WO2004022732A1

WO2004022732A1 - タンパク質およびグルコース脱水素酵素の精製方法

Info

Publication number: WO2004022732A1
Application number: PCT/JP2003/010540
Authority: WO
Inventors: Hideaki Yamaoka; Keisuke Kurosaka; Shido Kawase
Original assignee: Arkray Inc; Unitika Ltd
Current assignee: Arkray Inc; Unitika Ltd
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2003-08-20
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2005-02-28
Also published as: CN1751119A; JP4537850B2; US20120309072A1; ATE528393T1; CN100587066C; JPWO2004022732A1; EP1535997B1; EP1535997A4; EP1535997A1; AU2003262258A1; AU2003262258A8; US20060094098A1; US9206398B2

Abstract

　本発明は、電子伝達タンパク質を含む目的タンパク質が溶解したタンパク質溶液から、液体クロマトグラフィーを利用して前記目的タンパク質を精製する方法に関する。液体クロマトグラフィーは、充填剤が充填された充填槽に前記タンパク質溶液を導入して前記充填剤と前記目的タンパク質とを結合させた後に不純物を除去し、ヒドロキシコラン酸塩を含む溶離液を用いて、前記充填剤から前記目的タンパク質を溶離することにより行う。目的タンパク質は、たとえばグルコース脱水素活性を有するタンパク質を含むグルコース脱水素酵素である。液体クロマトグラフィーは、疎水クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーとを組み合わせて行う。

Description

質およびグルコース素酵素の精製方法技術分野

本発明は、液体クロマトグラフィーを利用して、タンパク質を精製する方法に関する。この精製方法は、たとえば電子伝達タンパク質が結合したグルコース脱水素酵素を精製する際に利用されるものである。

明

背景技術

特定の基質に対して特異的に反応する酵田素を用いたバイオセンサの開発は、産業の分野を問わず盛んに行われている。バイオセンサの代表的なものとしては、主に医療分野で使用されるグルコースセンサが挙げられる。

グルコースセンサは、酵素と電子伝達物質を含む反応系を構築するためのものであり、このグノレコースセンサを利用する場合には、たとえばアンべロメトリツクな手法を用いてグルコースが定量される。酵素としては、グルコースォキシダーゼ (GOD)ゃグノレコースデヒドロゲ^ "一ゼ (GDH) が使用されている。

GODは、グルコースに対する基質特異性が高くて熱安定性に優れており、酵素の量産化が可能であるために生産コストが他の酵素と比べて安価であるといった利点がある。その反面、 GODを使用した系は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすレ、ため、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすと、つた問題がある。

—方、 GDHを使用した系は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けにくレ、。このため、 GDHを使用した系は、酸素分圧が低い環境下で測定を行ったり、酸素量が多く要求される高濃度サンプルを測定するであっても、精度よくグルコース濃度を測定することができる。その反面、 GDHは、熱安定性が悪く、基質特異性が GODよりも劣るといった問題点がある。

このような事情力ら、 G0Dと GDHの双方の欠点を補う酵素力 S模索されていた。早出は、国際公開 W002/36779号公報に開示されているように、 ^^付近の土壌から新規菌株 (ブルクホルデリァ ·セパシァ KS1株)を分離し、この菌株から新しレヽ GDH を取得した。この GDHは、ひ， j3 , γサブュニットからなるものであり（以下「CyGDH」という）、電子伝達物質との反応速度が高く、耐熱 I"生の面でも問題がなレ、ものであり、グルコースセンサ用としては好適なものであった。

CyGDHをグルコースセンサに応用する^^には、 CyGDHを含む酵素溶液から、 CyGDHを精製する必要がある。酵素の精製には、通常、液体クロマトグラフィ一が利用されている。そのため、本発明者らは、常法にしたがって、疎水クロマトグラフィ一および陰ィオン交換ク口マトグラフィ一を併用して酵素溶液の精製を試みた。ところが、精製酵素液を SDS-PAGEで藤したところ、ひ， , γサブュニット以外に多くのタンパク質力 S含まれており、 CyGDHを良く精製することができなかった。発明の開示

本発明は、タンパク質の新規な精製方法を共することを目的としている。本発明の第 1の側面により樹共されるタンパク質の精製方法は、目的タンパク質が溶解したタンパク質溶液から、液体クロマトグラフィーを利用して前記目的タンパク質を精製する方法であって、前記液体クロマトグラフィーは、充填剤が充填された充填槽に前記タンパク質溶液を導入し、廳已充填剤に対して前記目的タンパク質をィ; ^させる第 1ステップと、ヒドロキシコラン酸塩を含む溶离街夜を用いて、前記充填剤から編己目的タンパク質を溶離させる第 2ステップと、を含んでいる。

なお、本明細書にぉレ、ては、「液体ク口マトグラフィー」という ¾ ^には、特段の限定がない限りは、カラムを用いてフロー (連続^)で精製する場合の他、バッチ式でタンパク質を精製する:^も含まれる。バッチ式の精製方法としては、たとえば容器内に充填剤とタンパク容液とを共存させて充填剤に目的タンパク質を結合させた後に充填剤を分離し、この充填剤を溶離夜に撫虫させて充填剤から目的タンパク質を分離して回収する方法が挙げられる。

精製文豫となる目的タンパク質としては、たとえば電子伝達タンパク質を含むものが挙げられる。典型的には、目的タンパク質としては、電子伝達タンパク質とグルコース^ κ素活性を有するタンパク質とを含んだグルコース素酵素を例示することができる。

充填剤としては、たとえばィオン交換樹脂が使用され、ィオン交換クロマトグラフィ一によつてタンパク質が精製される。この:^、イオン交漏脂としては、たとえば 4級アンモニゥム基をイオン交換基として有しているものが使用される。ここで、「ヒドロキシコラン酸」とは、コラン酸の 3τΚ和物であるコール酸および広義での誘導体をさすものとし、ヒドロキシコラン酸塩としては、コール酸塩、グリコウルソデォキシコール酸塩、タウログリコウルソデォキシコール^、タゥロウルソデォキシコール^^、ウルソデォキシコール酸塩、グリココール^^、タウロコール酸塩、グリコケノデォキシコール酸塩、タウロケノデォキシコール酸塩、グリコデォキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、ケノデォキシコール酸塩、デォキシコール酸塩、グリコリトコール酸塩、タウロリトコール酸塩、リトコール酸塩などが挙げられる。その中でも、コール^ ¾、たとえばコール酸ナトリゥムを使用するのが好ましい。

充填剤からの目的タンパク質の溶離は、溶離夜におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を一定にして行うのが好ましレ、。この^、溶离街夜におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度は、 0. 5-2. 5重量％の範囲、さらに好ましくは 0. 8〜1. 2重量⁰ /₀の範囲から選択するのが好ましい。このような手法は、バッチ式で目的タンパク質の溶離を行うに限らず、連続式で目的タンパク質の溶離を行うにも適用される。また、溶离街夜におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を時間とともに変化させて目的タンパク質の溶離を行うこともできる。この、溶离街夜の濃度の上限は、たとえば 3重量％以下、さらに好ましくは 1. 5重量％、最も好ましくは 1重量％とされる。すなわち、溶离街夜の濃度変化は、たとえば 0〜3重量％の範囲、さらに好ましくは 0〜1. 5重量％の範囲、最も好ましくは 0〜1. 0重量％の範囲で行われる。電子伝達タンパク質は、たとえば還元条件下での SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約 43kDaである。一方、グルコース脱水素活性を有するタンパク質は、還元条件下での SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約 60kDaである。このような電子伝達タンパク質おょぴサブュニットを含むグルコース素酵素は、たとえばグルコース Ifck素酵素を産生する能力を有するブルクホルデリァ属に属する微生物から、あるいは形質転換体から取得することができる。

本発明で採用されるブルクホルデリァ属に属する微生物は、本酵素の生産能を有するブルクホルデリァ属に属する微生物であれば特に制限されなレヽが、ブルクホルデリア'セパシァ、特にブノレクホルデリア'セパシァ KS1株 (以下、単に「KS1株」という）が好ましい。この KS1株は、平成 12年 9月 25日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305- 8566 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に微生物受託番号第 FERM BP- 7306として寄託されている。

形質転換体は、たとえばブルクホルデリァ属に属する微生物から取得した電子伝達タンパク質およびグルコース ?素活性を有するタンパク質をコードする配列を含む DNAを、宿主微生物に導入することにより形成することができる。宿主微生物としては、シユードモナス属に属する微生物（とくにシユードモナス'プチダ）または大腸菌を使用するのが好ましい。

国際公開 W002/36779号公報などに開示されているように、 KS1株由来のダルコ一ス素酵素は、サブュニット（ひサブュニット）および電子伝達タンパク質（ βサブュニット）にカ卩えて、還元条件下での SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約 14kDaである τ /サブュニットを有するものとして産生される。

Ύサブュニットを αサブユニットとともに発現させると、ひサブュニットのみを発現させた^に比べて高レヽ酵素活性が得られることが早出によつて、されている。したがって、酵素活性の観点からは、 γサブユニットを発現させるのが好ましく、前記 DNAにおレヽては、 γサブュニットの構伝子は、 aサブュニットの上流域に含ませておくのが好ましい。そうすれば、形質転換体においては、 α サブュニットを産生する際に、先ず γサブュニットが発現されてタンパク質としてすることにより微生物体内で効率良く Lサブュニットを産生することができるものと考えられる。

本発明の第 2の側面にぉレヽては、疎水クロマトグラフィーと陰ィオン交換ク口マトグラフィ一とを組み合わせてグルコース脱水素酵素を精製する方法であって、嫌己疎水クロマトグラフィーは、固定相に前記グルコース素酵素を保持させるステップと、不要なタンパク質を溶出させるステップと、ヒドロキシコラン酸塩を含む溶离街夜を用レヽて ΙίίΙ己グルコース素酵素を溶出させるステップと、を含み、編己陰ィオン交換ク口マトグラフィ一は、固斜目に觸己グルコース ΕτΚ素酵素を保持させるステップと、ヒドロキシコラン酸塩を含む溶离纖を用レ、て tilt己グルコース！ ^素酵素を溶出させるステップと、を含むことを糊敫とする、ダルコース IfeK素酵素の精製方法がされる。

疎水ク口マトグラフィ一におレ、ては、たとえばグルコース fcK素酵素の溶出は、溶离難におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を時間とともに変ィ匕させて行われる。一方、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいては、たとえばグルコース素酵素の溶出は、溶离街夜におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を一定にして行われる。また、溶离 if夜におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を時間とともに変ィ匕させて目的タンパク質の溶離を行うこともできる。この:^、溶离街夜の濃度の上限は、たとえば 3重量％以下、さらに好ましくは 1. 5重量％、最も好ましくは 1重量％とされる。すなわち、溶离哲夜の濃度変化は、たとえば 0〜3重量％の範囲、さらに好ましくは 0〜1. 5重量％の範囲、最も好ましくは 0〜1. 0重量％の範囲で行われる。本発明のグルコース Ifck素酵素の精製方法では、疎水クロマトグラフィーを行つた後に、前記陰ィオン交換ク口マトグラフィーを行うのが好ましレヽ。

グルコース素酵素は、たとえばグルコース素酵素を産生する能力を有するブルクホルデリァ属に属する微生物が産生したものである。ブルクホルデリァ属に属する微生物は、たとえば ¾S1株である。

グルコース IfeK素酵素は、形質転換体が産生したものであってもよレヽ。形質転換体は、グルコース ΕτΚ素酵素を産生する能力を有するブルクホルデリァ属に属する微生物から取得した前記グルコース foK素酵素をコードする DNAを、宿主微生物に導入することにより形成することができる。宿主微生物としては、たとえばシユードモナス ·プチダまたは大腸菌が用いることができる。

本発明のグルコース »素酵素の精製方法では、陰イオン交換クロマトグラフィーを、 4級アンモニゥム基をイオン交換基として有するイオン交漏脂を用いて行い、ヒドロキシコラン酸塩としてコ一ル酸塩を用いるのが好ましレ、。図面の簡単な説明

図 1は、シユードモナス.プチダの形質転換体から得た »素溶液を、溶離剤としてコール酸 Naを用レ、て精製した酵素の SDS- PAGEの結果を示したものである。図 2は、シユードモナス'プチダの形質転換体から得た粗酵素溶液を、溶離剤として NaClまたは KC1を用レ、て精製した酵素の SDS- PAGEの結果を示したものである。図 3は、大腸菌の形質皐云換体から得た粗酵素溶液を溶離剤としてコール翻 aを用いて精製した酵素の SDS-PAGEの結果について、シユードモナス'プチダの形質転換体およひ S1株から得た素溶液を精製した酵素とともに示したものである _p 発明を実施するための最良の形態

以下、本発明に係るタンパク質の精製方法について、グルコース ΕτΚ素酵素 (以下、「GDH」という）を精製するを例にとつて具体的に説明する。

グルコース脉素酵素の精製にあたっては、まず、酵素溶液を職する。酵素

？鎌は、グルコース脱水素酵素を産生する微生物やその培養液から採取してもよいし、この微生物から取得した DNAを導入した形質転換体やその培養液から採取してもよい。

酵素溶液は、 GDHが菌体内に存在する場合には、ろ過または遠心分離などの手段により培養液から菌体を採取した後、この菌体を的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壌し、必要に応じて EDTAなどのキレート剤および界面活性剤を添加して GDHを可溶化することにより得ることができる。一方、 GDHが菌体外 (培養液中）にする ¾ ^には、酵素溶液は、ろ過または遠心分離などの手段により培養液から菌体を分離することにより得ることができる。

グルコース feK素酵素を産生する微生物としては、たとえばプルクホルデリァ属に属する微生物、とくにブルクホルデリァ ·セパシァが好ましく使用される。このブルクホルデリァ ·セパシァからは、たとえば可溶化膜画分として酵素溶液を採取することができる。可溶化 si®分は、たとえば培養液を遠心分離して得られる菌体を破碎して細胞抽出液を採取し、この細胞抽出液を遠心分離して得られる上清を超遠心することにより沈殿物として得ることができる。菌体の破碎は、常法に従い、ネ嫌的方法または酵素的方法により行うことができる。形質転換体は、たとえば αサブュニット（グルコース ΕζΚ素活性を有するタンパク質)および ;3サブュニット（電子伝達タンパク質)の発現をコードする配列を含む DNAを取得した後、この DNAを含む組み換えべクターを、宿主微生物に導入することにより形成される。

DNAの取得にあたっては、まず組み換えベクターが構築される。この組み換えべクタ一は、グルコース feK素活性を有する酵素を産生する微生物から染色体 DNA を分離 ·精製した後、この染色体 DNAを切断した染色体 DNA断片または PCRなどにより増幅させた DNA断片と、リニァ一な発現べクターとを結合閉鎖させることにより構築することができる。

宿主微生物としては、大腸菌をはじめとする腸内細菌群、シユードモナス属ゃダルコノバクター属などのグラム陰 [■生菌、バチルス 'サブチリスなどのバチルス属細菌をはじめとするグラム陽 I·生菌、サッカロマイセス 'セビシェなどの酵母、ァスペルギルス ·二ガーなどの糸状菌が挙げられる。その中でもとくに、大腸菌およびシユードモナス属に属する微生物 (たとえばシユードモナス ·プチダ)が好ましく使用される。微生物の形質転換は、例えばェシエリヒア属細菌ではカルシウム処理によるコンビテントセル法、バチルス属細菌ではプロトプラスト法、酵母では KU法や KUR法、糸状菌ではマイクロマニュピレーション法等の方法によって行うことができる。形質転換する方法としては、エレクト口ポーレーシヨン法を用いることもできる。

酵素溶液の精製は、液体クロマトグラフィーを利用して行われる。液体クロマトグラフィ一による精製にぉレ、ては、目的とする精製の asが得られるように、液体クロマトグラフィーの種類、回数、組み合わせが選択される。液体クロマトグラフィ一としては、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およぴァフィニテイクロマトグラフィ一を挙げることができる。液体クロマトグラフィーは、カラム内に形成した固定相に目的タンパク質を保持させた後に、連続的に溶離夜を供給して目的タンパク質を溶離させて回収してもよいし、バッチ式で行ってもよい。バッチ式では、たとえば容器内に充填剤と目的タンパク質を含んだ料とを供給して充填剤に目的タンパク質をィ* させた後に不純物を除去し、溶離夜を供給して充填剤から目的タンパク質を溶離させ、目的タンパク質が回収される。

溶离街夜としては、溶離剤としてのヒドロキシコラン酸塩を含む溶液力 s使用される。複数回の液体ク口マトグラフィ一により目的タンパク質を精製する齢には、少なくとも一回の液体ク口マトグラフィ一におレ、て、溶离街夜としてヒドロキシコラン酸塩が使用される。この、最後に行う液体ク口マトグラフィ一におレ、て、溶离傲夜としてヒドロキシコラン酸塩を使用するのが好ましい。

ヒドロキシコラン酸塩としては、コール酸塩、グリコウノレソデォキシコール酸塩、タウログリコウルソデォキシコール酸塩、タウロウルソデォキシコール,、ウルソデォキシコール酸塩、グリココール酸塩、タウロコール酸塩、グリコケノデォキシコール酸塩、タウロケノデォキシコール酸塩、グリコデォキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、ケノデォキシコール酸塩、デォキシコール酸塩、グリコリトコール酸塩、タウロリトコール酸塩、リトコール酸塩などが挙げられる。その中でも、コール酸塩、たとえばコール酸ナトリウムを使用するのが好ましい。

溶离街夜は、この液中のヒドロキシコラン酸塩の濃度を一定にして充填剤と翻虫させてもよいし、ヒドロキシコラン酸塩の濃度を時間とともに戲泉的に変ィ匕させて供給してもよい。

液体クロマトグラフィーは、酵素?薪夜から直接行ってもよいが、酵素溶液中の目的タンパク質を濃縮した後に行ってもよい。濃縮は、たとえば濃縮、 m 縮、塩析処理、あるいは親水性有機溶媒 (たとえばメタノール、エタノール、ァセトン)による分別沈殿法、カロ熱処理、等電点処理により行うことができる。

このようにして得られた精製酵素は、たとえば凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライにより粉末化して市場に流通させることができる。実施例

以下にぉレヽては、上述した製造方法の具体的な例にっレヽて説明するとともに、溶離剤としてコール翻 aを用いたには、溶離剤として NaClや KC1を用いるに比べて、効率よく GDHを精製できることを実証する。

<酵素溶液の取得方法 > ( 1 ) ブルクホルデリァ ·セパシァ KS1株からの酵素溶液の取得ブルクホルデリァ ·セパシァ KS1株の培養は、好気的培養条件で行つた。より具体的には、 KS1株の培養は、培養液 1L当たりの組成が表 1となるように調整された培地 20Lを用いて、 34°Cで 8時間行つた。

表 1 ：培地組成

次レ、で、本 i咅養液 20Lを 4°C、 10分間、 9000 X gで遠心分离ることにより約 250g の菌体を得た。回収菌体は、凍結させた後に ΙΟιΛリン爰衝液 (pH6)に懸濁させ、高圧ホモジナイザー (Rannie社デンマーク）を用いて 500barの圧力で数回通液して菌体膜を破砕した。菌体膜を破枠することにより得られた細胞抽出液は、 GDH 活性力 ¾0kUであった。この細胞抽出液を 8000 X gで 60分間、遠心分離して細胞固形物を除去した。さらに、その上清を 10°Cで 17万 X g、 1時間の超遠心分離を行い、沈澱物としての膜画分を回収した。

月麵分は、最終濃度でコール^ aが 1. 5%、 KC1が 0. 1Mとなるように、 10mMリン廳爱衝液 (pH6)で再分散させ、 4°Cで一夜撹拌した。その結果、 30kUの GDHを含む分懸濁液が得られた。この^ ®分懸濁液を 10°Cで 17万 X g、 90分間、超遠心分離することにより沈殿を除去し、 GDHを含有する可溶化月麵分 (GDH活性力 ¾6kU) を得た。この可溶化膜画分を lOmMリン薩衝液 (pH6)で 3夜透析し、生成した不溶物を 10°Cで 17万 X g、 90分間の超遠心分離により沈殿として除去した。得られた上清 (可溶化 GDH画分）中の GDHは、活性が 28kU、比活性が 6. 8U/mgであった。

( 2 ) 形質転換体からの粗酵素激夜の取得

以下の実施例および比較例における精製を行うに当たって、宿主の異なる 2種類の形質転換体のそれぞれから素溶液を取得した。形質転換体の形成に当たっては、まず、 α , β , γサブュニットをコードする配列を含む DNAを、常法にしたがって KS1株から取得した。

次いで、得られた DNAをベクタープラスミドに揷入して GDH発現用プラスミドを形成し、これを宿主微生物に導入して形云換した。

宿主としては、シユードモナス ·プチダ ΚΤ2440株 (ATCC 47054)および大腸菌 BL21 株を使用した。

宿主としてシユードモナス.プチタ、 Τ2440株を用いる^^には、 GDH遺伝子を挿入するベクタープラスミドとして RSF1010を用い、大腸菌 BL21株を用いる場合には、ベクタープラスミドとして pTrc99Aを用いた。また、宿主として大月昜菌を用いる場合には、チトクロム C成熟化 (Cytochrome C maturation： com)遺伝子群を常日現させた。まず、大腸菌 ccmit伝子群をコードする配列を含む DNAを、常法にしたがつて JM109株から取得し、これをベクタープラスミドに揷入して ccm発現用プラスミドを形成した。このときにベクタープラスミドとして pBBR122を用いた。次に、 GDH発現用プラスミドを導入済みの宿主大腸菌に ccm発現用プラスミドを導入して形質転換した。

それぞれの形質転換体につ！/、ては、另 M固に培養した。

シユードモナス .プチダの形質転換体の場合は、通常通りの好気的条件で 20L の培養液中において行った。培養液の組成は、 3. 2%ポリペプトン、 2%酵母ェキス、 0. 5%NaCl、 2%グリセ口ール、 0. 05mL/Lアデ力ノール LG - 126 (旭電化東京）、 50 μ g/mLストレプトマイシン (pH7. 0)とした。培養液に対しては、 200mLの前培養液を植菌し、 34°Cで培養開始した。培養開始から 4時間後には、 0. 2mMとなるように IPTG Clsopropyl- β - D- thiogalactopyranoside)を添加して更に 20時間培養を行つて本培養液を得た。本培養液をシャープレス型遠心分離器で遠心分離し、シュ一ドモナスプチダの形質転換体については約 800 gの菌体を得た。

大腸菌の形質転換体の:^も、培養は通常通りの好気的条件で 2 Lの培養液中にて行った。培養液の組成は、 3. 2%ポリペプトン、 2%酵母エキス、 0. 5%NaCl、 2% グリセロール、 0. 05mL/Lアデ力ノール LG- 126 (旭電化東京）、 50 μ g/mLアンピシリン、 50 g/mLカナマイシン (pH7. 0)とした。培養液に対しては、 50mLの前培養液を植菌し、 30°Cで 29時間培養した。培養液からは、遠心分離により大腸菌の形質転換体が約 85 g得られた。

次いで、得られた菌体 (形質転換体)は、 10mMリン^!爰衝液 (pH8)に懸濁させ、高圧ホモジナイザ一 (500bar)を用、て破砕した後、マイドール 12 (花王東京)およ D¾C1を、それぞれを 1 %および 0. 1Mとなるように添して 30分間撹拌した。次に、遠心分離 (8000 X g、 60分、 10°C)により沈殿として細胞固形物を除去し、上清として粗酵素液を得た。

»素液は、ショードモナス ·プチダの形質転換体にっレ、ては、 GDH活性が 2930kU、比活性が 22U/ragであり、大腸菌の形質転換体については GDH活性力 59kU、比活性力 Sl0. 3U/mgであった。

くグノレコ一ス素活生の彻 j定方法 >

グルコース！^素活性は、グルコースの脱水素化に基づく、電子受容体の還元反応を追跡することにより行った。電子受容体としては、 2, 6-ジクロロフエノルィンドフエノル (DCIP)及ぴフエナジンメトサルフエ一ト（PMS)を用いた。

具体的には、まず 20mMグノレコース、 2mM PMSおよび 0. IraM DCIPを含む 47mMリン職爰衝液 (pH6. 0) 900 / Lを分光光度計のセルに入れ、 37°Cで 3分間プレインキュベーシヨンした。次に、 0. 5〜10 Lの酵素溶液を添加して、直ちに転倒混和して反応を開始させ、波長が 600nmのときの吸光度低下を 37°Cにおいて経時的に測定した。 DCIPの吸収波長は 600nmであり、吸光度低下はグルコースのfeK素ィ匕に基づく、電子受容体の還元反応によるものである。

ここで、吸光度の演算にあたっては、 DCIPのモル吸光係数を 4. 76mMん mとした。酵素 1単位 (U)は、標準測定条件下で 1分毎に Ι μ Μのグルコースを酸化する量と定義した。タンパク質濃度は、 UV法を用いて測定し、 280nmにおける吸収力の場合のタンパク質濃度を lg/Lと定義した。

[実施例 1 ]

本実施例では、上述した手法により KS1株から得た酵素溶液 (可溶化 GDH画分)を、疎水クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて精製した。

疎水ク口マトグラフィ一は、 60mMリン職爱衝液 (pH6)によつて予め街化しておいた Octyl sepharose 4 Fast Flowカラム（44mmID X 20cm アマシャムノィォサイエンス）を用いて行った。カラムに対しては、最終濃度力 ¾( 1となるように 1 Mリン騰爱衝液 (ΡΗ6)を加えて調製した可溶化 GDH画分 (酵素溶液)を供給した。続いて、 60 リン酸緩衝液 (ρΗ6)を 600mL、 20mMリン酸緩衝液 (pH8)を 900mL通液した後に、強固に吸着した GDHを、溶离哲夜を通液することにより溶出させた。溶離液としては、 20mMリン廳爰衝液 (pH8)中のコール翻 aを溶解させたものを使用した。溶離液は、コール翻 aの濃度力 ¾〜1重量⁰ /₀の範囲にぉレ、て線的に変化するように、流速を 15raL/minとして供給した。

その結果、 GDHは、コール酉 | aの濃度が約 0. 8重量。 /₀のときに溶出され、 GDH活性を有する画分が 340mL回収できた。この回収画分 (Octyl回収画分）の活性を測定したところ、比活性 108U/mg、総活十生 16kUであった。

陰ィオン交換ク口マトグラフィ一は、 20ιιΜリン麟爰衝液 (pH8)によつて予め §ΐ 化しておいた Q sepharose Fast Flowカラム（32脑 ID X 12cm アマシャムバイオサィエンス）を用！/、て行つた。この力ラムに対しては、 Octyl回収画分を供給した後、溶離夜を供給した。溶離夜としては， 1重量％コール翻 aを含有する 20raMリン薩衝液 (pH8)を用いた。溶离街夜は、流速を 8mL/minとして 600mL供給した。

その結果、 GDHは、溶離液を 300raL通液した辺りで特異的に溶出され、 GDH活性を有する画分を 340mL回収できた。この回収画分 (Q回収画分)の活'[~生を測定したところ、比活性 770U/mg、総活性 14kUであった。

なお、各操作後における液量、総活性、比活性、収率をまとめたものを、下記表 2に示した。

表 2

[実施例 2 ]

本実施例では、シユードモナス'プチダの形質転換体から得た粗酵素溶液を、疎水クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて精製した。

疎水クロマトグラフィーでは、まず、 0. 1Mの KC1を含む 10慮リン廳爱衝液 (pH8) によって予め平渙 ί化しておいた Phenyl cellulofineカラム（300匪 IDX IOcm チッソ、東京)に対して、粗酵素液を供給して充填剤に GDHを保持させた。次に、 0. 1M の KC1を含む lOraMリン酸緩衝液 (pH8)を孔、 lOmMリン酸緩衝液 (pH8)を 21L通液した後に、強固に吸着した GDHを 1溶離夜を通液することにより溶出させた。溶离街夜としては、 20mMリン赚衝液 (pH8)中にコール幽 aを溶解させたものを使用した。溶离夜は、コール翻 aの濃度力 ¾〜1重量⁰ /₀の範囲において直線的に変化するように、流速を 7L/hrとして供給した。

その結果、 GDHは、コール翻 aの濃度が約 0. 9重量％のときに溶出され、活性画分力 S7300mL回収された。この回収画分 (Phenyl回収画分)の活性を測定したところ、比活性 204U/mg、総活性 596 Jであつた。

陰ィオン交換ク口マトグラフィ一は、 10mMリン醱爰衝液 (pH8)で予め §ϊ化しておいた Q sepharose Fast Flowカラム（44匪 ID X 20cm アマシャムバイオサイェンス）を用いて行った。このカラムに対しては、 Phenyl回収画分を供給した。 Phenyl 回収画分は、分画分子量 50000のラボモジュール (旭化成東京）を用いて lOmMリン «衝液 (PH8)にバッファー置換した後にカラムに供給した。次に、カラムに対して 10mMリン廳爰衝液 (pH8)を 600mLを供給した後、溶離夜を供給した。溶離夜としては、 1重量％コール酸 Naを含有する lOmMリン薩衝液 (pH8)を用いた。溶离賺は、流速を lOraL/minとして供給した。

その結果、 GDHは、溶离街夜を 1400mL通液した辺りで特異的に溶出され、 315mLの活性画分が回収された。この活性画分 (Q回収画分)の活性を測定したところ、比活性 1283U/mg、総活性力 ¾90kUであつた。

なお、各操作後における液量、総活性、比活性、収率をまとめたものを、下記表 3に示した。表 3

本実施例ではさらに、 Phenyl回収画分およて ) 回収画分を SDS - PAGEで電気泳動を行った。 SDS-PAGEは、 Tris- Tricine緩衝液を用いて 8-25%ポリアクリルアミドの勾配ゲル中で実施した。ゲル中を泳動したタンパク質については、 CBB染色を施した。 SDS- PAGE電気泳動の結果は、図 1に示した。同図においては、レーン 2が Phenyl 回収画分の CBB染色を、レーン 3が Q回収画分の CBB染色をそれぞれ示している。

[実施例 3 ]

本実施例では、シユードモナス'プチダの形質転換体から得た粗酵素溶液を、疎水クロマトグラフィ一および陰ィオン交換ク口マトダラフィ一を組み合わせて精製した。

疎水ク口マトグラフィ一は、実施例 2と同様にして行レヽ、回収溶液を^ « し、比活性 300U/rag、総活性が 21kUである Phenyl回収画分を 70mL得た。

陰ィオン交換ク口マトグラフィ一は、 10mMリン麟爱衝液 (pH8)によつて予め 1奐 ϊ 化しておいた QAE-トヨパール 550カラム（44mmIDX 10cm 東ソー東京）を用いて行った。このカラムに対しては、 Phenyl回収画分を供給した後に、溶離液を供給した。溶离街夜としては、 1重量％コール^ aを含有する 10mMリン^!爰衝液 (_PH8)を用いた。溶离街夜は、流速を 5mL/minとして 2000raL供給した。

その結果、 GDHは、溶離液を 1600raL通液した辺りで特異的に溶出され、 300mLの活性画分が回収された。この活性画分 (QAE回収画分)の活性を測定したところ、比活十生 1500U/mg、忿活 'I生が 7. 8kUであった。

なお、各操作後における液量、総活性、比活性、収率をまとめたものを、下記表 4に示した。表 4

本実施例ではさらに、実施例 2と同様な手法により QAE回収画分を SDS- PAGEで電気泳動を行った後、タンパク質について CBB染色を施した。 SDS- PAGE電気泳動の結果は、図 1に示した。同図においては、レーン 4が QAE回収画分を示している。

[比較例 1 ] ^ΰ

本比較例では、シユードモナス'プチダの形質転換体から得た粗酵素溶液を、疎水クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて精製した。

疎水ク口マトグラフィ一は、実施例 2と同様にして行レ、、比活性 314U/mg、総活性が 256kUである Phenyl回収画分を 7200mL得た。ただし、本比較例では、 Phenyl 回収画分うちの総活性 39kUに相当する 1100mL(Qアプライ）について、次に説明する陰ィオン交換ク口マトグラフィ一を行つた。

陰ィオン交換ク口マトグラフィ一は、 lOmMリン廳爰衝液 (pH8)によつて予め∑Ρ§ϊ ィ匕しておいた Q sepharose Fast Flowカラム（44讓 ID X 13cm アマシャムバイオサィエンス）を用いて行った。このカラムに対しては、 Qアプライを供給した。その後、カラムに 800mLの lOraMリン廳爰衝液 (pH8)を通液して非吸着タンパク質を洗レヽ流した。次いで、カラムに対して溶离赚を供給した。溶離液としては、 10mMリン薩衝液 (pH8)中に NaClを溶解させたものを使用した。溶离赚は、 NaClの濃度力 ¾ 〜0. 6Mの範囲において直線的に変化するように、流速を 7. 5mL/minとして供給した。その結果、 GDHは、 NaCl濃度が約 0. 25Mと約 0. 4Mの 2箇所に溶出し、 140mLおよび 360raLの活性画分が回収された。これらの活性画分 (Q回収画分 (1)およ！)¾回収画分 (2))のそれぞれについて活性を測定したところ、 Q回収画分 (1)は比活性 600U/mg、総活性 4. 5kU、 Q回収画分 (2)は比活性 432U/mg、総活性 12kUであった。なお、各操作後における液量、総活性、比活性、収率をまとめたものを、下記表 5に示した。

表 5

本比較例ではさらに、実施例 2と同様な手法により Phenyl回収画分およ Ό¾回収画分 (2)を SDS - PAGEで電気泳動を行つた後、タンパク質にっレヽて CBB染色を施した。 SDS- PAGE電気泳動の結果は、図 2に示した。同図においては、レーン 2が Phenyl 回収画分を、レーン 3力 ¾回収画分 (1)をそれぞれ示している。 [比較例 2 ]

本比較例では、比較例 1で得られた Phenyl回収画分のうち、総活性 74kUに相当する 2100mL(QAEアプライ）から、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて GDHを精製した。

陰ィオン交換ク口マトグラフィ一は、 lOraMリン酸緩衝液 (pH8)によつて予め平衡ィ匕しておいた QAE -トヨパール 550カラム（4½mIDX 10cm 東ソー東京）を用いて行った。このカラムに対しては、まず QAE回収画分 (総活性 74kU)を供給した。次いで、 800mLの K !リン酸緩衝液 (pH8)を通液して非吸着タンパク質を洗レ、流した。その後、カラムに対して溶离街夜を供糸合した。溶离街夜としては、 ΙΟπΜリン觸爱褸 Ϊ液 (pH8)中に KC1を溶解させたものを使用した。溶离赚は、 KC1の濃度力 ¾〜1Μの範囲におレ、て ¾#泉的に変ィ匕するように、流速を 5mL/minとして供給した。

その結果、 GDHは、 KC1の濃度が約 0. 23Mと約 0. 43Mの 2箇所に溶出し、 200mLおよび 400mLの活性画分が回収された。これらの活性画分 (QAE回収画分 (1)およ Ό¾ΑΕ回収画分 (2))のそれぞれにつ!/ヽて活性を測定したところ、 QAE回収画分 (1)は比活性 399U/mg、総活生 7. 4kU、 QAE回収画分 (2)は比活性 217U/mg、総活个生 6. 4kUであった。なお、各操作後における液量、総活性、比活十生、収率をまとめたものを、下記表 6に示した。

表 6

本比較例ではさらに、実施例 2と同様な手法により QAE回収画分 (2)を SDS - PAGE で電気泳動を行つた後、タンパク質にっレヽて CBB染色を施した。 SDS - PAGE電気泳動の結果は、図 2に示した。同図においては、レーン 4が QAE回収画分 (2)を示している。

[実施例 4 ]

本実施例では、大腸菌の形質転換体から得られた纏素溶液を、疎水クロマトグラフィーおよび陰ィオン交換ク口マトグラフィーを組み合わせて精製した。疎水クロマトグラフィーは、 Octyl sepharose 4 Fast Flowカラムを用いて、実施例 1と同様な条件にぉレ、て行つた。

その結果、 GDHは、コール^ Naの濃度が約 0. 8重量％のときに溶出され、 GDH活性を有する画分が 220mL回収できた。この回収画分 (Octyl回収画分）の活性を測定したところ、比活十生 503U/mg、総活性 149 Jであった。

陰イオン交換クロマトグラフィーは、 Q sepharose Fast Flowカラムを用いて、実施例 1と同様な条件において行った。

その結果、 GDHは、溶离傲夜を 500mL通液した辺りで特異的に溶出され、 GDH活性を有する画分を 175mL回収できた。この回収画分 (Q回収画分)の活' ftを測定したところ、比活性 1147U/m_g、総活性 50kUであった。

なお、各操作後における液量、総活性、比活十生、収率をまとめたものを、下記表 7に示した

表 7

本実施例ではさらに、実施例 2と同様な手法により Q回収画分を SDS-PAGEで電気泳動を行つた後、タンパク質につ!/、て CBB染色を施した。 SDS- PAGE電気泳動の結果は、図 3に示した。同図にぉレヽては、レーン 3が本実施例の Q回収画分を示している。図 3においては、実施例 1における Q回収画分（レーン 2)および実施例 2における Q 回収画分（レーン 4)についても同時に電気泳動を行っている。

<結果の検討 >

表 2〜表 7カゝら分かるように、溶離剤としてコール酉 | aを用いて GDHを溶出させたには (実施例 1から 4)、溶離剤として NaClや KC1を用いて GDHをグラジェント溶出させた場合 (比較例 1および 2 )に比べ、最終的な比活性が高く、効率よく GDHが精製されている。この点については、図 1および図 2にも明確に表れている。すなわち、 KS1株由来の GDHは、 α， /3 , γサブユニットからなるが、これらのサブュニットの還元条件下での SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量は、それぞれ約 60kDa、約 43kDa, および約 14kDaである。この点を踏まえて図 1および図 2をみれば、実施例 2および 3で得られる回収画分では、比較例 1および 2で得られる回収画分に比べて、 α， β , γサブュ-ットに相当するバンドが大きく、その他の分子量のタンパク質が少なくなつている。したがって、疎水クロマトダラフィ一ゃ陰ィオン交換ク口マトグラフィ一を組み合わせて GDHを精製する際に、コール翻 aを用いて GDHを溶出させたには、効率よく GDHが精製できるといえる。

また、図 3から分かるように、宿主を大腸菌とした形質転換体からの »素を用いた場合には、 γサブユニットに相当するバンドが小さいものの、 α， βサブュニットに相当するバンドが他の粗酵素溶液を用いる場合に比べて大きくなっている。また、大月昜菌は、安価かつ入手容易であるともに、自己増殖性に優れたものである。したがって、工業的な応用を考えたには、大腸菌を宿主とする形質転換体から粗酵蒲夜を得、この画素溜夜を精製して GDHを得ること方法は有用であるといえる。

Claims

請求の範囲

1 . 目的タンパク質が溶解したタンパク質溶液から、液体ク口マトグラフィーを利用して嫌己目的タンパク質を精製する方法であって、

lift己液体クロマトグラフィーは、 ^ύ

充填剤が充填された充填槽に嫌己タンパク質激夜を導入し、前記充填剤に対して lift己目的タンパク質を保持させる第 1ステップと、

ヒドロキシコラン酸塩を含む溶离街夜を用いて、 tin己充填剤から前記目的タンノヽ。ク質を溶離させる第 2ステップと、

を含んでいる、タンパク質の精製方法。 ■

2 . 編己目的タンパク質は、電子伝達タンパク質を含んでいる、請求項 1に記載のタンパク質の精製方法。

3 . 膽己目的タンパク質は、グルコース ΒέτΚ素活性を有するタンパク質を含むグルコース素酵素である、請求項 2に記載のタンパク質の精製方法。

4. tiHB充填剤は、イオン交謹旨である、請求項 1に記載のタンパク質の精製方法。

5 . 前記イオン交 m 脂は、 4級アンモニゥム基をイオン交換基として有している、請求項 4に記載のタンパク質の精製方法。

6. Ι ΙΒ電子伝達タンパク質は、還元条件下での SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量力 S約 43kDaであり、

觸己グルコース脱水素活性を有するタンパク質は、還元条件下での SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約 60kDaである、請求項 3に記載のタンパク質の精製方法。

7. t己ヒドロキシコラン酸塩は、コ一ノレ酸塩である、請求項 1に記載のタンパク質の精法。

8 . 嫌己充填剤からの編己目的タンパク質の溶離は、膽己溶離液におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を一定にして行われる、請求項 1に記載のタンパク質の精製方法。

9 . 前記溶離夜におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度は、 0. 5〜2. 5重量⁰ /₀の範囲力選択される、請求項 8に記載のタンパク質の精製方法。

10. 前記グルコース脱水素酵素は、グルコース素酵素を産生する能力を有するブルクホルデリァ属に属する微生物が産生したものである、請求項 3に記載のタンパク質の精製方法。

11. 前記ブルクホルデリァ属に属する微生物は、ブルクホルデリア'セパシァ KS1 株 (FERM BP - 7306)である、請求項 10に記載のタンパク質の精製方法。

12. 編己グルコース脱水素酵素は、形質転換体が産生したものであり、

この形質転換体は、グルコース J«素酵素を産生する能力を有するブルクホルデリァ属に属する微生物から取得した tiff己電子伝達タンパク質および ttflBダルコース活十生を有するタンパク質をコードする DNAを、宿主微生物に導入して形成したものである、請求項 3に記載のタンパク質の精製方法。

13. 前記宿主微生物は、シユードモナス'プチダである、請求項 12に記載のタンパク質の精製方法。

14.編己宿主微生物は、大腸菌である、請求項 12に記載のタンパク質の精製方法。

15. 球水クロマトグラフィーと陰ィオン交換ク口マトグラフィ一とを組み合わせてグルコース I¾TK素酵素を精製する方法であつて、

ttlf己疎水クロマトグラフィ一は、固定相に Ml己グルコース脱冰素酵素を保將させるステップと、不要なタンパク質を溶出させるステップと、ヒドロキシコラン酸塩を含む溶离街夜を用レヽて tfrt己グルコース^ k素酵素を溶出させるステップと、を含み、

ΙΐίΙΒ陰ィオン交換ク口マトグラフィ一は、固定相に編 Sグルコース Ifck素酵素を保持させるステップと、ヒドロキシコラン酸塩を含む溶離液を用いて Sift己グルコース EzK素酵素を溶出させるステップと、を含んでいる、グルコース! ¾7_K素酵素の精製方法。

16. 肅己疎水クロマトグラフィーにおいては、膽己グルコース素酵素の溶出は、 tfit己溶离街夜におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を時間とともに変ィ匕させて行われ、

前記陰イオン交換クロマトグラフィ一においては、編己グルコース素酵素の溶出は、 it己溶離液におけるヒドロキシコラン酸塩の濃度を一定にして行われる、請求項 15に記載のグルコース麻素酵素の精製方法。

17. l己疎水ク口マトグラフィ一を行つた後に、 flit己陰ィオン交換クロマトグラフィ一を行う、請求項 16に記載のグルコース脱水素酵素の精製方法。

18. 前記グルコース脱水素酵素は、グルコース月脉素酵素を産生する能力を有するブルクホルデリァ属に属する微生物が産生したものである、請求項 15に記載のグルコース素酵素の精製方法。

19. flit己ブルクホルデリア属に属する微生物は、ブルクホルデリア'セパシァ KS1 株 (PERM BP- 7306)である、請求項 18に記載のグルコース素酵素の精^-法。

20. tin己グルコース脱水素酵素は、形質転換体が産生したものであり、

この形質転換体は、グルコース素酵素を産生する能力を有するブルクホルデリァ属に属する微生物から取得した ΙίίΙ己グルコース素酵素をコードする

DNAを、宿主微生物に導入して形成したものである、請求項 15に記載のグルコース素酵素の精製方法。

21. 前記宿主微生物は、シユードモナス'プチダである、請求項 20に記載のダルコース素酵素の精製方法。

22. 膽己宿主微生物は、大腸菌である、請求項 20に記載のグルコース to素酵素の精製方法。

23. 前記陰ィオン交換ク口マトグラフィ一は、 4級ァンモニゥム基をィオン交換基として有するイオン交浦脂を用いて行い、

前記ヒドロキシコラン酸塩としては、コール酸塩を用いる、請求項 15に記載のグルコース »素酵素の精製方法。