer include, but are not particularly limited to, HEPES-KOH, Tris-HCI, sodium acetate monoacetate, sodium citrate monohydrate, phosphoric acid, boric acid, MES, PIPES, etc. Can be.
  • Buffering agent the P H of the obtained extract to use something like held in the 4 to 1 0 to use something like good Mashigu pH is maintained in the 6 to 8.5 Is more preferred. If the pH of the extract is less than 4 or the pH exceeds 10, the components essential for the reaction of the present invention may be denatured. From such a viewpoint, it is particularly preferable to use HEPES-KOH (pH 6 to 8.5).
  • HEPES-KOH pH 6 to 8.5
  • the content of the buffer in the extraction solution is preferably 5 mM to 200 mM, more preferably 10 mM to 100 mM. preferable.
  • the calcium salt is not particularly limited as long as it does not inhibit the action of the present invention. Examples thereof include calcium chloride, calcium acetate, calcium sulfate, calcium citrate, calcium iodide, calcium lactate, and calcium lactate.
  • calcium chloride is preferably used.
  • the content of calcium chloride is not particularly limited, but is preferably 0.1 mM to 10 mM, and more preferably 0.5 mM to 5 mM, from the viewpoint that the effect of improving the protein synthesis ability can be effectively exhibited. More preferably, it is contained.
  • the amount of glycerol added is not particularly limited.From the viewpoint that the effect of improving the protein synthesis ability can be effectively exerted, 5 (v / v)% to 80 (v / v )% Is preferred to be added 10 (v / v)% ⁇
  • the procedure from cell disruption to obtaining a cultured mammalian cell extract for cell-free protein synthesis is not particularly limited.
  • the supernatant after centrifugation (supernatant 1) is directly used for mammalian culture.
  • Cell extract may be used, or supernatant 1 may be further centrifuged and the resulting supernatant (top Clarified 2) may be used as a mammalian cell extract.
  • the conditions for centrifugation of the supernatant 1 are the same as those described above (10,000 X g to 50, OOO X g, 0 ° C to 10 ° C, 10 minutes to 60 minutes). Just do it.
  • gel filtration may be performed, and a fraction near the highest absorbance at 280 nm from the filtrate after gel filtration may be fractionated to prepare an extract.
  • the following procedure may be performed.
  • a buffer having a conventionally known appropriate composition can be used without any particular limitation. For example, 1 OmM to 100 mM HEPES-KOH (pH 6 to 8.5), 20 mM to 20 mM 300 mM potassium acetate, 0.5 mM to 5 mM magnesium acetate, 0.5 ml!
  • a gel filtration buffer containing 55 mM DTT, 0.01 mM to 5 mM PMSF can be used.
  • the filtrate obtained by gel filtration can efficiently elute fractions with a high protein synthesis capacity of 0.1 m to 1 mL as one fraction. From the viewpoint of good fractionation, it is preferable that 0.4 mL to 0.6 mL be one fraction.
  • fractions having an absorbance of 10 or more at 280 nm are collected from the filtrate after gel filtration.
  • This processing for example using a device such as Ultrospe C 3300p rO (manufactured by Amersham Biosciences), for each fraction the absorbance was measured in the 280 nm, a sample was collected highest near fractions this absorbance, this Use as an extract.
  • the cultured mammalian cells to be subjected to the preparation method of the present invention are preferably washed with a washing solution before the rapid freezing, in order to avoid bringing the culture medium used for culture into the translation reaction solution. .
  • the composition of the washing solution may be the same as the composition of the above-mentioned extraction solution. Washing with a washing solution is performed by adding the washing solution to the cultured mammalian cells and centrifuging (eg, 700 X g , 10 minutes, 4 ° C).
  • the volume of the washing solution used for washing is preferably 5 mL to 100 mL per 1 g of cultured mammalian cells with a wet weight of 1 g, more preferably 10 mL to 50 mL, because the medium is completely washed away. .
  • the number of times of washing is preferably 1 to 5 times, more preferably 2 to 4 times.
  • the amount of cultured mammalian cells used in the preparation method of the present invention is not particularly limited, but is 0.1 g to 5 g per 1 mL of the extraction liquid in order to keep the extraction efficiency optimal. Is preferred. ⁇ 0.5 g to 2 g is more preferred.
  • the cultured mammalian cell extract prepared by the method of the present invention can be suitably used for cell-free protein synthesis.
  • the cultured mammalian cell extract preferably contains an extract derived from cultured mammalian cells at a protein / protein concentration of 1 mg / mL to 200 mgZmL. L OmgZmL ⁇ !! More preferably OOmgZmL.
  • the effect of the present invention may be such that the concentration of the essential components may be low and a sufficient synthesis reaction may not be performed. If the content protein concentration of the substance exceeds 200 mgZmL, the extract itself has high viscosity, which may make it difficult to operate.
  • the content of the extract derived from cultured mammalian cells in the extract is determined by measuring the protein concentration, for example, by measuring the protein concentration using a BCA Protein assay Kit (manufactured by PIERCE). It is determined. Specifically, add 0.1 mL of the sample to 2 mL of the reaction reagent, react at 37 ° C for 30 minutes, and use a spectrophotometer (Ultrospec3300 pro, manufactured by Amersham Bioscience) at 562 nm. As a control, normal serum albumin (BSA) is used, and a calibration curve is prepared. It can be measured by such a method.
  • BSA normal serum albumin
  • the extract of the present invention contains an extract derived from cultured mammalian cells at a protein concentration of 1 OmgZmL to 1OOmgZmL, 20 mM to 300 mM potassium acetate, 0.5 mM to 5 mM magnesium acetate, 0.5 mM to 5 mM. . DTT, of 0 01 mM ⁇ 5 mM of PMSF, 1 OmM ⁇ : I OOmM0HEPES- KOH (. P H6 ⁇ 8 5) preferably implemented to contain.
  • the present invention also provides a cell-free protein synthesis method using the above extract.
  • any protein for example, a protein that becomes cytotoxic in living cells, can be synthesized in a short time. It becomes.
  • an extract derived from eukaryote cultured mammalian cells is used, it is possible to synthesize glycoproteins in a cell-free system, and it is possible to synthesize many types of proteins without any particular limitation. be able to.
  • the cell-free protein synthesis reaction in the present invention refers to a protein synthesis reaction using only a cell-free translation system that reads information of mRNA and synthesizes a protein.
  • the composition of the cell-free protein synthesis reaction solution prepared using the extract obtained by the method of the present invention is not particularly limited, and a conventionally known composition may be appropriately selected. Is preferably 10 (vZv)% to 80 (vZv)%, particularly preferably 30 (v / v) 0 / & to 60 (vZv)%.
  • the content of the extract derived from cultured mammalian cells in the entire reaction solution is adjusted to be 0.1 mgZmL to 160 mgZmL in protein concentration, preferably 3 mg / mL to 60 mg / mL. More preferably, it is prepared to be mL. If the content of the extract is less than Q.I mgZmL or more than 160 mgZmL in protein concentration, the synthesis rate of the target protein may be reduced.
  • the cell-free protein synthesis reaction solution contains exogenous mRNA, potassium salt, magnesium salt, DTT, adenosine triphosphate, guanosine triphosphate, creatine phosphate, as components excluding the extract obtained by the method of the present invention.
  • the exogenous mRNA used in the above reaction solution refers to the mRNA not derived from the cultured mammalian cells used to prepare the extract, and if the mRNA is not derived from such cultured mammalian cells, the encoded protein (peptide ) May be one that encodes a toxic protein / protein, or one that encodes a glycoprotein / protein.
  • mRNA contained in the reaction mixture is exogenous mRNA or mRNA derived from cultured mammalian cells used to prepare the extract is determined by first isolating and purifying mRNA from the reaction mixture. Thereafter, cDNA can be synthesized by reverse transcriptase, and the nucleotide sequence of the obtained cDNA can be determined by comparing the nucleotide sequence with that of a known foreign mRNA.
  • the exogenous mRNA used in the reaction solution is not particularly limited in the number of bases, and all mRNAs need not have the same number of bases as long as the target protein can be synthesized.
  • Each mRNA may have a plurality of bases deleted, substituted, inserted or added as long as the sequences are homologous to the extent that the target protein can be synthesized.
  • Foreign mRNA used in the present invention may be a commercially available, a commercially available vector OR F (Open reading frame) of the protein of interest, e.g., pT N T Vector (Promega) for 5 'single ⁇ -globin leader It may be inserted downstream of one sequence, and the mRNA obtained by the transcription reaction using this may be used.
  • a foreign mRNA having a cap structure added by adding a methylated ribonucleotide or the like during the transcription reaction may be used.
  • the exogenous mRNA preferably contains 1 / mL to 1 000; U gZmL, more preferably 10 gZmL to 500 ⁇ gZmL, . If the amount of exogenous mRNA is less than 1 ⁇ gZmL or more than 1,000 ⁇ gZmL, the rate of protein synthesis tends to decrease.
  • the potassium salt in the reaction solution the various potassium salts described above as a component of the extraction solution, preferably potassium acetate, can be preferably used.
  • the potassium salt is preferably contained in the reaction solution at 10 mM to 500 mM, more preferably at 20 mM to 300 mM, from the same viewpoint as in the case of the potassium salt in the extraction solution described above.
  • the various magnesium salts described above as components of the extraction solution preferably magnesium acetate, can be preferably used.
  • the magnesium salt is preferably contained in the reaction solution at a concentration of 0.5 mM to 5 mM, preferably from 0.5 mM to 5 mM. Is more preferable.
  • the DTT in the reaction solution is preferably contained in the range of 0.1 mM to 10 mM, more preferably in the range of 0.5 mM to 5 mM, from the same viewpoint as the DTT in the extraction solution described above.
  • Adenosine triphosphate (hereinafter sometimes referred to as “ATPJ”) in the reaction solution is preferably contained at 0.01 mM to 10 mM in the reaction solution from the viewpoint of the rate of protein synthesis. 0.1% to 5 mM is more preferable, and if ATP is less than 0.01 mM or exceeds 10 mM, the protein synthesis rate power tends to decrease.
  • GTP guanosine triphosphate
  • the reaction solution is preferably contained at 0.01 mM to 10 mM in the reaction solution, More preferably, the content is 0.05 mM to 5 mM. If GTP is less than 0.01 mM or exceeds 10 mM, the rate of protein synthesis tends to decrease.
  • Creatine phosphate in the reaction solution is a component for continuously synthesizing proteins. There, it is formulated for the purpose of regenerating ATP and GTP.
  • creatine phosphate is preferably contained in the reaction solution at 1 mM to 200 mM, more preferably at 10 mM to 100 mM. If the creatine phosphate is less than "I mM", a sufficient amount of ATP and GTP are not easily regenerated, resulting in a decrease in the rate of protein synthesis. If it exceeds, creatine kinase in the reaction solution is a component for continuously synthesizing the protein, and creatine kinase, together with creatine phosphate, tends to act as an inhibitor and reduce the rate of protein synthesis. Formulated for the purpose of regenerating ATP and GTP.
  • creatine kinase is preferably contained in the reaction solution in an amount of 1 J 1g mL to 1 000 ⁇ gZmL, and more preferably 10 ⁇ gZmL to 500 j «gZmL in the reaction solution. More preferred. If the creatine kinase is full of 1 g / mL *, a sufficient amount of ATP and GTP are not easily regenerated, resulting in a decrease in the rate of protein synthesis. If it exceeds, it acts as an inhibitor, and the rate of protein synthesis tends to decrease.
  • the amino acid component in the reaction solution was composed of 20 kinds of amino acids, namely, palin, methionine, glutamic acid, alanine, leucine, phenylalanine, glycine, proline, isoleucine, tributan, asparagine, serine, tolenin, histidine, and asparagine. It contains at least 20 kinds of amino acids: acid, oral synth, lysine, glutamine, cystine, and arginine.
  • the amino acids also include radioisotope-labeled amino acids. Furthermore, if necessary, it may contain a modified amino acid.
  • the amino acid component generally contains approximately equal amounts of each type of amino acid.
  • the above-mentioned amino acid component power is preferably contained in the reaction solution ⁇ 1; UM to 10000 ⁇ , preferably 10 iM to 200 ⁇ . Is more preferable.
  • the amount of the amino acid component is less than 1 ⁇ m or exceeds 1 000 mm, the rate of protein synthesis tends to decrease.
  • the RNase inhibitor in the reaction solution is undesirably digested by the RNase derived from mammalian cultured cells mixed in the extract during the cell-free protein synthesis of the present invention, whereby the foreign mRNA and tRNA are undesirably digested, and the protein It is blended for the purpose of preventing the synthesis from being hindered, and preferably contains 0.1 UZL to 100 UZjtL in the reaction solution.It contains 0.5 UZjU to IOUZ JUL. And more preferred. If the RNase inhibitor is less than 0.1 U / 1_, RNase degradation activity tends to be unable to be sufficiently suppressed. If the RNase inhibitor exceeds 10 OUZ / L, it tends to harm the protein synthesis reaction.
  • the tRNA in the reaction solution corresponds to the above 20 kinds of amino acids, and contains approximately equal amounts of the t: kinds of tRNA.
  • the reaction solution preferably contains 1 / gZmL to 1 000 gZmL, more preferably 10 g / mL to 500 gZmL. If the tRNA force is more than ⁇ gZm or more than 100 gZmL, the rate of protein synthesis tends to decrease.
  • the buffer contained in the reaction solution those similar to the above-mentioned extract of the present invention can be suitably used, and for the same reason, HEPES-KOH (pH 6 to 8, 5) is preferably used. , No.
  • the buffer preferably contains 5 mM to 200 mM, more preferably 1 OmM to 100 Mm. Further, it is preferable that spermidine is further added to the reaction solution for the purpose of improving the translation reaction rate.
  • Spermidine is preferably contained in the reaction solution at a concentration of 0.01 mM to 10 ⁇ , more preferably 0.05 mM to 5 mM, and when spermidine is less than 0.01 mM, sufficient translation is achieved. This is because there is a tendency that the promoting ability is not recognized, and that if spermidine exceeds 1 OmM, it tends to inhibit the protein synthesis reaction. Further, in the reaction solution, it is preferable that calcium salt is added.
  • the various calcium salts described above as components of the liquid for extraction can be preferably used.
  • the calcium salt is added to the above-mentioned extraction solution.
  • the reaction solution preferably contains 0.05 mM to 1 OmM, and more preferably 0.1 mM to 5 mM. That is, as a reaction solution using the extract obtained by the method of the present invention, the extract contains 30 (vZv)% to 60 (vZv)%, 20 mM to 300 mM potassium acetate, 0.5 mM to 5 mM magnesium acetate, 0.5 ml!
  • TT5 mM DTT 0.1 mM-5 mM ATP, 0.05 mM-5 mM GTP, 10 mM-100 mM creatine phosphate, 10 ⁇ g Zm and 500 ⁇ g / mL creatine kinase, 10 ⁇ M ⁇ ⁇ 200 ⁇ amino acid component, 0.5 UZ ⁇ L ⁇ 1 OUZ ⁇ L RNase inhibitor, 10 ⁇ gZmL ⁇ 500 ⁇ gZmL tRNA, 10 gZmL ⁇ 500 ⁇ g mL foreign mRNA, 10 mM ⁇ 1 OOmM It is preferably realized to contain HEPES-KOH (pH 6-8.5).
  • the present invention is further realized so as to further contain 0.05 mM to 5 mM spermidine and 0.1 mM to 5 mM calcium chloride in addition to the above.
  • the cell-free protein synthesis reaction using the above reaction solution is performed in a conventionally known, for example, low-temperature constant temperature bath.
  • the reaction temperature is usually in the range of 10 ° C to 40 ° C, preferably 20 ° C to 30 ° C. If the reaction temperature is lower than 10 ° C, the rate of protein synthesis tends to decrease, and if the reaction temperature exceeds 40 ° C, essential components tend to be denatured.
  • the reaction time is generally 1 hour to 72 hours, preferably 3 hours to 24 hours.
  • the heat retention time is usually in the range of 0 ° C to 50 ° C, preferably 15 ° C to 37 ° C. If the heat retention temperature is less than 0 ° C, the effect of heat retention will not be obtained, and if the heat retention temperature exceeds 50 ° C, essential components will tend to be denatured.
  • the heat retention time is generally 1 minute to i 20 minutes, preferably 10 minutes to 60 minutes.
  • the amount of the synthesized protein can be measured by measuring the activity of the enzyme, SDS-PAGE, immunoassay and the like.
  • the protein that can be synthesized by the cell-free protein synthesis method of the present invention is not particularly limited.
  • Reference Example 1 Culture of cultured mammalian cells (derived from lymphoma)
  • the washing solution having the above composition was suspended in an extraction solution (cooled to 4 ° C.) prepared by adding 0.57 mL of 0.5 mM PMSF and 20% glycerol. This suspension was frozen rapidly (2 seconds) in liquid nitrogen. After thorough freezing, they were thawed in a water bath at about 10 ° C. After thawed completely, the mixture was centrifuged at 30,000 X g at 4 ° C for 10 minutes (himacCR20B3, manufactured by Hitachi, Ltd.) to remove the residue, and the supernatant was recovered. The resulting supernatant was further centrifuged (4 ° C, 30, OOO X g, 30 minutes), and the recovered supernatant was used as a mammalian cultured cell extract.
  • Reference Example 2 Preparation of foreign mRNA
  • pGEM-luc Vector (manufactured by Promega) 5 ng is a type I, and has a primer (Luc T7-F3-Kpn) having a base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in Sequence Listing Using a primer (Luc T7-R4-Kpn) and KODplus (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), PCR was carried out for 30 cycles at 97 ° C 15 ° 55 ° C 30 ° 68 ° C1 20 °>. After purifying the DNA fragment by ethanolosole precipitation, it was digested with Kpnl.
  • E. coli DH5 (Toyobo) was transformed.
  • Plasmid DNA prepared from the transformed Escherichia coli by the alkaline SDS method was purified using a primer (T7 promoter) having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS (manufactured by Applied Biosystems).
  • T7 promoter the primer having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS (manufactured by Applied Biosystems).
  • a sequencing reaction 96 ° C. for 10 seconds, 50 ° C. for 5 seconds, 60 ° C. for 4 minutes, 30 cycles.
  • This reaction solution was applied to an ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (manufactured by Applied Biosystems) to analyze the nucleotide sequence.
  • RQ1 RNase free DNase (promega) was added to 20 ⁇ L of the reaction solution after the transcription reaction, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 15 minutes to digest type I DNA. After removing the protein by phenolic mouth-mouth extraction, potassium acetate was added to a final concentration of 0.3 M and ethanol precipitation was performed. The obtained precipitate was dissolved in 100 ⁇ L of sterile water, applied to a Nick Column (Amersham / Kyo Science), and eluted with 400 ⁇ of sterile water. Potassium acetate was added to a final concentration of 0.3 ⁇ , and ethanol precipitation was performed, and the amount of synthesized mRNA was determined by measuring the absorbance at 260 nm.
  • luciferase atsushi kit E-1500, manufactured by Promega.
  • reaction solution 2.5 ⁇ L was added to 50 ⁇ L of luciferase assay reagent, and luminescence by luciferase was measured using a luminometer (Tuner Designs TD-20Z20, manufactured by Promega).
  • Mammalian cultured cells L51 78Y-S cultured in the same manner as in Reference Example 1 were washed with the same washing solution as in Example 1, and then suspended in the extraction solution cooled to 4 ° C as in Example 1. . Thereafter, the same operation as in Example 1 was performed except that extraction was performed with vigorous stirring for 5 minutes.
  • the cell-free protein synthesis reaction was performed using the mRNA prepared in Reference Example 2 with the same reaction solution composition as in Experimental Example 1.
  • luciferase was 10 ngZmL, which was about 1/50 of that of Experimental Example 1.
  • Reference Example 3 Culture of mammalian cultured cells (CHO) Triangle containing 200 mL of Chinese hamster ovary cells CHO K1-SFM (purchased from Tohoku University Institute of Aging and Medicine, Medical Cell Resource Center) at a cell concentration of 4.9 10 5 cells / mL, CHO SERUM-FREE MEDIUM (SIGMA) in a flask (500mL) 130rpm ⁇ 37 ° C ⁇ 5% C0 2 atmosphere and incubated for 120 hours. As a result, the cell concentration was 8.8 ⁇ 10 6 cdls / m and the wet weight was 3.2 g.
  • GHO mammalian cell
  • the cultured animal cells cultured in Reference Example 3 above were collected by centrifugation (700 X g , 10 minutes), and washed three times with a washing buffer having the following composition (700 X g , 10 minutes). Centrifugation). (Composition of washing buffer)
  • This cell suspension was rapidly frozen in liquid nitrogen. After sufficient freezing, they were thawed in an ice bath at about 4 ° C. After complete thawing, centrifuge at 4 ° C, 30000 X g for 10 minutes (himac CR20B3, manufactured by Hitachi, Ltd.) to remove cell debris, and the supernatant S1 was recovered. The resulting supernatant S1 was further centrifuged (4 ° C., 30,000 ⁇ g, 30 minutes), and then the supernatant S2 was recovered. The supernatant S2 was applied to PD-10 (manufactured by Amersham) equilibrated with a desalting buffer having the following composition.
  • the fraction was eluted with a desalting buffer, and a fraction having an absorbance of 30 or more at 280 nm was collected using a spectrophotometer (Ultrospec3300pro, manufactured by Amersham Biosciences). GHO) extract.
  • Example 1mM DTT 2 Cell-free protein synthesis using mammalian cell culture (GHO) extract
  • the mammalian cultured cell (GHO) extract prepared in Example 2 was first mixed with components other than the exogenous mRNA in the reaction solution composition of the following composition, and incubated at 25 ° C. for 30 minutes. Then, the exogenous mRNA synthesized in Reference Example 2 was added, and protein synthesis was performed in a cell-free system.
  • GHO mammalian cultured cell
  • ATP (manufactured by Sigma), GTP (manufactured by Sigma), and amino acids (20 types) (manufactured by Sigma) were used, respectively.
  • a low-temperature aluminum block thermostat MG-1000 was used as a reactor. The amount of the reaction solution was 25, the reaction temperature was 25 ° C., sampling was performed every reaction time, and the amount of the synthesized luciferase was measured. The synthesized luciferase was quantified using a luciferase assay kit (E-1500, manufactured by Promega).
  • SEQ ID NO: 1 is a primer Luc T7-F3-Kpn
  • SEQ ID NO: 2 is a primer Luc T7-R4-Kpn
  • SEQ ID NO: 3 is a primer T7 promoter.

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Abstract

抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有する、哺乳動物培養細胞抽出液の調製方法、および該方法で調製された哺乳動物培養細胞抽出液、ならびに該抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法。好ましくは、該無細胞系タンパク質合成方法は、合成反応を行う前に無細胞系タンパク質合成反応液に外来mRNA以外の成分を含んだ状態で一定時間の保温工程を含む。

Description

明細書 , 哺乳動物培養細胞抽出液およびその調製方法、ならびに該抽出液を用いた無細胞系 タンパク質合成方法
技術分野
本発明は、哺乳動物培養細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法、ならび に上記抽出液の調製方法に関する。
背景技術
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、 ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム 創薬が注目を集めて,いる。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応 用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要と なってくる。
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や哺乳動物培養 細胞などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用され ている。しかし、生細胞は自己機能を維持するため (こ外来タンパク質を排除する傾向 があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困 難なタンパク質も多い。
一方、細胞系を使用しなし、タンパク質の生産方法として、細胞破碎液ゃ抽出液に基 質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り揃え、目的の タンパク質をコードする mRNAを用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合さ せることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。こ のような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を 受けに《、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うこと力でき、またタンパク質 の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合 成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質合成では、生命体が利用していない アミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法で あると期待さ; Ιτている。このような無細胞系のタンパク質合成に供する細胞破砕液や 抽出液として、種々の生物由来のものを使用することが検討され、研究が進められて いる。
無 ½胞系タンパク質合成用抽出液としては、従来より様々なものが知られている力 翻訳後の糖鎖修飾などを考慮すると、ヒトタン/ ク質を完全な活性を保持した状態で発 現させ得るため、ヒ卜細胞により近縁な哺乳動物培養細胞由来の抽出液であることが 望ましいと考えられる。現在、哺乳動物培養細胞由来の無細胞系タンパク質合成用抽 出液としては、ゥサギ網状赤血球の系 (たとえば、非特許文献 1： Pelham et al., Eur. J. Biochem. 67， 247- 256(1976)参照）、 Chinese hamster ovary (CHO)の系（たとえば、特 許文献 1 :特開 2000— 325076号公報参照)が報告されている。
しかしながら、ゥサギ網状赤血球の系では、ゥサギにァセチルフエニルヒドラジン溶 液を皮下注射し、投与 4〜5日後にゥサギの耳から採血し、そこからライセートを調製 するという非常に煩雑な操作を伴う。また、 CHOの系では、不活性ガスの雰囲気中、 加圧下の CHOを減圧させることによって細胞を破砕して、その抽出液を調製するが、 この方法では、抽出液の作製に際し特別な装置や器具が必要である。さらに、抽出液 調製時の細胞数やガス圧、加圧時間によって無細胞系でのタンパク質合成能が大きく 影響されるため、条件設定に煩雑な操作を要する。また、かかる方法によって得られた 抽出液では、合成できるタンパク質の量は極めて少なぐ放射能標識を行ったアミノ酸 の取り込みによってのみ、.そのタンパク質合成活性を測定できるという程度である。 このため、調製が容易であり、かつタンパク質合成量の高い哺乳動物培養細胞由来 抽出液およびその調製方法の開発が望まれている。
発明の開示
発明の目的 本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところ は、調製が容易であり、かつ従来よりもタンパク質合成量の高い無細胞系タンパク質 合成用の哺乳動物培養細胞抽出液の調製方法、および該哺乳動物培養細胞抽出液、 ならびにこの哺乳動物培養細胞抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提 供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成する に至った。即ち、本発明は以下のとおりである。
( 1 )抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含 有する、 «乳動物培養細胞抽出液の調製方法。
(2)さらに急激に凍結させた後、哺乳動物培養細胞を解凍し、遠心分離する工程を含 む、請求項 1に記載の調製方法。
(3)急激な凍結が、液体窒素によって行われるものである、請求項 1ま は 2に記載の 調製方法。
(4)急激に凍結された哺乳動物培養細胞の解凍が、ー1 0°C〜20°Cの水浴または氷 水浴中で解凍されたものである、請求項 2または 3に記載の調製方法。
(5)抽出用液がプロテアーゼインヒビタ一を含有するも 0である、請求項 1→のうちの いずれかに記載の調製方法。
(6)哺乳動物培養細胞が、リンパ腫由来の培養細胞である、請求項 1 ~5のうちのい ずれかに記載の調製方法。
(7)哺乳動物培養細胞が、生殖巣由来の培養細胞である、請求項 1〜5のうちのずれ かに記載の調製方法。
(8)哺乳動物培養細胞が、チャイニーズハムスター卵巣 (GHO)由来の培養細胞である、 請求項 7に記載の調製方法。
(9)チャイニーズハムスター卵巣（CHO)が、 CHO Κ1一 SFM由来である、請求項 8 に記載の調製方法。 (1 0)請求項 1〜9のいずれかに記載の方法で調製された、哺乳動物培養細胞抽出液。
( 1 1 )請求項 1 0に記載の哺乳動物培養細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成 方法。
(1 2)無細胞タンパク質合成反応液の組成のうち、外来 mRNAを除いた反応液を保温 させる工程の後、外来 mRNAを添加して合成反応を行う、請求項 1 1に記載の無細胞 系タンパク質合成方法。
( 1 3)保温が 0°C〜50°Cで行われる、請求項 1 2に記載の無細胞系タンパク質合成方 法。 図面の簡単な説明
図 1は、実施例 2の実験結果を示すグラフであり、合成量に対する保温工程 (合成反 応を行う前、無細胞系タンパク質合成反応液に外来 mRNA以外の成分を含んだ状態 での一定時間の保温)の有無の影響を示す。
図 2は、実施例 2の実験結果を示すグラフであり、合成量に対する、保温工程の反応 液組成及び保持時間の影響を示す。 発明を実施するための形態
本発明は、哺乳動物培養細胞から抽出を行って哺乳動物培養細胞抽出液を調製す る方法であって、抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる： t程を 少なくとも含有することをその大きな特徴とするものである。このような方法によって哺 乳動物培養細胞抽出液を調製することで、上記特許文献 1に記載の従来の手法と比 較して、より緩和な状態で細胞の破砕を行うことができ、無細胞系タンパク質合成に必 須な成分を破壊することなく細胞外に取り出すことができるので、従来よりも無細胞系 にてタンパク質の合成量の高い哺乳動物培養細胞抽出液を容易に調製することがで きる。さらに本発明の方法によれば、使用器具などからの RNaseなどの混入も防ぐこ とができ、また、界面活性剤などの試薬を用いた細胞破砕法の場合に懸念される翻訳 反応を阻害するような物質の持込みもない。 本発明の調製方法では、抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結さ せることを要する。本発明の調製方法において、「急激に凍結」とは、 10秒以下、好ま しくは 2秒以下にて、哺乳動物培養細胞を凍結させることを指す。本発明において、哺 乳動物培養細胞の凍結を急激に行わなかった場合には、タンパク質合成に必須な成 分が不活化する虞があるため、本発明の上記効果を達成することができない。
上記のように哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる温度としては、通常— 80°C以 下であり、好ましくは— 1 50°C以下である。—80°Cを越える温度で急激に凍結させる と、タンパク質合成に必須な成分が失活してタンパク質合成能が低下してしまう傾向に あるためである。 上記哺乳動物培養細胞の急激な凍結は、たとえば、液体窒素や液体ヘリウムなどの 不活性ガスを使用することなどによって実現できるが、入手が容易であり安価な液体 窒素を用いて行うのが好ましい。 ' 本発明の調製方法においては、哺乳動物培養細胞からの抽出に際して、抽出用液 中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有しているな らば、その他の工程について特に制限はない。たとえば、乳鉢中で乳棒を用いてすり 潰す方法、ダウンスホモジナイザーを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法など、大 腸菌ゃ小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用の抽出液を得る際に従来より行 われていた種々の手法にて哺乳動物培養細胞を破碎し、抽出を行ってもよいが、哺乳 動物培養細胞は、大腸菌や小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用の抽出液を 得る場合と比較して細胞の破砕が容易であり、さらには、この凍結'解凍によるだけの 破砕法により得られた抽出液にはタンパク質合成に必須な成分が活性を保持した状 態で含まれているという理由によりタンパク質合成能の高い抽出液を得ることができる という利点もあることから、上記哺乳動物培養細胞を急激に凍結させた後、解凍し、遠 、分離することによって哺乳動物培養細胞を破碎するのが好ましい。 上記急激に凍結した哺乳動物培養細胞を、解凍した後、遠心分離する場合、解凍は、 たとえば一 1 0°C〜20°Cの水浴または氷水浴中での解凍、室温 (25°C)にての放置な どによって実現できるが、タンパク質合成に必須な成分の失活を防止し、タンパク質合 成能の低下を確実に防ぐことから、 0°C〜20°C (特には、 4°C〜1 0°C)の水浴または 氷水浴中で解凍を行うのが好ましい。 '
解凍した哺乳動物培養細胞の遠心分離は、当分野において通常行われている条件 (1 0, 000 X g〜50， OOO X g、0°C〜1 0°C、 10分間〜 60分間）で行 ばよい。 本発明に用いる哺乳動物培養細胞としては、特に制限はなく、たとえば、ヒ卜、ラッ卜、 マウス、サルなどの従来公知の適宜の哺乳動物由来の培養細胞を使用することがで きる。
また、本発明における哺乳動物培養細胞としては、いかなる組織由来の細胞であつ てもよぐたとえば、血球細胞、生殖巣由来細胞、リンパ腫 (リンホーマ）由来細胞、その 他の腫瘍細胞、幹細胞などを特に制限なく使用することができる。中でも浮遊培養が 可能であるため、培養および継代が容易であることから、リンパ腫由来細胞を使用す るのが好ましい。また、 CHQ細胞は、浮遊培養が可能であるだけでなく、無血清培地 にて培養が可能であり、より培養および継代が容易である。さらに、細胞系において広 く利用され、高いタンパク質合成能を有しており、無細胞系においても同様のことが期 " 待できることから、 CHO細胞を使用するのが好ましい。 なお本発明においては、単一種の哺乳動物における単一の組織由来の哺乳動物培 養細胞に限らず、単一種の哺乳動物における複数種の組織由来の哺乳動物培養細 胞ょリ抽出を行ってもよ 複数種の哺乳動物における単一の組織由来の哺乳動物培 養細胞より抽出を行ってもよぐ無論、複数種の哺乳動物における複数種の組織由来 の哺乳動物培養細胞より抽出を行ってもよい。 本発明の調製方法に用いられる抽出用液は、特に制限されるものではないが、プロ テアーゼインヒビターを少なくとも含有するの 好ましい。プロテア一ゼインヒビターを 含有する抽出用液を用いると、哺乳動物培養細胞由来の抽出物に含有されるプロテア ーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパクの不所望な 分解を防止でき、結果として哺乳動物培養細胞由来の抽出物が有するタンパク質合成 能を有効に引き出すことができるようになるという利点がある。 上記プロテアーゼインヒビターとしては、プロテア一ゼの活性を阻害し得るものである ならば特に制限はなぐたとえば、フエニルメタンスルホニルフルオリド (以下、 rPMSFj ということがある。）、ァプロチニン、べスタチン、ロイぺプチン、ぺプスタチン A、 E-64 (L一 trans—エポキシスクシニルロイシルアミドー 4—グァニジ/ブタン）、エチレンジァ ミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができる力 哺乳動物培養細胞由来の 抽出液にはセリンプロテアーゼが含まれることから、上記中でもセリンプロテアーゼに 対して特異性の高いインヒビターとして働く PMSFを使用するのが好ましい。また、 1種 類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類の混合物（プロテアーゼインヒビター カクテル)を用いてもよい。 当該抽出用液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、 本発明の作用に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、
OmM含有されることが好ましく、 0. 01 mM〜5mM含有されることがより好ましい。プ 口テアーゼインヒビターが 1 μ Μ未満であると.、プロテアーゼの分解活性を充分抑える ことができない傾向にあるためであり、またプロ亍ァーゼインヒビターが 50mMを越え ると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。 また本発明に用いる抽出用液は、上記プロテアーゼインヒビターに加えて、カリウム 塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトールおよび緩衝剤を少なくとも含有するのが好まし い。 ！ . 上記カリウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限 はなぐたとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸 水素二カリウム、クェン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ 化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリ ゥムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子と して作用する。 当該抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の 観点から、たとえば酢酸カリウムなど 1価のカリウム塩である場合、 1 0mM~500mM 含有されることが好ましぐ 20mM〜300mM含有されることがより好ましい。カリウム 塩が 1 OmM未満または 500mMを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定 になる傾向にあるためである。 上記マグネシウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制 限はなく、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クェン 酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、 硝酸マグネシウム、シユウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中 でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反 応における補助因子として作用する。 当該抽出用液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定 性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど 2価の塩である場合、 0. 1 mM~ 1 Om M含有されることが好ましぐ 0. 5mM〜5m|VI含有されることがより好ましい。マグネ シゥム塩が 0. 1 mM未満または 1 0mMを越えると、タンパク質の合成に必須な成分 が不安定になる傾向にあるためである。 上記ジチオトレイト一ル (以下、「DTT」ということがある。 )は、酸化防止の目的で配合 されるものであり、当該抽出用液中において 0· 1 mM〜1 0mM含有されることが好ま しぐ 0. 5mM〜5mM含有されることがより好ましし、。 DTTが 0. I mM未満または 1 0 mMを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためであ る。 上記緩衝剤は、緩衝能を付与し、抽出用液による抽出により調製された抽出液 (=抽 出用液 +抽出物)において、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こ る PHの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝 剤としては、特に制限はなぐたとえば、 HEPES— KOH、 Tris-HCI,酢酸一酢酸ナ卜 リウム、クェン酸一クェン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、 MES、 PIPESなどを使用する ことができる。
緩衝剤は、得られた抽出液の PHが 4~ 1 0に保持されるようなものを使用するのが好 ましぐ pHが 6〜8. 5に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液の p Hが 4未満または pHが 1 0を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があ るためである。このような観点より、上記中でも HEPES— KOH(pH6〜8. 5)を使用 するのが特に好ましい。 当該抽出用液中における緩衝剤の含有量に特に制限はない力 好適な緩衝能を保 持する観点から、 5mM〜200mM含有されることが好ましぐ 1 0mM〜1 00mM含有 されることがより好ましい。緩衝剤が 5mM未満であると、酸性または塩基性物質の添 加により PHの急激な変動を弓 Iき起こし、これを用いて調製した抽出液におし、て抽出物 が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤力 200mMを越えると、塩濃度が高くな リ過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。 さらに、抽出用液においては、得られる抽出液のタンパク質合成能向上を目的として、 カルシウム塩およびグリセロール力《さらに添加されたものであるのが好ましい。カルシ ゥム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、例え ば、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硫酸カルシウム、クェン酸カルシウム、ヨウ化力 ルシゥ厶、乳酸カルシウム、硝酸カルシウム、シユウ酸カルシウムなど、一般的な形態 で使用することができ、中でも塩化カルシウムを使用するのが好ましい。この場合、塩 化カルシウムの含有量は特に制限されないが、上記タンパク質合成能の向上の効果 を有効に発揮し得る観点より、 0. 1mM〜1 0mM含有されることが好ましく、0. 5mM ~5mM含有されることがより好ましい。また、グリセロールの添加量についても特に制 限されるものではない力《、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観 点より、 5(v/v)%〜80(v/v)%となるように添加されるのが好ましぐ 10(v/v)%〜
50(v/v)%となるように添加されるのがより好ましい。 本発明の哺乳動物培養細胞抽出液の調製方法において、細胞破砕後から、無細胞 系タンパク質合成用の哺乳動物培養細胞抽出液を得るまでの手順等については特に 制限されるものではない。
たとえば、抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程の後に、 解凍し、遠心分離する場合には、この遠心分離後の上清 (上清 1 )をそのまま哺乳動物 培養細胞抽出液としてもよいし、また、上清 1をさらに遠心分離して、得られた上清 (上 清 2)を哺乳動物培養細胞抽出液としてもよい。上記上清 1の遠心分離の条件としては、 上述したのと同様の条件（1 0, 000 X g〜50， OOO X g、0°C〜1 0°C、 1 0分間〜 60 分間）で行えばよい。 なお上述のようにそれぞれ調製した後に、ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より 2 80nmにおける吸光度が最も高い画分付近を分取して抽出液として調製するようにし てもよい。しかしながらタンパク質の合成効率の観点からは、当該ゲル濾過および画 分の分取を経ずに抽出液として調製するのが好ましい。 なお、上記ゲル濾過を施し、ゲル濾過後の濾液より 280nmにおける吸光度が最も 高い画分付近を分取する場合には、具体的には以下の手順にて行えばよい。
たとえば脱塩カラム PD— 1 0 (アマシャム バイオサイエンス社製)を用いて、常法に したがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記抽出用 液にて溶出する、というような条件にて行う。上記ゲル濾過用緩衝液としては、従来公 知の適宜の組成のものを特に制限なく使用することができ、たとえば、 1 OmM〜 1 00 mMの HEPES— KOH(pH6〜8. 5)、 20mM〜300mMの酢酸カリウム、 0. 5mM 〜5mMの酢酸マグネシウム、 0. 5ml！〜 5mMの DTT、0. 01 mM〜5mMの PMSF を含有するゲル濾過用緩衝液を用いることができる。ゲル濾過して得られる濾液は、 通常のゲル濾過で行われているように、 0. 1 mし〜 1 mLを 1画分とすればよぐ高いタ ンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、 0. 4mL~0. 6mL を 1画分とするのが好ましい。
次に >ゲル濾過後の濾液より 280nmにおける吸光度が 1 0以上の画分を分取する。 当該処理は、たとえば UltrospeC3300prO (アマシャム バイオサイエンス社製)など の機器を用いて、各画分について上記 280nmにおける吸光度を測定し、この吸光度 が最も高い画分付近を分取し、これを抽出液とする。 なお、本発明の調製方法に供する哺乳動物培養細胞は、培養に用いる培地の翻訳 反応液への持込みを避けるため、上記急激な凍結を行う前に、洗浄液にて予め洗浄し ておくのが好ましい。洗浄液の組成としては、上述した抽出用液と同様の組成のもので あればよい。洗浄液での洗浄は、哺乳動物培養細胞に洗浄液を添加し、これを遠心分 離 (たとえば、 700 X g、 1 0分間、 4°Cという条件)することによって行う。
洗浄に用いる洗浄液の量は、培地を完全に洗い流すという理由から、湿重量 1 gの哺 乳動物培養細胞に対し 5mL〜1 OOmLであるのが好ましぐ 1 0mL〜50mLであるの がより好ましい。
洗浄回数は、 1回〜 5回行うのが好ましく、 2回〜 4回行うのがより好ましい。 また本発明の調製方法に供する哺乳動物培養細胞の量は、特に制限されるもので はないが、抽出効率を最適に保っため、抽出用液 1 mLに対して 0. 1 g~5gであるの が好まし《0. 5g〜2gであるのがより好ましい。 本発明の方法にて調製された哺乳動物培養細胞抽出液は、無細胞系タンパク質合 成用として好適に使用することができる。哺乳動物培養細胞抽出液は、哺乳動物培養 細胞由来の抽出物をタン/ ク質濃度で 1 mg/mL〜 200mgZm L含有することが好 ましぐ l OmgZmL〜"！ OOmgZmL含有することがより好ましい。当該抽出物の含有 量がタンパク質濃度で 1 mgZmL未満であると、本発明の作用に 、須な成分の濃度 が低くなリ、充分な合成反応が行えなくなる虞力あるためであり、また当該抽出物の含 有量力タンパク質濃度で 200mgZmLを越えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操 作しづらい虞があるためである。
該抽出液中の哺乳動物培養細胞由来の抽出物の含有量は、タンパク質濃度を測定 することで決定され、たとえば、 BCA Protein assay Kit(PIERCE社製)を使用し、 タンパク質濃度を測定することによって決定される。具体的には、反応試薬 2mLに対し てサンプルを 0. 1 mL加え、 37°Cで 30分間反応させ、分光光度計（Ultrospec3300 pro、アマシャム バイオサイエンス社製)を用いて、 562nmにおける吸光度を測定す る。コントロールとしては、通常、ゥシ血清アルブミン (BSA)を使用し、検量線を作成す る。このような手法により測定することができる。 また抽出液中に含有される抽出物が哺乳動物培養細胞由来のものであるか否かは、 たとえば、抽出液中のリボソーム RNAの塩基配列解析を行うことによって判別すること ができる。 本発明の抽出液は、哺乳動物培養細胞由来の抽出物をタンパク質濃度で 1 OmgZ mL〜1 OOmgZmL含有するとともに、 20mM〜300mMの酢酸カリウム、 0. 5mM ~5mMの酢酸マグネシウム、 0. 5mM〜5mMの DTT、0. 01 mM~5mMの PMSF、 1 OmM〜： I OOmM0HEPES— KOH (PH6〜8. 5)を含有するように実現されるのが 好ましい。 また上記に加えて、さらに 0. 5mM〜5mMの塩化カルシウム塩および
10(v/v)%〜50(v/v)%のグリセロールを含有することが好まししゝ。 本発明はまた、上記抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供するもの である。本発明の方法にて得られた抽出液を用いてタンパク質合成反応を行うことによ つて、如何なるタンパク質、例えば生細胞で細胞毒となるタンパク質であっても、短時間 にて合成することが可能となる。また、真核生物である哺乳動物培養細胞由来の抽出 物を用いているため、糖タンパク質を無細胞系で合成することも可能であり、特に制限 されることなく多くの種類のタンパク質を合成することができる。なお本発明における無 細胞系タンパク質合成反応は、 mRNAの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細 胞翻訳系のみによるタン/ ク質合成反応を指す。 本発明の方法で得られる抽出液を用いて調製される無細胞系タンパク質合成反応 液の組成に特に制限はなく、従来公知の組成を適宜選択すればよいが、上記抽出液 が 1 0 (vZv) %〜80 (vZv) %、特には 30 (v/v) 0/ &〜 60 (vZv) %含有されるように 調製されるのが好ましい。すなわち、上記反応液の全体において、哺乳動物培養細胞 由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で 0. 1 mgZmL〜1 60mgZmLとなるよ うに調製されるのが好ましぐ 3mg/mL〜60mg/mLとなるように調製されるのがよ リ好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で Q. I mgZmL未満または 1 60 mgZmLを越えると、目的のタンパク質の合成速度が低下する虞があるためである。 無細胞系タンパク質合成反応液は、本発明の方法で得られた抽出液を除く成分とし て、外来 mRNA、カリウム塩、マグネシウム塩、 DTT、アデノシン三リン酸、グアノシン 三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、 RNaseインヒビター、 t RNA、緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。か力、る反応液を使用して翻訳反応 を行うことで、短時間で大量のタンパク質の合成が可能である。 上記反応液に用いる外来 mRNAとは、抽出液を調製するのに用いた哺乳動物培養 細胞に由来しない mRNAを指し，かかる哺乳動物培養細胞に由来しない mRNAであ るならば、コードするタンパク質 (ペプチドを含む)に特に制限はなぐ毒性を有するタン / ク質をコードするものであってもよいし、また糖タン/ ク質をコードするものであっても よい。なお、反応液に含有される mRNAが外来 mRNAであるか抽出液を調製するの に用いた哺乳動物培養細胞に由来する mRNAであるかは、まず、反応液中より、 mR NAを単離精製後、逆転写酵素により cDNAを合成し、得られた cDNAの塩基配列を解 祈し、既知の外来 mRNAの塩基配列と比較することで判別することができる。 なお反応液に用いる外来 mRNAは、その塩基数に特に制限はなぐ目的とするタン パク質を合成し得るならば mRNA全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とする タンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各 mRNAは、複数個の塩基が 欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。 本発明に用いる外来 mRNAは、市販のものでもよいし、目的とするタンパク質の OR F(Open reading frame)を市販のベクター、たとえば、 pTNT Vector (プロメガ社製）の 5 '一 βグロビンリーダ一配列の下流に挿入し、これを用いて転写反応で得られた mRN Aを用いても構わなし、。また、転写反応の際にメチル化されたリボヌクレオチドなどを加 えることにより付加されたキャップ構造を有する外来 mRNAを用いてもよい。 反応液中において、外来 mRNAは、タンパク質合成の速度の観点から、 1 /mL 〜1 000;U gZmL含有されることが好まし 1 0 gZmL〜500〃gZmL含有され ることがより好ましし、。外来 mRNAが 1 μ gZmL未満または 1 000 μ gZmLを越える と、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。 当該反応液中におけるカリウム塩と ては、抽出用液の成分として上述した各種の力 リウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出 用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、 1 0mM 〜500mM含有されることが好ましく、 20mM〜300mM含有されることがより好まし い。 当該反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各 種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシゥ ム塩は、上述した抽出液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該反応 液中において、 0. I mM〜"！ OmM含有されることが好ましぐ 0. 5mM〜5mM含有さ れることがより好ましい。 当該反応液中における DTTは、上述した抽出用液における DTTの場合と同様の観 点から、 0. 1 mM〜1 0mM含有されることが好ましく、 0. 5mM〜5mM含有されるこ とがより好ましい。 当該反応液中におけるアデノシン三リン酸 (以下、「ATPJということがある。）は、タン パク質合成の速度の観点から、当該反応液中において 0. 01 mM~1 0mM含有され ることが好ましぐ 0. 1 mM〜5mM含有されることがより好ましし、。 ATPが 0. 01 mM 未満または 10mMを越えると、タンパク質の合成速度力《低下する傾向にあるためであ る。 当該反応液中におけるグアノシン三リン酸 (以下、「GTP」ということがある。）は、タン パク質合成の速度の観点から、当該反応液中において 0. 01 mM〜1 0mM含有され ることが好ましく、 0. 05mM~5mM含有されることがより好ましし、。 GTPが 0. 01 m M未満または 10mMを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためで あ o 当該反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成 分であって、 ATPと GTPを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質 合成の速度の観点から、当該反応液中において 1 mM〜200mM含有されることが好 ましぐ 1 0mM〜1 00mM含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が" I mM未 満であると、充分な量の ATPと GTPが再生されにくぐ結果としてタンパク質の合成速 度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸力《200mMを越えると、阻 害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。 当該反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するため の成分であって、クレアチンリン酸と共に ATPと GTPを再生する目的で配合される。ク レアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において 1 J« g mL〜 1 000 μ gZmL含有されることが好ましぐ 1 0 μ gZmL~500j« gZmL含 有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが 1 g/mL*満であると、充分な 量の ATPと GTPが再生されにくぐ結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向 にあるためであり、またクレアチンキナーゼが 1 000 g mLを越えると、阻害物質と して働き、'タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。 当該反応液中におけるアミノ酸成分は、 20種類のアミノ酸、すなわち、パリン、メチォ ニン、グルタミン酸、ァラニン、ロイシン、フエニルァラニン、グリシン、プロリン、イソロイ シン、卜リブトフアン、ァスパラギン、セリン、トレ才ニン、ヒスチジン、ァスパラギン酸、チ 口シン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の 20種類のアミノ酸を少なくとも含 有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、 必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類 のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
本発明においては、タンパク質合成 ω速度の観点から、当該反応液中において上記 のアミノ酸成分力《1 ;U M~ 1 000 Μ含有されることが好ましぐ 1 0 i M〜200 Μ含 有されることがより好ましい。アミノ酸成分が 1 μ Μ未満または 1 000 Μを越えると、 タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。 当該反応液中における RNaseインヒビターは、抽出液に混在する哺乳動物培養細 胞由来の RNaseによって、本発明の無細胞系タンパク質合成の際に外来 mRNAや tR NAが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるもの であり、当該反応液中において 0. 1 UZ L〜1 00UZjt L含有されることが好ましぐ 0. 5UZ jUし〜 I OUZ JU L含有されることがより好ましし、。 RNaseインヒビターが 0. 1 U/ 1_未満であると、 RNaseの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるた めであり、また RNaseインヒビターが 1 0OUZ / Lを越えると、タンパク質合成反応を P且害する傾、向にあるためである。 当該反応液中における tRNAは、上記 20種類のアミノ酸に対応しナ::種類の tRNAを 概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、 当該反応液中において 1 / gZmL~1 000 gZmL含有されることが好ましぐ 1 0 g/mL〜500〃 gZmL含有されることがより好ましい。 tRNA力 μ gZm 満また は 1 0OO i gZmLを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためであ る。 反応液に含有される緩衝剤としては、上述した本発明の抽出液と同様のものが好適 に使用でき、同様の理由から、 HEPES—KOH (pH6~8, 5)を使用するのが好まし ， い。また、緩衝剤は、上述した抽出液における緩衝剤の場合と同様の観点から、 5mM 〜200mM含有されることが好ましぐ 1 OmM~ 1 OOmM含有されることがより好まし い。 さらに、反応液においては、翻訳反応速度を向上させる目的で、スペルミジンがさら に添加されたものであるのが好ましい。スペルミジンは、反応液中において 0. 0,1 mM 〜1 0ήηΜ含有されることが好ましぐ 0. 05mM〜5mM含有されることがより好ましい スペルミジンが 0. 01 mM未満であると、十分な翻訳促進能が認められない傾向にあ るためであり、また、スペルミジンが 1 OmMを越えると、タンパク質合成反応を阻害す る傾、向にあるためである。 さらに、反応液においては、 カルシウム塩力《さらに添加されたものであるのが好まし い。カルシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカルシウム塩、好適 には、塩化カルシウム、を好ましく使用できる。カルシウム塩は、上述した抽出用液に おけるカルシウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、 0. 05mM〜 1 OmM含有されることが好ましぐ 0. 1 mM〜5mM含有されることがより好ましい。 すなわち、本発明の方法で得られた抽出液を使用した反応液としては、当該抽出液 を 30(vZv) %〜60(vZv) %含有するとともに、 20mM〜300mMの酢酸カリウム、 0. 5mM〜5mMの酢酸マグネシウム、 0. 5ml ！〜 5mMの DTT、 0. 1 mM〜5mM の ATP、0. 05mM~5mMの GTP、 1 0mM~ 1 00mMのクレアチンリン酸、 1 0〃g Zmし〜 500 μ g/mLのクレアチンキナーゼ、 10 μ Μ~200 μ Μのアミノ酸成分、 0. 5UZ μ L〜 1 OUZ μ Lの RNaseインヒビター、 1 0 μ gZmL〜500 β gZmLの tRNA、 1 0 gZmL〜500 μ g mLの外来 mRNA、 10mM〜1 OOmMの HEPES— KOH (pH6〜8. 5)を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに 0. 05mM〜5mMのスペルミジン、 0. 1 mM〜5mMの塩化カルシウムを含有するように 実現されるのがより好ましい。 上記反応液を用いた無細胞系タンパク質合成反応は、従来公知のたとえば低温恒 温槽にて行う。反応温度は、通常、 1 0°C〜40°C、好ましくは 20°C〜30°Cの範囲内で ある。反応温度が 1 0°C未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、 また反応温度が 40°Cを越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。反応 の時間は、通常、 1時間〜 72時間、好ましくは 3時間〜 24時間である。 また、反応を行う前に、抽出液に mRNA以外の反応液組成の成分を加えた状態にお いて、一定時間保温を行うのが好ましい。保温は、従来公知のたとえば低温恒温槽に て行う。保温時間は、通常、 0°C〜50°C、好ましくは 1 5°C〜37°Cの範囲である。保温 温度力 0°C未満であると保温の効果が得られに《、また保温温度が 50°Cを超えると 必須な成分が変性する傾向にあるためである。保温の時間は、通常、 1分〜 i 20分、 好ましくは、 1 0分〜 60分である。 上記反応液を使用して合成できるタンパク質に特に制限はない。合成されたタンパク 質の量は、酵素の活性の測定、 SDS-PAGE,免疫検定法などによって測定できる。 本発明の無細胞系のタンパク質合成方法にて合成できるタンパク質に特に制限はな い。 実施例
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制 限されるものではない。
参考例 1：哺乳動物培養細胞 (リンパ腫由来)の培養
細胞数 2. 1 X 1 06個の哺乳動物培養細胞 L51 78Y— S (東北大学加齢医学研究所 附属医用細胞資源センターより分譲)を、 1 0<½ゥシ胎児血清 (Invitrogen社製)を含む RPMI1 640培地 (Invitrogen社製）が入った培養フラスコ（21 00cm2)内で 37°C、 5%C02雰囲気下で 70時間培養した。その結果、細胞数 4. 2 X 1 08個、湿重量 0. 57 gとなった。 実施例 1 :哺乳動物培養細胞 (リンパ腫由来)抽出液の調製 ;
まず、上記参考例 1で培養した動物培養細胞を遠心分離 (700 X g、 1 0分間）により 収集し、下記組成の洗浄液で 3回洗浄 (700 X g、 1 0分間の条件で遠心分離）した。 〔洗浄液の組成〕
■50mM HEPES— KOH (pH7. 4)
■l OOmM 酢酸カリウム
■2mM 酢酸マグネシウム
■2mM DTT
その後、上記組成の洗浄液に 0. 57mLの 0. 5mM PMSFおよび 20%グリセロー ルを添加して調製した抽出用液 (4°Cに冷却)に、懸濁した。 この懸濁液を液体窒素中にて急激に (2秒)凍結させた。充分に凍結させた後、約 1 0°Cの水浴中で解凍した。完全に解凍した後、 4°C、 30, 000 X gで 1 0分間遠心分離 (himacCR20B3.日立ェ機社製)して残渣を取除き、上清を回収した。得られた上清 をさらに遠心分離 (4°C、 30, OOO X g、 30分間）した後に回収した上清を、哺乳動物 培養細胞抽出液とした。 参考例 2：外来 mRNAの作製
(1 )ベクター DNAの構築
pGEM-luc Vector (プロメガ社製） 5ngを錶型とし、配列表配列番号 1に示す塩基 配列を有するプライマ一 (Luc T7— F3— Kpn)と、配列表配列番号 2に示す塩基配 列を有するプライマー (Luc T7— R4— Kpn)と、 KOD plus (東洋紡績社製)を用い て、 97°C1 5¾\ 55°C30¾\ 68°C1 20¾>、 30サイクレの PCRを行った。エタノーゾレ 沈殿により DNA断片を精製した後、 Kpnlで消化した。これとは別に、 pTNT Vector (プ 口メガ社製)を Kpnlで消化した。これらの反応液をァガロースゲル電気泳動で分離した 後、 Gen Elute Gel Purification Kit (シグマ社製）を用いて DNA断片を精製した。
Ligation High (東洋紡績社製)を用いて、これらの DNA断片をライゲーシヨンした後、 大腸菌 DH5 （東洋紡績社製)を形質転換した。形質転換した大腸菌からアルカリ一 SDS法により調製したプラスミド DNAを、配列表配列番号 3に示す塩基配列を有する プフイマ一 (T7 promoter)および Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS (アプライドバイォシステムズ社製)を用いてシークェンシング反応（96°C1 0秒、 50°C 5秒、 60°C4分、 30サイクル)を行った。この反応液を ABI PRISM 31 0 Genetic Analyzer (アプライドバイォシステムズ社製)に供し、塩基配列解析を行った。 pTNT V ector由来の 5'— βグロビンリーダー配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子の開始コド ンが揷入されたプラスミドを ρΤΝΤ— Lucと命名した。
(2)in vitro転写反 J7じ、 上記（1 )で作製した PTNT—Lucを BamHIで消化した後、フエノールクロ口ホルム抽出、 エタノール沈殿により精製した。得られた DNA断片 1〃gを錶型として、 RiboMax Lar ge Scale RNA Production System— T7 (プロメガ社製）を用い 20 Iスケール で 37°C4時間 mRNAを合成した。
(3)外来 mRNAの精製
上記転写反応後の反応液 20〃Lに、 1 Uの RQ1 RNase free DNase (プロメガ社 製)を添加し、 37°C、 1 5分間インキュベートし、錶型 DNAを消化した。フエノールーク口 口ホルム抽出によりタンパク質を除去した後、酢酸カリウムを終濃度 0. 3Mとなるよう に添加し、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を 1 00 μ Lの滅菌水に溶解し、 Nick Column (アマシャム /くィォサイエンス社製〉にアプライした。滅菌水 400 βしで溶出 を行った。溶出画分を回収し、酢酸カリウムを終濃度 0. 3Μとなるように添加し、ェタノ ール沈殿を行った。合成された mRNAの定量は、 260nmの吸光度を測定して行った。 実験例 1 :哺乳動物培養細胞 (リンパ腫由来)抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成 実施例 1で調製した哺乳動物培養細胞抽出液、および参考例 2で合成した外来 mR NAを用いて、下記組成の反応液を調製し、無細胞系でのタンパク質合成を行った。 〔反応液の組成〕
■50 (v/v) % 哺乳動物培養細胞抽出液
■25mM HEPES-KOH (pH7. 4)
•1 50mM 酢酸カリウム
■I mM 酢酸マグネシウム
■ 1 mM DTT
■0. 5mM ATP
■0. 1 mM GTP
■20mM クレアチンリン酸 ■200 jU g/mL クレアチンキナーゼ
" 0. 25mM スペルミジン
■40 M アミノ酸（20種）
· -l U ^ L· RNaseインヒビター (ヒ卜胎盤由来）
■ 200 β gZmL tRNA (酵母由来）
•240 gZmL 外来 mRNA
' 1 0 (νΖν) % グリセロール
ΑΤΡ (シグマ社製）、 GTP (シグマ社製）、アミノ酸 (20種）（シグマ社製）、 RNaseイン ヒビター (宝酒造社製）、 tRNA (ロシュ'ダイァグノスティックス社製)をそれぞれ用いた。 反応装置として低温アルミブロック恒温槽 MG— 1 000を用いた。反応液量は 25 μし 反応温度は 20°Cとし、反応時間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ 量を測定した。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアツセィキット (E— 1 500、 プロメガ社製)を用いて定量した。ルシフェラーゼァッセィ試薬 50〃 Lに反応液 2. 5 μ Lを添加し、ルミノメ一ター (Tuner Designs TD— 20Z20、プロメガ社製）を用いて、 ルシフェラーゼによる発光を測定した。
結果、反応開始 1時間で約 0. 5 U gZmLの無細胞系タンパク質合成に成功した。 比較例 Ί
参考例 1と同様にして培養した哺乳動物培養細胞 L51 78Y— Sを、実施例 1と同様 の洗浄液で洗浄した後、実施例 1と同様の 4°Cに冷却した抽出用液に懸濁した。その 後、 5分間激しく攪拌して抽出を行った以外は、実施例 1と同様の操作で行った。無細 胞系タンパク質合成反応は、参考例 2で作製した mRNAを用いて、実験例 1と同様の 反応液組成で行った。
結果、ルシフェラーゼは 1 0ngZmLと、実験例 1の約 50分の 1程度であった。 参考例 3：哺乳動物培養細胞 (CHO)の培養 細胞濃度 4.9 105cells/mLのチャイニーズハムスター卵巣細胞 CHO K1-SFM (東北 大学加齢医学研究所付属医用細胞資源センタ一より分譲)を CHO SERUM-FREE MEDIUM (SIGMA社製） 200mLが入った三角フラスコ (500mL)内で 130rpm■ 37°C■ 5%C02 雰囲気下で 120時間培養した。その結果、細胞濃度 8.8 X 106cdls/mし湿重量 3.2gと なった。 実施例 2：哺乳動物培養細胞 (GHO)抽出液の調製
まず、上記参考例 3で培養した動物培養細胞を遠心分離 (700 X g、 10分間)によリ収 集し、下記組成の洗浄用緩衝液で 3回洗浄 (700 X g、 10分間の条件で遠心分離）した。 〔洗浄用緩衝液の組成〕
■40mM HEPES-KOH (pH7.9)
■100mM 酢酸カリウム
■2mM 酢酸マグネシウム
■2mM 塩化カルシウム
•1 mM DTT
その後、重量を測定し、細胞 1gあたり 0.8mLの下^組成の抽出用緩衝液を添加し、 細胞を懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
■40mM HEPES-KOH (pH7.9)
•100mM 酢酸力リウ Λ
■2mM · 酢酸マグネシウム
■2mM 塩化カルシウム
■20%(v/v) グリセロール
- 1mM DTT
この細胞懸濁液を液体窒素中にて急激に凍結させた。十分に凍結させた後、約 4°Cの 氷浴中で解凍した。完全に解凍した後、 4°C、 30000 X gで 10分間遠心分離 (himac CR20B3,日立ェ機社製)して細胞残渣を取り除き、上清 S1を回収した。得られた上清 S1をさらに遠心分離 (4°C、 30000 X g、 30分間）した後に上清 S2を回収した。この上清 S2を下記組成の脱塩用緩衝液にて平衡化した PD- 10(アマシャム社製)にアプライした。 アプライした後、脱塩用バッファ一にて溶出し、分光光度計 (Ultrospec3300pro、アマシ ャムバイオサイエンス社製)を用いて、 280nmにおける吸光度が 30以上の画分を回収 し、哺乳動物培養細胞 (GHO)抽出液とした。
〔脱塩用緩衝液の組成〕
■40mM HEPES-KOH (pH7.9)
■100mM 酢酸カリウム
■2mM 酢酸マグネシウム
■1mM DTT 実験例 2 :哺乳動物培養細胞 (GHO)抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成
実施例 2で調製した哺乳動物培養細胞 (GHO)抽出液は、まず下記組成のうち反応液 組成における外来 mRNA以外の成分と混合し、 25°Cで 30分間保温した。その後、参 考例 2で合成した外来 mRNAを添加し、無細胞系でのタンパク質合成を行った。
〔反応液の組成〕
■50%〔V/V〕 哺乳動物培養細胞抽出液
■50mM , HEPES-KOH (pH7.9)
■1 75mM 酢酸カリウム
■ 1 m 酢酸マグネシウム
' 0. 5mM 塩化カルシウム
•2mM DTT
■0. 5mM ATP
" 0. 25mM GTP
■30mM クレアチンリン酸 ■200 j(i g/mL クレアチンキナーゼ
■80 /i M アミノ酸 (20種）
■1 60 i g mL mRNA (ルシフェラーゼ遺伝子をコード）
ATP (シグマ社製)、 GTP (シグマ社製)、アミノ酸 (20種）（シグマ社製)をそれぞれ用 いた。反応装置としては低温アルミブロック恒温槽 MG-1000を用いた。反応液量は 25 し、反応温度は 25°Cとし、反応時間ごとにサンプリングを行し、、合成されたルシフェラ 一ゼ量を測定した。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼァッセィキット (E - 1500、 プロメガ社製)を用いて定量した。ルシフェラーゼァッセィ試薬 50〃 Lに反応液 2.5〃 L を添加し、ルミノメータ一 (Tuner Designs TD- 20/20、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラ —ゼによる発光を測定した。その結果、反応開始 2時間後のタンパク質合成量は約 27 μ g/mL (図 1讕）と、タンパク質合成を行う前の保温 (25°C、 30分間)を行わない場合 (図 1口）より著しく向上した。 以上の説明で明らかなように、本発明によれば、調製が容易であり、かつ従来よりも タンパク質合成量の高い無細胞系タンパク質合成用哺乳動物培養細胞抽出液の調製 方法、および該哺乳動物培養細胞抽出液、ならびにこの哺乳動物培養細胞を用いた 無細胞系のタンパク質合成方法を提供することができる。 なお、配列表フリーテキス卜（人工配列の記載（Description of Artificial Sequence) ) において、配列番号 1はプライマー Luc T7— F3— Kpnであり、配列番号 2はプライ マー Luc T7— R4— Kpnであり、配列番号 3はプライマー T7 promoterである。

Claims

請求の範囲
1 .抽出用液中に懸濁した哺乳動物培養細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも 含有する、哺乳動物培養細胞抽出液の調製方法。
2.さらに急激に凍結させた後、哺乳動物培養細胞を解凍し、遠心 離する工程を 含む、請求項 1に記載の調製方法。
3.急激な凍結が、液体窒素によって行われるものである、請求項 1または 2に記載 の調製方法。
4.急激に凍結された哺乳動物培養細胞の解凍が、 -1 0°C~20°Cの水浴または 氷水浴中で解凍されたものである、請求項 2または 3に記載の調製方法。
5.抽出用液がプロテアーゼインヒビターを含有するものである、請求項 1→のうち のいずれかに記載の調製方法。
6.哺乳動物培養細胞が、リンパ腫由来の培養細胞である、請求項 1〜5のうちの いずれかに記載の調製方法。
7.乳動物培養細胞が、生殖巣由来の培養細胞である、請求項 1〜5のうちのいず れかに記載の調製方法。
8.哺乳動物培養細胞が、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO)由来の培養細胞で ある、請求項 7に記載の調製方法。
9.チャイニーズハムスター卵巣（CHO)が、 CHO K1— SFM由来である、請求項 8に記載の調製方法。
' 1 0.請求項 1〜9のいずれかに記載の方法で調製された、哺乳動物培養細胞抽出 液。
1 1 .請求項 1 0に記載の哺乳動物培養細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合 成方法。
1 2.無細胞タンパク質合成反応液の組成のうち、外来 mRNAを除いた反応液を保 温させる工程の後、外来 mRNAを添加して合成反応を行う、請求項 1 1に記載の無細 胞系タンパク質合成方法。
1 3.保温が 0°C〜50°Cで行われる、請求項 1 2に記載の無細胞系タンパク質合成 方法。
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