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WO2004029286A2 - Verfahren zur erkennung von enzymaktivitäten - Google Patents

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WO2004029286A2
WO2004029286A2 PCT/DE2003/003109 DE0303109W WO2004029286A2 WO 2004029286 A2 WO2004029286 A2 WO 2004029286A2 DE 0303109 W DE0303109 W DE 0303109W WO 2004029286 A2 WO2004029286 A2 WO 2004029286A2
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WO
WIPO (PCT)
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protein
fractions
immobilized
proteins
substrates
Prior art date
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Application number
PCT/DE2003/003109
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English (en)
French (fr)
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WO2004029286A3 (de
Inventor
Hartmut SCHLÜTER
Joachim Jankowski
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Charite Universitaetsmedizin Berlin
Original Assignee
Charite Universitaetsmedizin Berlin
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Publication date
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Publication of WO2004029286A2 publication Critical patent/WO2004029286A2/de
Publication of WO2004029286A3 publication Critical patent/WO2004029286A3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions

Definitions

  • the invention relates to a method for recognizing enzyme activities of any protein extracts.
  • proteome proteins expressed by the genome
  • Proteome analysis is expected to provide important new insights into understanding cellular functions and their disorders. Proteins include enzymes that are involved in all life processes. Due to their catalytic properties, enzymes can be found in the cell in much lower concentrations than many structural proteins, so that this important group of proteins often eludes 2D electrophoresis analysis. So far, only a fraction of all the enzymes expressed in the human organism over a lifetime are known. In the past, some of these enzymes have already described the integration into the development of disease processes and thus contributed to the detection and treatment of diseases. Functional proteome research should multiply knowledge in the future.
  • Proteome research to date has been largely based on the 2D electrophoresis technique, which is used to compare protein patterns of two different cell states.
  • the great advantage of 2D electrophoresis can be seen in the high resolution in protein separation and the rapid identification possibility of the proteins of interest. Up to 10,000 proteins can be separated with a 2D gel.
  • the 2D electrophoresis technique is accompanied by some disadvantages which make this technique unsuitable for functional questions in proteome research.
  • membrane proteins or proteins> 100 kDa must be separated using other separation techniques (e.g. using 1 D SDS). Proteins that only occur in the lowest concentrations can be made visible, but are often difficult to identify.
  • ICAT isotope coded affinity tags
  • WO 01/94924 A2 and DE 100 27 794 A1 describe a method for analyzing enzyme-catalyzed reactions using MALDI-TOF mass spectrometry. However, this method is only aimed at the analysis of enzyme-catalyzed reactions, e.g. for the determination of the enzyme kinetics.
  • DE 100 27 794 A1 defines even enzyme-catalyzed reactions as “enzymatic reactions with whole cells”. A similar process is also described in DE 100 44 132 A1, in which whole cells are also used therefore gain no knowledge of individual proteins.
  • Enzyme activity in the sense of the invention is understood to mean that such biomolecules such as proteins or peptides are able to form, respectively, biomolecule-enzyme complexes. have epitopes on their surface that react with enzymes. Furthermore, that after the complex has been dissolved, the original substrate is chemically modified as the reaction product (s), the formation of the product being based on a defined unit of time. Furthermore, it is also understood to mean that the biomolecules are in a position (generally) to form biomolecule-substrate complexes in which the substrate not an enzyme, but, for example, antibodies, synthetic substances, medicines, pharmaceuticals, etc.
  • proteins are extracted from biological sources such as human or animal tissue or from plant cells.
  • fractionation of the protein extract The protein extract is purified over several chromatographic steps until individual proteins are largely homogeneous.
  • samples that can originate from different purification steps are collected separately to create a protein library.
  • each individual sample is divided into 2 or more parts after fractionation. Part of the sample is covalently bound to particles.
  • Another part of the sample is frozen for later identification of proteins of interest.
  • the proteins are covalently bound to particles. After binding, the particles are freed of non-binding substances.
  • the immobilized particles are stored in the refrigerator or freezer. Suitable agents can be added to the particles for stabilization.
  • Aliquots of the immobilized protein fractions from the protein library are incubated with a substrate. The substrate is so chooses that it (in the presence of the desired protein) is chemically changed by the desired catalytic activity of the protein (enzyme) and the chemical reaction can be recognized via the reaction product formed.
  • enzyme activities of the immobilized proteins of the fractions are ultimately measured using mass spectrometric methods.
  • process steps b) to e) can be repeated cyclically for more effective fractionation.
  • substrates for the reaction with the immobilized protein fractions are understood to mean biomolecules of any kind occurring in nature, but also synthetic organic molecules or hybrids of biomolecules occurring in nature, for example — but not exclusively — enzymes, proteins, Peptides etc.
  • the substrates can be combined to form substrate libraries, such substrate libraries consisting of a mixture of several substrates or of a substrate (molecule) with multifunctional groups in the sense of reaction-specific groups.
  • the aim of the invention is therefore to develop an automated platform system which produces protein libraries from protein extracts, searches them for enzyme activities and identifies the enzymes on which the activities are based.
  • the protein library is created by immobilizing protein fractions. The immobilization stabilizes the enzyme activities and the ability for long-term storage and enables mass spectrometric analysis of the reaction products.
  • the immobilized proteins are incubated with the substrates specific for the enzymes sought. The presence of a sought enzyme can be assumed to be probable if the expected reaction products are detected.
  • the reaction products are detected using mass spectrometry, which provides a high degree of flexibility with regard to the substrates that can be used, the detection of unexpected reaction products and the rapid screening of a protein library.
  • a given protein extract is characterized by means of preliminary tests ("scouting" tests) with regard to its composition, in order to develop a fractionation strategy from the data obtained, which strategy is based on the combination of several orthogonal chromatographic separation techniques ( (separation techniques which differ significantly in their separation mechanisms) enables fractions to be obtained with as small a number of proteins as possible, and an aliquot of each protein fraction is frozen for possible later identification and stored. This measure also makes it possible to subject a fraction of interest to further cleaning steps if necessary.
  • the protein library of the immobilized protein fractions is designed in such a way that a single fraction can be tested against a large number of different substrates independently of time.
  • the choice of substrates depends on the screening goal.
  • the substrates are naturally defined for the search for synthesizing or metabolizing enzymes.
  • the reaction products are usually detected by mass spectrometry, but other detection systems such as bio-assays can also be used.
  • bio-assays can also be used.
  • the special feature of the method according to the invention consists in the method step of immobilizing the proteins after their purification. Immobilization has several indispensable advantages for the system:
  • the immobilization additionally enables long-term storage, which is necessary for the construction and use of protein libraries.
  • the novelty of the system is the approach to detect the reaction products created by direct mass spectrometric analysis (ESI or MALDI-MS) of the incubation solutions. This direct detection is only possible through the immobilization of the proteins.
  • the immobilization of the proteins prevents loss of signal intensity in the mass spectrometric analyzes due to the absence of the proteins.
  • the gel particles on which the proteins are immobilized are therefore of central importance in the context of the invention.
  • the development of magnetic gel particles is intended to simplify the automated production and handling of the protein library.
  • the particular advantage of the invention lies in its broad applicability with respect to the substrates, since there is no definition of fluorescent substrates, substrates with UV-absorbing groups or isotope-labeled substrates, but with underivatized, not -radioactive original substrates can be worked. This prevents the risk that the substrates will no longer be recognized by their enzymes due to steric changes caused by derivatization, or that false positive results may result from the model substrates derivatized with chromophores being converted to chemical bonds other than those expected (e.g.
  • Another particular advantage over any previously developed methodology is the ability not only to detect the presence of a sought protein with known reaction products, but also to detect proteins whose catalyzed reactions tion was previously unknown.
  • This advantage is of particular interest for the study of the metabolism of new active substances and the identification of the associated enzymes as well as for the exploration of new metabolic pathways.
  • a protein library is produced from a complex protein extract by fractionation and subsequent immobilization of the purified proteins, which is then searched for suitable enzyme activities using suitable substrates.
  • the protein extracts to be separated are selected to be large enough that even after multiple fractionation steps a sufficient amount of protein is retained for immobilization and identification; an absolute amount of the protein in the extract of 10 - 100 g has proven to be useful.
  • the protein libraries are created by gentle fractionation of protein extracts. For this purpose, larger protein extracts in the gram range are separated with a few separation steps to such an extent that the smallest possible number of proteins can be found in the individual protein fractions. This is achieved by using a special form of displacement chromatography (sample self-displacement).
  • the purified proteins are immobilized on affinity chromatography gel particles.
  • magnetic gel particles are also used for the immobilization, which have a suitable gel surface, which ensure the highest possible enzyme activity.
  • the gel particles are moved, preferably automated, through immobilization, washing, dosing and incubation steps. This auto At the same time, matatisation advantageously ensures that MALDI sample carriers or an electrospray injection system are loaded for the subsequent mass specrometric measurements; this provides an automated interface to the mass spectrometer.
  • reaction products with mass spectrometry eg MALDI or ESI-MS
  • the analysis of the reaction products with mass spectrometry (eg MALDI or ESI-MS) after incubation of the substrates with the immobilized proteins is also automated and the data obtained are managed and, if necessary, evaluated using corresponding software. Fractions with enzyme activity are checked for protein purity and identified for purity. For this purpose, the fractions obtained are analyzed for uniformity using techniques such as 2D electrophoresis or microbore HPLC and the corresponding fractions are identified by MALDI-MS and LC-ESI-MS / MS or by Edman degradation.
  • the automated system for carrying out the method according to the invention comprises the following components: a system (“scouting” system) for exploring the composition of the extract, which provides data for the combination of the cleaning steps, a multidimensional chromatography system for fractionating the protein extracts, a robot for the immobilization of the proteins, for the automatic incubation of substrates with fractions of the immobilized proteins and for the transfer of the reaction products to the mass spectrometer, a mass spectrometer and a data processing system.
  • a system for exploring the composition of the extract, which provides data for the combination of the cleaning steps
  • a multidimensional chromatography system for fractionating the protein extracts
  • a robot for the immobilization of the proteins
  • for the automatic incubation of substrates with fractions of the immobilized proteins and for the transfer of the reaction products to the mass spectrometer, a mass spectrometer and a data processing system.
  • Pig kidneys are selected as the source for the protein extract in the examples below. This choice has the advantage that the necessary organs can be obtained in sufficient quantities from slaughterhouses.
  • the kidney is used as an organ, because specific scientific questions can be connected to this organ (for example, searching for angiotensin II and urotensin-generating enzymes). This question is interesting for the project as a model for the evaluation of the system, since the detection of the enzyme activities via the mass spectrometric detection of the reaction products (angio- tensin I or angiotensin II; Urotensin) after incubation of renin substrate or pro-urotensin with immobilized protein fractions.
  • kidney as a source of the proteins is also advantageous because this tissue is known to synthesize renin.
  • the detection and identification of renin should serve as a control for the functionality of the invention.
  • Renin a specific protease formed in the kidney, catalyzes the hydrolysis of renin substrate, in which angiotensin I is formed as a reaction product.
  • An effective chromatography system with which it is possible to purify protein extracts into their individual components as quickly and gently as possible, is carried out by a) the systematic search ("scouting" experiments) for suitable parameters for the chromatographic separation of the protein extract and b) by combining different chromatography columns (Affinity, ion exchange, size exclusion, hydrophobic interaction, hydroxylapatite, immobilized metal ion affinity and reversed phase chromatography) based on orthogonal separation principles. Individual fractions are directly linked to the following by techniques such as column switching Chromatography column passed on without the protein fractions leaving the system, ie they have to be temporarily stored in fraction vessels.
  • the fractionation strategy includes the following steps: After creating a protein extract pool that is large enough to carry out a large number of fractionation experiments with identical samples, this pool is characterized in terms of its protein composition and enzymatic activities ("scouting" experiments).
  • SDS-PAGE electrophoresis, isoelectric focusing and 2D electrophoresis are the first to obtain a detailed picture of the proteins present in the extract, and this data is used to further plan fractionation, with the protein extract not only being separated into its components, but also
  • the eluates of the chromatography media are additionally examined with electrophoresis in order to document the effectiveness and selectivity of the respective chromatographic parameters, in order to check the influence of the chromatograph
  • Common steps for enzyme activities are to be used for various enzymes.
  • the enzyme Kinetics are investigated using methods of UV spectroscopy and fluorescence spectroscopy. The use of these techniques is necessary in order to be able to measure the activities not only after but also before the immobilization. By comparing the enzyme kinetics before and after immobilization, statements about the influence of immobilization on the enzyme activities are possible.
  • the problem with creating / building the protein library is to fractionate protein extracts with the aim of achieving the most effective possible separation of the proteins with high resolution - while maintaining as many enzymatic activities as possible. After successful separation, aliquots of the chromatographically obtained fractions have to be immobilized for the protein library.
  • the mass spectrometric investigations of the immobilized protein-substrate complexes for the detection of the enzymatic activity of the proteins are carried out with the methods of MALDI mass spectrometry, in particular with a reflector MALDI mass spectrometer. Both the work steps for immobilization and the mass spectrometric detection of enzymatic activities should be automated as much as possible, but of course can also be carried out “manually” (without automation) if necessary.
  • the protein libraries can be stored for a long time without loss of the enzymatic activities. It does not matter in which way the proteins are immobilized, for example as activated affinity chromatography gels or on magnetic gel particles. Such magnetic gel particles, so-called magnetobeads, are offered, for example, by chemagen (see www.chemagen.de). The coupling chemistry between magnetobeads and non-magnetobeads is essentially known. The advantage of using magnetobeads is that the particles are easier to automate using electromagnets.
  • the advantages of the automated mass spectrometry-supported system according to the invention for screening protein libraries for enzymatic activities are as follows:
  • the invention proves to be advantageous for functional proteome research in the sense of a comparison of two different life states (profiling of enzyme activities with substrate libraries to be developed, multifunctional probes), as well as for the search for new enzymes for the synthesis of biomolecules (with known biomolecules as substrates), for the metabolism of molecules (substrates: biomolecules, active substances) and for organic synthesis (substrates: synthesis building blocks);
  • biomolecules with known biomolecules as substrates
  • substrates for the metabolism of molecules
  • substrates biomolecules, active substances
  • organic synthesis substrates: synthesis building blocks
  • Metabolomics research beaten as new drug-relevant enzymes are recognized and metabolic pathways can be investigated with the invention.
  • the system can be used both for the targeted search for enzymes for the implementation of a given substance and for the exploration of natural synthetic routes.
  • the invention serves as a tool for the search for new enzymes for all biotechnological areas in which enzymes are used. This includes the pharmaceutical industry (search for new targets (enzymes) for drug development, search for new enzymes for the synthesis of drugs, decoding the metabolism of new drugs, development of new diagnostics), food technology
  • the invention serves as a tool for the search for enzyme activities of unknown enzymes for functional proteome research.
  • multiplex screening with multifunctional substrates and / or substrate mixtures / substrate libraries it is possible to create profiles of enzyme activities from two systems to be compared.
  • protein libraries of every prokaryotic or eukaryotic cell (or their cell cultures), every cell culture of human or animal cells, every human or animal organ or every conceivable plant can be created, which can be searched against substrate libraries for enzyme activities. Both known and unknown substances or mixtures can serve as substrates.
  • the invention has great potential for application and extends from the biochemistry of microorganisms to the biochemistry of plants to basic clinical research. Another area of application important for life science research is the possibility of being able to trace metabolic pathways, since not only unknown enzymes are detected and identified, but also new unknown metabolites can be recognized at the same time.
  • FIG. 2 dependence of the relative signal intensity of Lys-bradykinin (signal intensity of Lys-bradykinin:
  • FIG. 3 detection of urotensin-generating activity from a protein fraction mass spectrum of a reaction mixture of an incubation of a protein fraction bound to particles from kidney tissue with an urotensin substrate after an incubation time of 4 h.
  • External standard Saralasin.
  • Pig kidneys are used for the production of protein extracts. Immediately after being removed from the slaughterhouse, they are cooled in physiological saline (0.9% NaCI solution) until further processing. The kidney tissue is cut (at temperatures from 4 to 6 ° C) into pieces of approx. 1 cm 3 , filled into pre-cooled lyophilization tubes, frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C overnight. The tissue pieces are completely dried in a lyophilization plant for about a week 1 week. The anhydrous pieces of tissue are then pulverized with a grain mill at the finest level. 10 g of the powder are dissolved in 200 ml of buffer (20 mM Hepes buffer in 50% distilled water, 50% glycerol. 10 "4 M dithiothreitol, pH 7.4). A homogenizer is used for this.
  • two different goals can be pursued, namely 1.) the targeted purification of a single enzyme or 2.) high-resolution fractionation while maintaining a large number of activities.
  • the chromatographic purification steps are combined in such a way that protein fractions only leave the chromatography system after the last purification step and are collected in collecting vessels (deep-well plates). Aliquots of the fractions are aliquoted for the reserve systems.
  • the coupling of the proteins to particles takes place, for example, according to Hermanson et al. (Academic Press, 1992), 53-56). In this regulation, bromocyanine-activated particles (from Amersham) are used for the binding of proteins to particles. The particles are dissolved in four times their own amount of 1 mM HCl (pH 2-3). The swollen gel is rinsed several times with 100 times its own volume with HCI. Then it is washed with water 5-10 times its own volume.
  • coupling buffer A 0.1 M NaHCO 3 buffer in 0.5 M NaCl, pH 8.3
  • coupling buffer A 5-10 mg Protein per ml of gel
  • Unbound protein is removed by rinsing with coupling buffer A.
  • unbound active groups of the gel are blocked with glycine.
  • the gel is incubated with 2 to 3 times the gel volume of coupling buffer B (0.2 M glycine buffer in coupling buffer A) at room temperature for two hours or at 4 ° C. overnight with constant swirling. It is alternated 3 times with Tris-HCI Buffer, pH 8.0 and Na acetate buffer, pH 4 rinsed.
  • the finished gel is stored at 2-8 ° C in 0.02% sodium azide solution.
  • the individual fraction In order to be able to make statements about the enzymatic activities of individual fractions, the individual fraction must be incubated with a substrate that is chemically changed by the activity to be detected. (In the example in FIG. 1a: proteolytic cleavage of kallikrein substrate by kallikrein to the reaction product lys-bradykinin). The activity can be verified by mass spectrometric detection of the resulting reaction product.
  • ESI electrospray
  • MALDI-MS the sample to be analyzed must be largely free of salts and other low molecular weight substances.
  • This condition can be met if a) the components of the fractions are previously bound to particles and freed of salts and b) the substrates are dissolved in high-purity water and the solution is incubated. The reaction products can then be analyzed directly by mass spectrometry without further sample preparation.
  • a kallikrein preparation was bound to particles and incubated with kallikrein substrate. After a defined time interval (30 min), an aliquot of the reaction solution (1.5 ⁇ l) is removed and pipetted onto the surface of a metal anchor plate (Bruker). Then 1.5 ⁇ l of the UV-absorbing desorption matrix hydroxy- ⁇ -cyano-cinnamic acid (saturated in ACN / H 2 O (50/50) with 0.1% trifluoroacetic acid) are added. After the sample has crystallized on the sample plate, it is brought into the mass spectrometer (Reflex III, Bruker) via a vacuum lock.
  • Reflex III Reflex III
  • the desorption of the sample ions takes place through the pulse of a nitrogen laser beam (VSL-337 ND, Laser Science, wavelength 337 nm, pulse duration 4 ns, energy 10 6 -10 7 W / cm 2 , diameter of the radiation field 50 - 100 ⁇ m).
  • the acceleration voltage U acc in the electrostatic field was 10 kV
  • the pressure in the system was 6-8 x 10 "7 mbar.
  • the mass spectra are recorded with a LeCroy 9400 transient recorder. 200 spectra are summed up during the detection. As a further example, the mass spectrometric detection of an activity generating urotens is shown.
  • a peptide (urotensin-generating enzyme substrate) with the sequence RIKKPYKKRGPPSECFWKY (2430.3 Da) is dissolved in HPLC-pure water in a concentration of 10 "5 mol / l.
  • GPPSECFWKY (here called "urotensin”).
  • a signal of mass 1214.33 Da can then be seen in the mass spectrum (see FIG. 3).
  • This signal corresponds to the simply protonated ion of a urotensin-like peptide
  • An aliquot of the proteins bound to particles was removed and incubated with the urotensin-generating enzyme-substrate solution After an defined time interval, an aliquot of the reaction solution (1.5 ⁇ l) was taken and pipetted onto the surface of a metal anchor plate (from Bruker) Then 1.5 ⁇ l of the UV-absorbing desorption matrix hydroxy- ⁇ -cyano-cinnamic acid (saturated in ACN / H 2 O (50/50) with 0.1% trifluoroacetic acid) are added Allization of the sample on the sample plate is brought into the mass spectrometer via a vacuum lock and the sample is analyzed as indicated above.
  • the relative enzyme activity is defined here as the amount of the reaction product that occurs per unit of time:
  • rel.lnt f i relative intensity of the analyte, based on the internal standard, based on the incubation period t ⁇
  • the signal of the MALDI-MS depends on the location of the laser on the crystallized sample. Due to the non-uniform alignment of the crystals to the laser, the radiation energy that the area hit by the laser absorbs varies. As a result, different intensities of the signal are le detected due to the different intensity of the absorbed radiation energy. As a result, there is often no direct correlation between signal intensity and analyte concentration in individual spectra.
  • the problem is avoided by the following measures:
  • the sample is measured by an automated process, in which the laser of the MALDI-MS shoots at the sample in accordance with prescribed trajectories in order to find areas that guarantee an optimal yield of signal intensity.
  • the laser intensity is automatically optimized. In this example, a maximum of 60 laser pulses were applied to the sample per area. If no signal was detected before the 60 pulses were reached, a new area on the sample is automatically searched for. 200 spectra were summed and averaged for a total spectrum.
  • an external standard of the matrix Saralasin (10 "5 M to 10 " 10 M) is added.
  • FIG. 2 shows the ratio of the relative, ie, the signal intensity of lys-bradykinin based on the internal standard to the concentration of the analyte.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine integrierte Plattform-Technologie, mit der Biopolymer-Extrakte (vorzugsweise Proteinextrakte) aus biologischen Quellen (z.B. Zellkulturen von Prokaryoten und Eukaryoten, menschlichen oder tierischen Gewebe und Zellen, sowie pflanzliche Zellen) gereinigt, Proben verschiedener Reinigungsstufen in einem Rücklage-System (in Form einer Proteinbibliothek) aufbewahrt und Aliquots aus dem Rücklage-System abgenommen werden können, um diese auf definierte katalytische Aktivitäten zu prüfen. Proben, die die definierte Aktivität aufweisen, können dann über analytische Methoden identifiziert werden, insbesondere mittels Massenspektrometrie und proteinchemischen Methoden. Die einzelnen Verfahrensschritte können manuell oder automatisiert betrieben werden.

Description

Verfahren zur Erkennung von Enzymaktivitäten von beliebigen Proteinextrakten
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erkennen von Enzymaktivitäten von beliebigen Proteinextrakten.
Stand der Technik
Nachdem die Entschlüsselung des menschlichen Genoms fast abgeschlossen ist, ist die systematische Analyse der durch das Genom exprimierten Proteine (Prote- om) in den Vordergrund des Interesses gerückt. Von der Proteomanalyse werden neue wichtige Erkenntnisse für das Verständnis der zellulären Funktionen und ihrer Störungen erwartet. Zu den Proteinen gehören Enzyme, die an allen Lebensprozessen beteiligt sind. Aufgrund ihrer katalytischen Eigenschaften sind Enzyme im Ver- gleich zu vielen Strukturproteinen in sehr viel niedrigeren Konzentrationen in der Zelle anzutreffen, so dass diese wichtige Gruppe der Proteine sich der 2D- Elektrophorese-Analytik häufig entzieht. Bisher ist erst ein Bruchteil aller im menschlichen Organismus während einer Lebensspanne exprimierten Enzyme bekannt. In der Vergangenheit konnte bereits von einigen dieser Enzyme die Einbindung in die Entstehung von Krankheitsprozessen beschrieben und damit Beiträge zur Erkennung und auch Behandlung von Krankheiten geliefert werden. Durch die funktionelle Proteomforschung sollte sich der Erkenntnisgewinn in Zukunft vervielfachen. Die Erforschung der Enzyme ist jedoch nicht nur für das Verständnis, die Erkennung (Diagnostik) und die Behandlung (Pharmaco-Genomics) von Krankheiten von Be- deutung sondern auch für viele Bereiche der Biotechnologie. Hierzu zählen die Stoffumwandlung mittels Enzymen sowie der Einsatz von Enzymen in der Analytik. Die gezielte Suche nach neuen Enzymen stellt daher einen wichtigen Schritt in der funktionellen Proteomforschung mit einem großen anwendungsrelevanten Potential dar.
Die bisherige Proteomforschung stützte sich weitgehend auf die 2D-Elektrophorese Technik, mit der Proteinmuster zweier unterschiedlicher Zustände von Zellen vergleichend untersucht werden. Der große Vorteil der 2D-Elektrophorese ist in der hohen Auflösung bei der Proteintrennung und der schnellen Identifikationsmöglichkeit der interessierenden Proteine zu sehen. Bis zu 10.000 Proteine lassen sich mit einem 2D-Gel trennen. Die 2D-Elektrophorese-Technik wird jedoch von einigen Nachteilen begleitet, die diese Technik für funktionelle Fragestellungen der Proteomforschung für ungeeignet erscheinen lässt. Hinzu kommt, dass Membranproteine oder Proteine > 100 kDa mit anderen Trenntechniken (z.B. durch 1 D SDS) aufgetrennt werden müssen. Proteine, die nur in geringsten Konzentrationen vorkommen, können zwar sichtbar gemacht werden, sind aber häufig schwer zu identifizieren. Außerdem können aufgrund der Protein-denaturierenden Bedingungen keine Informationen über die Funktion der getrennten Proteine erbracht werden. Die neu entwickelte ICAT (isotope coded affinity tags) Technik erlaubt zwar für Cystein-haltige Proteine eine bessere vergleichende Quantifizierung der Proteinmuster zweier un- terschiedlicher Zustände, kann aber, methodisch bedingt, auch keine Informationen über die Funktion der interessierenden Proteine vermitteln.
Zum Nachweis von Enzymen wurden in jüngerer Zeit einige Fluoreszenz-basierte Nachweissysteme vorgestellt, mit denen sich Proteinfraktionen im Mikrotiterplatten- Format auf Enzymaktivitäten durchsuchen lassen. Ähnliche Nachweisverfahren gibt es auch auf UV-basierten Systemen. Bei all diesen Nachweisverfahren ist man jedoch immer auf die Verfügbarkeit von Substraten angewiesen, die mit einem fluoreszierenden Chromophor markiert sind. Durch die Derivatisierung mit dem Chro- mophor kann das Substrat unter Umständen so in seiner chemischen Struktur verändert werden, dass das gesuchte Enzym das Substrat als solches nicht mehr er- kennt. Der eindeutigste Nachweis von Enzymaktivitäten gelingt mit Isotopen- markierten Substraten. Diese Nachweissysteme haben jedoch den Nachteil, mit radioaktiven Substanzen arbeiten zu müssen. Jankowski et al. (Anal. Biochem. 290, 324-329 (2001)) beschreiben ein System, welches sich lediglich auf den grundsätzlichen Nachweis von Enzymaktivitäten beschränkt. Zum Nachweis von Enzymaktivitäten werden (ungereinigte) immobilisierte Proteine, die aus Protein-haltigen Lösungen stammen, mit Reaktions-spezifischen Substraten in salzfreien wässrigen Lösungen inkubiert. Die bei Anwesenheit eines gesuchten Enzyms entstehenden Reaktionsprodukte werden massenspektro- metrisch direkt aus dem Inkubationsmedium nachgewiesen. Mithilfe dieser Methode konnte in einem Proteinextrakt komplexer Zusammensetzung eine Vielzahl sich deutlich voneinander unterscheidender Enzymaktivitäten nachgewiesen werden, ohne dass jedoch Aussagen über die jeweiligen Reaktionspartner gemacht werden können.
Die WO 01/94924 A2 sowie DE 100 27 794 A1 beschreiben ein Verfahren zur Analyse Enzym-katalysierter Umsetzungen mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Dieses Verfahren ist jedoch lediglich auf die Analyse von Enzym-katalysierten Reaktio- nen gerichtet, z.B. zur Bestimmung der Enzymkinetik. Die DE 100 27 794 A1 definiert dabei selbst Enzym-katalysierte Umsetzungen als „enzymatische Reaktionen mit ganzen Zellen". Ein ähnliches Verfahren wird auch in der DE 100 44 132 A1 beschrieben, in dem ebenfalls mit ganzen Zellen gearbeitet wird. Aus diesen Druckschriften lassen sich daher keiner Erkenntnisse über einzelne Proteine gewinnen.
Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Aufspüren und zur Identifizierung von Biomolekülen wie beispielsweise Proteinen oder Peptiden, die potentielle Enzymaktivität aufweisen, zur Verfügung zu stellen.
Unter Enzymaktivität im Sinne der Erfindung wird dabei verstanden, dass derartige Biomoleküle wie beispielsweise Proteine oder Peptide in der Lage sind, Biomolekül- Enzym-Komplexe zu bilden, resp. auf ihrer Oberfläche solche Epitope aufweisen, die mit Enzymen reagieren. Ferner, dass nach Auflösen des Komplexes das ursprüngliche Substrat chemisch verändert als Reaktionsprodukt(e) hervorgeht, wobei die Bildung des Produktes auf eine definierte Zeiteinheit bezogen wird. Ferner wird darunter aber auch verstanden, dass die Biomoleküle überhaupt in der Lage sind (ganz generell) Biomolekül-Substrat-Komplexe zu bilden, bei denen das Substrat kein Enzym, sondern beispielsweise Antikörper, synthetische Stoffe, Medikamente, Phamazeutika etc. sein könenn.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Merkmale des Anspruchs 1. Erfindungsgemäß ist danach ein Verfahren zum Erkennen von Enzymaktivitäten von beliebigen Prote- infraktionen vorgesehen, welches aus mehreren aufeinanderfolgenden Verfahrensschritten gekennzeichnet ist, nämlich
a) Gewinnung eines Proteinextrakts. In diesem Verfahrensschritt werden aus biologischen Quellen wie z.B. menschlichem oder tierischen Gewebe oder aus pflanzlichen Zellen Proteine extrahiert. b) Fraktionierung des Proteinextrakts. Der Proteinextrakt wird über mehrere chromatographische Schritte soweit aufgereinigt, bis individuelle Proteine weitgehend homogen vorliegen. In diesem Verfahrensschritt werden zur Erstellung einer Proteinbibliothek Proben, die aus unterschiedlichen Reinigungsschritten stammen können, getrennt vonein- ander gesammelt. c) Teilen der Fraktionen des Proteinextrakts zur Erstellung einer Proteinbibliothek, wobei ein Teil jeder Fraktion distinkt immobilisiert wird (immobilisierte Proteinbibliothek) und der korrespondierende, nicht immobilisierte Teil der Proteinfraktion zur späteren Identifizierung eingefroren wird (gelöste Proteinbibliothek). In diesem Verfahrensschritt wird jede individuelle Probe nach der Fraktionierung in 2 oder mehr Teile aufgeteilt. Ein Teil der Probe wird an Partikel kovalent gebunden. Ein weiterer Teil der Probe wird für die spätere Identifizierung interessierender Proteine eingefroren. Um die voneinander ge- trennten Proteine in die Proteinbibliothek aufnehmen zu können, werden die Proteine kovalent an Partikel gebunden. Nach dem Binden werden die Partikel von nicht-bindenden Substanzen befreit. Die immobilisierten Partikel werden im Kühlschrank oder Gefrierschrank gelagert. Zur Stabilisierung können den Partikeln geeignete Agentien zugesetzt sein. d) Aliquots der immobilisierten Proteinfraktionen aus der Proteinbibliothek werden mit einem Substrat inkubiert. Das Substrat wird so ge- wählt, das es (im Falle der Anwesenheit des gesuchten Proteins) von der gesuchten katalytischen Aktivität des Proteins (Enzyms) chemisch verändert wird und sich über das entstehende Reaktionsprodukt die chemische Reaktion erkennen lässt. Über massenspektro- metrische Methoden werden daher letztlich Enzymaktivitäten der immobilisierten Proteine der Fraktionen gemessen. e) Massenspektrometrische Messung der Proben nach d). Eine solche Messung kann auch mehrmals durchgeführt werden, oder aber in definierten Zeitintervallen. Hierzu werden der Reaktionsmischung Pro- ben entnommen und für massenspektrometrische Analysen (MS) nach im wesentlichen bekannten Techniken vorbereitet. Die Proben der Reaktionsmischungen werden mit der MS analysiert, um die Reaktionsprodukte zu identifizieren. f) Vergleich der Proben, die Enzymaktivitäten aufweisen mit den Frakti- onen nach b). Ein Vorliegen der überprüften katalytischen Eigenschaft im Reaktionsgemisch ist daran erkennbar, dass ein oder mehrere Reaktionsprodukte, die aus dem Substrat durch chemische Umsetzung hervorgegangen sind, nachgewiesen werden können, nämlich durch Vergleich (nicht Substrat-modifizierten) mit den Ausgangs- Substanzen. Dies kann mithilfe eines entsprechenden Software-
Programms erfolgen. g) Identifizierung der Proben, die Enzymaktivitäten aufweisen mit den Fraktionen der gelösten Proteinbibliothek nach c). Mit im wesentlichen bekannten proteinchemischen Methoden der Analytik und Se- quenzierung können die Proteine, von denen man aufgrund des durchlaufenden Verfahrens (d-f) weiß, dass sie mit dem Substrat reagiert haben, identifiziert werden.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass zur effektiveren Fraktionierung die Verfahrensschritte b) bis e) zyklisiert wiederholt werden können.
Vorteilhaft ist es, die Fraktionen in Fraktionssammelgefäßen oder Multi-Deep-Well Platten (mit n Kavitäten, n > 1) zu sammeln. Das gleiche gilt für die Immobilisierung, die vorzugsweise in Reaktionsgefäßen oder auf Multi-Well-Platten (mit n Kavitäten, n > 1 ) erfolgt.
Im Sinne der Erfindung werden unter „Substrate" für die Reaktion mit den immobilisierten Proteinfraktionen in der Natur vorkommende Biomoleküle jeglicher Art, aber auch synthetische organische Moleküle bzw. Hybride von in der Natur vorkommenden Biomolekülen verstanden, beispielsweise - aber nicht ausschließlich - Enzyme, Proteine, Peptide etc.. Die Substrate können zu Substratbibliotheken zusammenge- fasst werden, wobei solche Substratbibliotheken aus einem Gemisch von mehreren Substraten oder aus einem Substrat (Molekül) mit multifunktionellen Gruppen im Sinn reaktionsspezifischer Gruppen bestehen können.
Die Erfindung setzt sich mithin zum Ziel, ein automatisiertes Plattform-System zu entwickeln, dass aus Proteinextrakten Proteinbibliotheken herstellt, diese auf Enzymaktivitäten durchsucht und die den Aktivitäten zugrundliegenden Enzyme identifiziert. Die Proteinbibliothek entsteht dabei durch Immobilisierung von Proteinfraktio- nen. Durch die Immobilisierung wird eine Stabilisierung der Enzymaktivitäten und die Fähigkeit zur Langzeitlagerung erreicht sowie die massenspektrometrische Analyse der Reaktionsprodukte ermöglicht. Um Enzyme in der Proteinbibliothek zu finden, werden die immobilisierten Proteine mit den für die gesuchten Enzyme spezifischen Substraten inkubiert. Die Anwesenheit eines gesuchten Enzyms kann dann als wahrscheinlich angenommen werden, wenn die erwarteten Reaktionsprodukte detektiert werden. Der Nachweis der Reaktionsprodukte erfolgt mit der Mas- senspektrometrie, wodurch eine hohe Flexibilität in Bezug auf die einsetzbaren Substrate, auf das Erkennen unerwarteter Reaktionsprodukte und ein schnelles Screenen einer Protein-Bibliothek erreicht wird.
Der grundsätzliche erfindungsgemäße Verfahrensablauf sieht wie folgt aus: Ein gegebener Proteinextrakt wird über Vorversuche (,,Scouting"-Versuche) bezüglich seiner Zusammensetzung charakterisiert, um aus den gewonnenen Daten eine Frakti- onierungsstrategie zu entwickeln, die unter Ausnutzung der Kombination mehrerer orthogonaler chromatographischer Trenntechniken (d.h. Trenntechniken, die sich in ihren Trennmechanismen deutlich voneinander unterscheiden), den Erhalt von Fraktionen mit einer möglichst kleinen Zahl von Proteinen ermöglicht. Ein Aliquot einer jeden Proteinfraktion wird für eine eventuelle spätere Identifizierung eingefroren und gelagert. Durch diese Massnahme besteht auch die Möglichkeit bei Bedarf eine interessierende Fraktion weiteren Reinigungsschritten zu unterziehen. Die Proteinbibliothek der immobilisierten Proteinfraktionen ist so angelegt, dass eine einzelne Fraktion gegen eine Vielzahl unterschiedlicher Substrate zeitlich unabhängig getestet werden kann. Diese Möglichkeit verlangt, dass die immobilisierten Proteine portioniert aus der Bibliothek entnommen werden können. Die Wahl der Substrate ist vom jeweiligen Screening-Ziel abhängig. Für die Suche nach synthetisierenden oder me- tabolisierenden Enzymen sind die Substrate naturgemäß definiert. Die Detektion der Reaktionsprodukte erfolgt in der Regel massenspektrometrisch, andere Detektions- Systeme wie Bio-Assays lassen sich jedoch ebenfalls verwenden. Sobald das erwartete Reaktionsprodukt detektiert ist und damit die Existenz des gesuchten Enzyms in der untersuchten immobilisierten Proteinfraktion angezeigt hat, wird die entsprechende nicht-immobilisierte Fraktion mit den klassischen Methoden der Proteinanalytik identifiziert. Die Besonderheit des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in dem Verfahrensschritt, die Proteine nach ihrer Reinigung zu immobilisieren. Durch die Immobilisierung werden für das System mehrere unverzichtbare Vorteile erzielt:
1. Die Immobilisierung sorgt für eine Stabilisierung der Proteine. Dieser Effekt wird in der biotechnologischen Anwendung von Enzymen seit etlichen Jahren genutzt (Tischer, W. and Kasche, V. (1999), Trends in Biotechnology 17, 326).
2. Die Immobilisierung ermöglicht zusätzlich eine Langzeitlagerung, die für den Aufbau und die Verwendung von Proteinbibliotheken notwendig ist. Die Neuheit des Systems besteht in dem Ansatz, entstandene Reaktionsprodukte durch direkte massenspektrometrische Analyse (ESI- oder MALDI-MS) der Inkubationslösungen nachzuweisen. Dieser direkte Nachweis wird erst durch die Immobilisierung der Proteine möglich.
3. Die Immobilisierung der Proteine verhindert Signalintensitätseinbußen der massenspektrometrischen Analysen durch die Abwesenheit der Proteine.
4. Die Immobilisierung der Proteine ermöglicht enzymatische Reaktionen in salzfreier wässriger Lösung, einer sehr wichtigen Bedingung für den direkten Nachweis der Reaktionsprodukte aus der Inkubationslösung mit der Mas- senspektrometrie.
5. Die Kombination der Immobilisierung der Proteine mit der Massenspektro- metrie erlaubt die Miniaturisierung des Nachweissystems: Für einen einzel- nen Reaktionsansatz sind jeweils nur einige wenige Gelpartikel und Substratlösungen < 1 μl realisierbar.
Den Gelpartikeln, an denen die Proteine immobilisiert werden, kommt deshalb im Rahmen der Erfindung eine zentrale Bedeutung zu. Durch die Entwicklung magnetischer Gelpartikel soll die automatisierte Herstellung und Handhabung der Protein- bibliothek vereinfacht werden. Im Vergleich zu herkömmlichen Systemen zum Nachweis von Enzymaktivitäten besteht der besondere Vorteil der Erfindung in ihrer breiten Anwendbarkeit in Bezug auf die Substrate, da keine Festlegung auf fluoreszierende Substrate, Substrate mit UV-absorbierenden Gruppen oder Isotopen- markierte Substrate erfolgt, sondern mit underivatisierten, nicht-radioaktiven Origi- naI-Substraten gearbeitet werden kann. Hierdurch wird der Gefahr vorgebeugt, dass die Substrate aufgrund sterischer Veränderungen, die durch Derivatisierung entstehen, von ihren Enzymen nicht mehr erkannt werden oder das falsch positive Ergebnisse dadurch entstehen können, dass die mit Chromophoren derivatisierten Modellsubstrate an anderen als den erwarteten chemischen Bindungen umgesetzt (z.B. gespalten) werden. Durch den Nachweis der Reaktionsprodukte mit der Mas- senspektrometrie ist im Vergleich zu anderen Methoden wie der HPLC der Vorteil der Eindeutigkeit bei der Identifizierung der Reaktionsprodukte gegeben. Identische Retentionszeiten der HPLC können auch von nicht-identischen Substanzen verursacht werden. Der Einsatz der Massenspektrometrie ermöglicht eine schnelle auto- matisierbare Analyse auch größerer Probenmengen. Die Geschwindigkeit der Analysen kann durch Inkubation der immobilisierten Proteine mit mehreren Substraten gleichzeitig zusätzlich beschleunigt werden. Auch dieser Vorteil wird erst durch den Einsatz der Massenspektrometrie möglich.
Ein weiterer besonderer Vorteil gegenüber jeder bisher entwickelten Methodik be- steht in der Möglichkeit, nicht nur die Anwesenheit eines gesuchten Proteins mit bekannten Reaktionsprodukten zu erkennen, sondern im Fall neu entstandener unerwarteter Reaktionsprodukte auch Proteine aufzuspüren, deren katalysierte Reak- tion bisher nicht bekannt war. Dieser Vorteil ist insbesondere für die Untersuchung der Metabolisierung von neuen Wirkstoffen und die Identifizierung der zugehörigen Enzyme sowie für die Erkundung neuer Stoffwechselwege von Interesse. Durch die Besonderheit der Proteinbibliothek, nämlich die Immobilisierung der Proteine auf magnetischen Partikeln, die in 96well Platten abgelegt und gelagert werden können, ist das System nicht ausschließlich auf die Massenspektrometrie fixiert, sondern offen für beliebige andere Systeme zum Nachweis von Reaktionsprodukten, einschließlich Systemen zum Nachweis biologischer Wirkung. Da die Inkubation der Substrate mit den immobilisierten Proteinen in salzfreien Medien funktioniert, ist eine ideale Kompatibilität zu Bio-Assays gewährleistet. Viele Bio-Assays zeigen unter nicht-physiologischen Bedingungen, wie sie durch begleitende Salze entstehen können, falsch-positive Ergebnisse.
Aus einem komplexen Proteinextrakt wird durch Fraktionierung und anschließende Immobilisierung der gereinigten Proteine eine Proteinbibliothek hergestellt, die an- schließend mit geeigneten Substraten nach verschiedenen Enzymaktivitäten durchsucht wird. Die jeweils zu trennenden Proteinextrakte werden so groß gewählt, dass auch nach mehrfachen Fraktionierungsschritten eine für die Immobilisierung und Identifizierung ausreichend große Proteinmenge erhalten bleibt; eine absolute Menge der Proteine im Extrakt von 10 - 100 g hat sich dabei als zweckdienlich erwie- sen.
Die Erstellung der Proteinbibliotheken erfolgt durch schonende Fraktionierung von Proteinextrakten. Hierzu werden größere Proteinextrakte im Grammbereich mit wenigen Trennschritten soweit aufgetrennt, dass in den einzelnen Proteinfraktionen eine möglichst kleine Zahl von Proteinen zu finden ist. Dies wird durch die Anwen- düng einer besonderen Form der Displacement-Chromatographie (Sample-Self- Displacement) erreicht.
Die gereinigten Proteine werden an Affinitätschromatographiegel-Partikel immobilisiert. Um die immobilisierten Proteine einfach handhaben und automatisieren zu können, werden ferner auch magnetische Gelpartikel für die Immobilisierung ver- wendet, die eine geeignete Geloberfläche aufweisen, die eine möglichst hohe Enzymaktivität gewährleisten. Die Gelpartikel werden durch Immobilisierungs-, Wasch- , Dosier- und Inkubationsschritte bewegt, vorzugsweise automatisiert. Diese Auto- matisierung sorgt vorteilhaft gleichzeitig dafür, dass für die nachfolgenden mas- senspekrometrischen Messungen, MALDI-Probenträger oder ein Elektrospray- Injektionssystem beschickt werden; damit liegt ein automatisiertes Interface zum Massenspektrometer vor. Die Analyse der Reaktionsprodukte mit der Mas- senspektrometrie (z.B. MALDI- oder ESI-MS) nach Inkubation der Substrate mit den immobilisierten Proteinen erfolgt ebenfalls automatisiert und die gewonnenen Daten werden über eine korrespondierende Software verwaltet und ggf. ausgewertet. Fraktionen mit Enzymaktivität werden mit proteinchemischen Methoden auf Reinheit geprüft und identifiziert. Dazu werden die gewonnenen Fraktionen auf Einheitlichkeit mit Techniken wie der 2D-Elektrophorese oder der Mikrobore-HPLC analysiert und die entsprechenden Fraktionen per MALDI-MS und LC-ESI-MS/MS oder dem Ed- man-Abbau identifiziert. Große Proteine werden per 1 DE-SDS-Gel nachgereinigt und analysiert; basische Proteine können mittels einer für ribosomale Proteine entwickelten Technik überprüft werden (Koc EC, Burkhart W, Blackburn K, Koc H, Mo- seley A, Spremulli LL. Protein Identification of four proteins from the small subunit of the mammalian mitochondrial ribosome using a proteomics approach. Protein Sei. 2001 Mar;10(3):471-81).
Das automatisierte System zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst folgende Komponenten: Ein System (,,Scouting"-System) zur Erkundung der Zusammensetzung des Extrakts, welches Daten für die Kombination der Reinigungsschritte liefert, ein mehrdimensionales Chromatographie-System zur Fraktionierung der Proteinextrakte, einen Roboter zur Immobilisierung der Proteine, zur automatischen Inkubation von Substraten mit Fraktionen der immobilisierten Proteine sowie zum Transfer der Reaktionsprodukte zum Massenspektrometer, einem Massenspektrometer und einem Datenverarbeitungssystem.
Als Quelle für den Proteinextrakt werden in den untenstehenden Beispielen Schweine-Nieren gewählt. Diese Wahl hat den Vorteil, dass die notwendigen Organe über Schlachthöfe in ausreichender Menge besorgt werden können. Als Organ wird die Niere eingesetzt, weil sich mit diesem Organ konkrete wissenschaftliche Fragestel- lungen verbinden lassen (beispielsweise Suche nach Angiotensin II- und Urotensin- generierenden Enzymen ). Diese Fragestellung ist insofern für das Projekt als Modell für die Evaluierung des Systems interessant, als der Nachweis der Enzymaktivitäten über den massenspektrometrischen Nachweis der Reaktionsprodukte (Angio- tensin I bzw. Angiotensin II; Urotensin) nach Inkubation von Reninsubstrat bzw. Pro- Urotensin mit immobilisierten Proteinfraktionen geführt werden kann. Die Wahl der Niere als Quelle für die Proteine ist auch deshalb von Vorteil, weil dieses Gewebe bekanntermaßen Renin synthetisiert. Als Kontrolle für die Funktionsfähigkeit der Erfidung soll das Aufspüren und die Identifizierung von Renin dienen. Renin, eine in der Niere gebildete spezifische Protease, katalysiert die Hydrolyse von Reninsubstrat, bei der Angiotensin I als Reaktionsprodukt entsteht.
Ein effektives Chromatographiesystem, mit dem es gelingt, Proteinextrakte möglichst schnell und schonend in seine Einzelbestandteile aufzureinigen wird durch a) die systematische Suche (,,Scouting"-Experimente) nach geeigneten Parametern für die chromatographische Trennung des Proteinextraktes und b) durch die Kombination unterschiedlicher Chromatographiesäulen (Affinitäts-, lonenaustausch-, Größenausschluß-, Hydrophobe-lnteraktions-, Hydroxylapatit, Immobilisierte-Metallionen- Affinitäts- und Reversed-Phase-Chromatographie) erreicht, die auf orthogonalen Trennprinzipien basieren. Einzelne Fraktionen werden durch Techniken wie Säulenschalten direkt an die jeweils folgende Chromatographiesäule weitergegeben, ohne dass die Proteinfraktionen das System verlassen, sprich in Fraktionsgefäßen zwischengelagert werden müssen. Um Verdünnungen der Proteinfraktionen zu vermeiden, werden weitgehend Adsorptionschromatographie-Medien eingesetzt. Die An- Wendung der Displacement-Chromatographie-Technik gewährleistet ebenfalls konzentrierte Proteinfraktionen. Die Fraktionierungsstrategie beinhaltet folgende Schritte: Nach dem Anlegen eines Proteinextraktpools, der groß genug ist, um eine Vielzahl von Fraktionierungsexperimenten mit identischen Proben durchzuführen, wird dieser Pool bezüglich seiner Protein-Zusammensetzung und enzymatischen Aktivi- täten charakterisiert (,,Scouting"-Experimente). Durch SDS-PAGE-Elektrophoresen, isoelektrische Fokussierungen und 2D-Elektrophoresen wird als erstes ein detailliertes Bild über die im Extrakt vorhandenen Proteine gewonnen. Diese Daten dienen der weiteren Planung der Fraktionierung, wobei der Proteinextrakt nicht nur in seine Komponenten getrennt werden soll, sondern die gereinigten Proteine auch ihre en- zymatischen Aktivitäten nicht verlieren dürfen. Die Eluate der Chromatographiemedien werden zusätzlich mit Elektrophoresen untersucht, um die Effektivität und Selektivität der jeweiligen chromatographischen Parameter zu dokumentieren. Zur Ü- berprüfung des Einflusses der chromatographischen Schritte auf Enzymaktivitäten sollen gängige Substrate für verschiedene Enzyme eingesetzt werden. Die Enzym- kinetiken werden mit Methoden der UV-Spektroskopie und der Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Der Einsatz dieser Techniken ist notwendig, um die Aktivitäten nicht nur nach sondern auch vor der Immobilisierung messen zu können. Über den Vergleich der Enzymkinetiken vor und nach Immobilisierung sind Aussagen über den Einfluss der Immmobilisierung auf die Enzymaktivitäten möglich.
Die Problematik beim Erstellen / Aufbau der Proteinbibliothek ist, Proteinextrakte mit dem Ziel zu fraktionieren, eine möglichst effektive Trennung der Proteine mit hoher Auflösung zu erreichen - unter gleichzeitigem Erhalt möglichst vieler enzymatischer Aktivitäten. Aliquots der chromatographisch gewonnenen Fraktionen müssen nach erfolgreicher Trennung für die Proteinbibliothek immobilisiert werden.
Die massenspektrometrischen Untersuchungen der immobilisierten Protein- Substrat-Komplexe zum Nachweis der enzymatischen Aktivität der Proteine werden mit den Methoden der MALDI-Massenspektrometrie durchgeführt, insbesondere mit einem Reflektor-MALDI-Massenspektrometer. Sowohl die Arbeitsschritte zur Immo- bilisierung als auch der massenspektrometrische Nachweis enzymatischer Aktivitäten sollen möglichst weitgehend automatisiert werden, lassen sich gegebenenfalls aber natürlich auch „manuell" (ohne Automatismus) durchführen.
Ferner ist im Rahmen der Erfindung vorgesehen, dass die Proteinbibliotheken ohne Verlust der enzymatischen Aktivitäten langzeitgelagert werden können. Dabei ist es gleichgültig, auf welche Weise die Proteine immobilisiert sind, als beispielsweise aktivierte Affinitätschromatographie-Gele oder auf magnetischen Gelpartikel. Derartige magnetische Gelpartikel, sogenannte Magnetobeads werden beispielsweise von der Fa. chemagen angeboten (siehe www.chemagen.de). Die Kupplungschemie zwischen Magnetobeads und nicht-Magnetobeads ist im wesentlichen bekannt. Der Vorteil der Verwendung von Magnetobeads liegt in der leichter zu automatisierenden Handhabung der Partikel mithilfe von Elektromagneten.
Vorteile des erfindungsgemäßen automatisierten Massenspektrometrie- unterstützten System zum Screenen von Proteinbibliotheken auf enzymatische Aktivitäten (MESS) liegen in folgendem: • Die Erfindung erweist sich als vorteilhaft für die funktionelle Proteomforschung im Sinn eines Vergleichs zweier verschiedener Lebenszustände (Profiling von Enzymaktivitäten mit zu entwickelnden Substratbibliotheken multifunktioneller Sonden), sowie für die Suche nach neuen Enzymen für die Synthese von Biomolekülen (mit bekannten Biomolekülen als Substrate), für die Metabolisierung von Molekülen (Substrate: Biomoleküle, Wirkstoffe) und für die organische Synthese (Substrate: Synthesebausteine); Vorteile liegen sowohl in der Forschung als auch in der Industrie. Neben der Möglichkeit die Erfindung für die systematische funktionelle Proteomfor- schung zu nutzen, wird auch die Brücke zur Pharmaco-Genomics- und zur
Metabolomics-Forschung geschlagen, da neue Wirkstoff-relevante Enzyme erkannt und Stoffwechselwege mit der Erfindung untersucht werden können.
• Es erlaubt der Proteomforschung eine systematische Suche nach funktions- relevanten Proteinen.
• Es stellt eine Methode zum Aufspüren von Enzymen dar, deren biologisches Erkennungsprinzip durch ihre Substratspezifität gegeben ist. Als Beispiel für Anwendungen kann die Suche nach Enzymen genannt werden, mit denen die spezifische Detektion eines gegebenen Analyten durchgeführt werden soll. Ferner können mithilfe der Erfindung Synthesewege und Metaboliten in
Zellsystemen verfolgt werden.
• Das System lässt sich sowohl zur gezielten Suche nach Enzymen für die Umsetzung eines gegebenen Stoffes als auch zur Erkundung natürlicher Synthesewege nutzen.
• Die Erfindung dient als Werkzeug für die Suche nach neuen Enzymen für sämtliche biotechnologischen Bereiche, in denen Enzyme eingesetzt werden. Hierzu zählt die pharmazeutische Industrie (Suche nach neuen Targets (Enzymen) für die Wirkstoffentwicklung, Suche nach neuen Enzymen für die Synthese von Wirkstoffen, Entschlüsselung der Metabolisierung neuer Wirkstoffe, Entwicklung neuer Diagnostika), die Lebensmitteltechnologie
(Suche nach neuen Enzymen für die Aufbereitung und Herstellung von Nah- rungsmitteln und Nahrungsmittelbausteinen, Entwicklung Enzym-basierter Analytik) und die chemische Industrie (Suche nach Enzymen für die Synthese von Substanzen, Suche nach Enzymen für die Umsetzung von Abfallstoffen, Entwicklung Enzym-basierter Analytik).
Da an jeder Lebensäußerung einer Zelle Enzyme beteiligt sind, angefangen vom Stoffwechsel, über die Steuerung und Kommunikation bis zur Reproduktion, wird die systematische Erforschung von Enzymaktivitäten und der zugehörigen Enzyme zum besseren Verständnis von Lebensfunktionen beitragen. Als Werkzeug zur Suche nach Enzymaktivitäten unbekannter Enzyme dient die Erfindung zur funktioneilen Proteomforschung. Durch Multiplex-Screening mit multifunktionellen Substraten oder/und Substratgemischen / Substratbibliotheken ist es möglich, Profile von Enzymaktivitäten von zwei zu vergleichenden Systemen zu erstellen. Mit der Erfindung lassen sich Proteinbibliotheken von jeder prokaryoten oder eukaryoten Zelle (bzw. deren Zellkulturen), jeder Zellkultur menschlicher oder tiericher Zellen, jedem menschlichen oder tierischen Organ oder jeder erdenklichen Pflanze anlegen, die gegen Substratbibliotheken auf Enzymaktivitäten durchsucht werden können. Als Substrate können sowohl bekannte als auch unbekannte Substanzen oder Gemische dienen. Die Erfindung weist ein großes Anwendungspotential auf und erstreckt sich von der Biochemie der Mikroorganismen über die Biochemie der Pflanzen bis zur klinischen Grundlagenforschung. Eine weiteres für die Life-Science Forschung wichtiges Anwendungsgebiet ist durch die Möglichkeit gegeben, Stoffwechselwege verfolgen zu können, da nicht nur unbekannte Enzyme aufgespürt und identifiziert werden, sondern gleichzeitig auch neue unbekannte Metaboliten erkannt werden können.
Weitere vorteilhafte Maßnahmen sind in den übrigen Unteransprüchen beschrieben; die Erfindung wird nachfolgend auch anhand von Ausführungsbeispielen und Figuren näher beschrieben. Es zeigt:
Figur 1 Nachweis von Kallikrein-Aktivität mittels Massenspektrometrie: Massenspektrum der Reaktionslö- sung der Inkubation von Kallikrein (Fa. Sigma), gebunden an Partikel, mit Kallikrein-Substrat (10"5 mol/l), nach 30 min Inkubation. Die Signale entspre- - lo ¬
chen einfach geladenen protonierten Molekülionen ([M+H]+-lonen). Saralasin: Interner Standard (10"5 mol/l).
Figur 2 Abhängigkeit der relativen Signalintensität von Lys-Bradykinin (Signalintensität von Lys-Bradykinin :
Signalintensität)
Figur 3 Nachweis von Urotensin-generierender Aktivität aus einer Proteinfraktion: Massenspektrum eines Reaktionsgemisches einer Inkubation einer an Partikel gebundenen Proteinfraktion aus Nierengewebe mit einem Urotensin-Substrat nach 4 h Inkubationszeit. Externer Standard: Saralasin.
Ausführungsbeispiele:
Herstellung von Proteinextrakten:
Für die Herstellung von Proteinextrakten werden Nieren von Schweinen verwendet. Direkt nach ihrer Entnahme im Schlachthof werden diese in physiologischer Kochsalzlösung ( 0,9 % NaCI-Lösung) bis zur weiteren Verarbeitung gekühlt. Das Nierengewebe wird (bei Temperaturen von 4 bis 6°C) in ca. 1 cm3 große Stücke geschnitten, in vorgekühlte Lyophilisationsgefäße gefüllt, in Flüssigstickstoff eingefro- ren und über Nacht bei -80°C gelagert. In einer Lyophilisationsanlage werden die Gewebestücke ca. eine Woche 1 Woche vollständig getrocknet. Die wasserfreien Gewebestücke werden dann mit einer Getreidemühle auf feinster Stufe pulverisiert. 10 g des Pulvers werden in 200 ml Puffer (20 mM Hepes Puffer in 50 % destilliertes Wasser, 50 % Glycerol.10"4 M Dithiothreitol, pH-Wert 7,4) gelöst. Hierfür wird ein Homogenisator verwendet.
Fraktionierung von Proteinextrakten:
Um geeignete Schritte für die Fraktionierung des Proteinextrakts zu finden, werden a) Fällungsversuche und b) Batch-Versuche (Scouting-Versuche) mit verschiedenen für die Chromatographie von Proteinen anwendbare Gelmaterialien (z.B. Ionenaustauscher-Gele, Gele für die hydrophobe Interaktionschromatographie, etc.) durchgeführt. Aliquots der resultierenden Fraktionen werden auf ihre Proteinkonzentration mit einem Bradford-Assay und auf ihre Zusammensetzung mit der SDS-PAGE- Elektrophorese analysiert. Zum Nachweis enzymatischer Aktivitäten werden nach jedem Schritt bzw. von jeder Fraktion Proben genommen. Aus den gewonnen Daten werden dann Kombinationen von Reinigungsschritten gebildet, um Fraktionen zu erhalten, die individuelle Proteine möglichst hoher Reinheit enthalten. Die Kombination der Schritte ist abhängig von den Zielen, die mit der Reinigung verfolgt werden. Grundsätzlich können zwei unterschiedliche Ziele verfolgt werden, nämlich 1.) die gezielte Reinigung eines einzigen Enzyms oder 2.) eine hochauflösende Fraktionierung unter Erhalt einer Vielzahl von Aktivitäten. Die chromatographischen Reinigungsschritte werden so kombiniert, das Proteinfraktionen erst nach dem letzten Reinigungsschritt das Chromatographie-System verlassen und in Sammelgefäßen (Deep-Well-Platten) gesammelt werden. Aliquots der Fraktionen werden für die Rücklage-Systeme aliquotiert.
Bindung der Proteine an Partikel:
Die Kupplung der Proteinen an Partikel erfolgt beispielsweise entsprechend Her- manson et al. (Academic Press, 1992), 53-56). In dieser Vorschrift werden zur Bin- düng von Proteinen an Partikel Bromcyan-aktivierte Partikel (Fa. Amersham) eingesetzt. Die Partikel werden in der vierfachen ihrer eigenen Menge 1 mM HCI (pH 2-3) gelöst. Das gequollene Gel wird mehrmals mit dem 100-fachen des eigenen Volumens mit HCI gespült. Dann wird es mit dem 5-10-fachen des eigenen Volumens mit Wasser gewaschen. Anschließend wird mit 5 ml Kopplungspuffer A (0,1 M NaHCO3-Puffer in 0,5 M NaCI, pH 8,3) pro Gramm trockenem Gel gewaschen und anschließend sofort das zu koppelnde Protein, gelöst im Kopplungspuffer A (5-10 mg Protein pro ml Gel), zum Gel zugegeben und unter ständigem Umschwenken über Nacht bei 4°C oder 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht gebundenes Protein wird durch Spülen mit Kopplungspuffer A entfernt. Dann werden nicht gebundene aktive Gruppen des Gels mit Glycin blockiert. Dazu wird das Gel mit dem 2 bis 3-fachem des Gelvolumens an Kopplungspuffer B (0,2 M Glycin-Puffer in Kopplungspuffer A) bei Raumtemperatur zwei Stunden oder bei 4°C über Nacht unter ständigem Umschwenken inkubiert. Es wird 3 mal abwechselnd mit Tris-HCI Puffer, pH 8,0 und Na-Acetat-Puffer, pH 4 gespült. Die Lagerung des fertigen Gels erfolgt bei 2-8°C in 0,02%iger Natriumazidlösung.
Messung der enzymatischen Aktivität mittels Massenspektrometrie:
Um Aussagen über die enzymatischen Aktivitäten individueller Fraktionen treffen zu können, muss die individuelle Fraktion mit einem Substrat inkubiert werden, das durch die nachzuweisende Aktivität chemisch verändert wird. (Im Beispiel der Fig. 1a: Proteolytische Spaltung von Kallikrein-Substrat durch Kallikrein zum Reaktionsprodukt Lys-Bradykinin). Der Nachweis der Aktivität gelingt über den mas- senspektrometrischen Nachweis des resultierenden Reaktionsprodukts. Um die Reaktionsprodukte einer enzymatischen Aktivität einer massenspektrometrischen Messung mit der Elektrospray- (ESI-) oder der MALDI-MS zugänglich zu machen, muss die zu analysierende Probe weitgehend von Salzen und anderen niedermolekularen Substanzen befreit sein. Diese Bedingung kann erfüllt werden, wenn a) die Komponenten der Fraktionen zuvor an Partikel gebunden werden und von Salzen befreit werden und b) die Substrate in hochreinem Wasser gelöst werden und in dieser Lösung die Inkubation stattfindet. Die Reaktionsprodukte können dann direkt ohne weitere Probenvorbereitung massenspektrometrisch analysiert werden.
Im hier angegebenen Beispiel der Fig. 1 wurde eine Kallikrein-Präparation an Partikel gebunden und mit Kallikrein-Substrat inkubiert. Nach einem definierten Zeitinter- vall (30 min) wird ein Aliquot der Reaktionslösung (1 ,5 μl) abgenommen und auf die Oberfläche eines metallenen Ankertellers (Fa. Bruker) pipettiert. Anschließend werden 1 ,5 μl der UV-absorbierenden Desorptionsmatrix Hydroxy-α-cyano-Zimtsäure (gesättigt in ACN/H2O (50/50) mit 0,1% Trifluoressigsäure ) hinzugegeben. Nach Kristallisation der Probe auf dem Probenteller wird dieser über eine Vakuumschleu- se in das Massenspektrometer (Reflex III, Fa. Bruker) gebracht. Durch den Impuls eines Stickstoff-Laserstrahl (VSL-337 ND, Laser Science, Wellenlänge 337 nm, Impulsdauer 4 ns, Energie 106-107 W/cm2, Durchmesser des Bestrahlungsfeldes 50 - 100 μm) erfolgt die Desorption der Probenionen. Die Beschleunigungsspannung Uacc im elektrostatischen Feld betrug 10 kV, der im System vorliegende Druck 6-8 x 10"7 mbar. Die Aufzeichnung der Massenspektren wird mit einem LeCroy 9400 Transientenrecorder durchgeführt. Bei der Detektion werden 200 Spektren summiert. Als weiteres Beispiel wird der massenspektrometrische Nachweis einer Urotensin- generierenden Aktivität dargestellt. Als Substrat wird ein Peptid (Urotensin- generierendes-Enzym-Substrat) mit der Sequenz RIKKPYKKRGPPSECFWKY (2430,3 Da) in einer Konzentration von 10"5 mol/l in HPLC-reinem Wasser gelöst. Im Fall der Anwesenheit einer Urotensin-generierenden Aktivität entsteht GPPSECFWKY (hier "Urotensin" genannt). Im Massenspektrum ist dann ein Signal der Masse 1214,33 Da zu erkennen (siehe Fig. 3). Dieses Signal entspricht dem einfach protonierten Ion eines Urotensin-ähnlichen Peptids. Aus dem Rücklagesystem 1 wird ein Aliquot der an Partikel gebundenen Proteine entnommen und mit der Urotensin-generierendes-Enzym-Substrat-Lösung inkubiert. Nach einem definierten Zeitintervall wird ein Aliquot der Reaktionslösung (1 ,5 μl) abgenommen und auf die Oberfläche eines metallenen Ankertellers (Fa. Bruker) pipettiert. Anschließend werden 1 ,5 μl der UV-absorbierenden Desorptionsmatrix Hydroxy-α-cyano-Zimtsäure (gesättigt in ACN/H2O (50/50) mit 0,1% Trifluoressigsäure ) hinzugegeben. Nach Kristallisation der Probe auf dem Probenteller wird dieser über eine Vakuumschleuse in das Massenspektrometer verbracht und die Probe analysiert, wie oben angegeben.
Berechnung der relativen Enzymaktivität:
Die relative Enzym-Aktivität wird hier definiert als Menge des Reaktionsprodukts, die pro Zeiteinheit entsteht:
. .. ._ . .. ..... rel.Int - rel.IntΛ relative Enzymaktivitat = - -
rel.lntfi: relative Intensität des Analyten, bezogen auf den internen Standard, bezogen auf den Inkubationszeitraum t^
Bei der Quantifizierung von Analyten (Reaktionsprodukten) mit dem MALDI- Massenspektrometer tritt das folgende Problem auf: Das Signal der MALDI-MS ist abhängig vom Ort, den der Laser auf der kristallisierten Probe trifft. Bedingt durch die nicht gleichmäßige Ausrichtung der Kristalle zum Laser, variiert die Strahlungsenergie, die der vom Laser getroffene Bereich absorbiert. Als Folge werden bei der wiederholten Messung einer einzigen Probe unterschiedliche Intensitäten der Signa- le aufgrund der unterschiedlichen Intensität der absorbierten Strahlungsenergie de- tektiert. Infolge dessen ist häufig bei Einzelspektren kein direkter Zusammenhang zwischen Signal-Intensität und Analyt-Konzentration zu erkennen.
Das Problem wird durch folgende Maßnahmen umgangen: Die Probe wird durch ein automatisiertes Verfahren gemessen, bei dem der Laser der MALDI-MS nach vorgeschriebenen Bahnen die Probe beschießt, um Bereiche zu finden die eine optimale Ausbeute an Signalintensität gewährleisten. Sobald ein Signal detektiert ist, wird automatisch die Laserintensität optimiert. Pro Bereich wurden in diesem Beispiel maximal 60 Impulse des Lasers auf die Probe gegeben. Wurde vor Erreichen der 60 Impulse kein Signal mehr detektiert, wird automatisch ein neuer Bereich auf der Probe gesucht. Für ein Gesamtspektrum wurden 200 Spektren summiert und gemit- telt. Als weitere Maßnahme zur Gewährleistung, dass Signalintensität und Analyt- Konzentration sich proportional zueinander verhalten, wird ein externer Standard der Matrix Saralasin (10"5 M bis 10"10 M ) zugegeben. 1 ,5 μl Lösung der Standard- Matrix-Mischung werden dann anschließend mit 1 ,5 μl Löung des Analyten (hier Lys-Bradykinin) vermischt wird. Nach der MS-Analyse wird der Quotient der relativen Intensität der Saralasinkonzentration und der relativen Intensität der Reaktionsprodukt-Konzentration bestimmt. Fig. 2 gibt das Verhältnis der relativen, d.h. auf den internen Standard bezogenen Signalintensität von Lys-Bradykinin zur Konzentration des Analyten wieder.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Erkennen von Enzymaktivitäten von beliebigen Proteinextrakten, bestehend aus folgenden Verfahrensschritten:
a) Gewinnung eines Proteinextrakts, b) Fraktionierung des Proteinextrakts, c) Teilen der Fraktionen des Proteinextrakts zur Erstellung einer Prote- inbibliothek, wobei ein Teil jeder Fraktion distinkt immobilisiert wird
(immobilisierte Proteinbibliothek) und der korrespondierende, nicht immobilisierte Teil der Proteinfraktion zur späteren Identifizierung eingefroren wird (gelöste Proteinbibliothek), d) Immobilisierte Proteinfraktionen der immobilisierten Proteinbibliothek werden mit einem Substrat inkubiert, e) Massenspektrometrische Messung der Proben nach d), f) Vergleich der Proben, die Enzymaktivitäten aufweisen mit den Fraktionen nach b), g) Identifizierung der Proben, die Enzymaktivitäten aufweisen mit den Fraktionen der gelösten Proteinbibliothek nach c).
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Verfahrensschritte b) bis e) zykli- siert wiederholt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Proteinextrakt über ein multidimensionales Chromatographie-System gereinigt und fraktioniert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei die Fraktionen in Fraktionssammelgefäßen oder Multi-Deep-Well Platten (mit n Kavitäten, n > 1) gesammelt werden.
5.- Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Partikel der einzelnen Fraktionen durch kovalente Bindung an geeignete Immobilisierungssubstanzen immobilisiert werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Immobilisierung an magnetische Beads oder Affinitätschromatographie-Gele erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Immobilisierung in Reaktionsgefäßen oder auf Multi-Well-Platten (mit n Kavitäten, n > 1) erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei als Substrate natürliche Biomoleküle jeglicher Art, aber auch synthetische organische Moleküle bzw. Hybride von in der Natur vorkommenden Biomolekülen verwendet werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei als Substrate auch Substratbibliotheken, bestehend aus einem Gemisch von mehreren Substraten verwendet werden.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, wobei die Verfahrensschritte b) bis g) automatisiert werden.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, wobei die massenspektrometrische Messung der Proben nach Verfahrensschritt e) in definierten Zeitintervallen erfolgt.
12. Verfahren nach den Anspruch 1 oder 8, wobei Verfahrensschritt e) ein- oder mehrfach wiederholt wird
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102006049822A1 (de) * 2006-10-19 2008-04-24 Charité-Universitätsmedizin Berlin Verfahren zur Identifikation von Urotensin-2Konvertase-Inhibitoren
US8142996B2 (en) 2006-02-28 2012-03-27 Bruker Daltonik Gmbh Mass spectrometric determination of blood enzyme activity

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10027794A1 (de) * 2000-06-07 2001-12-13 Basf Ag Verfahren zur Analyse Enzym-katalysierter Umsetzungen mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8142996B2 (en) 2006-02-28 2012-03-27 Bruker Daltonik Gmbh Mass spectrometric determination of blood enzyme activity
DE102006009083B4 (de) * 2006-02-28 2018-05-30 Bruker Daltonik Gmbh Massenspektrometrische Bestimmung der Aktivität von Blutenzymen
DE102006049822A1 (de) * 2006-10-19 2008-04-24 Charité-Universitätsmedizin Berlin Verfahren zur Identifikation von Urotensin-2Konvertase-Inhibitoren
DE102006049822B4 (de) * 2006-10-19 2009-01-02 Charité-Universitätsmedizin Berlin Verfahren zur Identifikation von Urotensin-2-Konvertase-Inhibitoren

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