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WO2004037275A1 - Gallensäurekonjugate und damit gebildete partikel - Google Patents

Gallensäurekonjugate und damit gebildete partikel Download PDF

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WO2004037275A1
WO2004037275A1 PCT/EP2003/010580 EP0310580W WO2004037275A1 WO 2004037275 A1 WO2004037275 A1 WO 2004037275A1 EP 0310580 W EP0310580 W EP 0310580W WO 2004037275 A1 WO2004037275 A1 WO 2004037275A1
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WO
WIPO (PCT)
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conjugate
liposomes
structural unit
particles
particle
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP2003/010580
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English (en)
French (fr)
Inventor
Gerhard PÜTZ
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Original Assignee
Individual
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Publication date
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Priority to AU2003275978A priority Critical patent/AU2003275978A1/en
Publication of WO2004037275A1 publication Critical patent/WO2004037275A1/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome

Definitions

  • the present invention relates to conjugates containing a bile acid or bile acid salt component.
  • the invention further relates to particles, in particular liposomes or similar vesicular particles, which comprise such conjugates or which are formed, inter alia, with these conjugates.
  • Such conjugates and particles which comprise or contain the conjugates are particularly well suited for therapeutic applications, in particular for target-specific and especially liver-specific therapy.
  • target- or cell type-specific liposomes have been constructed in which an internalizing receptor serves as a cellular target protein for the binding of the liposomes on the cell surface.
  • This approach enables the liposomes bound in this way to enter the cell via receptor-mediated endocytosis.
  • Geho et. al. in US Pat. No. 4,603,044 describe such a targeted drug delivery system (trageted drug delivery) which is to be bound to hepatobiliary receptors.
  • a vesicle is linked to a conjugate consisting of a connector molecule, a bridge molecule and a target molecule.
  • the target molecule is said to have an intended receptor molecule Hepatocytes interact.
  • An iminodicarboxyl acid residue as a connector molecule, a “bridging ion”, especially a chromium complex as a bridge molecule, and a target molecule that is identical to the connector molecule are proposed for the structure, wherein other target molecules for binding to the desired receptor are also conceivable.
  • the object of the present invention is to provide an improved system for targeted therapy.
  • the conjugate according to the invention has the following components:
  • the conjugate consequently has the structure (a) - (b), with this the preferred structure (a) - (c) - (b).
  • a conjugate with components (a) and (b) and optionally (c) is capable of hepatocyte-specific proteins transporting bile salt, such as Na +, which mainly transports cholyltaurine (CT) / Cholyltaurine co-transporting polypeptide (Ntcp) and various organic anion transporting polypeptides (Oatp 1-x), which was confirmed by inhibition of bile acid transport by the special conjugate according to the invention.
  • FIG. 1 shows an example of a conjugate according to an embodiment of the invention, in which a lipid structural unit is linked via a linker structural unit to a structural unit of a bile acid salt;
  • FIG. 2A schematically shows the possible structure of a bile salt-bearing liposome according to an embodiment of the invention
  • FIG. 2B shows an enlarged detail in area X of FIG. 2A
  • FIG. 3 shows the inhibition of the uptake of natural bile salts in hepatocytes by particles carrying bile salts using the example of liposomes.
  • FIG. 4 shows a typical organ distribution when using particles carrying the conjugate according to the invention using the example of liposomes in comparison to liposomes without the conjugate; 5A to C show the binding of the inventive contact jugate-bearing particles using the example of liposomes, in which a fluorescent model substance had been incorporated, on hepatocyte primary cultures, and FIG. 5D shows a comparison with liposomes without the conjugate, in each case as a fluorescence-microscopic image of the hepatocytes.
  • lipid of the structural unit (a) of the conjugate means any fat molecule or a fat-like substance which is preferably found in natural cells. With lipid structure units occurring in natural cells, immunological defense reactions can advantageously be suppressed better. Phospholipids, especially phosphoglycerides, are particularly advantageous. A phospho-diester linkage can conveniently be used for the covalent connection to the structural unit (b) or - in the preferred case the intermediate linker - (c). The use of phosphoglycerides as a lipid structural unit in the conjugate is very advantageous, since when the particles described in more detail below, in particular with liposomes, are built up, the conjugate is stably anchored via a phosphoglyceride with long-chain acyl residues.
  • the lipid structural unit (a) is preferably constructed as a diacyl phosphoglyceride, where the acyl residue can be, for example, a saturated fatty acid residue such as lauryl, myristyl, palmitinyl, stearinyl, arachinyl or an unsaturated fatty acid residue such as palmitoleyl, oleyl, linolyl, lindenyl and arachidonyl.
  • C12 to C18 acyl residues in particular C16 to C18 acyl residues, are particularly suitable.
  • the acyl radicals can be selected independently of one another.
  • a bile acid or a bile acid salt serves as the structural unit (b), the salt form being, for example, the Na, the K, the ammonium salt, the salt of an amino acid or an organic amine or the like. Unless otherwise stated, the terms bile acid and bile acid salt are used synonymously below.
  • the structural unit (b) has the steroid characteristic of bile acid Basic structure, for example in the form of a 5 ⁇ -cholanic acid derivative.
  • the cholanic acid derivative is preferably modified on the 24C carboxylate with nitrogen-containing bases such as glycine or taurine.
  • Modification with taurine is particularly advantageous because the -S0 3 H group forms a permanently charged sulfate group at the end of the bile salt opposite the lipid structure unit after dissociation and thereby an undesired insertion of the hydrophobic cholane framework area into a particle, especially into a liposome membrane - bran, difficult or prevented. Moreover, the non-hepatocyte-specific insertion of the hydrophobic framework region into the membranes of cells can be made more difficult or prevented by the negative charge.
  • a functional group in the 24C radical and one or more hydroxyl groups in the 3-, 7- or 12-position of the cholane skeleton can be considered for linking the structural units (a) and (b).
  • a suitable functionalization can also be introduced at other points for linking.
  • the linkage is therefore preferably via the 3-hydroxy position of the steroid structure of bile acid.
  • the 7- and 12-positions of the steroid skeleton of bile acid may or may not be hydroxylated, or they may be modified by other structural units.
  • Particularly suitable bile acids are taurocholic acid and especially lithotaurocholic acid and their salts.
  • the structural unit (b) can be directly covalently linked to the structural unit (a) may be connected, for example via an ester linkage such as a phosphorus diester linkage with the phosphoglyceride described above.
  • an ester linkage such as a phosphorus diester linkage with the phosphoglyceride described above.
  • linker structural unit (c) between the structural units (a) and (b). This linker molecule can itself consist of one or more structural units.
  • Suitable structural units are, for example, alone or in combination, a polyalkylene glycol group with n polarization units, where n is an integer such as di-, tri- or tetramethylene glycol or polyethylene glycol, a dicarboxylate group such as succinyl and the like.
  • FIG. 1 A specific example of a conjugate according to the invention is shown in FIG. 1 in the form of a schematic structure.
  • the respective structural units (a) - (c) - (b) are indicated.
  • the structural representation only serves to illustrate a possible structure, but is not to be understood as restrictive, since according to the invention any variations are possible within the scope of the respective structural unit (a), (b) and, if appropriate, (c).
  • a particle comprises the special conjugate described above.
  • Suitable particles are microparticulate carriers or transport vehicles of suitable size, which are preferably designed such that therapeutic agents are bound or included on and / or in the particle.
  • the particle can be of natural or artificial origin or an artificial modification of natural vehicles.
  • the functional component (b) is easily integrated into the hydrophobic areas of the particle via the lipid component (a) and anchored there in a stable manner.
  • the particle composition suitably contains 0.1-50% by weight, preferably 0.5-5% by weight and in particular 0.75-2% by weight, based on the total amount of the particle components, e.g. the liposome mixture, the conjugate according to the invention.
  • Particularly preferred particle carriers for the conjugate according to the invention are liposomes.
  • the lipid-containing conjugate of the invention in particular in combination with the preferred diacylphosphoglycerides described above, a particularly stable anchoring of the functional component (b) to the liposomes is possible.
  • the production of such liposome particles is particularly simple since the conjugate according to the invention can easily be used as a starting material and only needs to be mixed with other lipid components suitable for liposomes, such as normal phosphoglycerides, cholesterol, lecithin or the like.
  • the liposome mixture in addition to the conjugate according to the invention, which is suitably used in a proportion of 0.1 to 50 mol%, preferably 0.5 to 5 mol%, can contain up to 99.9 mol% of normal phospholipids and if desired, contain 0.1 to 80 mol% of cholesterol and optionally further constituents.
  • Suitable normal phospholipids can be selected from the following group: Phospholipids with long-chain saturated fatty acid residues of C16 and above, in particular C16-C18 such as DPPC and DSPC, preferably in a proportion of 20 to 40 mol%, or of long-chain unsaturated fatty acid residues such as POPC and DNPC, preferably in a proportion of 10 to 30 mol%, since these favor the storage of the liposomes at 4 ° C without transition into the liquid crystalline phase; and phospholipids with medium saturated chain lengths (C8-C14) such as DMPC, preferably in a proportion of 20 to 40 mol%, or with medium unsaturated chain lengths such as D yPC, preferably in a proportion of 20 to 90 mol% and in particular from 40 to 80 mol% because these favor a fusion with cell membranes.
  • C16-C18 such as DPPC and DSPC
  • POPC and DNPC long-chain unsaturated fatty acid residues
  • the liposome mixture preferably contains from 10 to 90 mol%, more preferably from 20 to 60 mol%, of cholesterol. While the main components of the liposome mixture are neutral in total, such as the uncharged cholesterol or the zwitterionic diacylphosphocholine, one or more negatively charged phospholipids can additionally be added to the liposome mixture.
  • the structural unit (b) of the conjugate contained in the liposome can protrude outwards and bind better to a transport protein.
  • a negative total charge of the liposome also leads to a slower opsonization in vivo and thus to an increased length of time of the liposomes in the blood.
  • Suitable negatively charged lipids are, for example, phosphatidylglycerol, DSPG, DMPG and glutyryl-DSPG, since it ensures a particularly long half-life of the liposomes in the blood.
  • the negatively charged lipid component of the liposomes can preferably be present in a proportion of 1 to 50 mol%, more preferably 4 to 15 Mol% are added.
  • FIG. 2A shows a schematic representation of the possible structure of a liposome carrying bile salt
  • FIG. 2B shows section X of FIG. 2A enlarged.
  • the hydrophilic residues in the bile salt structural unit (b) of the conjugate according to the invention (3-litho-cholyltaurine-distearoyl-phosphoethanolamine) point, for example, inwards and outwards of the double-walled liposome membrane, while the lipid structural unit (a) of the conjugate is stable in the liposomes - membrane is integrated and thus anchored.
  • the bile salt structural unit (b) points essentially outwards.
  • the size of the particle according to the invention can generally be in the nanometer range up to the micrometer range.
  • the average particle size is suitably in the range from 10 nm to 10 ⁇ m, more preferably from 40 to 200 nm and in particular from 100 to 150 nm.
  • the particle preferably further comprises a fusion peptide known per se, e.g. those described in WO 99/39742 A, such as the 25-amino acid N-terminal sequence of the surfactant associated protein B, in order to promote the fusion with the cellular membrane after the binding of the particle to the transporter of the hepatocyte and thus the content of the particle easier to discharge into the cell plasma.
  • the fusion peptide can be tailored via tailored amino acid sequences, e.g. via hydrophobic amino acids, or suitable modifications, e.g. via covalent links, firmly connected to the particle or anchored there, e.g. in WO 99/39742 A and by Pecheur et al. (Biochemistry 36, 3773-3781 (1997) and Biochemistry 37, 2361-2371 (1998).
  • the particles in particular the liposomes, can preferably also be a sterically stabilized, ie a so-called Have “stealth component”, for example lipid-bound polyethylene glycol (PEG) or lipid-bound glutaryl, in order to prolong the half-life of the particles against the immune system in circulation in vivo.
  • a so-called Have “stealth component” for example lipid-bound polyethylene glycol (PEG) or lipid-bound glutaryl
  • the particle according to the invention can preferably comprise a therapeutic agent or a pharmaceutical composition or a diagnostic agent for use in the medical field.
  • Suitable therapeutic agents are, for example, cytostatics, antibiotics, antivirals, antimycotics, gene therapy substances such as DNAs or antisense molecules, antibodies, cytokines, interferons, radionuclides and the like.
  • Suitable diagnostic agents are, for example, contrast agents, radioactive isotropes, NMR imaging agents and the like.
  • conjugate according to the invention and the particle according to the invention comprising it are therefore particularly well suited for use in therapy and diagnostics in medicine, in particular in hepatocyte-related diseases such as hepatitis or liver cell carcinoma.
  • the conjugate according to the invention and a particle and / or a therapeutic or diagnostic agent are combined in separate complements of a kit.
  • the kit preferably comprises, in separate compliments, a liposome preparation in which the conjugate according to the invention is enclosed in the liposomes, and separately the therapeutic or diagnostic agent.
  • the liposome preparation can then be loaded with the therapeutic or diagnostic agent before use.
  • the activated bile salt derivative was precipitated by adding 50 ml of ether, the precipitate was separated from the supernatant after a short centrifugation and dissolved in a mixture of 10 ml of CHCl 3 , 5 ml of MeOH and 200 ⁇ l of water.
  • Liposomes were produced in a modified form using the extrusion method of MacDonald et al. , Biochim. Biophys. Acta. 1061, 297-303. (1991).
  • the individual lipids, which should be contained in the liposome membrane, were in a defined concentration in chloroform (POPC, DPPC, DNPC, DMPC, DMyPC, cholesterol) or in a mixture of chloroform, methanol and dist. Dissolved water in the ratio 1/1 / 0.02 (v / v / v) (DSPG, DMPG, 3-LCT-DSPE). These stock solutions were stored at -20 ° C. For the production of liposomes of the desired lipid composition, the corresponding aliquots of the lipid stock solutions were transferred to a 25 ml round-bottomed flask. The lipid composition of the liposomes used in mol% is given in Table 1.
  • the composition of the buffer used corresponded to that of the perfusion buffer used for hepatocyte isolation. No glucose was used to increase the shelf life of the liposomes.
  • the liposome buffer was filtered through a membrane with a pore diameter of 220 ⁇ m.
  • the desired amount of liposome buffer was added to the dried lipid mixture and the mixture was stirred for 15 minutes at 40 ° C. and 50 rpm using a rotary evaporator. By adding 10-20 glass beads (710 - 1018 microns) the resuspen- lipids are accelerated considerably.
  • the amount of liposome buffer added was chosen so that the suspension obtained contained 10-40 mg lipid / ml.
  • the lipid suspension was centrifuged at 1000 xg for 30 seconds and then left at room temperature for 2 hours. Finally, the resulting multilamellar vesicles were pressed 13 times through a polycarbonate membrane (LFM-200, Milsch equipment) with a pore diameter of 200 nm using a LiposoFast ® extrusion apparatus (Milsch Equipment, Laudenbach, Germany) and then 21 times through two superimposed polycarbonate membranes (LFM-100, milk equipment) with a pore diameter of 100 nm.
  • LFM-200 LiposoFast ® extrusion apparatus
  • the size of the liposomes produced was determined by means of PCS (photon correlation spectroscopy) (C. Washington, 1992, in M.H. Rubinstein, ed., Ellis Horwood, Ltd., London, England.). The results of mean diameters (measured from 9 individual preparations each, the mean values and the standard deviation are given) for the bile salt-bearing liposomes and the control liposomes are shown in Table 2.
  • the liposomes produced with an average diameter of approximately 120 nm can be used very well both in vitro and in vivo for the investigation of the binding of bile salt-bearing liposomes to hepatocytes.
  • the possible structure for the bile salt-bearing liposome is shown in FIG. 2A to illustrate the size relationships (the size shown should correspond to a liposome diameter of 100 nm).
  • the liposome membrane 1 has so-called bile salt layers 2.
  • 2B shows a modeled, enlarged section of the membrane of such a bile salt-bearing liposome.
  • the results illustrate a specific binding of the bile salt-bearing liposomes to bile salt-transporting proteins of the hepatocytes.
  • Uptake of the liposomes modified according to the invention via a receptor-mediated endocytosis was practically not observed.
  • a lysosomal pathway can thus be prevented or at least strongly suppressed.
  • the long-lived liposomes were prepared as described in Example 2, but using the lipid composition given in Table 3.
  • Liposomes labeled with [ 3 H] cholesteryl hexadecyl ether were used to study the organ distribution of long-lived liposomes.
  • Male albino rats of the Wistar S 300 strain (approx. 200 g) were anesthetized by intraperitoneal injection of a 2% Nembutal ® solution (1.5 ml / kg body weight). The amount of long-lived liposomes injected was calculated so that the PC concentration in the serum of the rats was 2 mM liposomal PC.
  • the corresponding amount of stock liposome solution was mixed with 1% by volume of a sterile 125 mM CaCl 2 solution and injected into the vein of the hind leg over a period of about 1 min using a cannula. After 90 minutes, the rats' abdominal cavity was opened and the kidneys and spleen were removed. A blood sample was taken from the heart and placed in a prepared 1.5 ml reaction vessel containing EDTA to prevent coagulation. To separate the erythrocytes, the blood sample was centrifuged at 2000 xg for 2 min. 3 aliquots of 200 ⁇ l each were transferred from the supernatant to 20 ml liquid scintillation vials.
  • the liver was perfused with 10 ml of the cell buffer indicated below and then removed. Kidneys and spleen were each treated with 10 ml of ice-cold cell buffer, the liver was mixed with 15 ml of ice-cold cell buffer, and the organs were then homogenized. The total volume of the homogenate was determined and 3 aliquots of 200 ⁇ l each were transferred to 20 ml liquid scintillation vials. In each of the 20 ml liquid scintillation vials 1 ml of Biolute S ® (tin) was added and the samples were fed to the liquid scintillation measurement as described.
  • Biolute S ® tin
  • FIG. 4 The result of organ distribution after 90 minutes of infusion is shown in FIG. 4.
  • the long-lived, bile salt-bearing liposomes hatchched columns
  • the control liposomes black column
  • the spleen and kidney are practically not affected.
  • Liposomes containing 0.3 mol% of the fluorescent dye Ph 2 -DiOC18 were used to investigate the accumulation of long-lived liposomes on liver hepatocytes.
  • the fluorescence intensities of the liposome preparations were determined by fluorescence spectroscopy, and suspensions with control liposomes and bile salt-bearing liposomes with the same fluorescence intensity were always used for the studies using confocal laser scanning microscopy.
  • the excitation of the Ph 2 -DiOC18-carrying liposomes was carried out using an argon laser at a wavelength of 488 nm
  • the fluorescence signal was detected at a wavelength of 505 nm.
  • the hepatocytes were cultivated with collagen type
  • the cell culture medium located above the cells was then removed as completely as possible, and 150 ⁇ l of a liposome suspension according to the invention prepared as described in Example 2 and containing 2 mM liposomal PC were added to the cells. After incubating the cells at 37 ° C. for 5 minutes, the liposome suspension was aspirated as completely as possible, and the cells were carefully washed 3 times with 150 ⁇ l of cell buffer each. Then 150 ul cell culture medium was added to the cells and the flow chamber was inserted into the confocal laser microscope.
  • the image was taken with a confocal laser scanning microscope (LSM 510 UV; ZEISS, Jena, Germany; recording speed: 2.24 ⁇ s / pixel; pixel size in the x and y direction: 0.2 - 0.4 ⁇ m; distance the cutting planes in the z direction: 0.05 ⁇ m to 0.15 ⁇ ; setting the pinhole so that the half-maximum z resolution was between 0.5 and 1 ⁇ m at full width)
  • the hepatocytes were left in the culture dish for cultivation and carefully 3 times with each
  • FIG. 5 shows the results of the binding of liposome aggregates to the hepatocyte surface
  • FIG. 5A showing the binding of bile salt-bearing liposomes after 5 minutes
  • FIG. 5B showing the binding of bile salt-bearing liposomes after 6 hours
  • FIG. 5C an enlarged section from FIG. 5B and 5D shows the comparison with control liposomes after 6 h.
  • Fluorescent liposome aggregates appear in the form of brightly fluorescent dots (see arrows in FIGS. 5B and 5C). The specific binding to hepatocytes is clearly visible (cf. FIGS. 5B and C compared to FIG. 5D).
  • the liposomes were infused analogously to that described in Example 4. After perfusion of the liver, small pieces of the individual liver lobes were removed with a scalpel. The removed pieces of liver were placed on a thin cork disc and immediately frozen in liquid N 2 . Ultrathin sections of the liver tissue were made from the frozen pieces of liver using a microtome. These were viewed under the fluorescence microscope.
  • liposomes which contained a suitable fusion peptide (SBP25) (WO 99/39742 A).
  • SBP25 peptide was chemically synthesized, purified by high-performance liquid chromatography and has the following amino acid sequence: Ac-Phe-Pro-Ile-Pro-Leu-Pro-Tyr-Cys-Trp-Leu-Ala-Arg-Ala- Leu-Ile-Lys-Arg-Ile-Gln-Ala-Met-Ile-Pro-Lys-Gly-NH 2 (HPLC purity 87%).
  • the liposomes were prepared as described in Example 2 by extrusion, using the lipid composition given in Table 4. SBP25 was dissolved in methanol, and 0.04 ⁇ mole SBP25 per ⁇ mol phospholipid was added to the respective mixture of lipids dissolved in organic solvents to prepare SBP25-bearing liposomes. The organic solvent was then removed. The following buffer (pH 7.6) was used for the resuspension of the lipids:
  • the non-encapsulated lipid was separated using gel permeation chromatography.
  • the liposome suspensions were brought to a volume of 1 ml, and the subsequent separation of the liposomes and the non-encapsulated fluorescent dextran was carried out under hydrostatic pressure.
  • the liposome suspensions contained 2 mM liposomal PC. After 2 h, 5 h or 20 h, the liposome suspensions were removed, the cells were washed and then viewed under a fluorescence microscope.

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Abstract

Es wird ein Konjugat beschrieben, die eine Lipid-Struktureinheit, eine Gallensäure- oder Gallensalz-Struktureinheit, und gegebenenfalls eine Linker-Struktureinheit aufweist, wobei die Lipid-Struktureinheit und die Gallensäure- bzw. Gallensalz-Struktureinheit kovalent, gegebenenfalls über die dazwischenliegende Linker-Struktureinheit, verbunden sind. Mit solchen Konjugaten können, je nach Wunsch mit weiteren Bestandteilen, sehr nützliche Partikel, insbesondere Liposomen oder ähnliche vesikuläre Teilchen, aufgebaut werden. Solche Konjugate und Partikel, die die Konjugate umfassen bzw. gebunden enthalten, sind für therapeutische Anwendungen, insbesondere für die Target­und speziell die Leber-spezifische Therapie besonders gut geeignet.

Description

Gallensäurekonjugate und damit gebildete Partikel
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Konjugate, die eine Gallensäure- oder Gallensäuresalz-Komponente enthalten. Die Erfindung bezieht sich ferner auf Partikel, insbesondere Liposomen oder ähnliche vesikuläre Teilchen, die solche Konjugate umfassen oder die unter anderem mit diesen Konjugaten gebildet sind. Solche Konjugate und Partikel, die die Konjugate umfassen bzw. gebunden enthalten, sind für therapeutische Anwendungen, insbesondere für die Target- und speziell die Leber-spezifische Therapie besonders gut geeignet.
Im Stand der Technik sind Target- bzw. zellartenspezifische Liposomen konstruiert worden, bei denen ein internalisierender Rezeptor als zelluläres Zielprotein für die Bindung der Liposomen auf der Zelloberfläche dient. Bei diesem Ansatz wird der Eintritt der so gebundenen Liposomen in die Zelle über eine rezeptorvermittelte Endozytose ermöglicht. Geho et. al . beschreiben im US-Patent 4,603,044 ein solches zielgerichtetes Wirkstoff-Freisetzungssystem (Trageted Drug Delivery) , das an hepatobiliäre Rezeptoren gebunden werden soll. Ein Vesikel wird mit einem Konjugat verknüpft, das aus einem Verbindermolekül, einem Brückenmolekül und einem Zielmolekül besteht. Das Zielmolekül soll mit einem beabsichtigten Rezeptormolkekül des Hepatozyten interagieren. Zum Aufbau werden ein Iminodicar- boxylsaurerest als Verbindermolekül, ein "Überbrückungsion" , speziell ein Chromkomplex als Brückenmolekül, und ein dem Verbindermolekül identisches Zielmolekül vorgeschlagen, wobei auch andere Zielmoleküle zur Bindung an den gewünschten Rezeptor denkbar sind.
Im US-Patent 6,063,400 wenden Geho et al . ein derartiges Konjugat für Liposomen an, die als therapeutischen Wirkstoff ein biogenes Amin und darüber hinaus ein sogenanntes Sequestriermittel (speziell Nukleotidderivate) enthalten, um eine zielgerichtete Bindung an einen Rezeptor zu ermöglichen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein verbessertes System zur zielgerichteten Therapie bereitzustellen.
Die Aufgabe wird gemäß der Erfindung gelöst durch ein Konjugat gemäß Anspruch 1, ein Partikel gemäß Anspruch 12, eine Verwendung gemäß Anspruch 23 sowie einen Kit gemäß Anspruch 24. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Das erfindungsgemäße Konjugat weist folgende Komponenten auf:
(a) eine Lipid-Struktureinheit und
(b) eine Gallensäure- oder Gallensäuresalz-Struktureinheit,
wobei die Komponenten (a) und (b) kovalent, gegebenenfalls über eine
(c) Linker-Struktureinheit, verbunden sind.
Ohne Linker-Komponente besitzt das Konjugat folglich den Strukturaufbau (a) - (b) , mit dieser den bevorzugten Strukturaufbau (a) - (c) - (b) . Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß ein solches Konjugat mit den Komponenten (a) und (b) und ggf. (c) in der Lage ist, spezifisch an Gallensalz transportierende Proteine der Hepato- zyten, wie z.B. das hauptsächlich Cholyltaurin (CT) transportierende Na+/Cholyltaurin-kotransportierende-Polypeptid (Ntcp) und verschiedene Organische-Anionen-transportierende- Polypeptide (Oatp 1-x) , zu binden, was durch Inhibierung des Gallensäuretransports durch das spezielle, erfindungsgemäße Konjugat bestätigt wurde. Die beobachtete Inhibierung der Gal- lensalzaufnähme ist selbst bei einer maximalen Belegung der Hepatocyten mit entsprechenden Vesikeln unvollständig, was eine wichtige, günstige Voraussetzung für die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Konjugats für die Therapie schafft, da eine vollständige Inhibition des Transports der Gallensäure bzw. des Gallensalzes zu einer Choleastase und damit zu einer Schädigung des Patienten führen würde.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von bevorzugten Ausführungsformen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert .
Fig. 1 zeigt ein Beispiel eines Konjugats gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, bei dem eine Lipidstruktureinheit über eine Linker-Struktureinheit an eine Struktureinheit eines Gallensäuresalzes gebunden ist;
Fig. 2A zeigt schematisch die mögliche Struktur eines Gallensalz-tragendes Liposoms gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, und
Fig. 2B zeigt eine AusSchnittsvergrößerung im Bereich X der Fig. 2A;
Figur 3 zeigt die Inhibierung der Aufnahme natürlicher Gallensalze in Hepatocyten durch Gallensalze tragende Partikel am Beispiel von Liposomen.
Figur 4 zeigt eine typische Organverteilung bei Anwendung von das erfindungsgemäße Konjugat tragenden Partikeln am Beispiel von Liposomen im Vergleich zu Liposomen ohne das Konjugat; Fig. 5A bis C zeigen die Bindung von das erfindungsgemäße Kon- jugat tragenden Partikeln am Beispiel von Liposomen, in die eine fluoreszierende Modellsubstanz inkorporiert worden war, an Hepatocytenprimärkulturen, und Fig. 5D zeigt einen Vergleich mit Liposomen ohne das Konjugat, jeweils als fluores- zenz- ikroskopisches Bild der Hepatocyten.
Mit dem Ausdruck "Lipid" der Struktureinheit (a) des Konjugats ist irgendein Fettmolekül oder ein fettähnlicher Stoff gemeint, der vorzugsweise in natürlichen Zellen vorkommt. Mit in natürlichen Zellen vorkommenden Lipidstruktureinheiten können vorteilhaft immunologische Abwehrreaktionen besser unterdrückt werden. Besonders vorteilhaft sind Phospholipide, vor allem Phosphoglyceride . Eine Phospho-Diesterverknüpfung kann bequem zur kovalenten Verbindung zur Strukturtureinheit (b) oder - im bevorzugten Fall des dazwischenliegenden Linkers - (c) genutzt werden. Der Einsatz von Phosphoglyceriden als Lipidstruktur- einheit im Konjugat ist sehr vorteilhaft, da beim Aufbau der unten näher beschriebenen Partikel, insbesondere bei Liposomen, eine stabile Verankerung des Konjugats über ein Phospho- glycerid mit langkettigen Acylresten ermöglicht wird. Folglich ist die Lipidstruktureinheit (a) vorzugsweise aufgebaut als Diacyl-Phosphoglycerid, wobei der Acylrest zum Beispiel ein gesättigter Fetsäurerest wie Lauryl, Myristyl, Palmitinyl, Stearinyl, Arachinyl oder ein ungesättigter Fettsäurerest wie Palmitoleyl, Oleyl, Linolyl, Lindenyl und Arachidonyl sein kann. Zur besseren Integration in bevorzugten Liposomenparti- kel eignen sich C12- bis C18-Acylreste, insbesondere C16- bis C18-Acylreste besonders gut. Die Acylreste können unabhängig voneinander gewählt werden.
Als Struktureinheit (b) dient eine Gallensäure oder ein Gal- lensäuersalz, wobei als Salzform z.B. das Na-, das K-, das Ammonium-Salz, das Salz einer Aminosäure oder eines organischen Amins oder dergleichen in Betracht kommt. Nachfolgend werden, wenn nicht anders angegeben, die Ausdrücke Gallensäure und Gallensäuresalz als Synonyme verwendet. Die Struktureinheit (b) besitzt die für Gallensäure typische Steroid- Grundstruktur, z.B. in Form eines 5ß-Cholansäurederivats . Das Cholansäurederivat ist vorzugsweise am 24C-Carboxylat mit stickstoffhaltigen Basen wie Glycin oder Taurin modifiziert. Insbesondere die Modifizierung mit Taurin ist vorteilhaft, weil die -S03H-Gruppe nach Dissoziation eine permanent geladene Sulfatgruppe am gegenüber der Lipidstruktureinheit entgegengesetzten Ende des Gallensalzes bildet und dadurch eine nicht gewünschte Insertion des hydrophoben Cholan- Gerüstbereichs in ein Partikel, speziell in eine Liposomenmem- bran, erschwert oder verhindert wird. Im übrigen kann durch die negative Ladung die nicht Hepatocyten spezifische Insertion des hydrophoben Gerüstbereichs in die Membranen von Zellen erschwert oder verhindert werden.
Zur Verknüpfung der Struktureinheiten (a) und (b) kommen grundsätzlich eine funktioneile Gruppe im 24C-Rest und eine oder mehrere Hydroxylgruppen in der 3-, 7- oder 12-Position des Cholan-Gerüsts in Betracht . Zur Verknüpfung können auch an anderen Stellen eine geeignete Funktionalisierung eingeführt werden. Im Hinblick auf eine stärkere spezifische Bindung an Hepatozyten ist es bevorzugt, die Verknüpfung an die Lipidstruktureinheit (a) oder den Linker (c) strukturell möglichst weit entfernt vom 24C-Rest des Gallensäure- Steoridgerüstes auszubilden. Die Verknüpfung erfolgt daher vorzugsweise über die 3-Hydroxy-Position des Steroidgerüsts der Gallensäure. Die 7- und 12-Positionen des Steroidgerüsts der Gallensäure können hydroxyliert sein oder nicht, oder sie können durch andere Struktureinheiten modifiziert sein. Besonders gut geeignete Gallensäuren sind Taurocholsäure und vor allem Lithotaurocholsäure sowie deren Salze.
Es wurde ferner festgestellt, daß die spezifische Bindung an Hepatozyten signifikant stärker war, wenn die Verknüpfung an die 3-Position des Steroidgerüsts der Gallensäure bzw. des -Salzes in der ß-Konfiguration vorlag.
Die Struktureinheit (b) kann direkt kovalent mit der Struktur- einheit (a) verbunden sein, z.B. über eine Esterverknüpfung wie einer Phosphordiesterverknüpfung mit dem oben beschriebenen Phosphoglycerid. Zur leichteren Synthese sowie zur Einführung eines molekularen Abstandshalters, damit die Struktureinheiten (a) und (b) ihre jeweilige Funktion besser ausüben können, liegt zwischen den Struktureinheiten (a) und (b) vorzugsweise eine Linkerstruktureinheit (c) vor. Dieses Linkermolekül kann selbst aus einer oder mehreren Struktureinheiten bestehen. Geeignete Struktureinheiten sind zum Beispiel, allein oder in Kombination, eine Polyalkylenglykolgruppe mit n Polarisationseinheiten, wobei n eine ganzen natürliche Zahl ist, wie Di-, Tri- oder Tetramet ylenglykol oder Polyethylenglykol , eine Dicarboxylatgruppe wie Succinyl und dergleichen.
Ein spezielles Beispiel eines erfindungsgemäßen Konjugats ist in Fig. 1 in Form einer schematischen Struktur dargestellt. Die jeweiligen Struktureinheiten (a) - (c) - (b) sind angegeben. Die strukturelle Darstellung dient nur zur Veranschaulichung einer möglichen Struktur, ist jedoch nicht einschränkend zu verstehen, da erfindungsgemäß im Rahmen der oben beschriebenen jeweiligen Struktureinheit (a) , (b) und ggf. (c) beliebige Variationen möglich sind.
Das zuvor beschriebene, erfindungsgemäße Konjugat mit den wesentlichen Struktureinheiten (a) und (b) , die vorzugsweise mit dem Linker (c) verknüpft sind, sind besonders geeignet zur Anwendung auf medizinischem Gebiet, insbesondere für therapeutische Verfahren.
In einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Partikel das oben beschriebene, spezielle Konjugat. Als Partikel kommen mikropartikuläre Träger oder Transportvehikel geeigneter Größe in Betracht, die vorzugsweise so ausgestaltet sind, daß am und/oder im Partikel therapeutische Wirkstoffe gebunden oder eingeschlossen sind. Das Partikel kann natürlichen oder künstlichen Ursprungs sein oder eine künstliche Modifikation von natürlichen Vehikeln darstellen. Diesbezüglich kann auf Partikel verwiesen werden, die aus herkömmlichen Drug Delivery-Systemen bekannt sind. Geeignet sind z.B. Liposomen, Mikrosphären, Nanopartikel, Niosomen, Polymerpartikel, Lipo- proteine, Viruspartikel (Viren, Virushüllen und andere, modif- zierte Viruspartikel, deren Virulenzeigenschaft entfernt wurde oder in anderer Weise modifiziert wurde) und bestimmte Zellarten wie Blutzell-Subtypen, wie Erythrocyten und Lymphocyten. Die Funktionskomponente (b) wird dabei auf einfache Weise über die Lipidkomponente (a) in hydrophobe Bereiche des Partikels integriert und dort stabil verankert .
Die Partikelzusammensetzung enthält geeigneterweise 0,1-50 Gew.-%, vorzugsweise 0,5-5 Gew.-% und insbesondere 0,75-2 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der Partikelkomponenten wie z.B. der Liposomenmischung, des erfindungsgemäßen Konjugats .
Besonders bevorzugte Partikelträger für das erfindungsgemäße Konjugat sind Liposomen. In Kombination mit dem Lipid-haltigen Konjugat der Erfindung, insbesondere in Kombination mit den oben beschriebenen, bevorzugten Diacylphosphoglyceriden, ist eine besonders stabile Verankerung der funktioneilen Komponente (b) an die Liposomen möglich. Ferner ist die Herstellung solcher Liposomenpartikel besonders einfach, da das erfindungsgemäße Konjugat leicht als Ausgangsmaterial eingesetzt werden kann und lediglich mit weiteren, für Liposomen geeignete Lipidkomponenten wie normale Phosphoglyceride, Cholesterol, Lecitin oder dergleichen gemischt zu werden braucht .
Im Fall der Liposomenpartikel kann die Liposomenmischung neben dem erfindungsgemäßen Konjugat, das geeigneterweise in einem Mengenanteil von 0,1 bis 50 Mol-%, vorzugsweise 0,5 bis 5 Mol- % verwendet wird, bis 99,9 Mol-% normale Phospholipide und, falls gewünscht, 0,1 bis 80 Mol-% Cholesterol und gegebenenfalls weitere Bestandteile enthalten. Geeignete normale Phospholipide können aus folgender Gruppe ausgewählt werden: Phospholipide mit langkettigen gesättigten Fettsäureresten von C16 und darüber, insbesondere C16-C18 wie z.B. DPPC und DSPC, vorzugsweise in einem Anteil von 20 bis 40 Mol-%, oder von langkettigen ungesättigten Fettsäureresten wie z.B. POPC und DNPC, vorzugsweise in einem Anteil von 10 bis 30 Mol-%, da diese die Lagerung der Liposomen bei 4°C ohne Übergang in die flüssigkristalline Phase begünstigen; und Phospholipide mit mittleren gesättigten Kettenlängen (C8-C14) wie z.B. DMPC, vorzugsweise in einem Anteil von 20 bis 40 Mol-%, oder mit mittleren ungesättigten Kettenlängen wie z.B. D yPC, vorzugsweise in einem Anteil von 20 bis 90 Mol-% und insbesondere von 40 bis 80 Mol- %, weil diese eine Fusion mit Zellmembranen begünstigen. Der Zusatz von Cholesterol zur Liposomenmischung verringert einerseits die Fluidität der Membran und vergrößert andererseits die Breite des Phasenübergangs zwischen der flüssigkristallinen und der Gelphase. Cholesterol verringert ferner die Permeabilität der Liposomenmembran und erhöht die Verweildauer der im Inneren der Liposomen gelöst vorliegenden hydrophilen Verbindungen in den Liposomen. Deshalb enthält die Liposomenmischung vorzugsweise von 10 bis 90 Mol-%, weiter bevorzugt von 20 bis 60 Mol-% Cholesterol. Während die Hauptkomponenten der Liposomenmischung in der Summe neutral geladen sind, wie z.B. das ungeladene Cholesterol oder das zwitterionige Diacyl- Phosphocholin, können zusätzlich ein oder mehrere negativ geladene Phospholipide der Liposomenmischung zugesetzt werden. Durch die Coulomb-Abstoßung gegenüber dem negativ geladenen Gallensäurerest, insbesondere der Taurin-modifizierten Gallensäure, kann die Struktureinheit (b) des im Liposom enthaltenen Konjugats nach außen ragen und besser an ein Transportprotein binden. Eine negative Gesamtladung des Liposomen führt darüber hinaus in vivo zu einer verlangsamten Opsonisierung und damit zu einer verlängerten Verweildauer der Liposomen im Blut. Als negativ geladenes Lipid eignet sich z.B. Phosphatidylglycerol, DSPG, DMPG und Glutyryl-DSPG, da es eine besonders lange Halbwertszeit der Liposomen im Blut gewährleistet . Die negativ geladene Lipidkomponente der Liposomen kann vorzugsweise in einem Anteil von 1 bis 50 Mol-%, weiter bevorzugt von 4 bis 15 Mol-% zugesetzt werden.
Fig. 2A zeigt eine schematische Darstellung der möglichen Struktur eines Gallensalz tragenden Liposoms, und Fig. 2B zeigt den Ausschnitt X der Fig. 2A vergrößert. Die hydrophilen Reste in der Gallensalz-Struktureinheit (b) des erfindungsgemäßen Konjugats (3-Litho-Cholyltaurin-Distearoyl- Phosphoethanolamin) zeigen beispielsweise nach innen und nach außen der doppelwandigen Lipsomenmembran, während die Li- pidstruktureinheit (a) des Konjugats stabil in der Liposomen- membran integriert und somit verankert ist. In der praktischen Anwendung ist es bevorzugt, dass die Gallensalz- Struktureinheit (b) im wesentlichen nach außen zeigt.
Die Größe des erfindungsgemäßen Partikels kann im allgemeinen im Nanometerbereich bis hin zum Mikrometerbereich liegen. Die mittlere Partikelgröße liegt geeigneter Weise im Bereich von lOnm bis lOμm, weiter bevorzugt von 40 bis 200nm und insbesondere von 100 bis 150nm.
Das Partikel umfaßt neben dem erfindungsgemäßen Konjugat vorzugsweise ferner ein an sich bekanntes Fusionspeptid, z.B. die in der WO 99/39742 A Beschriebenen, wie die 25 Aminosäuren umfassende N-terminale Sequenz des Surfactant Associated Protein B, um nach der Bindung des Partikels an den Transporter des Hepatozyten die Verschmelzung mit der zellulären Membran zu fördern und so den Inhalt des Partikels leichter in das Zellu- plasma zu entladen. Das Fusionspeptid kann über maßgeschneiderte Aminosäuresequenzen, z.B. über hydrophobe Aminosäuren, oder geeignete Modifizierungen, z.B. über kovalente Verknüpfungen, fest mit dem Partikel verbunden bzw. dort verankert werden, wie z.B. in der WO 99/39742 A und von Pecheur et al . (Biochemistry 36, 3773-3781 (1997) und Biochemistry 37, 2361- 2371 (1998) beschrieben.
Die Partikel, insbesondere die Liposomen, können vorzugsweise ferner neben dem erfindungsgemäßen Konjugat und ggf. dem Fusionspeptid eine sterisch stabilisierte, d.h. eine sogenannte "Stealth-Komponente" aufweisen, z.B. Lipid-gebundenes Polye- thylenglycol (PEG) oder Lipid-gebundenes Glutaryl, um die Halbwertszeit der Partikel gegenüber dem Immunsystem in der Zirkulation in vivo zu verlängern.
Das erfindungsgemäße Partikel kann zur Anwendung auf medizinischem Gebiet vorzugsweise einen therapeutischen Wirkstoff oder eine ArzeneimittelZusammensetzung oder ein diagnostisches Mittel umfassen. Geeignete therapeutische Wirkstoffe sind zum Beispiel Cytostatika, Antibiotika, Antivirusmittel, Antimyko- tika, gentherapeutische Substanzen wie DNAs oder Antisense- Moleküle, Antikörper, Cytokine, Interferone, Radionuklide und dergleichen. Geeignete diagnostische Mittel sind zum Beispiel Kontrastmittel, radioaktive Isotrope, NMR-bildgebende Mittel und dergleichen.
Das erfindungsgemäße Konjugat und das dieses umfassende, erfindungsgemäße Partikel sind daher besonders gut geeignet zur Anwendung bei Therapie und Diagnostik in der Medizin, insbesondere bei Hepatozyten-bezogenen Erkrankungen wie der Hepatitis oder dem Leberzellkarzinom.
In einem weiteren Gegenstand der Erfindung sind das erfindungsgemäße Konjugat und ein Partikel und/oder ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel in jeweils getrennten Kompatimenten eines Kits kombiniert. Vorzugsweise umfaßt der Kit in getrennten Kompatimenten eine Liposomenpraparation, bei der in den Liposomen das erfindungsgemäße Konjugat eingeschlossen ist, und getrennt davon das therapeutische oder diagnostische Mittel . Vor der Anwendung kann dann die Liposomenpraparation mit dem therapeutischen oder diagnostischen Mittel beladen werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von nicht einschränkend zu verstehenden Beispielen näher erläutert . Beispiele
Abkür ungen:
CT Cholyltaurin
DCCI Dicyclohexylcarbodiimid
DMPG l,2-0-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-rac- (1-glycerol)
DMPC 1, 2-0-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin
DmyPC 1, 2-0-Dimyristoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin
DNPC l,2-0-Dinervonoyl-sn-glycero-3-phosphocholin
DPPC 1, 2-O-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin
DSPE l,2-0-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin
DSPG l,2-0-Distearoyl-sn-glycero-3-phospho-rac- (1-glycerol)
Glutaryl-DSPE N-Glutaryl-1 , 2-O-Distearoyl-sn-glycero-3 - phosphoethanolamin
LCT Lithocholyltaurin
LCT-DSPE Dinatrium-3- (1, 2-0-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-
2'-ethanolamidosuccinyl) -ethoxy-cholan-24-oyl-2 - aminoethansulfonat
Ph2-DiOC18 3,3' -Dioctadecyl-5 , 5 ' -diphenyloxacarbocyanin- chlorid
PC Phosphatidylcholin
POPC 1-O-Palmitoyl-2-O-oleoyl-sn-glycero-1-phosphocholin
UDCT Ursodeoxycholyltaurin
Beispiel 1: Herstellung eines erfindungsgemäßen Konjugats
(1) Herstellung von 3 - (2-Hydroxyethoxy) -5ß-cholan-24-säure Literatur: G. Wess et al . , Tetrahedron Letters 33, 195-198 (1992)
(1-1) Synthese von 3α-Hydroxy-5ß-cholan-24-säure-methylester
In 150 ml absolutiertem Methanol wurden 15 g 3α-Hydroxy-5ß- cholan-24-säure (39,8 mMole) gelöst und mit 70μl konzentrierter Salzsäure versetzt. Nach 4-stündigem Erhitzen unter Rück- fluss wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das erhaltene Rohprodukt wurde durch Umkristallisation in Me- OH/Wasser gereinigt. Ausbeute: 4,3 g (36,6 mMole, 92 %) .
(1-2) Synthese von 3α- (2-Propenoxy) -5ß-cholan-24-säure- methylester
Unter Argonatmosphäre wurden 5 g (12,8 mMole) 3α-Hydroxy-5ß- cholan-24-säure-methylester und 6,5ml Diisopropyl-ethyl-amin in 15 ml wasserfreiem DMF gelöst und auf Siedetemperatur erhitzt. Die Zugabe von 15ml Allylbromid (173 mMole) erfolgte tropfenweise über einen Zeitraum von 8 h. Anschließend wurden das überschüssige Allylbromid, gebildetes HBr und das Diisopropyl-ethyl-amin durch Destillation bei Normaldruck, das Lösungsmittel durch Destillation im Hochvakuum entfernt. Der abgekühlte Rückstand wurde in Ether aufgenommen und säulenchro- matographisch im Laufmittel Cyclohexan/Essigester 30/1 (v/v) gereinigt. Ausbeute: 4,2 g (9,8 mMole, 77%).
(1-3) Synthese von 3oc- (2-Oxoethoxy) -5ß-cholan-24-säure- methylester
Zu einer Lösung von 3,5 g 3α- (2-Propen) -5ß-cholan-24-säure- methylester (8,1 mMole) und 56mg Osmiumtetraoxid (0,21 mMole) in 50 ml Dioxan und 10ml Wasser wurden innerhalb von 45 min in kleinen Portionen 4,5 g Natriumperiodat (21 mMole) gegeben. Nach 10-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das bis dahin ausgefallene Salz abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die Reinigung erfolgte chromatographisch im Laufmittelgemisch Cyclohexan/Essigester 5/1 (v/v). Ausbeute: 2,8 g (6,5 mMole, 80 %) .
(1-4) Synthese von 3α- (2-Hydroxyethoxy) -5ß-cholan-24-säure- met ylester
In 40 ml eines Gemisches aus THF und Wasser im Verhältnis 4/1 (v/v) wurden 3,5 g 3α-Hydroxyethoxy-5ß-cholan-24-säure- methylester (8,1 mMole) gelöst und mit 250 mg Natriumborhydrid (6,61 mMole) versetzt. Nach 14-stündigem Rühren wurde solange 0,1 N HCl zugegeben, bis keine Wasserstoffentwicklung mehr zu beobachten war. Die organischen Bestandteile er Lösung wurden mit Ether extrahiert, die vereinigten Etherphasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde anschließend am Rotationsverdampfer entfernt. Das erhaltene Rohprodukt wurde mit Hilfe einer Flashchromatographie im Laufmittel Cy- clohexan/Essigester 4:1 (v/v) gereinigt. Ausbeute: 2,2 g (5,1 mMole, 63 %) .
(1-5) Synthese von 3α- (2-Hydroxyethoxy) -5ß-cholan-24-säure
Die Verseifung von 1 g 3α- (2-Hydroxyethoxy) -5ß-cholan-24- säure-methylester (2,3 mMole) erfolgte durch vierstündiges Erhitzen unter Rückfluss in einer Lösung von 260 mg Kaliumhydroxid (4,6 mMole) in 20 ml Methanol und 5 ml Wasser. Nach Abkühlung wurde diese Lösung mit 250 ml verdünnter Salzsäure versetzt und 3-mal mit jeweils 200 ml Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Zur Reinigung des erhaltenen Produktes wurde eine Chromatographie mit einem Gemisch aus Cyclohexan/Essigester/Essigsäure in einem Verhältnis von 70/30/1 (v/v/v) als Laufmittel durchgeführt. Ausbeute: 0,89 g (2,1 mMole, 92%).
(2) Synthese von 3ß- (2-Hydroxyethoxy) -5ß-cholan-24-säure
Zu einer Lösung von 10 g 3α-Hydroxy-5ß-cholan-24-säure (26,6 mMole) in 10ml getrocknetem und frisch destilliertem Pyridin wurden unter Argonatmosphäre 2,6ml Methansulfonsäurechlorid (32 mMole) langsam zugetropft. Während dieser Zeit und noch weitere 30min lang wurde der Reaktionsansatz auf 0°C gekühlt. Anschließend wurde noch 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der gebildete Methansulfonsäurester wurde ohne Reinigung in einem Gemisch aus 40 ml wasserfreiem Glycol und 10 ml frisch destilliertem Pyridin gelöst und 2 h lang bei 100 °C gerührt. Nach dem Abkühlen wurde diese Lösung in 500 ml 0,1 N HCl gegeben und die organischen Bestandteile wurden drei Mal mit jeweils 500 ml Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt. Die Reinigung des Rohproduktes wurde auf chromatograsphischem Wege mit dem Laufmittel Cyclohexan/Essigester/Essigsäure 70/30/1 (v/v/v) durchgeführt. Ausbeute: 3,8 g (9,0 mMole, 38 %) .
(3) Herstellung der Natrium-3- (2-hydroxyethoxy) -5ß-cholan-24- oyl) -2 ' -aminoethansulfonate
(3-1) Synthese der 3- (2-Acetyl-ethoxy) -5ß-cholan-24-säuren
Zu einer Lösung von 1 g 3- (2-Hydroxyethoxy) -5ß-cholan-24-säure (2,4 mMole) in 15 ml getrocknetem und frisch destilliertem Pyridin wurden 4 ml Acetanhydrid gegeben und der Reaktionsansatz wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Um überschüssiges Acetanhydrid und eventuell gebildetes gemischtes Anhydrid zu hydrolysieren wurden 8 ml Wasser zugegeben. Pyridin, Wasser und Essigsäure wurden anschließend azeotrop mit Toluol im Vakuum entfernt. Die Reinigung des Produktes erfolgte durch Chromatographie unter erhöhtem Druck im Laufmittel Cyclo- hexan/Essigester/Essigsäure 80/20/1 (v/v/v) .
3 - (2-Acetyl-ethoxy) -5ß-cholan-24-säure:
Ausbeute: 870 mg (1,9 mMole, 79 %) ; Schmelzpunkt: 107 °C
3ß- (2-Acetyl-ethoxy) -5ß-cholan-24-säure :
Ausbeute: 980 mg (2,1 mMole, 88 %) ; Schmelzpunkt: 109 °C
(3-2) Synthese der Natrium-3- (2-hydroxyethoxy) -5ß-cholan-24- oyl-2 ' -aminoethansulfonate
In 10ml getrocknetem Dioxan wurden unter Schutzgasatmosphäre 660 mg (1,4 mMole) 3- (2-Acetylethoxy) -5ß-cholan-24-säure, 430 mg (2,1 mMole) DCCI und 240 mg (2,1 mMole) N-Hydroxysuccinimid gelöst, und der Reaktionsansatz wurde bei Raumtemperatur 12 h lang gerührt. Der während der Reaktion ausfallende N,N- Dicyclohexanharnstoff wurde abfiltriert und das klare Filtrat mit einer Lösung aus 263 mg Taurin (2,1 mMole) und 177 mg Na- triumhydrogencarbonat (2,1 mMole) in 5ml Wasser versetzt. Die- ser Reaktionsansatz wurde erneut 12 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der während der Reaktion ausgefallene N,N- Dicyclohexanharnstoff wurde wiederum abfiltriert, und Dioxan und Wasser wurden unter vermindertem Druck entfernft. Die Abspaltung der Acetylschutzgruppe erfolgte durch 2- stündiges Erhitzen in 50 ml 1 N NaOH unter Rückfluss. Das Produkt wurde durch Adsorptionschromatographie an Serdolit® PAD-
1 aus der Reaktionsmischung entfernt und säulenchromatogra- phisch bei erhöhtem Druck im Lauf ittel CHCl3/MeOH 3/1 (v/v) gereinigt .
Natrium- (3α- (2-hydroxyethoxy) -5ß-cholan-24-oyl) -2^- aminoethansulfonat :
Ausbeute: 550 mg (1,0 mMole, 72 %) ; Schmelzpunkt: 223 °C.
Natrium- (3ß- (2-hydroxyethoxy) -5ß-cholan-24-oyl) -2 - aminoethansulfonat :
Ausbeute: 650 mg (1,2 mMole, 85 %) ; Schmelzpunkt: 214 °C.
(4) Herstellung der Dinatrrum-3- (1, 2-O-distearoyl-sn-glycero- 3-phospho-2''-ethanolamidosuccinyl) -ethoxy-5ß-cholan-24-oyl-2 - aminoethansulfonate
(4-1) Synthese der Natrium-3-succinylethoxy-5ß-cholan-24-oyl-
2 ^-aminoethansulfonate
Zu einer Lösung von 200 mg (0,38 mMole) Natrium-3- (2- Hydroxyethoxy) -5ß-cholan-24-oyl-2 ^-aminoethansulfonat in 5 ml getrocknetem und frisch destilliertem Pyridin wurden 120 mg (1,2 mMole) Bernsteinsäureanhydrid gegeben und 12 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssiges Bernsteinsäureanhydrid und eventuell gebildetes gemischtes Anhydrid wurden durch einstündiges Rühren nach Zugabe von 2 ml Wasser hydrolysiert . Pyridin und Wasser wurden nach Beendigung der Reaktion azeotrop mit Toluol am Rotationsverdampfer entfernt. Das erhaltene Rohprodukt wurde über eine Säulenchromatographie im Laufmittel CHCl3/MeOH 2/1 (v/v) gereinigt. Natrium-3α- (succinyl-ethoxy) -5ß-cholan-24-oyl-2^- aminoethansulfonat : Ausbeute: 170 mg (0,27 mMole, 71 %) ; Schmelzpunkt: 178 °C.
Natrium-3ß- (succinyl-ethoxy) -5ß-cholan-24-oyl-2 - aminoethansulfonat :
Ausbeute: 190 mg (0,30 mMole, 79 %) ; Schmelzpunkt: 176 °C.
(4-2) Synthese der Dinatrium-3- (l,2-0-distearoyl-sn-glycero-3- phospho-2 " -ethanolamidosuccinyl) -ethoxy-5ß-cholan-24-oyl-2 - aminoethansulfonate (Fig. 1)
Eine Lösung von 250 mg (0,39 mMol) Natrium-3- (2-ethoxy) -5ß- cholan-24-oyl-2^-aminoethansulfonat in 3 ml wasserfreiem DMF wurde unter Argonatmosphäre mit 116 mg DCCI (0,58 mMole) und 65 mg (0,58 mMol) N-Hydroxysuccinimid versetzt und 16 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Der ausgefallene Niederschlag wurde abgesaugt und mit 2 ml kaltem DMF gewaschen. Das aktivierte Gallensalzderivat wurde durch Zugabe von 50 ml Ether ausgefällt, der Niederschlag nach kurzer Zentrifugation vom Überstand getrennt und in einem Gemisch aus 10 ml CHC13, 5 ml MeOH und 200 μl Wasser gelöst.
Zu dieser Lösung wurden 300 mg DSPE (0,4 mMole) und 400 μl 1 N NaOH (0,4 mMole) gegeben und der Reaktionsansatz wurde anschließend 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde nach Beendigung der Reaktion im Vakuum entfernt und das erhaltene Produkt wurde mittels einer Säulenchromatographie mit dem Laufmittel CHCl3/MeOH/H20 9/3/0,1 (v/v/v) gereinigt .
Dinatrium-3α- (1, 2-0-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-2 - ethanolamidosuccinyl) -ethoxy-5ß-cholan-24-oyl-2 "- aminoethansulfonat :
Ausbeute: 170 mg (0,12 mMole, 31 %) ; Schmelzpunkt: 211 °C. Rf-Werte : 0,08 CHCl3/MeOH/H20 9/3/0,1 (v/v/v)
0,10 CHCl3/MeOH 2/1 (v/v) ^- MR: δ = 0,69 (s, 3H, CH3-18) ; 0,90 (t, J = 8, 6H, 2 x H3C-CH2-) ; 0,95 (s, 3H, CH3-19) ; 0,95 (d, J = 7 Hz, 3H, CH3- 21); 2,32 (dd, J = 7, 4H, 2 X -CH2-CH2-CH2-0-CO-) ; 2,56 (t, J = 7, 2H, -CO-CH2-CH2-CO-0-) ; 2,69 (t, J = 7, 2H, -NH-C0-CH2-CH2-C0-) ; 3,01 (t, J = 7 Hz, 2H, -CH2-S03 ~) ; 3,35
(m, 1H, CH-3) ; 3,44 (m, 2H, -0-CH2-CH2-NH-) ; 3,61 (t, J = 7 Hz, 2H, -HN-CH2-CH2-S03Na) ; 3,70 (t, 2H, J = 6 Hz, -CH2-0-CH-) ; 3,81 - 4,18 (m b, 6H) ; 4,21 (t, 2H, J = 6 Hz, -CO-0-CH2-) ; 5,23 (m, -0-CH2-HCOH-CH2-0-) ;
(Lösungsmittel: CDCl3/CD3OD/D20 2/1/0,1 (v/v/v))
Massenspektrum: m/z = 1424 (M+Na)+, 1402 (M+H)+, 1380 (M- Na+2H)+, 1378 (M-Na)", 677 (M-2Na)2"
Dinatrium-3ß- (1, 2-0-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-2' - ethanolamidosuccinyl) -ethoxy-5ß-cholan-24-oyl-2 - aminoethansulfonat :
Ausbeute: 220 mg (0,16 mMol, 41 %) ; Schmelzpunkt: 206 °C.
Rf-Werte : 0,08 CHCl3/MeOH/H20 9/3/0,1 (v/v/v) 0,03 CHCl3/MeOH/H20 8/2/0,1 (v/v/v)
^Η-NMR: 5 = 0,68 (s, 3H, CH3-I8) ; 0,92 (t, J = 8, 6H, 2 X H3C-CH2-); 0,96 (d, J = 7 Hz, 3H, CH3-21) ; 0,97 (s, 3H, CH3-
19) ; 2,35 (dd, J = 7, 4H, 2 X -CH2-CH2-CH2-0-C0-) ; 2,56 (t, J = 7, 2H, -C0-CH2-CH2-C0-0-) ; 2,68 (t, J = 7, 2H, -NH-CO-CH2-CH2-CO-) ; 3,01 (t, J = 7 Hz, 2H, -CH2-S03 ~) ; 3,44 (m, 2H, -0-CH2-CH2-NH-) ; 3,58 (t, J = 7 Hz, 2H, -HN-CH2-CH2-S03Na) ; 3,62 (t, 2H, J = 6 Hz, -CH2-0-CH-) ; 3,67 (m, 1H, CH-3) ; 3,92 - 4,21 (m b, 6H) ; 4,21 (t, 2H, J = 6 Hz, -CO-O-CH2-) ; 5,27 (m, -0-CH2-HC0H-CH2-0-) ; (Lösungsmittel: CDC13/CD30D/D20 2/1/0,1 (v/v/v))
Massenspektrum: m/z = 1424 (M+Na)+, 1402 (M+H) +, 1380 (M-
Na+2H)+, 1378 (M-Na)", 677 (M-2Na)2"
Beispiel 2 :
Herstellung von erfindungsgemäßen Partikeln am Beispiel von Liposomen
Die Herstellung von Liposomen erfolgte in einer modifizierten Form nach der Extrusionsmethode von MacDonald et al . , Biochim. Biophys. Acta. 1061, 297-303. (1991).
Die einzelnen Lipide, die in der Liposomenmembran enthalten sein sollten, wurden in definierter Konzentration in Chloroform (POPC, DPPC, DNPC, DMPC, DMyPC, Cholesterol) oder in einem Gemisch aus Chloroform, Methanol und dest. Wasser im Verhältnis 1/1/0,02 (v/v/v) (DSPG, DMPG, 3-LCT-DSPE) gelöst. Diese Stammlösungen wurden bei -20 °C gelagert. Zur Herstellung von Liposomen gewünschter Lipidzusammensetzung wurden die entsprechenden Aliquoten der Lipidstammlösungen in einen 25-ml- Rundkolben überführt. Die Lipidzusammensetzung der verwendeten Liposomen in Mol-% ist in Tab. 1 angegeben.
Tabelle 1. Lipidzusammensetzung der verwendeten Liposomen in Mol-
Figure imgf000019_0001
Die resultierende Lipidmischung wurde im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und anschließend 45 min lang im Olpumpenvakuum getrocknet. Für die Liposomenpraparation wurde folgender Puffer (pH 7,4) verwendet (Liposomenpuffer) :
NaCl 118 mM
KC1 4,74 rtiM
KH2P04 0,59 mM
Na2HP04 0,59 mM
HEPES 10 mM NaHCO„ 15 mM
MgCl2 1,18 mM
Der verwendete Puffer entsprach in seiner Zusammensetzung dem für die Hepatocytenisolierung verwendeten Perfusionspuffer. Auf Glucose wurde verzichtet, um die Lagerfähigkeit der Liposomen zu erhöhen. Vor seiner Verwendung wurde der Liposomenpuffer durch eine Membran mit einem Porendurchmesser von 220 μm filtriert. Um die Lipide zu resuspendieren wurde die gewünschte Menge an Liposomenpuffer zur getrockneten Lipidmischung gegeben und es wurde 15 min lang bei 40 °C und 50 Upm mit Hilfe eines Rotationsverdampfers gerührt. Durch die Zugabe von 10-20 Glasperlen (710 - 1018 microns) konnte das Resuspen- dieren der Lipide erheblich beschleunigt weden. Die zugegebene Menge an Liposomenpuffer wurde so gewählt, dass die erhaltene Suspension 10 - 40 mg Lipid/ml enthielt. Die Lipidsuspension wurde 30 s lang bei 1000 x g zentrifugiert und danach 2 h lang bei Raumtemperatur ruhen gelassen. Schließlich wurden die entstandenen multilamellaren Vesikel mit Hilfe einer Extrusions- apparatur LiposoFast® (Milsch-Equipment , Laudenbach, Deutschland) 13-mal durch eine Polycarbonatmembran (LFM-200, Milsch- Equipment) mit einem Porendurchmesser von 200 nm gedrückt und anschließend 21-mal durch zwei übereinanderliegende Polycarbo- natmembranen (LFM-100, Milsch-Equipment) mit einem Porendurchmesser von 100 nm gedrückt. Die Liposomen wurden bei 4 °C gelagert und nicht länger als 7 Tage nach ihrer Herstellung benutzt .
Die Größenbestimmung der hergestellten Liposomen erfolgte mittels der PCS (Photonen-Korrelations-Spektroskopie) (C. Washington, 1992, in M.H. Rubinstein, ed., Ellis Horwood, Ltd., London, England.). Die Ergebnisse mittleren Durchmesser (gemessen aus jeweils 9 individuellen Präparationen, angegeben sind die Mittelwerte und die Standardabweichung) für die Gallensalz tragenden Liposomen und die Kontroll-Liposomen sind in Tab. 2 gezeigt.
Tabelle 2..
Figure imgf000020_0001
Die hergestellten Liposomen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 120 nm sind für die Untersuchung der Bindung von gal- lensalztragenden Liposomen an Hepatozyten sowohl in vitro als auch in vivo sehr gut verwendbar. Die mögliche Struktur für das Gallensalz tragende Liposom ist in Fig. 2A gezeigt, um die Größenverhältnisse zu veranschaulichen (die gezeigte Größe soll einem Liposomendurchmesser von 100 nm entsprechen) . Die Liposomenmembran 1 weist so genannte Gallensalzschichten 2 auf. Fig. 2B zeigt einen modellhaften, vergrößerten Ausschnitt aus der Membran eines solchen Gallensalz tragenden Liposoms .
Beispiel 3 :
Inhibierung des Gallensalztransports in Hepatocyten durch das erfindungsgemäße Konjugat tragende Partikel
Zu dieser Untersuchung wurde die Aufnahme von radioaktiv markierten Substanzen in frisch isolierte Hepatozyten mit Hilfe der Zentrifugalfiltrationstechnik durch eine Silikonölschicht bestimmt (Klingenberg, M. & Pfaff, E., Methods Enzymol . 10, 680-684) . Für die Bestimmung der Aufnahmegeschwindigkeit in Anwesenheit von Liposomen wurden Kontroll-Liposomen oder 3-ß- LCT-DSPE tragende Liposomen in Konzentrationen von 0,5, 2 und 5 mM liposomalem PC verwendet. Für jede Liposomensorte und jede Liposomenkonzentration wurden jeweils drei Messreihen durchgeführt. Bei den Versuchen mit Liposomen wurden entsprechende Mengen Liposomenstammlösung zu der CT-Lδsung gegeben und die CT und Liposomen enthaltenden Inkubationsansätze wurden vor Zugabe der Zellen mindestens 15 min lang auf 37 °C temperiert. Durch Zugabe von jeweils 400 μl der Zellstammlösung, die eine Konzentration von ungefähr 2,5 x 106 Zellen/ml
(5 mg/ml) aufwies, wurde die Messung der CT-Aufnähme gestartet. Über einen Zeitraum von 60 s wurden alle 10 s jeweils 100 μl aus dem Inkubationsansatz entnommen und in ein Zentri- fugenröhrchen überführt, das zuvor mit 10 μl 0,77 M Perchlorsäure und 150 μl einer Silikonölmischung (AR 20:AR 200 = 1:1
(v/v) blasenfrei gefüllt worden war. Die Aufnahme wurde durch Zentrifugalfiltration gestoppt (Microfuge® B, Beckman Instruments, München, Deutschland) , wobei die Zellen aus dem wässri- gen Medium durch die Silikonölschicht hindurch in die Perchlorsäurelösung überführt und dort denaturiert werden. Nach Beendigung der Messung wurden die Zentrifugenröhrchen in flüssigem Stickstoff eingefroren und an der Phasengrenze zwischen Perchlorsäure und Silikonol durchtrennt. Die Spitzen, in denen sich die denaturierten Zellen befanden, wurden einzeln in ein Szintillationsgefäß überführt und mit 250 μl einer 1:2-
Mischung (v/v) von Biolute® S (Zinsser Analytik) und Xylol versetzt.
Zur Bestimmung der eingesetzten Gesamtradioaktivität wurden jedem Ansatz zweimal 50 μl entnommen und in Flüssigkeitsszin- tillationsgefäße überführt. Zur Bestimmung der Radioaktivität wurden die Proben genauso behandelt wie die Spitzen, welche die denaturierten Zellen enthielten. Die Ermittlung der Proteinkonzentration bei den Aufnahmeuntersuchungen erfolgte durch sechsfache Bestimmung der Proteinkonzentration in der Zellstammlösun .
Die Auswertung der Meßwerte erfolgte gemäß folgender Gleichung :
B D
In dieser Gleichung bedeuten:
J : Flussrate [nMole/ (min-mg Protein)]
A : Steigung der Regressionsgeraden [dpm/min] ; aus 100 μl Probe
B : Gesamtradioaktivität im Ansatz [dpm]
C : Menge des Substrats [nMole]
D : Menge an Protein in 100 μl des Inkubationsansatzes [mg/100 μl]
Bei einer Konzentration von 2 mM liposomalem PC und gleichzeitiger Zugabe von Liposomen und CT konnte bei frisch isolierten Hepatozyten eine deutlich signifikante Gallensalz vermittelte Inhibition des CT-Transportes festgestellt werden. Bei frisch isolierten Hepatozyten zeigten 3-ß-LCT-DSPE tragende Liposomen deutlich ausgeprägtere Wechselwirkungen mit den Hepatozyten als 3- -LCT-DSPE tragende Liposomen. Ein typisches Ergebnis ist in Fig. 3 dargestellt. Sowohl die Aufnahme von radioaktivem CT in Abwesenheit als auch in Anwesenheit von Liposomen steigt im beobachteten Intervall linear mit der Zeit an. Kontroll-Liposomen üben praktisch keinen Einfluss auf die Transportgeschwindigkeit von CT aus, während 3-α-LCT-DSPE tragende Liposomen die Aufnahme von CT geringfügig, 3-ß-LCT-DSPE tragende Liposomen die Aufnahme von CT deutlich inhibieren.
Die Ergebnisse verdeutlichen eine spezifische Bindung der Gallensalz tragenden Liposomen an Gallensalz transportierende Proteine der Hepatocyten. Eine Aufnahme der erfindungsgemäß modifizierten Liposomen über eine Rezeptor vermittelte En- docytose wurde praktisch nicht beobachtet. Somit kann ein ly- sosomaler Abbauweg verhindert oder zumindest stark unterdrückt werden.
Beispiel 4 :
Langlebige, Gallensalz tragende Partikel am Beispiel von Liposomen
(1) Herstellung
Die Präparation der langlebigen Liposomen erfolgte wie im Beispiel 2 beschrieben, wobei jedoch die in Tabelle 3 angegebene Lipidzusammensetzung verwendet wurde.
Tabelle 3 Lipidzusammensetzung der langlebigen Liposomen in Mol-
Figure imgf000024_0001
a: erhältlich von Avanti Polar Lipids, Ine Alabaster,
Alabama, USA b: erhalten gemäß Beispiel 1
(2) Untersuchung der Organverteilung von langlebigen Liposomen in vivo
Für Untersuchung der Organverteilung von langlebigen Liposomen wurden Liposomen verwendet, die mit [3H] Cholesterylhexadecyl- ether markiert waren. Männliche Albinoratten vom Stamm Wistar S 300 (ca. 200 g) wurden durch eine intraperitoneale Injektion einer 2%igen Nembutal®-Lösung (1,5 ml/kg Körpergewicht) narkotisiert. Die injizierte Menge an langlebigen Liposomen wurde so berechnet, dass die PC-Konzentration im Serum der Ratten 2 mM liposomales PC betrug. Die entsprechende Menge Liposomen- stammlösung wurde mit 1 Vol% einer sterilen 125 mM CaCl2- Lösung versetzt und mit Hilfe einer Kanüle über einen Zeitraum von etwa 1 min in die Vene des Hinterbeines injiziert. Nach 90 min wurde der Bauchraum der Ratten geöffnet und die Nieren und die Milz wurden entfernt. Aus dem Herzen wurde eine Blutprobe entnommen und in ein vorbereitetes 1, 5-ml-Reaktionsgefäß gefüllt, das zur Vermeidung der Gerinnung EDTA enthielt. Zum Abtrennen der Erythrozyten wurde die Blutprobe bei 2000 x g 2 min lang zentrifugiert. Vom Überstand wurden 3 Aliquoten zu je 200 μl in 20-ml-Flüssigkeitsscintillationsgefäße überführt. Die Leber wurde mit 10 ml des nachfolgend angegebenen Zellpuffers perfundiert und anschließend entfernt. Nieren und Milz wurden jeweils mit 10 ml eiskaltem Zellpuffer versetzt, die Leber wurde mit 15 ml eiskaltem Zellpuffer versetzt, und die Organe wurden anschließend homogenisiert. Das Gesamtvolumen des Homogenisats wurde bestimmt und jeweils 3 Aliquoten zu je 200 μl wurden in 20-ml-Flüssigkeitsscintillationsgefäße überführt. In jedes der 20-ml-Flüssigkeitsscintillationsgefäße wurden 1 ml Biolute S® (Zinnser) gegeben und die Proben wurden wie beschrieben der Flüssigkeitsscintillationsmessung zugeführt .
Zellpuffer:
NaCl 118 mM
KC1 4,74 mM
KH2P04 0,59 mM
Na2HP04 0,59 mM
HEPES 10 mM
NaHCO 4. 15 mM
MgCl2 1,18 mM
D-Glucose 5,5 mM
CaCl2 125 mM
Das Ergebnis der Organverteilung nach 90 minütiger Infusion ist in Fig. 4 gezeigt. Die langlebigen, Gallensalz tragenden Liposomen (schraffierte Säulen) sind wesentlich spezifischer in der Leber vorhanden als die Kontroll-Liposomen (schwarze Spalte) . Milz und Niere sind wie bei der Kontrolle praktisch nicht betroffen.
(3) Anreicherung der erfindungsgemäßen Liposomen auf der Hepa- tocytenoberflache
Für die Untersuchung der Anreicherung von langlebigen Liposomen an Leberhepatocygten wurden Liposomen verwendet, die 0,3 Mol-% des fluoreszierenden Farbstoffes Ph2-DiOC18 (erhältlich von Molecular Probes Europe, Leiden, Holland) enthielten.
Die Fluoreszenzintensitäten der Liposomenpraparationen wurden fluoreszenzspektroskopisch bestimmt, und für die Untersuchungen mit Hilfe der konfokalen Laser-scanning-Mikroskopie wurden immer Suspensionen von Kontroll-Liposomen und Gallensalz tragende Liposomen mit gleicher Fluoreszenzintensität eingesetzt. Die Anregung der Ph2-DiOC18 tragenden Liposomen erfolgte mit Hilfe eines Argon Lasers bei einer Wellenlänge von 488 nm, die Detektion des Fluoreszenzsignals erfolgte bei einer Wellenlänge von 505 nm.
Die Kultivierung der Hepatozyten erfolgte auf mit Kollagen Typ
1 beschichteten Objektträgern mit einem Durchmesser von 30 mm, die in 35-mm-Kulturschalen eingelegt wurden. Die den Zellrasen tragenden Objektträger wurden am Rande mit Silikon beschichtet und auf die Objektträger wurde eine temperierbare Durchfluss- ka mer aufgelegt, die über einen Zulauf und einen Ablauf verfügte .
Anschließend wurde das über den Zellen befindliche Zellkulturmedium möglichst vollständig entfernt, und 150 μl einer wie im Beispiel 2 beschrieben hergestellten, erfindungsgemäßen Lipo- somensuspension, die 2 mM liposomales PC enthielt, wurden zu den Zellen gegeben. Nach 5-minütiger Inkubation der Zellen bei 37 C wurde die Liposomensuspension möglichst vollständig abgesaugt, und die Zellen wurden vorsichtig 3-mal mit je 150 μl Zellpuffer gewaschen. Dann wurden 150 μl Zellkulturmedium zu den Zellen gegeben und die Durchflusskammer wurde in das konfokale Lasermikroskop eingesetzt. Die Aufnahme erfolgte mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (LSM 510 UV; ZEISS, Jena, Deutschland; Aufnahmegeschwindigkeit: 2,24 μs/Pixel; Pixelgröße in x- und y-Richtung: 0,2 - 0,4 μm; Abstand der Schnittebenen in z-Richtung: 0,05 μm bis 0,15 μ ; Einstellung des Pinhole so, dass die halb maximale z-Auflösung bei voller Weite zwischen 0,5 und 1 μm lag) .
Zur längeren Inkubation wurden die Hepatozyten zur Kultivierung in der Kulturschale belassen und vorsichtig 3-mal mit je
2 ml Zellpuffer gespült. Anschließend wurden 2 ml einer 2 mM liposomales PC enthaltenden, erfindungsgemäßen Liposomensuspension zugegeben, und die Hepatozyten wurden unter den üblichen Bedingungen für weitere 6h in einem Brutschrank kultiviert. Anschließend wurden die Liposomensuspensionen entfernt, und die Hepatozyten 3-mal mit je 2 ml Zellpuffer sehr vorsichtig gewaschen. Die Objektträger wurden wie beschrieben in die Durchflusskammer eingebracht und wie oben beschrieben unter dem konfokalen Lasermikroskop betrachtet .
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse der Bindung von Liposomenaggrega- ten an der Hepatocytenoberfläche, wobei Fig. 5A die Bindung Gallensalz tragender Liposomen nach 5 min, Fig. 5B die Bindung Gallensalz tragender Liposomen nach 6 h, Fig. 5C einen vergrößerten Ausschnitt aus Fig. 5B und Fig. 5D den Vergleich mit Kontrollliposomen nach 6 h zeigt. Fluoreszierende Liposomenag- gregate erscheinen in Form von hell fluoreszierenden Punkten (s. Pfeile in Fig. 5B und 5C) . Die spezifische Bindung an Hepatocyten ist deutlich sichtbar (vgl. Fig. 5B und C im Vergleich zu Fig. 5D) .
(4) Lokalisierung der erfindungsgemäßen Liposomen in der Leber
Die Infusion der Liposomen erfolgte analog wie im Beispiel 4 beschrieben. Nach Perfusion der Leber wurden mit einem Skalpell kleine Stücke der einzelnen Leberlappen entfernt. Die entnommenen Leberstücke wurden auf eine dünne Korkscheibe verbracht und sofort in flüssigem N2 tiefgefroren. Von den tiefgefrorenen Leberstücken wurden mit einem Mikrotom Ultradünnschnitte des Lebergewebes angefertigt . Diese wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
Langlebige Gallensalz tragende Liposomen zeigten im Gegensatz zu Kontroll-Liposomen 90 min nach Injektion eine deutliche Fluoreszenzintensität in weiten Teilen des Lebergewebe. Langlebige Kontroll-Liposomen dagegen zeigten nur an einige Stellen eine sporadische Fluoreszenzintensität. Die starke Anreicherung der erfindungsgemäß aufgebauten Liposomen entlang der Sinusoide der Leber zeigt, dass die erfindungsgemäß aufgebauten Liposomen auch in vivo eine Gallensalz vermittelte Wechselwirkung mit Hepatozyten vermitteln.
Beispiel 5 Fusion von mit einer Modellsubstanz beladenen Liposomen mit . - Hepatozyten in Primärkultur
Um die Fusion von Liposomen mit Hepatozyten zu erleichtern bzw. zu beschleunigen wurden Liposomen verwendet, die ein geeignetes Fusionspeptid (SBP25) enthielten (WO 99/39742 A) . Das Peptid SBP25 wurde chemisch synthetisiert, durch High- performance-liquid-chromatographie gereinigt und besitzt die folgende Aminosäuresequenz: Ac-Phe-Pro-Ile-Pro-Leu-Pro-Tyr- Cys-Trp-Leu-Ala-Arg-Ala-Leu-Ile-Lys-Arg-Ile-Gln-Ala-Met-Ile- Pro-Lys-Gly-NH2 (HPLC-Reinheit 87 %) .
Die Präparation der Liposomen erfolgte wie im Beispiel 2 beschrieben durch Extrusion, wobei die in Tabelle 4 angegebene Lipidzusammensetzung verwendet wurde. SBP25 wurde in Methanol gelöst, und zur Präparation von SBP25 tragenden Liposomen wurden 0,04 μmole SBP25 je μmol Phospholipid zu der jeweiligen Mischung aus in organischen Lösungsmitteln gelösten Lipiden gegeben. Das organische Lösungsmittel wurde dann entfernt. Für die Resuspension der Lipide wurde folgender Puffer (pH 7,6) verwendet :
NaCl 110 mM
KC1 4,74 mM
KH2P04 0,59 mM
Na2HP04 0,59 mM
HEPES 20 mM
NaHCO 4. 15 mM
MgCl2 1,18 mM
In diesem Puffer wurden 25 mg/ml Dextran gelöst, das mit Fluo- rescein derivatisiert worden war (erhältlich von Molecular Probes, Inc.; die mittlere Molmasse des Dextrans betrug 10000 g/mol, so dass Konzentration der an Dextran gebundenen Fluo- resceinmoleküle : 2 , 5 - 5 mM Fluorescein) .
Tabelle 4 Zusammensetzung der für die Untersuchungen zur Fusion von Liposomen mit Hepatozyten verwendeten Liposomen in Mol-%
Figure imgf000029_0001
Die Abtrennung des nicht verkapselten Lipides erfolgte mit Hilfe einer Gelpermeationschromatographie . Für die Gelpermea- tionschromatographie wurde eine Chromatographiesäule mit einem Durchmesser von 15 mm und einer Länge von 55 mm verwendet, die mit Sephadex S-500 (Pharmacia) gefüllt war. Die Liposomensus- pensionen wurden auf ein Volumen von 1 ml gebracht, und die anschließende Trennung der Liposomen und des nicht verkapselten fluoreszierende Dextrans erfolgte unter hydrostatischem Druck.
Zur Fusion der modifizierten Liposomen mit den Hepatozyten in Primärkultur enthielten die Liposomensuspensionen 2 mM liposomales PC. Nach 2 h, 5 h oder 20 h wurden die Liposomensuspensionen entfernt, die Zellen gewaschen und anschließend unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
Nach 2, 5 und 20 h wurden die Liposomen von den Zellen entfernt und die Hepatozyten wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet . Nach 2 h konnte keine Fluoreszenzfärbung der Hepatozyten beobachtet werden. Nach 5 h zeigten SBP25 tragende Liposomen und SBP25 und Gallensalz tragende Liposomen eine geringe Fluoreszenzfärbung der Hepatozyten. Nach 20 h zeigten SBP25 tragende Liposomen und SBP25 und Gallensalz tragende Liposomen im Gegensatz zu Kontroll-Liposomen eine deutliche Fluoreszenzfärbung des Zytosols der Hepatozyten. Die Anwesenheit von SBP25 und Gallensalz tragenden Liposomen führte zu einer deutlich intensiveren Färbung des Zytoplasmas der Hepatozyten, als die Anwesenheit von SBP25 tragenden Liposomen. Die Gallensalz vermittelte Bindung der Gallensalz und SBP25 tragenden Liposomen ist somit in der Lage, den durch SBP25 vermittelten Fusionsprozess zu beschleunigen.

Claims

Ansprüche
1. Konjugat mit folgenden Komponenten:
(a) einer Lipid-Struktureinheit,
(b) einer Gallensäure- oder Gallensalz-Struktureinheit, wobei die Struktureinheiten (a) und (b) kovalent, gegebenenfalls über eine dazwischenliegende Komponente
(c) einer Linker-Struktureinheit , verbunden sind.
2. Konjugat gemäß Anspruch 1, wobei die Lipid- Struktureinheit (a) von in Zellen vorkommenden Fett- oder fettähnlichen Stoffen stammt.
3. Konjugat gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Lipid-Struktureinheit (a) ein Phosphoglycerid ist, welches an (b) oder
(c) mit einer Phosphodiesterverknüpfung kovalent gebunden ist,
4. Konjugat gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Lipid-Struktureinheit (a) ein C12- bis C18-Fettsäurerest enthält .
5. Konjugat gemäß Anspruch 3, wobei das Phosphoglycerid einen Diacylrest aufweist, wobei die Acylreste unabhängig voneinander eine C12- bis C18-Kette aufweisen.
6. Konjugat gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Gallensäure- oder Gallensalz-Struktureinheit (b) ein 5ß- Cholansäurederivat ist.
7. Konjugat gemäß Anspruch 1 oder 6, wobei die Struktureinheit (b) mit einer Taurylgruppe derivatisiert ist.
8. Konjugat gemäß Anspruch 1, 6 oder 7, wobei die Verknüpfung der Struktureinheit (b) an (a) oder (c) über die 3- Position des Steroidgerüsts der Gallensäure- oder des Gallensalzes erfolgt.
9. Konjugat gemäß Anspruch 8, wobei die Verknüpfung an die
3-Position des Steroidgerüsts in der ß-Konfiguration vorliegt.
10. Konjugat gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Linker-Struktureinheit (c) eine Polyalkylenglykol- und/oder eine Alkyldiacarboxylatgruppe ist .
11. Konjugat gemäß einem der vorangehenden Ansprüche zur Anwendung auf medizinischem Gebiet.
12. Partikel, welches ein Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 umfaßt.
13. Partikel gemäß Anspruch 12 mit der Eigenschaft, an Gallensäure oder Gallensalz transportierende Proteine binden zu können.
14. Partikel gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei der Mengenanteil des Konjugats 0,5-5 Gew.-%, bezogen auf Partikel- Gesamtmenge, beträgt.
15. Partikel gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, aufgebaut in Form eines Liposoms, welches das Konjugat trägt.
16. Partikel gemäß Anspruch 15, wobei das Liposom neben dem Konjugat Phospholipide enthält, die aus folgender Gruppe mit jeweiligen Anteilen ausgewählt sind:
20 bis 40 Mol-% Phospholipide mit langkettigen gesättigten Fettsäuren von C16 und darüber,
10 bis 30 Mol-% Phospholipide mit langkettigen ungesättigten Fettsäuren von C16 und darüber, und 10 bis 40 Mol-% Phospholipide mit mittelkettigen gesättigten Fettsäuren von C8 bis C14, und 40 bis 90 Mol-% Phospholipide mit mittelkettigen ungesättigten Fettsäuren von C8 bis C14.
17. Partikel gemäß Anspruch 15 oder 16, wobei das Liposom ferner Cholesterol enthält .
18. Partikel gemäß Anspruch 17, wobei der Gehalt an Cholesterol 20 bis 60 Mol-% beträgt.
19. Partikel gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei das Liposom ferner eine negativ geladene Lipidkomponente enthält.
20. Partikel gemäß Anspruch 19, wobei der Gehalt der negativ geladenen Lipidkomponente 5 bis 15 Mol-% beträgt.
21. Partikel gemäß einem der Ansprüche 12 bis 20, wobei die mittlere Teilchengröße des Partikels im Bereich von lOn bis 500nm liegt.
22. Partikel gemäß einem der Ansprüche 12 bis 21, wobei es zusätzlich ein Fusionspeptid umfaßt.
23. Partikel gemäß einem der Ansprüche 12 bis 22, wobei es zusätzlich eine Stealth-Komponente umfaßt.
24. Partikel gemäß einem der Ansprüche 12 bis 23, wobei es zusätzlich ein therapeutisches oder ein diagnostisches Mittel umfaßt .
25. Verwendung eines Konjugats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder eines Partikels gemäß einem der Ansprüche 12 bis 24 in der medizinischen Therapie oder der Diagnostik.
26. Kit mit folgenden Bestandteilen:
- einem Partikel gemäß einem der Ansprüche 12 bis 23 und
- ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel .
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