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WO2004038016A1 - プラスチックの分解法及びそれを利用した有用物質の製造方法 - Google Patents

プラスチックの分解法及びそれを利用した有用物質の製造方法

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Publication number
WO2004038016A1
WO2004038016A1 PCT/JP2003/011861 JP0311861W WO2004038016A1 WO 2004038016 A1 WO2004038016 A1 WO 2004038016A1 JP 0311861 W JP0311861 W JP 0311861W WO 2004038016 A1 WO2004038016 A1 WO 2004038016A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
plastic
dna
aspergillus
biosurfactant
pbs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2003/011861
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Keietsu Abe
Katsuya Gomi
Yohei Yamagata
Fumihiko Hasegawa
Hiroshi Maeda
Tasuku Nakajima
Masayuki Machida
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tohoku Techno Arch Co Ltd
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Original Assignee
Tohoku Techno Arch Co Ltd
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tohoku Techno Arch Co Ltd, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST filed Critical Tohoku Techno Arch Co Ltd
Priority to US10/532,423 priority Critical patent/US20060106120A1/en
Priority to EP20030809435 priority patent/EP1595949B1/en
Priority to JP2004546395A priority patent/JP4273504B2/ja
Publication of WO2004038016A1 publication Critical patent/WO2004038016A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C12N9/242—Fungal source
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29B—PREPARATION OR PRETREATMENT OF THE MATERIAL TO BE SHAPED; MAKING GRANULES OR PREFORMS; RECOVERY OF PLASTICS OR OTHER CONSTITUENTS OF WASTE MATERIAL CONTAINING PLASTICS
    • B29B17/00—Recovery of plastics or other constituents of waste material containing plastics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/375—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Basidiomycetes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J11/00—Recovery or working-up of waste materials
    • C08J11/04—Recovery or working-up of waste materials of polymers
    • C08J11/10—Recovery or working-up of waste materials of polymers by chemically breaking down the molecular chains of polymers or breaking of crosslinks, e.g. devulcanisation
    • C08J11/105—Recovery or working-up of waste materials of polymers by chemically breaking down the molecular chains of polymers or breaking of crosslinks, e.g. devulcanisation by treatment with enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2367/00—Characterised by the use of polyesters obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain; Derivatives of such polymers
    • C08J2367/02—Polyesters derived from dicarboxylic acids and dihydroxy compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08J2367/00—Characterised by the use of polyesters obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain; Derivatives of such polymers
    • C08J2367/04—Polyesters derived from hydroxy carboxylic acids, e.g. lactones
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W30/00—Technologies for solid waste management
    • Y02W30/50—Reuse, recycling or recovery technologies
    • Y02W30/62—Plastics recycling; Rubber recycling

Definitions

  • the present invention relates to a method for decomposing a plastic in the presence of a plastic-binding protein, and more particularly to a method for decomposing a plastic in the presence of Aspergillus' oryzae or Aspergillus sposa.
  • a method for decomposing a plastic in the presence of Aspergillus' oryzae or Aspergillus sposa Used for the method of decomposing plastics, the production technology of contacting biodegradable plastics with microorganisms and converting the carbon in plastics into new useful substances by microorganisms in the process of decomposing plastics, and the above methods
  • the present invention relates to various proteins and genes encoding the same.
  • Fuji Chimera Research Institute Co., Ltd., p. 23 pointed out that the limit of the allowable amount of biodegradable plastic in natural soil, which is the current technology, and the high cost of biodegradable plastic itself.
  • filamentous fungi especially Aspergillus' oryzae Koji mold is a fungus that has been used for a long time in the brewing industry in Japan, which manufactures sake, miso, soy sauce, and mirin, and has been directly eaten by the U.S. Food and Drug Administration (FDA). It is a safe gene source listed in (Generally Recognized as Safe).
  • koji molds are excellent in the ability to secrete proteins and the like outside the cells, and are therefore used for producing various useful substances.
  • Patent Document 1 describes a method for decomposing a polybutylene succinate resin using amycolatopsis-meditelanei HT-6 which is a kind of actinomycetes as a microorganism.
  • Patent Document 2 discloses a method for enzymatically degrading a biodegradable polymer using enzymes such as lipase and cutinase.
  • Patent Document 1 JP-A-9-12527-1
  • Patent Literature 2 Japanese Translation of PCT International Publication No. 2001-51254
  • the current biodegradable plastic decomposition technology is based on the simple decomposition of plastic into water and carbon dioxide by microorganisms in soil. It is not premised on conversion to material. This situation is the same at home and abroad.
  • the cost of current biodegradable plastics is three to five times higher than conventional petrochemical plastics (see “'01 Current Status of Biodegradable Polymers and New Developments”. Chuo Research Center, Inc. 51 3-521)
  • biodegradable plastics are degraded by land reclamation only near the ground surface (about 30 to 50 cm in depth).
  • the present invention provides a biosurfactant such as a plastic-binding protein. It is based on the new finding that it is adsorbed on the hydrophobic surface of tics, thereby effectively promoting the degradation of plastics in cooperation with plasticolytic enzymes.
  • the present invention relates to a method for decomposing plastic in the presence of a biosurfactant such as a plastic-binding protein, and particularly to a method for decomposing plastic using a plasticase.
  • the present invention relates to a method for producing a useful substance from a plastic, comprising contacting a microorganism with a plastic, decomposing the plastic by the action of the microorganism, and further converting the components of the decomposed plastic into useful substances by the microorganism. It relates to the method for producing useful substances.
  • This method decomposes plastic waste as a fermentation substrate for microorganisms and converts it to the production of high value-added useful substances (enzyme 'pharmaceuticals' and chemical products).
  • useful substances enzyme 'pharmaceuticals' and chemical products.
  • the kind of the useful substance is not particularly limited, and includes any substance known to those skilled in the art. ), Secondary metabolites (such as antibiotics and chemical precursors), and biosurfactants.
  • the useful substance is a substance secreted out of the cells, operations such as purification after production are easy, which is advantageous in terms of efficiency and economy.
  • monomers and oligomers obtained when the plastic is decomposed are also useful as raw materials for recycling the plastic, and thus can be included in useful substances.
  • microorganism that degrades plastic and the microorganism that converts the components of degraded plastic into useful substances may be the same, or different types of microorganisms may be used.
  • Microorganisms used to convert degraded plastic components into useful substances include, for example, ultraviolet irradiation, mutation treatment with drugs such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoganidinine (NTG), etc. And a mutant which highly expresses a useful substance.
  • NTG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoganidinine
  • a mutant which highly expresses a useful substance.
  • it is preferable to use a transformed bacterium which is recombined with a gene encoding various useful substances such as an enzyme involved in the biosynthesis system of the useful substance and highly expresses the enzyme, as described below.
  • the present invention in a third aspect, decomposes a plastic, which comprises contacting a microorganism with a plastic and decomposing the plastic by the action of the microorganism in the presence of a biosurfactant and Z or a plasticase.
  • the microorganism used in each of the above aspects of the present invention is not particularly limited as long as it has the ability to degrade plastic or the ability to convert degraded plastic to produce useful substances.
  • Representative examples include filamentous bacteria and eukaryotic filamentous fungi.
  • filamentous bacteria include actinomycetes such as Streptomyces.
  • Streptomyces genus Streptomyces 'Grizeus or Streptomyces' Serikara are examples of filamentous bacteria.
  • eukaryotic fungi include the genus Aspergillus, the genus Penicillium, the genus Trichoderma, the genus Rhizopus j Wu, the genus Mucor, and the humicola (Humicola). Genus, Magnaporthe, Metarhizium, Neurospora, Monascus
  • Aspergillus includes Aspergillus Rize (Aspergillus oryzae), Aspergillus sojae, and Aspergillus nidulans are included. Among them, Aspergillus oryzae RIB40 strain (FERM P-1 8273) was registered with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary Center (1-1-1, Higashi 1-1, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) on March 28, 2001. Deposited on date.
  • the Aspergi lus oryzae pN-cha strain (cutinase, hydrophobin, amylase triple expression strain) is based on the Budapest Treaty on the International Recognition of Deposit of Microorganisms in Patent Procedures, and is based on the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Was deposited internationally on September 11, 2003 (1-1, Higashi 1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) with the Patent Organism Depositary Center, and has a deposit number: FERM BP—08486. . Further, various transformants obtained from the filamentous bacteria and eukaryotic filamentous fungi by genetic engineering techniques known to those skilled in the art can also be advantageously used in the present invention.
  • DNA containing a gene encoding a plastic binding protein or biosurfactant such as Hyde mouth hobin of the present invention DNA containing a gene encoding a plasticase such as cutinase, and useful substances (eg, Enzymes that produce useful substances by biosynthesis of useful substances, depolymerization of high molecular substances, and various rearrangement reactions, such as hydroxylase and oxidase, polyketide synthase, cytosolic oxidase, Transformants recombined with at least one DNA selected from DNAs containing genes encoding esterase, phenoloxidase, 0-amylase, cellulase, lipase, and protease) Can be done.
  • useful substances eg, Enzymes that produce useful substances by biosynthesis of useful substances, depolymerization of high molecular substances, and various rearrangement reactions, such as hydroxylase and oxidase, polyketide synthase, cytosolic oxidase,
  • the present invention also relates to such various transformed bacteria as a fourth aspect.
  • the microorganism from which to create such a transformed bacteria in addition to the above-described microorganisms, is Asuperugirusu genus Asuperugirusu 'two guard Aspergillus ni g ei, Asuperugirusu' Awamori ⁇ Aspergillus awamort), Asuperugirusu 'Kawachi Aspergillus kawachi!
  • FIG. 1 is a photograph confirming that Aspergillus fungi such as A orj / zae have a PBS conversion ability.
  • Figure 2 is a photograph confirming that A has the ability to convert to PLA.
  • FIG. 3 shows combinations of media for DNA microarray analysis.
  • FIG. 4 schematically shows a group of genes specifically expressed in the presence of PBS.
  • FIG. 5 shows the results of a visual analysis of the results of Su3PP5, Su3PE5, and Su3Bu5 DNA microarrays, where each number represents the gene expression by the ratio of (Cy5 Cy3).
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of JZ3981 including the full length of Hide-mouth Hobin.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing the construction of a plasmid for high expression of Hyd mouth hobin for Aspergillus. It is a photograph of electrophoresis (SDS-PAGE).
  • Figure 9 shows that the protein is expressed only in the culture supernatant of the Aspergillus oryzae transformant in which the cutinase gene, a PBS-degrading enzyme has been inserted into the chromosomal DNA, at the same position as the purified PBS-degrading enzyme preparation.
  • Figure 10 shows that the glaA142 promoter was fused upstream of the target gene.
  • FIG. 11 is a photograph of SDS-PAGE showing that a cutinase-Hide mouth hobin co-expressing strain was obtained.
  • Fig. 12 shows the production of pPTR-eno-hyp, a plasmid for high expression of hide mouth hobin.
  • Fig. 13 shows the production of pNG-amy, a plasmid for high expression of Aspergillus oryzae amylase.
  • FIG. 14 is a photograph of SDS-PAGE showing that the cutinase-Hide mouth Hobin-0? Amylase triple co-high-expressing strain highly expresses hydrophobin.
  • Figure 15 shows that the glaA142 promoter was fused upstream of the hyp B gene.
  • Figure 16 shows the construction of pNG-gla-hydrophobinn-315 with the glaA142 promoter fused upstream of the hydrophobin-315 gene.
  • FIG. 17 shows a phylogenetic tree of Hyde-mouth hobins and their analogs derived from filamentous fungi.
  • Figure 18 shows the state of adsorption of hide-mouth hobin on various biodegradable plastics.
  • FIG. 19 shows a phylogenetic tree of filamentous fungal proteases and their analogs.
  • Figure 20 is a graph showing the protein concentration in the eluted fractions of the octylcellulofine column in the PBS-decomposed culture supernatant, and the presence of proteins contained in each fraction.
  • 5 is a photograph of SDS-PAGE showing the above.
  • FIG. 21 shows the construction of a PBS-binding protein high expression system.
  • Figure 22 shows a photograph of SDS-PAGE showing that a band was observed at the position of the target protein (about 14 kDa) only in the culture supernatant of the Aspergillus oryzae transformant.o
  • FIG. 23 is a photograph showing that the growth of the approximately 14 kDa protein and Hide-mouth Hobin high-expressing strain on the hydrophobic surface exceeds that of the wild-type strain.
  • Figure 24 is a photograph of SDS-PAGE showing the adsorption of PbpA to PBS at the inlet.
  • FIG. 25 shows a phylogenetic tree of PbpA and PbpB homologous sequences.
  • FIG. 26 is a photograph showing degradation of a platinum wire PBS-coated product by cutinase.
  • FIG. 27 is a photograph showing the promotion of cutinase decomposition of PBS film by RolA.
  • FIG. 28 shows the effect of cutinase of RolA to promote the decomposition of PBS emulsion by in vitro.
  • FIG. 29 shows how degradation is promoted when PbpA is adsorbed to PBS.
  • FIG. 30 shows a comparison of hide mouth hobin and artificial surfactant on the degradation of kitchenase by PBS film.
  • the biosurfactant used in the first aspect of the present invention is generally a surfactant produced by an organism, and particularly a surfactant produced by a microorganism outside a cell. It is an activator and a kind of orchid plastic adsorption factor.
  • the biosurfactant include, besides the plastic-binding protein, any substance known to those skilled in the art, such as phospholipid or glycolipid in which a hydrophilic sugar and a hydrophobic fatty acid are bound.
  • mannosyl erythritol And glycolipid esters such as rhamnolipid, cyclic lipopeptides and cyclic polypeptides, as well as amphipathic proteins such as surfactin.
  • plastic-binding protein include hide-mouth hobins and homologs thereof as specifically shown in the following examples, and other plastic-binding proteins.
  • the source of the fungus it can be obtained from the various filamentous bacteria and eukaryotic fungi described above, especially from Aspergillus molds such as Aspergillus oryzae as specifically described in the Examples below. Those derived from various microorganisms such as typical filamentous bacteria can be used.
  • plastic-degrading enzyme used in the method of the present invention may be any one known to those skilled in the art.
  • at least one selected from esterase, protease, peptidase, lipase, cutinase, serine hydrolase and the like can be used.
  • Plastic degrading enzymes are also derived from the various filamentous bacteria and eukaryotic filamentous fungi described above, and particularly represented by molds of the genus Aspergillus such as Aspergillus oryzae, as specifically described in Examples below. Those derived from various microorganisms such as filamentous bacteria can be used.
  • a hide binding hobin derived from Aspergillus oryzae can be used as a plastic-binding protein, and a cutinase derived from Aspergillus oryzae can be used as a plasticase.
  • the plastic to be decomposed in the method of the present invention is not particularly limited. A typical example is what is known as "biodegradable plastic".
  • Biodegradable plastic is defined as "needed for its intended use in the state of use. It is a material that retains sufficient functions and is decomposed to a simpler molecular level by the action of microorganisms in the soil or water when discarded. Based on the degree of decomposition, it is divided into “completely degradable biodegradable plastics” and “partially degradable (collapsed) biodegradable plastics.” It can be broadly divided into “natural polymer system J” and “chemical synthesis system”. In the method of the present invention, any of these types of biodegradable plastics can be used.
  • plastics used in the method of the present invention are selected from the group consisting of, for example, polyesters, polyurethanes, polypropylenes, polyvinyl chlorides, nylons, polystyrenes, starches, and mixtures thereof.
  • polyesters include polybutylene succinate (PBS), polybutyl succinate 'adipate (PBSA), polylactic acid (PLA), aliphatic polyesters, polycaprolactone and mixtures thereof. Selected from a group.
  • the plastic to be decomposed may be included as a component of a so-called “composite material J.
  • composite material J is generally two types.
  • the plastic part is selectively decomposed from the composite material containing the plastic to recover the plastic as a monomer or an oligomer, while the metal or the like substantially containing no plastic is used.
  • the decomposition reaction of the plastic is carried out according to the purpose and scale. The reaction can be carried out by appropriately selecting any reaction system (for example, an aqueous system and a solid phase system) and reaction conditions known to those skilled in the art.
  • the plastic to be decomposed can take any form corresponding to each culture system, such as an emulsified liquid and a solid pellet.
  • the plastic to be decomposed in order to decompose the plastic in the presence of the biosurfactant, it is necessary to add the biosurfactant to the reaction system. Can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • a preferred example of the method of the present invention comprises the steps of mixing biosurfactant with plastic in a low water activity state, and decomposing the plastic with a plastic decomposition enzyme in a high water activity state.
  • water activity is a factor known to those skilled in the art, and defines “water activity as the ratio of an aqueous solution in which a solute is dissolved to a pure vapor pressure" (John A. Troller & ⁇ HB Christian Author, Water Activity and Food 'Academic Press, Inc.
  • Low water activity state J refers to the conditions under which biosurfactants can be effectively adsorbed on water-phobic surfaces of plastics. Refers to a state where the water activity is 0.97 or less, preferably 0.95 or less, and more preferably 0.9 or less, for example. No state Means state.
  • the solute at this time includes, for example, salts, sugars, alcohols and the like. Therefore, as one specific example, a plastic in the form of a film or a pellet in a low water activity state is mixed with a biosurfactant, an effective amount of the biosurfactant is adsorbed to the plastic, and then the water activity is increased to increase the plasticity of the plastic.
  • the decomposition of the film can be promoted by the decomposing enzyme.
  • the biosurfactant enhances the hydrophobic interaction between the plastics is to mix the biosurfactant with the plastic in a high salt state, or to mix the plastic in a low salt state. It consists of decomposing the plastic with a decomposing enzyme.
  • the “high salt concentration state” means conditions under which the biosurfactant can be effectively adsorbed on the hydrophobic surface of the plastic. Specifically, for example, when NaGI is used as the salt, the concentration becomes low. It means a state of 4% or more, preferably 8% or more, more preferably 14% or more.
  • the “low salt concentration state” means a state that is not such a high salt concentration state.
  • the reaction temperature of the method of the present invention is, for example, 0 to 100 ° C, preferably 0 to 80 ° C, and more preferably 15 to 80 ° C.
  • the reaction solution is acidified by the influence of acidic substances such as monomers and oligomers generated by the decomposition of plastic, and as a result, the pH value of the reaction system may fall outside the optimal pH range of the plastic degrading enzyme.
  • the decomposition reaction in a buffer solution having a high buffer capacity, or neutralize the reaction system appropriately by adding a basic substance from the outside during the decomposition reaction, and sexual status, for example D H4-11, preferably pH6-10, more preferably pH7-9.
  • the biosurfactant and the plasticase can be used as protein preparations, respectively. It is also possible to degrade plastic by the action of biosurfactants and plastic degrading enzymes produced in situ by Oryzae or Aspergillus sp.
  • the biodegradation of plastic can be promoted by coexisting a biosurfactant and a biodegradable enzyme in the culture system.
  • a biosurfactant and a biodegradable enzyme may be those produced by the microorganism itself, or in addition to them, may be further added from outside the culture system.
  • Various conditions such as the amount and ratio of addition and the timing of addition can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • These substances need not always be added simultaneously, but can be added sequentially at each stage of the method.
  • biosurfactant and the biodegradable or plastic-degrading enzyme that can coexist in the culture system have already been described in the first embodiment of the present invention.
  • a biosurfactant, a plasticolytic enzyme, and a transformant that highly expresses ⁇ or a useful substance are used.
  • the genes encoding the above-mentioned substances can be introduced into different microorganisms, respectively, and reacted with a plurality of the thus obtained transformants. That is, any one of a transformed bacterium recombinantly transformed with a gene encoding a biosurfactant, a transformed bacterium transformed with a gene encoding a plasticase, and a transformed bacterium transformed with a useful substance gene can be used.
  • Each method of the present invention can be carried out by using a plurality of transformants comprising a combination of the above.
  • the gene encoding a biosurfactant, a plasticolytic enzyme, or a useful substance introduced in the transformed bacterium of the present invention is not limited to one kind, and may include genes of a plurality of kinds of biosurfactants, respectively. It is also possible to recombine with genes of various types of plastic decomposition enzymes or genes of multiple types of useful substances
  • the same microorganism was recombined with both genes encoding a biosurfactant and a plasticolytic enzyme.
  • Transformants that are fungi can be used.
  • microbial cells that produce plastic-degrading enzymes are strongly adsorbed to the plastic surface, and plastic-degrading enzymes are produced, thereby promoting plastic degradation.
  • useful substances by culturing in the presence of two types of microorganisms, a transformant capable of degrading the plastic thus obtained and a microorganism for producing useful substances.
  • the same microorganism was recombined with genes encoding biosurfactants, plasticases, and useful substances, respectively.
  • Transformants that are high expressing bacteria can be used. For example, using the above-mentioned co-high-expressing bacteria as the original strain, as described above, a mutant strain that highly expresses a useful substance, or a recombinant gene that encodes a useful substance and highly expresses these substances By creating a transformant that transforms, it is possible to introduce a gene for a useful enzyme into a microorganism with enhanced plastic resolution and to express it with high expression. By using bacteria, it is possible to efficiently decompose plastics and efficiently produce useful substances.
  • the method when a plurality of types of microorganisms are used, the method may be carried out in a co-culture system in which the plurality of types of microorganisms are simultaneously cultured, or a plurality of continuous microorganisms in which the method of the present invention is responsible for a decomposition reaction and a conversion reaction, respectively. It is composed of various culture stages, and in each stage, it is also possible to treat the culture solution obtained in the previous stage with successively further different microorganisms.
  • a surfactant or a biosurfactant and / or a plastic-degrading enzyme is added to the reaction system, for example, from the outside to coexist in the reaction system to degrade and convert the plastic. It is possible to further improve efficiency.
  • the surfactant any substance known to those skilled in the art can be used.
  • biosurfactants which are biological surfactants produced by organisms, especially microorganisms, on the cell surface or outside the cells, are preferable from the viewpoint of the environment. T / JP2003 / 011861
  • the decomposition reaction and the conversion reaction are carried out in a liquid culture system containing a plastic emulsion and a plastic solid pellet.
  • the culture can be performed in any culture system known to those skilled in the art, such as a solid culture system using a solid or a plastic powder. Therefore, the plastic to be decomposed can take any form corresponding to each culture system, such as a solid pellet and an emulsion.
  • Those skilled in the art can appropriately select the composition of the culture solution and medium, and various culture temperature conditions such as temperature and pH, depending on the type of plastic and the microorganism used.
  • the biosurfactant in order for the biosurfactant and the plastic degrading enzyme to work effectively together to degrade the plastic, first, the biosurfactant must be interlinked so that the biosurfactant is effectively adsorbed on the plastic. It is preferable to carry out the treatment under such conditions that the hydrophobic interaction between the two is enhanced. Therefore, for example, after a buffer solution or the like is added to a plastic so as to obtain an appropriate low water activity state, cells (cells, spores, hyphae, etc.) of a microorganism such as the transformed bacterium of the present invention are inoculated and thermostated.
  • Koji is prepared by culturing in a humidifier, and after the biosurfactant produced by microorganisms acts on the plastic, an appropriate buffer is added to bring the water into a high water activity state. Can be decomposed. At this time, it is preferable that the addition of the surfactant or the biosurfactant from the outside is performed in a low water activity state, while the addition of the plastic degrading enzyme is performed in a high water activity state.
  • a buffer having a high buffering capacity is used to prevent the influence of acidic substances such as monomers and oligomers generated by decomposition of plastic, or Adding a basic substance from the outside during the decomposition reaction It is preferred that the reaction system is appropriately neutralized and maintained in a neutral state.
  • a DNA comprising the following (a) or (b) a nucleotide sequence encoding a polypeptide:
  • DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3 or a partial sequence thereof
  • DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the DNA comprising the nucleotide sequence of (a) and a stringent DNA that hybridizes under the following conditions and has a function substantially equivalent to that of the DNA of (a).
  • a DNA comprising the following (a) or (b) a nucleotide sequence encoding a polypeptide:
  • Specific examples of the plastic-binding protein gene derived from Aspergillus oryzae used in the present invention include the following (a) or (b) a DNA comprising a base sequence encoding a polypeptide:
  • DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 or 7 or a partial sequence thereof
  • DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the DNA comprising the nucleotide sequence of (a) under stringent conditions.
  • DNA that has hybridized and has substantially the same function as the DNA of (a) can be mentioned.
  • the “function” of the polypeptide means a biological function or activity that it exhibits inside and / or outside a cell (microbial body).
  • substantially equivalent means that the functions (activity) exhibited by them can be considered to be equivalent as functions inside and / or outside of a cell (microbial cell), though the degree varies. Is shown.
  • the DNA of the present invention can be prepared by a method known to those skilled in the art. For example, it can be easily cloned from the deposited strain by the method described in the Examples. Alternatively, based on the information on the nucleotide sequence or amino acid production sequence of the DNA of the present invention described in the present specification, it is prepared by chemical synthesis well-known to those skilled in the art or by PCR using the primer of the present invention. You can do it.
  • under stringent conditions means that the degree of homology between base sequences is, for example, about 80% or more, preferably about 90 % or more, and more Preferably, it means a condition that a hybrid is specifically formed only between nucleotide sequences having high homology, such as about 95% or more. Specifically, for example, at a temperature of 60 ° C. to 68 ° C., conditions such as a sodium concentration of 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, and a pH of 6 to 8 can be mentioned. Hybridization is carried out, for example, by the method described in the current protocol in molecular biology ⁇ edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987).
  • the amino acid sequence substantially identical to the specific amino acid sequence in the present invention is 80% or more on average, preferably 90 ⁇ 1 ⁇ 2 or more as a whole when compared with the amino acid sequence aligned with the entire amino acid sequence. Particularly preferably, it means an amino acid sequence in which 99% or more amino acids are the same. Therefore, a polypeptide consisting of an amino acid sequence substantially identical to a certain amino acid sequence is considered to have substantially the same function as a polypeptide consisting of the amino acid sequence.
  • amino acid sequence in which some amino acids are deleted, substituted or added in the specific amino acid sequence of the polypeptide of the present invention is defined as an amino acid sequence as long as it has a function substantially equivalent to that of the polypeptide comprising the amino acid sequence.
  • it is composed of an amino acid sequence in which "! To about 20, more preferably about 1 to 10, more preferably about several amino acids are deleted, substituted or added, or an amino acid sequence obtained by combining them.
  • the “function” of a polypeptide means a biological function or activity that it exhibits inside and / or outside a cell (cell).
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence substantially identical to the above specific amino acid sequence, or an amino acid sequence in which some amino acids are deleted, substituted or added Polypeptides can be easily prepared by appropriately combining methods known to those skilled in the art, such as, for example, site-directed mutagenesis, homologous recombination, primer extension, and PCR. .
  • homologous amino acids polar-nonpolar amino acids, hydrophobic 'hydrophilic amino acids, positive-negative amino acids
  • Substitution between charged amino acids, aromatic amino acids, etc. is considered as a possibility.
  • each polypeptide of the present invention In order to maintain substantially the same function, it is desirable that amino acids in the functional domain contained in each polypeptide of the present invention be retained.
  • the various transformants already described as preferred examples of microorganisms that can be advantageously used in each method of the present invention can be prepared by using various techniques and means well known in the art, using a set containing each DNA or gene.
  • a recombinant vector is prepared, and the host such as the filamentous bacterium, eukaryotic filamentous fungus, or a mutant thereof is used with the recombinant vector, for example, a protoplast-PEG method, an electoporation method, a Ti-plasmid method, And a recombinant method known to those skilled in the art such as a particle gun.
  • genes encoding these substances can be expressed under the control of a constitutive expression promoter or various inducible expression promoters. As a result, these substances are highly expressed, are produced in large amounts on the cell surface or outside the cells, promote the decomposition of plastics, and further promote the production of useful substances.
  • constitutive expression promoters for Aspergillus oryzae include enoA promoter, pgkA promoter, and tefl promoter.
  • Examples of the inducible expression promoter for Rize include a glucoamylase promoter or a monoamylase promoter using maltose as an inducing substrate, and a xylanase promoter using xylose as an inducing substrate. Examples Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
  • Various genetic manipulations in the examples followed the method described in the above-mentioned Current protocols in molecular biology (. Edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987).
  • PBS Polybutylene succinate
  • PBS emulsion was Biono Reemulsion OLX-07527 manufactured by Showa Polymer Co., Ltd. Milli-Q water was used for the preparation of the reagent.
  • Aspergillus oryzae RIB40 was used.
  • PBS emulsion liquid 10ml adjust to pH 6.5 with 10 N KOH lM MgS0 4 2ml agarose 5 &
  • PBS emulsion minimal medium a minimal agar medium in which the carbon source was limited to PBS.
  • A. awamori, A. niger, and A. spore suspensions were spotted and cultured at 37 ° C for 7 days.
  • 5 ml of the minimum liquid medium using PBS as the sole carbon source ⁇ yzae spore suspension was inoculated to a final concentration of 0.5 X 10 5 cells / ml, and cultured with shaking at 30 ° C for 5 days. .
  • the liquid culture was performed in a test tube.
  • Table 2 and FIG. 3 show the composition of the medium, the culture conditions for DNA microarray analysis, and their combinations.
  • the spore suspension was inoculated to a final concentration of 0.5 ⁇ 10 7 cells / ml in 150 ml of Czapek-Dox medium in a 500 ml Erlenmeyer flask with blades, and cultured at 30 ° C. for 12 hours.
  • the cells were collected with Miracloth (CALBIOCHE), washed with sterilized water, and excess water was removed.
  • the recovered bacteria were transferred to a minimal medium using PBS solid pellet, PBS emulsion, succinic acid, and 1,4-butanediol as the sole carbon sources, and cultured at 30 ° C with shaking.
  • the culture time was 120 hours for PBS pellets, 70 hours for PBS emulsion, 12 hours for succinic acid, and 24 hours for 1,4-butanediol.
  • cells were collected from the PBS emulsion, succinic acid, and 1,4-butanediol medium using Miracloth, washed with sterilized water, and excess water was removed.
  • the PBS solid pellet the cells were separated from the PBS solid pellet using a tea strainer. After measuring the wet weight of the obtained wet cells, the cells were ground into a powder while pouring liquid nitrogen in a mortar.
  • Message Maker (Gibco BRL) was used.
  • RNA Purification was performed according to the manual attached to Message Maker. The procedure when a total RNA amount of 1 mg was used is shown below. 1 mg of total RNA was filled up in a 15 ml tube to 1.8 ml using DEPG-treated water (final concentration: 0.55 mg / ml), incubated at 65 ° C for 5 minutes, and quenched on ice. 200 M 1 of 5 M NaGI was added, mixed well, and 1 ml of oligo (dT) Cellulose Suspension was added. After mixing well, the mixture was incubated at 37 ° C for 10 minutes.
  • DEPG-treated water final concentration: 0.55 mg / ml
  • oligo (dT) Cellulose Suspension For 3 minutes to remove oligo (dT) Cellulose Suspension.
  • a 5 mg / ml glycogen solution To about 2 ml of the supernatant, add a 5 mg / ml glycogen solution, add 200 I, 7.5 M ammonium acetate (pH 5.2), add 200 I, mix, and dispense into 5 eppendle tubes. Ice-cold ethanol was added, and ethanol precipitation was performed overnight at -20 ° C. After centrifugation at 12,000 X and 4 ° C for 30 minutes, the supernatant was discarded, rinsed with 75% ethanol, air-dried, and dissolved in an appropriate amount of DEPC-treated water.
  • a cDNA microarray (manufactured by Asahi Techno Glass Co., Ltd.) carrying 2146 EST clones of A. oryzae was used.
  • the gap cover glass (25 ⁇ 50 mm) used was manufactured by MATSUNAM.
  • the hybridization cassette used was Array IT. Scanner analysis was performed using Axon's Gene Pix 4000B microarray scanner, and image analysis was performed using Axon's Gene Pix Pro 3.0 software package and Mesia Cybernetics' Array Pro program.
  • the slide glass was set in a hybridization cassette, and 30 l of purified water and 5 l of 3X SSG were dropped at two points apart from the cover glass on the glass in order to prevent drying, to prevent drying. Hybridization was carried out at 55 ° C for 8 hours with gentle shaking. After the completion of the hybridization, the slide glass was washed by the following operation. The hybridization cassette was removed, and the slide glass was immersed in 2 ⁇ SSC / 0.1% SDS and quickly slid down in the liquid. The mixture was shaken in a separately prepared 2 ⁇ SSC / 0.1% SDS for 5 minutes at room temperature.
  • the plate was shaken in 0.2 X SSG / 0.1% SDS kept at 40 ° C for 5 minutes, and then left in 0.2 X SSC for 3 minutes. After centrifugation at 300 X g for 1 minute to remove water from the slide glass, detection was performed. If the control (succinic acid) expression level is higher than that of the sample (PBS solid pellet, PBS emulsion, 1,4-butanediol), the spot on the DNA chip will develop a green color. When the expression level is almost the same, the color develops yellow, and when the expression level of the sample exceeds the control, the color develops red.
  • the control succinic acid
  • Su3PP5 and Su3PE5 genes that are specifically expressed in the presence of PBS are colored red in Su3PP5 and Su3PE5, but not in Su3Bu5 (Fig. 4). Therefore, the genes that were colored red in Su3Bu5 were subtracted from the genes that were colored red in Su3PP5 and Su3PE5, and genes specifically expressed in the presence of PBS were searched.
  • HYDROPHOBIN PRECURSOR showed 9e-57 homology. Furthermore, it contains eight cysteine residues conserved in hydrophobin (Hide mouth Hobin), revealing that the clone of ⁇ _ is the hydrophobin (Hide mouth Hobin) gene (? P) of 3 ⁇ 4. Oryzae. It became.
  • Terminator Ready Reaction mix 8 J.I
  • the culture medium for E. coli used was in accordance with the manual attached to Stratagene's XL1-Blue 1-4-1) Construction of pNG-enoP-hyp
  • pNGEG-d1 containing the enoA promoter As a vector, pNGEG-d1 containing the enoA promoter (Toda T. et a Curr. Genet. 40: 260-267, [2001]) was used. JZ3981 (pSPORT 1-hyp), including the insert, was purchased from the Brewing Research Institute (currently the National Research Institute of Brewing, 3-7-1 Kagamiyama, Hiroshima City, Hiroshima Prefecture). "Method"
  • Both the vector DNA and the insert DNA were completely digested with restriction enzymes and then subjected to agarose gel electrophoresis to cut out DNA fragments under long-wavelength (366 nm) UV. After that, the DNA was repeated once with the rep A gene (Bio-Rad-Laboratories) to obtain vector DNA and insert DNA.
  • the ligation reaction was performed using the prepared vector DNA and insert DNA, and T4 DNA ligase (GIBCO BRL Lifetechnology) 5 X ligation buffer (250 mM Tris-HCI; pH 7.6, 50 mM MgGI "5m ATP, 5 mM DTT, 25% PEG-8000 ), The temperature was adjusted to 20; I with sterile water, and the reaction was performed at 16 ° C for 16 hours.
  • a single colony of E. coli transformed with the desired plasmid DNA was inoculated into 3 ml LB liquid medium supplemented with ampicillin to a final concentration of 100 g / ml, and cultured at 37 ° C with shaking. . Transfer 1.5 ml of culture to 2 ml Eppendorf tube JP2003 / 011861
  • plasmid DNAIOjig was completely digested with /! ⁇ // 71, subjected to phenol extraction and ethanol precipitation by a conventional method, and dissolved in 10 I of TE to obtain a DNA solution for transformation.
  • a spore suspension of Aspergillus oryzae niaD300 strain (a mutant strain deficient in the nitrate reductase gene (?) Derived from RIB40 strain: provided by the Brewing Research Institute) is added to YPD liquid medium, and cultured with shaking at 30 ° C for 12 hours. did. Cells were collected from the culture using a glass filter. The cells transferred to a centrifuge tube 50ml volumes of protoplast solution (0.6M KCI in 10ml, 0.2M NaH 2 P0 4, pH 5.5, 5mg / ml Lysing enzyme (Sigma Chemical Co.), 10mg / ml Cellulase Onozuka R - 10 (Yakult Phrmaceutical Ind.
  • the pro Bok plast was suspended in Sol [to be 1 X10 9 or protoplasts / ml.
  • the conidia were added to a 1.5 ml microtube and cultured at 30 ° C for 40 hours. Transfer the cultured cells to a new 1.5 ml microtube and add a 50 ⁇ I protoplast solution 0.8 M KCI, 10 mM citric acid, pH 6.5, 2.5 mg / ml Lysing enzyme (Signa).
  • 5'-GTAGAATCACGAATGAGACCTTTGACGACC-3 ' was synthesized, and 5'-GTAGAATCACGAATGAGACCTTTGACGACC-3' and 5'- Two types of oligonucleotides, GTTAGTCGACTGACCAATTCCGCAG-3 ', were synthesized.
  • the PGR equipment used was PGR Thermal Cycler PERSONAL (Takara Shuzo). Plasmid DNA used for transformation as a positive control was designated as type I.
  • the amplification reaction of pNG-enoP-hyp denatured type I DNA at 95 ° C for 3 minutes and performed 30 cycles of holding at 94 ° C for 1 minute, 55.5 ° C for 1 minute, 72 ° C for 90 seconds.
  • the cells were completely extended at 72 ° C. for 95 seconds and kept at 4 ° C.
  • the amplification reaction of pNG-enoP denatures type I DNA at 95 ° C for 3 minutes, followed by 30 cycles of holding at 94 ° C, 1 minute, 57 ° C, 1 minute, 72 ° C, and 90 seconds.
  • the cells were completely extended at 72 ° C for 95 seconds and kept at 4 ° C.
  • amplification of the PGR fragment was confirmed at the same position as that of the positive control.
  • Hyde-mouth hobin High-expressing Aspergillus oryzae containing no Hyde-mouth hobin gene were added to 200 ml of YPD medium (1 (w / v%) yeast extract, 2 (w / v%) Peptone, 2 (w / v%) glucose) was inoculated at a concentration of 2500 spores / ml, cultured with shaking at 30 ° G for 24 hours, and the cells were filtered with a glass filter to obtain a culture supernatant.
  • Biodegradation enzymes are mentioned as biodegradable plastic decomposition factors. Therefore, we obtained a biodegradable plastic-degrading enzyme gene and bred a high-expressing Aspergillus strain. PBS was used as the biodegradable plastic.
  • PBS emulsion was added to the fractionated solution to 0.1 (v / v%), the temperature was kept at 37 ° C, and the active fraction was traced by the decrease in turbidity (decomposition of PBS). .
  • the obtained active fraction was dialyzed against 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0, applied to a DEAE-TOYOPEARL 650S column (Tosoichi) equilibrated with the same buffer, and the adsorbed fraction was purified to 0%. Elution was performed with a linear concentration gradient of -0.3 M NaCI.
  • the obtained active fraction was dialyzed against 10 mM MES buffer, pH 5.5, applied to a HiTrap SP column (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with the same buffer, and the adsorbed fraction was subjected to 0-0.3 M NaCI buffer. Was eluted with a linear concentration gradient.
  • the obtained active fraction is subjected to SDS-PAGE
  • the active fraction obtained here was used as a purified PBS-degrading enzyme preparation.
  • a 160 mm x 160 mm, 1 mm thick electrophoresis plate was used. 50 ⁇ l of the sample solution was applied to the wells, and further 25 1 of V8 protease solution was overlaid. Current 15 mA — Start electrophoresis at a constant rate, stop electrophoresis when the dye (promophenol blue) has migrated to almost the middle of the concentrated gel, leave it at room temperature for 1 hour, and allow V8 protease to run in the gel. Limited decomposition was performed. After that, electrophoresis was resumed, and the proteins in the gel were removed after the electrophoresis.
  • NCBI National Cancer Institute
  • NCBI http://www.ncbi.nim.nih.gov/
  • BLAST search Zhang, ⁇ , et al. (1997) Genome Res., 7, 649-656
  • chromosomal DNA was prepared from hyphae of Aspergillus oryzae.
  • a suspension of Aspergillus oryzae RIB40 spores to a concentration of 0.5 x 10 6 spores / ml was used in a 500 ml Erlenmeyer flask in 100 ml of YPD liquid medium [1 (w / v%) yeast extract, 2 (w / v %) Peptone, 2 (w / v%) glucose.
  • the cells were cultured at 30 ° C. and 125 rpm for 16 hours. The culture was filtered through a glass filter to collect mycelia and washed with distilled water. After draining the hypha, put the cells in a mortar pre-cooled to -20 ° C and pour liquid nitrogen. 2003/011861
  • Freeze at 38 and immediately crush with a chilled pestle The crushed mycelium is placed in a 1.5 ml microtube with a spatula, suspended in 0.4 ml of TE (10 m Tris-HCl buffer, pH 8.0, 1 mM EDTA), and the lysis solution (2 (w / v%) 0.4 ml of SDS, 0.1 M NaCI, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0 ⁇ was added, and the mixture was stirred slowly and left at room temperature for 15 minutes. After centrifugation at 15,000X for 10 minutes, the supernatant was collected in a new 1.5 ml microtube.
  • TE Tris-HCl buffer, pH 8.0, 1 mM EDTA
  • Southern hybridization and colony hybridization were performed using Antifluorescein-AP (Eizo Diagnostics, Inc.).
  • the SSG solution used in the future was 20-fold concentration (20xSSC) (175.4 g NaCI and 88.2 g Sodium Citrate Dihydrate dissolved in water, adjusted to 1 I, and autoclaved). Those prepared by dilution were used. 10 g of the chromosomal DNA was completely digested with 50 units of £ coR V (Takara Shuzo) and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • Alkaline transfer buffer (0.4 N NaOH) was placed in the tray, placed on a glass plate, and pre-cut filter paper (ADVANTEG TOYO) cut to the length required to reach the buffer, and moistened with the buffer.
  • Paper towels were stacked at a height of 5 cm and weighted. After blotting for 12 hours, the membrane was washed with 4x SSG and hybridized.
  • Random Primers and Reaction Buffer Mix 5 I % Fluoresc ene Nucleotide Mix 5 jti U Kl enow Fragment 1 fl ⁇ was added, mixed by pipetting, and reacted at 37 ° C for 1 hour. After the reaction, add 5 ⁇ l of 0.1 M EDTA, pH 8.0, and add hybridization buffer (2 X SSC, 0.1 (w / v%) SDS, 5 (w / v%) Dextran Sulphate, 20 ng / ml. 0.5 (v / v%) Blocking Reagent ⁇ was used as the probe solution.
  • the membrane after blotting is rinsed with 2 ⁇ SSC, transferred to a hybridization bag, and the hybridization buffer is adjusted to 0.1 ml / cm 2 and the carrier DNA is adjusted to a final concentration of 50 ⁇ g / ml. In addition, it was kept at 60 ° C for 1 hour. Subsequently, 200 ⁇ l of the hyb ridization buffer and 20 ⁇ l of the probe solution 35 ⁇ l of carrier DNA (10 mg / ml) were mixed in a microtube and boiled at 100 ° C. for 5 minutes. The mixture was quenched in ice and left for 5 minutes. This was pre-warmed to 60 ° C, replaced with the solution in the hybridization bag, and kept at 60 ° C for 16 hours.
  • Membrane was removed from the High Priestess die See Chillon bags, washed by shaking 1 cm 2 of the membrane per 1 ml or more 2 X SSC, 1 (w / v%) 60 ° C, 1 5 min with SDS vigorously, then The plate was washed similarly with 0.2 X SSC, 0.1 (w / v%) SDS at 60 ° C for 15 minutes. Subsequent operations were performed at room temperature. Washing was performed by vigorous shaking for 5 minutes in 1 ml or more of 0.1 M Tris-hydrochloric acid buffer, pH 7.5, 0.15 NaCI per 1 cm 2 membrane.
  • Washing was performed by vigorous shaking four times for 5 minutes each in 0.15 M NaCI. Washing was performed by shaking vigorously twice for 5 minutes each in 0.1 M Tris-HCl buffer, pH 9.5, 0.1 M NaCI. Transfer the membrane to a plastic bag and add EGF substrate 1 ml of Auto Phos (Eizo Diagnostics, Inc.) was added and reacted for 30 minutes in the dark. The membrane was removed from the plastic bag, left for 4 hours in the dark, and analyzed with a fluorescence analyzer (FLA-2000; FUJIFILM). As a result, a strongly hybridizing band of about 1300 base pairs was detected.
  • FLA-2000 fluorescence analyzer
  • Nylon membrane (Hybond- ⁇ +; Amersham Pharmacia Biotech) is placed on LB agar medium containing 50 jU g / ml of ampicillin, and the transformed E. coli suspension is spread on it and incubated at 37 ° C for 16 hours. Cultured. Peel the membrane off the medium and remove the membrane to 10 (w / v%) SDS for 3 min at 0.5 N
  • 1.5 ml of the culture was transferred to a 1.5 ml microtube and centrifuged at 15,000 x 1 minute to remove the medium.
  • the cells were suspended in 100 m of TEG (25 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0, 10 mM EDTA, 50 mM glucose), and 200 ⁇ 1 of 1 (w / v%) SDS, 0.2 N NaOH And mixed gently and left on ice for 5 minutes. Further, 150 ⁇ 1 of 3 M sodium acetate, pH 5.2 was added, mixed gently, and left on ice for 5 minutes. To this was added 150 ⁇ l of 10 M ammonium acetate, mixed gently, and centrifuged at 15,000 ⁇ , 4 ° C.
  • the DNA was washed with 70 (v / v%) ethanol and centrifuged at 15,000 x 4 ° C for 10 minutes to completely remove the supernatant and obtain a precipitate.
  • the precipitate was dissolved in 0.1 ml of TE, and this was used as a plasmid DNA solution.
  • the base sequence of the inserted DNA fragment in this plasmid DNA was determined by the protocol of AB [PR [SM TM 377 DNA sequencer Long Read (PE Biosystem), ABI PRISM TM 377 DNA sequencing system (PE Biosystem) I]. Iron corner? was analyzed.
  • an open reading frame containing the nucleotide sequence of the probe was found in the fcoRV digested fragment of chromosomal DNA consisting of 1334 base pairs inserted into the plasmid DNA.
  • This open reading frame contained the nucleotide sequence of three introns, the nucleotide sequence coding for the initiation methionine, ATG, and a stop codon, and also had the full length of the PBS-degrading enzyme gene (Ohnish et al. (1995) FEMS Microbiol Lett., 126 (2), 145-150).
  • Ligation was performed using DNA ligase (Takara Shuzo) to obtain a ligated DNA solution.
  • 100 ⁇ l of transformable Escherichia coli DH5a (Takara Shuzo) was added, and the mixture was allowed to stand on ice for 20 minutes and at room temperature for 10 minutes to obtain a transformed E. coli suspension.
  • the transformed E. coli suspension was spread on LB agar medium, and cultured at 37 ° C for 16 hours. A colony on the medium was picked up with a platinum needle, transplanted into an LB liquid medium (50 ⁇ g / ml ampicillin), and cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours. Plasmid DNA was extracted from the cultured cells in the same manner as described above to obtain the plasmid DNA for transformation of Aspergillus oryzae (pNG-cut). 10 Ug of this plasmid DNA was digested with H, rifenol was extracted by an ordinary method, and ethanol precipitation was performed. Then, it was dissolved in 10 ⁇ l of E to obtain a DNA solution for transformation.
  • pNG-cut Aspergillus oryzae
  • Transformation of Aspergillus oryzae was performed by a modification of the protoplast-PEG method of Vollmer et al. (Vollmer, SJ, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4869-4873). The details followed Example 2 (2-2). After sporulation in the transformation regeneration medium, scrape the conidial stalk with a platinum needle, suspend in 0.01 (v / v%) Tween 80, dilute this suspension appropriately, and spread on Czapek-Dox agar medium. Monospore separation was performed by repeating culturing at ° C. single The spore separation was confirmed by the Hondel method (spore PGR method) (van, Zeiji, CM, et al.
  • the amplification reaction is performed by denaturing type I DNA at 94 ° C for 3 minutes, 30 cycles of holding at 94 ° C for 1 minute, 55.5 ° C for 1 minute, 72 ° C for 90 seconds, and then 72 ° C. , 95 seconds, and kept at 4 ° C.
  • amplification of the PGR fragment was confirmed at the same position as the positive control, and as a result, the PBS-degrading enzyme gene was located downstream of the glucoamylase II promoter sequence on the chromosomal DNA.
  • PNGA1 42 was transformed with) Asuperugirusu 'oryzae transformed glucoamylase as spore suspension solution becomes 0.5 x 1 0 6 spores / ml of transformed strains.
  • an inducer of the promoter YPM Liquid medium ⁇ 1 (w / v%) yeast extract, 2 (w / v%) peptone, and 2 (w / v%) maltose ⁇ were added respectively.
  • the mixture was cultured at 30 ° C. and 125 rpm for 16 hours, and the culture supernatant was obtained by filtration through M [RACLOTH (CALBiOGHEM (registered trademark)).
  • a PBS emulsion was added to the obtained culture supernatant so that the concentration became 0.1 (v / v%), the mixture was kept at 37 ° C, and the turbidity was reduced (decomposition of the PBS).
  • the expression of the protease was confirmed, its activity was observed only in the culture supernatant of the Aspergillus oryzae transformant in which the PBS-degrading enzyme gene was inserted into the chromosomal DNA.
  • add 50 jiil of cold trichloroacetic acid to 100 tl ⁇ of the culture supernatant, mix well, then leave the mixture on ice for 20 minutes, centrifuge at 15,000? ⁇ 4 ° C for 15 minutes and centrifuge.
  • plasmid DNA high expression Aspergillus oryzae of biodegradable plastic-degrading enzyme cutinase gene that has been transformed, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary center one (Higashi Tsukuba, Ibaraki, Japan 1 It was deposited on 1-chome, 1-chome, on October 4, 2002, and is assigned the accession number: FERM P-1 9054.
  • Example 4 plasmid DNA (P NG- cut) high expression Aspergillus oryzae of biodegradable plastic-degrading enzyme cutinase gene that has been transformed, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary center one (Higashi Tsukuba, Ibaraki, Japan 1 It was deposited on 1-chome, 1-chome, on October 4, 2002, and is assigned the accession number: FERM P-1 9054.
  • Example 4 Example 4
  • a test plot (pNG-cut + pNGenoP-hyp) in which a high-mouth hobin-high-expressing strain and a cutinase-high-expressing koji mold were co-cultured was provided.
  • the culture solution on day 2 of the culture was filtered through MIRAGLOTH to remove the cells, and the turbidity (measured at 630 nm) of the culture filtrate was reduced as shown in Table 3.
  • the initial turbidity (OD 63 ;) was 8.73.
  • the decrease in turbidity was large in the order of coculture, cutinase-expressing strain, hide-mouth hobin expressing strain, and control.
  • Example 4 Each strain used in Example 4 was adjusted to 1 ⁇ 10 7 spores / ml, inoculated into a minimal medium (0.5% maltose) in which 0.5% (w / v) PBS powder was suspended, and 30 ° C. C was cultured for 8 days. After the cultivation, the PBS micropowder containing the cells was washed (taken in a 50 ml falcon tube, added with about 25 ml of sterile water, and stirred with a vortex mixer) to completely separate the cells from the PBS fine powder.
  • the washing solution was filtered with Miracloth filter paper, and the filtrate was centrifuged (10,000 rpm, 15 min), and the supernatant was removed and the suspension was adjusted with a minimum medium so as to have the volume of the initial culture conditions.
  • the suspension was diluted 300-fold and the absorbance was measured at 630 nm. Table 4 shows the obtained results.
  • Example 6 Production of a useful substance by co-culturing Aspergillus aspergillus oryzae high-expressing hobin-expressing bacterium, cutinase-high-expressing bacterium, and an enzyme (a useful substance) involved in the biosynthesis system of a useful substance (a useful substance)
  • Example 4 obtained by transforming the RIB40 strain.
  • 1 ⁇ 10 6 spores were inoculated into the medium and cultured at 30 ° C. for 2 days.
  • the culture was filtered through MIRACLOTH to remove the cells, and a culture filtrate was obtained.
  • the mixture was centrifuged at 15000 ⁇ 4 ° C for 10 minutes to completely remove the remaining PBS, and a culture supernatant was obtained.
  • -Amylase activity was measured using a culture supernatant diluted 100-fold with water.
  • the expression level of ⁇ -amylase activity in each culture supernatant was measured by the iodine coloring method. .
  • a solution 50 mM Bok squirrel buffer (pH 6.8) which was dissolved soluble Starch such that 0.3% during, B solution; 1 N iodine in hydrochloric acid 2x1 0- 4% was prepared which was dissolved so that the potassium iodide to 2x 1 0- 3%.
  • 50 ⁇ ⁇ of the diluted culture supernatant was added to solution A 400 ⁇ ⁇ and reacted at 37 ° C for 10 minutes.
  • Solution B was added to the mixture at 50 ⁇ ⁇ , mixed well, and the absorbance at 620 nm was immediately measured.
  • the decrease in absorbance relative to the value of Blank (uninoculated) was shown in Table 5 as the relative activity of he-amylase. Was.
  • a hide-mouth hobin high-expressing plasmid for Aspergillus was constructed.
  • a pPTR1 vector which is a vector for expression of Aspergillus, was used.
  • pPTR-gla-hyp was prepared by fusing the glaA142 promoter, which is highly inducible and highly inducible to the high expression of hide mouth hobin, upstream of the target gene. ( Figure 10) (7-1) Construction of pPTR-gla-hyp
  • pNGA142 two types of vectors (pNGA142, pPTRII) were used, and pNG-enoP-hyp prepared in Example 2 was used for preparing inserts.
  • pNGA142 and pNG-enoP-hyp were cut with TaI and Sa / I, respectively.
  • Example 2 The above methods 1 to 6 were performed in the same manner as in Example 2. After the obtained plasmid was digested with al and Sa / l, the presence of an imported fragment was confirmed by agarose electrophoresis, and the completion of pNG-gla-hyp was confirmed.
  • pPTR 1 and pNG—gla—hyp were each digested with Pst Y and Sma I
  • Transformation of Aspergillus oryzae was performed using a modified version of the protoplast-PEG method.
  • DNA pPTR-gla-hyp prepared above was used. 10 ⁇ g of each of these plasmid DNAs was completely digested with SacII, extracted with rifenol by an ordinary method, and subjected to ethanol precipitation. The subsequent transformation of Aspergillus oryzae followed the method described in Example 2 (2-2).
  • the protoplast regeneration medium Gzapec-Dox soft agar medium supplemented with pyrithiamine (TaKaRa) at 100 ⁇ g / ml was used.
  • single spores were isolated by transferring the spores formed on the medium to Czapek-Dox agar medium containing pyrithiamine.
  • pPTR-gla-hyp spores as primer for PGR
  • oligonucleotides 5'-GTGTGTGGGGTATGTAAGGGTG-3 ', were synthesized.
  • the PCR equipment used was PGR Thermal Cycler PERSONAL (Takara Tozo). Plasmid DNA used for transformation was designated as type I as a positive control.
  • the amplification reaction of pPTR-gla-hyp denatured type I DNA at 95 ° C for 3 minutes, and 30 cycles of holding at 94 ° C, 1 minute, 55.5 ° C, 1 minute, 72 ° C, 90 seconds were performed. Thereafter, the cells were completely extended at 72 ° C for 95 seconds and kept at 4 ° C.
  • the amplified PGR fragment was subjected to agarose gel electrophoresis, amplification of the PCR fragment was confirmed at the same position as the positive control. Based on the results, the glaA142 promoter-Hide mouth hobin gene was inserted downstream of the glaA142 promoter-sequence on the chromosomal DNA of Aspergillus. The existence of the array was confirmed.
  • the transformed cutinase-Hide mouth hobin co-expressing strain was inoculated into 200 ml of YPM medium (Example 2 (2-2)) at a concentration of 1 ⁇ 10 6 spores / ml, and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours.
  • the cells were filtered through a glass filter, and the culture supernatant was obtained.100 jUl of 100 (w / v%) cold acetic acid at a low concentration was added to 200 ⁇ ⁇ of the culture supernatant, mixed well, and then iced. The sample was centrifuged at 15,000 Xg at 4 ° C for 20 minutes to completely remove the supernatant, and the precipitate was removed using a 15 // 1 SDS-forming solution ⁇ Example 2 (2 -2) ⁇ , leave it in a boiling water bath for 5 minutes to convert it to SDS, And The subsequent SDS-PAGE method was as described in Example 2 (2-2).
  • pPTR1 was used as a revector and the insert used was pNG-enoP-hyp created in Example 2.
  • pPTR1 and pNG-enoP-hyp were cut with PsiI and SmaI, respectively.
  • Example 2 The above methods 1 to 6 were performed in the same manner as in Example 2. After the obtained plasmid was digested with PstI and agarose electrophoresis, the presence of the inserted fragment was confirmed, and the completion of pPTR-enoP-hyp was confirmed.
  • 5′-GTAGAATCACGAATGAGACCTTTGACGACC-3 ′ oligonucleotide was synthesized.
  • the equipment for PGR was PCR Thermal Cycler PERSONAL (Takara Shuzo). Plasmid DNA used for transformation was used as a positive control.
  • the amplification reaction of pPTR-gla-hyp denatures type III DNA at 95 ° C for 3 minutes, and 30 cycles of holding at 94 ° C, 1 minute, 55.5 ° C, 1 minute, 72 ° C, 90 seconds are performed. After that, the cells were completely extended at 72 ° C for 95 seconds and kept at 4 ° C.
  • the culture was filtered through M [RACLOTH to remove the cells, and a culture filtrate was obtained.
  • the resulting culture was centrifuged at 15,000 ⁇ ⁇ , 4 ° C for 10 minutes to completely remove the remaining PBS and obtain a culture supernatant.
  • the para-amylase activity was measured by the iodine coloration method similar to the method of Example 6 using a culture supernatant diluted 100-fold with water. That is, as a reagent solution for measurement, solution A; a solution in which soluble starch was dissolved to a concentration of 0.2% in 50 mM Tris buffer (pH 6.8); solution B; iodine in 1 N hydrochloric acid
  • 2x10- 4% was prepared which was dissolved so that the potassium iodide to 2x10- 3%.
  • 50 ⁇ l of the diluted culture supernatant was added to 400 A of the solution A, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the solution B was added thereto in an amount of 50 jUl, mixed well, and the absorbance at 620 nm was measured immediately.
  • the amylase gene was determined from the results of the amylase activity measurement. Since the transfected triple expression strain showed the highest ⁇ -amylase activity, the acquisition of the triple expression strain was confirmed.
  • strain a -amylase relative activity (delta OD fi click n)
  • Hide-hobin homolog (10-1) Search for hide-hobin homolog using Aspergillus oryzae EST database
  • denature type III DNA for 3 minutes perform 30 cycles of holding at 95 ° C, 1 minute, 57.2 ° C, 30 seconds, 72 ° C, 90 seconds, and then complete extension at 72 ° C, 90 seconds And kept at 4 ° C.
  • Whether a DNA fragment was actually amplified by PGR was confirmed by agarose electrophoresis.
  • the nucleotide sequence was sequenced. The PGR amplified fragment was subjected to agarose electrophoresis, a DNA fragment was excised under long-wavelength (363 nm) UV, and the DNA was replated once with the prep A gene (BIO-Rad-Laboratories).
  • PCR fragment recovered using PGEM-T Easy Vector Systems was subjected to TA cloning according to the protocol attached to PGEM-T Easy Vector Systems.
  • the base sequence of the inserted DNA fragment in this plasmid DNA was converted to AB [PR [SM TM 377 DNA sequencer Long Read (PE)
  • pNGA142 and TA-hypB were each digested with aIhiSail.
  • Example 2 The above methods 1 to 6 were performed in the same manner as in Example 2. After the obtained plasmid was digested with alhi, the presence of an inserted fragment was confirmed by agarose electrophoresis, and the completion of pNG-gla-hypB was confirmed.
  • oligonucleotides of 5'-GTAGAATCACGAATGAGACCTTTGACGACC-3 ' were synthesized.
  • PCR equipment is PGR Thermal Cycler PERSONAL (Takara Shuzo) Was used.
  • the plasmid DNA used for the transformation was designated as type III.
  • the amplification reaction of pNG-gla-hyp B denatures type I DNA at 95 ° C for 3 minutes, and 30 cycles of holding at 94 ° C, 1 minute, 57.0 ° C, 1 minute, 72 ° C, 90 seconds After this, the cells were completely extended at 72 ° C for 95 seconds and kept at 4 ° C.
  • the ORF (open reading frame) of hydrophobin-315 is predicted from the information in the A.oryzae EST database, and the two types of oligonucleotides 5'—CTGGTTCGTTTGTCGACATGAAGGT—3 'and 5 so that the ORF is included in the fragment amplified by PCR '—TCAATGGTGTAGAAGGCGTTGGG-3' was synthesized and used as a primer for cloning.
  • A.oryzae RIB 40 chromosomal DNA prepared in Example 3-3 was used as type I DNA.
  • the PCR equipment used was PGR Thermal Cycler PERSONAL (Takara Shuzo).
  • the amplification reaction denatures the type I DNA at 95 ° C for 3 minutes, and after 30 cycles of holding at 95 ° C, 1 minute, 55.4 ° C, 30 seconds, 72 ° C, 90 seconds, and then 72 ° C C, complete extension for 90 seconds and kept at 4 ° C. Whether the DNA fragment was actually amplified by PGR was confirmed by agarose electrophoresis. Furthermore, in order to confirm whether the target gene contained a mutation by PGR, the nucleotide sequence was sequenced in the same manner as in (8-2-2). From the analysis results, no mutation in the base sequence in the amplified fragment obtained by the PCR reaction was confirmed. (10-2-5) Construction of high expression plasmid for hydrophobin-315
  • hydrophobin-315 In order to breed Aspergillus oryzae with high expression of hydrophobin-315, a plasmid with high expression of hydrophobin-315 for Aspergillus was constructed. Using PNGA1 42 based vector is a vector for Aspergillus expression. High expression of hydrophobin-315 is strongly induced by maltose One
  • the revector used pNGA142 and the insert used was -1 ⁇ 1 ⁇ 0 ⁇ -315.
  • pNGA142 and TA-hydrophobin-315 were J-cut with 6aI and Sa / I, respectively.
  • Aspergillus oryzae was transformed using an improved version of the protoplast-PEG method, and the plasmid DNA to be transformed was prepared as described above.
  • pNG-gla-hydrophobin-315 was used. 10 g of these plasmid DNAs were completely digested with, extracted with rifenol by an ordinary method, and precipitated with ethanol, and then dissolved in 10 I of TE to obtain a DNA solution for transformation. Subsequent transformation of Aspergillus oryzae followed the method described in Example 2 (2-2).
  • Transformation of pNG-gla-hydrophobun-315 is carried out in the same manner as in Example 2, and the transformant is used as a primer for the spore PGR of pNG-gla-hydrophobin-315 5′-CTGCTTCCTTTGTCGACATGAAGGT-3 ′ When Two oligonucleotides of 5'-GTAGAATCACGAATGAGACCTTTGACGACC-3 'were synthesized.
  • the PCR equipment used was a PGR Thermal Cycler PERSONAL (Tatori).
  • the plasmid DNA used for the transformation was designated as type III.
  • the amplification reaction of pNG-gla-hydrophobin-315 denatures type I DNA at 95 ° C for 3 minutes and holds 30 cycles of holding at 94 ° C, 1 minute, 57.0 ° C, 1 minute, 72 ° C, 90 seconds. After the cycle, the cells were completely extended at 72 ° C for 95 seconds and kept at 4 ° C.
  • the obtained amplified PGR fragment was subjected to agarose electrophoresis, amplification of the PGR fragment was confirmed at the same position as the positive control. The presence of the inserted sequence of 5 genes was confirmed.
  • Rol A In the degradation of biodegradable plastic in the system where Hyde-mouth hobin (Rol A) is present, Rol A is considered to be adsorbed on the surface of biodegradable plastic due to the physical property of amphiphilicity.
  • Rol A is adsorbed to these biodegradable plastics using PBS (Plasma, PBSA, PLA) as a biodegradable plastic 30H861
  • the spores of the hydrophobin high-expressing Aspergillus oryzae obtained in Example 2 were inoculated to a concentration of 1 ⁇ 10 6 spores / ml into a 3 L Tosaka flask containing 1 L of a minimal medium containing 1% maltose at 30 ° C. Cultured for 48 hours. The culture was filtered through MiRAGLOTH (CALBIOCHEM) to obtain a culture supernatant. Ammonium sulfate was added to the culture supernatant so as to be 40% saturated, and then centrifuged at 8,000 ⁇ , 4 ° C. for 20 minutes to obtain a supernatant fraction.
  • alkaline phosphatase Since alkaline phosphatase is immobilized on the secondary antibody, 66 ⁇ L of NBT (nitro blue tetrazdium 50 mg / ml in 70% dimethylformamide) is used as a substrate in 10 mL of alkaline phosphatase buffer (1 OOmM Tris-HCI, PH mixing 9.5), 100m NaCI, and 5mM MgCI 2. Thereafter, a mixture of 33 I BIPG (50 mg / mL in 70% dimethylformamide) was used in this solution.
  • NBT nitro blue tetrazdium 50 mg / ml in 70% dimethylformamide
  • the PCR fragment used as a probe for Southern hybridization was prepared as follows.
  • cDNA library a library of a group of genes expressed during culture in the presence of PBS was obtained (hereinafter abbreviated as cDNA library).
  • a suspension of Aspergillus oryzae RIB40 spores was added to 100 ml of Gzapek-Dox medium in a 500 ml triangular flask with a concentration of 0.5 ⁇ 10 6 spores / ml. After the addition, the cells were cultured at 30 ° C for 24 hours. The mycelium was collected using Miracloth (CALBIOCHEM), washed with sterilized water, and then removed of excess water. The collected mycelium was transferred to a minimal medium using PBS emulsion as the sole carbon source, and cultured with shaking at 30 ° C for 3 days. Miracro after culture One
  • the mycelium was recovered using a microscopy. According to Example 1, total RNA and mRNA were obtained from the mycelium. Next, a reverse transcription reaction was performed using the obtained mRNA as a type II. To an Etsu Pendorf tube, add 2 ⁇ l of mRNA (92 ng / l) 5 ⁇ U oligo (dT) primer (0.5 ⁇ g / ⁇ 1) 1 U 2.5 mM dNTP MIX (2.5 mM each) 4 and DEPG-treated water After incubation at 70 ° C for 10 minutes, leave on ice for 1 minute or more to
  • the (dT) primer was annealed. Then, the reaction solution 5 X First Strand Bufffer (250 mM Tris-HCI, pH 8.3, 375 mM KCI, 15 mM MgCI 2) 4jU U 0.1 M DTT 2 it I was added and incubated 5 minutes at 42 ° C Then, 1 jul of reverse transcriptase Super Script II RT (200 U / l) was added, and the mixture was stirred by pipetting, incubated at 42 ° C for 50 minutes, and further superscript II RT (200 U / jUl) 1 ji After adding I and stirring by pipetting, the mixture was incubated at 42 ° C for 50 minutes to perform a reverse transcription reaction.
  • 5 X First Strand Bufffer 250 mM Tris-HCI, pH 8.3, 375 mM KCI, 15 mM MgCI 2
  • 4jU U 0.1 M DTT 2 it I was added and incubated 5 minutes at 42 ° C
  • AT-3 ' ⁇ was synthesized. Using this one set of primers, PCR was carried out using a cDNA library as type III to amplify a probe for Southern hybridization.
  • the PCR equipment used was PGR Thermal Cycler PERSONAL (Takara Shuzo).
  • the cDNA library used the cDNA library solution described above, and the polymerase used Extaq polymerase (Takara Shuzo).
  • the amplification reaction was performed by denaturing type I DNA at 95 ° C for 3 minutes, performing 30 cycles at 95 ° C for 1 minute, 53 ° C for 1 minute, and holding at 72 ° C for 30 seconds.
  • the sample was completely extended at 1 ° C for 1 minute and kept at 4 ° C. When subjected to agarose gel electrophoresis, amplification of a fragment consisting of about 160 base pairs was confirmed.
  • NEN RandomPrimer Fluorescein Labeling Kit with
  • the gel near 1800 base pairs was cut out under UV irradiation, DNA was extracted from the gel using prep A gene (BioRad), and this was used as an inserted DNA fragment.
  • the plasmid pBluescript II KS + DNA (Stratagene) Digest 2.5 ⁇ g with Hindi (Takara Shuzo) or Sacl (Takara Shuzo) and H // 7d III (Takara Shuzo), extract with rifenol and precipitate with ethanol according to standard methods, and then add alkaline phosphatase.
  • the phosphoric acid at the 5 'end was removed with ZE (Takara Shuzo), this reaction solution was subjected to rifenol extraction and ethanol precipitation by a conventional method, and then dissolved in TE to obtain a vector DNA solution.
  • Link with the inserted DNA fragment A ligated DNA solution was obtained, and the ligated DNA solution was used to transform Escherichia coli DH5 strain and subjected to colony hybridization, resulting in a positive signal.
  • plasmid DNA that is a positive signal from A plasmid DNA solution was obtained from Enterobacteriaceae by the method described in Example 3 (3-3). The nucleotide sequence of the inserted DNA fragment in this plasmid DNA was analyzed.
  • an open reading frame containing the nucleotide sequence of the probe was found in the Hfnc ⁇ digested fragment of chromosomal DNA consisting of 2713 base pairs inserted into the plasmid DNA (Sequence Table 4), and also consisting of 1801 base pairs.
  • An open reading frame containing the nucleotide sequence of the probe was found in the Sac1 / H'ndIII digested fragment of chromosomal DNA (Sequence Table 5). These two open reading frames each contained 2 or 3 intron nucleotide sequences, and further contained a nucleotide sequence ATG encoding an initiation methionine and a stop codon, that is, the full length of the PBS-degrading enzyme analog gene.
  • PGR was performed using the cDNA library containing the PBS-degrading enzyme gene described in Example 3 and the above-mentioned two types of PBS-degrading enzyme analog genes as P-type, and introduced into an E. coli expression plasmid (pET-12b; Novagen). PCR fragments were prepared as needed.
  • pET-12b E. coli expression plasmid
  • the oligonucleotide primer set of 5'-GACCGGATGGATCCCGAAAATTTATCC-3 ' was used to convert 5' to the PBS-degrading enzyme analog gene consisting of an open reading frame of 2713 base pairs in Aspergillus genome.
  • PCR Thermal Cycler PERSONAL (Takara Shuzo) was used.
  • cDNA library 1 the above cDNA library solution was used, and Extaq polymerase (Takara Shuzo) was used as the polymerase.
  • the amplification reaction is performed by denaturing type I DNA at 95 ° C for 3 minutes, holding at 95 ° C, 1 minute, 57 ° C, 1 minute, 72 ° C, 1 minute 30 cycles, then 72 ° C The tube was completely extended for 1 minute and kept at 4 ° C.
  • the resulting amplified PGR fragment was digested with ⁇ 3 / ⁇ I (Takara Shuzo), subjected to agarose gel electrophoresis, stained with ethidium bromide, and then irradiated with UV from 625 bp, 650 bp, and 759 bp, respectively. A fragment was cut out. DNA was extracted from the gel using prep A gene (BioRad) and used as an inserted DNA fragment.
  • a DNA solution was used. Next, 1 Ug of the vector DNA and 1.5 jUg of the inserted DNA fragment were ligated with T4 DNA ligase (Takara Shuzo) to obtain a ligated DNA solution. Escherichia coli DH50T (Takara Shuzo) was transformed using the ligated DNA solution to obtain transformed Escherichia coli carrying each plasmid DNA. The plasmid DNA was extracted from the cultured cells of the transformed Escherichia coli in the same manner as described above.
  • E. coli BL21-SI Invitrogen
  • each transformant was transformed on LB agar medium containing 50 jt g / ml ampicillin without NaCI. I got it.
  • an Escherichia coli transformant (pET-cut) transformed using the plasmid DNA into which the PBS-degrading enzyme gene was inserted, and transformed using the plasmid DNA into which the PBS-degrading enzyme analog gene was inserted.
  • Escherichia coli transformant 1 species (pET-cuthom1, pET-cuthom2 ) and, to be ⁇ , no, (P in ET-1 2b were transformed) picked colonies of E. coli transformants in platinum needle, LB liquid medium (50 mu g / ml ampicillin and NaCI). After inoculation, shaking culture was performed at 37 ° C for 16 hours to obtain preculture. 500 il of each preculture solution was added to 50 ml of LB medium (containing 0.5% NaGI) in a 500 ml volumetric flask. After addition, the culture was shake-cultured at 30 ° C for 12 hours to induce and express the target enzyme protein in the culture supernatant.
  • LB liquid medium 50 mu g / ml ampicillin and NaCI
  • -A homologue found as a result of a tblastn search in the Aspergillus nidulans genome database. It is registered as genomic DNA for each contigue, but the following three species are not registered as annotated gene or cutinase.
  • Cut1 P29292 protein
  • GI gene
  • Locus MQ 1943.3
  • Cut8 Locus MG 09100.3 and below
  • the four types of cutins are known genes and proteins, and their functions have been confirmed.
  • Nectria haematococca Cutinase Q96UT0 protein
  • GI gene
  • a spore suspension of RIB40 strain was shaking cultured for 5 days and inoculated to a final concentration of 1 .0 X 1 0 6.
  • the culture was filtered through Miracloth to remove the cells.
  • the filtrate was saturated with 20% ammonium sulfate, cooled on ice for 1 hour, and the precipitate was removed by centrifugation at 10,000 ⁇ , 4 ° C. for 30 minutes.
  • the supernatant was applied to a 10 mM Tris-HGI buffer, pH 8.0, 20% saturated octyl-cell mouth fine column (Seikagaku Kogyo Co., Ltd.) saturated with ammonium sulfate.
  • the eluted fraction was subjected to SDS-PAGE to confirm the eluted protein.
  • the gel after SDS-PAGE was performed using Silvestin, for PAGE protein (Nacalai TeX), and the method was performed according to the method described in the instruction manual.
  • the presence of a protein with a molecular weight of about 14 kDa was confirmed near 0% saturation of ammonium sulfate (Fig. 20). This protein was eluted near the ammonium sulfate concentration of 0% saturation in hydrophobic chromatography, suggesting that it is a highly hydrophobic protein.
  • a homology search was performed using a DNA data bank (http: @ www.ddbj.nig.ac.jp / Welcome-j.html). As a result, the homology was confirmed to be the same as the 4MeS protein produced by Metallidum anisoprie.
  • the homology of 138 amino acid residues was confirmed in Aspergillus fumigatus genome database (http: httpwww.tigr.org/tdb/e2k1/afu1/)
  • the sequence contained in contig 4875 was confirmed. And consequently showed homology with the sequence contained in contig 4820.
  • Table 10 shows specific values for the above homology (percent).
  • Southern hybridization was performed in the same manner as in Example 3 (3-3) using Antifluorescein-AP (Eizo Diagnostics, Inc.). As a target, 10 ig of chromosomal DNA completely digested with 50 units of EcoR Bamhn (Takara Shuzo) was used. Southern hybridization results ⁇ ? ⁇ Using a probe of about 570 bp for the digested fragment, a band consisting of about 3000 bp was detected, and a probe of 300 bp for the BamH ⁇ digested fragment was detected. When used, a band consisting of 2000 base pairs was detected.
  • chromosomal DNA was completely digested with 50 units of fcoRI and 5 amH ⁇ respectively, subjected to agarose gel electrophoresis, stained with ethidium bromide, and then subjected to 3,000 base pairs and a gel around 2000 under UV irradiation. I cut it out. DNA was extracted from the gel using prep A gene (BioRad) and used as an imported DNA fragment.
  • plasmid pBluescript II KS + DNA (Stratagene) is digested with oRI and Baml (Takara Shuzo), extracted with rifenol and precipitated with ethanol according to a standard method, and then alkaline phosphatase (Takara Shuzo). ) To remove the phosphoric acid at the 5 'end. This reaction solution was subjected to rifolol extraction and ethanol precipitation in the usual manner, and then dissolved in TE to obtain a vector DNA solution. Furthermore, a ligated DNA solution was obtained by ligation with the inserted DNA fragment described above. Escherichia coli DH5 strain is transformed using these ligated DNA solutions, and colony hybridization is performed. -PT / JP2003 / 011861
  • a set of oligonucleotides was designed with reference to the base sequence around the cloned target gene (5'-CTTGCATTCAAGTCGACCTGAACAC-3 ',
  • the PCR reaction was performed using the genomic DNA of the strain RIB40 as a template. The reaction was performed at 95 ° C for 3 minutes. The denatured DNA was then denatured at 95 ° C for 1 minute at 60 ° C. After 30 cycles of holding at 72 ° C for 1 minute at 72 ° C for 30 minutes, complete extension was performed at 72 ° C for 1 minute, and the sample was held at 4 ° C. The fragment amplified by PGR was subjected to agarose electrophoresis. As a result, amplification of about 730 base pairs was observed. PT / JP2003 / 011861
  • This reaction solution was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation in the usual manner, and then dissolved in TE to obtain a vector-DNA solution.
  • 1 jug of the vector DNA and 1.5 ⁇ g of the imported DNA fragment were ligated with T4 DNA ligase (Takara Shuzo) to obtain a ligated DNA solution.
  • Escherichia coli DH5 was transformed using the ligated DNA solution to obtain transformed Escherichia coli having each plasmid DNA.
  • the plasmid DNA was extracted from the cultured cells of the transformed Escherichia coli in the same manner as described above, and the plasmid DNA for the transformation of Aspergillus was obtained.
  • the plasmid DNA was extracted from the cultured cells by the method described in Example 3 (3-3). After extraction, plasmid DNA for transformation of Aspergillus was obtained.
  • the plasmid DNA (10 ⁇ g) was digested with, extracted with rifenol by an ordinary method, and precipitated with ethanol, and then dissolved in TE (101) to obtain a DNA solution for transformation. Subsequent transformation of Aspergillus oryzae was performed according to the method described in Example 7 (7-1-2) to obtain a transformant.
  • two oligonucleotides (5, -CTTGCATTCAAGTCGACCTGAACAC -3 ',
  • the desired gene ⁇ scan Perugirusu inserted into the chromosome DNA with a spore suspension of 'the Orize transformed strain inserted non (transformed by P NGA142) Asuperugirusu' Orize transformant 0.5 x 10 s Individual spores / ml were added to 100 ml of YPM liquid medium ⁇ Example 2 (2-2) ⁇ containing maltose which is an inducer of the dalcoamylase 'promoter. After addition, incubate at 30 ° C, 125 rpm for 16 hours, and transfer the culture supernatant to MIRAGLOTH
  • the spores PbpA high expression strain was 1 0 6 (/ ml) inoculation so that the YPM liquid medium 750 ml was carried out for 2 days of culture.
  • the culture was filtered through Miracloth, ammonium sulfate was added to the filtrate to a concentration of 60%, and the mixture was ice-cooled for 1 hour.
  • the filtrate was centrifuged at 10,000 X g and 4 ° C to remove a precipitate.
  • the centrifuged supernatant is applied to an octyl-cellulofine column (Seikagaku Corporation), a deacel mouth fine column (Seikagaku Corporation), and an S-Sepharose column FF (Pharmacia) to convert PbpA to a single band by SDS-PAGE. Purification was performed until complete.
  • Ammonium sulfate was added to the 10 mM Tris-HCI ( ⁇ 8.0) buffer so that the concentration was ⁇ 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, and 90%.
  • 0.2 g of PBS powder (1 mm 3 ) was added to each 1 ml of the buffer and suspended well.
  • 1001 of a purified PbpA preparation (0.1 mg / ml) was added, and the mixture was shaken (125 rpm) at 30 ° C. for 3 hours to perform an adsorption treatment. This mixture was passed through a filter (pore size: 0.2 jUm millipore) to completely remove PBS, and the filtrate was subjected to SDS-PAGE (FIG. 24).
  • the sequence showing homology to PbpB was obtained from the genome database for both the base sequence and the amino acid sequence. Expression has not been confirmed and function is unknown.
  • the biodegradable plastic is selectively degraded from the biodegradable plastic composite by a degrading enzyme, and the biodegradable plastic is recovered as a monomer and an oligomer in the soluble category, and the other composite is recovered.
  • platinum wire was used for one of the composite materials and PBS was used for the biodegradable plastic.
  • the degrading enzyme a purified PBS degrading enzyme preparation (cutinase) described in Example 3 was used. 4 g of PBS was dissolved in 20 ml of closed-mouthed form so that the concentration became 20 (w / v%) in a 100-ml vial.
  • Pbp A is adsorbed to PBS under conditions of low water activity of 30% or more of ammonium sulfate. Therefore, the water activity was reduced by drying PbpA on a PBS film, and PBS degradation by cutinase was attempted with PbpA adsorbed on PBS.
  • the purified sample of PbpA was diluted with purified water, and the concentration was adjusted to 1.0, 5.0, 10, 50, and 100 (j! G / ml). Spot 10 PbpA solution of each concentration on PBS film.
  • the mixture was completely dried at ° C to promote adsorption of PbpA to PBS.
  • a filter paper having a diameter of 6 mm was allowed to stand still in the form of PbpA adsorbed on a PBS film, and soaked with a 10 I cutinase solution (20 g / ml).
  • the PBS film in this state was kept at 37 ° C for 6 hours, and the decomposition of the PBS film was observed.
  • Examples 15-1 and 15-3 it was confirmed that hide mouth hobin and PbpA promoted PBS by cutinase. It was examined whether these biosurfactants show a significant promoting effect when compared to artificial surfactants.
  • Plysurf A210G (Daiichi Kogyo Seiyaku) was used as a human surfactant.
  • a biosurfactant at a concentration at which a promoting effect was observed in Examples 15-1 and 15-3 (Hide mouth Hobin: 2.5 jU g / ml, PbpA: 10 ⁇ g / ml) was applied on a PBS film. -1 and 15-3.
  • Plysurf A210G 2.5 g / m and 10 ⁇ g / ml of Plysurf A210G were adsorbed on a PBS film.
  • adsorption treatment was performed in the same manner using 10 mM Tris-HCI buffer (pH 8.0) in the case of a hide mouth hobin and purified water in the case of PbpA.
  • the reaction was carried out under the conditions described in (1), (2) at 30 ° C for 12 hours, and (3) PbpA at 6 hours at 37 ° C.
  • the PBS film was washed with purified water, dried and observed.
  • PBS was significantly degraded at the site where both biosurfactants were adsorbed on the PBS film as compared with the control (FIG. 30).
  • No significant PBS degradation was observed at the site where Plysurf A210G was adsorbed as compared to the control (FIG. 30). Note that, since the PBS film was captured as a transmission image, the PBS decomposition part is shown in black in FIG.
  • biosurfactants such as Hyde-mouth Hobin and PbpA promote the PBS degradation of cutinase more strongly than artificial surfactants such as Pricer A210G.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention allows a biosurfactant such as a plastic-binding protein to be adsorbed on a hydrophobic surface of a plastic, thereby effectively promoting the decomposition of a plastic in cooperation with a plasticase. It is based on this new knowledge.
  • the present invention provides a method for degrading plastics more effectively in the presence of a biosurfactant. Furthermore, by utilizing microorganisms that produce biosurfactants and plastic degrading enzymes, or biosurfactants and / or plastic degrading enzymes themselves, it is possible to efficiently promote large-scale decomposition of high-density plastics. And a novel method that can simultaneously produce useful substances by using microorganisms (filamentous fungi and actinomycetes) having high productivity of useful substances such as enzyme proteins and antibiotics. I can do it.

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Description

明細書 プラスチックの分解法及びそれを利用した有用物質の製造方法 技術分野 本発明は、プラスチック結合性タンパク質の存在下でプラスチックを分解する 方法、特に、ァスペルギルス 'ォリゼ又はァスペルギルス■ソーャの作用によリブ ラスチックを分解する方法、更に、生分解性プラスチックに微生物を接触させ、 プラスチックを分解する過程で、プラスチック中の炭素を微生物により新たな有 用物質に転換する生産技術、並びに、以上の方法に使用される各種のタンパ ク質及びそれをコードする遺伝子等に関するものである。 背景技術 日本のプラスチックの需要量は、 1 997年の統計によれば 1 400〜1 500万トンに 達し、そのうち 900万トン以上が廃棄プラスチックとして排出されており、環境問 題及び化石燃料の消費抑制の観点から対応が必要とされている (社団法人プ ラスチック処理協会発行「プラスチックリサイクルの基礎知識」）。その対策とし て、石油化学系プラスチックの焼却による炭酸ガスおよびダイォキシン類の発 生と、非分解性プラスチックの環境への廃棄の抑制を目的に、生分解性プラス チックが開発されてきた。生分解性プラスチックは、 201 0年には全プラスチックの 約 3-7%、すなわち 50- 1 00万トン/年の流通量が予測されているが (「生分解性ポ リマ一の市場拡大シナリオ」株式会社富士キメラ総研版， 23頁）、現状の技術で ある生分解性プラスチックの自然土壌中における分解処理許容量の限界と生 分解性プラスチック自身のコスト高が問題として指摘されている。 ところで、糸状菌の中でも、特にァスペルギウス 'ォリゼ（キコウジ菌）等を含む 麹菌は、清酒、みそ、醤油、及び、みりん等を製造する、わが国における醸造産 業において古くから利用され、直接に食されてきた菌類であり、米国の FDA (食 品医薬局）により G RAS ( Generally Recognized as Safe)にリストアップされて いる安全な遺伝子源である。 更に、麹菌は、蛋白質などを菌体外に分泌する能力に優れておリ、その為に 、様々な有用物質の生産に利用されている。 特許文献 1には、微生物として放線菌の一種であるアミコラトプシス-メディテ ラーネィ HT— 6を用いてポリブチレンサクシネ一卜系樹脂を分解する方法が記 載されている。 特許文献 2には、リパーゼ及びクチナーゼ等の酵素を用いる生分解性ポリマ 一の酵素分解方法が記載されている。
これらの方法ではバイオサーファクタン卜を反応系に共存されることについては 何等開示されていない。又、プラスチック分解成分以外の有用物質を製造する ことについても何等教示されていない。 特許文献 1 : 特開平 9一 2527 1号公報
特許文献 2 : 特表 2001—5 1 2504号公報 現状の生分解性プラスチック分解技術は土壌中での微生物によるプラスチ ックの水と二酸化炭素への単純な分解を前提としておリ、有用付加価値物 質への転換を前提にはしていない。この状況は国内外を問わず同じである。 現在の生分解性プラスチックは従来の石油化学系プラスチックに比較してコ スト高（3〜 5倍）であり（「' 01生分解性ポリマーの現状と新展開 J株式会社ダ ィャリサ—チマ—テック 株式会社中央リサーチセンター版 51 3-521頁）、コ ストダウンあるいは何らかのコスト回収技術が求められている 更に、生分解性プラスチックの土壌埋め立てによる分解は、もっぱら地表近 く（深さ 30 ~ 50cm程度）のみで行なわれているが、元来土壌中の菌密度は 少な 深い部分に至ってはさらに菌密度が低下することから、自然界におけ る土壌中での分解速度は遅い。したがって、生分解性プラスチックの需要が 予測通りに拡大した場合、大量に廃棄されるプラスチック負荷を土壌中での 分解で賄いきるのは不可能である。さらに、国土の狭い日本においては広大 な埋め立て分解地の確保が困難であり、廃棄量の多い都市近郊では特に問 題となる。現在は包装材'農業資材 'コンポスト対応包材が先行しているが、 今後、自動車内装部品、コンピュータ'家電包材など大量消費財への生分 解性プラスチックの利用が進展した場合、生分解性プラスチックの高密度処 理施設が必要となる。生分解性ポリマー使用に関する問題点としても各種ァ ンゲート結果によれば、 コスト高と同時に大量処理施設のインフラ整備が指 摘されている（「' 01生分解性ポリマーの現状と新展開」株式会社ダイヤリサ一 チマ一テック， 株式会社中央リサーチセンター版 51 3-521頁）。 これらの課題に対して、本発明者らは銳意研究した結果、全く新しいコンセ ブトとして、バイオサーファクタントのような界面活性物質とプラスチック分解酵 素を生産する微生物あるいは界面活性物質及び 又はプラスチック分解酵 素そのものを活用することで、高密度のプラスチックの大規模分解を効率的 に進行させることに加えて、酵素タンパク質や抗生物質などの有用物質生産 性の高い微生物（糸状菌ゃ放線菌）を用いることによって、有用物質の生産 も同時に行うことができる新規な方法を発明するにいたった。 発明の開示 本発明は、プラスチック結合性タンパク質等のバイオサーファクタントがプラス チックの疎水表面に吸着し、それによつて、プラスチック分解酵素と共同してブラ スチックの分解を有効に促進することできる、という新たな知見に基づくものであ る。 即ち、本発明は第一の態様として、プラスチック結合性タンパク質等のバイオ サーファクタントの存在下でプラスチックを分解する方法、特に、プラスチック分 解酵素を用いてプラスチックを分解する方法に係る。 本発明は、第二の態様として、プラスチックに微生物を接触させ、微生物の作 用によりプラスチックを分解し、更に、分解されたプラスチックの成分を微生物に より有用物質に転換することから成る、プラスチックから有用物質を製造する方 法に係る。 この方法は、プラスチック廃材を微生物の発酵基質として分解しつつ、付加価 値の高い有用物質（酵素'医薬品'化成品など）の生産に転換する新たな分解 -物質生産が可能な循環再生システムとして有用である。 ここで、有用物質の種類に特に制限はなく、当業者に公知の任意の物質を包 含するが、例えば、有用物質の生合成系に関与する酵素等のタンパク質、一 次代謝産物（有機酸等）、二次代謝産物（抗生物質及び化成品前駆体等）、 及びバイオサーファクタント等を挙げることが出来る。特に、有用物質が菌体外 に分泌される物質である場合には、製造した後の精製等の操作が容易となり、 効率及び経済性の点で有利である。又、プラスチックが分解されたときに得られ るモノマー及びオリゴマーもプラスチック再生のための原料として有用であるの で、有用物質に含めることが出来る。 プラスチックを分解する微生物と、分解されたプラスチックの成分を有用物質 に転換する微生物とは、同一であってもよいし、夫々別の種類の微生物でも良 い。 分解されたプラスチックの成分を有用物質に転換する為に使用する微生物と しては、例えば、紫外線照射、 N—メチルー N '—ニトロ一 N—二トロソグァニジ ン（NTG)等の薬剤による突然変異処理で得ることが出来、有用物質を高発現 する変異株を挙げることが出来る。更に、以下に記載するような、有用物質の 生合成系に関与する酵素等の各種の有用物質をコードする遺伝子によって組 換えられ、該酵素を高発現する形質転換菌を使用することが好ましい。 更に本発明は、第三の態様として、バイオサーファクタント及び Z又はプラスチ ック分解酵素の共存下で、プラスチックに微生物を接触させ、微生物の作用に よりプラスチックを分解することから成る、プラスチックを分解する方法に係る。 以上の本発明の各態様で使用する微生物は、プラスチックを分解する能力、 又は、分解されたプラスチックを転換して有用物質を産生する能力を有するも のである限り、特に制限はないが、微生物の代表例として、糸状性細菌及び真 核糸状真菌を挙げることが出来る。 糸状性細菌の例としてはストレブトマイセス属等の放線菌がある。更に、ストレ プトマイセス属のストレブ卜マイセス 'グリゼウスまたはストレブ卜マイセス'セリカラ 一を挙げることが出来る。 一方、真核糸状真菌としては、ァスペルギルス (Aspergillus)属、ぺニシリウム (Peni cilh um)属、卜リコデルマ （Trichoderma)属、リゾブス（Rh izopus) j禹、ムコ一 レ （Mucor) 属、フミコーラ (Humicola) 属、マグナホ Ίレサ （Magnaporthe)属、メ タリチウム （Metarhizium)属、ノイロスポラ（Neurospora)属、モナスカス（
Monascus)属、アクレモニゥ厶 (Acremonium J禹及ひフザリウム (Fusarium) J を挙げることが出来る。ァスペルギルス (Aspergill us)属には、ァスペルギルス 'ォ リゼ (Aspergillus oryzae)、ァスぺ レキリレス-ソ一ャ (Aspergillus sojae) 、及び ァスペルギルス.二ドランス (Aspergillus nidulans)等が包含される。 この中で、ァスペルギルス 'ォリゼ RIB40株（FERM P— 1 8273 )は、独立 行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東 1丁 目 1番地 1 )に平成 1 3年 3月 28日付けで寄託されている。 更に、 Aspergi lus oryzae pN - cha株 ( クチナーゼ、ハイドロホ一ビン、アミラー ゼ三重高発現株）は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブ ダペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セ ンタ一（茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 )に 2003年（平成 1 5年） 9月 1 1日付 けで国際寄託され、受託番号： FERM B P— 08486を付されている。 更に、上記の糸状性細菌及び真核糸状真菌等から当業者に公知の遺伝子 工学的手法によって得られる各種形質転換菌も本発明で有利に使用すること が出来る。 即ち、本発明のハイド口ホービン等のプラスチック結合性タンパク質若しくはバ ィォサ一ファクタントをコードする遺伝子を含む D NA、クチナーゼ等のプラスチッ ク分解酵素をコードする遺伝子を含む D NA、及び、有用物質（例えば、有用物 質の生合成や、高分子物質の低分子化、各種転位反応により有用物質を生 成するような酵素である水酸化酵素や酸化酵素、ポリケタイド合成酵素、チトク 口一ムォキシダ一ゼ、エステラーゼ， フエノールォキシダーゼ， 0? -アミラーゼ， セ ルラーゼ， リパーゼ， 及びプロテアーゼ）をコードする遺伝子を含む D NAから選 択される少なくとも一つ以上の D NAによって組換えられた形質転換菌を挙げる ことが出来る。これらの形質転換菌は、該界面活性物質を高発現し、プラスチ ック分解酵素を高発現し、又は有用物質の生合成に関与する酵素を高発現す ることが可能である。 従って、本発明は、第四の態様としてこのような各種形質転換菌にも係るもの である。 このような形質転換菌を作成する元となる微生物の例として、上記の微生物 以外に、ァスペルギルス属であるァスペルギルス'二ガー Aspergillus nigei 、 ァスペルギルス 'ァヮモリ ^Aspergillus awamort) 、ァスペルギルス'カヮチ Aspergillus kawachi!)^ァスへレ十ゾレス-フミ力タス ^Aspergillus fumigatus)、ァ スペルギルス 'フラバス Aspergillus ai^s)、ァスペルギルス'パラシティクス Aspergillus parasiticus、マ入へ） = · ス- ミっス {Aspergillus nom/usj 、 / スペルギルス'タマリ（4s/oe/¾7'〃"s iamar/)及びァスペルギルス 'レペンス（
A spergillus rep ens)等を挙げることが出来る。 更に、第五の態様として、本発明は、上記の方法等に使用することが出来る 、新規なプラスチック結合性タンパク質及びプラスチック分解酵素、並びに、これ らをコードする遺伝子に係る。それらは、特に、ァスペルギルス'オリゼ由来のも のである。 図面の簡単な説明 図 1は、 A orj/zae 等のァスペルギルス属糸状菌が PBS転換能力を持つこと を確認した写真である。
図 2は、 A が P LA転換能力を持つことを確認した写真である。
図 3は、 D NAマイクロアレイ解析用の培地の組み合わせを示す。
図 4は、 PB S存在時に特異的に発現する遺伝子群を模式的に示す。
図 5は、 Su3PP5 、 Su3PE5、 Su3Bu5の DNAマイクロアレイの結果を視覚的に 解析した結果であり、各数字は、遺伝子発現を（Cy5 Cy3 )の比で表わしてい る。
図 6は、ハイド口ホービンの完全長を含む JZ3981の塩基配列を示す。 図 7は、麹菌用ハイド口ホービン高発現プラスミドの構築を示す模式図である 図 8は 、イド口ホービン高発現麹菌が高度に ハイド口ホービンを培養上清 に分泌していることを示すゲル電気泳動（S DS— PAGE)の写真である。
図 9は、 PBS 分解酵素であるクチナーゼ遺伝子が染色体 DNA 中に挿入さ れたァスペルギルス 'ォリゼ形質転換株の培養上清中にのみ PBS 分解酵素精 製標品と同じ位置にタンパク質が発現していることを示すゲル電気泳動（S DS 一 PAGE)の写真（左）、及び該形質転換株による PB Sの分解を示す写真（右） である。
図 1 0は、 glaA 1 42 promoter を目的遺伝子の上流に融合した
pPTR-gla-hyp の作製を示す。
図 1 1は、クチナーゼ- ハイド口ホービン共高発現株が取得されたことを示す、 SDS-PAGE の写真である。
図 1 2は、ハイド口ホービン高発現用プラスミド pPTR- eno- hyp の作製を示す 図 1 3は、麹菌ひアミラーゼ高発現用プラスミド pNG - amyの作製を示す。
図 1 4は、クチナーゼ- ハイド口ホービン - 0?アミラーゼ三重共高発現株がハイ ドロホービンを高発現することを示す、 SDS- PAGE の写真である。
図 1 5は、 glaA 1 42 promoter を hyp B遺伝子の上流に融合させた
pNG-gla-hyp Bの作製を示す。
図 1 6は、 glaA 1 42 promoter を hydrophobin- 31 5遺伝子の上流に融合させた pNG-gla-hydrophobi n-31 5 の作製を示す。
図 1 7は、糸状菌由来ハイド口ホービン及びその類似体の系統樹を示す。 図 1 8は、各種生分解性プラスチックへのハイド口ホービンの吸着の様子を示 す。
図 1 9は、糸状菌由来タンパク質分解酵素及びその類似体の系統樹を示す。 図 20は、 PB S分解培養上清中のォクチルセルロファインカラムの溶出画分 中のタンパク質濃度を示すグラフ、及び各画分中に含まれるタンパク質の存在 を示す SDS- PAGE の写真である。
図 21は、 PBS結合タンパク質高発現系の構築を示す。
図 22は、ァスペルギルス 'ォリゼ形質転換株の培養上清中にのみ目的タンパ ク質の位置（約 14 kDa)にバンドが観察されたことを示す SDS- PAGE の写真で める o
図 23は、疎水表面上での約 14 kDaタンパク質及びハイド口ホービン高発現株 の生育が野性株のものを上回ることを示す写真である。
図 24は、インビ卜口での PbpAの PBSへの吸着を示す SDS- PAGE の写真で o5る。
図 25は、 PbpA及び PbpB相同配列の系統樹を示す。
図 26は、白金線 PBS被覆物のクチナーゼによる分解を示す写真である。 図 27は、 RolAによる PBSフィルムのクチナーゼ分解の促進を示す写真である 図 28は、 in vitroでの RolAのクチナーゼによる PBS乳化液分解促進効果を示 す。
図 29は、 PbpAを PBSに吸着させた際の分解促進の様子を示す。
図 30は、 PB Sフィルムのクチナ一ゼ分解に対するハイド口ホービン及び人工 界面活性剤との比較を示す。 発明を実施するための最良の形態 本発明の第一の態様において使用するバイオサ一ファクタン卜は、一般的に 、生物が生産する界面活性剤であり、特に、微生物が菌体外に生産する界面 活性剤であり、蘭体プラスチック吸着因子の一種である。 バイオサ一ファクタントとしては、プラスチック結合性タンパク質以外に、当業 者に公知の任意の物質、例えば、リン脂質や親水性の糖と疎水性の脂肪酸が 結合しているグリコリピド等がある。例えば、マンノシルエリスリ卜一ルリピッド及 びラムノリピッド等の糖脂質エステル、環状リポペプチド、環状ポリペプチド、並 びに、サーファクチン等の両親媒性タンパク質等を挙げることが出来る。 プラスチック結合性タンパク質は、以下の実施例で具体的に示されるような ハイド口ホービン及びそのホモログ類、並びにその他のプラスチック結合性タン パク質を挙げることが出来る。その取得源に特に制約はないが、上記の各種の 糸状性細菌及び真核糸状真菌由来のもの、特に、以下の実施例に具体的に 記載したような、ァスペルギルス'オリゼ等のァスペルギルス属カビに代表される 糸状性細菌などの各種微生物由来のものを使用することが出来る。
一方、本発明方法で使用するプラスチック分解酵素も当業者に公知の任意 のものを使用することが出来る。例えば、エステラーゼ、プロテア一ゼ、ぺプチダ —ゼ、リパーゼ、クチナーゼ、及ぴセリンハイドロラーゼ等から選択される少なくと も一種を使用することが出来る。プラスチック分解酵素も、上記の各種の糸状 性細菌及び真核糸状真菌由来のもの、特に、以下の実施例に具体的に記載 したような、例えば、ァスペルギルス 'ォリゼ等のァスペルギルス属カビに代表さ れる糸状性細菌などの各種微生物由来のものを使用することが出来る。 従って、例えば、プラスチック結合性タンパク質としてァスペルギルス'オリゼ由 来のハイド口ホービン、プラスチック分解酵素としてァスペルギルス 'ォリゼ由来 のクチナーゼを使用することが出来る。 本発明方法で分解の対象となるプラスチックに、特に制限はない。その代表 例として、「生分解性プラスチック」として知られているものを挙げることが出来る
生分解性プラスチックとは、「使用状態ではその使用目的において必要とされ る充分な機能を保ち、廃棄されたときには土中又は水中の微生物の働きによつ て、より単純な分子レベルにまで分解されるプラスチック」ともいうべき物質であ る。分解の程度に基づいて、「完全分解型生分解性プラスチック」と「部分分解 (崩壊）型生分解性プラスチック」とに分けられ、更に、材料及び製造方法から 【ま、「微生物生産系」、「天然高分子系 J及び「化学合成系」に大きく分けること が出来る。本発明方法では、これらのいずれの種類の生分解性プラスチックも 使用することが出来る。 従って、本発明方法において用いられるプラスチックの具体例は、例えば、ポ リエステル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニール、ナイロン、ポリスチ レン、デンプン、及びそれらの混合物から成る群から選択される。更に、ポリエス テルとしては、ポリブチレンサクシネート（PBS)、ポリブブチルサクシネー卜'アジ ペート（PB SA)、ポリ乳酸（P LA)、脂肪族ポリエステル、ポリ力プロラクトンそれ らの混合物から成る群から選択される。 更に、本発明の全ての方法において、分解の対象となるプラスチックは、所謂 「複合材料 Jの一構成要素として含まれているものでもよい。ここで、「複合材料 Jとは一般的に 2種類以上の異なる物質から構成されている材料であり、例え ば、プラスチックと各種金属及びその他の無機物質から構成されているものが ある。このような複合材料は各種産業素材として多方面で各種の目的に利用 されている。 従って、本発明により、プラスチックを含む複合材料から、プラスチック部分を 選択的に分解して、プラスチックをモノマー又はオリゴマーとして回収し、一方で 、プラスチックを実質的に含まない金属等のその他の部分を回収することが出 来る。 本発明方法において、プラスチックの分解反応は、 目的'規模などに応じて、 当業者に公知の任意の反応系（例えば、水溶系及び固相系）及び反応条件を 適宜選択して実施することが出来る。例えば、プラスチック乳化液を含む液体 培養系及びプラスチック固型ペレット又はプラスチック粉体等を使用する固体培 養系等の当業者に公知の任意の培養系において行うことが出来る。 従って、分解の対象となるプラスチックは、乳化液状及び固型ペレット等の、 夫々の培養系に応じた任意の形態をとることが出来る。 本発明の第一の態様において、バイオサ一ファクタン卜の存在下でプラスチッ クを分解させるためには、バイオサーファクタントを反応系に添加する必要があ るが、その添加量、時期、手段及び方法等は当業者が適宜選択することが出 来る。 本発明の効果を得るには、まず、ハ'ィォサ一ファクタントがプラスチックに効果 的に吸着するように両者間の疎水的相互作用が強まるような条件下で処理す ることが好ましい。 その為に、本発明方法の好適例としては、低水分活性状態でバイオサーファ クタン卜をプラスチックと混合するステップ、高水分活性状態でプラスチック分解 酵素によりプラスチックを分解するステップからなる。 ここで、「水分活性」は当業者に公知の因子であり、「溶質の溶けた水溶液と 純粋の蒸気圧との比を水分活性」と定義するものである（John A. Troller &丄 H. B. Christian著， Water Activity and Food ' Academi c Press, Incj。本発 明において、「低水分活性状態 Jとは、バイオサーファクタントがプラスチックの疎 水表面に有効に吸着できるような条件を意味し、具体的には、例えば、水分活 性が 0.97以下、 好ましくは 0.95以下、さらに好ましくは、 0.9以下であるような状 態をいう。又、「高水分活性状態」とは、このような低水分活性状態ではない状 態を意味する。この時の溶質としては、例えば、塩類、糖類、アルコール類など が挙げられる。 従って、一具体例として、低水分活性状態でフィルム状又はペレット状のブラ スチックとバイオサ一ファクタン卜を混合して、該プラスチックに有効量のバイオサ 一ファクタント吸着させ、その後、水分活性を高めてプラスチック分解酵素により 該フィルムの分解を促進させることが可能である。 或いは、バイオサ一ファクタン卜がプラスチックの間の疎水的相互作用が強ま るような別の好適例としては、高塩濃度状態でバイオサーファクタントをプラスチ ックと混合するステップ、低塩濃度状態でプラスチック分解酵素によりプラスチッ クを分解するステップからなる。ここで、「高塩濃度状態」とはバイオサーファクタ ン卜がプラスチックの疎水表面に有効に吸着できるような条件を意味し、具体的 には、例えば、塩として NaGIを用いた場合、濃度が 4%以上、好ましくは 8 %以 上、さらに好ましくは 1 4%以上であるような状態をいう。又、「低塩濃度状態」と は、このような高塩濃度状態ではない状態を意味する。しかしながら必ずしも低 溶質濃度状態でプラスチック分解酵素を作用させる必要はなく、高溶質濃度状 態で、サーファクタントを結合させ、その状態でプラスチック分解酵素を作用させ ることもできる。 - 又、本発明方法の反応温度としては、例えば、 0~ 1 00°C、好まし ま、 0〜8 0°C、より好ましくは、 1 5〜80°Cである。 更に、プラスチックの分解により発生するモノマー及びオリゴマーなどの酸性物 質の影響で反応溶液が酸性化し、その結果、反応系の pH値がプラスチック分 解酵素の至適 pH範囲から外れることがあるので、それを防ぐために、分解反応 を高緩衝能を有する緩衝液中で実施したり、又は、分解反応中に、外部から塩 基性物質を加えるなどして適宜反応系を中和し、適当な中性状態、例えば、 D H4〜1 1、好ましくは pH6〜1 0、より好ましくは pH7〜9に維持すること力《§子ま しい。 更に、バイオサ一ファクタント及びプラスチック分解酵素は、夫々、タンパク質 製剤として使用することも出来るし、このようなタンパク質製剤を用いずに、ブラ スチックにァスペルギルス 'ォリゼ又はァスペルギルス'ソーャを接触させ、ァス ペルギルス.ォリゼ又はァスペルギルス■ソーャがその場で産生するバイオサー ファクタント及びプラスチック分解酵素の作用によりプラスチックを分解すること も可能である。
本発明の第二〜第四の各態様において、バイオサーファクタン卜及びノ又は プラスチック分解酵素を培養系に共存させることにより、プラスチックの分解を 促進することが出来る。これらの物質は微生物自体により産生されたものでも 良いし、それらに加えて、更に培養系の外部より添加することが可能である。添 加の量及び割合'添加の時期等の諸条件は当業者が適宜選択することが出 来る。これらの物質は必ずしも同時に添加する必要はなく、方法の各段階で逐 次的に添加することも可能である。 界面活性物質若しくはバイオサーファクタン卜を反応系叉は培養系に共存さ せることにより、微生物のプラスチックへの接触を増強することが出来、プラスチ ックの分解効率を促進させることが出来る。 培養系に共存させることができるバイオサーファクタン卜及びノ又はプラスチック 分解酵素は、既に本発明の第一の態様において記載したものである。 既に記載したように、本発明方法においては、バイオサーファクタン卜、プラス チック分解酵素、及び Ζ又は有用物質を高発現する形質転換菌を使用するこ 03 011861
15 とによって、プラスチックを分解し、分解されたプラスチックを有用物質に転換す ることをより促進することが可能となる。 本発明方法においては、上記各物質をコードする遺伝子を夫々別の微生物 に導入して、こうして得られた複数種類の形質転換菌を用いて反応させること ができる。即ち、バイオサーファクタントをコードする遺伝子によって組換えられた 形質転換菌、プラスチック分解酵素をコードする遺伝子によって組換えられ形 質転換菌、及び、有用物質遺伝子によって組換えられ形質転換菌のうちの任 意の組み合わせからなる複数の形質転換菌を使用することによって本発明の 各方法を実施することができる。 尚、本発明の形質転換菌において導入される、バイオサ一ファクタント、プラス チック分解酵素、又は有用物質をコードする遺伝子は一種類とは限らず、夫々 、複数種類のバイオサーファクタン卜の遺伝子、複数種類のプラスチック分解酵 素の遺伝子、又は複数種類の有用物質の遺伝子で組換えることも可能である
或いは、実施例に記載されているように、同一の微生物をバイオサ一ファクタ ン卜、プラスチック分解酵素をコードする双方の遺伝子によって組換えられた、こ の両物質が同時に高発現される共高発現菌である形質転換菌を使用すること が出来る。その結果、プラスチック分解酵素を生産する微生物菌体がプラスチ ック表面により強く吸着して、プラスチック分解酵素を生産することからプラスチ ック分解が促進される。 こうして得られたプラスチックを分解する能力のある形質転換菌と有用物質生 産用の微生物の 2種類の微生物を共存させて培養することによって有用物質 の製造を行なうことも可能である。 更に、実施例に記載されているように、同一の微生物をバイオサーファクタント 、プラスチック分解酵素、及び有用物質の夫々をコードする遺伝子によって組換 えられた、これらの物質が同時に高発現される三重共高発現菌である形質転 換菌を使用することが出来る。 例えば、上記の共高発現菌を元の菌株として使用して、既に記載したように、 有用物質を高発現する変異株、又は、有用物質をコードする遺伝子によって組 換えられこれらの物質を高発現する形質転換菌を作成することによって、プラス チック分解能を高めた微生物に有用酵素の遺伝子を導入して高発現させるこ とが可能となり、こうして得られる一種類の三重共高発現菌である形質転換菌 を使用することによって、プラスチックを分解すると同時に有用物質の生産を効 率よく行なわせることができる。 本発明において、複数種類の微生物を使用する場合には、これら複数種類 の微生物を同時に培養する共培養系で実施したり、又は、本発明方法が夫々 分解反応及び転換反応を担う複数の連続的な培養段階から構成されており、 その各段階において、夫々前の段階で得られた培養液に更に異なる微生物を 逐次的に作用させて処理することも可能である。 又、以上のような各種形質転換菌を使用した場合でも、更に、界面活性物質 若しくはバイオサーファクタント及び/又はプラスチック分解酵素を、例えば外部 より添加することによって反応系に共存させ、プラスチックの分解及び転換を更 に効率化することも可能である。 界面活性物質としては、当業者に公知の任意の物質を使用することが出来 る。しかしながら、生物、特に、微生物が細胞表面又は菌体外に生産する生物 系界面活性物質であるバイオサーファクタン卜が環境面等の点で好ましい。 T/JP2003/011861
17 本発明の微生物を利用してプラスチックを分解する方法、及び、プラスチック 力、ら有用物質を製造する方法において、分解反応及び転換反応は、プラスチッ ク乳化液を含む液体培養系及びプラスチック固型ペレツ卜又はプラスチック粉体 等を使用する固体培養系等の当業者に公知の任意の培養系において行うこと が出来る。 従って、分解の対象となるプラスチックは、固型ペレット状及び乳化液等の、 夫々の培養系に応じた任意の形態をとることが出来る。培養液及び培地等の 組成、並びに、温度、 pH等の各種培養温度条件は、プラスチック及び使用する 微生物の種類等に応じて当業者が適宜選択することが出来る。 ただし、既に記載したように、バイオサーファクタントとプラスチック分解酵素と が共同して有効に作用してプラスチックを分解させるためには、まず、バイオサ 一ファクタン卜がプラスチックに効果的に吸着するように両者間の疎水的相互作 用が強まるような条件下で処理することが好ましい。 従って、例えば、プラスチックに緩衝液等を添加して適当な低水分活性状態 とした後、本発明の形質転換菌のような微生物の菌体（細胞、胞子、菌糸など )を接種して恒温恒湿器内で培養して麹を作成し、それによつて、微生物が産 生するバイオサーファクタン卜がプラスチックに作用した後、適当な緩衝液を加え て高水分活性状態にし、プラスチック分解酵素によりプラスチックを分解する方 法が考えられる。この際に、外部からの界面活性剤又はバイオサーファクタント の添加は低水分活性状態で行ない、一方、プラスチック分解酵素の添加は高 水分活性状態で行なうことが好ましい。 尚、既に記載したように、分解する際には、プラスチックの分解により発生す るモノマ一及びオリゴマーなどの酸性物質の影響を防ぐために、高緩衝能を有 する緩衝液を使用したり、又は、分解反応中に、外部から塩基性物質を加える などして適宜反応系を中和し、中性状態に維持することが好ましい。
本発明で使用するァスペルギルス 'ォリゼ由来のハイド口ホービン及びハイド ロホ一ビンホモログ遺伝子の具体例として、以下の（a)又は（b)ポリペプチドをコ ードする塩基配列を含む DNA:
(a)配列番号：1、2又は 3で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一で あるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（b) (a)で示されるアミノ酸配列において 、一部のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなりハイドロホ 一ビンと実質的に同等の機能を有するポリペプチド、を挙げることが出来る。 別の具体例として、以下の（a)又は（b)の DNA:
(a)配列番号： 1、 2又は 3でで示される塩基配列又はその部分配列を含む DNA、 （b) (a)の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAと ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、（a)の DNAと実質的に同等の機 能を有する DNA、を挙げることが出来る。 本発明で使用するァスペルギルス 'ォリゼ由来のプラスチック分解酵素遺伝 子の具体例として、以下の（a)又は（b)ポリペプチドをコードする塩基配列を含 む DNA:
(a)配列番号：4又は 5で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一である アミノ酸配列からなるポリペプチド、 (b) (a)で示されるアミノ酸配列において、一 部のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなりプラスチック分 解酵素と実質的に同等の機能を有するポリペプチド、を挙げることが出来る。 別の具体例として、以下の（a)又は（b)の DNA:
(a)配列番号：4又は 5で示される塩基配列又はその部分配列を含む DNA
、 (b) (a)の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリ ンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、（a)の DNAと実質的に同等の機能を有 する DNA、を挙げることが出来る。 本発明で使用するァスペルギルス 'ォリゼ由来のプラスチック結合性タンパク 質遺伝子の具体例として、以下の（a)又は（b)ポリペプチドをコードする塩基配 列を含む DNA:
(a)配列番号：6又は 7で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一である アミノ酸配列からなるポリペプチド、 (b) (a)で示されるアミノ酸配列において、一 部のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなりプラスチック結 合性タンパク質と実質的に同等の機能を有するポリペプチド、を挙げることが出 来る。
別の具体例として、以下の（a)又は（b)の DNA:
(a)配列番号： 6又は 7で示される塩基配列又はその部分配列を含む DNA 、 （b)(a)の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズし、（a)の DNAと実質的に同等の機能を有 する DNA、を挙げることが出来る。 ここで、ポリペプチドの「機能」とは、それが細胞（菌体）の内部及び 又は外 部において示す生物学的機能又は活性を意味する。更に、「実質的に同等」と は、それらの示す機能（活性）が程度の差はあるものの細胞（菌体）の内部及び 又は外部における機能として同等であると見做し得るものであることを示す。 本発明 DNAは当業者に公知の方法で調製することが出来る。例えば、寄託 されている菌株から実施例で記載した方法によって容易にクローニングすること が出来る。或は、本明細書に記載された本発明 DNAの塩基配列又はアミノ酸 産配列の情報に基づき、当業者に周知の化学合成、又は、本発明のプライマ 一を使用した PCRにより増幅して調製することも出来る。 本明細書において、 Γストリンジェン卜な条件下」とは、各塩基配列間の相同性 の程度が、例えば、全体の平均で約 80%以上、好ましくは約90%以上、より 好ましくは約 95 %以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、 特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば 、温度 60°C〜68 °Cにおいて、ナトリウム濃度 1 50〜900mM、好ましくは 600〜 900mM、 pH 6〜8であるような条件を挙げることが出来る。 ハイブリダィゼーシヨンは、例えば、カレン卜'プロトコールズ 'イン'モレキュラー -ノヽィォロン一 ( Current protocols i n molecular biology ^ edited by Frederick M. Ausubel et al.， 1 987 ) )に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそ れに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用す る場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 本発明における特定のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、該 アミノ酸配列と全アミノ酸配列に亘つてアラインメントして比較した場合に、全体 の平均で 80%以上、好ましくは 90 <½以上、特に好ましくは 99 %以上のアミノ酸 が同一であるようなアミノ酸配列を意味する。従って、或るアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチドは、該アミノ酸配列から成るポリ ペプチドと実質的に同等の機能を有するものと考えられる。 又、本発明ポリペプチドにおける特定のアミノ酸配列において一部のアミノ酸 が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列とは、該アミノ酸配列から成るポリべ プチドと実質的に同等の機能を有する限りにおいて、好ましくは、 "!〜 20個程度 、より好ましくは 1 ~ 1 0個程度、さらに好ましくは数個のアミノ酸が欠失、置換又 は付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列から成るも のと意味する。又、ポリペプチドの「機能」とは、それが細胞（菌体）の内部及び 又は外部において示す生物学的機能又は活性を意味する。 上記の特定のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリぺプ チド、又はその一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列から成る ポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、ブラ イマ一伸長法、及び PCR法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、 容易に作成することが可能である。 尚、その際に、実質的に同等の機能を有するためには、当該ポリペプチドを構 成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性-非極性アミノ酸、疎水性'親水性アミ ノ酸、陽性-陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が可能性とし て考えられる。又、実質的に同等の機能の維持のためには、本発明の各ポリべ プチドに含まれる機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。 本発明の各方法で有利に使用することができる微生物の好適例として既に 記載した各種形質転換菌は、当該技術分野における周知の様々な技術及び 手段を用いて、夫々の DNA又は遺伝子を含む組換えベクターを作成し、該組 換えベクターで上記の糸状性細菌、真核糸状真菌、及びそれらの変異株等の 宿主を、例えば、プロトプラスト一 PEG法、エレクト口ポレーシヨン法、 Ti一プラス ミド法、及びパーティクルガン等のような当業者に公知の組換え法によって得る ことが出来る。 既に記載したように、これら形質転換菌においては各物質の生産誘導の抑制 が解除されていることが望ましい。その為には、例えば、これらの物質をコードす る遺伝子を構成的発現プロモーター又は各種の誘導型発現プロ一ター等の制 御下で発現させることができる。その結果、これら物質を高発現され、細胞表面 又は菌体外に多量に生産されプラスチック分解が促進され、更に、有用物質の 生産が促進される。 これらの各種プロモーターは当業者に公知である。例えば、ァスペルギルス- ォリゼ用の構成的発現プロモーターとしては、 enoA プロモータ一、 pgkAプロモ 一ター、及び teflプロモーター等を挙げることが出来る。又、ァスペルギルス'ォ リゼ用の誘導型発現プロモーターとしては、マルトースを誘導基質とするグルコ アミラーゼプロモーター又は 一アミラーゼプロモーター、及ぴキシロースを誘導 基質とするキシラナーゼプロモーター等を挙げることが出来る。 実施例 以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに 限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、上記の Current protocols in molecular biology (. edited by Frederick M. Ausubel et al.， 1 987)に記載されている方法に従った。 実施例 1
( 1 )菌体プラスチック吸着因子 - ハイド口ホービン遺伝子の取得
( 1—1 ) A o/rzae による生分解性プラスチック転換確認
[材料]
①試薬
特にことわりの無い限り、ナカライ亍スク（株）の特級試薬を用いた。生分解性 プラスチックとしてポリブチレンサクシネ一卜 (PBS)を選択し、 PB Sェマルジヨンは 昭和高分子（株）製のビオノ一レエマルジヨン OLX- 07527 を用いた。試薬の調 製はミリ Q水を用いた。
②菌体
Aspergillus oryzae RIB40 を用しゝた。
③培地
以下の表 1に示した。 [表 1 ]
10 X stock solution ( H 6.5 ) ( /litter ) PBS emulsion minimal medium (l/Utter) upper medium
NaNひ 60 g
10 X stock solution 100ml
KC1 5.2 g
1000 X trace elements 1 ml H2P04 15.2 g solution
PBS emulsion liquid 10ml adjust to pH 6.5 with 10 N KOH lM MgS04 2ml agarose 5 &
1000 X trace elements solution ( /litter ) lower medium (1 /litter)
10 X stock solution 100ml
FeS04 - 7H20 1.0 g
1000 X trace elements linl
Zn · 7H，0 8.8 g solution
lM MgS04 2nil
Cu · 5H20 0.4 g
agarose 15g
Mn■ 4Hつ O 0.15 g
Na2B4O? " 10H2O 0.1 g
pour the medium on the lower medium
(NH4)6Mo7024 · 7H2〇 0.05 g
[方法]
炭素源を PBS に限定した最少寒天培地 （PBS emulsion minimal medi um)に 各種のァスペルギルス属糸状菌（ん oryzae, A. sojae, A. kawachii,
A.awamori, A. niger, A. の胞子懸濁液を スポットし 37°Cで 7日間培 養した。同様に PB Sを唯一の炭素源とした最少液体培地 5mlにん ^yzae胞子 懸濁液を終濃度 0.5 X 1 05個/ mlとなるよう植菌し、 30°Cで 5日間振盪培養した。 なお、液体培養は試験管で行なった。 [結果]
固体培養では . oryzae, 及び ん so'aeの場合に、夫々、約 1. 9cm及び約 1 . 5cm幅の halo力 観察された（図 1 (A) )。又、 A nidulansでも haloが 観察さ れた。又、 A oryzaeの液体培養でも PBSの濁度の顕著な低下が観察された (図 1 (B))。これらのことから、ん oryzae 等のァスペルギルス属糸状菌が PBS転換能力を持つことを確認された。 更に、生分解性プラスチックとして PBSの代わりにポリ乳酸（PLA)を使用した 各培養系において、 A oryzae によるプラスチックの分解を確認した。その結果 を図 2に示す。
(1 -2) DNAマイクロアレイを用いた発現遺伝子解析
(1 -2-1 ) 麹菌 Total RNA の調製
[材料]
菌体からの Total RNAの調製には、 Sepaso卜 RNAISuper (ナカライテスク（株) )を用いた。
②培地
培地の組成、 DNAマイクロアレイ解析を行なう上での培養条件とその組み合 わせを表 2及び図 3に示した。
2]
C source Succinate 1.4-butanediol PBS emulsion PBS pellets the quantity of lOg 10ml 4.3ml 100g C sources the volume of cultures 150ml 150ml 450ml 1500ml cultivating times 24 24h 60h 120h [方法]
500 ml 容羽根付き三角フラスコ内の Czapek- Dox 培地 150 ml に 終濃度が 0.5 X 107個/ ml になるよう胞子懸濁液を植菌し、 30°Cで 12時間培養した。菌体 をミラクロス（ CALBIOCHE )で集菌し、滅菌水で洗浄後余分な水分を取リ除い た。この回収した菌を、 PBS固型ペレット， PBSェマルジヨン， コハク酸， 1、4-ブタ ンジオール を各々唯一の炭素源とした最少培地へと移し、 30°Cで振盪培養を 行なった。培養時間は PBS pellets は 120 時間、 PBSェマルジヨンは 70 時間 、 コハク酸は 12 時間、 1、 4 -ブタンジオールは 24 時間とした。培養終了後、 PBS ェマルジヨン， コハク酸， 1、4 -ブタンジオール培地は、ミラクロスを用いて菌 体を回収し、滅菌水で洗浄後余分な水分を取リ除いた。 PBS固型ペレツ卜は、 茶漉しを用いて菌体と PBS固型ペレットを分離した。得られた湿菌体の湿重量 を計測した後、乳鉢中で液体窒素を注ぎながらパウダー状になるまで破砕した 。湿重量の 4倍量の Sepaso卜 RNAISuper を入れた 50 ml容チューブにパウダー 状の菌体を移し、激しく撹拌後室温で 5分間放置した。 Sepasd-RNAISuperの 1/5量のクロ口ホルムを加え、よく撹拌した後、室温で 3分放置した。 10,000 X 、 4°Cで 15分遠心した後、水層を 15 ml容チューブに移し同量の水飽和酸性フエノ ール 'クロ口ホルム（フエノール/クロ口ホルム = 1 / 1)を加え混合後、 12,000 X 、 4°Cで 10分遠心し水層を別の 15 ml容チューブに移した。等量のイソプロパ ノールを加え室温で放置 10分間放置後 12,000 X g、 4°Cで 10分遠心し、上清を 捨て、 10 mlの 70%エタノールでリンスした。風乾後、適量の DEPC(
diethylpirocarbonate)処理水に溶解させた。
(1 -2-2)mRNA の精製
[材料]
mRNAの精製には、 Message Maker(Gibco BRL)を用いた。
[方法]
精製操作は Message Maker 添付マニュアルに従った。以下、 Total RNA量 1 mg を用いた時の手順を示した。 1 mg の total RNAを 15 ml容チューブに 1,8 mlに DEPG処理水を用いてフィル アップ（終濃度 0.55 mg/ml)し、 65°Cで 5分間インキュベート後、氷上にて急冷し た。 5 M NaGI を 200 / 1力□え、よく撹拌後 oligo(dT) Cellulose Suspension を 1 ml添力 Πし、よく混合した後、 37°Cで 10分間インキュベートした。サンプルをシリン ジに入れプランジャーで押し切った後、ディスポのカップに入れた 3 mlの Wash buffer 1 をシリンジで吸った。シリンジ中の液をよく懸濁し、液をプランジャーで 押し切った。同様の操作を 3 mlの Wash buffer 2 で行なった。 次に 65°Cに保温 しておいた DEPG処理水 1 mlをシリンジで吸い上げ、よく懸濁後、 15 mlチューブ に押し出した。再度、 DEPG処理水 1 mlで溶出した後、溶出液を合わせ、 12,000 X 、 4°Cで 3分間遠心し、 oligo(dT) Cellulose Suspensionを取り除いた。この上 清約 2 mlに対し、 5 mg/ml のグリコーゲン溶液を 20 1、 7.5 M 酢酸アンモニゥ ム（pH 5.2)を 200 I加えて混合し、エツペンドルチューブ 5本に分注し、 2倍量の 氷冷エタノールを加え、 -20°Cにて一晩エタノール沈殿を行なった。 12,000 X 、 4 °Cで 30分間遠心した後、上清を捨て 75%エタノールでリンスした、風乾後、適量 の DEPC処理水に溶解させた。
(1 -2-3) mRNAのラベリング
[材料]
精製した mRNAの虽光色素によるラベリングは Gy3—dUTP、 Gy5— dUTP( Amersham Biosciences)を用し ： 0
[方法]
エツペンドルフチューブに、 mRNA 0.5~1.0 i g ランダムプライマ一（9 mer)(2 i g/ i I) 1 し oligo(dT)primer (12-18mer)(0.5 i g/ I) 1〃 I 、 DEPG処理水を加 え 10 lとした。 70°Cで 10分インキュベートした後、室温に 10分放置し、その後氷 上で 5分間以上放置し、 mRNAにプライマーをァニ一リングさせた。次に、この反 応液に 5 X First Strand Bufffer (250 mM Tris-HCI, pH 8.3、 375 mM KCI 、 15 mM MgCI2)4 'し 0.1 M DTT 2j(i|、 50xdNTPs(25 mM dATP,GTP,CTP 、 10 mM TTP)0.4/i U Cy-dye(3 or 5)2〃し Super Script II RT(200 U/jLi l)1.5jUl を加えピペッティングによる撹拌後 42°Cで 1時間インキュベートし逆転写反応さ せた。なお、この操作以降直接光が当たらないように注意して行なった。その後 再び Super Script II RT(200 U/ il)1.5 il を加え撹拌し、 42°C，1時間、 70°C ，10分、 37°C,5分インキュベートした後、 RNase H(10 U/jUl)0.3〃l 力!]え、 37°C ,15分、 70°C，10分インキュベートし未反応 mRNAを分解させた。専用のチューブ に装着した Microcon- 30 のカップに各々の組み合わせ（図 3)で Gy3、 Cy5でラベ ルした溶液を混合し、 300 1の TE を加え、 10,000 室温で 20分間遠心濃縮し た。再度 400 Iの TE を加え 10,000 室温で 20分間遠心濃縮した。次に Human Got1— DNA(1 mg/ml)60〃lと TE 300 l を加え、 10,000 X 室温で 30 分間遠心濃縮した。 Microcon - 30 のカップを取り出し、新しいチューブに逆さに 揷入し、 3,000 X 室温で 3分間遠心してカップ中の溶液を回収した。これを TE で 28 il にフィルアップした後、 yeast tRNA(10 mg/ml)4 / 1、 poly dA(1 mg / ml)16 U 20XSSC 10.2 U 10% SDS 1.8/ 1 を加えた。この混合液 60 jU I を 1分間煮沸し、室温に戻したものを用いてハイブリダィゼーシヨンを行なった。
(1—2— 4)ハイブリダィゼーシヨン、洗浄、検出
[材料]
A. oryzae の 2146個の ESTクローンを搭載した cDNA マイクロアレイ (旭テク ノグラス（株）製）を用いた。ギャップカバーグラス（25 X 50 mm)は MATSUNAM 株）製を用いた。ハイブリダィゼーシヨンカセットは Array IT を用いた。また、スキ ャナー解析は Axon 社製 Gene Pix 4000B microarray scanner にて、画像解 析は Axon 社製 Gene Pix Pro 3.0 software package および Mesia Cybernetics 社製 Array Pro program を用しゝた。
[方法]
スライドグラスの上に遺伝子がスポットされた領域を囲むように、ギャップカバ 一グラスをのせ、端から上記で調製したラベル化溶液 30 I を毛細現象により 11861
28 流し込んだ。スライドグラスをハイブリダィゼーシヨンカセットにセットし乾燥を防ぐ ためにカセット内の窪みに 30 l の精製水とガラス上のカバーグラスと離れた 2 点に 5 l の 3 X SSGを滴下した。ハイブリダィゼーシヨンは 55°C 8時間 ゆるや かに振盪させながら行なった。ハイブリダィゼーシヨン終了後、以下の操作でス ライドグラスの洗浄を行なった。ハイブリダィゼーシヨンカセットを外し、スライドグ ラスを 2 X SSC / 0.1%SDS に浸して液中ですばやく滑り落とした。別に準備し た 2 X SSC / 0.1%SDS 中で 5分間室温にて振盪した。続いて、 40°Cに保温して ある 0.2 X SSG / 0.1%SDS 中で 5分間振盪した後、 0.2 XSSC 中に 3分間放置 した。 300 X g で 1分間遠心し、スライドグラスの水分を除いた後、検出を行なつ た。コントロール（コハク酸）の発現量がサンプル（PBS 固型ペレツ卜， PBS エマ ルジョン， 1、 4-ブタンジオール）のそれよりも多い場合、 DNAチップのスポットは緑 色に発色する。発現量が同程度の場合は黄色に発色し、サンプルの発現量が コントロールより上回る場合は、赤色に発色する。よって、 PBS存在時に特異的 に発現している遺伝子は Su3PP5 と Su3PE5 で赤色に発色し、 Su3Bu5 では発 色がないものである（図 4)。よって、 Su3PP5 と Su3PE5 で赤色に発色している 遺伝子群から、 Su3Bu5で赤色に発色している遺伝子群を差し引き、 PBS存在 時に特異的に発現している遺伝子を検索した。なお、 Su3PP5 、 Su3PE5、 SU3Bu5全てに共通して発現するヒストンをコードする遺伝子を黄色、つまり、シ グナル強度（Gy5 / Gy3)約 1に設定した。
[結果]
Su3PP5 、 Su3PE5、 Su3Bu5の DNAマイクロアレイの結果を視覚的に解析する と、 JZ3981力 、 Su3PP5 と Su3PE5でのみ赤色に発色してし、た（図 5 )。尚、スホ。 ッ卜の下に示された各数字は、遺伝子発現を（Cy5ZCy3)の比で表わしている 。ヒストンはコントロールである。このことから、 JZ3981が PBS分解に関わる遺伝 子であることが示された。次にこのクローンについて、 Aspergillus oryzae ESTデ ータベース（www.aist.go.jp/ffdb/index.html)に対する BLASTネットヮ一クサ一 ビスを用いて、相同性の高いクローン情報を得た。 (1一 2— 5) ESTデータベースを用いた JZ3981の探索
[結果]
A. oryzae ESTデータベースに対して BLASTネットワークサービスを用いて、相 同性の高いクローン情報を検索した。 JZ3981 \tEmericella nidulansの RODLET PROTEIN PRECURSOR \:Ae - 5，、 AspergWus fumigatus の
HYDROPHOBIN PRECURSOR に 9e— 57 の相同性を示した。さらに、 hydrophobin (ハイド口ホービン）に保存されている 8つのシスティン残基を含んで ねり、 ι_のクロ一ンは ¾. oryzae の hydrophobin (ハイド口ホービン）遺伝子（ ? p) であることが明らかとなった。
0—3)麹菌ん oryzaeハイドロホ一ビン遺伝子（Ayp)の単離
(1 -3-1) JZ3981の塩基配列の解析
ESTクローン JZ3981の EST情報は部分配列のみであったので、 JZ3981の全 塩基配列を決定した。
[方法]
ABI PRISM 310 Genetic Analyzerを用いてシークェンシングを行なった。
JZ3981 4j!il
M 13 Universal primer (F or R) 4 μ. I
Terminator Ready Reaction mix 8 (J. I
DDW fill up to 20 i I 上記のような反応系を作製し、 TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL (宝 酒造（株））にて PGR反応を行なった。 PGR反応条件は 96°C 3分、 96°C 10分 、 50°C 5分、 60°C4分を 30cycleとした。 PGR反応後、エタノール沈殿を行なった 後、 loading dye 15 j! Iに溶解し 3分間煮沸したのち、 ABI PRISM 310 Genetic Analyzerに供し、 ABI PRISM Seaquencing Analysis version 3.0 で角 ¥析した。 [結果] JZ3981がハイド口ホービンの完全長を含むことを確認した（図 6)。 実施例 2 (2) ハイド口ホービン高発現麹菌の育種
(2-1) 麹菌用ハイド口ホービン高発現プラスミドの構築
ハイド口ホービン 高発現麹菌を育種するために、麹菌用ハイド口ホービン高 発現プラスミドを構築した。麹菌発現用ベクターである PNGA142 系ベクターを 用いた（Γキノコとカビの基礎科学とバイオ技術」宍戸和夫-編著（アイピーシー） p. 534)。また、ハイドロホ一ビンの高発現には構成的プロモーターの存在が不 可欠であるため、目的遺伝子の上流に目的遺伝子（AyP)の上流に ひ promoter を融合させた pNG - enoP - hypを作製した（図 7 )。
[材料]
①試薬
各種制限酵素、修飾酵素類は宝酒造（株）、 Boehringer Mannheim 山之内（ 株）、 New England Biolabs のものを適宜用いた。試薬を調製する際はミリ Q水 を用し、、特に断りのない限り 121°C、 20分間オートクレープ滅菌した。
②菌株
大^售 {Escher chia co/)は XL1-Blue(Stratagene社製） を用いた。麹菌は A oryzae RIB40を用いた。
③培地
用いた大腸菌用培地は、 Stratagene社の XL1- Blue添付のマニュアルに従つ 1-4-1) pNG-enoP-hyp の構築
「材料」
④ベクタ一
ベクターとしては、 enoA promoter を含む pNGEG— d1 (Toda T. et aし Curr. Genet. 40:260 - 267， [2001])を使用した。インサートを含む JZ3981 (pSPORT 1 - hyp)は醸造研究所（現在の独立行政法人酒類総合研究所：広島県広島市 鏡山 3— 7— 1 )から分譲を受けた。 「方法」
①制限酵素による DNAの切断
pNGEG-dK pSPORT 1一 hyp各々を /) alと Sadによリ切 fした。
②ベクター DNA、インサート DNAの調製
ベクタ一 DNA、インサート DNAともに、制限酵素で完全に切断した後、ァガロース ゲル電気泳動に供し、長波長（366nm)UV下で DNAフラグメントを切り出した。そ の後、 rep A gene (Bio— Rad— Laboratories)にて DNAを回 1|又し、ベクター DNA、 インサー卜 DNAとした。
③ライゲーシヨン
ライゲーシヨン反応は調整したベクター DNAとインサート DNA、さらに T4 DNA ligase(GIBCO BRL Lifetechnology) 5 X ligation buffer (250 mM Tris-HCI; pH7.6、 50mM MgGI" 5m ATP、 5 mM DTT、 25%PEG - 8000)、滅菌水で 20； I にし 16°Cで 16時間反応させた。
④大腸菌の形質転換
ライゲーシヨン液 10 〃1 に 10 / Iの 10XKCM(1 M KGI、 0.3 M GaCI2、0.5 M MgGI2)、7 μ\ の 30%ポリエチレングリコール（#6000)、 73〃 I の滅菌水を加え 、よく撹拌した。これを氷中でよく冷却した後、氷上解凍したコンビテントセルを 100 il 加え穏やかに撹拌し、氷中で 20分間、続いて室温で 10分間放置した。 これに、 200 μ \ の LB液体培地を加え、終濃度 100 μ g / m\ になるようにァ ンピシリンを添加した LB平板培地にまき、 37°Cで一晚培養した。
⑤プラスミド DMAの調製
目的のプラスミド DNAを用いて形質転換した大腸菌の単一のコロニーを、終 濃度 100 g / ml になるようにアンピシリンを添加した3 mlLB液体培地に植菌 し、 37°Cでー晚振盪培養した。 1.5 ml の培養液を 2 mlのエツペンドルフチューブ JP2003/011861
32 に移して 15，000x で 1分間遠心分離し、沈殿を 100jUl の氷冷した TEG(25 mM Tris-HCU 0 mM EDTA、 50 mM Glucose, pH 8.0)で懸濁し、これに 200 μ I の 0.2 N NaOH-1% SDS を加えて穏やかに撹拌した後、 150 〃 I の 3 M NaOAc pH 5.2 を加えて混合した。これを 15，000 x で 4 °Cで 5分間遠心分離し上清を 回収し 450 μ\ のフエノール'クロ口ホルム'イソアミルアルコール（25:24: 1 )を 加えて激しく撹拌した後、 15，000X 、室温で 5分間遠心分離し上層を回収した 。この溶液に- 20 °Cで氷冷した 900 Iのエタノールを加えて- 20 °Cで 10分間放 置後、 15，000X で 4 °Cで 5分間遠心分離した。沈殿を 500 Iの 70 <½ェタノ一 ルでリンスしたのち、乾燥させ、最後に RNaseH(100 μ& / ml)を含む ΤΕ(10 mM Tris-HCU 1 mM EDTA, pH 8.0) 50 Iに溶解した。得られたプラスミドを alと Sa/Iで切断後、ァガロース電気泳動にょリ揷入断片の存在を認め、
PNG- enoP - hypの完成を確認した。
(2— 2)ハイド口ホービン高発現麹菌の形質転換 '育種
ァスペルギルス -ォリゼの形質転換はプロトプラスト- PEG法を改良した方法を 用い、形質転換するプラスミド DNAは上記で作製した pNG-enoP-hyp， pNG- enoP(pNG- enoP- hypのハイド口ホービン遺伝子インサート無し- ベクター のみ）を用いた。これらのプラスミド DNAIOji gを/!^/ /71で完全消化し、定法により フエノール抽出、エタノール沈澱処理を行った後 10 Iの TEに溶解し形質転換 用 DNA溶液とした。
ァスペルギルス -ォリゼ niaD300 株（RIB40株由来の硝酸還元酵素遺伝子（ ?)欠損変異株：醸造研究所より分与）の胞子懸濁液を YPD液体培地に添 加し、 30°C 、 12時間振盪培養した。培養液よリガラスフィルターを用いで集菌し た。菌体を 50ml容の遠心チューブに移し、 10mlのプロトプラスト化溶液（0.6M KCI , 0.2M NaH2P04 , pH 5.5 , 5mg/ml Lysing enzyme(Sigma Chemical Co.)， 10mg/ml Cellulase Onozuka R - 10 (Yakult Phrmaceutical Ind.Co.,Ltd.)， 10mg/ml Yatalase (TaKaRa) )を加え懸濁し、 30°C90rpm， 3 時間振盪しプロ卜 プラスト化反応を行った。滅菌した MIRACLOTH(CALBIOCHEM) にて濾過し、 濾液中のプロトプラストを 3000 xg , 4°C ， 5 分間遠心分離することで沈澱とし て得た。 Solid.2M ソルビ! ル ， 50mM CaCI2， Tris-HCI buffer， pH7,5)にて 3 回プロトプラストを洗浄し、 3000Xg， 4°C ， 5 分間遠心分離することで沈澱と して得た。このプロ卜プラストを 1 X109個プロトプラスト/ mlになるように Sol【に懸濁 した。プロトプラスト懸濁液 100 lに前述の形質転換用プラスミド DNA溶液 各 10〃1と 12.5 lの So (50(w/v%) PEG #4000， 50m CaCI2， 10mM Tris-HCI buffer , pH7.5を加えよく混合し、氷中で 30 分間放置した。次にこの混合液を 50ml容の遠心チューブに移し、 1mlの Soliを加え混合した後、 2mlの 1.2M ソルビ I ^一 'ル ， 50mM CaCI2 , Ttis-HCI buffer， ρΗ7·5を力 Qえよく混合した。 55°Cに温 めておいた Gzapek- Dox 軟寒天培地にプロトプラスト懸濁液を加え混合し、 ， Gzapek-Dox寒天培地に重層した。その後、 30°C で胞子を形成するまで培養し た。 胞子形成後、白金針にて分生子柄をかきとり、 0.01 %(v/v%) Tween80に懸 濁し、この懸濁液を希釈し、 Czapek-Dox寒天培地に広げ 30°C で培養するこ とを繰り返し単胞子分離をおこなった。単胞子分離の確認は Hondel 法 (胞子 PCR法）を改変しておこなった。白金針にて 200〃1 の YPD 培地が入った
1.5ml 容マイクロチューブに分生子を添加し、 30°C で 40 時間培養した。培養 菌体を新しい 1.5ml 容マイクロチューブに移し、 50〃 I のプロトプラスト化溶液 0.8M KCI， 10mM クェン酸 , pH6.5， 2.5mg/ml Lysing enzyme (Signa
Chemical Co.)， 2.5mg/ml Yatalase (TaKaRa) ) を加えて懸濁し、 3フ。 C で一 時間放置した後、 95 °Cで 3分間加温し、次いで 5分間以上氷上に放置し菌体 を沈澱させた。この上清 5 1 を錶型として PGR の反応系に用いた。
PNG- enoP- hypの胞子 PCR用のプライマ一として
5' -ATTCGCGAAAATGGTAGCTCGAGGA-3' と
5'-GTAGAATCACGAATGAGACCTTTGACGACC-3' の 2 種のオリゴヌクレ ォチドを合成し、 pNG-enoPのプライマ一として 5' - GTAGAATCACGAATGAGACCTTTGACGACC-3' と 5' - GTTAGTCGACTGACCAATTCCGCAG-3' の 2種のオリゴヌクレオチドを合成し た。 PGR 用装置は PGR Thermal Cycler PERSONAL (宝酒造） を用し、た。ポ ジ亍イブコントロールとして形質転換に使用にしたプラスミド DNA を錶型とした 。pNG- enoP-hypの増幅反応は 95°C ， 3 分間錶型 DNA を変性し、 94°C ' 1 分間 ， 55.5°C ， 1 分間 ， 72°C ， 90 秒間保持するサイクルを 30 サイクル おこなった後、 72°C , 95 秒間で完全伸長させ 4°C で保持した。 pNG-enoPの 増幅反応は 95°C ， 3 分間錶型 DNA を変性し、 94°C , 1 分間 ， 57°C ， 1 分間 ， 72°C ， 90 秒間保持するサイクルを 30 サイクルおこなった後、 72°C ， 95 秒間で完全伸長させ 4°C で保持した。得られた PCR 増幅断片をァガロー ス電気泳動に供したところ、ポジティブコントロールと同じ位置に PGR 断片の 増幅が確認され、その結果より、麹菌の染色体 DNA 上にエノラーゼプロモー ター配列下流にハイド口ホービン遺伝子の挿入された配列の存在が確認され、 pNG - enoPもまた形質転換されたことが確認された。 形質転換された ハイド口ホービン 高発現麹菌とハイド口ホービン遺伝子を揷 入していない麹菌（pNG- enoP)を 200ml の YPD 培地 （ 1(w/v%)酵母エキス , 2(w/v%) ペプトン ， 2(w/v%) グルコース） に 2500胞子/ ml濃度で植菌し、 30 °G ， 24 時間振蓥培養しガラスフィルターで菌体を濾過し、培養上清を得た。培 養上清 1ml に対して 500|/1 の 100 (w/v%) 冷トリクロ口酢酸を加え、よく混 合した後、氷中に 12 - 16 時間放置した。サンプルを 15000Xg， 4°C ， 20 分 間遠心分離し上清を完全に除いた後、沈澱を 15 il の SDS化溶液 （0.063M Tris-HCI buffer， pH6.8， 2 (w/v%) SDS， 1(v/v%) 2—メルカプトエタノー レ ， 10(w/v%) グリセロール ， 0.05(w/v%) ブロモフエノールブルー)に溶解させたあ と、沸騰湯浴中に 5分間放置し SDS化をおこない、これをサンプルとした。以後 の SDS-PAGE と PVDF膜へのブロッテイングの方法は Schagger ら
(Schagger, H., et al. (1987) Anal. Biochem., 166， 368— 379)の方法にした力《つ た。泳動板は、 160mm X 160mm, 1mm 厚のものを使用し、電流 10mA —定で 泳動を開始しサンプルのグリセロール前線が泳動板の先端まで泳動したところ で電気泳動を止めた。その後、電気泳動したゲルを PVDF膜に転写し、 PVDF膜 上より 14.3kDa の断片を切り抜き、そのままァミノ末端アミノ酸配列の解析を おこなった。解析の結果アミノ末端から LPPAS であり、麹菌ハイド口ホービン EST クローンの塩基配列をアミノ酸置換したものと相同検索をしたところ一致し たため培養上清に ハイド口ホービンがあることが確認された。また PVDF 膜に 転写すると同時に GBB 染色をしたところハイド口ホービン遺伝子を挿入してい ない麹菌の培養上清からは、分子量 14.3kDaにバンドが確認されなかったこと から。ハイド口ホービン高発現麹菌はその細胞表層のみならず高度にハイド口 ホービンを培養上清に分泌していることが確認された（図 8 )。 尚、プラスミド DNA (PNG-enoP- hyp )で形質転換された ハイド口ホービン高発 現麹菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城 県つくば市東 1丁目 1番地 1 )に平成 1 4年 1 0月 4日付けで寄託され、受託番 号： FERM P— 1 9055を付与されている。 実施例 3
( 3 )生分解性プラスチック分解酵素クチナ一ゼ遺伝子の取得とその高発現麹 菌の育種
生分解性プラスチック分解因子として分解酵素があげられる。そこで、生分解 性プラスチック分解酵素遺伝子を取得するとともに、その高発現麹菌株の育種 を行った。生分解性プラスチックとしては PBSを用いた。
( 3— 1 )ァスペルギルス 'ォリゼ由来 PBS (ポリブチレンサクシネート）分解酵 素の精製
0.5 X 1 06 個胞子/ ml となるようにァスペルギルス 'ォリゼ RIB40 胞子懸濁 液を 500 ml 容三角フラスコ内の 1 00 ml の 1 (v/v %) PB S 乳化液（昭和高 分子）を含み、唯一の炭素源とした Czapek Dox 培地 （34 g/ml クロラムフ 工ニコール）（Nakajima, K.,et al. (2000) Curr. Genet., 37, 322-327) に添カロした 。添加後 30°C， 125卬 m， 5 日間培養した。培養液を MIRACLOTH
(GALBIOCHEM (登録商標）） にて濾過し、その濾液を 8000 g, 4°C， 20 分間遠 心分離し得られた上清を粗酵素液とした。粗酵素液に 20% 飽和となるように 硫酸アンモニゥムを加えた後、 8000 g， 4°C， 20 分間遠心分離し得られた上清 画分を得た。上清画分を 10 mM 卜リス-塩酸緩衝液， ρΗ 8.0, 20 % 飽和硫酸 アンモニゥムにて平衡化した Octyト Gellulofine (生化学工業）に供し、吸着画 分を 20-0 % 飽和硫酸アンモニゥ厶の直線濃度勾配による溶出させた。分画 した溶液に対して 0.1 (v/v %) となるように PBS 乳化液を添加し、 37°C にて 保温し、その濁度の低下（PBS の分解）によって活性画分を追跡した。得られ た活性画分を 10 mM 卜リス-塩酸緩衝液， pH 8.0 に対して透析し、同緩衝液に て平衡化した DEAE- TOYOPEARL 650S カラム（東ソ一）に供し、吸着画分を 0-0.3 M NaCI の直線濃度勾配により溶出させた。得られた活性画分を 10mM MES 緩衝液， pH 5.5 に対して透析し、同緩衝液にて平衡化した HiTrap SP カラム（アマシャムフアルマシア バイオテク）に供し、吸着画分を 0-0.3 M NaCI の直線濃度勾配により溶出させた。得られた活性画分を SDS-PAGE
(Laemmli, U. K. (1970) Nature, 227， 680-685) に供し電気泳動的に均一であ ることが確認されたため、ここで得られた活性画分を PBS 分解酵素精製標品 とした。
(3-2) PBS 分解酵素の内部アミノ酸配列の決定
上記で得られた精製酵素溶液 （0.4 mg/ml) 250 i I に対して 200 /i I の 100 (w/v %) 冷トリクロ口酢酸を加え、よく混合した後、氷中に 12-16 時間放 置した。サンプルを 15000 g, 4°C, 20 分間遠心分離し、上清を完全に除いた 後、沈殿を 50 μ \ の SDS 化溶液 {0.063 Μ 卜リス-塩酸緩衝液， ΡΗ 6.8， 2 (w/v %) SDS, 1 (v/v %) 2-メルカプトエタノール， 10 (w/v %) グリセロール } に溶 解させた後、沸騰湯浴中に 5 分間放置し SDS 化をおこない、これをサンプル 溶液とした。別に V8 プロテアーゼ溶液 〖6.3 U g の V8 プロテアーゼを 25 μ \ JP2003/011861
37 の 0.05 (w/v %) ブロモフエノールブル一， 0.019 M 卜リス-塩酸緩衝液， pH 6.8， 0.6 (w/v %) SDS, 0.3 (v/v %) 2—メルカプトエタノール， 3 (w/v %) グリセロール に溶解させたもの } を調製した。以後の SDS- PAGE と PVDF 膜へのブロッテ イングの方法は Schagger らの方法 （Schagger, H.， et a I. (1987) Anal.
Biochem., 166, 368 - 379) に従った。 160 mm x 160 mm, 1 mm 厚の泳動板を 使用した。 50 μ\ のサンプル溶液をゥエルにアプライし、さらに 25 〃1 の V8 プロテアーゼ溶液を重層した。電流 15 mA —定で泳動を開始し、色素（プロモ フエノールブルー）が濃縮ゲルのほぼ中間まで泳動された時点で泳動を停止し、 そのまま室温にて 1 時間放置し、ゲル内での V8 プロテアーゼによる限定分 解をおこなった。その後電気泳動を再開し、泳動後ゲル内のタンパク質を
PVDF B莫に転写した。 PVDF 膜上より 7.9 kDa 10.3 kDa, 11.9 kDa の断片を 切り抜き、そのままァミノ末端アミノ酸配列の解析をおこなった （Matsudaira, P. (1987) J. Biol. Chem" 262， 10035— 10038)。 10.3 kDa.11.9 kDa のァミノ末端 アミノ酸配列を解析した結果、両者共にァミノ末端側より、 AQGLFEQAVS、であ つた。得られたアミノ酸酉己列に対して National Center for Biotechnology
Information (NCBI； http://www.ncbi.nim.nih.gov/) の BLAST 検索 (Zhang, 丄， et al. (1997) Genome Res., 7， 649—656) を利用して相同検索をおこなった ところ、ァスペルギルス 'ォリゼの産生するクチナーゼの内部アミノ酸配列と一致 した (Ohnishi, K.， et al. (1995) FEMS Microbiol. Lett" 126 (2)， 145—150)。
(3— 3)PBS 分解酵素遺伝子を含む染色体 DNA のクローニング
PBS 分解酵素遺伝子を含む染色体 DNA を取得するために、ァスペルギル ス 'ォリゼの菌糸より染色体 DNA を調製した。 0.5 X 106 個胞子/ ml となる ようにァスペルギルス 'ォリゼ RIB40 胞子懸濁液を 500 ml 容三角フラスコ内 の 100 ml の YPD 液体培地 [1 (w/v %) 酵母エキス， 2 (w/v %) ペプトン， 2 (w/v %) グルコース } に添加した。添加後 30°C， 125 rpm, 16 時間培養した。 培養液をガラスフィルターで濾過し菌糸を集め、蒸留水で洗浄した。菌糸を脱 水した後、予め - 20°C に冷やしておいた乳鉢に菌体を入れ、液体窒素を注い 2003/011861
38 で凍結させ、直ちに冷やした乳棒で細かく粉砕した。粉砕した菌糸をスパーテル で 1.5 ml 容マイクロチューブにとり、 0.4 ml の TE (10 m 卜リス-塩酸緩衝液， pH 8.0, 1 mM EDTA) に懸濁した後、溶菌溶液 {2 (w/v %) SDS, 0.1 M NaCI, 10 mM EDTA, 50 mM トリス-塩酸緩衝液， pH 7.0} を 0.4 ml 加えてゆっくり撹 拌し、室温に 15 分間放置した。 15,000X 10 分間遠心分離して上清を新し しゝ 1.5 ml 容マイクロチューブに回収した。フエノール'クロ口ホルム■イソアミルァ ルコール （25:24:1) を等量加え、ゆっくりチューブを上下に撹拌した後、 15000 g, 5 分間遠心分離して上清を新しい 1.5 ml 容マイクロチューブに回収した。
- 20°C に冷やしたエタノールを 2.5 倍量加えて、- 20°Cに 10 分間放置した後 , 15,000 x^, 4°C， 15 分間遠心分離し上清を完全に除き沈殿を得た。沈殿を 0.5 ml の TE に溶解させ、 5 μ \ の RNase A (10 mg/ml) 溶液を加え、 37°C に 30 分間放置し RNA を分解した。 0.5 ml のフエノール'クロ口ホルム■ィソァ ミルアルコール （25:24:1) を加え、ゆっくりチューブを上下に撹拌した後、 15,000 Xg, 5 分間遠心分離して上清を新しい 1.5 ml 容マイクロチューブに回収した。 この操作をもう 1 回繰り返した。 0.5 ml のクロ口ホルム'イソアミルアルコール (24:1) を加え、ゆっくりチューブを上下に撹拌した後、 15，000 X ， 5 分間遠心分 離して上清を新しい 1.5 ml 容マイクロチューブに回収した。 50 μ\ の 5 M NaCI と 1 ml の冷エタノールを加え、- 20°Cに 10 分間放置した後、 15，000X 4°C, 15 分間遠心分離し上清を完全に除き沈殿を得た。 70 (v/v %) エタノールで DNA を洗浄して 15,000 X ， 4°C， 10 分間遠心分離し上清を完全に除き沈殿 を得た。沈殿を 0.1 ml の TE で溶解し、これを染色体 DNA 溶液とした。 次に、前述の内部アミノ酸配列をもとに、 30 塩基からなるオリゴヌクレオチド (5' -GCACAAGGACTGTTTGAACAAGCTGTTTCC-3' ) と、既知のクチナーゼ 遺伝子塩基配列を基に、 30 塩基からなるオリゴヌクレオチド
(5' -CCAGGCAGACAAGATCTCCCACGGCGCAAT-3' ) を合成した。この 1 組のプライマ一セットを用い、染色体 DNA を錶型として PGR をおこないサザ ンハイブリダィゼーシヨンのプローブを増幅した。 PCR 用装置は PGR Thermal Cycler PERSONAL (宝酒造）を用いた。染色体 DNA は 100 ng 用い、ポリメ ラ一ゼは Ex taq polymerase (宝酒造）を用いた。増幅反応は、 95°C， 3 分間錶 型 DNA を変性し、 95°C， 1 分間、 60°C，1 分間、 72°C， 30 秒間保持するサイ クルを 30 サイクルおこなった後、 72°C， 1 分間で完全伸長させ、 4°Cで保持し た。得られた PCR 増幅断片をァガロースゲル電気泳動に供したところ、 300 塩基対からなる断片の増幅が確認された。 次 Iこ、 NEN RandomPnmer Fluorescein Labeling Kit with
Antifluorescein- AP (Eizo Diagnostics, Inc.) を用いてサザンハイブリダィゼー シヨンとコロニーハイブリダィゼーシヨンをおこなった。また今後使用した SSG 液 は 20 倍濃度（20x SSC) (1 75.4 g NaCI と 88.2 g Sodi um Citrate Dihydrate を水に溶解し、 1 I に合わせた後、オートクレープ滅菌したもの)を適宜滅菌水で 希釈し調製したものを用いた。染色体 DNA 1 0 g を 50 ユニットの £coR V (宝酒造）で完全消化しァガロースゲル電気泳動に供した。トレイにアルカリトラ ンスファー緩衝液 （0.4 N NaOH) を入れ、ガラス板をのせ、緩衝液に届くまでの 長さに予め切った濾紙（ADVANTEG TOYO)をのせて緩衝液で湿らせた。この 上に泳動後のゲルをのせ、同じ大きさに切ったナイロンメンブラン（Hybond-N+; アマシャムフアルマシア バイオテク）をゲル上に置き、さらにその上に滅菌水で 湿らせた濾紙を 3 枚のせた。ペーパータオルを 5 cm の高さに積み重ね、重り をのせた。 1 2 時間ブロッテイングしたあと、メンブランを 4x SSG で洗浄し、ハイ ブリダィゼーシヨンをおこなった。 次に、前述の PGR 反応液に対して 1 /1 0 量の 5 M NaGI を加えさらに 2.5 倍量の冷エタノールを加え、 - 20°Cに 1 0 分間放置した後、 1 5,000 4°C, 1 5 分間遠心分離し上清を完全に除き沈殿を得た。 70 (v/v %) エタノールで DNA を洗浄して 1 5，000 x ， 4°C， 1 0 分間遠心分離し上清を完全に除き沈殿を得た 。沈殿を 1 g/〃l となるように TE に溶解した。この DNA 溶液 20 〃1 と NEN Random Primer Fluorescein Labeli ng Kit with Antitluorescein-AP の Random Primers and Reaction Buffer Mix 5 I % Fl uorescei n Nucleotide Mix 5 jti U Kl enow Fragment 1 fl \ を加え、ピペッティングにより混合し、 37°Cで 1 時間反応させた。反応後、 0.1 M EDTA, pH 8.0 を 5 μ \ 加え、 20 ng/ml とな るように hybridization buffer {2 X SSC, 0.1 (w/v %) SDS, 5 (w/v %) Dextran Sulphate, 0.5 (v/v %) Blocki ng Reagent} と混合したものをプローブ溶液とした
次にブロッテイング後のメンブランを 2 X SSC でリンスし、ハイブリダィゼーショ ンバッグに移し、 0.1 ml/cm2 となるように hybridization buffer と終濃度 50 μ g/ml となるように Carrier DNA を加え、 60°Cで 1 時間保温した。続いて 200 μ I の hyb ridization buffer とプローブ溶液 20 μ l Carrier DNA (10 mg/ml) 35 μ \ をマイクロチューブ中で混合し、 1 00°Cで 5 分間煮沸した。氷中で急冷 しそのまま 5 分間放置した。これを予め 60°C に温めておき、ハイブリダィゼー シヨンバッグ中の溶液と交換し、 60°Cで 1 6 時間保温した。メンブランをハイプリ ダイゼーシヨンバッグより取り出し、 1 cm2 のメンブランあたり 1 ml 以上の 2 X SSC, 1 (w/v %) SDS で 60°C， 1 5 分間激しく振盪することによって洗浄し、次に 0.2 X SSC, 0.1 (w/v %) SDS で 60°C， 1 5 分間同様に洗浄した。以後の操作 は室温でおこなった。 1 cm2のメンブランあたり 1 ml 以上の 0.1 M トリス -塩 酸緩衝液， pH 7.5, 0.1 5 NaCI 中で激しく 5 分間振 ¾することで洗浄した。 次にプラスチックバッグ内の 1 cm2のメンブランあたり 0.1 ml 以上の 0.1 M 卜 リス -塩酸緩衝液， pH 7.5, 0.1 5 M NaCI, 0.5 (v/v %) Blocking Reagent 中で 1 時間振還した。次にプラスチックバッグ内の 1 cm2のメンブランあたり 0.1 ml 以上の 0.1 トリス-塩酸緩衝液， pH 7.5， 0.1 5 NaCI, 0.5 (v/v %) Blocking Reagent, 1 /1 000 (v/v) Antifluorescein-AP Conjugate との混合液中で 1 時 間振盪した。その後メンブランを取り出し 0.1 M 卜リス-塩酸緩衝液， pH 7.5,
0.1 5 M NaCI 中で 5 分間ずつ 4 回激しく振盪することで洗浄した。 0.1 M トリ ス-塩酸緩衝液， pH 9.5， 0.1 M NaCI 中で 5 分間ずつ 2 回激しく振盪するこ とで洗浄した。メンブランをプラスチックバッグに移し、これに EGF substrate Auto Phos (Eizo Diagnostics, Inc.) を 1 ml 加え、遮光下で 30 分間反応さ せた。メンブランをプラスチックバッグから取り出しさらに 4 時間遮光下で放置し た後、蛍光分析機 （FLA- 2000; FUJIFILM) にて解析した。その結果約 1300 塩基対からなる強くハイブリダィズするバンドが検出された。 次に、染色体 DNA 1 0 ji g を 50 ユニットの fcoR V で完全消化しァガロー スゲル電気泳動に供しェチジゥムブロマイドで染色後、 1300 塩基対付近のゲ ルを UV 照射下で切り出した。ゲル中より prep A gene (BioRad) を用いて DNA を抽出し、これを揷入 DMA 断片とした。 次にプラスミド pBluescript II S+ DNA (Stratagene) 2.5 g を fcoR V ( 宝酒造）にて消化し、定法によリフヱノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなつ た後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造）により 5' 末端のリン酸を除去した。こ の反応液を定法によリフエノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後 TE に溶解したものをべクタ一 DNA 溶液とした。 次に、ベクター DNA 1 g と挿入 DNA 断片 1.5 μも を Τ4 DNA ligase ( 宝酒造）により連結させ、連結 DNA 溶液を得た。この連結 DNA 溶液 10 l と 10 μ \ の 10x KCM (1 M KCI, 0.3 M CaCI2, 0.5 M MgGI2)、フ 〃 I の 30 (w/v %) PEG#6000 N 73 μ I の滅菌水を混合し、 1 00 μ \ の形質転換可能な大 腸菌 DH5 （宝酒造）を加え、氷中に 20 分間、室温に 10 分間放置し形質 転換大腸菌懸濁液を得た。ナイロンメンブラン（Hybond- Ν+; アマシャムフアルマ シァ バイオテク）を 50 jU g/ml のアンピシリンを含む LB 寒天培地上に置き、 その上に形質転換大腸菌懸濁液をまき、 37°Cで 1 6 時間培養した。メンブラン を培地上より剥がし取リメンブランを 10 (w/v %) SDS に 3 分間、 0.5 N
NaOH, 1.5 M NaCI に 10 分間浸し、溶液を除いた後、 1 M トリス-塩酸緩衝液， pH 8.0, 1.5 M NaCI に浸し、溶液を除いた後、 2x SSC で洗浄した。メンブラン を 0.4 N NaOH に 1 時間浸し 2x SSG で洗浄した。このメンブランを前述の サザンハイブリダィゼーシヨンの時と同様の操作をおこない、プローブをハイプリ ダイズした。その結果ポジティブシグナルを得た。 次に、元の寒天培地上からポジティブシグナルとなるプラスミド DNA を有する 大腸菌を白金針にて拾い、 LB 液体培地 （50 jt g/ml アンピシリン） に移植し 37 °C にて 16 時間振盪培養した。培養液 1.5 ml を 1.5 ml 容マイクロチュー ブに移し、 15，000 X 1 分間遠心分離し培地を除いた。菌体を 100 m の TEG (25 mM 卜リス-塩酸緩衝液， pH 8.0， 10 mM EDTA, 50 mM グルコース） で懸濁し、これに 200 〃1 の 1 (w/v %) SDS, 0.2 N NaOH を加え穏やかに混 合し氷中に 5 分間放置した。さらに 150 〃1 の 3 M 酢酸ナトリウム， pH 5.2 を加え穏やかに混合し氷中に 5 分間放置した。これに 10 M 酢酸アンモニゥ ムを 150 μ\ 加え穏やかに混合し、 15，000 x ， 4°C， 10 分間遠心分離し上清 を新しい 1.5 ml 容マイクロチューブに移した。これに 600 β\ の 2-プロパノー ルを加え、よく混合した後 15,000 X ， 4°C， 10 分間遠心分離し上清を除いた。
70 (v/v %) エタノールで DNA を洗浄して 15，000X 4°C， 10 分間遠心分離 し上清を完全に除き沈殿を得た。沈殿を 0.1 ml の TE で溶解し、これをプラス ミド DNA 溶液とした。このプラスミド DNA 中の揷入 DNA 断片の塩基配列を AB【 PR【SMTM 377 DNA sequencer Long Read (PE Biosystem) のプロトコ一レ ί二従しゝ、 ABI PRISM™ 377 DNA sequencing system (PE Biosystem) Iこて角？ 析した。その結果、プラスミド DNA に挿入された 1334 塩基対からなる染色体 DNA の fcoRV 消化断片には、プローブの塩基配列を含むオープンリーデイン グフレームが見出された。このオープンリーディングフレームは 3 箇所のイン卜 ロン塩基配列を含み、さらに開始メチォニンをコードする塩基配列 ATG とスト ップコドンを含み、すなわも PBS 分解酵素遺伝子の全長を有していた (Ohnish に et al. (1995) FEMS Microbiol Lett., 126(2)， 145 - 150)。
(3— 4)PBS 分解酵素高発現系の構築
前述の PBS 分解酵素遺伝子全長を有するプラスミド DNA 5 g を EcoRV (宝酒造）にて消化し、ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムブ口 マイドで染色後 UV 照射下で 1334 塩基対からなる断片を切り出した。ゲル 中より prep A gene (BioRad) を用いて DNA を抽出し、これを揷入 DNA 断 片とした。次に塩基配列中にグルコアミラーゼのプロモーター配列 （PglaA 142) を有するプラスミド pNGA142 DNA 5 〃g をプロモーター配列の直後にある制 限酵素 pmac I 認識配列の位置で P aC ί (宝酒造）で消化し、定法にょリフ ェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後、アルカリフォスファターゼ（宝 酒造）により 5' 末端のリン酸を除去した。この反応液を定法によリフエノール 抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後 ΤΕ に溶解したものをベクター DNA 溶液とした。次に、ベクター DNA 1 Ug と揷入 DNA 断片 1.5 i g を T4
DNA ligase (宝酒造）により連結させ、連結 DNA 溶液を得た。この連結 DNA 溶液 10 〃1 と 10 jUl の 10XKGM (1 M KCI, 0.3 M CaCI2, 0.5 M MgCI2)、 7 μ\ の 30 (w/v %) PEG#6000、 73 1の滅菌水を混合し、 100 μ\ の形質転換 可能な大腸菌 DH5a (宝酒造）を加え、氷中に 20 分間、室温に 10 分間放 置し形質転換大腸菌懸濁液を得た。次に 50 Ug/m\ のアンピシリンを含む
LB 寒天培地上にに形質転換大腸菌懸濁液をまき、 37°Cで 16 時間培養した 。培地上のコロニーを白金針にて拾い、 LB 液体培地 （50 〃g/ml アンピシリン ) に移植し 37°C にて 16 時間振通培養した。培養菌体中より前述と同様に プラスミド DNA を抽出し、この麹菌形質転換用プラスミド DNA(pNG- cut) を 得た。このプラスミド DNA 10 Ug を H で消化し、定法によリフエノール抽 出、エタノール沈殿処理をおこなった後 10 μΐ の ΤΕ に溶解し形質転換用 DNA 溶液とした。ァスペルギルス 'ォリゼの形質転換は Vollmer らのプロトプ ラス卜一 PEG 法 (Vollmer, S. J., et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4869- 4873)を改良して行った。詳細は実施例 2 (2- 2)に従った。 形質転換再生培地で胞子形成後、白金針にて分生子柄をかきとり、 0.01 (v/v %) Tween 80 に懸濁し、この懸濁液を適宜希釈し、 Czapek - Dox 寒天培 地に広げ 30°C で培養することを繰り返すことで単胞子分離をおこなった。単 胞子分離の確認は Hondel 法（胞子 PGR 法）（van, Zeiji, C. M.， et al.
(1 997) J. Biotechnol., Jan 3; 59 (3)， 221 -224) を改変しておこなった。単胞子 分離の詳細は実施例 2(2-2)記載の方法に従った。胞子 PCR 用プライマーと して、 2 種のオリゴヌクレオチド （5，— TGGAGTGGGG GATGGGGTGGAC— 3 '， 5 ' -GTAGAATCACGAATGGAGCCTTTGACGACC-3 ' ) を合成した。 PCR 用装 置は PGR Thermal Cycler PERSONAL (宝酒造）を用いた。ポジティブコント口 ールとして麹菌形質転換用プラスミド DNAを錶型とした。ポリメラーゼは Ex Taq polymerase (宝酒造）を用いた。増幅反応は、 94°C， 3 分間錶型 DNA を 変性し、 94°C， 1 分間、 55.5°C，1 分間、 72°C， 90 秒間保持するサイクルを 30 サイクルおこなった後、 72°C， 95秒間で完全伸長させ、 4°Cで保持した。得られた PGR 増幅断片をァガロースゲル電気泳動に供したところ、ポジティブコントロー ルと同じ位置に PGR 断片の増幅が確認され、その結果より染色体 DNA 上 にグルコアミラーゼ■プロモーター配列の下流に PBS 分解酵素遺伝子が連結 した塩基配列が挿入されたことと、それを有するァスペルギルス-オリゼ形質転 換株が得られたことが確認された。この PBS 分解酵素遺伝子が染色体 DNA 中に挿入されたァスペルギルス "ォリゼ形質転換株と、揷入されていない（
PNGA1 42 にて形質転換した）ァスペルギルス 'オリゼ形質転換株の胞子懸濁 液を 0.5 x 1 06 個胞子/ ml となるようにグルコアミラーゼ.プロモーターの誘導 物質であるマルトースを含む 1 00 ml の YPM液体培地 {1 (w/v %) 酵母ェキ ス， 2 (w/v %) ペプトン， 2 (w/v %) マル!—ス} にそれぞれ添加した。添加後 30 °C， 1 25 rpm, 1 6 時間培養し、培養上清を M【RACLOTH (CALBiOGHEM (登録 商標）） にて濾過することで得た。得られた培養上清に対して 0,1 (v/v %) となる ように PBS 乳化液を添加し、 37°C にて保温し、その濁度の低下（PBS の分 解）によって PBS 分解酵素の発現を確認したところ、 PBS 分解酵素遺伝子が 染色体 DNA 中に挿入されたァスペルギルス'ォリゼ形質転換株の培養上清 中にのみその活性の存在が認められた。次に培養上清 1 00 tl \ に 50 jii l の 冷トリクロ口酢酸を加えよく混合した後、氷中で 20 分間放置し、 1 5,000 ?< ， 4 °C, 1 5 分間遠心分離し上清を完全に除き、沈殿画分を得た。これに 1 5 μ \ の SDS 化溶液 {0.063 M トリス—塩酸緩衝液， pH 6.8, 2 (w/v %) SDS, 1 (v/v %) 2—メルカプトエタノール， 1 0 (w/v %) グリセロール， 0.05 (w/v %) プロモフエノ ールブルー } を加え溶解させた後、沸騰湯浴中にて 5 分間放置し SDS 化を おこなった。これを前述の PBS 分解酵素精製標品と共に SDS- PAGE に供し たところ、 PBS 分解酵素遺伝子が染色体 DNA 中に挿入されたァスペルギル ス 'ォリゼ形質転換株の培養上清中にのみ PBS 分解酵素精製標品と同じ位 置にタンパク質の発現が確認された（図 9)。 尚、プラスミド DNA(PNG- cut)で形質転換された生分解性プラスチック分解酵 素クチナーゼ遺伝子の高発現麹菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特 許生物寄託センタ一（茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 )に平成 1 4年 1 0月 4日 付けで寄託され、受託番号： FERM P— 1 9054を付与されている。 実施例 4
( 4 )麹菌ァスペルギルス 'ォリゼ ハイド口ホービン高発現菌、クチナーゼ高発現 菌の単独培養、及び、これらの共培養によるプラスチック分解試験（液体培養 系）
ハイド口ホービン高発現麹菌（pNG- enoP- hyp)単独、クチナーゼ高発現麹菌 (pNG-cut)単独、コントロールとして宿主である RIB40株にベクタ一のみを導入し た株 (PNGA 1 42)を実施例 1記載の Gzapek- Dox最少培地に PBS乳化液 0.20/0， 誘導基質としてマル I ^一ス 0.5%を加えた培地に胞子を 1 x 1 06/mlで添加し 30°C で 2日間振盪培養した。さらにハイド口ホービン高発現株とクチナーゼ高発現麹 菌の共培養した試験区（pNG- cut+pNGenoP- hyp)も設けた。培養 2日目の培養 液を MIRAGLOTHでろ過して菌体を除き、培養ろ液の濁度（ 630nmで測定）の 低下を表 3に示した。尚、初発の濁度（O D63。；)は 8. 73であった。その結果、共 培養株 >クチナーゼ発現株 >ハイド口ホービン発現株 >コントロールの順序で 濁度低下が大きかった。 [表 3]
Strain 残存乳化 PBS濁度 （0D630)
Control (pNGA 142 ) 4.99
pNG-cut+pNG-enoP-hyp 1.53
pNG-cut 3.26
pNG-enoP-hyp 4.16 実施例 5
( 5 )麹菌ァスペルギルス 'ォリゼ ハイド口ホービン高発現菌、クチナーゼ高発現 菌の単独培養、及び、これらの共培養によるプラスチック分解試験（固体培養 系）
実施例 4で用いたそれぞれの菌株を 1 X 107胞子個/ mlに調整し、 0.5%(w/v)の PBS粉末を懸濁した最小培地 (0.5%マルトース）に接種して、 30°Cで 8日間培養 した。培養後、菌体が取り込んでいる PBS微細粉末を洗浄 （菌体を 50mlファ ルコンチューブに取り 25ml程度の滅菌水を加えボルテックスミキサーで撹拌） し 、菌体と PBS微細粉末を完全に分離した。洗浄液をミラクロスろ紙で濾過し、 濾液を遠心（10，000rpm1 5min)後、上清を除き初期培養条件の液量になるよう に最小培地で調整し懸濁させた。その懸濁液を 300倍希釈し 630nmで吸光度 を測定した。得られた結果を表 4に示す。
これらの結果から、ハイド口ホービン高発現株、クチナーゼ高発現株共に、宿 主の RIB40株に比較して、粉体の固形 PBSにおける生育も著しく増加し、 PBSの 転換能が向上していることが確認された。 [表 4]
Figure imgf000049_0001
実施例 6 ( 6 )麹菌ァスペルギルス'ォリゼ ハイド口ホービン高発現菌、クチナーゼ高発現 菌、及び、有用物質の生合成系に関与する酵素（有用物質）を高発現菌の共 培養による有用物質の製造
次いで生分解性プラスチック PBSの分解に共役した、有用物質生産の例とし て工業用酵素ひ-アミラーゼの生産を行った。実施例 4と同様の培地を用いて、 クチナーゼ高発現株 (pNG- cut組み換え体）とハイド口ホービン高発現株
(pNG - enoP-hyp)の共培養、クチナーゼ高発現株 (PNG - cut組み換え体）とハイ ドロホービン高発現株 (pNG - enoP- hyp)とひ-アミラーゼ高発現株（pNG-amy)の 共培養を行った。コントロールとして PNGA142のインサートを持たないベクターの みを有する RIB40株を用いた。 pNG- amyを保持する R1B40形質転換体は、麹菌 Of -アミラーゼ遺伝子（S. Tada et al.: Agric. Biol. Chem., 53, 593-599 [1 989]) をクチナーゼ遺伝子同様に PNGA1 42に挿入して作製し、 RIB40株を形質転換し て得た。実施例 4の実験と同様に、培地に 1 X 106個の胞子を接種し、 30°Cで 2 日間培養した。培養液を MIRACLOTHでろ過して菌体を除き、培養ろ液を得、 1 5000 X 4°C， 10 分間遠心分離し残存する PBS を完全に除き培養上清を 得た。 -アミラーゼ活性の測定は、培養上清を水にて 1 00 倍に希釈したものを用 いた。各培養上清中の α -アミラーゼ活性発現量はヨウ素呈色法にて測定した 。測定用試薬溶液として、 A 液； 50 mM 卜リス緩衝液 （pH 6.8) 中に可溶性澱 粉を 0.3 % となるように溶かしたもの、 B 液； 1 N 塩酸中にヨウ素を 2x1 0— 4 %、 ヨウ化カリウムを 2x 1 0—3 % になるように溶かしたものを調製した。 A 液 400 β \ に 50 μ \ の希釈した培養上清を加え 37°Cで 1 0 分間反応させた。そこに B 液を 50 β \ 加え、よく混合し、直ちに 620 nm の吸光度を測定し、 Blank (未 接種） の値に比した吸光度の減少量をひ-アミラーゼの相対活性量として 表 5 に示した。 PBS減少量は三重共培養株 =二重共培養株 >コントロールの順序 で大きかった。 Q? -アミラーゼ活性誘導は三重共培養姝>二重共培養株 >コン 卜ロールの順序で大きく、 PBS分解で供給される PB Sモノマーをエネルギー源と して、三重共培養区では工業用 -アミラーゼ生産されることが明らかになった
[表 5 ]
Strain 残存 PBS濁度 （OD630) a -amylase相対活性（A 0D620) Blank (未接種） 10.44 0
Control (pNGA142 ) 3.18 0
pNG-cut+pNG-enoP-hyp 0.47 0.020
pNG-cut+pNG-enoP-hyp+pNG-amy 0.36 0.134
実施例 7
(7 )クチナーゼ-ハイド口ホービン共高発現株の育種
実施例 3-4 で得られたクチナーゼ高発現株を用いてクチナーゼ-ハイドロホ 一ビン共高発現株を取得するために、麹菌用ハイド口ホービン高発現プラスミド を構築した。麹菌発現用ベクターである pPTR 1ベクターを用いた。また、ハイド 口ホービンの高発現にはマル! ^一スで強力に誘導がかかる glaA 142 promoter を目的遺伝子の上流に融合した pPTR-gla - hyp を作製した。（図 10) (7-1) pPTR-gla-hyp の構築
[材料]
pPTR -gla-hyp の構築にあたり 2 種類のベクター (pNGA 142， pPTR ί) を使用し インサートの調製には実施例 2 で作成した pNG- enoP - hyp を使用 した。
[方法]
① 制限酵素による DNAの切断
pNGA 142 と pNG— enoP— hyp各々を T a Iと Sa/Iにより切断した。
② ベクター DNA、インサート DNAの調製
③ ライゲ一シヨン
④ 大腸菌の形質転換
⑤ プラスミド DNAの調製
上記方法②から⑤については、実施例 2 と同様に行った。得られたプラスミ ドを a lと Sa/lで切断後、ァガロース電気泳動によリ揷入断片の存在を 認め、 pNG- gla- hypの完成を確認した。
⑥ 制限酵素による DNAの切断
pPTR 1と pNG— gla— hyp 各々を Pst Y ， Sma I で切断した
⑦ ベクタ一 DNA、インサート DNAの調製
⑧ ライゲ一シヨン
⑨ 大腸菌の形質転換
⑩ プラスミド DNAの調製
上記方法⑦から⑩については、実施例 2 と同様に行った。得られたプラスミ ドを ¾ilと Sma Iで切断後、ァガロース電気泳動にょリ揷入断片の存在を 認め、 pPTR- gla - hypの完成を確認した。
(7- 2)クチナ一ゼ-ハイド口ホービン共高発現麹菌の育種
ァスペルギルス 'ォリゼ（実施例 3 - 4 で得られたクチナーゼ高発現株）の形 質転換はプロトプラスト- PEG法を改良した方法を用い、形質転換するプラスミ ド DNAは上記で作製した pPTR- gla - hypを用いた。これらのプラスミド DNA10〃 gを Sac IIで完全消化し、定法によリフエノール抽出、エタノール沈澱処理を行 つた後 10 Iの TEに溶解し形質転換用 DNA溶液とした。以降のァスペルギル ス 'ォリゼの形質転換については実施例 2 (2-2) に記した方法に従った。 但しプロトプラスト再生培地である Gzapec- Dox 軟寒天培地には 100 μ g/ml となるようにピリチアミン （TaKaRa) を添加したものを用いた。さらに培地 上で形成した胞子をピリチアミンを含む Czapek - Dox 寒天培地に植え継ぐこと で単胞子分離を行った。 pPTR- gla- hypの胞子 PGR用のプライマーとして
5' -ATTCGCGAAAATGGTAGCTCGAGGA-3'と
5' - GTGTGTGGGGTATGTAAGGGTG - 3' の 2種のオリゴヌクレオチドを合成 した。 PCR 用装置は PGR Thermal Cycler PERSONAL (宝酉造） を用し、た。 ポジティブコントロールとして形質転換に使用にしたプラスミド DNA を錶型とし た。 pPTR-gla-hypの増幅反応は 95°C ， 3 分間錶型 DNA を変性し、 94°C ， 1 分間 ， 55.5°C , 1 分間 ， 72°C ， 90 秒間保持するサイクルを 30 サイクル おこなった後、 72°C ， 95 秒間で完全伸長させ 4°C で保持した。得られた
PGR 増幅断片をァガロース電気泳動に供したところ、ポジティブコントロールと 同じ位置に PCR 断片の増幅が確認され、その結果より、麹菌の染色体 DNA 上に glaA142 promoter—配列下流にハイド口ホービン遺伝子の揷入された配 列の存在が確認された。 形質転換された クチナーゼ - ハイド口ホービン共高発現株を 200ml の YPM 培地 （実施例 2 (2-2)} に 1 X 106胞子 /ml濃度で植菌し、 30°C ， 24 時間 振盪培養しガラスフィルタ一で菌体を濾過し、培養上清を得た。培養上清 200 β \ に対して 100jU l の 100 (w/v%) 冷トリクロ口酢酸を加え、よく混合した後 、氷中に 12-16 時間放置した。サンプルを 15，000 Xg， 4°C , 20 分間遠心分 離し上清を完全に除いた後、沈澱を 15// 1 の SDS化溶液 {実施例 2 (2- 2)}に 溶解させたあと、沸騰湯浴中に 5分間放置し SDS化をおこない、これをサンプ ルとした。以後の SDS - PAGEの方法は実施例 2 (2-2) に記した通りとした。
SDS-PAGE に供した後、 GBB 染色により 14 kDa にクチナーゼ高発現株には 確認されない バンドが確認されたことから、クチナーゼ- ハイド口ホービン共高 発現株が取得された (図 11)。 実施例 8
(8)麹菌ァスペルギルス'ォリゼ クチナーゼ高発現株、ハイド口ホービン高発 現株、クチナーゼ'ハイド口ホービン共高発現株によるプラスチック分解試験 （ 液体培養） 実施例 2で作製したハイド口ホービン高発現麹菌、実施例 3で作製したクチナ ーゼ高発現麹菌、実施例 7で作製したクチナーゼ'ハイド口ホービン共高発現麹 菌、及びコントロールとして pNGA142 株の胞子を YPM培地 （ 1(vy/v%)酵母 エキス ， 2(w/v%) ペプトン ， 4(w/v%) マル! ス） に PBS 乳化液 0,1 % を 加えた培地に 1 X106個/ ml になるように植菌する。 30 。C , 24 時間培養し培 養液を MILACLOTH にて分離し培養ろ液の濁度を 630nm の波長で吸光度 を測定し PBS 分解率を算出した。
その結果、クチナーゼ 'ハイド口ホービン共高発現株 >クチナーゼ高発現株 >ハイド口ホービン高発現株 >コントロール （pNGA142 株） の順序で濁度の低 下が大きかった。（表 6)
[表 6] 使用菌株 濁度 (OD630) 分解率
Blank 1.103
PNGA142 1.023 7.25% ハイ ドロホービン高発現株 0.831 24.66% クチナーゼ高発現株 0.436 60.47% クチナーゼ-ハイ ドロホービン共高発現株 383 65.28% 実施例 9
( 9 )クチナーゼ-ハイドロホ一ビン-ァ.ミラーゼ三重共高発現株の育種
(9-1 ) 実施例 3 - 4 で得られたクチナーゼ高発現株を用いてクチナーゼ-ハイド 口ホービン-アミラーゼ三重高発現株を取得するために、ハイド口ホービン高発 現用プラスミド pPTR- eno- hyp を作製（図 1 2)した。また、麹菌 アミラーゼ高 発現用プラスミド pNG- amy (図 13)は東北大学大学院農学研究科応用生命科 学生命工学研究室より分譲を受けた。また、ハイドロホ一ビンの高発現には構 成的に誘導がかかる eno A promoter を目的遺伝子の上流に融合させた pPTR-eno - hypを作成した。ひ-アミラーゼの高発現には、マルトースで強力に 誘導がかかる glaA 142 promoter を目的遺伝子の上流に融合させた
pNG-amy も分譲を受けた。
[材料]
pPTR -enoP-hyp の構築にあたリベクタ一に pPTR 1を使用し インサート は実施例 2 で作成した pNG- enoP-hyp を使用した。
[方法]
① 制限酵素による DNAの切断
pPTR 1 と pNG— enoP— hyp各々を Psi Iと Sma Iにより切断した。
② ベクター DNA、インサート DNAの調製
③ ライゲーシヨン
④ 大腸菌の形質転換
⑤ プラスミド DNAの調製
上記方法②から⑤については、実施例 2 と同様に行った。得られたプラスミド を Pst lと で切断後、ァガロース電気泳動にょリ揷入断片の存在を 認め、 pPTR-enoP-hypの完成を確認した。
(9 - 2)クチナーゼ-ハイド口ホービン-アミラーゼ三重共高発現麹菌の育種 ァスペルギルス-ォリゼの形質転換はプロトプラスト- PEG法を改良した方法を 用い、形質転換するプラスミド D N Aは上記で作製した p PT R - e n oP-hypと
pNG— amyを用しヽた。 pPTR— enoP— hyp プラスミド DNA 1 0 μ g を Sac / /^完全 消化し、定法によリフエノール抽出、エタノール沈澱処理を行った後 1 0〃1の TE に溶解し形質転換用 DNA溶液とした。さらに pNG- amy プラスミド DNA につい ては 1 0 〃g を制限酵素処理をせずに 1 0 jU lの TEに溶解し形質転換用 DNA 溶液とした。以降のァスペルギルス 'ォリゼの形質転換については実施例 7 (7-1 -2) に記した方法を踏襲した。 pPTR-enoP- hypの胞子 PCR用のプライマー として 5 ' -ATTCGCGAAAATG GTAGCTCGAGGA-3 ' と
5' -CTGTGTCCCGTATGTAACGGTG -3 ' の 2種のオリゴヌクレオチドを合成 した。 pNG-amy の胞子 PGR 用のプライマ一として
5' -GGTTCGCTTCGTAAGTCTTCCCTT-3 'と
5' -GTAGAATCACGAATGAGACCTTTGACGACC-3 ' のォりゴヌクレオチド、を 合成した。 PGR 用装置は PCR Thermal Cycler PERSONAL (宝酒造） を用い た。ポジティブコントロールとして形質転換に使用にしたプラスミド DNA を錶型 とした。 pPTR - gla - hypの増幅反応は 95°C ， 3 分間錶型 DNA を変性し、 94 °C ， 1 分間 ， 55.5°C ， 1 分間 ， 72°C ， 90 秒間保持するサイクルを 30 サイ クルおこなった後、 72°C ， 95 秒間で完全伸長させ 4°C で保持した。得られた PCR 増幅断片をァガロース電気泳動に供したところ、ポジティブコントロールと 同じ位置に PCR 断片の増幅が確認され、その結果より、麹菌の染色体 DNA 上に e n o A p r 0 m 01 e r配列下流にハイド口ホービン遺伝子の揷入された配列と glaA 1 42 promoter 配列下流に アミラーゼ遺伝子の揷入された配列の存在 が確認された。 形質転換された クチナーゼ 一 ハイド口ホービン共高発現株を 200ml の
YPM 培地 {実施例 2 (2-2)} に 1 X 1 06胞子/ ml濃度で植菌し、 30°C , 24 時間 振盪培養しガラスフィルターで菌体を濾過し、培養上清を得た。培養上清 200 μ \ に対して 1 00 /i l の 1 00 (w/Vo/o) 冷トリクロ口酢酸を加え、よく混合した後 、氷中に 12-16 時間放置した。サンプルを 15，000 Xg， 4°C ， 20 分間遠心分 離し上清を完全に除いた後、沈澱を 15 i l の SDS化溶液 （実施例 2 (2-2)} に溶解させたあと、沸騰湯浴中に 5分間放置し SDS化をおこない、これをサン プルとした。以後の SDS- PAGEの方法は実施例 2 (2 - 2) に記した通りとした。
SDS- PAGE に供した後、、 GBB 染色により 14 kDa にクチナ一ゼ高発現株には ^ 確認されない バンドが確認されたことから、クチナーゼ- ハイド口ホービン -0?ァ ミラーゼ三重共高発現株 ( . oryzae pN- cha株）がハイド口ホービンを高発現す ることが確認された。（図 14)。 (9-3) アミラーゼ発現の確認
次いで生分解性プラスチック PBSの分解に共役した、物質生産の例としてェ 業用酵素ひ-アミラーゼの生産を行った。表 5同様の培地を用いて、実施例 7で 作製したクチナ一ゼ-ハイド口ホービン共高発現株、及び本実施例で作製したク チナーゼ-ハイド口ホービン -アミラーゼ三重共高発現株 (ん oryzae pN- cha株） の培養を行った。コントロールとして pNGA142のインサートを持たないベクタ一の みを有する PNGA142株を用いた。培地に 1X106個の胞子を接種し、 30°Cで 24 時間培養した。培養液を M[RACLOTHでろ過して菌体を除き、培養ろ液を得、 15,000 ^·, 4°C， 10 分間遠心分離し残存する PBS を完全に除き培養上清を 得た。 ひ -アミラーゼ活性の測定は、培養上清を水にて 100 倍に希釈したもの を用い実施例 6の方法と同様のヨウ素呈色法にて測定した。 即ち、測定用試薬溶液として、 A 液； 50 mM 卜リス緩衝液 （pH 6.8) 中に可 溶性澱粉を 0.2 % となるように溶かしたもの、 B 液； 1 N 塩酸中にヨウ素を
2x10— 4 %、ヨウ化カリウムを 2x10— 3 % になるように溶かしたものを調製した。 A 液 400 \ に 50 μ、 の希釈した培養上清を加え 37°Cで 10 分間反応させ た。そこに B 液を 50 jUl 加え、よく混合し、直ちに 620 nm の吸光度を測定 し、 Blank (未接種） の値に比した吸光度の減少量を -アミラーゼの相対活性 量として 表 7に示した。ひアミラーゼ活性測定結果からアミラーゼ遺伝子を揷 入した三重高発現株がもっとも高い αアミラーゼ活性を示した事から、三重共 高発現株の取得を確認した。
[表 7 ]
strain a -amylase相対活性 （ Δ ODfiク n)
Blank - υ - ' "
Figure imgf000057_0001
実施例 1 0
( 1 0)ハイド口ホービンホモログ ( 1 0-1 ) Aspergillus oryzae EST データベースを用いたハイド口ホービンホモログ の探索
現在までに報告されている糸状菌、担糸菌のハイド口ホービンの塩基配列、 アミノ酸配列 から A. oryzae EST データベースに対して BLAST ネットワーク サービスを用い、相同性の高いクローン情報を探索した。 探索結果として Aspergillus oryzae ノ、イド口ホービン hyp ^ {Aspergillus oryzae EST データベースのマッチング結果：塩基配列の e値： 0.0、アミノ酸配列 の e値： 6e - 36 ) (配列表 2)、 PAoA'oia nam e roハイド口ホービンと相同性（
Aspergillus oryzae EST データベースのマッチング結果：塩基配列の e値： 0.029、アミノ酸配列の e値： 1 e - 1 9)を示すクローン hydrophobin- 31 5(配列表 3) の情報が得られ、ハイド口ホービンに保持されている 8つのシスティン残基を含 んでいた。このことより、このクローンは . o/yzae のハイド口ホービンであること が明らかになった。 (1 0 - 2)麹菌ん oryzae ハイド口ホービン遺伝子ホモログのクローニングと高発現 株の育種
(1 0-2-1 ) hypB のクローニング
BLAST ネットワークサービスの情報から hypB の O RF (オープンリーディング フレム)を予想し、 PC R にて増幅される断片に O RF が含まれるように 2種類の オリゴヌクレオチド 5 ' - CAACCCAACCGTCGACATGAAGTTCT-3 ' と 5 ' - GCCAAATGGCGTCTAGATTACAGACC-3 ' を合成しクロ一ニング用の primer とした。錶型 DNA として実施例 3 - 3 で調整した A. oryzae RIB 40 染色体 DNA を使用した。 PCR 用装置は PC R Thermal Cycler PERSONAL (宝酒造） を用いた。増幅反応は 95 。C , 3分間錶型 DNA を変性し、 95 °C ， 1分間 ， 57.2 °C ， 30 秒間 ， 72 °C ， 90秒間保持するサイクルを 30 サイクル行った後 、 72 °C , 90秒間で完全伸長させ 4 °Cで保持した。実際に PGR によって DNA 断片が増幅されているかをァガロース電気泳動により確認した。さらに PGR で目的遺伝子に変異が入っているかを確認するため、塩基配列のシーク エンスを行った。 PGR 増幅断片をァガロース電気泳動に供し長波長 （363nm) UV 下で DNA フラグメントを切り出し prep A gene (BIO-Rad-Laboratories) にて DNA を回 1|又した。 PGEM— T Easy Vector Systems(Promega) を使用し回 収した PCR 断片を PGEM-T Easy Vector Systems に添付のプロトコルに沿つ て TA クローニングを行った。このプラスミド DNA (TA- hypB)中の揷入 DNA 断 片の塩基配列を AB【 PR【SMTM 377 DNA sequencer Long Read (PE
Biosystem) のプロ卜コーレ ίこ従しヽ、 AB【 PRISMTM 377 DNA sequencing system (PE Bi osystem) にて解析した。解析結果から PGR 反応によって得ら れた増幅断片中の塩基配列の変異は確認されなかった。
(1 0-2-2) hyp B 高発現プラスミドの構築
高発現麹菌を育種するために、麹菌用 hyp Β 高発現プラスミドを構 築した。麹菌発現用ベクターである pN GA1 42 系べクタ一を用いた。また Aw 高発現にはマル! ^一スで強力に誘導がかかる glaA 142 promoter を目的遺伝 子の上流に融合させた pNG-gla - hyp B を作製した。（図 1 5)
[材料]
pNG-gla-hypB の構築にあたリベクタ一を pNGA1 42をインサートは TA- hyp
Bを使用した。
[方法]
① 制限酵素による DNAの切断
pNGA 1 42 と TA-hypB 各々を a Iヒ Sai lにより切断した。
② ベクター DNA、インサート DNAの調製
③ ライゲ一シヨン
④ 大腸菌の形質転換
⑤ プラスミド DNAの調製
上記方法②から⑤については、実施例 2 と同様に行った。得られたプラスミ ドを a lヒ Sai lで切断後、ァガロース電気泳動にょリ揷入断片の存在を 認め、 pNG- gla- hypBの完成を確認した。
( -2-3) yp B 高発現株の育種
ァスペルギルス 'ォリゼの形質転換はプロトプラスト- PEG法を改良した方法を 用い、形質転換するプラスミド DNAは上記で作製した pNG- gla- hyp Bを用いた。 これらのプラスミド DNAI O jU gを "" Π、完全消化し、定法によリフエノール抽出、 エタノール沈澱処理を行った後 1 0 i Iの TEに溶解し形質転換用 DN A溶液とし た。以降のァスペルギルス 'ォリゼの形質転換についてはは実施例 2 (2-2) に 記した方法を踏襲した。集菌した菌体を実施例 2と同様に pNG-gla - hypBを用い て形質転換し、 PNG- gla - hyp Bの胞子 PGR用のプライマーとして
5 ' -CAACCCAACCGTCGACATGAAGTTCT-3 ' と
5 ' -GTAGAATCACGAATGAGACCTTTGACGACC -3 ' の 2種のオリゴヌクレオ チドを合成した。 PCR 用装置は PGR Thermal Cycler PERSONAL (宝酒造） を用いた。ポジティブコントロールとして形質転換に使用にしたプラスミド DNA を錶型とした。 pNG - gla - hyp Bの増幅反応は 95°C , 3 分間錶型 DNA を変 性し、 94°C ， 1 分間 ， 57.0°C ， 1 分間 ， 72°C , 90 秒間保持するサイクルを 30 サイクルおこなった後、 72°C ， 95 秒間で完全伸長させ 4°C で保持した。 得られた PCR 増幅断片をァガロース電気泳動に供したところ、ポジティブコン トロールと同じ位置に PGR 断片の増幅が確認され、その結果より、麹菌の染 色体 DNA 上に glaA142 promoter—配列下流に hyp B遺伝子の挿入された配 列の存在が確認された。 (10-2-4) hydrophobin-315 のクロ一ニング
A.oryzae EST データベースの情報から hydrophobin-315 の ORF (オープン リーディングフレム)を予想し、 PCR にて増幅される断片に ORF が含まれるよう に 2種類のオリゴヌクレオチド 5'— CTGGTTCGTTTGTCGACATGAAGGT— 3' と 5'— TCAATGGTGTAGAAGGCGTTGGG— 3' を合成しクローニング用の primer とした。錶型 DNA として実施例 3- 3 で調整した A.oryzae RIB 40 染 色体 DNA を使用した。 PCR 用装置は PGR Thermal Cycler PERSONAL (宝 酒造）を用いた。増幅反応は 95 °C ， 3分間錶型 DNA を変性し、 95 °C ， 1分 間 ， 55.4 °C , 30 秒間 ， 72 °C ， 90秒間保持するサイクルを 30 サイクル行つ た後、 72 °C ， 90秒間で完全伸長させ 4 °Cで保持した。実際に PGR によつ て DNA 断片が増幅されているかをァガロース電気泳動により確認した。さらに PGR で目的遺伝子に変異が入っているかを確認するため、塩基配列のシーク エンスを （8-2-2) の方法と同様に行った。解析結果から PCR 反応によって得 られた増幅断片中の塩基配列の変異は確認されなかった。 (10-2-5) hydrophobin-315 高発現プラスミドの構築
hydrophobin-315 高発現麹菌を育種するために、麹菌用 hydrophobin-315 高発現プラスミドを構築した。麹菌発現用ベクターである PNGA142 系ベクター を用いた。また hydrophobin- 315 高発現にはマルトースで強力に誘導がかかる 1
59 glaA 142 promoter を目的遺伝子の上流に融合させた
pNG-gla-hydrophobin-315 を作製した。（図 16)
[材料]
pNG-gla-hydrophobin-315 の構築にあたリベクタ一は pNGA142をインサー 卜は丁 -1^1^0^-315を使用した。
[方法]
① 制限酵素による DNAの切断
pNGA 142 と TA— hydrophobin— 315 各々を 6a Iと Sa/ Iによし J切断した 。
② ベクタ一 DNA、インサート DNAの調製
③ ライゲ一シヨン
④ 大腸菌の形質転換
⑤ プラスミド DNAの調製
上記方法②から⑤については、実施例 2 と同様に行った。得られたプラスミ ドを と Sa/Iで切断後、ァガロース電気泳動にょリ揷入断片の存在 を認め、 pNG- gla- hydrophobin-315の完成を確認した。
(10-2-6)hydrophobin-315 高発現株の育種
ァスペルギルス 'ォリゼの形質転換はプロトプラスト- PEG法を改良した方法 を用い、形質転換するプラスミド DNAは上記で作製した
pNG- gla- hydrophobin-315を用いた。これらのプラスミド DNA10 gを 【で 完全消化し、定法によリフエノール抽出、エタノール沈澱処理を行った後 10 ϋ Iの TEに溶解し形質転換用 DNA溶液とした。以降のァスペルギルス 'ォリゼ の形質転換についてはは実施例 2 (2 - 2) に記した方法を踏襲した。
pNG-gla-hydrophobun- 315の形質転換は、実施例 2の形質転換と同様に行つ て、形質転換体を pNG - gla- hydrophobin - 315の胞子 PGR用のプライマーとして 5' - CTGCTTCCTTTGTCGACATGAAGGT-3' と 5 ' -GTAGAATCACGAATGAGACCTTTGACGACC -3 ' の 2種のオリゴヌクレオ チドを合成した。 PCR 用装置は PGR Thermal Cycler PERSONAL (宝酉造） を用いた。ポジティブコントロールとして形質転換に使用にしたプラスミド DNA を錶型とした。 pNG-gla- hydrophobin- 31 5の増幅反応は 95°C ， 3 分間錶型 DNA を変性し、 94°C ， 1 分間 ， 57.0°C , 1 分間 ， 72°C ， 90 秒間保持する サイクルを 30 サイクルおこなった後、 72°C ， 95 秒間で完全伸長させ 4°C で 保持した。得られた PGR 増幅断片をァガロース電気泳動に供したところ、ポジ ティブコントロールと同じ位置に PGR 断片の増幅が確認され、その結果より、 麹菌の染色体 DNA 上に glaAl 42 promoter配列下流に hydrophobi n— 31 5遺伝 子の挿入された配列の存在が確認された。
(1 0- 2- 7)カビのハイド口ホービン相同遺伝子
以上、プラスチックに吸着性の麹菌のハイドロホ一ビン遺伝子群の単離を述 ベたが、それら DNA及びアミノ酸配列を既知の DNA及びタンパク質データベース に対して検索を行った。その結果を、遺伝的系統樹として図 1 7に示した。その 果、 -^ΐ^" Isi Magnaporthe gnsea^ Aspergillus fumigatus、 Aspergillus nidu/ansに 同遺伝子が存在することが明らかとなった。これらはいずれもハィ ド口ホービン特有のシスティン残基を有していたことから、ハイド口ホービンであ ることが確認される。これら遺伝子産物も、プラスチックの疎水表面に吸着し、 生分解性プラスチック分解酵素と共同して、プラスチック分解を促進する因子と して働くと予想される。
尚、図 1 7に示された各ハイド口ホービン遺伝子のァノテーシヨンに関する現 時点での情報は以下の通りである。 Magnaporthe gnsea P 1
—植物感染に重要な接着因子。クローニング済
ACCESSION NO. L20685(Nucleotide) . AAA201 28(Protein) Aspergillus fum!gatus Rod A
→ァスペルギル症感染に重要な因子。クローニング済
ACCESSION NO . AF057335(Nucleoti de) , ΑΑΒ6071 2(Protein) Aspergillus fumigatus Rod B
—ウィルスの胞子への感染を防ぐ。クローニング済
AEM .Mar . 2003 . p 1 581 - 1 588
Aspergillus nidulans Rod A
—胞子形成時に発現し菌体表面を疎水性にする。クローニング済
ACCESSION NO . M61 1 1 3(Nucleoti de)， AAA33321 (Protein)
Aspergillus nidulans DewA
—胞子形成時に発現し菌体表面を疎水性にする。クローニング済
ACCESSION NO . U07935 (Nucleotide) , S67924(Protein)
Aspergillus oryzae DewA
→ A. nidulans の hydrophobi n {Aspergillus nidulans Dew A) と相同性をもつ ものとして見出された。
Aspergillus oryzae RolA
LOCUS AB094496 861 bp DNA linear PLN 07 - MAR- 2003
DEFINITION Aspergillus oryzae rolA gene for hydrophobin putative, complete cds.
ACCESSION AB094496
VERSIO N AB094496.1 G【:28875528
SOURCE Aspergillus oryzae
ORGANISM Aspergillus oryzae Eukaryota; Fungi; Ascomycota; Pezizomycotina;
Eurotiomycetes;
Eurotiales; Trichocomaceae; mitosporic Trichocomaceae;
Aspergillus.
REFERENCE 1
AUTHORS Takahashi，丁.， Yoneda，S,， Maeda,H„ Yamagata,Y., Abe，K.， Machida,M.T Gomi，K. and Nakajima，T.
TITLE Hyper induction of a Hydrophobin— like protein, RolA， of
Aspergillus oryzae by olybutylene succinate in liquid culture
JOURNAL Unpublished
Aspergillus oryzae nameko(hydrophobin-315)
新規遺伝子（実施例 10参照） Aspergillus oryzae HypB
→本遺伝子及びその発現産物であるタンパク質は既知であり、以下のァクセ ッシヨン番号にて登録されている。クローニングは既報の情報を基に行い、ん oryzae 染色体 DNA より単離した （実施例 10)。また本遺伝子は PBS 存在 時に特異的に発現することを確認している。
ACCESSION NO . AB097448(Nucleotide)， BAC77248(Protein) 実施例 11
(1 DRol A の生分解性プラスチックへの吸着
ハイド口ホービン（Rol A )が存在する系での生分解性プラスチックの分解にお いて、 Rol A は両親媒性という物理学的特性から、生分解性プラスチックの表 面に吸着することが考えられた。生分解性プラスチックとしてフイルム状（1mm)の PBS , PBSA， PLA を用い Rol Aがこれらの生分解性プラスチックに吸着する 30H861
63 か否かを確認した。
(11-1) Hydrophobin (Rol A) 高発現麹菌からの Rol A の精製
実施例 2 で得られた hydrophobin 高発現麹菌の胞子を 1 X 106 個胞子/ ml になるように、 1%マルトースを含む 1L の最少培地を入れた 3L 容坂ロフラスコ に接種し 30°Cで 48時間培養した。培養液を MiRAGLOTH (CALBIOCHEM) に て濾過し、培養上清を得た。培養上清に 40% 飽和となるように硫酸アンモニゥ ムを加えた後、 8，000x ， 4°C, 20 分間遠心分離し得られた上清画分を得た。 上清画分を 10 mM トリス-塩酸緩衝液， PH 8.0, 40 % 飽和硫酸アンモニゥム にて平衡化した Octy卜 CelMofine (生化学工業）に供し、吸着画分を 40 - 0% 飽和硫酸アンモニゥ厶の直線濃度勾配による溶出させた。溶出させた全画分 を SDS - page に供し、予想された大きさのところにバンドが確認された画分を 回収した。回収した画分を 10mM クェン酸- NaOH 緩衝液 （PH.4.0) で透析し 、同緩衝液で平衡化した S-Sepharose FF に供し吸着画分を NaCI ， 0 - 0.5M の直線勾配で溶出させた。回収した全画分を SDS- PAGE に供し CBB 染色 により 目的の大きさのバンドが均一であることが確認されたため、これを精製 Rol Aとした。
(11-2) Rol A 抗体の作製
(11-1)で得た、 RolA精製タンパク質を用いて、マウス抗 RolA抗体を作製した（ 株式会社 ティ一ケークラフト）。
(11-3) イミュノブロッテイングによる生分解性プラスチックへの Rol Aの吸着の 確認
フィルム状の PBS， PBSA (昭和高分子） 及び PLA (三井化学）、コントロール としてスライドガラス に 1cm2 に切り抜いたろ紙 （Whatman) に精製 Rol A 溶 液（2.5〃 g protein/ ml Tris—HCI buffer , pH 8.0)を 10〃lろ紙にスポットし 30 °C ， 13時間 ， 湿度 95% でインキュベートした。このフィルムを入れた容器に T/JP2003/011861
64
11-2)で作製した一次抗体の 1000 倍希釈液 （1% BSA， 0.05% Tween 20 , 10mM リン酸緩衝液 ， pH7.2， 0.9w/v NaCI) 10ml を加え 1時間振盪し 10mM リン酸緩衝液 PH7.2 で三回洗浄する。次に 5000 倍した二次抗マウス抗体（生 化学工業社製）希釈液 10ml を容器に入れ 30 分間軽く振盪し 10mMリン酸 緩衝液 pH7.2 で三回洗浄する。二次抗体にはアルカリフォスファタ一ゼが固定 化してあるため、基質として 66 μ Lの NBT(nitro blue tetrazdium 50mg/ml in 70 % dimethylformamide)を 10mLのアルカリフォスファターゼ buffer (1 OOmM Tris-HCI， PH 9.5)， 100m NaCI， 5mM MgCI2 と混合。その後、この溶液に 33 Iの BIPG (50mg/mL in 70%dimethylformamide)を混合したものを用いた。
この基質溶液を フィルムの入っている容器に加え、生分解性プラスチックに 吸着している Rol A を検出した。その結果、 RolAタンパク質は、ガラス表面に は吸着せず、 PBS, PBSA, PLAの全ての表面に吸着していることが検出された（ 図 18)。 実施例 12
(12)新規プラスチック分解酵素遺伝子の探索
(12-1) PBS分解酵素類似体遺伝子を含む染色体 DNAのクロ一ニング
PBS分解酵素類似体遺伝子を含む染色体 DNAのクローニングを行なうにあた リ、サザンハイブリダィゼーシヨンに用いるプローブとなる PCR断片を以下の
RT-PCR法により得た。
プローブ配列を取得するために、 PBS存在下での培養時に発現している遺伝 子群のライブラリーを取得した （以下 cDNAライブラリーと省略）。 0.5 X 106個胞 子/ mlとなるようにァスペルギルス'オリゼ RIB40胞子懸濁液を 500 ml容三角フ ラスコ内の 100 mlの Gzapek- Dox培地 に添加した。添加後 30°C， 24時間培養 した。菌糸体をミラクロス （CALBIOCHEM) にて集菌し、滅菌水で洗浄後余分 な水分を取り除いた。この回収した菌糸体を、 PBSェマルジヨンを唯一の炭素源 とした最少培地へと移し、 30°C， 3日間振盪培養を行った。培養終了後ミラクロ 1
65 スを用いて菌糸体を回収した。菌糸体から実施例 1に従って、 total RNA及び m RN Aを取得した。次に、得られた m RN Aを錶型とした逆転写反応を行った。エツ ペンドルフチューブに、 mRNA (92 ng/ l) 5 μ U oligo (dT) primer (0.5 μ g/ β 1) 1 U 2.5 mM dNTP MIX (2.5 mM each) 4 し DEPG処理水 2 〃lを加え、 70°Cで 10分間インキュベートした後氷上で 1分間以上放置し、 mRNAに oligo
(dT) primerをアニーリングさせた。次に、この反応液に 5 X First Strand Bufffer (250 mM Tris-HCI, pH 8.3、 375 mM KCI 、 15 mM MgCI2)4jU U 0.1 M DTT 2 i Iを加え、 42°Cで 5分間インキュベートした後、逆転写酵素 Super Script Π RT(200 U/ l)1 julを加えピペッティングによる撹拌後 42°Cで 50分間インキュべ 一卜し、さらに Super Script II RT(200 U/jU l)1 ji Iを加えピペッティングによる撹 拌後 42°Cで 50分間インキュベートし逆転写反応させた。この溶液を 70°Cで 15分 間インキュベートすることで、逆転写酵素を失活させ、さらに RNaseH (10 U/ il) 1 Iを加え、 37°C で 20分間インキュベートすることで、未反応 mRNAを分解し た。この逆転写反応で得られた溶液を cDNAライブラリー溶液 とした。 次に実施例 3にて同定した PBS分解酵素タンパク質（クチナーゼ）と、ァスペル ギルス'フミガタス由来の既知の類似酵素タンパク質の相同性の比較から、 18 塩基からなるミックスオリゴヌクレオチド
{5' - (
G)- 3'} と 15塩基からなるミックスオリゴヌクレオチド
{5'-
A)AT-3'} を合成した。この 1組のプライマーセットを用い、 cDNAライブラリーを 錶型として PCRを行い、サザンハイブリダィゼーシヨンのプローブを増幅した。
PCR用装置は PGR Thermal Cycler PERSONAL (宝酒造）を用し、た。 cDNAライ ブラリーは上記の cDNAライブラリー溶液を 1 |用い、ポリメラ一ゼは Ex taq polymerase (宝酒造)を用いた。増幅反応は、 95°C， 3分間錶型 DNAを変性し、 95°C, 1分間、 53°C，1 分間、 "72°C， 30秒間保持するサイクルを 30サイクルおこな つた後、 72°C， 1分間で完全伸長させ、 4°Cで保持した。得られた PCR増幅断片 をァガロースゲル電気泳動に供したところ、およそ 160塩基対からなる断片の増 幅が確認された。 次 Iこ、 NEN RandomPrimer Fluorescein Labeling Kit with
Antifluorescein-AP (Eizo Diagnostics, Inc.) を用いて実施例 3 (3—3) と同様 にサザンハイブリダィゼーシヨンをおこなった。ターゲットとして染色体 DMA 10 μ gを 50ユニットの/// "c【【 （宝酒造）または Sac【（宝酒造） と Hind【【【（宝酒造） で完全消化したものを用いた。その結果 HinC 1\ にて完全消化した場合約
2700 塩基対からなり、 Sac I と H/nd III にて完全消化した場合約 1800 塩基 からなる強くハイブリダィズするバンドが検出された。 次に、実施例 3 (3-3) に従ってコロニーハイブリダィゼーシヨンを行った。染 色体 DNA 10 jUgを 50ユニットの〃/ "C II (宝酒造）または Sac l (宝酒造） と Ηίηά III (宝酒造)で完全消化しァガロースゲル電気泳動に供しェチジゥムブ口 マイドで染色後、各々、 2700 塩基対、 1800 塩基対付近のゲルを UV照射下で 切り出した。ゲル中より prep A gene (BioRad) を用いて DNAを抽出し、これを揷 入 DNA断片とした。 次にプラスミド pBluescript II KS+ DNA (Stratagene) 2.5 μ gを Hindi (宝酒 造)または Sac l (宝酒造） と H//7d III (宝酒造）にて消化し、定法によリフエノール 抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後、アルカリフォスファタ一ゼ（宝酒造）に より 5 ' 末端のリン酸を除去した。この反応液を定法によリフエノール抽出、エタ ノール沈殿処理をおこなった後 TEに溶解したものをベクター DNA溶液とした。さ らに、前述の挿入 DNA 断片と連結させることで、連結 DNA 溶液を得た。これ ら連結 DNA 溶液を用いて大腸菌 DH5 株を形質転換し、コロニーハイブリダ ィゼーシヨンに供した。その結果ポジティブシグナルを得た。 次に元の寒天培地上からポジティブシグナルとなるプラスミド DNAを有する大 腸菌から実施例 3 (3-3) に記した方法によりプラスミド DNA溶液を得た。このプ ラスミド DNA中の挿入 DNA断片の塩基配列を解析した。その結果、プラスミド DNA に挿入された 2713 塩基対からなる染色体 DNA の Hfnc \\ 消化断片 には、プローブの塩基配列を含むオープンリーディングフレームが見出され (配 列表 4)、また 1801 塩基対からなる染色体 DNA の Sac 1/ H'nd III 消化断片 には、プローブの塩基配列を含むオープンリーディングフレームが見出された (配 列表 5)。この 2 種のオープンリーディングフレームは各々 2 または 3 箇所の イントロン塩基配列を含み、さらに開始メチォニンをコードする塩基配列 ATG とストップコドンを含み、すなわち PBS 分解酵素類似体遺伝子の全長を有して いた。
(12-2) PBS 分解酵素ならびに PBS 分解酵素類似体の大腸菌を宿主とした 発現系の構築
実施例 3 に記した PBS 分解酵素遺伝子、ならびに前述の 2 種の PBS 分解酵素類似体遺伝子を含む cDNA ライブラリーを錶型として PGR を行い、 大腸菌用発現プラスミド （pET- 12b; Novagen) に揷入すべく PCR 断片を調製 した。前述の PBS存在下での培養時に発現している遺伝子群を含む cDNA ライブラリーに対して、 PBS 分解酵素遺伝子に対しては、
5' -TGCAGTGGCGGATCCGGTGGAC-3' と
5' -GACCGGATGGATCCCGAAAATTTATCC-3' のオリゴヌクレオチドプライマ —セットを、麹菌ゲノム中にて 2713 塩基対のオープンリーディングフレームから なる PBS 分解酵素類似体遺伝子に対しては、 5 '
-GGCAGCAGGGGATCCCATCGCTG-3' と 5 '
-CGTAGCCCACACTCGGATCCTAAGCTGAC-3'のオリゴヌクレオチドプライマ —セットを、麹菌ゲノム中にて 1801 塩基対のオープンリーディングフレームから なる PBS 分解酵素類似体遺伝子に対しては、 5 '
-GGCGGCTGCGGATCCAGTAGATATC-3' と 5 '
-CAGTTCAGGGGGATCCTATAGAGTCC-3' のオリゴヌクレオチドプライマーセ ッ卜を合成し、 PCR に用し、た。 PGR用装置は PCR Thermal Cycler PERSONAL (宝酒造）を用いた。 cDNAライブラリ一は上記の cDNAライブラリー溶液を 1 1 用し、、ポリメラーゼは Ex taq polymerase (宝酒造）を用いた。増幅反応は、 95°C, 3分間錶型 DNAを変性し、 95°C， 1分間、 57°C，1 分間、 72°C， 1 分間保持する サイクルを 30サイクルおこなった後、 72°C， 1 分間で完全伸長させ、 4°Cで保持 した。得られた PGR増幅断片を β3/ηΗ I (宝酒造）で消化し、ァガロースゲル電 気泳動に供しェチジゥムブロマイドで染色後 UV 照射下で各々、 625 塩基対、 650 塩基対、 759 塩基対からなる断片を切り出した。ゲル中より prep A gene (BioRad) を用いて DNA を抽出し、これを挿入 DNA 断片とした。次に塩基配 列中に T7 プロモーター配列とシグナル配列 （OmpT- leader sequence) を有 するプラスミド pET- 12b (Novagen) DNA 5 Ug をシグナル配列の直後にある 制限酵素 Sa H〖 認識配列の位置で SamH l (宝酒造）で消化し、定法によ リフエノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後、アルカリフォスファタ一ゼ (宝酒造）により 5' 末端のリン酸を除去した。この反応液を定法によリフエノー ル抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後 TE に溶解したものをベクター
DNA 溶液とした。次に、ベクター DNA 1 U g と挿入 DNA 断片 1.5 jU g を T4 DNA ligase (宝酒造）により連結させ、連結 DNA 溶液を得た。この連結 DNA 溶液 を用いて大腸菌 DH50T (宝酒造）を形質転換し、各々のプラスミド DNA を保持する形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌の培養菌体中より 前述と同様にプラスミド DNA を抽出し、この大腸菌形質転換用プラスミド
DNA を得た （pET— cut， pET-cuthom1, pET—cuthom2)。このプラスミド DNA 1 g を 用い前述と同様にして、大腸菌 BL21 - SI (Invitrogen) を形質転換し、 NaCI を含まない 50 jt g/ml のアンピシリンを含む LB 寒天培地上にて各々 の形質転換株を取得した。 次に PBS 分解酵素遺伝子が挿入されたプラスミド DNA を用いて形質転 換された大腸菌形質転換株 （pET- cut) と、 PBS 分解酵素類似体遺伝子が 挿入されたプラスミド DNA を用いて形質転換された大腸菌形質転換株 1 種 (pET-cuthom1、 pET-cuthom2)と、揷入されてし、なし、 （PET-1 2b にて形質転換 した） 大腸菌形質転換株のコロニーを白金針にて拾い、 LB 液体培地 （50 μ g/ml アンピシリン、 NaCI を含まない） にそれぞれ植菌した。植菌後 37°C, 1 6 時間振盪培養することで前培養とした。各々の前培養溶液 500 i l を 500 ml 容坂ロフラスコ内の 50 mlの LB 培地 （0.5 % NaGI を含む） に添加した。 添加 後 30°C にて 1 2 時間振盪培養することで、目的の酵素タンパク質を培養上 清中に誘導'発現させた。培養液 50 mlを 50 ml容マイクロチューブに移し、 8000 g, 10分間遠心分離し培養上清を得た。得られた培養上清に対して 0.1 (v/v ) となるように PBS 乳化液を添加し、 37°C にて保温し、その濁度の低下（PBS の分解）によって PBS 分解酵素の発現を確認したところ、 PBS 分解酵素遺伝 子および PBS 分解酵素類似体遺伝子が挿入されたプラスミド DMA により形 質転換された大腸菌形質転換株の培養上清中にのみその活性の存在が認め られた (表 8)。 [表 8]
Plasmid pET-12b pET-cut pET-cuthom1 pET-cuthom2
Name Blank Cut(L1 ) Homologuel HomologueZ
PBSA ND 83 57 19
Substrate
PLA ND 3 6 4
ND； not detected 次に上記と同様の方法で得られた培養上清に対して 0.1 (w/v ) となるよう にポリ乳酸 （PLA) 乳化液を添加し、 37°C にて保温し、その濁度の低下（PLA の分解）によって PLA 分解活性の有無を確認したところ、 PBS 分解酵素遺伝 子および PBS 分解酵素類似体遺伝子が挿入されたプラスミド DNA により形 質転換された大腸菌形質転換株の培養上清中にのみその活性の存在が認め られた（表 8)。すなわち実施例 3 で得られた PBS 分解酵素および、 2 種の PBS 分解酵素類似体にはポリブチレンサクシネート （PBS) 分解活性と併せて ポリ乳酸 （PLA) 分解活性をも有することが分かった。 (1 2-3)ィモチ菌由来の生分解性プラスチック分解酵素遺伝子群
これまでに麹菌ァスペルギルス'オリゼ由来の PBS分解酵素遺伝子及びその タンパク質の存在を確認したが、そこで麹菌の PBS分解酵素相同遺伝子を既 知の DNA及びプロテインデータベースに対して検索した後、図 1 9の系統樹を作 成した。相同遺伝子の多くが糸状菌（力ビ）由来であり、特に Magnaporthe w/sesには 8種の相同遺伝子の存在が確認された。そこで、 Magnaporthe grisealQ- 5株を以下の条件にて PBS乳化液若しくは PLA乳化液中で培養し、 その培養上清中の PLAおよび PBSの分解活性を測定した（表 9)。 即ち、 Voge卜 N 培地（2% Sucrose) にて 24°C、 4日間振盪培養した後、菌糸 体を濾過により取得し、 C源が各々 P B SA又は PLA乳化液（1 w/v %)に限定さ れた Vogd - N 培地に移し、 24°C、 2日間振盪培養した。各々の培養上清を濾 過及び遠心分離により取得し、各培養上清に PB SA乳化液又は P LA乳化液 を 0.1 (w/v %) となるように加え、 37 °Cにて 24時間インキュベートし、 O. D. 63 0を測定し、分解率（Degradation rario) を算出した。その結果、 "aporiAe gr!sea 70-1 5 株は PLA及び PBS分解活性を有することが明らかとなった。
[表 9 ]
Carbon source Substrate Degradation ratio (%)
PBSA PBSA ND
PLA PBSA 1 2
PBSA PLA 63
PLA PLA 30
ND； not detected 尚、図 1 9に示された各生分解性プラスチック分解酵素遺伝子のァノ亍一ショ ンに関する現時点での情報は以下の通りである。
Figure imgf000073_0001
Cut (L1 ) BAA07428.1 (protei n), GI (gene): 94981 3
Homologue 1， 2 遺伝子、タンパク質としては未登録
Aspergillus fu mi gat us
- Aspergillus fumigatus ゲノムデータべ一ス中において、 tblastn 検索の結果 見出された homologue であり、 annotated gene ではない。よって遺伝子、タン パク質としての登録は行われていない。
CutA contigue 4882 中に見出された遺伝子発現産物
CutB contigue 4865 中に見出された遺伝子発現産物
CutC contigue 481 2 中に見出された遺伝子発現産物
Aspergillus nidulans
- Aspergillus nidulans ゲノムデータベース中において、 tblastn 検索の結果見 出された homologue である。 genomic DNA として各 contigue 毎に登録され ているが、以下の 3 種については annotated gene 並びに cutinase としての 登録もない。
CutA AACD01 0001 22.1 (protei n), GI (gene): 29570975
CutB AACD01 0001 29.1 (protein), G【（gene): 29570982
CutC AACD01 000093.1 (protein), GI (gene): 29570946
Magnaporthe grisea
■Cut1 -8 についてはすべてゲノムデータベース中において、 annotati on 済み
■Cut1 のみがタンパク質的に cuti nase として確認されている。
■Cut2-8 Iこっし、て Iましヽずれ 于ータベース中 Iこおしゝて、 hyoothetical protei n して扱われている。
Cut1 P29292 (protein), GI (gene): 1345869， Locus: MQ 1943.3
Cut2 Locus: MG 02301.3
Cut3 Locus: MG 11108.3
Cut4 Locus: MG 03792.3
Cut5 Locus: MG 05798.3
Cut6 Locus: MG 02393.3
Cut7 Locus: MG 00734.3
Cut8 Locus: MG 09100.3 以下 4 種の cutinase は既知の遺伝子及びタンパク質で、その機能も確認さ れているものである。
Monilin!a fructicola Cut1 Q8TGB8 (protein), GI (gene): 29839372
Fusarium solani Cut1 K02640.1 (protein), GI (gene): 168145
Nectria ipomoeae Cut1 Q99174 (protein), GI (gene): 2493916
Nectria haematococca Cutinase Q96UT0 (protein), GI (gene):
20137890 以下の既知の遺伝子及びタンパク質は、その機能は確認されていないものであ る。
Pyrenopeziza brassicae Cut1 Q9Y7G8 (protein), G【（gene): ： 29839423
Botryotina fuckelian Cut1 W00298 (protein), GI (gene): 2493915
Blumeria graminis Cut1 Q8X1P1 (protein), GI (gene): 29839380
Colletorichum capsici Cut1 P10951 (protein), G【（gene): 117650
Glomerella cingulata Cut1 P11373 (protein), G【（gene): 117651
Alternaria brassicicol Cut1 P41744 (protein), GI (gene): 1169141
Ascochyta rabiei Cut1 P29292 (protein), GI (gene): 1 7649
Mycosphaerella rabiei Cut1 P29292 (protein), GI (gene): 117649 3 011861
73 実施例 1 3
( 1 3 )麹菌ァスペルギルス-オリゼからの生分解性プラスチック結合タンパク質と 高発現株の育種 (1 3- 1 )生分解性プラスチック結合タンパク質（PbPA、PbpB )遺伝子の取得 ァスペルギルス 'ォリゼの染色体 DNAより生分解性プラスチック結合タンパク 質 PbpA、 PbpBのクローニングを行った。そしてァスペルギルス .ォリゼの PbpA高 発現株の育種を行ったのでその過程を以下に示す。
[方法]
3 L容の三角フラスコに 1 (w/v %) となるように PBS 乳化液を含み、唯一の 炭素源とした Gzapek- Dox 培地を 750 ml調製し、ァスペルギルス 'ォリゼ
RIB40 株の胞子懸濁液を終濃度 1 .0 X 1 06となるように接種して 5日間振盪培養 した。その培養液をミラクロスで濾過し菌体を除いた。その濾液を 20 % の硫酸 アンモニゥムで飽和させ 1時間氷冷し、 1 0,000 X 、 4°Cにて 30分間遠心分離に よる沈殿を除去した。その上清を 1 0 mM Tris- HGI 緩衝液， pH 8.0, 20 % 飽和 硫酸アンモニゥムで飽和させたォクチルーセル口ファイン カラム （生化学工業） に供し、硫酸アンモニゥム濃度 20- 0 %の直線勾配で吸着タンパク質の溶出を 行った。溶出フラクションに対して SD S- P AG Eを行い溶出タンパク質の確認を行 つた。 SDS- PAGE後のゲルはシルベストスティン， PAGE蛋白質用（ナカライテク ス）を用いて行い、方法は説明書に記載されている方法に基づいて行った。 硫酸アンモニゥム 0 % 飽和付近に分子量約 1 4 kDaのタンパク質の存在を確 認した（図 20)。このタンパク質は疎水クロマトグラフィーの硫酸アンモニゥム濃 度 0% 飽和付近で溶出したことから、疎水性が高いタンパク質であることが考え られた。このタンパク質の N末端配列の解析を行ったところその配列は
DASAVLADFNTLSTであった。 11861
74
この配列を Aspergi〃us oryzae EST blast search
(http://www.nrib.go.jp/ken/EST/db/blast.html) にて相同性検索を行った結 果、 138残基のアミノ酸配列と相同性を示した。この 138アミノ酸残基を日本
DNAデータバンク（http：〃 www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html)にて相同性検 索を行った結果メタリジゥム'ァニソプリエの産生する 4MeSタンパク質と相同性 を示した。また、 138アミノ酸残基をァスペルギルス'フミガタスのゲノムデータべ ース（http：〃 www.tigr.org/tdb/e2k1/afu1/)上で相同性を確認したところ、コン ティグ 4875内に含まれる配列と、コンティグ 4820内に含まれる配列と相同性を 示すことが明らかとなった 。
尚、以上の相同性 (パーセント)に関する具体的な値を表 10に示した。
[表 10]
Figure imgf000076_0001
そこでこの両者の配列を基に、ァスペルギルス 'ォリゼの染色体 DNAからクロ 一二ングを試みることとした。 ァスペルギルス■フミガタスの相同配列とァスペルギルス 'ォリゼのコドン頻出 頻度（http://www.kazusa.orjp/codon/)を参考にして二組のオリゴヌクレオチド (5' -ATGCTCGCCAAGCACGTC-3'、 5' -GGCCTTCTTGTACTCGGC-3' )、 ( 5' -GACGCAATCTCCACCAC-3'、 5' - TGAAAGGGATGGGCAATGTG - 3' )を 設計した。この 2組のプライマーセットを用い、染色体 DNA を錶型として PGR をおこないサザンハイブリダィゼーシヨン用のプローブを増幅した。 PCR 用装置 1861
75 は PGR Thermal Cycl er PERSO NAL (宝酒造）を用いた。染色体 DNA は
1 00 ng 用い、ポリメラーゼは Ex taq polymeras （宝酒造）を用いた。增幅反応 は、 95°C， 3分間錶型 DNA を変性し、 95°C, 1分間、 50°C，1分間、 72°C, 30 秒 間保持するサイクルを 30 サイクルおこなった後、 72°C, 1分間で完全伸長させ 、4°Cで保持した。得られた PGR 増幅断片をァガロースゲル電気泳動に供した ところ、約 570塩基対と約 300塩基対からなる断片の増幅が確認された。 次 Iこ、 NEN RandomPrimer Fl uorescei n Labeli ng Kit with
Antifluorescein-AP (Eizo Diagnostics, Inc.) を用いて実施例 3 (3-3) と同様 にサザンハイブリダィゼ一シヨンをおこなった。ターゲットとして染色体 DNA 1 0 i g を 50 ユニットの EcoR Bamhn (宝酒造）それぞれで完全消化したもの を用いた。サザンハイブリダィゼ一シヨンの結果^^ ?〖 消化断片に対して約 570 塩基対プローブを用いた時に約 3000塩基対からなるバンドが検出され、 BamH \ 消化断片に対し 300塩基対のプローブを用いた時に 2000塩基対からなるパンド が検出された。 次に、染色体 DNA 1 0 μ g を 50 ユニットの fcoRI、 5amH〖 それぞれで完 全消化しァガロースゲル電気泳動に供しェチジゥムブロマイドで染色後 3000塩 基対および 2000付近のゲルを UV 照射下で切り出した。ゲル中より prep A gene (BioRad) を用いて DNA を抽出し、これを揷入 DNA 断片とした。 次にプラスミド pBluescript II KS+ DNA (Stratagene) 2.5 U g を oRI、 Bam l それぞれで (宝酒造）にて消化し、定法によリフエノール抽出、エタノー ル沈殿処理をおこなった後、アルカリフォスファタ一ゼ（宝酒造）により 5 ' 末端 のリン酸を除去した。この反応液を定法にょリフヱノール抽出、エタノール沈殿 処理をおこなった後 TE に溶解したものをべクタ一 DNA 溶液とした。さらに、 前述の挿入 DNA 断片と連結させることで、連結 DNA 溶液を得た。これら連 結 DNA 溶液を用いて大腸菌 DH5 株を形質転換し、コロニーハイブリダィゼ - P T/JP2003/011861
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—シヨンに供した。その結果ポジティブシグナルを得た。 次に元の寒天培地上からポジティブシグナルとなるプラスミド DNAを有する大 腸菌から実施例 3 (3 - 3) に記した方法によりプラスミド DNA溶液を得た。このプ ラスミド DNA中の挿入 DNA断片の塩基配列を解析した。その結果、プラスミド DNA に揷入された 3008、及び 2004塩基対からなる染色体 DNA の £coR【、 BamHl それぞれの消化断片には、約 570、 300塩基対それぞれのプローブの 塩基配列を含むオープンリーディングフレームが見出された。前者のオープンリ ーデイングフレームは 584塲基対 （PbpA - 配列表 6) で後者は 561塩基対
(PbpB - 配列表 7) であり、変換された推定アミノ酸配列はそれぞれ 174残基及 び 186アミノ酸残基であった。また、前者オープンリーディングフレームは 1箇所 のイントロン塩基配列を含み、後者はイントロンを含んでいなかった。 両アミノ酸配列と麹菌 ESTデータベースより得られた 138アミノ酸を比較した結 果、前者のものと 100 %の相同性を示した。したがって前者の配列が目的のタン パク質であることが明らかになった。
(13-2) PBS結合タンパク質高発現麹菌の育種 PBS結合タンパク質高発現系の構築（図 21)
クローニングされた目的遺伝子の周辺塩基配列を参考に一組のオリゴヌクレ ォチド、を設計した（5 '-CTTGCATTCAAGTCGACCTGAACAC-3'、
5 '-CTATTGAACTATGCTTCTAGAAGGCCTAATC-3' )。ァスぺ ^ (レギレス "才リ ゼ RIB40株のゲノム DNAをテンプレートとして PCR反応を行った。增幅反応は、 95°C， 3 分間錶型 DNA を変性し、 95°C， 1 分間、 60°C,1 分間、 72°C， 30 秒 間保持するサイクルを 30 サイクルおこなった後、 72°C， 1 分間で完全伸長させ 、4°Cで保持した。その PGRによる増幅断片をァガロース電気泳動にて確認を行 つたところ約 730塩基対の増幅が見られた。この増幅断片を 【（宝酒造）及び P T/JP2003/011861
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Xba I (宝酒造）で消化し、その消化断片をァガロースゲル電気泳動に供したゲ ル中より prep A gene (BioRad) を用いて DNA を抽出し、これを揷入 DNA 断片とした。次に塩基配列中にグルコアミラーゼのプロモータ一配列 （PglaA 1 42) を有するプラスミド pNGA1 42 DNA 5 g を Sa/ I及び ^ a【で消化し、定法 によリフエノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後、アルカリフォスファタ ーゼ（宝酒造）により 5 ' 末端のリン酸を除去した。この反応液を定法にょリフ ェノール抽出、エタノール沈殿処理をおこなった後 TE に溶解したものをべクタ ― DNA 溶液とした。次に、ベクタ一 DNA 1 ju g と揷入 DNA 断片 1 .5〃g を T4 DNA ligase (宝酒造）により連結させ、連結 DNA 溶液を得た。この連結 DNA 溶液 を用いて大腸菌 DH5 （宝酒造）を形質転換し、各々のプラスミド DNA を保持する形質転換大腸菌を得た。形質転換大腸菌の培養菌体中より 前述と同様にプラスミド DNA を抽出し、この麹菌形質転換用プラスミド DNA を得た実施例 3 (3-3) に記した方法により培養菌体中よりプラスミド DNA を 抽出し、麹菌形質転換用プラスミド DNA を得た。このプラスミド DNA 1 0〃g を で消化し、定法によリフエノール抽出、エタノール沈殿処理をおこな つた後 1 0 1 の TE に溶解し形質転換用 DNA 溶液とした。以降のァスペル ギルス 'ォリゼの形質転換については実施例 7 (7-1 -2) に記した方法を踏襲し て行い、形質転換体を得た。また胞子 PGR 用プライマーとして、 2 種のオリゴ ヌクレオチド (5， - CTTGCATTCAAGTCGACCTGAACAC -3 ' ,
5 ' -GTAGAATCACGAATGGAGCCTTTGACGACC-3 ' ) を合成した。 PCR 用装 置は PCR Thermal Cycler PERSONAL (宝酒造）を用いた。ポジティブコント口 ールとして麹菌形質転換用プラスミド DNAを錶型とした。ポリメラーゼは Ex Taq polymerase (宝酒造）を用いた。増幅反応は、 94°C， 3 分間錶型 DNA を 変性し、 94°C， 1 分間、 55.5°C，1 分間、 72°C, 90 秒間保持するサイクルを 30 サイクルおこなった後、 72°C, 95秒間で完全伸長させ、 4°Cで保持した。得られた PCR 増幅断片をァガロースゲル電気泳動に供したところ、ポジティブコントロー ルと同じ位置に PGR 断片の増幅が確認され、その結果より染色体 DNA 上 にグルコアミラーゼ 'プロモーター配列の下流に 目的遺伝子が連結した塩基配 2003/011861
78 列が挿入されたことと、それを有するァスペルギルス 'ォリゼ形質転換株が得ら れたことが確認された。この 目的遺伝子が染色体 DNA 中に挿入されたァス ペルギルス 'ォリゼ形質転換株と、挿入されていない（PNGA142 にて形質転換 した）ァスペルギルス 'ォリゼ形質転換株の胞子懸濁液を 0.5 x 10s 個胞子 /ml となるようにダルコアミラーゼ'プロモーターの誘導物質であるマルトースを 含む 100 ml の YPM液体培地 〖実施例 2 (2-2)} にそれぞれ添加した。添加 後 30°C, 125 rpm, 16 時間培養し、培養上清を MIRAGLOTH
(CALBIOCHEMe) にて濾過することで得た。培養上清 100 il に 50/il の冷ト リクロロ酢酸を加えよく混合した後、氷中で 20 分間放置し、 15000 4°C， 15 分間遠心分離し上清を完全に除き、沈殿画分を得た。これに 15 I の SDS 化溶液 ί実施例 2 (2-2)} に溶解させたあと、沸騰湯浴中に 5分間放置し SDS 化をおこなし、、これをサンプルとした。以後の SDS- PAGEの方法は実施例 2 (2-2) に記した通りとした。 SDS-PAGE に供した結果、目的遺伝子が染色体 DNA 中に挿入されたァスペルギルス 'ォリゼ形質転換株の培養上清中にのみ 目的タンパク質の位置（約 14 kDa)にバンドが観察された（図 22)。その後、電気 泳動したゲル中よりタンパク質を PVDF 膜に転写し、 PVDF膜上より 約 14 kDa のバンドを切り抜き、そのままァミノ末端アミノ酸配列の解析をおこなった。解析 の結果アミノ末端から DASAV であったことこから、この約 14 kDaタンパク質が 目的タンパク質であることが確認された。
(13-3) PbpA高発現株の疎水表面上での生育
090mmのプラスチックシャーレに 20 gの粒状 PBS(1 mm3)を入れ、 15 mlの YPM液体培地を加えて、良くかき混ぜ YPM培地を均一にした。その培地上に前 述した高発現株、ハイド口ホービン高発現株、そして野性株の胞子を 108個接種 した後、良くかき混ぜ胞子を均一にした。またポリウレタン製の家庭用スポンジ を縦、横 6 cm,高さ 1 cmに切り取り、十分に YPM液体培地をしみ込ませた。そ の中心部に約14 kDaタンパク質高発現株、ハイド口ホービン高発現株、そして 野性株の胞子を 108個接種した。この両培地を 30°Cにて 7日間培養を行ったとこ ろ、疎水表面上での約 1 4 kDaタンパク質及びハイド口ホービン高発現株の生育 は明らかに野性株のものを上回り旺盛な生育を示した（図 23)。このことから今 回高発現を行ったこのタンパク質は、実施例 1 にて見出されたハイド口ホービ ンと同様に、カビが PBSのような疎水表面上に展開するための補助因子であり 、疎水表面への吸着を促すものと考えられた。そこで、このタンパク質を PBS binding protei n とし、 PbpAとした。そして PbpAのクローニングの際に得られた相 同配列を PbpBとした。
(1 3-4)/" 1 / oでの PbpAの PBSへの吸着
PbpA高発現株の胞子をを 750 mlの YPM液体培地に 1 06 (/ml)になるように接 種して 2日間培養を行った。その培養液をミラクロスにて濾過し、その濾液に 60 %になるように硫酸アンモニゥムを加え 1時間氷冷した。 1 0,000 X g、 4°Cにてその 濾液を遠心分離し沈殿物を除去した。その遠心上清ををォクチルーセルロフアイ ンカラム（生化学工業）、デァエーセル口ファインカラム（生化学工業）、 S-セファ ロースカラム FF (フアルマシア）に供し PbpAを SDS— PAGE的に単一バンドになる まで精製を行った。
1 0 mM Tris-HCI (ρΗ 8·0)Ζくッファーに濃度力《0、 1 0、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90 %になるように硫酸アンモニゥムを加えた。それぞれ 1 mlのバッファーに 対して 0.2 gの PBS粉末（1 mm3)を加えよく懸濁した。この PBS懸濁液に対して PbpA精製標品（0.1 mg/ml )を 1 00 1加えて 30°Cにて 3時間振盪（125 rpm )し、 吸着処理を行った。この混合液をフィルター（孔径 0.2 jU mミリポア）に通して完全 に PBSを除き、その濾過液を SDS- PAGEに供した（図 24)。 その結果、硫酸アンモニゥム濃度 0、 1 0、20 % 時の濾過液中には PbpAの存 在が確認されたが 30 %以降は濾過液中に PbpAは見られなかった。この結果よ リ PbpAは硫酸アンモニゥム 30%存在下で PB Sに吸着していることが示唆される。 T JP2003/011861
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(1 3- 5)PbpA相同遺伝子
以上、 Aspergillus oryzaeには PBSなどの生分解性プラスチック表面への吸着 因子 PbpA及びび PbpBが存在することを示した力 既存の DNAデータべ一ス検 索から、カビ ァスペルギルス-フミガタスとメタリジゥム 'ァニスプリエに相同遺伝 子が存在することが見出された (図 25)。これら遺伝子産物の機能はこれまで全 く推定されていなかったが、 PbpAの結果から、同様にプラスチック吸着機能を有 するタンパク質と考えられる。 尚、図 25に示された各 PbpA及び PbpB相同遺伝子のァノ亍一シヨンに関する 現時点での情報は以下の通りである。
Aspergillus oryzae PbpA
Aspergillus oryzae PbpB
本実施例に記載。
Aspergillus fumigatus conti g 4875内の酉己列
PbpAと相同性を示す配列で塩基配列、アミノ酸配列共にん fumigatus の ゲノムデータベースより取得された。発現は確認されておらず、機能未知。
Aspergillus fumigatus contig 4820内の酉 Sタ
PbpBと相同性を示す配列で塩基配列、アミノ酸配列共にん m の ゲノムデータベースより取得された。発現は確認されておらず、機能未知。
Metarhizium anisopliae 4MeS
ACCESSION No. AF01 2092 (Nucleotide), ACCESSION No. AAB6931 1
(Protein)
M. anisopliae を培養時の cDNAから得られた配列。培養条件は不明。機 能も全く分かっていない。 実施例 1 4 (14)生分解性プラスチックと他のマテリアルとの複合材料からの生分解性ブラ スチックの選択的分解
生分解性プラスチック複合材料から生分解性プラスチックを分解酵素により 選択的に分解し、生分解性プラスチックはモノマー及びオリゴマーとして可溶性 区分に回収し、もう一方の複合材料を回収する。 今回、複合材料の一方は白金線、生分解性プラスチックには PBSを用いた。 分解酵素には実施例 3に記載した PBS分解酵素精製標品（クチナーゼ）を用い た。 100ml容ビ一力一内に 20(w/v %)となるように 20mlのクロ口ホルムに 4 g PBS を溶解した。この溶液にひたした 00.5mm白金線を取り出した後、乾燥させ表面 を PBSで被膜した金属（白金線）断片を得た。 12mm X 90mm試験管中にて蒸留 水で洗浄した 0.5mm X 8mmの PBS被膜金属断片に対し、 600 / l の 120 g/ml PBS分解酵素溶液（50mM 卜リス—塩酸緩衝液， pH9.0)を加え、 37°Cにて、 1 N NaOHにて pHを 9.0に保持しながら 7日間保温した（コントロールとして 50mM トリ スー塩酸緩衝液， pH9.0を用いた）。その結果、酵素添加区において PBS被膜が 選択的に分解され金属断片は固型物として回収された (図 26)。この結果より、 生分解性プラスチックと他の材料との複合材料より、生分解性プラスチックとも う一方の複合材料を分別して回収可能なことを示している。 実施例 15
(15- 1)クチナーゼによる PBSフイルムの分解に対する Rol Aの 分解促進効果 76 X 26mm のスライドガラス （MATSUNAMI)社製 に同じ大きさに切り出した PBS フィルムに lOmM Tris— HGI buffer pH8.0 に溶解した RolA ( 2.5〃 g/ml) を 10〃1しみ込ませたろ紙（1。012)^ 3^3 を置き、 12時間 ， 30°Cで反応させ た。コントロールには、 Rol Aが溶解している bufferを 10 1しみ込ませたろ紙
(1cm2) を PBS フィルム上に置いた。 12 時間後 20jUg/ml 濃度の cutinase 10 /ilをろ紙に加え 6 時間 ， 37°Cで分解反応を行った。分解反応後、ろ紙を置い ていた所が白く濁っているのが観察された。濁度は RolA を前もって吸着させ ていたろ紙の方が高ぐ Rol Aを吸着させていなかった方の濁度は低かった。予 備実験の結果より CLitinase による PBS フィルム分解では、 PBS 分解率が高 い程、 cutinase 接触面が白濁することが、分かっている。これらの結果から、 Rol Aによる cutinase の PBS 分解が促進されることが分かった（図 27)。図 27 では白黒が反転して表示されており、黒い部分が分解を示している。
(15-2) クチナーゼによる PBS 乳化液の分解に対する RolAの 分解促進効果 96穴マイクロタイタ一プレー卜に 0.1w/v に調整した PBS 乳化液 89.5 ilを入 れ、そこに 10mM Tris-HGI buffer pH8.0 に溶解した RolA ( 250ng/ml) を 10 μ\ 加え 12時間 ， 30°Cで Rol A の PBS への吸着反応を行った。コントロー ルとして Rol A の替わりに 10mM Tris— HGI buffer pH8.0 を 10〃I PBS 孚 L化 液に加えたものを用いた 吸着反応後、 10mM Tris- HGI buffer pH8.0 に溶解した 1mg/ml 濃度の cutinase を 0.5 l加え 40°Cで分解反応を行い、 30 分毎に PBS の濁度を 630nm の波長で吸光度を測定し PBS 分解率を算出した（図 28)。結果として PBS 分解率に有意な差が確認されたため、 PBS 乳化液中での Rol Aによる PBS 分解促進効果が認められた。
(15- 3)クチナーゼによる PBSフィルムの分解に対する PbpAの分解促進効果
Pbp Aは硫酸アンモニゥム 30%以上の水分活性の低い状態条件で PB Sに吸着 する。そこで PBSフィルム上で PbpAを乾燥させることで水分活性を下げ、 PbpA が PBSに吸着している状態でクチナーゼによる PBS分解を試みた。
PbpAの精製標品を精製水で希釈し、 1.0、 5.0、 10、 50、 100 (j! g/ml) の濃度 こ調整した。それぞれの濃度の PbpA溶液 10 1を PBSフィルム上にスポットし 37 °Cにて完全に乾燥させ PbpAの PBSに対する吸着を促した。 PBSフィルム上に吸 着した PbpA状に直径 6 mmの濾紙を静置し、 10 Iのクチナーゼ溶液（ 20 g/ml )をしみ込ませた。この状態の PBSフィルムを 37°Cで 6時間保温し PBSフィルムの 分解を観察した。 反応後の PBSフィルムを観察したところ、 100、 50( g/ml)の PbpAをスポットし た部分では濾紙を静置した部分全体に有為な PBSの分解が観察された (図 29) 。そして 10、 5.0 (〃 g/ml)の PbpAをスポットした部分では、 10 jUlの PbpA溶液をス ポットした部分にのみ有為な分解が観察された。したがって、 PbpAが PBSに吸 着した場合においてより有効にクチナーゼの分解が促進されることが明らかに なった。
(15-4) クチナ一ゼによる) PBSフィルムの分解に対するハイド口ホービン及び
PbpAと人工界面活性剤との分解促進効果の比較
実施例 15- 1、 15 - 3においてハイド口ホービンと PbpAがクチナーゼによる PBSを 促進することが確認された。これらのバイオサーファクタントが人工界面活性剤 と比較した場合に有意に促進効果を示すかどうかを検討した。本実験では人 ェ界面活性剤としてプライサーフ A210G (第一工業製薬）を用いた。 実施例 15-1、 15- 3において促進効果が観察された濃度（ハイド口ホービン： 2.5jUg/ml、 PbpA: 10〃 g/ml)のバイオサ一ファクタントを PBSのフィルム上に実 施例 15-1、 15- 3の方法に従って吸着させた。また、同様に 2.5 g/mし 10〃 g/mlのプライサーフ A210Gを PBSフィルム上に吸着させた。このとき界面活性成 分を含まないコントロールとしてハイド口ホービンの場合は 10mM Tris- HCIバッフ ァー (pH 8.0)を、そして PbpAの場合は精製水を用い、同様に吸着処理を行った 。吸着しているバイオサープアクタントとプライサーフ A OGを被うように直径
6mmの濾紙を静置し、 10mM Tris-HCI バッファ一（pH 8.0)に溶解している 10 I のクチナーゼ溶液（20 g/ml)をしみ込ませた。この PBSフィルムを実施例 15 - 1 03 011861
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、 1 5- 3に記載されている条件で反応を行った（ハイド口ホービン： 30°Cにて 1 2時 間、 PbpA: 37°Cにて 6時間）。反応後の PBSフィルムを精製水で洗浄後、乾燥さ せた後に観察を行った。 その結果、 PBSフィルム状の両バイオサーファクタントを吸着させた部位はコン トロールと比較して PBSが有意に分解されていた（図 30)。そしてプライサーフ A21 0Gを吸着させた部位においては、コントロールと比較した場合に有意な PBS の分解は観察されなかった（図 30)。尚、 P B Sのフィルムを透過画像として取り 込んだので、図 30において PB S分解部分は黒色で表されている。このことから ハイド口ホービンや PbpAといったバイオサーファクタントはプライサ一フ A21 0Gの ような人工界面活性剤よりも強力にクチナーゼの PB S分解を促進することが明 らかになつた。 産業上の利用可能性 本発明はプラスチック結合性タンパク質等のバイオサーファクタントがプラス チックの疎水表面に吸着し、それによつて、プラスチック分解酵素と共同してブラ スチックの分解を有効に促進することできる、という新たな知見に基づくものであ る。
'
従って、本発明においては、バイオサーファクタントの存在下でプラスチックを より効果的に分解する方法が提供される。更に、バイオサーファクタントとブラ スチック分解酵素を生産する微生物、或いは、あるいはバイオサーフケクタン 卜及び 又はプラスチック分解酵素そのものを活用することで、高密度のブラ スチックの大規模分解を効率的に進行させることが可能となり、更に、酵素タ ンパク質や抗生物質などの有用物質生産性の高い微生物（糸状菌ゃ放線 菌）を用いることによって、有用物質の生産も同時に行うことができる新規な 方法を提供することが出来る。

Claims

請求の範囲
1 . バイオサ一ファクタン卜の存在下でプラスチックを分解する方法。
2. バイオサーファクタン卜がプラスチック結合性タンパク質である、請求項 1 記載の方法。
3. プラスチック分解酵素を用いてプラスチックを分解する、請求項 1又は 2 記載の方法。
4. バイオサーファクタントがプラスチックに効果的に吸着するように両者間の 疎水的相互作用が強まるような条件下でバイオサーファクタントをプラスチックと 混合することを含む、請求項 1、 2又は 3記載の方法。
5. 低水分活性状態で イオサーファクタントをプラスチックと混合するステツ プ、高水分活性状態でプラスチック分解酵素によりプラスチックを分解するステ ップからなる、請求項 4記載のプラスチックの分解法。
6. 高塩濃度状態でバイオサーファクタントをプラスチックと混合するステップ 、低塩濃度状態でプラスチック分解酵素によりプラスチックを分解するステップ からなる、請求項 5記載のプラスチックの分解法。
7. プラスチックにァスペルギルス 'ォリゼ又はァスペルギルス'ソーャを接触 させ、ァスペルギルス'オリゼ又はァスペルギルス-ソーャがその場で産生する バイオサーファクタント及びプラスチック分解酵素の作用によりプラスチックを分 解することから成る、請求項 1ないし 6のいずれか一項に記載の方法。
8. プラスチックに微生物を接触させ、微生物の作用によりプラスチックを分 解し、更に、分解されたプラスチックの成分を微生物により有用物質に転換する こと力、ら成る、プラスチックから有用物質を製造する方法。
9. 有用物質が、タンパク質、一次代謝産物、二次代謝産物、及びパイォサ 一ファクタントから成る群から選択されることを特徴とする請求項 8に記載の方 法。
1 0. 有用物質が菌体外に分泌される物質であることを特徴とする、請求項 8 ないし 9のいずれか一項に記載の方法。
1 1 . 有用物質の生合成系に関与する酵素をコードする遺伝子によって組換 られ、該酵素を高発現する形質転換菌を使用することを特徴とする、請求項 8 ないし 1 0のいずれか一項に記載の方法。
1 2. 界面活性物質及び 又はプラスチック分解酵素を共存させることにより、 プラスチックの分解を促進することを特徴とする、請求項 7ないし 1 1のいずれか 一項に記載の方法。
1 3. 界面活性物質及び/又はプラスチック分解酵素を反応系の外部より添 加して、プラスチックの分解を促進することを特徴とする、請求項 1 2に記載の方 法。
1 4. バイオサーファクタン卜及び/又はプラスチック分解酵素をコードする遺伝 子によって組換えられ、界面活性物質及び Z又はプラスチック分解酵素を高発 現する形質転換菌を使用することを特徴とする、請求項 1 2又は 1 3に記載の 方法。
1 5. バイオサ一ファクタン卜及び 又はプラスチック分解酵素をコードする遺伝 子が構成的発現プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項 1 4に 記載の方法。
1 6. バイオサーファクタン卜及び/又はプラスチック分解酵素をコードする遺伝 子が誘導型発現プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項 1 4に 記載の方法。
1 7. 界面活性物質としてバイオサーファクタントを用いることを特徴とする、請 求項 1 .2ないし 1 3のいずれか一項に記載の方法。
1 8. バイオサーファクタント及び 又はプラスチック分解酵素の共存下で、プ ラスチックに微生物を接触させ、微生物の作用によりプラスチックを分解するこ とから成る、プラスチックを分解する方法。
1 9. バイオサーファクタント及び 又はプラスチック分解酵素を反応系の外部 より添加して、プラスチックの分解を促進することを特徴とする、請求項 1 8に記 載の方法。
20. バイオサーファクタント及び/又はプラスチック分解酵素をコードする遺伝 子によって組換られ、バイオサーファクタン卜及び 又はプラスチック分解酵素を 高発現する形質転換菌を使用することを特徴とする、請求項 1 8又は 1 9に記 載の方法。
21 . バイオサ一ファクタン卜及び 又はプラスチック分解酵素をコードする遺伝 子を構成的発現プロモーターの制御下で発現させることを特徴とする、請求項
20に記載の方法。
22. バイオサーファクタント及び Z又はプラスチック分解酵素をコードする遺伝 子を誘導型発現プロモーターの制御下で発現させることを特徴とする、請求項 20に記載の方法。
23. ァスペルギルス属カビ由来のバイオサーファクタント及び Z又はプラスチ ック分解酵素を用いることを特徴とする、請求項 1 8ないし 22のいずれか一項に 記載の方法。
24. ァスペルギルス属カビがァスペルギルス 'ォリゼであることを特徴とする、 請求項 23に記載の方法。
25. プラスチック分解酵素がエステラーゼ、プロテアーゼ、ぺプチダーゼ、リパ ーゼ、クチナーゼ、セリンハイドロラーゼ、及びそれらの混合物から成る群から選 択されることを特徴とする、請求項 1 8ないし 24のいずれか一項に記載の方法
26. バイオサーファクタン卜としてハイド口ホービン、プラスチック分解酵素とし てクチナーゼを用いることを特徴とする、請求項 1 8ないし 25のいずれか一項に 記載の方法。
27. プラスチックが生分解性プラスチックである、請求項 7ないし 26のいずれ か一項に記載の方法。
28. プラスチックがポリエステル、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニ ール、ナイロン、ポリスチレン、デンプン、及びそれらの混合物から成る群から選 択されることを特徴とする、請求項 27に記載の方法。
29. ポリエステルがポリブチレンサクシネート、ポリ乳酸、ポリブブチルサクシネ 一卜 'アジペート、脂肪族ポリエステル、及びポリ力プロラクトンから成る群から選 択されることを特徴とする、請求項 28記載の方法。
30. 微生物が糸状性細菌であることを特徴とする、請求項 7ないし 29のいず れか一項に記載の方法。
3 1 . 糸状性細菌が放線菌であることを特徴とする、請求項 30に記載の方法 。
32. 放線菌がストレブ卜マイセス属であることを特徴とする、請求項 3 1に記載 の方法。
33. ストレブトマイセス属がストレブトマイセス 'グリゼウスまたはストレブ卜マイ セス■セリカラーであることを特徴とする、請求項 32に記載の方法。
34. 微生物が真核糸状真菌であることを特徴とする、請求項 7ないし 29のい ずれか一項に記載の方法。
35. 真核糸状真菌がァスペルギルス属、ぺニシリウム属、トリコデルマ属、リ ゾプス属マグナポルサ属、メタリチウム属、ノィロスポラ属、モナスカス属、アクレ モニゥム属及びムコール属から成る群から選択されることを特徴とする、請求項 34に記載の方法。
36. ァスペルギルス厲微生物が、ァスペルギルス.ォリゼ、ァスペルギルス-ソ ーャ、ァスペルギルス'二ガー、ァスペルギルス 'ァヮモリ、ァスペルギルス 'カヮ チ、ァスペルギルス'二ドウランス、ァスペルギルス 'タマリ及びァスペルギルス■レ ペンスから成る群から選択されることを特徴とする、請求項 35に記載の方法。
37 . 液体培養系において、プラスチックに微生物を接触させることを特徴とす る、請求項 7ないし 36のいずれか一項に記載の分解方法。
38. 固体培養系において、プラスチックにァスペルギルス'オリゼを接触させる ことを特徴とする、請求項 7ないし 36のいずれか一項に記載の分解方法。
39. 界面活性物質をコードする遺伝子を含む DNA、プラスチック分解酵素を コードする遺伝子を含む D NA、及び有用物質をコードする遺伝子を含む D NA から選択される少なくとも一つ以上の D NAによって組換えられた形質転換菌。
40. 界面活性物質がァスペルギルス.オリゼ由来のハイド口ホービンである、 請求項 39記載の形質転換菌。
41. プラスチック分解酵素がァスペルギルス 'ォリゼ由来のクチナーゼである
、請求項 39記載の形質転換菌。
42. 界面活性物質がァスペルギルス 'ォリゼ由来のハイド口ホービンであり、 プラスチック分解酵素がァスペルギルス 'ォリゼ由来のクチナーゼであり、且つ、 有用物質がひ一アミラーゼである、請求項 39記載の形質転換菌。
43. ァスペルギルス属微生物である、請求項 39ないし 42のいずれか一項に 記載の形質転換菌。
44. ァスペルギルス'ォリゼ由来であることを特徴とする、請求項 43に記載の 形質転換菌。
45. プラスチックが複合材料の一構成要素として含まれている、請求項 1ない し 38のいずれか一項に記載の方法。
46. 以下の（a)又は（b)ポリペプチドをコードする塩基配列を含む DNA:
(a)配列番号：3で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一である アミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b) (a)で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換、 又は付加されたアミノ酸配列からなリハイドロホービンと実質的に同等の機能を 有するポリペプチド。
47. 以下の（a)又は（b)の DNA:
( a )配列番号： 3でで示される塩基配列又はその部分配列を含む D N A、 (b) (a)の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとスト リンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、（a)の DNAと実質的に同等の機能を 有する DNA。
48. 以下の（a)又は（b)ポリペプチドをコードする塩基配列を含む DNA:
(a)配列番号： 4又は 5で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一 であるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b) (a)で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換. 又は付加されたアミノ酸配列からなりプラスチック分解酵素と実質的に同等の 機能を有するポリペプチド。
49. 以下の（a)又は（b)の DNA:
(a)配列番号：4又は 5で示される塩基配列又はその部分配列を含む DN A、
(b) (a)の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとス トリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、（a)の DNAと実質的に同等の機能 を有する DNA。
50. 以下の（a)又は（b)ポリペプチドをコードする塩基配列を含む DNA:
(a)配列番号：6又は 7で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一 であるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b) (a)で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換、 又は付加されたアミノ酸配列からなりプラスチック結合性タンパク質と実質的に 同等の機能を有するポリペプチド。
51. 以下の（a)又は（b)の DNA:
(a)配列番号： 6又は 7で示される塩基配列又はその部分配列を含む DN
A、
(b) (a)の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとス トリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、（a)の DNAと実質的に同等の機能 を有する DNA。
52. 請求項 46ないし 51のいずれか一項に記載の遺伝子によリコ一ドされる タンパク質。
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