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WO2004110479A1 - Hyaluronatlyase enthaltendes mittel zur behandlung des akuten myokardinfarktes bzw. symptomen darauf sowie zur behandlung von postinfarktioneller myokarditis und myokardischämie - Google Patents

Hyaluronatlyase enthaltendes mittel zur behandlung des akuten myokardinfarktes bzw. symptomen darauf sowie zur behandlung von postinfarktioneller myokarditis und myokardischämie Download PDF

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WO2004110479A1
WO2004110479A1 PCT/DE2003/001789 DE0301789W WO2004110479A1 WO 2004110479 A1 WO2004110479 A1 WO 2004110479A1 DE 0301789 W DE0301789 W DE 0301789W WO 2004110479 A1 WO2004110479 A1 WO 2004110479A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hyaluronate lyase
composition according
enzyme
hyaluronate
treatment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/DE2003/001789
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Wolfram
Jörg-Hermann Ozegowski
Peter-Jürgen Müller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hans-Knoll-Institut fur Naturstoff-Forschung Ev
Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Leibniz Institut fuer Naturstoff Forschung und Infektionsbiol eVi
Original Assignee
Hans-Knoll-Institut fur Naturstoff-Forschung Ev
Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Leibniz Institut fuer Naturstoff Forschung und Infektionsbiol eVi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hans-Knoll-Institut fur Naturstoff-Forschung Ev, Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU, Leibniz Institut fuer Naturstoff Forschung und Infektionsbiol eVi filed Critical Hans-Knoll-Institut fur Naturstoff-Forschung Ev
Priority to PCT/DE2003/001789 priority Critical patent/WO2004110479A1/de
Priority to AU2003239763A priority patent/AU2003239763A1/en
Publication of WO2004110479A1 publication Critical patent/WO2004110479A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)

Definitions

  • the invention relates to agents containing a new active substance for the treatment of acute myocardial infarction or symptoms thereon and for the treatment of postinfarctional myocarditis and myocardial ischemia.
  • the proposed active ingredient has glucosaminoglycan-cleaving activity and is characterized mainly by preferential degradation of hyaluronic acid.
  • the glucosaminoglycans include chondroitin sulfate, dermatan sulfate and heparan sulfate. These occur in the tissues of all vertebrates.
  • Hyaluronic acid is particularly present in the intercellular matrix of the skin and cartilaginous tissue as well as in body fluids such as aqueous humor of the eyes and synovial fluid. Together with the other glucosaminoglycans, hyaluronic acid forms part of the walls of blood vessels, in particular also of atheromatous deposits or plaques on arterial inner walls.
  • Hyaluronic acid has the property of binding water to form viscous, hydrocolloid solutions or to form sparingly soluble polyelectrolyte complexes with basic proteins. It consists of glucuronic acid and acetylated glucosamine linked by ß- (l-3) -glycosidic bonds. These disaccharide units are in turn linked together by glycosidic ⁇ (1-4) bonds.
  • Hyaluronic acid is cleaved by hyaluronidases according to a hydrolytic mechanism.
  • hyaluronidases does not correctly describe three different types of hyaluronic acid-splitting enzymes (Ludowieg J: The Mechanisms of Hyaluronidases, J Biol Chem 236, pp.333-339, 1961). Once upon a time, the endohydrolases hydrolytically cleave the ⁇ - (1-4) bonds. These include the majority of hyaluronidases from higher organisms, such as bovine testes hyaluronidase. These hyaluronate glycan hydrolases (hyaluronoglucosaminidases / E.C.
  • Rinderhodenhyaluronidase has a conducive effect on collateral blood flow into the ischemic tissue (Askenazi J, Hillis LD, Diaz PE et al .: The Effects of Hyaluronidase on Coronary Blood Flow Following Coronary Artery Occlusion in the Dog. Circ Res 40, p.566- 571, 1977 / Premaratne S, Watanabe BI, LaPenna WF, et al .: Effects of hyaluronidase on reducing myocardial infarct size in a baboon model of ischemia-reperfusion injury J Surg Res 58, p.205-210, 1995).
  • Interstitial edema Due to the ability to bind water, the interstitial accumulation of hyaluronic acid contributes to the interstitial edema in the infarcted myocardial tissue. Interstitial edema is believed to affect electromechanical characteristics of the myocardium, allowing reentry phenomena due to loss of contact between muscle cells, leading to tachycardia and ventricular fibrillation. In addition, edema causes increased extracellular pressure and disturbs the microcirculation of the myocardium through altered cardiac wall compliance.
  • Bovine testicular hyaluronidase limits the cellular damage during myocardial ischemia by degradation of hyaluronic acid (Waidenstrom A, Martinussen HJ, Gerdin B et al .: Accumulation of hyaluronan and tissue edema in experimental myocardial infarction, J Clin Invest 88, pp. 1622-1628, 1991).
  • Presselt proposes the treatment of atheromatous vascular diseases of humans and animals with hyaluronate lyase of microbial origin.
  • Injection preparations for intravenous and intraarterial applications are used for the treatment of the cause of cardiac arrhythmias, atherosclerosis, cerebral infarctions, cerebral thrombosis, coronary thrombosis and cardiac infarction as a result of atheromatous plaque formation.
  • the enzyme counteracts the formation of atheromatous plaques or dissolves them on prolonged use.
  • hyaluronate lyase can be used to counteract the triggering cause of myocardial infarction, atheromatous plaque formation, which is a prerequisite for the subsequent acute occlusion of the vessel by a blood thrombus.
  • the heart attack is interpreted as a normal vascular disease whose treatment is to be understood as a therapy of atherosclerotic changes or plaque formation.
  • this presentation does not do justice to the complex pathophysiology of a heart attack and its life-threatening consequences.
  • the irreversible state is particularly pronounced when the vascular occlusion is not abolished within a few hours by therapeutic measures such as the injection of antithrombotic agents.
  • the subsequent irreversible sequelae are later associated with scarring and loss of function of the heart muscle as well as in unfavorable cases death. Because of the acute threat to life therefore a specific, especially a very fast-acting therapy for the secondary symptoms is necessary.
  • a specific therapy should limit the extent of the damage or make the damage at least partially reversible.
  • the relatively slow-acting plaque degradation in the case of secondary symptoms occurring according to the application of hyaluronate lyase proposed by Presselt (WO 00/39290) is far from sufficient for this purpose.
  • Gottlieb (US Pat. No. 3,708,575) proposes treating human vascular diseases such as cardiac arrhythmias, thromboses, cardiac and cerebral infarctions with hyaluronidase from animal testes (molar mass 120,000 D) in high dosages of 20,000 to 1,000,000 IU per injection.
  • An isotonic sterile solution of, for example, 10,000 IU / ml is injected intravenously, intraarterially or intrathecally.
  • the enzyme was obtained from bovine testes.
  • the bovine testicular hyaluronidase is erroneously referred to in the patent title as glucuronoglycosaminoglycan hyaluronate lyase, although it is clear from the description of the invention and the cited literature that it is an enzyme from bovine testes.
  • a hyaluronidase with the cleavage specificity of a lyase is not detectable in animal testes. Esterase activity attributed to the enzyme also indicates hyaluronidase and not hyaluronate lyase.
  • the method used to measure specific activity refers to a protocol for the determination of hyaluronidases.
  • testicular hyaluronidases are limited because of the relatively low and rapidly decreasing effect of multiple uses as well as the increased risk of transmission of infectious material.
  • purification of hyaluronidases from tissue macerates with a naturally high proportion of foreign proteins and lipoid compounds requires a high cleaning effort, so that highly active preparations can not be produced.
  • bovine test hyaluronidase is due to marked inhibition of the enzyme by sulfated glucosaminoglycans such as heparin or heparin-like glucosaminoglycans present in the mammalian extracellular matrix.
  • the invention is therefore based on the object to find means for the aforementioned treatment, with which in particular the life-threatening consequences of myocardial infarction can be treated quickly and effectively.
  • the active substance contained in the agents should not or only to a lesser extent cited the disadvantages of testicular hyaluronidase or of hyaluronidases of animal origin and, even when it is used, do not give rise to any danger from possible infections.
  • compositions comprising microbial hyaluronate lyases or their fragments which, according to their cleavage mechanism, are used as lyases of the enzyme classification number E.C. 4.2.2.1, among other things, lead to an intensive and rapid reduction of postischemic damage to the myocardium.
  • the hyaluronate lyases used are formed in particular by the microorganism of the genus Streptococcus, in particular the serological groups B or C, preferably by the species Streptococcus agalactiae and in particular by Streptococcus equisimilis or by a recombinant microorganism during a fermentation.
  • the recombinant microorganism used is preferably a microorganism of the species E. coli, in particular the strain Escherichia coli EC 084 (HKI 0295).
  • the enzymatic active ingredient unlike testicular hyaluronidases or other hyaluronidases of animal origin, cleaves hyaluronic acid according to an elimination mechanism to form unsaturated cleavage products.
  • hyaluronidases of animal origin E.C. 3.2.1.35/36) hydrolytically cleave the hyaluronic acid upon addition of water to form saturated cleavage products.
  • the hyaluronate lyases continue to differ from animal hyaluronidases by the amino acid sequences as well as the isoelectric points (IP).
  • the invention relates to galenic formulations or compositions containing microbial hyaluronate lyase and / or the active fragments prepared therefrom for the rapid treatment of acute myocardial infarction or symptoms thereon and for the treatment of postinfarctional myocarditis and myocardial ischemia.
  • implantation of valve prostheses, pacemaker supplies or coronary angiography to avoid reperfusion syndromes as well as in pectanginous complaints and acute myocardial infarction applied.
  • the particularly rapid onset of action of the agent is achieved by the application of enzyme activities up to 1,000,000 IU / kg body weight (body weight).
  • the application of such high activities has not been suggested, u. a. also because such high enzyme activities could not be produced economically.
  • the observed effect is surprising.
  • the application of the active ingredient-containing galenic formulation in high doses is carried out according to the invention by intravenous injection or via a cardiac catheter.
  • the use of the microbial hyaluronate lyases in the proposed high doses does not indicate adverse effects on the health of experimental animals.
  • the hyaluronanase activity for prophylactic use is between 100 IU / kg body weight (KG) and 1,000,000 IU / kg body weight, preferably 1000 IU / kg body weight to 500,000 IU / kg body weight.
  • the use of these relatively high activities per dose certainly also in the context of the absence of inhibitors, leads to the rapid neutralization of the life-threatening consequences of myocardial infarction.
  • Another advantage of the proposed agent is that it can be produced in a simple manner in the high activities required for the application as decisive prerequisites for effective therapy.
  • microbial hyaluronate lyases which are an enzyme group hitherto not used to treat the life-threatening consequences of myocardial infarction, develop a rapid cardioprotective effect in the proposed high dosage by reducing the damaging effect of ischemia on the myocardial cell membranes , Ventricular fibrillation or other tachycardiac arrhythmias, which usually occur in the first few hours of the infarction as an expression of electrical instability and are significantly responsible for the high mortality, are prevented and cardiac necrosis and scarring are reduced.
  • the observed cardioprotective effects of hyaluronate lyase have not previously been described in the literature.
  • the interstitial edema that occurs during myocardial infarction increases extracellular pressure and disturbs the microcirculation of the heart muscle.
  • the parallel released enzymes accumulate in the cardiac lymph. Their volume gradually increases as a result of the infarct event.
  • ischemic tissue before myocardial necrosis can develop, a reduction in lymphatic filling can be observed.
  • This mechanism of lymphatic blockage or collapse apparently plays an essential role in the pathophysiology of myocardial infarction. Reduced lymphatic drainage causes local accumulation of potentially toxic products that can contribute to local damage.
  • the rapid action of the agent may also be related to the absence in the blood plasma of any natural inhibitors that inhibit hyaluronate lyase.
  • hyaluronidase is inhibited by such natural inhibitors. This property of hyaluronate lyases should be of benefit for the treatment of heart attacks, since no tissue inactivation suppresses the activity of the enzyme, thus allowing it to uninhibitedly penetrate into the tissue and exert its effect.
  • the activity of hyaluronate lyase from Streptococcus equisimilis is also hardly inhibited by another class of inhibitors, the sulfated glycosaminoglycans, such as sulfated hyaluronic acid or heparin.
  • the agents containing microbial hyaluronate lyases are used for their inventive use in the form of galenic formulations. They contain as Injection preparation, for example, an isotonic aqueous solution of a highly purified microbial Hyaluronatlyase with concentrations up to 2,000,000 IU / ml and conventional excipients in injection preparations.
  • the enzyme protein of hyaluronate lyase is advantageously used in the form of a storage-stable solid, which generally contains stabilizing additives, for example, filled in glass ampoules. The use of freeze-dried active ingredient is particularly advantageous. As stabilizing additives z.
  • sodium chloride, glucose, magnesium salts, polyvinylpyrrolidine, amino acid, albumins and their hydrolyzates or gelatin and its hydrolysates can be used.
  • the solid in physiological saline Prior to application, the solid in physiological saline is dissolved into an isotonic injection formulation.
  • the enzyme activity of an ampoule after filling with physiological saline solution is between 1000 IU / ml and 2,000,000 IU / ml.
  • a catheter enzyme-containing solutions which contain 50 IU / ml to 1,000,000 IU / ml Hyaluronatlyase and have a similar composition as the injection solutions.
  • the preparation of the microbial hyaluronate lyases used in the injection or catheter formulation can be carried out, for example, with regard to the sequence and selection of the purification steps in a manner not limiting the scope of the invention as follows. Without specifying the invention on the Hyaluronatlyase or its fragment on a particular microorganism, the invention is illustrated by the example of the enzyme from the generally available Streptococcus agalactiae.
  • Hyaluronate lyase is recovered as a highly purified enzyme for injection or the purified hyaluronate lyase is converted into a fragment with a specific protease by the following purification procedures.
  • the recombinant strain Escherichia coli EC 084 (HKI 0295) is used to produce a hyaluronate lyase substantially identical to the enzyme from Streptococcus agalactiae.
  • This strain was deposited with the DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH in Braunschweig according to the Budapest Treaty.
  • the preparation of the high-purity hyaluronate lyase and the highly purified fragment in a form suitable for the composition according to the invention can be carried out by way of example with regard to the order and the selection of the purification steps in a manner not limiting the scope of the invention as follows.
  • the fermentation of the microorganism, z. is carried out in a stirred fermenter under pH constant maintenance at an acidity of pH 6.5 to 7.5.
  • the lactic acid formed during the fermentation is neutralized by the addition of dilute sodium hydroxide solution.
  • the medium consists of inorganic salts, yeast hydrolyzate, optionally casein peptone or soy peptone, as well as glucose.
  • the cells are separated.
  • the cell mass is going through Microfiltration separated by filter modules with a pore size of for example 0.45 microns and discarded.
  • the culture filtrate is concentrated in an ultrafiltration apparatus and purified.
  • the exclusion limit (cut off) of the ultrafilter module is 80,000 D.
  • the result is a pre-cleaned enzyme solution, which is subjected to known purification methods.
  • the culture filtrate is concentrated in an ultrafiltration apparatus and purified.
  • the exclusion limit of the ultrafilter module is between 30 and 50 kD.
  • the result is a pre-purified enzyme solution, which must be subjected to further purification steps before it can be used as an injection preparation.
  • the purification steps and the use of pyrogen-free auxiliaries result in pyrogen-free preparation of the injection preparation.
  • the enzyme After increasing the ionic strength by adding ammonium sulfate to a saturation of 40%, the enzyme is adsorbed on phenylsepharose. Subsequently, the desorption is carried out with a neutral buffered aqueous solution containing 25% ammonium sulfate, based on 100% saturation. The solution is treated after a dialysis step to remove impurities with Q-Sepharose (Pharmacia). Subsequently, a specific adsorption to a dye, z. B. aminophenyloxamic acid. The final cleaning may be together with the determination of the molecular weight in the form of a molecular weight chromatography on Superdex (Pharmacia).
  • Streptococcus equisimilis When Streptococcus equisimilis is used as enzyme-forming agent, the remainder step is eliminated by adsorption on the dye.
  • the enzymatically active fragment is prepared by partial digestion or proteolytic partial degradation of the holoenzyme with a gap-specific protease, which cleaves the peptide bond preferentially on the C-terminal side of the aromatic amino acids.
  • the partial digestion of the holoenzyme to the fragment is carried out with immobilized or non-immobilized specific protease.
  • the highly purified enzyme or enzyme fragment show only a specific precipitation after immunization in the rabbit. Monoclonal antibodies stain all detectable bands in the blot.
  • the holoenzyme has a specific activity of about 400,000 IU / mg and the specific activity of the fragment is between about 400,000 and 800,000 IU / mg.
  • at least one of the stabilizers for example albumin, preferably ovalbumin, and inorganic salts are added to the enzyme or fragment.
  • proteases are used for digestion, which cleave the C-terminal peptide bond of aromatic amino acids.
  • MO / 2 which is prepared from the culture filtrate of Streptomyces hygroscopicus (strain AP 40).
  • MO / 2 is a metalloenzyme with Co + "1" in the active center (DD 270 924).
  • the proteases are preferably used in purified form.
  • protease MO / 2 is purified, for example, by chromatography on phenylsepharose, DEAE-Sepharose, Q-Sepharose and Sephacryl SlOO with an enrichment factor of 20.
  • the molecular weight of the enzyme as determined by SDS gel electrophoresis and molecular weight chromatography on Sephadex G50 superfme is 14,000 to 15,000 D.
  • the enzyme hydrolyzes natural polypeptides such as casein, hemoglobin, bovine serum, albumin and ovalbumin.
  • An advantage of the use of the protease MO / 2 is that the enzyme cleaves proteins very specifically or has a very low general digestive activity towards proteins. The enzyme almost exclusively cleaves only the peptide bonds of the C-terminal residue from the aromatic amino acids. It has an esterolytic activity towards N-benzoyl-L-proline-nitroanilide and pronounced milk-precipitating properties.
  • the properties of milk precipitation which is detectable in the formation of a long-term stable casein gel, comparable to the gel which occurs in milk precipitation with the very specific lab enzyme, are further evidence of the limited activity of the protease which is very advantageous for the invention MO / 2, specifically to cleave the bonds of the holoenzyme, without leading to degradation of the fragments.
  • the protease MO / 2 is bound to suitable insoluble immobilization supports and used in this form for the cleavage of the holoenzyme.
  • the composition of the basal perfusion solution was: NaCl 118 mmol / l, KCl 4.7 mmol / l, CaCl 2 2.5 mmol / l, NaHPO 4 1.2 mmol / l, NaHCO 3 24.9 mmol / l, MgSO 4 1.6 mmol / l, glucose 5.5 mmol / l, Na pyruvate 2.0 mmol / l and Na 2 EDTA 0.5 mmol / l.
  • the hyaluronate lyase solution used was prepared as follows: One vial of hyaluronate lyase corresponding to 200,000 IU was dissolved in ice-cold distilled water (1 ml) and perfusion solution (4 ml) and immediately added to 1995 ml of tempered and fumigated perfusion solution so that the concentration was 100 IU / ml , With this solution, the heart was perfused either before or after global ischemia. After removal of the hearts they were clamped in the perfusion apparatus and perfused for 15 min with basal perfusion solution until stable action potentials were achieved.
  • LDH activity is a measure of cardiac damage due to permeability and integrity changes of cardiac cell membranes (LDH activity is proportional to the extent of cardiac damage).
  • Vl lactate dehydrogenase
  • the conditions given in Vl resulted in irreversible ventricular fibrillation from the 30 minute reperfusion. In V2 and V3 no ventricular fibrillation was observed until the 85th minute.
  • the protective effect of hyaluronate lyase was more effective in perfusion after ischemia (V3) with a perfect sinus rhythm comparable to the situation before ischemia.
  • V3 perfusion after ischemia
  • Body weight and mean weight of the isolated hearts of the control animals were not significantly different from the measurements of the dogs treated with hyaluronate lyase.
  • the mean weight of the infarcted myocardium in the control group was 11.2 ⁇ 1.8 g.
  • Hyaluronatlyase significantly reduced infarct tissue (p ⁇ 0.02) to 3.1 ⁇ 0.4 g. This confirms the cardioprotective effect of microbial hyaluronate lyase in vivo.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft bzw. ein aus diesem Enzym hergestelltes kleineres aktives Fragment und von pharmazeutischen Formulierungen enthaltend dieses Enzym oder Fragment insbesondere zur Therapie der Folgen eines Herzinfarktes bzw. Symptomen darauf. Das Enzym wird als Injektionspräparat bzw. Perfusionslösung zur Therapie von Herzinfarkten und Reperfusionssyndromen, zur Behandlung pektanginöser Beschwerden und von Myokardinfarkten sowie zur Kardioprotektion unter und nach invasiven, chirurgischen bzw. diagnostischen Eingriffen am Herzen, z. B. Bypass-Operationen, Implantationen von Klappenprothesen, Schrittmacherversorgungen oder Koronarangiographien eingesetzt. Bei der Behandlung wird die Hyaluronatlyase intravenös injiziert oder mit Hilfe eines Katheters appliziert.

Description

Hyaluronatlyase enthaltendes Mittel zur Behandlung des akuten Myokardinfarktes bzw. Symptomen darauf sowie zur Behandlung von postinfarktioneller Myokarditis und Myokardischämie
Die Erfindung betrifft Mittel enthaltend einen neuen Wirkstoff zur Behandlung des akuten Myokardinfarktes bzw. Symptomen darauf sowie zur Behandlung von postinfarktioneller Myokarditis und Myokardischämie. Der vorgeschlagene Wirkstoff besitzt Glukosaminoglykan-spaltende Aktivität und ist vor allem durch bevorzugten Abbau von Hyaluronsäure charakterisiert.
Zu den Glukosaminoglykanen gehören neben der Hyaluronsäure Chondroitinsulfat, Dermatansulfat und Heparansulfat. Diese kommen im Gewebe aller Vertebraten vor. Hyaluronsäure ist besonders in der interzellulären Matrix der Haut und des Knorpelgewebes sowie in Körperflüssigkeiten, wie Kammerwasser der Augen und Gelenkflüssigkeit vorhanden. Zusammen mit den anderen Glukosaminoglykanen ist Hyaluronsäure Bestandteil der Wände von Blutgefäßen, insbesondere auch athero- matöser Ablagerungen bzw. Plaques auf Arterieninnenwänden. Hyaluronsäure hat die Eigenschaft, Wasser unter Bildung viskoser, hydrokolloider Lösungen zu binden oder mit basischen Proteinen schwerlösliche Polyelektrolytkomplexe zu bilden. Sie besteht aus Glukuronsäure und azetyliertem Glukosamin, die durch ß-(l-3)-glycosidische Bindungen verbunden sind. Diese Disaccharideinheiten sind wiederum miteinander durch glycosidische ß-(l-4)-Bindungen verbunden. Hyaluronsäure wird durch Hyaluronidasen nach einem hydrolytischen Mechanismus gespalten. Der Begriff Hyaluronidasen beschreibt nicht korrekt drei unterschiedlich wirkende Typen hyaluronsäurespaltender Enzyme (Ludowieg J: The mechanisms of hyaluro- nidases. J Biol Chem 236, S.333-339, 1961). Es sind einmal die Endohydrolasen, die die ß-(l-4)-Bindungen hydrolytisch spalten. Zu ihnen gehören die Mehrzahl der Hyaluronidasen aus höheren Organismen, beispielsweise die Hyaluronidase aus Rinderhoden. Diese Hyaluronat-Glycanhydrolasen (Hyaluronoglucosaminidasen / E.C. 3.2.1.35) spalten neben den Bindungen der Hyaluronsäure in einem begrenzten Maße auch andere Glukosaminoglykane. Einen weiteren Typ stellt die Endo-ß-Hyalurono- glucuronidase (E.C. 3.2.1.36) aus dem Blutegel dar, welche die ß-(l-3)-Bindung hochspezifisch spaltet. Der dritte Enzymtyp, die Hyaluronatlyase (E.C. 4.2.2.1.), spaltet Hyaluronsäure in der ß-(l-4)-Bindung nach einem Eliminierungsmechanismus unter Bildung einer Doppelbindung in (4-5)-Stellung an der Glukuronsäure. Hyaluronat- lyasen sind häufig mikrobieller Herkunft. Sie werden beispielsweise in Streptomyceten und in anderen Bakterien gefunden. Ihr gemeinsames Merkmal ist ihre hohe Spezifität gegenüber Hyaluronsäure. Andere Glukosaminoglykane werden in der Regel in einem vemachlässigbaren Ausmaß gespalten (Ozegowski JH, Günther E, Reichardt W: Purification and characterization of hyaluronidase from Streptococcus agalactiae. ZbI Bakt 280, S.497-506, 1994 / Ohya, T. and Kaneko, Y.: Novel hyaluronidase from Streptomyces. Biochim Biophys Acta 198, S.607-609, 1970 / Gase K, Ozegowski JH., Malke H: The Streptococcus agalactiae hylB gene encoding hyaluronate lyase - completion of the sequence and expression analysis. Biochim Biophys Acta 1398(1), S.86-98, 1998).
Allgemein ist bekannt, dass Applikation von Hyaluronidasen tierischer Herkunft, speziell der bovinen testikulären Hyaluronidase, den Schaden reduzieren, der durch einen Herzinfarkt entsteht (Repa I, Garnic JD, Hollenberg NK: Myocardial infarction treated with two lymphagogues, calcium dobesilate (CLS 2210) and Hyaluronidase - a coded, placebo-controlled animal study. J Cardiovasc Pharmacol 16, S.286-291, 1990). Rinderhodenhyaluronidase hat einen förderlichen Effekt auf den kollateralen Blutfluß in das ischämische Gewebe (Askenazi J, Hillis LD, Diaz PE et al.: The effects of hyaluronidase on coronary blood flow following coronary artery occlusion in the dog. Circ Res 40, S.566-571, 1977 / Premaratne S, Watanabe BI, LaPenna WF, et al.: Effects of hyaluronidase on reducing myocardial infarct size in a baboon model of ischemia-reperfusion injury. J Surg Res 58, S.205-210, 1995). Es wird vermutet, dass eine Behandlung mit Hyaluronidase tierischer Herkunft die postischämische Genesung der Herzfunktion durch eine Vergrößerung des Herz- Lymph- Volumens verbessert (Yotsumoto G, Moriyama Y, Yamaoka A et al.: Experimental study of cardiac lymph dynamics and edema formation in ischemia/reperfusion injury — with reference to the effect of hyaluronidase. Angiology 49, S.299-305, 1998).
Durch die Fähigkeit, Wasser zu binden, trägt die interstitielle Akkumulation von Hyaluronsäure zum interstitiellen Ödem im infarzierten Herzmuskelgewebe bei. Interstitielle Ödeme beeinflussen wahrscheinlich elektromechanische Charakteristiken des Myokards, ermöglichen aufgrund des Kontaktverlustes zwischen Muskelzellen Reentry-Phänomene und führen so zu Tachykardien bis hin zum Kammerflimmern. Desweiteren verursachen Ödeme erhöhten extrazellulären Druck und stören die Mikrozirkulation des Myokards durch eine veränderte Herzwand-Compliance. Durch Abbau der Hyaluronsäure begrenzt bovine testikuläre Hyaluronidase den zellulären Schaden während der myokardialen Ischämie (Waidenstrom A, Martinussen HJ, Gerdin B et al.: Accumulation of hyaluronan and tissue edema in experimental myocardial infarction. J Clin Invest 88, S.1622-1628, 1991).
Presselt (WO 00/39290) schlägt die Behandlung atheromatöser Gefäßkrankheiten von Mensch und Tier mit Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft vor. Injektionspräparate für intravenöse und intraarterielle Applikationen werden für die Behandlung der Ursache von Herzrhythmusstörungen, Atherosklerose, zerebralen Infarkten, zerebralen Thrombosen, Koronarthrombosen und kardialen Infarkten als Folge atheromatöser Plaquebildung eingesetzt. Das Enzym wirkt der Entstehung atheromatöser Plaques entgegen bzw. löst diese bei längerer Anwendung auf. Gemäß diesem Schutzrecht kann mit Hyaluronatlyase der auslösenden Ursache des Herzinfarktes, der athermatösen Plaquebildung, die eine Vorbedingung für den nachfolgenden akuten Verschluß des Gefäßes durch einen Blutthrombus ist, entgegengewirkt werden. Der Herzinfarkt wird hierbei als normale Gefäßkrankheit interpretiert, deren Behandlung als Therapie der atherosklerotischer Veränderungen bzw. Plaquebildung zu verstehen ist. Diese Darstellung wird jedoch der komplexen Pathophysiologie eines Herzinfarktes und dessen lebensbedrohlicher Folgen bei weitem nicht gerecht. Ausgelöst durch Plaquebzw, nachfolgender Thrombusbildung entstehen nach dem Gefäßverschluß sehr schnell Myokardläsionen und -nekrosen, die aus einer Unterbrechung oder einer kritischen Verminderung der Sauerstoffzufuhr im Herzmuskel resultieren und weitgehend irre- versiblen Charakter haben. Der irreversible Zustand tritt insbesondere dann verstärkt auf, wenn der Gefäßverschluß nicht innerhalb weniger Stunden durch therapeutische Maßnahmen wie der Injektion von antithrombisch wirkende Mitteln aufgehoben wird. Die weitgehend irreversible Folgesymptomatik sind neben irreversiblen Herzmuskel- nekrosen später dann Narbenbildung verbunden mit Funktionsverlust des Herzmuskels sowie in ungünstigen Fällen der Eintritt des Todes. Wegen der akuten Lebensbedrohung ist deshalb eine spezifische, insbesondere eine sehr schnell wirkende Therapie gegen die Folgesymptomatik notwendig. Durch eine spezifische Therapie sollte das Ausmaß der Schädigung begrenzt bzw. der Schaden zumindestens teilweise reversibel gestaltet werden. Der relativ langsam wirkende Plaque-Abbau bei auftretender Folgesymptomatik entsprechend der von Presselt (WO 00/39290) vorgeschlagenen Anwendung von Hyaluronatlyase ist hierfür bei weitem nicht ausreichend. Gottlieb (US 3,708,575) schlägt vor, Gefäßkrankheiten des Menschen wie Herz- arrhythmien, Thrombosen, kardiale und zerebrale Infarkte mit Hyaluronidase aus Tierhoden (Molmasse 120.000 D) in hohen Dosierungen von 20.000 bis 1.000.000 IU pro Injektion zu behandeln. Eine isotonische sterile Lösung mit beispielsweise 10.000 IU/ml wird intravenös, intraarteriell oder intrathekal injiziert. Das Enzym wurde aus Rinderhoden gewonnen. Irrtümlicherweise wird die bovine testikuläre Hyaluronidase im Patenttitel als Glucuronoglycosaminoglycan-Hyaluronatlyase gefuhrt, obwohl aus der Erfindungsbeschreibung und der zitierten Literatur eindeutig hervorgeht, dass es sich um ein Enzym aus Rinderhoden handelt. Eine Hyaluronidase mit der Spaltungs- spezifität einer Lyase ist jedoch in Tierhoden nicht nachweisbar. Eine dem Enzym zugeschriebene Esteraseaktivität deutet ebenfalls auf eine Hyaluronidase und nicht auf eine Hyaluronatlyase hin. Auch bezieht sich die angewendete Methode zur Messung der spezifischen Aktivität auf eine Vorschrift zur Bestimmung von Hyaluronidasen.
Der Einsatz testikulärer Hyaluronidasen ist aus Gründen der relativ geringen und bei mehrfacher Verwendung sehr schnell nachlassenden Wirkung sowie aufgrund der zunehmenden Gefahr der Übertragung von infektiösem Material eingeschränkt. Darüber hinaus erfordert die Reinigung der Hyaluronidasen aus Gewebemazeraten mit einem naturgemäß hohen Anteil an Fremdproteinen und lipoiden Verbindungen einen hohen Reinigungsaufwand, sodass hochaktive Präparate nicht herstellbar sind. Es gibt außerdem Hinweise, dass die relativ geringe Wirkung der Hyaluronidase aus Rindertestes auf die ausgeprägte Inhibition des Enzyms durch sulfatierte Glukosamino- glykane wie Heparin oder heparinähnliche Glukosaminoglykane, die in der extrazellulären Matrix von Säugern vorhanden sind, zurückzufuhren ist. Es ist ein Anliegen der Erfindung, ein neues effektives Mittel zur Behandlung des akuten Myokardinfarktes bzw. Symptomen darauf sowie zur Behandlung von postinfarktioneller Myokarditis und Myokardischämie zu finden, welches dafür besser geeignet ist als Mittel welche bovine testikuläre Hyaluronidasen enthalten und für deren Gabe mehr als 9 Stunden nach den ersten Symptomen eines Herzinfarktes kein signifikanter Nutzen nachgewiesen werden konnte (MILIS Study Group: Hyaluronidase therapy for acute myocardial infarction - results of a rando-mized, blinded, multicenter trial. Am J Cardiol 57, S.1236-1243, 1986).
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, Mittel für die vorgenannte Behandlung aufzufinden, mit dem insbesondere die lebensbedrohlichen Folgen des Myokardinfarktes schnell und wirksam therapiert werden können. Der in den Mitteln enthaltene Wirkstoff soll die angeführten Nachteile der testikulären Hyaluronidase bzw. von Hyaluronidasen tierischer Herkunft nicht oder lediglich in geringerem Maß aufweisen und auch bei seiner Verwendung keine Gefährdung durch eventuelle Infektionen entstehen lassen.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass Mittel, welche mikrobielle Hyaluronatlyasen bzw. ihre Fragmente, die nach ihrem Spaltmechanismus als Lyasen der Enzymklassifikationsnummer E.C. 4.2.2.1 zugerechnet werden, enthalten, unter anderem zu einer intensiven und schnellen Reduktion des postischämischen Schadens am Myokard fuhren. Die eingesetzten Hyaluronatlyasen werden insbesondere durch den Mikroorganismus der Gattung Streptococcus, insbesondere den serologischen Gruppen B bzw. C zugehörig, bevorzugt durch die Arten Streptococcus agalactiae und besonders aus Streptococcus equisimilis oder durch einen rekombinanten Mikroorganismus bei einer Fermentation gebildet. Als rekombinanter Mikroorganismus wird bevorzugt ein Mikroorganismus der Art E. coli, insbesondere der Stamm Escherichia coli EC 084 (HKI 0295) eingesetzt. Der enzymatische Wirkstoff spaltet, anders als testikuläre Hyaluronidasen bzw. andere Hyaluronidasen tierischer Herkunft, Hyaluronsäure nach einem Eliminierungs- mechanismus unter Bildung von ungesättigten Spaltprodukten. Im Gegensatz dazu spalten Hyaluronidasen tierischer Herkunft (E.C. 3.2.1.35/36) die Hyaluronsäure hydrolytisch bei Anlagerung von Wasser unter Bildung gesättigter Spaltprodukte. Die Hyaluronatlyasen unterscheiden sich von tierischen Hyaluronidasen weiterhin durch die Aminosäuresequenzen sowie die Isoelektrischen Punkte (IP).
Demgemäß betrifft die Erfindung galenischen Formulierungen bzw. Mittel enthaltend mikrobielle Hyaluronatlyase und/oder die aus ihr hergestellten aktiven Fragmente zur schnellen Behandlung des akuten Myokardinfarktes bzw. Symptomen darauf sowie zur Behandlung von postinfarktioneller Myokarditis und Myokardischämie. Bevorzugt werden die Mittel für die Kardioprotektion unter und nach invasiven, chirurgischen bzw. diagnostischen Eingriffen am Herzen, z. B. Bypass-Operationen, Implantationen von Klappen-prothesen, Schrittmacherversorgungen oder Koronarangiographien, zur Vermeidung von Reperfusionssyndromen sowie bei pectanginösen Beschwerden und akuten Myokardinfarkten appliziert.
Das besonders schnelle Eintreten der Wirkung des Mittels wird durch die Anwendung von Enzymaktivitäten bis zu 1.000.000 IU/kg Körpergewicht (KG) erreicht. Die Applizierung derartig hoher Aktivitäten wurde bisher nicht vorgeschlagen, u. a. auch deshalb, weil so hohe Enzymaktivitäten nicht in wirtschaftlicher Weise herstellbar waren. Insofern ist die beobachtete Wirkung überraschend. Die Applizierung der wirkstoffhaltigen galenischen Formulierung in hohen Dosen erfolgt erfindungsgemäß durch intravenöse Injektion oder über einen Herzkatheter. Die Verwendung der mikrobiellen Hyaluronatlyasen in den vorgeschlagenen hohen Dosen zeigt keine negativen Auswirkungen auf den Gesundheitszustand von Versuchstieren.
Die Hyaluronalyase-Aktivität für die prophylaktische Nutzung liegt zwischen 100 IU/kg Körpergewicht (KG) und 1.000.000 IU/kg KG, bevorzugt 1000 IU/kg KG bis 500.000 IU/kg KG. Die Verwendung dieser relativ hohen Aktivitäten pro Dosis führt - sicherlich auch im Zusammenhang mit dem NichtVorhandensein von Inhibitoren - zu der schnellen Neutralisierung der lebensbedrohlichen Folgen des Myokardinfarktes. Vorteilhaft an dem vorgeschlagenen Mittel ist auch, dass es in den für die Anwendung notwendigen hohen Aktivitäten als entscheidende Voraussetzungen für eine wirksame Therapie, auf einfachem Weg herstellbar ist. Es hat sich somit gezeigt, dass mikrobielle Hyaluronatlyasen, die eine bisher nicht zur Behandlung der lebensbedrohlichen Folgen von Herzinfarkten eingesetzte Enzymgruppe darstellen, in der vorgeschlagenen hohen Dosierung eine schnelle kardioprotek- tive Wirkung entfalten, indem sie die schädigende Wirkung der Ischämie auf die myokardialen Zellmembranen verringern. Kammerflimmern bzw. andere tachykarde Herzrhythmusstörungen, die regelhaft vor allem in den ersten Stunden des Infarktes als Ausdruck der elektrischen Instabilität auftreten und wesentlich für die hohe Sterblichkeit verantwortlich sind, werden verhindert sowie Herzmuskelnekrosen und Narbenbildung reduziert. Die beobachteten kardioprotektiven Effekte der Hyaluronatlyase sind in der Literatur bisher nicht beschrieben worden. In den bisher publizierten Studien wurden allerdings auch keine bakteriellen Hyaluronatlyasen, sondern Hyaluronidasen tierischer Herkunft, vor allem Rinderhodenhyaluronidasen, verwendet. Dieser überraschende Vorteil der mikrobiellen Hyaluronatlyase gegenüber testikulärer Hyaluronidase ist über eine Erhöhung des Herzlymphvolumens nicht hinreichend zu begründen und nur multifak- toriell erklärbar. Die Kardioprotektion durch Hyaluronatlyase ist unabhängig von antiatherogenen oder antiatheromatösen Effekten des Enzyms und auch in Abwesenheit atherosklerotischer Gefaßveränderungen nachweisbar. Der herausragenden kardioprotektiven Wirkung der Hyaluronatlyase liegt ein neuer, bisher unbekannter Wirkmechanismus zu Grunde.
Die bei Myokardinfarkt auftretenden interstitiellen Ödeme steigern den extrazellulären Druck und stören die Mikrozirkulation des Herzmuskels. Die parallel freigesetzten Enzyme akkumulieren in der Herzlymphe. Deren Volumen nimmt infolge des Infarktereignisses graduell zu. Dagegen ist im ischämischen Gewebe, bevor myokar- diale Nekrosen entstehen können, eine Reduktion der Lymph-Füllung zu beobachten. Dieser Mechanismus des Lymphverschlusses bzw. -kollapses spielt offenbar eine wesentliche Rolle in der Pathophysiologie des Herzinfarktes. Reduzierte Lymphdrainage verursacht die lokale Akkumulation von potentiell toxischen Produkten, die zu einer lokalen Schädigung beitragen können.
Die schnelle Wirkung des Mittels kann möglicherweise auch damit zusammenhängen, dass im Blutplasma keine natürlichen Inhibitoren vorhanden sind, welche die Hyaluronatlyase hemmen. Die Hyaluronidase wird im Gegensatz hierzu durch solche natürliche Inhibitoren gehemmt. Diese Eigenschaft der Hyaluronatlyasen sollte für die Behandlung von Herzinfarkten von Vorteil sein, da keine Gewebe-Inaktivierung die Aktivität des Enzyms unterdrückt und dieses somit ungehemmt in das Gewebe penetrieren und ihre Wirkung entfalten kann.
Weiterhin wird im Gegensatz zur Aktivität der testikulären Hyaluronidase die Aktivität von Hyaluronatlyase aus Streptococcus equisimilis auch durch eine weitere Klasse von Inhibitoren, den sulfatierte Glukosaminoglykanen, wie beispielsweise der sulfatierten Hyaluronsäure oder Heparin, kaum inhibiert.
Die Mittel enthaltend mikrobielle Hyaluronatlyasen werden für ihre erfinderische Verwendung in Form von galenischen Formulierungen eingesetzt. Sie enthalten als Injektionspräparat beispielsweise eine isotonische wässrige Lösung einer hochgereinigten mikrobiellen Hyaluronatlyase mit Konzentrationen bis zu 2.000.000 IU/ml und in Injektionspräparaten übliche Hilfsstoffe. Das Enzymprotein der Hyaluronatlyase wird vorteilhaft in Form eines lagerstabilen Feststoffes, der in der Regel stabilisierende Zusätze enthält, beispielsweise in Glasampullen abgefüllt, eingesetzt. Besonders vorteilhaft ist der Einsatz von gefriergetrocknetem Wirkstoff. Als stabilisierende Zusätze können z. B. Natriumchlorid, Glukose, Magnesiumsalze, Polyvinylpyrrolidin, Aminosäure, Albumine und deren Hydrolysate oder Gelatine und deren Hydrolysate verwendet werden. Vor der Applizierung wird der Feststoff in physiologischer Kochsalzlösung zu einer isotonischen Injektionsformulierung gelöst. Die Enzymaktivtät einer Ampulle liegt nach Auffüllen mit physiologischer Kochsalzlösung zwischen 1000 IU/ml und 2.000.000 IU/ml. Für den Einsatz eines Katheters werden enzymhaltige Lösungen angewendet, die 50 IU/ml bis 1.000.000 IU/ml Hyaluronatlyase enthalten und eine ähnliche Zusammensetzung wie die Injektionslösungen aufweisen.
Die Herstellung der in der Injektions- bzw. Katheterformulierung eingesetzten mikrobiellen Hyaluronatlyasen kann beispielsweise hinsichtlich Reihenfolge und Auswahl der Reinigungsschritte in einer den Schutzumfang der Erfindung nicht einschränkenden Weise wie folgt durchgeführt werden. Ohne damit die Erfindung auf die Hyaluronatlyase oder ihres Fragmentes auf einen bestimmten Mikroorganismus festzulegen, wird die Erfindung am Beispiel des Enzyms aus dem allgemein zugänglichen Streptococcus agalactiae erläutert. Die gebildete Hyaluronatlyase besitzt einen Isoelektrischen Punkt von etwa IP = 8,6 sowie eine Molmasse von etwa 116.000 D und wirkt als Endoglycanase. Durch nachfolgend aufgeführte Reinigungsverfahren wird die Hyaluronatlyase als ein hochgereinigtes Enzym für Injektionszwecke gewonnen oder die gereinigte Hyaluronatlyase mit einer spezifisch wirkenden Protease zu einem Fragment umgesetzt. Als spezifisch wirkende Protease kann, ohne die Erfindung einzuschränken, beispielsweise die saure Metalloprotease MO/2 (DD 270924) eingesetzt werden, die aus dem Mikroorganismus Streptomyces hygroscopicus AP40 gewonnen werden kann. Diese Protease besitzt eine Molmasse von etwa 14 kD und einen Isoelektrischen Punkt zwischen IP = 3,85 bis 4,0.
Zur Herstellung einer mit dem Enzyms aus Streptococcus agalactiae weitgehend identischen Hyaluronatlyase wird der rekombinante Stamm Escherichia coli EC 084 (HKI 0295) eingesetzt. Dieser Stamm wurde bei der DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig entsprechend des Budapester Vertrages hinterlegt.
Die Herstellung der hochreinen Hyaluronatlyase und des hochgereinigtes Fragments in einem für das erfindungsgemäße Mittel geeigneten Form kann beispielhaft in Bezug auf die Reihenfolge als auch die Auswahl der Reinigungsschritte in einer nicht den Schutzumfang der Erfindung einschränkenden Weise wie nachfolgend durchgeführt werden.
Die Fermentation des Mikroorganismus, z. B. eines der oben genannten, erfolgt in einem gerührten Fermenter unter pH-Konstanthaltung bei einer Azidität von pH 6,5 bis 7,5. Die während der Fermentation gebildete Milchsäure wird durch Zugabe von verdünnter Natronlauge neutralisiert. Das Medium besteht aus anorganischen Salzen, Hefehydrolysat, wahlweise Kaseinpepton oder Sojapepton sowie Glukose. Nach etwa 20-stündiger Fermentation werden die Zellen separiert. Die Zellmasse wird durch Mikrofiltration durch Filtermodule mit einer Porenweite von beispielsweise 0,45 μm abgetrennt und verworfen.
Das Kulturfiltrat wird in einem Ultrafiltrationsgerät konzentriert und gereinigt. Die Ausschlussgrenze (cut off) des Ultrafilter-Moduls liegt bei 80.000 D. Es entsteht eine vorgereinigte Enzymlösung, die an sich bekannten Reinigungsmethoden unterworfen wird.
Das Kulturfiltrat wird in einem Ultrafiltrationsgerät konzentriert und gereinigt. Die Ausschlußgrenze des Ultrafilter-Moduls liegt zwischen 30 bis 50 kD. Es entsteht eine vorgereinigte Enzymlösung, die weiteren Reinigungsschritten unterworfen werden muss, bevor sie als Injektionspräparat verwendet werden kann. Durch die Reinigungsschritte und Verwendung pyrogenfreier Hilfsstoffe wird Pyrogenfreiheit des Injektionspräparats erreicht.
Nach Erhöhung der Ionenstärke durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 40 % wird das Enzym an Phenylsepharose adsorbiert. Anschließend erfolgt die Desorption mit einer neutralen gepufferten wässrigen Lösung, die 25 % Ammoniumsulfat, bezogen auf 100 % Sättigung, enthält. Die Lösung wird nach einem Dialyseschritt zur Entfernung von Verunreinigungen mit Q-Sepharose (Pharmacia) versetzt. Anschließend erfolgt eine spezifische Adsorption an einen Farbstoff, z. B. Aminophenyloxaminsäure. Die Endreinigung kann zusammen mit der Bestimmung des Molekulargewichts in Form einer Molekulargewichtschromatografie an Superdex (Pharmacia) bestehen.
Bei Verwendung von Streptococcus equisimilis als Enzymbildner entfällt der Remigungsschritt durch Adsorption an den Farbstoff. Dieses Enzym wirkt als Exogly- canase, sein Isoelektrischer Punkt liegt zwischen IP = 4,5 und IP = 4,8 und es wird in einem geringeren Maß als das Enzym aus Streptococcus agalactiae durch sulfatierte Glukosaminoglykane gehemmt.
Erfindungsgemäß wird das enzymatisch aktive Fragment durch Teilverdauung bzw. proteolytischen Teilabbau des Holoenzyms mit einer spaltspezifisch wirkenden Prote- ase, welche die Peptidbindung bevorzugt an der C-terminalen Seite der aromatischen Aminosäuren spaltet, hergestellt. Die Teilverdauung des Holoenzyms zu dem Fragment erfolgt mit immobilisierter oder auch mit nicht-immobilisierter spezifischer Protease. Vorteilhaft ist an der Umsetzung mit immobilisierter Protease, dass die Verdauung gezielt und ohne Kontamination durch die Protease selbst durchgeführt werden kann. Im Fall der direkten Umsetzung mit zugesetzter Protease muß nach der Verdauung ein Inaktivierungsschritt der Protease, die Abtrennung des Proteaseproteins und eine Hochreinigung erfolgen. Das hochgereinigte Enzym oder das Enzymfragment zeigen nach Immunisierung im Kaninchen nur eine spezifische Präzipitation. Mit monoklonalen Antikörpern werden alle nachweisbaren Banden im Blot angefärbt. Das Holoenzym besitzt eine spezifische Aktivität von etwa 400.000 IU/mg und die spezifische Aktivität des Fragmentes liegt etwa zwischen 400.000 und 800.000 IU/mg. Zur Stabilisierung werden dem Enzym bzw. Fragment mindestens einer der Stabilisatoren, beispielsweise Albumin, bevorzugt Ovalbumin, und anorganische Salze zugesetzt.
Ohne die Erfindung dadurch einzuschränken, soll beispielhaft ein Weg zur Gewinnung des enyzmatische aktiven Fragmentes beschrieben werden. Erfindungsgemäß werden Proteasen zur Verdauung eingesetzt, welche die C-terminale Peptidbindung von aromatischen Aminosäuren spalten. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die Metalloprotease MO/2 eingesetzt, die aus dem Kulturfiltrat von Streptomyces hygroscopicus (strain AP 40) hergestellt wird. MO/2 ist ein Metalloenzym mit Co+"1" im aktiven Zentrum (DD 270 924). Die Proteasen werden bevorzugt in gereinigter Form eingesetzt. Die Reinigung der Protease MO/2 erfolgt beispielsweise durch Chromato- grafie an Phenylsepharose, DEAE-Sepharose, Q-Sepharose and Sephacryl SlOO mit einem Anreicherungsfaktor von 20. Die spezifische Aktivität liegt bei 0,25 Kunitz Units/mg (U/mg), das Reaktionsmaximum bei einer Azidität von pH = 4,2 und das Reaktionstemperaturmaximum bei 65 °C. Das Molekulargewicht des Enzyms, bestimmt durch SDS Gelelektrophorese und Molekulargewichtschromatografie an Sephadex G50 superfme beträgt 14.000 bis 15.000 D. Die Protease MO/2 ist eine Endopeptidase mit einem Isoelektrischen Punkt bei IP = 3,85 und einem bei IP = 3,92. Das Enzym hydrolysiert natürliche Polypeptide wie Kasein, Hämoglobin, Bovinserum, Albumin und Ovalbumin. Vorteilhaft an der Verwendung der Protease MO/2 ist, dass das Enzym Proteine sehr spezifisch spaltet bzw. eine sehr geringe allgemeine Verdauungsaktivität gegenüber Proteinen besitzt. Das Enzym spaltet fast ausschließlich nur die Peptidbindungen des C-terminalen Restes von den aromatischen Aminosäuren. Es besitzt eine esterolytische Aktivität gegenüber N-Benzoyl-L-proline-nitroanilid und ausgeprägte milchfällende Eigenschaften. Die Eigenschaften der Milchfällung, die an der Bildung eines langzeit- stabilen Kaseingels nachweisbar ist, vergleichbar mit dem Gel, welches bei der Milchfällung mit dem sehr spezifisch wirkenden Labenzym auftritt, sind als weiterer Hinweis auf die begrenzte, für die Erfindung sehr vorteilhafte Aktivität der Protease MO/2 zu werten, die Bindungen des Holoenzyms spezifisch zu spalten, ohne zu einem Abbau der Fragmente zu führen. In einer weiteren Ausführung der Erfindung wird die Protease MO/2 an geeignete unlösliche Immobilisierungssupporte gebunden und in dieser Form zur Spaltung des Holoenzyms eingesetzt. Vorteilhaft an dieser Vorgehensweise ist, dass auf diese Weise der Übergang gelöster Protease in die Lösungen der Fragmente verhindert wird.
Beispiel 1
Wirkung bakterieller Hyaluronatlyase auf das Langendorff-Herz bei Applikation vor und nach einer künstlich induzierten globalen Ischämie
Männliche Weiße Neuseelandkaninchen wurden durch zervikale Dislokation betäubt, durch Thorakotomie das Herz entnommen und mit der Aorta an einem Perfusionsapparat befestigt. Die Perfusion erfolgte retrograd nach der Langendorff-Methodemit modifiziertem Krebs-Henseleit-Puffer (pH 7,4) bei konstanter Temperatur (370C), konstantem Druck (60 mmHg) und ständiger Carbogen-Begasung. Die Zusammensetzung der basalen Perfusionslösung war: NaCl 118 mmol/1, KCl 4,7 mmol/1, CaCl2 2,5 mmol/1, NaHPO4 1,2 mmol/1, NaHCO3 24,9 mmol/1, MgSO4 1,6 mmol/1, Glukose 5,5 mmol/1, Na-Pyruvat 2,0 mmol/1 und Na2EDTA 0,5 mmol/1. Die verwendete Hyaluronatlyaselösung wurde wie folgt hergestellt: Eine Ampulle Hyaluronatlyase entsprechend 200.000 IU wurde in eiskaltem destillierten Wasser (1 ml) und Perfusionslösung (4 ml) gelöst und sofort in 1995 ml temperierte und begaste Perfusionslösung gegeben, so dass die Konzentration 100 IU/ml betrug. Mit dieser Lösung wurde das Herz entweder vor oder nach der globalen Ischämie perfundiert. Nach der Entnahme der Herzen wurden diese in die Perfusionsapparatur eingespannt und für 15 min mit basaler Perfusionslösung bis zum Erreichen stabiler Aktionspotentiale perfundiert. In zwei Vorversuchen, die zur Festlegung der Zeitdauer der globalen Ischämie beim Kaninchenherz dienen sollten, wurde für 10 min bzw. 12 min eine globale Ischämie durch das Abklemmen der zuströmenden Perfusionslösung („no flow"-Bedingungen) induziert. Danach wurde erneut mit Perfusionslösung perfundiert. Da in beiden Vorversuchen keine klaren Herzrhythmusstörungen nach Reperfusion im Beobachtungszeitraum auftraten, wurde für die eigentlichen Versuche Vl -V3 eine 15- minütige Dauer der globalen Ischämie festgelegt.
Es wurden folgende Versuchsansätze durchgeführt:
Versuch 1 (Vl)
Kontrollbedingungen mit Puffer 15 min Ischämie 15 min
Reperfusion mit Puffer 85 min
Versuch 2 (V2)
Kontrollbedingungen mit Puffer 15 min 100 IU/ml Hyaluronatlyase im Puffer 15 min Ischämie 15 min Reperfusion mit Puffer 85 min
Versuch 3 (V3) Kontrollbedingungen mit Puffer 15 min Ischämie 15 min Reperfusion mit 100 IU/ml Hyaluronatlyase im Puffer 85 min
Das in jedem Versuch anfallende Eluat wurde zu definierten Zeitpunkten gesammelt und die Laktatdehydrogenase (LDH)-Aktivität bestimmt. Die LDH- Aktivität ist ein Maß für eine Herzschädigung aufgrund von Permeabilitäts- und Integritätsänderungen der kardialen Zellmembranen (LDH-Aktivität ist proportional zum Ausmaß der Herzschädigung) . Die in Vl gegebenen Bedingungen resultierten in einem irreversiblen Kammerflimmern ab der 30 Minute der Reperfusion. In V2 und V3 wurde bis zur 85. Minute kein Kammerflimmern beobachtet. Dabei war die protektive Wirkung der Hyaluronatlyase effektiver bei der Perfusion nach Ischämie (V3) mit einem perfekten Sinusrhythmus vergleichbar zu der Situation vor Ischämie. Zudem trat in der Reperfusions- phase in V3 im Gegensatz zu V2 eine Verlängerung der Aktionspotentialdauer während der gesamten Beobachtungszeit auf. Dies war in erster Linie auf eine verlängerte Depolarisation zurückzuführen und spricht für eine unmittelbare Beteiligung von Kalzium- und Kaliumkanälen. Die gemessene LDH-Aktivität war bei den beiden Versuchen mit Hyaluronatlyase (V2 und V3) um den Faktor 20 geringer im Vergleich zum Versuch Vl. Dies läßt auf eine erheblich geringere Herzschädigung durch Ischämie schließen. Beispiel 2
In vivo- Wirkung intravenös applizierter bakterieller Hyaluronatlyase auf die Größe des Herzinfarktes bei anästhesierten Hunden
6 männliche Mischlingshunde (Gewicht 8,5 bis 11,5 kg) wurden mit 30 mg/kg KG Pentobarbital i.v. anästhesiert und zwecks künstlicher Beatmung intubiert. Eine linke Thorakotomie wurde im 5. Intercostalraum durchgeführt und das Herz freigelegt. Durch Ligatur der linken, vorderen, absteigenden Koronararterie wurde ein akuter Herzinfarkt induziert.
30 Minuten nach der Ligation wurden bei 3 Hunden eine Stunde kontinuierlich 500 IU/kg KG Hyaluronatlyase in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung über die Femoralvene infundiert. Zur Kontrolle erhielten die anderen drei Hunde über den gleichen Zeitraum 100 ml physiologischer Kochsalzlösung ohne Zusatz von Hyaluronatlyase.
8 Stunden nach der Ligation wurden die Hunde getötet, die Herzen isoliert, gewogen und von der Spitze zur Basis in 1 cm dicke Scheiben geschnitten. Diese wurden dann zur Abgrenzung des infarzierten vom gesunden Myokard mit gepuffertem Nitroblue- Tetrazolium gefärbt. Das Gewicht des Infarktgewebes wurde entsprechend der planimetrischen Methode nach Roberts et al. bestimmt (Roberts AJ5 Jacobstein JG, Cipriano PR, Alonso DR, Combes JR, Gay WA: Effectiveness of dipyridamole in reducing the size of experimental myocardial infarction. Circulation 61, S.228-236, 1980).
Körpergewicht und mittleres Gewicht der isolierten Herzen der Kontrolltiere unterschieden sich nicht signifikant von den Meßwerten der mit Hyaluronatlyase behandelten Hunde. Das mittlere Gewicht des infarzierten Myokards betrug in der Kontrollgruppe 11,2 ± 1,8 g. Hyaluronatlyase reduzierte das Infarktgewebe signifikant (p < 0,02) auf 3,1 ± 0,4 g. Damit bestätigte sich der kardioprotektive Effekt mikro- bieller Hyaluronatlyase in vivo.

Claims

Patentansprüche:
1. Mittel enthaltend Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft oder eines enzymatisch aktiven Fragmentes davon zur Applikation bei akuten Myokardinfarkt bzw. Symptomen darauf sowie bei postinfarktioneller Myokarditis und Myokardischämie.
2. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass es für die Kardioprotektion unter und nach invasiven, chirurgischen bzw. diagnostischen Eingriffen am Herzen, z. B. Bypass-Operationen, Implantationen von Klappenprothesen, Schrittmacherversorgungen oder Koronarangiographien, zur Vermeidung von
Reperfusionssyndromen sowie bei pectanginösen Beschwerden und akuten Myokardinfarkten appliziert wird.
3. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass zwischen 100 IU und 1.000.000 IU, bevorzugt zwischen 1000 IU/kg Körpergewicht bis 500.000 IU/kg
KG, Hyaluronatlyase- Aktivität pro kg Körpergeweicht appliziert werden.
4. Mittel nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, dass zur Applikation ein Herzkatheter angewendet wird.
5. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Hyaluronatlyase als Holoenzym oder das enzymatisch aktive Fragment davon oder eine Mischung beider Formen in Formulierungen, die gegebenenfalls Stabilisatoren und pharmazeutisch unbedenkliche Verdünnungsmittel bzw. Träger enthalten, appliziert werden.
6. Mittel nach Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, dass in den Injektionslösungen bis 2.000.000 IU/ml neben in den Injektionslösungen üblichen Stabilisatoren und pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln bzw. Trägern enthalten sind.
7. Mittel nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, dass in der über einen Katheter zugeführten Perfusionslösung die Hyaluronatlyase in Konzentrationen zwischen 50 IU/ml und 1.000.000 IU/ml neben in den Injektionslösungen üblichen Stabilisatoren und pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln bzw. Trägern enthalten sind.
8. Mittel nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, dass die Hyaluronatlyase aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptococcus, vorzugsweise aus Streptokokken der serologischen Gruppen B bzw. C, bevorzugt aus Streptococcus agalactiae oder Streptococcus equisimilis, durch mikrobielle Fermentation gewonnen wird.
9. Mittel nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, dass die Hyaluronatlyase aus einem rekombinanten Mikroorganismus, bevorzugt der Art Escherichia coli und insbesondere aus Escherichia coli EC 084 (HKI 0295) gewonnen wird.
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PCT/DE2003/001789 Ceased WO2004110479A1 (de) 2003-05-27 2003-05-27 Hyaluronatlyase enthaltendes mittel zur behandlung des akuten myokardinfarktes bzw. symptomen darauf sowie zur behandlung von postinfarktioneller myokarditis und myokardischämie

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102007031417A1 (de) 2007-07-04 2009-01-08 Friedrich-Schiller-Universität Jena Hyaluronatlyase mit erhöhter Wirksamkeit, insbesondere für die Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen und Medizinprodukten, sowie deren Verwendung
RU2543356C1 (ru) * 2014-03-03 2015-02-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ КПССЗ" СО РАМН) Способ прогнозирования ранней постинфарктной стенокардии у пациентов с острым инфарктом миокарда с подъемом сегмента st в госпитальном периоде

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WO2000039290A2 (de) * 1998-12-23 2000-07-06 Id Pharma Gmbh Pharmazeutische formulierung enthaltend ein hyaluronsäure-spaltendes enzym mikrobieller herkunft
WO2000077221A1 (en) * 1999-06-12 2000-12-21 Merck Patent Gmbh Hyaluronidase from the hirudinaria manillensis, isolation, purification and recombinant method of production
WO2002059289A1 (de) * 2001-01-23 2002-08-01 Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V. Verwendung von mikrobieller hyaluronatlyase zur bindegewebserweichung

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