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WO2004031769A1 - 相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置、並びにバイオアッセイ用基板 - Google Patents

相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置、並びにバイオアッセイ用基板 Download PDF

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Publication number
WO2004031769A1
WO2004031769A1 PCT/JP2003/012168 JP0312168W WO2004031769A1 WO 2004031769 A1 WO2004031769 A1 WO 2004031769A1 JP 0312168 W JP0312168 W JP 0312168W WO 2004031769 A1 WO2004031769 A1 WO 2004031769A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bioassay
detection
interaction
cantilever
substrate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2003/012168
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takayoshi Mamine
Takashi Kinoshita
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sony Corp
Original Assignee
Sony Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sony Corp filed Critical Sony Corp
Priority to EP03799124A priority Critical patent/EP1548438B1/en
Priority to DE60323517T priority patent/DE60323517D1/de
Priority to US10/529,949 priority patent/US20060063153A1/en
Priority to AU2003266583A priority patent/AU2003266583A1/en
Publication of WO2004031769A1 publication Critical patent/WO2004031769A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N29/00—Investigating or analysing materials by the use of ultrasonic, sonic or infrasonic waves; Visualisation of the interior of objects by transmitting ultrasonic or sonic waves through the object
    • G01N29/02—Analysing fluids
    • G01N29/036—Analysing fluids by measuring frequency or resonance of acoustic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2291/00—Indexing codes associated with group G01N29/00
    • G01N2291/02—Indexing codes associated with the analysed material
    • G01N2291/025—Change of phase or condition
    • G01N2291/0256—Adsorption, desorption, surface mass change, e.g. on biosensors
    • G01N2291/0257—Adsorption, desorption, surface mass change, e.g. on biosensors with a layer containing at least one organic compound

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting an interaction, a bioassay device, and a substrate for a bioassay, which are particularly useful in the field of bioinformatics (bioinformatics).
  • This DNA chip has a comprehensive analysis of intermolecular interactions such as hybridization, since many different types of DNA oligonucleotide chains and complementary DNA (cDNA) are integrated on a glass substrate or silicon substrate. It is characterized by the fact that it becomes possible.
  • mRNA messenger RNA
  • mRNA messenger RNA
  • PCR amplification by incorporating a fluorescent probe dNTP by PCR (Polymerase Chain Reaction) reaction, etc., perform hybridization on the above substrate, and perform fluorescence measurement with a predetermined detector It is.
  • DNA chips can be classified into two types.
  • the first type synthesizes oligonucleotides directly on a given substrate by using a photolithography technique that applies semiconductor exposure technology, and is based on Afiymetrix. Things are typical.
  • This first type of DNA chip is described in, for example, Japanese Patent Publication No. Hei 4-1505763.
  • the second type also called the “Stanford method” is made by dispensing and solidifying DNA prepared in advance on a substrate using a split pin. Things.
  • the second type of DNA chip has a lower degree of integration than the first type of DNA chip, it has the advantage that a DNA fragment of about 1 kb can be immobilized.
  • This second type of DNA chip is described, for example, in Japanese Published Patent Application No. 10-503841.
  • a laser beam is applied to a force window on which the DNA probe is immobilized on the upper surface,
  • the presence or absence of a hybridization reaction is detected by measuring a change in the intensity of the reflected light at a predetermined position of the light receiving unit due to the bending of the cantilever as a result of the hybridization reaction.
  • a detection nucleotide chain such as a DNA probe, a protein, or the like is immobilized (immobilized) in a two-dimensional narrow detection portion of a substrate, and a hybridization reaction or the like is performed. Since the technology is such that the interaction between substances such as an antigen-antibody reaction progresses, the degree of freedom of the reaction product is spatially limited, and steric hindrance may occur during the reaction. For this reason, the conventional DNA chip technology and the like have a problem that the efficiency of the mutual reaction is low and the reaction time is long.
  • the sample solution is simply dropped onto a predetermined spot (detection unit) on the substrate, and is fixed to the target substance contained in the sample solution and the spot. No measures have been taken to position it relative to the detection substance in the engulfed state.
  • the above-mentioned cantilever sensor technology has the advantage that it is not necessary to carry out fluorescent labeling of the target substance contained in the sample solution in advance, but when the cantilever is highly integrated, the cantilever surface is irradiated with laser light. However, there is a problem that mechanical control for receiving the reflected light becomes difficult.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting an interaction and a bioassay device for detection, and a substrate for bioassay.
  • a method for detecting an interaction and a bioassay device include: a cantilever having at least a part of which is surface-treated so that a substance for detection can be fixed; A reaction region that provides a field of interaction between the detection substance and the target substance immobilized in the processing unit, a drive source that vibrates and excites the cantilever, and a vibration that detects the vibration amplitude of the cantilever; A detecting unit that includes at least a detecting unit that detects an interaction between the substances, and detects the interaction by measuring a change in the natural frequency of the cantilever based on the interaction.
  • the cantilever has a vibrator in which a piezoelectric material is arranged between opposing electrodes, and the driving source vibrates the force cantilever by applying an AC voltage between the opposing electrodes. I do.
  • the detection substance and the target substance are, for example, nucleotide chains, and the interaction is, for example, hybridization.
  • a substance for detection is used.
  • a substance for detection is immobilized on a cantilever having at least a portion of which is surface-treated so that it can be fixed, and a change in the natural frequency of the force cantilever based on an interaction between the substance for detection and a target substance is measured.
  • the interaction is detected.
  • the detection substance and the target substance are nucleotide chains
  • the detection nucleotide chain immobilized on the end surface of the cantilever and the target nucleotide chain are hybridized, so that the mass of the force receptor increases.
  • the natural frequency of the force chiller decreases. Therefore, in the method for detecting an interaction and the bioassay device according to the present invention, the change in the natural frequency is measured to detect the octylation.
  • a bioassay substrate comprises: a force sensor having at least a part of which is surface-treated so that a detection substance can be fixed; A detection unit is provided that includes at least a reaction region that provides a field for an interaction between the detection substance immobilized on the substrate and the target substance.
  • the detection unit may be configured as a cell detection unit provided with the cantilever protruding from a wall surface, and a plurality of the cell detection units are provided on a substrate.
  • the substrate for bioassay according to the present invention can be formed as a disc-shaped substrate, and in this case, the cell detection unit is arranged so as to exhibit a radial view from above.
  • the reaction region may be provided in a groove extending radially on the substrate.
  • the cantilever is provided in the groove. It is provided to protrude from one side.
  • different detection substances can be immobilized on the above-described cell detection unit or groove unit, or on a plurality of grouped cell detection units or groove units.
  • the reaction region may be filled with a substance capable of causing a reversible phase change of gel or sol between room temperature and the optimal reaction temperature.
  • FIG. 1 is a perspective view showing the appearance of a bioassay substrate used in a bioassay apparatus according to the present embodiment.
  • FIG. 2 is an enlarged perspective view showing one of a large number of cell detectors provided on the bioassay substrate.
  • FIG. 3 is an enlarged perspective view showing a force lever projecting from the reaction area side of the cell detection unit.
  • FIGS. 4A to 4D are diagrams illustrating an example of a manufacturing process of the same force lever.
  • FIG. 5 is a diagram showing a method of detecting a change in the natural frequency of the same force cantilever.
  • FIG. 6 is a diagram showing a voltage waveform measured when the frequency of the AC power supply is changed.
  • FIG. 7 is a perspective view showing another configuration of the same force cantilever.
  • FIG. 8 is a diagram showing a vertical cross section of the cantilever at a position including the piezoelectric element.
  • 9A and 9B are views for explaining another example of the substrate used in the bioassay apparatus.
  • FIG. 9A is a plan view of the substrate as viewed from above, and FIG. The enlarged plan view of the X section of FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • FIG. 9A is a plan view of the substrate as viewed from above
  • FIG. The enlarged plan view of the X section of FIG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • nucleotide chain means a polymer of a nucleoside phosphate ester in which a purine base or pyrimidine base and a sugar are daricoside-bonded, and an oligonucleotide containing a DNA probe, It broadly includes polynucleotides, DNAs (purified or fragmented) obtained by polymerizing purine nucleotides and pyrimidine nucleotides, cDNAs (cDNA probes) obtained by reverse transcription, RNAs, and the like.
  • FIG. 1 shows an external perspective view of a bioassay substrate (hereinafter, abbreviated as a substrate) 1 used in a bioassay apparatus according to the present embodiment.
  • the substrate 1 shown in FIG. 1 is used for a disk-shaped substrate (disk) used for an optical information recording medium such as a CD (Compact Disk), a DVD (Digital Versatile Disk), and an MD (Mini Disk) (registered trademark). Formed from a base material.
  • CD Compact Disk
  • DVD Digital Versatile Disk
  • MD Mini Disk
  • This base material is formed in a disc shape using quartz glass-silicon, polycarbonate, polystyrene, or other synthetic resin that can be formed into a disc shape, preferably a synthetic resin that can be injection-molded.
  • quartz glass-silicon polycarbonate, polystyrene, or other synthetic resin that can be formed into a disc shape, preferably a synthetic resin that can be injection-molded.
  • a lower running cost can be realized as compared with a conventional glass substrate.
  • a hole (not shown) for fixing a spindle used when rotating the substrate 1 can be formed.
  • a large number of cell detectors 2 each having a small chamber-like reaction region separated from the peripheral substrate region are provided so as to extend radially upward from the peripheral region at the center of the substrate 1. ing.
  • the cell detector 2 can be arranged at an appropriate position on the substrate 1, but by arranging the cells radially upward as described above, the space on the substrate 1 can be effectively used. And increase the information integration density.
  • the cell detectors 2 are partitioned so as not to contaminate each other, different detection nucleotide chains are immobilized in each cell detection unit or in each grouped cell detection unit, and each detection nucleotide chain is fixed. Separate and independent conditions can be set to allow the hybridization reaction to proceed.
  • a marker gene for the onset of disease can be grouped and immobilized on the substrate 1, thereby confirming the expression status of a plurality of diseases simultaneously using one substrate 1. Can be recognized.
  • FIG. 2 shows an enlarged perspective view of one of the cell detectors 2.
  • the cell detection unit 2 has a reaction region 10 where a hybridization reaction between the nucleotide chain D for detection and the target nucleotide chain T is performed, and both ends of the reaction region 10. It has a positive electrode 11 and a negative electrode 12 for forming an electric field (electric field), and a cantilever 13 protruding from the negative electrode 12 side of the cell detector 2.
  • the reaction region 10 is formed as a substantially square cell opening upward, for example, a cell having a depth of l / ⁇ m, a length and a width of 100 xm. Is not limited to
  • the end face 13a on the reaction region 10 side of the above-mentioned force trap 13 is subjected to a surface treatment so that the terminal site of the nucleotide chain D for detection is immobilized by a chemical bond such as a coupling reaction.
  • the end face 13a may be subjected to a surface treatment suitable for immobilizing the previously processed end portion of the nucleotide D for detection such as a DNA probe.
  • the surface treatment is performed on the end face 13a.
  • the present invention is not limited to this, and it is sufficient that at least a part of the cantilever 13 is subjected to the surface treatment.
  • an ion cloud is formed in the nucleotide chain by the phosphate ion (negative charge) forming the backbone of the nucleotide chain and the hydrogen ion (positive charge) formed by ionizing water around it.
  • the polarization vector generated by the negative and positive charges of the molecule is directed in one direction as a whole by the application of a high frequency high voltage, and as a result, the nucleotide chain is elongated.
  • the nozzle 3 whose tip portion is shown in FIG. 2 is for dropping the sample solution S (S ′), and is used for detection based on position information and rotation synchronization information provided from the substrate 1 as described later.
  • the sample solution S containing the nucleotide chain D and the sample solution S ′ containing the target nucleotide chain T are dropped exactly following the reaction region 10.
  • an ink jet printing method can be suitably employed. This is because the minute droplet can be dropped exactly following the predetermined reaction region 10.
  • the ⁇ ink-jet printing method '' is a method that applies a nozzle used in an ink-jet printer, and injects a sample solution S (S ') from the printer head to the substrate 1 using electricity, like an ink jet printer. Things.
  • This method includes a piezoelectric ink jet method, a bubble jet (registered trademark) method, and an ultrasonic jet method.
  • Piezoelectric ink jet method is a method of applying a pulse to a piezoelectric body. This is a method in which droplets are ejected by the pressure of the order.
  • the bubble jet (registered trademark) method is a thermal method in which droplets are ejected by the pressure of bubbles generated by heating a heater in a nozzle.
  • a silicon substrate that serves as a heater is embedded in the nozzle, and a uniform bubble is created at a rate of about 30 O / s to push out droplets.
  • care must be taken when using biological material samples because the sample solution S (S ') is exposed to high temperatures.
  • the ultrasonic jet method is a method in which an ultrasonic beam is applied to the free surface of a sample solution S (S '), and a locally high pressure is applied to cause droplets to be ejected from that location. It can form droplets about 1 zm in diameter at high speed without the need for a nozzle.
  • the “piezoelectric ink jet method” can be suitably adopted as the “ink jet printing method”. By changing the shape of the applied pulse, the size of the droplet (microdroplet) can be controlled, which is suitable for improving the analysis accuracy.
  • the droplet when the radius of curvature of the surface of the droplet is small, the droplet can be made small, and when the radius of curvature of the droplet is large, the droplet can be made large. It is also possible to reduce the radius of curvature by pulling the droplet surface inward by rapidly changing the pulse in the negative direction.
  • a liquid layer (salt solution) stored and held in the reaction region 10 is generated by generating a potential difference between the positive electrode 11 and the negative electrode 12 provided in the cell detection unit 2.
  • An electric field (electric field) is formed in the probe, and the detection nucleotide D is extended linearly along the direction of the electric field.
  • the high-frequency high voltage is preferably 1 ⁇ 10 6 V / m and about 1 MHz (Masao Washizu and Osamu Kurosawa: “Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures”, IEEE Transaction on In dustrial Application, Vol.26, No.26, p.1165-1172 (1990)).
  • a positive electrode 11 and a negative electrode 12 may be provided for each cell detector 2, and the positive electrode 11 and the negative electrode 12 may be provided.
  • Each of 12 may be used as a common electrode.
  • FIG. 3 is an enlarged view of the cantilever 13 protruding from the reaction region 10 side of the cell detection unit 2.
  • FIG. 3 shows a detection nucleotide chain D having an end portion immobilized on the end surface 13a of the cantilever 13 and a target nucleotide chain T having a base sequence complementary to the base sequence of the detection nucleotide chain D.
  • This is a schematic representation of a state in which hybridization has occurred to form a double strand.
  • FIG. 3 shows a state in which one detection nucleotide chain D is immobilized on the end face 13a for simplicity, but it is actually equivalent to the width of the cantilever 13 A number of detection nucleotide chains D are immobilized.
  • the reaction region 10 can be filled with a phase change substance (not shown) such as agarose gel, which can cause a reversible phase change of gel or sol between room temperature and the optimum reaction temperature.
  • a phase change substance such as agarose gel
  • the phase-change substance is converted into a sol at a high temperature, a voltage is applied in this state to arrange nucleotide chains such as single-stranded DNA, and then the temperature is lowered to form a gel.
  • a procedure for forming a sol at an optimal reaction temperature can be performed.
  • phase change substance when the phase change substance is in a gelled state, the progress of hybridization may be hindered when the sample solution S ′ containing the target nucleotide chain T is dropped onto the cell detection unit 2, so that ordinary As in the case of electrophoresis, a vertical groove may be formed in advance at the dropping point, and the sample solution S ′ may be dropped into this groove.
  • the above-mentioned cantilever 13 has a vibrator in which a piezoelectric material is arranged between the opposing electrodes, and can vibrate according to the frequency by applying an AC voltage. At this time, the entire cantilever 13 is formed as a piezoelectric vibrator. Alternatively, a piezoelectric element can be formed on the cantilever 13.
  • the cantilever 13 can be manufactured by applying the technology described in, for example, Japanese Patent Application Publication No. 2001-134749. The principle of this manufacturing method will be briefly described with reference to FIGS. 4A to 4D.
  • a polysilicon layer 21 serving as a sacrifice layer for finally forming a void portion is formed at a part of the bottom of the silicon substrate 20 serving as the cell detection unit 2.
  • a photoresist is applied to the bottom surface, and a resist padder that masks a portion other than the portion where the cantilever 13 is formed is formed by a photolithography method or the like.
  • an insulating layer composed of Si 2 is formed by, for example, a CVD (Chemical Vapor Deposition) method using the Si H 4 —N 20 system.
  • the layer 22 is formed.
  • the present invention is not limited to the S i 0 2, for example, S i H 4 - by NH 3 system C VD method using, it may be formed an insulating layer 2 2 consisting of S i ⁇ (silicon nitride). Then, 4 as shown in C, P t (platinum) or I n (indium) lower electrode layer ing from such 2 3, P ZT (P b (T i, Z r) 0 3: lead zirconate titanate lead) or S BT (S r B i 2 T a 2 0 9: strontium bismuth tantalate) pressure material charge layer 24 made of such, P t or putter by sequentially stacking an upper electrode layer 2 5 consisting of I n such Ping.
  • P t platinum
  • I n indium
  • XeF 2 xenon difluoride
  • Br F 3 bromine trifluoride
  • the presence or absence of a hybridization reaction is detected by detecting a change in the natural frequency of the cantilever 13 manufactured as described above.
  • an AC circuit connecting the lower electrode layer 23 and the upper electrode layer 25 is formed, and the frequency is changed by an AC power supply 30 serving as a drive source of the cantilever 13.
  • the current related to the resonance amplitude is converted into a voltage by the resistor 31 and this voltage is measured by the voltmeter 32 as the vibration detecting means.
  • the voltage waveform measured by the voltmeter 32 is, for example, as shown by the solid line in FIG.
  • the resonance amplitude of the cantilever 13 depends on the frequency of the AC power supply 30.
  • the frequency f of the AC power supply 30 at the peak of the voltage indicates the natural frequency of the cantilever 13 because it becomes maximum when the natural frequency matches the natural frequency of 13.
  • the detection nucleotide chain D immobilized on the end surface 13a of the cantilever 13 and the target nucleotide chain T having a base sequence complementary to the base sequence of the detection nucleotide chain D are hybridized.
  • the natural frequency of the cantilever 13 decreases due to an increase in the mass of the cantilever 13 derived from the target nucleotide chain T.
  • the voltage waveform frequency of the AC power supply 3 0 lower sheet thickness, during peak dashed position in Fig. 6 becomes f 2.
  • the amount of change in the natural frequency (f over f 2), in order to positively correlated with mass changes of the cantilever 1 3, the natural frequency of the prior immobilization of detecting nucleotide chain D, detection nucleotide By measuring the natural frequency after immobilization of the chain D and the natural frequency after completion of the hybridization reaction, the number of the detection nucleotide chains D immobilized on the cantilever 13 or the detection nucleotide chain It is possible to quantitatively detect the number of target nucleotide chains T hybridized with D. The larger the change in mass, the higher the detection sensitivity of the change in the natural frequency. Therefore, it is preferable to increase the mass by modifying the end of the target nucleotide chain T with one anchor molecule.
  • the frequency may not be detected accurately, and therefore, after the completion of the hybridization reaction and before the measurement of the frequency.
  • the phase change material may be solified, and the phase change material may be removed by the action of centrifugal force generated by rotating the substrate 1.
  • the entirety of the cantilever 13 is a piezoelectric vibrator.
  • the present invention is not limited to this.
  • a piezoelectric element 40 a serving as a drive electrode is provided above the cantilever 13.
  • a piezoelectric element 40b serving as a detection electrode may be provided.
  • FIG. 8 shows a vertical cross-sectional view of the force cantilever 13 at a position including the piezoelectric elements 40a and 40b in this case.
  • the cantilever 13 is made of Si 2 or S An insulating layer 42 of i N x is formed. Also, the piezoelectric elements 40a and 4Ob are composed of lower electrode layers 43a, 43b,? The piezoelectric material layers 44 a and 44 b composed of ⁇ or 38 and the upper electrode layers 45 a and 45 b composed of Pt or In are sequentially laminated.
  • the cantilever 13 When detecting the presence or absence of the hybridization reaction, the cantilever 13 is vibrationally excited while the frequency is changed by an AC power supply 50 as a driving source. Then, a potential difference based on the resonance amplitude is measured by a voltmeter 51 as a vibration detecting means. As described above, when the mass of the cantilever 13 increases due to the hybridization reaction, the natural frequency of the cantilever 13 decreases, and the frequency of the AC power supply 50 at the peak of the voltage decreases.
  • a marker solution gene associated with a specific disease is contained in a sample solution S ′ extracted from predetermined cells or the like.
  • the fact that there is a target nucleotide chain T having complementarity with the detection nucleotide chain D can be recognized, and as a result, it is predicted that the above-mentioned disease has occurred in the above cells.
  • FIG. 9A shows a plan view of the substrate in this example as viewed from above
  • FIG. 9B shows an enlarged plan view of a portion X in FIG. 9A.
  • the substrate 60 shown in FIG. 9A includes a groove detection unit 61.
  • the groove detecting section 61 has a groove in which a reaction area 70 is radially extended on the substrate 60.
  • the groove is formed from one side in the longitudinal direction as shown in FIG. 9B.
  • a cantilever 73 having a configuration similar to that of the cantilever 13 in the cell detection unit 2 is protruded at a predetermined interval.
  • Positive and negative electrodes 71 and 72 are provided opposite to each other where the cantilever 73 is provided so as to sandwich the reaction region 70.
  • the groove detecting portion 61 is a configuration in which the cell detecting portion 2 is arranged in the groove.
  • Each positive electrode 71 can be made a common electrode, and similarly, each negative electrode 72 can be made a common electrode. That is, the positive common electrode and the negative common electrode can be arranged side by side on the substrate 60 so as to face each other with the reaction region 70 interposed therebetween. With this configuration, it is possible to apply electricity by pressing the needle-shaped probe against the positive and negative common electrodes from above.
  • the above-described reaction region 70 may be formed in pits (not shown) arranged in each groove, and a substantially identical spot size is realized by dropping a small droplet into the reaction region of the pit. can do.
  • a liquid sending means utilizing a capillary phenomenon or a liquid sending means utilizing a centrifugal force generated by rotating the disk-shaped substrate 60 by a predetermined method can be used.
  • a liquid reservoir 62 is provided in the center of the substrate 60, and the sample liquid S (S ') or an extra target nucleotide chain that has not been actively bonded after the reaction is provided in the liquid reservoir 62.
  • the liquid By injecting a cleaning liquid or the like for removing T and rotating the substrate 60, the liquid can be smoothly and reliably fed from the central region of the substrate into the groove (ie, the reaction region 70).
  • a different nucleotide chain D for detection can be immobilized in each groove detecting section or in each grouped groove detecting section.
  • the position information and the rotation synchronization information of the substrates 1 and 60 will be briefly described.
  • the rotation direction of the substrates 1 and 60 a large number of address pits formed in advance by a disk masking process are formed.
  • the reaction regions 10 and 70 which are drop detection positions, are considered to be user-one data regions.
  • Synchronous pits are arranged in other areas using the sample support method, etc., and are also used as a tracking support, and by inserting an address part (geographical address on the disk) immediately after that. Give location information.
  • the address part starts from the sector 1 mark, which is the first pattern, and contains the VFO that gives the rotation phase of the disk that is actually rotating, the address mark that gives the start position of the address data, and the ID (identifier) that contains the track and sector numbers. ifier) are combined.
  • an apparatus having at least the following units and mechanisms is used. That is, the substrate rotating means for rotatably holding the substrates 1, 60, and the substrate rotating means for rotating the substrates 1, 60. While dropping, the dropping means for dropping the sample solution S (S ') into the reaction regions 10 and 70 in a certain order in the evening, and the distance between (the nozzle of) the dropping means and the substrate. Based on the focus support mechanism for maintaining a constant value and the position information and rotation synchronization information provided from the substrates 1 and 60, the sample solution S (S ') This is a device (not shown) having at least a tracking support mechanism for following the regions 10 and 70.
  • the above-described interaction detecting method according to the present invention can be suitably implemented. That is, when the detection nucleotide chain D and the target nucleotide chain T immobilized on the end surfaces of the cantilevers 13 and 73 are hybridized, the masses of the cantilevers 13 and 73 increase, so that the cantilever 13 and 73 The natural frequency of 3 decreases. Therefore, by measuring the change in the natural frequency, hybridization can be detected.
  • the bioassay substrate is formed in a disk shape.
  • the present invention is not limited to this shape, and a rectangular or other flat shape can be appropriately selected and determined.
  • the present invention is described in this manner.
  • the present invention is not limited to the example of detecting the presence or absence of the Chillon reaction.
  • a desired double-stranded nucleotide is formed from the nucleotide chain D for detection, An interaction between the double-stranded nucleotide and a peptide (or protein), an enzyme response, and other intermolecular interactions can be performed. Specifically, when the above-described double-stranded nucleotide is used, binding between a receptor molecule such as a hormone receptor, which is a transcription factor, and a response element DNA molecule can be analyzed.
  • a receptor molecule such as a hormone receptor, which is a transcription factor
  • bioassay broadly refers to biochemical analysis based on interaction between hybridization and other substances.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention described above is particularly suitable for a bioassay method based on a DNA chip, and can be used for gene mutation analysis, SNP s (base polymorphism) analysis, gene expression frequency analysis, and the like. It can be widely used in medicine, clinical diagnostics, pharmacogenetics, forensic medicine and other fields.

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Abstract

　セル検出部（２）において、カンチレバー（１３）の端面（１３ａ）は予め表面処理が施されており、検出用ヌクレオチド鎖Ｄを固定化可能とされている。反応領域（１０）には正電極（１１）及び負電極（１２）によって電界が生じており、ノズル（３）から滴下された標的ヌクレオチド鎖Ｔは、伸長したまま端面（１３ａ）の方向に移動する。検出用ヌクレオチド鎖Ｄと標的ヌクレオチド鎖Ｔとがハイブリダイゼーションするとカンチレバー（１３）の質量が増加するため、固有振動数が低下する。そこで、カンチレバー（１３）に交流電圧を印加して固有振動数変化を測定することで、ハイブリダイゼーションの有無を検出すると共に、ハイブリダイゼーションした標的ヌクレオチド鎖Ｔの本数等を定量的に検出する。

Description

明細書 相互反応作用検出方法及びバイオアツセィ装置、 並びにバイオアツセィ用基板 技術分野 本発明は、 バイオインフォマティクス （生命情報科学） 分野において特に有用 な相互反応作用検出方法及びバイオアッセィ装置、 並びにバイオアツセィ用基板 に関する。
本出願は、 日本国において 20 0 2年 1 0月 4日に出願された日本特許出願番 号 2 0 0 2— 29 28 6 1を基礎として優先権を主張するものであり、 この出願 は参照することにより、 本出願に援用される。 背景技術 現在、 マイクロアレイ技術によって所定の DN Aが微細配列された、 いわゆる DNAチップ又は DNAマイクロアレイ （以下、 DNAチップと総称する。 ） と 呼ばれるバイオアツセィ用の集積基板が、 遺伝子の突然変異、 SNP s (—塩基 多型） 分析、 遺伝子発現頻度解析等に利用されており、 創薬、 臨床診断、 薬理ジ エノミクス、 法医学その他の分野において広範に活用され始めている。
この DNAチップは、 ガラス基板ゃシリコン基板上に多種多数の DNAオリゴ ヌクレオチド鎖や、 c DNA (complementary DNA) 等が集積されていることから、 八ィプリダイゼ一ション等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴 とされている。
D N Aチップによる解析手法の一例を簡潔に説明すれば、 ガラス基板ゃシリコ ン基板上に固相化された DNAプローブに対して、 細胞、 組織等から抽出した m RN A (messenger RNA) を逆転写 P CR (Polymerase Chain Reaction) 反応等 によって蛍光プローブ d NT Pを組み込みながら P C R増幅し、 上記基板上にお いてハイプリダイゼ一ションを行い、 所定の検出器で蛍光測定を行うというもの である。
ここで、 DNAチップは、 2つのタイプに分類できる。 第 1のタイプは、 半導 体露光技術を応用したフォトリソグラフィ一の技術を用いて、 所定の基板上に直 接オリゴヌクレオチドを合成していくものであり、 ァフィメトリクス （Afiymetr ix) 社によるものが代表的である。 この第 1のタイプの DNAチップについては、 例えば日本公表特許公報平 4一 505763号に記載されている。
一方、 第 2のタイプは、 「スタンフォード方式」 とも称されるもので、 先割れ ピンを用いて、 予め用意された DNAを基板上に分注 ·固相化していくことによ つて作製されるものである。 この第 2のタイプの DNAチップは、 集積度は第 1 のタイプの DN Aチップに比べて低いものの、 1 k b程度の DNA断片を固相化 できるという利点がある。 この第 2のタイプの DNAチップについては、 例えば 日本公表特許公報平 10— 503841号に記載されている。
また、 国際公開第 0 1Z 33226号パンフレットには、 MEMS (Micro El ectro Mechanical Systems：マイクロマシン） を用いて作製されたカンチレバー (片持ち梁） を利用する、 上述した従来の DN Aチップ技術とは異なる技術的思 想に基づく力ンチレバ一センサー技術が提案されている。
この国際公開第 0 1Z33 22 6号パンフレットに記載された力ンチレバーセ ンサ一による解析手法の一例を簡潔に説明すると、 上面に D N Aプローブが固相 化された力ンチレバ一にレーザ一光を照射し、 ハイプリダイゼ一ション反応の結 果カンチレバーが橈むことにより所定位置の受光部における反射光の強度が変化 するのを測定することで、 ハイプリダイゼーション反応の有無を検出するという ものである。
しかしながら、 上述した従来の DNAチップ技術では、 2次元である基板の狭 小な検出部において、 DNAプローブ等の検出用ヌクレオチド鎖ゃタンパク質等 を固相化 （固定化） し、 ハイブリダィゼ一シヨン反応や抗原抗体反応等の物質間 の相互反応を進行させるという技術であることから、 空間的に反応生成物の自由 度が制限され、 また、 反応の際に立体障害が発生する可能性があった。 このため、 従来の DN Aチップ技術等では、 相互反応の効率が悪く、 反応時間が長いという 問題があった。 また、 従来の D N Aチップ技術では、 試料溶液は、 基板上の所定のスポット部 位 （検出部） に滴下されるのみであって、 試料溶液に含まれている標的物質とス ポット部位に固定された状態の検出物質との相対的な位置決めを行うための工夫 は、 何ら講じられていなかった。
一方、 上述したカンチレバーセンサー技術では、 試料溶液に含まれている標的 物質を予め蛍光標識する必要がないという利点がある一方で、 カンチレバーを高 集積化した場合に、 カンチレバー表面にレーザー光を照射し、 その反射光を受光 する機械的な制御が困難になるという問題があった。 発明の開示 本発明は、 このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、 標的物質に 対する蛍光標識等を行うことなく、 ハイブリダィゼ一ションその他の物質間の相 互作用を定量性よく検出する相互反応作用検出方法及びバイオアッセィ装置、 並 びにバイオアツセィ用基板を提供することを目的とする。
上述した目的を達成するために、 本発明に係る相互反応作用検出方法及びバイ オアッセィ装置は、 検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処 理が施されたカンチレバーと、 当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質 と標的物質との相互反応作用の場を提供する反応領域と、 上記カンチレバ一を振 動励起する駆動源と、 上記カンチレバーの振動振幅を検出する振動検出手段とを 少なくとも備える検出部において物質間の相互反応作用を検出するものであり、 上記相互反応作用に基づく上記カンチレバーの固有振動数の変化を測定すること で、 上記相互反応作用を検出する。
ここで、 上記カンチレバーは、 対向電極間に圧電材料を配置してなる振動子を 有しており、 上記駆動源は、 上記対向電極間に交流電圧を印加することにより上 記力ンチレバーを振動励起する。
また、 上記検出用物質及び上記標的物質は、 例えばヌクレオチド鎖であり、 上 記相互反応作用は、 例えばハイプリダイゼーションである。
このような相互反応作用検出方法及びパイオアッセィ装置では、 検出用物質を 固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施されたカンチレバーに検出 用物質を固定化し、 上記検出用物質と標的物質との相互反応作用に基づく上記力 ンチレバーの固有振動数変化を測定することで、 上記相互反応作用を検出する。 例えば、 上記検出用物質及び上記標的物質がヌクレオチド鎖である場合、 上記 カンチレパ一の端面に固定化された検出用ヌクレオチド鎖と標的ヌクレオチド鎖 とがハイプリダイゼーションすると上記力ンチレパーの質量が増加するため、 力 ンチレパーの固有振動数が低下する。 そこで、 本発明に係る相互反応作用検出方 法及びバイオアツセィ装置では、 この固有振動数変化を測定することで、 八イブ リダイゼーションを検出する。
また、 上述した目的を達成するために、 本発明に係るバイオアツセィ用基板は、 検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施された力ンチ レバ一と、 当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との相互 反応作用の場を提供する反応領域とを少なくとも備える検出部が設けられたもの である。
ここで、 上記検出部は、 上記カンチレバ一がー壁面から突出して設けられたセ ル検出部として構成することができ、 このセル検出部は、 基板上に複数配設され る。 本発明に係るバイオアツセィ用基板は、 円盤状基板として形成することがで き、 この場合、 セル検出部は、 上方視放射状を呈するように配設される。
また、 バイオアツセィ用基板を円盤状基板として形成する場合において、 上記 反応領域を基板上に放射状に延設された条溝内に設けるようにしてもよく、 この 場合、 上記カンチレバーは、 上記条溝の片側から突出して設けられる。
さらに、 上記セル検出部若しくは条溝単位、 又はグルーピングされた複数のセ ル検出部若しくは条溝単位に、 異なる検出用物質を固定化することができる。 さらにまた、 上記反応領域に対して、 室温と反応至適温度との間で、 ゲル、 ゾ ルの可逆相変化が起こり得る物質を充填してもよい。
このようなバイオアツセィ用基板では、 上記相互反応作用に基づく上記力ンチ レバ一の固有振動数の変化を測定することで上記相互反応作用が検出される。 本発明の更に他の目的、 本発明によって得られる具体的な利点は、 以下に説明 される実施例の説明から一層明らかにされるであろう。 図面の簡単な説明 図 1は、 本実施の形態におけるバイオアツセィ装置に用いられるバイオアツセ ィ用基板の外観を示す斜視図である。
図 2は、 同バイオアツセィ用基板に多数配設されたセル検出部の 1つを拡大し て示す斜視図である。
図 3は、 同セル検出部の反応領域側に突設された力ンチレバ一を拡大して示す 斜視図である。
図 4 A乃至図 4 Dは、 同力ンチレバ一の作製工程の一例を説明する図である。 図 5は、 同力ンチレバーの固有振動数変化を検出する方法を示す図である。 図 6は、 交流電源の周波数を変化させた際に計測される電圧波形を示す図であ る。
図 7は、 同力ンチレバーの他の構成を示す斜視図である。
図 8は、 圧電素子を含む位置におけるカンチレバーの垂直断面を示す図である。 図 9 A及び図 9 Bは、 同バイオアツセィ装置に用いられる基板の他の例を説明 する図であり、 図 9 Aは、 基板の上方視平面図を示し、 図 9 Bは、 図 9 A中の X 部の拡大平面図を示す。 発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明を適用した具体的な実施の形態について、 図面を参照しながら詳 細に説明する。 この実施の形態で説明するバイオアツセィ装置及びその相互反応 作用検出方法は、 対向電極間に圧電材料を配置してなる振動子を有するカンチレ バー （片持ち梁） の端面に予め検出用ヌクレオチド鎖 （検出用物質） の末端部位 を固定化し、 この検出用ヌクレオチド鎖と標的ヌクレオチド鎖 （標的物質） との ハイプリダイゼーション反応に由来する質量変化により力ンチレバーの固有振動 数が変化することを利用して、 ハイプリダイゼ一ション反応を定量的に検出する ものである。 ここで、 本明細書において 「ヌクレオチド鎖」 とは、 プリン塩基又はピリミジ ン塩基と糖とがダリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体を意 味し、 DN Aプロ一ブを含むオリゴヌクレオチド、 ポリヌクレオチド、 プリンヌ クレオチドとピリミジンヌクレオチドとが重合した D N A (全長或いはその断 片） 、 逆転写により得られる c DNA (c DNAプローブ） 、 RNA等を広く含 む。
先ず、 本実施の形態におけるバイオアツセィ装置に用いられるバイオアツセィ 用基板 （以下、 基板と略称する。 ） 1の外観斜視図を図 1に示す。 図 1に示す基 板 1は、 CD (Compact Disk) 、 DVD (Digital Versatile Disk) 、 MD (Mi ni Disk) (登録商標） 等の光情報記録媒体に用いられる円盤状基板 （ディスク） に採用される基材から形成されている。
この基材は、 石英ガラスゃシリコン、 ポリカ一ポネー卜、 ポリスチレンその他 の円盤状に成型可能な合成樹脂、 好ましくは射出成型可能な合成樹脂によって円 盤状に形成されている。 なお、 安価な合成樹脂基板を用いることで、 従来のガラ ス基板に比して低ランニングコストを実現できる。 基板 1の中心には、 基板 1を 回転する場合に使用されるスピンドル固定用の孔 （図示せず） を形成することも できる。
基板 1の一方の表面には、 基板 1の中心の周辺領域から上方視放射状に延びる ように、 周辺の基板領域とは区画された小室状の反応領域を備えるセル検出部 2 が多数配設されている。
このセル検出部 2は、 基板 1上の適切な位置に配設することが可能であるが、 このように上方視放射状に配設することで、 基板 1上のスペースを有効に利用す ることができ、 情報の集積密度を高めることができる。
また、 セル検出部 2は、 互いにコンタミネーシヨンしないように区画されてい るため、 セル検出部単位又はグルーピングされたセル検出部単位で、 異なる検出 用ヌクレオチド鎖を固定化し、 検出用ヌクレオチド鎖毎に別個独立の条件を設定 して、 ハイプリダイゼーション反応を進行させることができる。
例えば、 疾病発症のマーカー遺伝子を基板 1上にグルーピングして固定化する ことができ、 これにより 1つの基板 1を用いて同時に複数の疾病の発現状況を確 認することができる。
また、 T m (Me l t ing Temperature) 又は G C含有率の違いに基づいて、 固定化 する検出用ヌクレオチド鎖をグルーピングしておくことも可能である。 これによ り、 アクティブなハイブリダィゼ一シヨン反応が得られるバッファ一組成、 濃度 等の反応条件、 洗浄条件、 滴下するサンプル溶液濃度等を、 検出用ヌクレオチド 鎖の性質に応じてきめ細かく選択することが可能となり、 解析作業において疑陽 性又は疑陰性が示される危険性を減少させることができる。
このセル検出部 2の 1つを拡大した外観斜視図を図 2に示す。 図 2に示すよう に、 セル検出部 2は、 検出用ヌクレオチド鎖 Dと標的ヌクレオチド鎖 Tとの間の ハイプリダイゼーション反応の場となる反応領域 1 0と、 その反応領域 1 0の両 端に電場 （電界） を形成する正電極 1 1及び負電極 1 2と、 セル検出部 2の負電 極 1 2側から突出して設けられたカンチレバー 1 3とを備えている。
反応領域 1 0は、 上方に開口する略正方形のセル、 例えば、 深さが l /^ m、 長 さ及び幅が共に 1 0 0 x mのセルとして形成されているが、 図示された形状、 サ ィズに限定されない。
上述した力ンチレパー 1 3の反応領域 1 0側の端面 1 3 aは、 検出用ヌクレオ チド鎖 Dの末端部位がカップリング反応等の化学結合によって固定化されるよう に、 表面処理が施されている。 すなわち、 この端面 1 3 aは、 D N Aプローブ等 の検出用ヌクレオチド Dの予め加工された末端部位を固定化するのに好適な表面 処理が施されていればよい。 例えば、 ストレプトアビジンによってカンチレバー 1 3の端面 1 3 aが表面処理されている場合には、 ピオチン化されたヌクレオチ ド鎖末端の固定化に適している。 なお、 ここでは端面 1 3 aに表面処理が施され ているが、 これに限定されるものではなく、 カンチレバ一 1 3の少なくとも一部 に表面処理が施されていればよい。
ここで、 ヌクレオチド鎖内では、 ヌクレオチド鎖の骨格をなすリン酸イオン (陰電荷） とその周辺にある水がイオン化した水素イオン （陽電荷） とによって イオン雲が形成されていると考えられ、 これらの陰電荷及び陽電荷により生じる 分極ベクトルが、 高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、 その結果 としてヌクレオチド鎖が伸長する。 さらに、 電気力線が一部に集中する不均一電 界が印加された場合、 ヌクレオチド鎖は、 電気力線が集中する部位に向かって移 動する （Seiichi Suzuki, Takeshi Yamanashi, Shin - ichi Tazawa, Osamu Kuros awa and Masao Washizu: "Quantitative analysis on electrostatic orientat i on of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy" , IEEE Transaction on Industrial Application, Vol.34, No.1, p.75-83 (1998)参 照） 。
そこで、 正電極 1 1及び負電極 1 2により、 各力ンチレバ一 1 3の端面 1 3 a に電気力線が集中するような高周波高電圧の電界を印加すると、 高周波高電圧の 印加によって伸長処理されたヌクレオチド鎖が端面 1 3 aに向かって移動し、 そ の末端部位が端面 1 3 aと接触することによって、 検出用ヌクレオチド Dの末端 部位を力ンチレバ一 1 3の端面 1 3 aに確実に固定化することができる。 特に、 カンチレバ一 1 3として、 後述するように P ZT (ジルコン酸チタン酸鉛) や S BT (タンタル酸ストロンチウムビスマス） 等の圧電性を有する強誘電体を用い る場合には、 その強誘電体により電気力線がカンチレバー 1 3の端面 1 3 aに集 中するため好適である。
図 2中にその先端部位を示すノズル 3は、 試料溶液 S (S ' ) を滴下するもので あり、 後述するように基板 1から提供される位置情報と回転同期情報とに基づい て、 検出用ヌクレオチド鎖 Dを含有する試料溶液 Sと標的ヌクレオチド鎖 Tを含 有する試料溶液 S'とを、 反応領域 1 0に正確に追従して滴下する構成とされてい る。
滴下手段としては、 ィンクジエツトプリンティング法を好適に採用することが できる。 これは、 所定の反応領域 1 0に正確に追従して微小滴を滴下することが できるためである。
「インクジエツトプリンティング法」 は、 インクジェットプリンタ一で用いら れるノズルを応用する方法であり、 電気を用いてィンクジェットプリンターのよ うにプリンターヘッドから基板 1に試料溶液 S (S') を噴射するものである。 こ の方法には、 圧電式インクジェット法、 バブルジェット （登録商標） 法、 超音波 ジェット法がある。
圧電式インクジエツト法は、 圧電体にパルスを印加することによって生じる変 位の圧力により液滴を飛ばす方式である。 また、 バブルジェット （登録商標） 法 は、 熱方式であって、 ノズル中のヒーターを熱して発生させた気泡の圧力によつ て液滴を飛ばす方式である。 ノズル内にヒーターとなるシリコン基板を埋め込み、 約 30 O /sで制御して一様な気泡を作成し、 液滴を押し出す。 しかしながら、 試料溶液 S (S') が高温に曝されることになるため、 生体物質試料を用いる場合 には注意を要する。 超音波ジェット法は、 超音波ビームを試料溶液 S (S') の自 由面に当て、 局所的に高い圧力を与えることによってその箇所から小滴を放出さ せる方式である。 ノズルを必要とせず、 高速で直径約 1 zmの小滴を形成できる。 本実施の形態においては、 「インクジェットプリント法」 として、 「圧電式ィ ンクジェット法」 を好適に採用できる。 印加するパルスの形状を変えることによ つて、 液滴 （微小滴） のサイズを制御することができるため、 解析精度向上に好 適である。 すなわち、 液滴表面の曲率半径が小さいときには液滴を小さくし、 液 滴の曲率半径が大きいときには液滴を大きくすることができる。 また、 パルスを 急激に負の方向に変化させることにより液滴表面を内側に引っ張り、 曲率半径を 小さくすることも可能である。
ここで、 反応領域 1 0に滴下されてきた検出用ヌクレオチド Dの多くは、 塩基 が重層した状態でカンチレバー 1 3の端面 1 3 aに固定化されるため、 後から滴 下された標的ヌクレオチド鎖 Tとのハイプリダイゼーション反応の際には、 立体 障害の問題が発生してしまう。
そこで本実施の形態では、 セル検出部 2に配設された正電極 1 1と負電極 12 との間に電位差を生じさせることで反応領域 1 0に貯留保持されている液層 （塩 溶液） に電場 （電界） を形成し、 電界の向きに沿って検出用ヌクレオチド Dを直 鎖状に伸長させる。 なお、 上記高周波高電圧は、 l X 106V/m、 約 1 MHz付 近が好適と考えられる (Masao Washizu and Osamu Kurosawa: "Electrostatic M anipulat ion of DNA in Microf abr icated Structures" , IEEE Transact ion on In dustrial Application, Vol.26, No.26, p.1165-1172 (1990) 参照） 。
なお、 基板 1上にセル検出部 2が列設された場合においては、 セル検出部 2毎 に正電極 1 1及び負電極 12を設けるようにしてもよく、 また、 正電極 1 1及び 負電極 12をそれぞれ共通電極化するようにしてもよい。 上述のように高周波高電圧を印加することにより、 検出用ヌクレオチド鎖 D及 び標的ヌクレオチド鎖 Tが直鎖状に伸長するため、 立体障害が少なくなり、 ハイ ブリダィゼ一シヨン反応が効率よく進行することになる。 この結果、 ハイブリダ ィゼーションの反応時間が短縮化されるとともに、 疑陽性又は疑陰性を示す確率 も減少する。
ここで、 セル検出部 2の反応領域 1 0側に突設されたカンチレバ一 1 3を拡大 して図 3に示す。 この図 3は、 カンチレバー 1 3の端面 1 3 aにその末端部位が 固定化された検出用ヌクレオチド鎖 Dと該検出用ヌクレオチド鎖 Dの塩基配列と 相補性のある塩基配列を有する標的ヌクレオチド鎖 Tとがハイプリダイゼーショ ンし、 2本鎖を形成している状態を模式的に表したものである。 なお、 図 3では、 簡単のため、 端面 1 3 aに 1本の検出用ヌクレオチド鎖 Dが固定化されている状 態を示しているが、 実際にはカンチレバ一 1 3の幅に応じて相当数の検出用ヌク レオチド鎖 Dが固定化される。
反応領域 1 0に対しては、 室温と反応至適温度との間で、 ゲル、 ゾルの可逆相 変化が起こり得るァガロースゲル等の相変化物質 （図示せず） を充填することも 可能である。 この場合には、 相変化物質を高温下でゾル化し、 この状態で電圧を 印加して 1本鎖 D N A等のヌクレオチド鎖を配列した後に、 温度を低下させてゲ ル化し、 さらに続いてハイブリダィゼーシヨン時には、 反応至適温度でゾル化す る手順を行うことができるという利点がある。 また、 ハイブリダィゼ一シヨン時 において相変化物質をゲル状態に保持しておけば、 D N A等のヌクレオチド鎖を 伸長させた状態でハイプリダイゼ一ションさせることができるため好適である。 なお、 上記相変化物質がゲル化した状態のときには、 標的ヌクレオチド鎖 Tを 含む試料溶液 S 'をセル検出部 2に滴下した際に、 ハイプリダイゼ一ションの進行 が妨げられる虞があるため、 通常の電気泳動の場合と同様に、 滴下ポイントに垂 直方向の溝を予め形成しておき、 この溝の中に試料溶液 S 'を滴下するようにして よい。
ところで、 上述したカンチレパ一 1 3は、 対向電極間に圧電材料を配置してな る振動子を有しており、 交流電圧を印加することで、 その周波数に応じて振動さ せることができる。 この際、 カンチレバー 1 3の全体を圧電振動子として形成す ることもでき、 また、 カンチレバ一 1 3上に圧電素子を形成することもできる。 このカンチレバー 1 3は、 例えば日本公開特許公報 20 0 1— 34749 9号 に記載された技術を応用して作製することができる。 この作製手法の原理を図 4 A乃至図 4 Dを用いて簡潔に説明する。
先ず、 図 4 Aに示すように、 セル検出部 2となるシリコン基板 2 0の底部の一 部に、 最終的に空隙部分を形成するための犠牲層となるポリシリコン層 2 1を形 成し、 底部全体が一様な高さとなるようにする。 そして、 底部表面にフォトレジ ストを塗布し、 フォトリソグラフィ一法などにより、 カンチレバー 1 3を作製す る部分以外をマスクするレジストパダーンを形成する。 その後、 例えば S i H4— N20系を用いた CVD (Chemical Vapor Deposition：化学的気相成長） 法によ り、 図 4 Bに示すように S i〇2 (二酸化シリコン） からなる絶縁層 22を形成す る。 なお、 S i 02に限らず、 例えば S i H4— NH3系を用いた C VD法により、 S i Νκ (窒化シリコン） からなる絶縁層 2 2を形成するようにしても構わない。 そして、 図 4 Cに示すように、 P t (白金） 又は I n (インジウム） 等からな る下部電極層 2 3、 P ZT (P b (T i , Z r) 03 : ジルコン酸チタン酸鉛） 又は S BT (S r B i 2T a 209： タンタル酸ストロンチウムビスマス） 等からなる圧 電材料層 24、 P t又は I n等からなる上部電極層 2 5を順次積層してパター二 ングする。
最後に、 図 4Dに示すように、 真空チャンバ内で X e F2 (二フッ化キセノン） 又は B r F3 (三フッ化臭素） を昇華させて導入し、 選択的エッチングによりポリ シリコン層 2 1を完全に除去する。
本実施の形態では、 このようにして作製されたカンチレバー 1 3の固有振動数 変化を検出することにより、 ハイブリダィゼーション反応の有無を検出する。 具体的には、 図 5に示すように、 下部電極層 23と上部電極層 2 5とを接続し た交流回路を形成し、 カンチレパ一 1 3の駆動源となる交流電源 3 0により周波 数を変化させながらカンチレパ一 1 3を振動励起する。 そして、 共振振幅に関連 した電流を抵抗 3 1で電圧変換し、 この電圧を振動検出手段としての電圧計 3 2 で計測する。 電圧計 3 2で計測される電圧波形は、 例えば図 6の実線のようにな る。 なお、 カンチレバー 1 3の共振振幅は、 交流電源 30の周波数がカンチレバ 一 1 3の固有振動数と一致したときに最大となるため、 電圧のピーク時における 交流電源 3 0の周波数 f は、 カンチレバ一 1 3の固有振動数を示している。 ここで、 カンチレパー 1 3の端面 1 3 aに固定化された検出用ヌクレオチド鎖 Dと該検出用ヌクレオチド鎖 Dの塩基配列と相補性のある塩基配列を有する標的 ヌクレオチド鎖 Tとがハイブリダィゼ一シヨンして 2本鎖を形成した場合、 標的 ヌクレオチド鎖 Tに由来するカンチレバー 1 3の質量増加によりカンチレバ一 1 3の固有振動数が低下する。 これにより、 電圧波形は図 6の破線の位置に下方シ フトし、 ピーク時における交流電源 3 0の周波数は f 2となる。
したがって、 この電圧のピーク時における周波数 （固有振動数） の変化を検出 することにより、 ハイプリダイゼーションの有無を検出することができる。
さらに、 この固有振動数の変化量 （ f ー f 2) は、 カンチレバー 1 3の質量変 化量と正に相関するため、 検出用ヌクレオチド鎖 Dの固定化前の固有振動数、 検 出用ヌクレオチド鎖 Dの固定化後の固有振動数、 及びハイプリダイゼ一ション反 応完了後の固有振動数を測定することで、 カンチレバー 1 3に固定化された検出 用ヌクレオチド鎖 Dの本数、 或いは検出用ヌクレオチド鎖 Dとハイプリダイゼー ションした標的ヌクレオチド鎖 Tの本数を定量的に検出することが可能である。 なお、 質量変化の大きい方が固有振動数変化の検出感度が上がるため、 標的ヌ クレオチド鎖 Tの末端をアンカ一分子で修飾し、 質量を増加させておくことが好 ましい。
また、 上述したように反応領域 1 0にァガロースゲル等の相変化物質を充填し ている場合には、 正確に振動数を検出できない虞があるため、 ハイブリダィゼ一 シヨン反応完了後、 振動数の測定前に、 この相変化物質をゾル化し、 基板 1を回 転させることで生じる遠心力の作用により、 相変化物質を除去してもよい。
以上の例では、 カンチレバー 1 3の全体を圧電振動子としたが、 これに限定さ れるものではなく、 図 7に示すように、 カンチレバー 1 3の上部に駆動電極とな る圧電素子 4 0 aと検出電極となる圧電素子 4 0 bとを設けるようにしても構わ ない。 この場合における圧電素子 4 0 a及び 4 0 bを含む位置での力ンチレバー 1 3の垂直断面図を図 8に示す。
図 8に示すように、 カンチレパー 1 3は、 シリコン基板 4 1上に S i〇2又は S i N xからなる絶縁層 4 2が形成されたものである。 また、 圧電素子 4 0 a及び 4 O bは、 P t又は I nからなる下部電極層 4 3 a , 4 3 b、 ？∑丁又は3 8丁か らなる圧電材料層 4 4 a , 4 4 b、 P t又は I nからなる上部電極層 4 5 a , 4 5 bとが順次積層されたものである。
八イブリダイゼ一ション反応の有無を検出する際には、 駆動源となる交流電源 5 0により周波数を変化させながらカンチレバー 1 3を振動励起する。 そして、 共振振幅に基づく電位差を振動検出手段としての電圧計 5 1で計測する。 上述と 同様に、 ハイブリダィゼ一シヨン反応によりカンチレバー 1 3の質量が増加する と、 カンチレバー 1 3の固有振動数が低下し、 電圧のピーク時における交流電源 5 0の周波数は低くなる。
以上のようにしてハイプリダイゼーション反応に由来する固有振動数変化が確 認された場合、 例えば所定の細胞等から抽出された試料溶液 S '中に、 特定の疾患 に関連するマーカ一遺伝子を含む検出用ヌクレオチド鎖 Dと相補性を有する標的 ヌクレオチド鎖 Tが存在するという事実が認識でき、 その結果、 上記細胞には上 記疾患が発生していることが予測されることになる。
次に、 本実施の形態におけるバイオアツセィ装置に用いられる基板の他の例に ついて、 図 9 A及び図 9 Bを参照しながら説明する。 ここで、 図 9 Aは、 本例に おける基板の上方視平面図を示し、 図 9 Bは、 図 9 A中の X部の拡大平面図を示 す。
図 9 Aに示す基板 6 0は、 条溝検出部 6 1を備える。 この条溝検出部 6 1は、 反応領域 7 0が基板 6 0上に放射状に延設された条溝を備え、 該条溝を形成する 長手方向の片側からは、 図 9 Bに示すように、 上記セル検出部 2におけるカンチ レバ一 1 3と同様の構成を備えるカンチレバー 7 3が所定間隔で突設されている。 また、 カンチレバ一 7 3が設けられた各部位には、 反応領域 7 0を挟むように正 負電極 7 1， 7 2が対設されている。 なお、 条溝検出部 6 1は、 上記セル検出部 2が条溝内に配列された構成ともいえる。
各正電極 7 1は共通電極化することができ、 同様に各負電極 7 2についても共 通電極化できる。 すなわち、 正の共通電極と負の共通電極とを、 反応領域 7 0を 挟むように対向させて、 基板 6 0上に放射状をなすように並設することができる。 この構成により、 針状のプローブを正負の共通電極に上方から押し当てて、 通電 させることができる。
上述の反応領域 7 0は、 各条溝内に配列形成したピット （図示せず） に形成し てもよく、 このピットの反応領域に微小滴を滴下することによって、 ほぼ同一の スポットサイズを実現することができる。
また、 この条溝検出部 6 1では、 毛細管現象を利用した送液や、 円盤状の基板 6 0を所定の方法で回転させることによって生じる遠心力を活かした送液手段も 利用することができる。
具体的には、 基板 6 0の中心部に液溜部 6 2を設け、 この液溜部 6 2に試料溶 液 S ( S ' ) や、 反応後にアクティブに結合しなかった余分な標的ヌクレオチド鎖 Tを除去するための洗浄液等を注入し、 基板 6 0を回転させることによって、 基 板中心領域から条溝内 （すなわち反応領域 7 0 ) に円滑かつ確実に送液すること ができる。
なお、 この条溝検出部 6 1においても、 条溝検出部単位又はグルーピングされ た条溝検出部単位に、 異なる検出用ヌクレオチド鎖 Dを固定化することができる。 以下、 基板 1， 6 0の位置情報及び回転同期情報について簡潔に説明する。 基 板 1 , 6 0の回転方向には、 予めディスクマス夕リングプロセスにより形成され た多数のァドレスピットが形成されている。 基板 1 , 6 0を光ディスクとして考 えた場合、 滴下検出位置である反応領域 1 0 , 7 0は、 ユーザ一データ領域と考 えられる。 他の領域には、 サンプルサ一ポ方式等により同期ピットを配列し、 力 つトラッキングサ一ポとしても利用し、 さらに、 直後にアドレス部 (ディスク上 の地理的な番地） を挿入することによって位置情報を与える。
アドレス部は、 先頭パターンであるセクタ一マークから始まり、 実際に回転し ているディスクの回転位相を与える V F O、 ァドレスデータの開始位置を与える アドレスマーク、 トラック及びセクタのナンパ一が入った I D ( Ident i f i er) な どが組み合わされてなる。
上述した構成の基板 1 , 6 0を用いてバイオアツセィを行うには、 少なくとも 以下の手段及び機構を備える装置を使用する。 すなわち、 上記基板 1， 6 0を回 転可能に保持する基板回転手段と、 この基板回転手段によって基板 1， 6 0を回 転させながら、 反応領域 1 0， 7 0に対して試料溶液 S ( S ' ) を一定の順序、 夕 イミングで滴下する滴下手段と、 該滴下手段 （のノズル） と基板との間の距離を 一定に保持するためのフォーカスサ一ポ機構と、 基板 1 , 6 0から提供される位 置情報及び回転同期情報に基づいて、 試料溶液 S ( S ' ) の滴下を基板 1 , 6 0の 反応領域 1 0， 7 0に追従させるトラッキングサ一ポ機構とを少なくとも備えて いる装置 （図示せず） である。
以上説明した基板 1， 6 0及びこれらを用いるバイオアツセィ装置を採用すれ ば、 上述した本発明に係る相互反応作用検出方法を好適に実施することができる。 すなわち、 カンチレバー 1 3， 7 3の端面に固定化された検出用ヌクレオチド 鎖 Dと標的ヌクレオチド鎖 Tとがハイプリダイゼーションするとカンチレバ一 1 3， 7 3の質量が増加するため、 カンチレバ一 1 3 , 7 3の固有振動数が低下す る。 そこで、 この固有振動数変化を測定することで、 ハイブリダィゼ一シヨンを 検出することができる。
また、 正電極 1 1， 7 1及び負電極 1 2， 7 2によって反応領域 1 0， 7 0に 電場を形成することにより、 反応領域 1 0， 7 0内の検出用ヌクレオチド Dと標 的ヌクレオチド Tとを伸長させた状態で相対的に移動させ、 八イブリダイゼーシ ョンを行わせることができるため、 ハイブリダイゼ一ションの効率が向上する。 なお、 本発明は、 図面を参照して説明した上述の実施例に限定されるものでは なく、 添付の請求の範囲及びその主旨を逸脱することなく、 様々な変更、 置換又 はその同等のものを行うことができることは当業者にとって明らかである。
例えば、 上述の実施の形態では、 バイオアツセィ用基板を円盤状に形成したが、 この形態に限定されるものではなく、 矩形状その他の平板状の形態を適宜選択決 定することができる。
また、 上述の実施の形態では、 検出用ヌクレオチド鎖 Dと標的ヌクレオチド鎖 Tとのハイプリダイゼーシヨン反応の有無を検出する場合を代表例として説明し たが、 本発明は、 このようにハイブリダィゼ一シヨン反応の有無を検出する例に 限定されるものではない。
すなわち、 上述した反応領域 1 0， 7 0においては、 ハイプリダイゼーシヨン 反応に加え、 検出用ヌクレオチド鎖 Dから所望の 2本鎖ヌクレオチドを形成し、 該 2本鎖ヌクレオチドとペプチド （又はタンパク質） との相互反応、 酵素応答反 応その他の分子間相互作用を行わせることができる。 具体的に、 上記 2本鎖ヌク レオチドを用いる場合には、 転写因子であるホルモンレセプ夕一等のレセプ夕一 分子と応答配列 D N A分子との結合などを分析することができる。
このように、 本発明において 「バイオアツセィ」 とは、 ハイブリダィゼ一ショ ンその他の物質間の相互反応に基づく生化学的分析を広く意味するものである。 産業上の利用可能性 上述した本発明は、 D N Aチップに基づくバイオアツセィ方法に特に好適であ り、 遺伝子の変異解析、 S N P s (—塩基多型） 分析、 遺伝子発現頻度解析等に 利用でき、 創薬、 臨床診断、 薬理ジエノミクス、 法医学その他の分野において広 範囲に活用できる。

Claims

請求の範囲
1 . 検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施された力 ンチレバ一と、 当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との 相互反応作用の場を提供する反応領域と、 上記カンチレバーを振動励起する駆動 源と、 上記カンチレバーの振動振幅を検出する振動検出手段とを少なくとも備え る検出部において物質間の相互反応作用を検出する相互反応作用検出方法であつ て、
上記相互反応作用に基づく上記力ンチレバーの固有振動数の変化を測定するこ とで、 上記相互反応作用を検出する検出工程を有すること
を特徴とする相互反応作用検出方法。
2 . 請求の範囲第 1項記載の相互反応作用検出方法であって、
上記カンチレバーは、 対向電極間に圧電材料を配置してなる振動子を有してお り、
上記駆動源は、 上記対向電極間に交流電圧を印加することにより上記カンチレ パーを振動励起すること
を特徴とする相互反応作用検出方法。
3 . 請求の範囲第 1項記載の相互反応作用検出方法であって、
上記検出用物質及び上記標的物質がヌクレオチド鎖であり、 上記相互反応作用 がハイプリダイゼ一シヨンであることを特徴とする相互反応作用検出方法。
4 . 請求の範囲第 3項記載の相互反応作用検出方法であって、
上記反応領域に電場を形成し、 該反応領域内の検出用ヌクレオチドと標的ヌク レオチドとを伸長させた状態で相対的に移動させ、 ハイプリダイゼーションを行 わせる電場形成工程を有することを特徴とする相互反応作用検出方法。
5 . 検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施された力 ンチレバーと、 当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との 相互反応作用の場を提供する反応領域と、 上記カンチレパーを振動励起する駆動 源と、 上記力ンチレバーの振動振幅を検出する振動検出手段とを少なくとも有す る検出部を備えたことを特徴とするバイオアツセィ装置。
6 . 請求の範囲第 5項記載のバイオアツセィ装置であって、 上記カンチレパーは、 対向電極間に圧電材料を配置してなる振動子を有してお り、
上記駆動源は、 上記対向電極間に交流電圧を印加することにより上記力ンチレ パ一を振動励起すること
を特徴とするバイオアツセィ装置。
7 . 請求の範囲第 5項記載のバイオアツセィ装置であって、
上記検出用物質及び上記標的物質がヌクレオチド鎖であり、 上記相互反応作用 がハイプリダイゼーションであることを特徴とするバイオアツセィ装置。
8 . 請求の範囲第 7項記載のバイオアツセィ装置であって、
上記検出部は、 上記反応領域に電場を形成し、 該反応領域内の検出用ヌクレオ チドと標的ヌクレオチドとを伸長させた状態で相対的に移動させ、 ハイプリダイ ゼ一シヨンを行わせる電場形成手段をさらに有することを特徴とするバイオアツ セィ装置。
9 . 検出用物質を固定可能なように少なくともその一部に表面処理が施された力 ンチレパーと、 当該表面処理部に固定化された状態の検出用物質と標的物質との 相互反応作用の場を提供する反応領域とを少なくとも備える検出部が設けられた ことを特徴とするバイオアツセィ用基板。
1 0 . 請求の範囲第 9項記載のバイオアツセィ用基板であって、
上記検出部は、 上記カンチレパーが一壁面から突出して設けられたセル検出部 であって、 当該セル検出部が基板上に複数配設されたことを特徴とするパイオア ッセィ用基板。
1 1 . 請求の範囲第 1 0項記載のバイオアツセィ用基板であって、
円盤状基板として形成され、
上記セル検出部は、 上記円盤状基板上に上方視放射状を呈するように配設され たこと
を特徴とするバイオアツセィ用基板。
1 2 . 請求の範囲第 1 0項記載のバイオアツセィ用基板であって、
上記セル検出部単位又はグルーピングされた複数のセル検出部単位に、 異なる 検出用物質が固定化されたことを特徴とするバイオアツセィ用基板。
1 3 . 請求の範囲第 9項記載のバイオアツセィ用基板であって、
円盤状基板として形成され、
上記反応領域は、 基板上に放射状に延設された条溝内に設けられ、 上記条溝の 片側から上記カンチレバーが突出して設けられたこと
を特徴とするバイオアツセィ用基板。
1 4 . 請求の範囲第 1 3項記載のバイオアツセィ用基板であって、
上記条溝単位又はグルーピングされた複数の条溝単位に、 異なる検出用物質が 固定化されたことを特徴とするバイオアツセィ用基板。
1 5 . 請求の範囲第 9項記載のバイオアツセィ用基板であって、
上記反応領域に対して、 室温と反応至適温度との間で、 ゲル、 ゾルの可逆相変 化が起こり得る物質を充填したことを特徴とするバイオアツセィ用基板。
1 6 . 請求の範囲第 9項記載のバイオアツセィ用基板であって、
上記相互反応作用に基づく上記カンチレパーの固有振動数の変化を測定するこ とで上記相互反応作用が検出されることを特徴とするバイオアツセィ用基板。
1 7 . 請求の範囲第 9項記載のバイオアツセィ用基板であって、
上記検出用物質及び上記標的物質がヌクレオチド鎖であり、 上記相互反応作用 がハイプリダイゼーションであることを特徴とするパイオアッセィ用基板。
1 8 . 請求の範囲第 1 7項記載のバイオアツセィ用基板であって、
上記検出部は、 上記反応領域に電場を形成し、 該反応領域内の検出用ヌクレオ チドと標的ヌクレオチドとを伸長させた状態で相対的に移動させ、 ハイプリダイ ゼ一ションを行わせる電場形成手段をさらに有することを特徴とする請求項 1 7 記載のバイオアツセィ用基板。
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