WO2004022741A1

WO2004022741A1 - 哺乳類人工染色体

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Publication number: WO2004022741A1
Application number: PCT/JP2003/011134
Authority: WO
Inventors: Tsuneko Okazaki; Masashi Ikeno; Toshihide Itou; Nobutaka Suzuki
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-09-03
Filing date: 2003-09-01
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2005-03-03
Also published as: CA2501708A1; AU2003261863A1; JPWO2004022741A1; US20080235817A1; EP1536007B1; US20070004002A1; AU2003261863C1; EP1536007A1; EP1536007A4; JP4293990B2; CA2501708C; AU2003261863B2

Abstract

　哺乳類細胞内で安定的に維持され、それが保持する目的遺伝子の発現が効率的に行われ得る哺乳類人工染色体を提供する。哺乳類セントロメア配列及び選択マーカー遺伝子を含む環状の第１ベクターと、機能配列を含む環状の第２ベクターとを哺乳類宿主細胞に導入し、前記選択マーカー遺伝子を利用して形質転換細胞を選択し、選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択することにより、哺乳類複製起点、哺乳類セントロメア配列、及び機能配列を有し、環状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体を構築する。

Description

明細書哺乳類人工染色体技術分野

本発明は哺乳類人工染色体に関する。詳しくは、哺乳類人工染色体の作製方法、哺乳類人工染色体、及び哺乳類人工染色体の利用に関する。本発明において提供される哺乳類人工染色体は、例えば所望の遺伝子を哺乳類細胞内へと運搬するためのベクタ一として遺伝子治療、細胞、組織、又は哺乳類個体の形質転換等に利用することができる。背景技術

有糸分裂において安定して維持されるヒ卜人工染色体（HAC(s)) は数メガ bp のサイズを有し、そしていくつもの CENP-Bボックスを有する線状（YAC) 又は環状（BAC又は PAC)であり、数 1 0キロベースのヒ卜 αサテライト（アルフォイド）を含む前駆体 DNAコンストラク卜の導入によってヒト線維芽細胞株 ΗΤ1080内でしぱしば de novoに形成される（Ikeno et al . 1998; Henning et al . 1999; Eber sole et aに 2000)。そのような HAC上には必須キネ卜コアタンパク質が検出されるので、導入されたアルファサテライ卜アレイは真のヒ卜染色体におけるものに類似した活性型セン卜ロメァ /キネ卜コア構造を de novoに組み立てることができる ( Ikeno et al . 1994; Ikeno et al. 1998; Henning et al. 1999; Eberso I e et al. 2000; Ando et al. 2002)。 HAC は細胞内タンパク因子を利用して細胞周期ごとに複製されるので、 HAC はアルフ才イド配列内に一つ又は複数の複製起点も有する。テロメァ配列を有するアルフォイド YACから調製された線状の HAC はその末端に機能的テロメァ構造を獲得したが、 BAC又は PACから調製された環状の HACはテロメァ構造を有していなかった（Ikeno et al. 1998; Ebersole et al. 2000)。遺伝子療法によるヒ卜疾患の治療は取り組む価値があり且つ将来有望な分野である。我々は、欠損ヒト遺伝子の修復やそれらの機能又は制御機構を詳細に特徴付けることに利用し得る数万もの遺伝子を手にしているが、効率的な遺伝子輸送技術の開発には依然として大きな障害が存在する。哺乳動物細胞用として現在利用可能なベクターはそのほとんどが小さなウィルス由来である（Mineta et al. 1995; Fi sher et al . 1997; Pfei ter & Verna 2001 )。これらのベクターは所望の遺伝子（導入遺伝子）を高い効率で遺伝子導入できるという利点を有するものの、そのクローニング許容サイズは限られている。これらのベクターは小さすぎるために組織特異的制御領域を含む長いゲノム断片を挿入することができない。さらには、導入遺伝子はたいていの場合、宿主細胞の染色体内へのランダムインテグレーションの後に限って安定して維持され、そのような場合の遺伝子発現は通常予測不可能であって（ほとんどの場合は抑制される）、導入遺伝子の真の制御領域による制御は行われない。更に悪いことには、このような導入遺伝子を組み込むステップは好ましくない突然変異（ミュータジエネシス）を伴うことがある。

—方 HACは、制御領域を含み、 100 kbを越える大きさの DNAからなる大きな導入遺伝子を保持する能力を備える。導入遺伝子を含む HACは、導入遺伝子及びァルフ才イド配列の両者を有する前駆コンストラクトから（Mej ia et al . 2001 )、又はアルフォイド配列と導入遺伝子をそれぞれ別個に有した前駆コンス卜ラクトから de novo に形成され得る（Grimes et al . 2001 )。したがって、 HACは治療用途におけるベクターとしてだけでなく、大きなゲノム断片を用いることによってはじめて可能となる、組織又は器官特異的な遺伝子発現制御を解析するモデルシステムとしても利用できると考えられる。発明の開示

本発明は以上の背景の下なされたものであって、その目的は哺乳類細胞内で遺伝子などの目的とする機能配列を安定的に発現させる技術を提供することである。具体的には、本発明は哺乳類細胞内で安定的に維持され、それが保持する機能配列の発現が効率的に行われる哺乳類人工染色体、その作製方法、及びそれを利用した細胞等の形質転換方法等を提供することを目的とする。本発明者らは以上の目的に鑑み、哺乳類人工染色体を人工染色体前駆体から形成させる過程で、機能配列としての目的遺伝子を取り込む方法を採用し、目的遺伝子（GCH1 遺伝子）が発現可能に保持される哺乳類人工染色体の作製を試みた。即ち、環状ベクターである BACを人工染色体前駆体として使用し、 GCH1遺伝子全体及びその上流制御領域をカバーする約 1 80k bのゲノム領域を保持する BAC ( GCH 1 -BAC) と、ヒトセン卜ロメァ配列として約 50k b又は約 l OOkbのアルフ才イド配列を含む BAC (アルフォイド BAC) をヒト線維芽細胞である HT 1080細胞にコトランスフェク卜した。その結果、 GCH 1遺伝子を複数コピー有するヒ卜人工染色体（H AC) を構築することに成功し、得られた HACは選択操作を行わなくともヒ卜細胞及びマウス細胞の両者において安定して維持されることが示された。さらに検討を行ったところ、この HACを有する形質転換株において GCH1活性の上昇が認められ、また、その活性は染色体上に存在する場合と同様にインター： 7エロンァの誘導に応答性を示すものであった。即ち、構築された HAC から自然な状態の GCH1 遺伝子の発現が確認された。

一方、線状ベクターである YAC を前駆体として使用し、 BACの場合と同様の方法でヒ卜 ;8グロビン遺伝子群全領域を保持するヒト人工染色体の構築に成功した。更に、構築された HACをマウス胚性幹細胞（E S細胞）に移入することに成功するとともに、得られた ES細胞を利用してキメラマウス（HAC保有マウス）の作出にも成功した。このことは、個体レベルでの遺伝子導入ツールとして人工染色体を利用できることが実験的に確認されたという、極めて重要な意味をもつ。また、 XY核型に加えて X0核型 E S細胞に対しても HACの移入に成功し、さらにそれを用いて HAC保有のメスキメラマウスの作出にも成功した。尚、メスキメラマウスが利用できれば哺乳類人工染色体の伝達が容易になると考えられている。

また、遺伝子挿入部位を備える哺乳類人工染色体を作製する際に、後に導入される遺伝子の発現を促進する目的でィンスレーター配列を組み込んで哺乳類人工染色体の構築を行ったことろ、驚くべきことに哺乳類人工染色体への遺伝子導入効率が高くなつた。つまり、インスレーター配列を用いることによって、目的遺伝子を保持する哺乳類人工染色体を高効率で作製できることが判明した。

本発明は以上の検討の結果得られた知見に基づいてなされたものであって、以下の構成を提供する。

[ 1 ] 哺乳類セン卜ロメァ配列を含む環状の第 1 ベクターと、機能配列を含む環状の第 2ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第 1 工程と、

形質転換細胞を選択する第 2工程と、及び

選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第 3工程と、

を含むことを特徴とする哺乳類人工染色体の作製方法。

[ 2 ] 哺乳類セン卜ロメァ配列及び哺乳類テロメァ配列を含む酵母人工染色体からなる第 1 ベクターと、機能配列を含む酵母人工染色体からなる第 2ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第 1 工程と、

形質転換細胞を選択する第 2工程と、及び

を含むことを特徴とする哺乳類人工染色体の作製方法。

[3] 前記第 1 ベクターが選択マーカー遺伝子を有し、前記第 2工程における形質転換細胞の選択は該選択マーカー遺伝子を利用して行われる、 1又は 2に記載の作製方法。

[4] 前記哺乳類セン卜ロメァ配列は、以下の配列が規則的間隔で複数個配列される領域を含む、 1 ~ 3のいずれかに記載の作製方法、

5' - NTTCGNNNNANNCGGGN- 3' ：配列番号 1 (但し、 Nは A， T, C，及び Gのいずれかである）。

[5] 前記哺乳類セントロメァ配列はヒト染色体アルファサテライト領域由来の配列を含む、 1 〜 4のいずれかに記載の作製方法。

[6] 前記哺乳類セン卜ロメァ配列はヒト 21番染色体由来の 11量体繰返しュニットを含む、 5に記載の作製方法。

[7] 前記哺乳類セントロメァ配列のサイズは約 50kb以下である、 1 ~ 6のいずれかに記載の作製方法。

[8] 前記機能配列が目的遺伝子及びその制御領域をコードする配列からなる, 1 ~ 7のいずれかに記載の作製方法。

[9] 前記目的遺伝子はハウスキーピング遺伝子以外の遺伝子である、 8に記載の作製方法。

[1 0] 前記目的遺伝子はヒトグアノシン三リン酸シクロヒドロラーゼ I の構造遺伝子である、 8に記載の作製方法。

[1 1 ] 前記機能配列はヒ卜 i3グロビン遺伝子群全領域をコードする配列である、 8に記載の作製方法。

[1 2 ] 前記機能配列は、所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列からなる、 1 ~ 7のいずれかに記載の作製方法。 [1 3 ] 前記挿入用配列が loxPサイ卜若しくは FRTサイ卜又はこれらいずれかの配列の一部を改変した配列であって、前記所望の配列を挿入する機能を有する配列である、 1 2に記載の作製方法。

[1 4] 前記第 1 工程において導入する、前記第 1 ベクターと前記第 2ベクタ一の量比はモル比で約 1 0 ： 1 〜約 1 ： 1 0の範囲にある、 1 〜 1 3のいずれかに記載の作製方法。

[1 5] 前記第 2ベクターとして、それに含まれる機能配列が互いに異なる複数のベクターが使用される、 1 ~ 1 4のいずれかに記載の作製方法。

[1 6] 前記第 2ベクターがインスレーター配列をさらに含む、 1 〜 1 5のいずれかに記載の作製方法。

[1 7] 1 - 1 6のいずれかに記載の作製方法によって得られ、

哺乳類複製起点、哺乳類セン卜ロメァ配列、及び機能配列を有し、

環状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。

[1 8] 1 ~ 1 6のいずれかに記載の作製方法によって得られ、

哺乳類複製起点、哺乳類セントロメァ配列、哺乳類テロメァ配列、並びに目的遺伝子及びその制御領域をコードする機能配列を有し、

線状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。

[1 9] 哺乳類複製起点、哺乳類セン卜ロメァ配列、並びに目的遺伝子（ハウスキーピング遺伝子を除く）及びその制御領域をコードする機能配列を有し、環状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。

[2 0] 前記目的遺伝子はヒ卜グアノシン三リン酸シクロヒドロラーゼ I の構造遺伝子である、 1 9に記載の哺乳類人工染色体。 [2 1 ] 哺乳類複製起点、哺乳類セン卜ロメァ配列、哺乳類テロメァ配列、並びに目的遺伝子（ハウスキーピング遺伝子を除く）及びその制御領域をコードする機能配列を有し、

[2 2] 前記機能配列はヒ卜 ; 8グロビン遺伝子群全領域からなる、 2 1 に記載の哺乳類人工染色体。

[2 3 ] 哺乳類複製起点、哺乳類セン卜ロメァ配列、及び所望の配列を特異的に挿入するための揷入用配列を有し、

[2 4] 哺乳類複製起点、哺乳類セン卜ロメァ配列、哺乳類テロメァ配列、及び所望の配列を特異的に挿入するための揷入用配列を有し、

[2 5 ] 前記挿入用配列が ΙοχΡサイ卜若しくは FRTサイ卜又はこれらいずれかの配列の一部を改変した配列であって、前記所望の配列を挿入する機能を有する配列である、 2 3又は 2 4に記載の作製の哺乳類人工染色体。

[2 6] 前記哺乳類セン卜ロメァ配列は、以下の配列が規則的間隔で複数個配列される領域を含む、 1 7 ~ 2 5のいずれかに記載の哺乳類人工染色体、

5'-NTTCGNNNNANNCGGGN-3' ：配列番号 1 (但し、 Nは A， T， C，及び Gのいずれかである）。

[2 7 ] 前記哺乳類セン卜ロメァ配列はヒ卜染色体アルファサテライト領域由来の配列を含む、 1 7〜 2 5のいずれかに記載の哺乳類人工染色体。

[2 8] 前記哺乳類セントロメァ配列はヒ卜 21番染色体由来の 11量体繰返しユニットを含む、 2 7に記載の哺乳類人工染色体。

[2 9] 前記機能配列又は前記挿入用配列を複数個有する、 1 7 ~ 2 8のいずれかに記載の哺乳類人工染色体。

[3 0] インスレーター配列をさらに含む、 1 7 ~ 2 9のいずれかに記載の哺乳類人工染色体。

[3 1 ] 1 7 ~ 3 0のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を自己の染色体外に保有する哺乳類細胞。

[3 2] 1 7〜 3 0のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を自己の染色体外に保有するヒ卜細胞。

[3 3] 1 7 ~ 3 0のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を自己の染色体外に保有する胚性幹細胞。

[3 4] 1 - 1 6のいずれかに記載の作製方法によって得られる哺乳類人工染色体又は 1 7~ 3 0のいずれかに記載の哺乳類人工染色体をターゲッ卜細胞としての哺乳類細胞に導入する工程を含む、

ことを特徴とする、前記機能配列又は前記挿入用配列が長期間安定して維持可能な状態に導入された哺乳類細胞の作製方法。

[3 5] 哺乳類セントロメァ配列を含む環状の第 1 ベクターと、機能配列を含む環状の第 2ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第 1工程と、

形質転換細胞を選択する第 2工程と、

選択された形質転換細胞の中から、哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第 3工程と、

選択された細胞から前記哺乳類人工染色体を分離する第 4工程と、及び分離された前記哺乳類人工染色体を夕ーゲッ卜細胞としての哺乳類細胞に導入する第 5工程と、

を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。 [ 3 6 ] 哺乳類セン卜ロメァ配列及び哺乳類テロメァ配列を含む酵母人工染色体からなる第 1 ベクターと、機能配列を含む酵母人工染色体からなる第 2ベクタ一と、を哺乳類宿主細胞に導入する第 1 工程と、

形質転換細胞を選択する第 2工程と、

選択された細胞から前記哺乳類人工染色体を分離する第 4工程と、及び分離された前記哺乳類人工染色体をターゲッ卜細胞としての哺乳類細胞に導入する第 5工程と、

を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。

[ 3 7 ] 哺乳類セン卜ロメァ配列を含む環状の第 1 ベクターと、機能配列を含む環状の第 2ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第 1 工程と、

形質転換細胞を選択する第 2工程と、

選択された細胞と、微小核形成能を有する哺乳類細胞とを融合させる第 4工程と、

融合細胞の中から、微小核形成能を有し、かつ前記哺乳類人工染色体を保有するハイブリッド細胞を選択する第 5工程と、及び

選択されたハイプリッド細胞から微小核を形成させる第 6工程と、

を含む、哺乳類人工染色体を含有する微小核体の作製方法。

[ 3 8 ] 哺乳類セン卜ロメァ配列及び哺乳類テロメァ配列を含む酵母人工染色体からなる第 1 ベクターと、機能配列を含む酵母人工染色体からなる第 2ベクタ —と、を哺乳類宿主細胞に導入する第 1 工程と、

形質転換細胞を選択する第 2工程と、選択された形質転換細胞の中から哺乳類人工染色体を保有する細胞を選択する第 3工程と、

[ 3 9 ] 3 7又は 3 8に記載の作製方法によって得られる微小核体とターゲッ卜細胞としての哺乳類細胞とを融合させる工程、

[ 4 0 ] 1 7〜 3 0のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を保有する宿主細胞から哺乳類人工染色体を分離する工程と、及び

分離された前記哺乳類人工染色体をターゲッ卜細胞としての哺乳類細胞に導入する工程と、

[ 4 1 ] 1 7 ~ 3 0のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を保有する宿主細胞と、微小核形成能を有する哺乳類細胞と、を融合させる工程と、

融合細胞の中から、微小核形成能を有し、かつ前記哺乳類人工染色体を保有するハイブリッド細胞を選択する工程と、及び

選択されたハイプリッド細胞から微小核を形成させる工程と、

[ 4 2 ] 4 1 に記載の作製方法によって得られる微小核体とターゲッ卜細胞としての哺乳類細胞とを融合させる工程、

を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。 [4 3] 前記ターゲット細胞としての哺乳類細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、又は組織幹細胞である、 3 4、 3 5、 3 6、 3 9、 4 0、及び 4 2のいずれかに記載の哺乳類細胞の作製方法。

[4 4] 前記ターゲット細胞としての哺乳類細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、又は組織幹細胞を、特定の組織の細胞へと分化するように誘導してなる細胞である、 3 4、 3 5、 3 6、 3 9、 4 0、及び 4 2のいずれかに記載の哺乳類細胞の作製方法。

[4 5] 前記ターゲット細胞としての哺乳類細胞は、哺乳類の受精卵である、 3 4、 3 5、 3 6、 3 9、 4 0、及び 4 2のいずれかに記載の哺乳類細胞の作製方法。

[4 6] 哺乳類人工染色体の作製に使用されるベクターであって、

サイズが約 50kb以下の哺乳類セン卜ロメァ配列、及び選択マーカー遺伝子を含むベクター。

[4 7] 前記哺乳類セントロメァ配列は、以下の配列が規則的間隔で複数個配列される領域を含む、 4 6に記載のベクター、

5'-NTTCGNNMNAMNCGGGN- 3' ：配列番号 1 (但し、 l\lは A， T， C，及び Gのいずれかである）。

C48] 前記哺乳類セン卜ロメァ配列はヒ卜染色体アルファサテライ卜領域由来の配列を含む、 4 6又は 4 7に記載のベクタ一。

[4 9 ] 前記哺乳類セン卜ロメァ配列はヒ卜 21番染色体由来の 11 量体繰返しユニットを含む、 4 8に記載のベクター。

[5 0] 哺乳類人工染色体の作製に使用されるベクターであって、

ΙοχΡサイ卜若しくは F叮サイト又はこれらいずれかの配列の一部を改変した配列であって、前記所望の配列を挿入する機能を有する配列と、

インスレー夕一配列と、を含むベクター。 [5 1 ] 哺乳類人工染色体が導入されてなる、非ヒ卜形質転換動物。

[5 2] 前記哺乳類人工染色体が、 1 7〜 1 9のいずれかに記載の哺乳類人工染色体である、 5 1 に記載の非ヒト形質転換動物。

[5 3] 哺乳類人工染色体が導入されてなる、 X0型マウス胚性幹細胞。

[5 4] 前記哺乳類人工染色体が、 1 7 ~ 1 9のいずれかに記載の哺乳類人工染色体である、 5 3に記載の X0型マウス胚性幹細胞。

[5 5] 哺乳類人工染色体が導入されてなる、メスキメラマウス。

[5 6] 前記哺乳類人工染色体が、 1 7〜 1 9のいずれかに記載の哺乳類人工染色体である、 5 5に記載の、メスキメラマウス。図面の簡単な説明

図 1 は、形質転換株内におけるコトランスフエク卜 BACの運命についてまとめた表である。 GCH1- BACに加えて CMV/α 100BAC又は SV/α 50BACを用いたコ卜ランスフ：!：クションによって得られた BS耐性細胞株を FISHで解析した結果が示される。「HAC上」は、 <¾21- 1 アルフォイド DNAプローブと BACベクタープローブの両方で検出された人工染色体を保有する細胞株を示す。これらの細胞株のメタフエィズ■ スプレツドの 95¾以上においてそれぞれ一つの HACが検出された。残りの細胞では、導入された BACは HT1080の染色体に組込まれたか（染色体上）、又は FISH解析においてシグナルが検出できなかった（検出されず）。「GCHを保有する HAC」は、 GCH1遺伝子のシグナルが認められた HACを保有する細胞株を示す。図 2は、 HAC保有細胞株における GCH1活性の測定結果をまとめた表である。 IFN- ァ誘導の存在下、及び非存在下において HT/GCH2- 10 、 HT/GCH5-18 及び HT1080 細胞における GCH1活性を測定した結果が示される。表中の各データはこれら三つの独立した実験から得られた平均値土標準偏差で表されている。

図 3は、アルフォイド BAC及び GCH1- BACのコンス卜ラクトを示す図である。 CMV/ α 100 BACは、 BACベクター内にヒト 21番染色体由来の lOOkbの α 21- 1 アルフォイド配列、及び哺乳類細胞を選択するための CMV- Bsd (ァスペルギルス，テレゥス（Aspergi I lus terreus) 由来の B I as t i c i d i n Sデアミナーゼ遺伝子）選択マーカーを含む。 SV/a 50 BACは、 50kbの a 21-1 アルフォイド配列、及び SV2- Bsr (バチルス ·セレウス（Baci I lus cereus) 由来の B I as t i c i d i n Sデアミナーゼ遺伝子）選択マーカーを含む。 GCH1- BACは GCH1遺伝子を含む 180 kbのゲノム DNA断片を含む。 FISH解析用、サザン解析用、及び GCH1 遺伝子のェクソン（1~6) 用のプローブとして使用された領域は、それぞれハッチングを施したボックス、黒塗りのボックス、及び白抜きのボックスで表される。 BACベクターは E. col i 内での選択のためのクロラムフエ二コール耐性遺伝子（Cm) を含む。

図 4は、 HAC上の GCH1 シグナルを検出するための FISH解析の結果を示す図である。 HT/GCH2- 10細胞株（CMV/a 100 BACと GCH1- BACのコトランスフエクシヨンによって形成された）、及び HT/GCH5-18 (SV/a50 BACと GCH1- BACのコ卜ランスフエクションによって形成された）に GCH1 ェクソン 1 プローブ（緑）及び BAC ベクタープローブ（赤）を（左欄）、又は GCH1 ェクソン 456 (緑）及び GCH1ェクソン〗（赤）を（右欄）ハイブリダィズさせている。矢じりは HACを示す。

図 5は、 GCH1-HACの構造解析の結果を示す図である。 HAC内の GCH1遺伝子を制限酵素分析した結果が示される。 HT/GCH2- 10 、 HT/GCH5- 18 、及び卜ランスフエクシヨンを行っていない HT1080から調製したゲノム DNAを BamHI (A)又は Stul (B) で消化し、常法的なゲル電気泳動で分画した。内在性 GCH1遺伝子座及び GCH1- BAC を使用した場合に、 USプローブ（A)及びェクソン 6プローブ（B)によって検出される BaniHI 断片及び Stul 断片の予想されるサイズが上段に示される。

図 6は、ドットハイプリダイゼーシヨンによる HAC内の GCH1-BAC及びアルフ才イド BACのコピー数の推定に用いたグラフ図である。左欄は GCH1 ェクソン 6プロ —ブで得られた強度値である。 GCH1-BAC(0.4, 0.2, 0.1 ng)の入力 DNAと、 HT1080、 HT/GCH2- 10及び HT/GCH5- 18からそれぞれ調製したゲノ厶 DNA(1.0， 0.5 ig)とを GCH1ェクソン 6プローブとハイプリダイズさせた。 O. lngの GCH1- BACDNAの強度値を基準値として使用した。右攔は BACベクタ一プローブで得られた強度値である。 GCH1-BAC(0.5, 0.1, 0.05ng)と、 HT1080、 HT/GCH2- 10及び HT/GCH5- 18からそれぞれ調製したのゲノム DNA(0.5， 0.25/ig)とを BACベクタープローブとハイブリダィズさせた。各プローブで得られたシグナル強度はフジ · イメージアナラィザ一 BAS1000を使用して決定した。

図 7は、 HAC保有細胞株とマウス A9細胞との細胞融合によって得られたハイブリッド細胞を FISH解析した結果を示す図である。 HT/GCH5- 18細胞株を PEGを利用して A9細胞と融合させた。 BS耐性及びゥヮバイン耐性の細胞株を FISHで解析した。メタフェイズ ' スプレッドを BACベクタープローブ（赤）及び Alu反復配列プローブ（緑）と（A)、又は BACベクタープローブ（緑）及びマウス ■ マイナ —サテライトプローブ（赤）と（B) ハイブリダィズさせた。矢印は HACを示す。図 8は、 HACを移入した ES細胞を FISH解析した結果を示す図である。 Aはアルフォイド DNA及び BACベクターをプローブとして検出した結果であり、 Bは GCH1 のェクソン 1領域及び BACベクターをプロープとして検出した結果であり、 C はマウスマイナーサテライト DNAと BACベクターをプローブとして検出した結果である。

図 9は、 ES細胞中での HACの安定性を解析した結果を示す図である。黒塗りのボックスはプラストサイジン S存在下（bs+)で培養した場合における HAC保有細胞の割合であり、白抜きのボックスはプラストサイジン S非存在下（bs-)で培養した場合における HAC保有細胞割合である。

図 1 0 (A)は、 A201F4.3 (1 レーン及び 2 レーン）及び 7c5hTEL (3 レーン及び 4 レーン）を PEGE で分析した結果を示す図である。宿主の染色体に加えて 150kb 又は 100kb にグロビン又はアルフォイド YACが存在するのが認められる（1 レ一ン及び 3 レーン）。 YACを精製、濃縮し（2 レーン及び 4 レーン）、混合した YAC (5 レーン）を HT1080細胞に導入した。図中の Mは分子量マーカーを示す。図 1 0 (B) は、 YACの導入によって得られた形質転換株に対する FISH解析の結果を示す図である。形質転換株に認められたミニ染色体が矢印で示される（上段）。また、 YAC の腕部（緑色：矢じり）とアルフォイド（赤色：矢印）のシグナルが存在する（下段）。 DAPIで染色している（青色）。

図 1 1 は、ミニ染色体を保有する形質転換株に対する FISH解析の結果を示す図である。プローブとして YACの腕部（緑色、矢じり）及びアルフォイド（赤色、矢印）を用いた結果（左上）、同図下段に示されるグロビンの A (緑、矢じり）及びアルフォイド（赤、矢印）を用いた結果（右上）、；8グロビンの B (緑、矢じり）及びアルフォイド（赤、矢印）を用いた結果（左下）、）8グロビンの C (緑、矢じり）及びアルフォイド（赤、矢印）を用いた結果（右下）である。

図 1 2は、ミニ染色体を保有する形質転換株である二つのクローン（C11 及び C29) に対してヒ卜 /3グロビンプローブ（配列番号 5、配列番号 6、及び配列番号 9 ) 又はテロメァ反復配列（配列番号 8の配列が繰り返されてなる約 500bpの配列）をプローブとして行った FISH解析の結果を示す図である。青、緑、赤はそれぞれ DAPしヒト j8グロビン、テロメァのシグナルである。

図 1 3は、 A9細胞とミニ染色体保有細胞の融合により得られた形質転換細胞の FISH解析結果を示す図である。左上欄は DAPI (青）による染色結果、右上欄はヒ卜 ) 8グロビンプローブ（配列番号 5、配列番号 6、及び配列番号 9の混合）によるシグナル（緑）を検出した結果、左下欄はアルフォイドプローブ（配列番号 3 ) によるシグナル（赤）を検出した結果、右下欄はこれらを重ね合わせたものである。アルフォイドのシグナルはミニ染色体にのみ認められる。

図 1 4は、ミニ染色体のファイバー FISH解析の結果を示す図である。上段は; 8 グロビンプローブ（配列番号 5、配列番号 6、及び配列番号 9の混合）を用いた結果、中段はアルフォイドプローブ（配列番号 3 ) を用いた結果、下段は以上の二つの結果を重ね合わせたものである。アルフォイド及び /3グロビンの各シグナルはそれぞれ赤及び緑で表される。

図 1 5は、 HAC 保有細胞におけるグロビン遺伝子の転写量を解析した結果を示す図である。上段は RT- PCR法による解析結果、下段はリアルタイム PCR法による解析結果である。図中の +及び一はそれぞれ HAC保有及び HAC非保有を表す。図 1 6 (a)は、 HAC保有 ES細胞株を用いて作出されたキメラマウスを示す図である。図 1 6 (b)は、 HAC保有 ES細胞を導入した胚を移植したマウス（仮親）から自然分娩により得られた仔マウス（生後 24時間）の各種臓器由来 DNAに対する PCR解析の結果である。 TT2は ES細胞を、 TT2/GCH2- 10は HAC保有 ES細胞を、 brain は脳を、 heartは心臓を、 thymusは胸腺を、 l iverは肝臓を、 spleenは脾臓を、 kidneyは腎臓をそれぞれ表す。また、 cl〜(： 15は各個体を表す。図 1 6 (c)は、 ES 細胞を用いて作出したマウス個体に対する FISH解析の結果を示す図である。アルフォイド配列のシグナル及び BACベクターのシグナルが観察される（矢じり）。図 1 7は、 HAC保有の X0核型 ES細胞株を用いて作出されたキメラマウスを示す図である。

図 1 8 は、哺乳類人工染色体の構築に使用したァクセプター前駆体 BAC-LCR-lox71の特徴部分を示す図である。

図 1 9は、ヒ卜 /?グロビン LCR及び lox部位を含む前駆体を使用して構築された人工染色体において、 EGFP 強度を測定した結果の図である。 HAC：ヒ卜 /3グロビン LCR及び lox部位を含む前駆体を使用して構築された人工染色体、 INT1及び INT 2 ： pEGFP-CIを染色体上のランダムな場所に組み込んだ安定株の中から、 EGFP の蛍光強度の高い順に選択した二つの細胞株。右下のグラフは、各測定結果をグラフ化したものである。発明を実施するための最良の形態

本発明の第 1 の局面は哺乳類人工染色体（mammal ian arti f icial chromosome) の作製方法に関し、環状ベクターを前駆体として用いる方法と線状ベクターを前駆体として用いる方法を包含する。尚、以下の説明において哺乳類人工染色体を MAC ともよび、これにはヒト人工染色体 (human arti f icial chromosome；以下、「HAC」ともいう）が含まれる。

(哺乳類人工染色体の前駆体としてのベクター）

本発明では哺乳類人工染色体（MAC) 前駆体として第 1 ベクター（環状ベクター又は酵母人工染色体）と第 2ベクター（環状ベクター又は酵母人工染色体）が用いられる。第 1 ベクターは哺乳類セン卜ロメァ配列を含み、 MAC の複製及び安定的な維持に必要なセントロメァを供給し、他方、第 2ベクターは機能配列を含み、 MAC に組込まれる機能配列の供給源となる。それに含まれる機能配列が互いに異なる複数種類の第 2ベクターを使用することもできる。即ち、例えば第 1 ベクタ一と、それに含まれる機能配列が異なるベクターを 2種類使用して本発明の MAC を作製することができる。このように複数種類の第 2ベクターを使用すれば、複数の機能配列が発現可能に保持された MACを構築することが可能となる。このことは例えば、協同的に作用する複数の遺伝子などを同時に導入するためのツールとして本発明の MACを利用できることを意味する。第 1 ベクター及び第 2ベクターとして環状ベクター又は線状ベクターが使用される。環状ベクターとしては細菌（大腸菌など）において自律複製できる BAC (b acter i a I art i f i ci al chromosome) 又は PAC (P1 art i f i cial chromosome) を用いることができる。 BAC又は PAC を使用することは、導入操作、増幅、維持などの取リ扱いが容易であり、また様々な種類のものを入手可能であるといつた利点を有する。本発明で使用される環状ベクターは公知の BAC又は PACに必要な改変を施すことにより構築され得る。例えば、 Be l o-BAC ( New Eng l and B i o l a b s i n c . , Bev e r l y, MA 01 91 5-5599) を出発材料として、これに制限酵素処理等によって哺乳類セントロメァ配列の挿入部位を作製し、この挿入部位に別途用意した哺乳類セン卜口メァ配列を挿入することにより、哺乳類セン卜ロメァ配列を含む環状べクタ一 (第 1 ベクター）を構築することができる。一方、機能配列を含むベクター（第 2ベクター）は、そのクローンを含むライプラリーが提供されている場合には当該ライブラリ一から調製することができる。勿論のこと、第 1 ベクタ一と同様に、公知のベクターに遺伝子工学的手法を用いて第 2のベクターを作製してもよい。線状ベクターとしては酵母内で染色体として機能する DNAコンストラクト（酵母人工染色体、以下、「YACJともいう）が使用される。この場合の第 1 ベクターは哺乳類セントロメァ配列、哺乳類テロメァ配列を少なくとも含む。ここで、「哺乳類テロメァ Jとは哺乳類の染色体のテロメァ領域に存在する繰り返し配列をいう。ヒ卜テロメァは 5' - TTAGGG- 3'が繰り返されて構成されており、ヒ卜人工染色体（H AC) を作製する場合にはこの配列の繰り返しを含んでいるセントロメァ配列を用いることが好ましい。第 1 ベクター及び又は第 2ベクターが選択マーカ一遺伝子を含んでいることが好ましい。これらのベクターを用いて卜ランスフォーメーション（トランスフェクシヨン）を行った際に、選択マーカー遺伝子を利用して形質転換細胞を容易に選択することが可能となるからである。いずれかのベクタ一のみが選択マーカ一遺伝子を含んでいることがさらに好ましい。選択マーカーの使用数を削減することにより、 MAC の作製あるいはその利用の過程において必要な各選択操作がより簡便化されるからである。

さらに、第 1 ベクタ一のみが選択マーカー遺伝子を含んでいることが特に好ましい。かかる構成によれば、選択マーカー遺伝子を利用して哺乳類セントロメァ配列が適切に導入された形質転換細胞を選択することができ、即ち染色体として機能する DNAコンストラク卜を保有する可能性の高い形質転換細胞を効率的に選択することが可能となる。その一方で、機能配列を含むベクター（第 2ベクター）に選択マーカーを挿入する必要がなくなることから、選択マーカー遺伝子を含まないクローンの集合からなる市販のライブラリーから調製したベクターをそのままの状態で（即ち、選択マーカー遺伝子を挿入する操作を経ることなく）第 2ベクタ一として使用できるという利点も有する。加えて、第 2ベクターが選択マ一カー遺伝子を含む必要がないことは、その分だけ第 2ベクターに挿入できるインサー卜 DMAのサイズに余裕ができ、結果としてよリ大きなサイズの機能配列を保持する MACの構築が可能となる。

(哺乳類セントロメァ配列）

本発明において「哺乳類セン卜ロメァ配列」とは、哺乳類細胞内においてセン卜ロメァとして機能する配列をいう。哺乳類セン卜ロメァ配列としては、例えばヒ卜染色体のアルファサテライト領域由来の配列を用いることができる。ここでの「アルファサテライ卜領域由来の配列」とはアルファサテライ卜領域の一部又は全部の配列、又はこれらいずれかの配列の一部に改変を施した配列を意味する。ここでの「一部に改変 Jとは、対象となる配列において 1 若しくは複数の塩基を置換、欠失、挿入、及びノ又は付加することをいう。このような改変は複数の領域になされていてもよい。ヒ卜染色体のアルファサテライ卜領域には一般に、 5' -NTTCGN NANNCGGGN-3' (配列番号 1 )からなる CEMP- B boxと呼ばれる配列が規則的間隔で複数個配置されている（Mas画 to et aに NATO AS I Series, vol. H72, Spr i nger-Ver I ag. pp 31-43, 1993; Yoda et al. Mo I. Cel l. Biol . , 16， 5169-5177, 1996)。本発明における哺乳類セン卜ロメァ配列は、好ましくはこの CENP- B boxを高頻度に有する領域を含んでいる。ヒ卜 2 1 番染色体のアルファサテライ卜領域由来の配列を用いることが好ましい。ヒ卜 2 1 番染色体のアルファサテライト領域については詳細な検討がされており α21- 1 と呼ばれる領域が存在する。 α21- 1 領域はアルフォイド 11量体繰り返しュニッ卜と呼ばれる配列を備え、この繰り返しュニッ卜では 5'-NTTCGTTGGAA ACGGGA-3' (配列番号 2) なる CENP- B boxが規則的間隔で複数個配置されている (Ikeno et al. Human Mo I. Genet. , 3, 1245-1247, 1994)。

好ましくは、本発明における哺乳類セントロメァ配列はこのようなアルフォイド 1 1 量体繰り返しュニッ卜を複数有する。ヒト 21番染色体のアルフォイド領域から分離され、同定された配列を配列番号 3 (約 25kbのアルフォイド断片）に示す。セン卜ロメァ配列は、構築された哺乳類人工染色体において適切な機能を有するセン卜ロメァが形成されるのに十分な長さを有する。例えば約 25kb〜約 150kb のサイズ（例えば約 50kb、約 80kb、約 100kb) のセン卜ロメァ配列を用いる。好ましくは約 80kb以下、さらに好ましくは約 50kb以下のセン卜ロメァ配列を用いる。サイズの小さなセントロメァ配列を用いることは、これを含む第 1 ベクターの分離、精製などの操作を容易とし、またクローニング及び/又は増殖時に生じ得る脱落、改変などの確率を低下させる。ここで、後述の実施例で示されるように、環状ベクター（BAC) を用いた例において約 50kbのアルフ才イド DNAをセン卜ロメァ配列として用いた場合においてもセントロメァキネ卜コア構造を適切に形成可能な人工染色体が構築されることが確認されている。同様に、線状べクター（酵母人工染色体）を用いた例において約 80kbのアルフォイド謹をセン卜ロメァ配列として用いた場合においてもセン卜ロメァ /キネ卜コア構造を適切に形成可能な人工染色体が構築されることが確認されている。哺乳類セントロメァ配列は、適当なヒ卜細胞や、 WAV17 等のヒト染色体を保有する融合細胞、又はヒ卜以外の哺乳類細胞から調製され得る。例えば、これらの中のいずれかの細胞をァガロースプラグとして固定した後、制限酵素処理、パルスフイードゲル電気泳動（以下、「PEGEJともいう）等によって目的のセン卜ロメァ配列を含む DNA断片を精製、濃縮する。その後、適当なベクターにクローニングし、使用に供する。

—方、哺乳類セン卜ロメァ配列を保有するクローンを含むライブラリ一を利用できる場合には、これから適宜制限酵素処理等を用いて哺乳類セン卜ロメァ配列を取得することができる。たとえば、 LL21NC02ライプラリー（Lawrence Li vermo re Laboratory) を利用して α 21-Ι アルフォイド断片を取得し、この断片を哺乳類セン卜ロメァ配列として使用することができる。この場合、取得した α 21-Ι ァルフ才イド断片を複数用いて哺乳類セン卜ロメァ配列を構築してもよい。さらには、互いに大きさの異なる α 21-Ι アルフォイド断片を複取得し、これらを組合わせて哺乳類セントロメァ配列を構築してもよい。

(哺乳類複製起点）

一般に哺乳類セントロメァ配列内には一つ以上の複製起点が存在する。従って、通常、哺乳類セントロメァ配列を含む第 1 ベクターには哺乳類複製起点が含まれる。使用する哺乳類セン卜ロメァ配列が哺乳類複製起点を含んでいない場合には、別途、哺乳類複製起点を第 1 ベクタ一又は第 2ベクターに含有させる。但し、第 2ベクターが保持する機能配列が既に哺乳類複製起点を含んでいる場合にはこの限りでない。

(機能配列）

機能配列はそれが発現することによって特定の作用が奏される配列をいい、典型的には目的遺伝子及びその制御領域をコードする配列からなる。本発明の機能配列として、それが発現することによって特定の遺伝子発現の抑制や特定の RNA の働きを抑制する等の機能を有する配列、例えばいわゆるアンチセンス RNAゃリボザィ厶 R NA等をコードする配列を用いることもできる。

目的遺伝子としては種々の遺伝子を採用することができ、ヒ卜グアノシン三リン酸シクロヒドロラーゼ I ( GCH 1 ) 遺伝子、ヒ卜） 8グロビン遺伝子群、 RBや p 53 などの癌抑制遺伝子、 c - my cや p 53などのアポ卜一シス誘導遺伝子、サイ卜カイン、各種増殖因子、抗体、腫瘍抗原等をコードする遺伝子等をその例として挙げることができる。目的遺伝子をコードする配列はゲノム D NAであっても c DNAであつてもよい。

機能配列として、複数の目的遺伝子をコードする配列を含むものを用いることができる。このような配列としては、複数のタンパク質が相互作用して特定の効果が得られる場合において当該複数の夕ンパク質に対応する塩基配列を含むものや、一連の反応系に必要な複数の酵素に対応する塩基配列を含むものを例示することができる。このような場合には、各発現産物に対応する配列ごとにその発現を制御する配列を使用することも可能であるが、全ての発現産物或は一部（二つ以上）の発現産物の発現を一括して制御することが可能な配列を使用してもよい。例えば、複数の発現産物に対応する配列を一つのプロモーター配列の制御下に配置して構成したコンストラク卜を使用することができる。目的遺伝子の配列は例えば公知のライプラリーから調製することができる。目的遺伝子（及びその制御領域）の配列を含むベクタークローンからなるライブラリ一を利用可能な場合には、これから調製される目的遺伝子（及びその制御領域）の配列を含むベクターを本発明の第 2ベクター（又はその作製材料）として用いることもできる。例えば、 CITB (Cal i fornia Insti tute of Technology) Human BAC Libraries, RPC 1-11 (Roswe I I Park Cancer Inst i tute) Human BAC Library (Keio Univerci ty), CITB Mouse BAC Library, RPCI-22 Mouse BAC Library などの BACライブラリーや、 RPCI Human PAC Li braries RPC卜 21 ouse PAC Libr aryなどの PACライブラリー、又は CEPH Human YAC Library, Washington Uni ve rs i ty Human YAC l i brary, W I /M I T 820 YAC Library, Whi tehead I Mouse YAC Ubraryなどの YACライブラリー（以上、 Reseach Geneti cs 社、 2130 Memorial Parkway SW， Huntsvi I le, AL 35801, US) を利用することができる。

本発明ではクローニング許容サイズの大きなベクターを使用することから、構造遺伝子に加えてその制御領域を含む大きなサイズの DMA断片を機能配列として用いることができる。ここでの制御領域は、原則的には目的遺伝子自身の制御配列（染色体で目的遺伝子の制御に直接関与している領域の配列）を意味するが、その機能が維持される限度においてこれに一部の改変を施した配列であってもよい。ここでの「一部の改変」とは、対象となる配列において 1 若しくは複数の塩基を置換、欠失、挿入、及び又は付加することをいう。このような改変は複数の領域になされていてもよい。所望の配列を特異的に挿入するための配列（本発明において、「揷入用配列」という）を機能配列として含む第 2ベクターを用いることができる。このような第 2ベクターを用いれば所望の配列を後から挿入可能な、汎用的な哺乳類人工染色体（MAC) を構築することができる。ここでの所望の配列とは、典型的には所望の遺伝子をコードする配列（好ましくは併せてそめ制御領域コードする配列を含む配列）であるがこれに限定されるものではなく、それが発現することによって特定の遺伝子発現の抑制や特定の RMAの働きを抑制する等の機能を有する配列、例えばいわゆるアンチセンス RNAゃリボザィ厶 RNA等をコードする配列であってもよい。挿入用配列の種類は特に限定されるものではないが、 ΙοχΡサイ卜又は F叮 (FI p Recombination Target) サイト等を好適に用いることができる。例えば ΙοχΡ サイ卜を用いれば、まず loxPサイ卜を有する MACが作製され、これに Cre リコンピナーゼを作用させることによつて部位特異的に所望の配列を導入することができ、最終的に所望の配列を含む MACが構築される。同様に、 FRTサイ卜を有する M ACを作製した場合には Flpリコンビナーゼを利用して最終的に所望の配列を含む MACを構築することができる。尚、 ΙοχΡサイト又は FRTサイト等の一部を改変した配列であっても所望の配列を挿入する機能を有する限りにおいて挿入用配列として使用することができる。改変の例としては、その一部を削除、追加、或は置換などして導入効率を高めたリ又は導入反応のみが特異的に行われるようにすることが挙げられる。哺乳類セントロメァ配列を含む第 1 ベクターと、機能配列としての挿入用配列を含む第 2ベクターの使用割合を調整することにより、作製される哺乳類人工染色体内に組込まれる揷入用配列の数を変えることが可能である。また、このような第 1 ベクターと第 2ベクターとの共導入によって哺乳類人工染色体を作製すれば、作製される哺乳類人工染色体においてそのセン卜ロメァから離れた位置（即ちセン卜ロメァに挟まれない位置）に挿入用配列を組込むことが可能であり、適切に機能する挿入配列を保持した哺乳類人工染色体が構築される。本発明で使用される第 2ベクターがインスレーター配列を有していることが好ましい。ここにインスレー夕一配列とは、ェンハンサーブロッキング効果（隣会う遺伝子の発現が互いに影響を受けない）又は染色体バウンダリー効果（遺伝子発現を保証する領域と遺伝子発現が抑制される領域を隔て区別する）を発揮することによって特徴付けられた塩基配列のことをいう。インスレーター配列を使用することによって、哺乳類人工染色体が保持する目的遺伝子の発現が促進されることを期待できる。一方、後述の実施例に示されるように、上記の ΙοχΡ等の挿入用配列を使用する際にィンスレーター配列を併用すれば、哺乳類人工染色体への目的遺伝子の導入効率が高くなることが判明した。このように、インスレーター配列を使用すれば哺乳類人工染色体への遺伝子導入効率を高めるという効果も奏され、効率的且つより確実に、目的遺伝子を保持した哺乳類人工染色体の構築が可能となる。使用できるインスレーター配列は特に限定されず、既にインスレーターとして同定されている配列は勿論のこと、期待される効果（目的遺伝子の発現促進又は遺伝子導入効率の上昇）を減殺しない限度でそれらの配列に改変を加えた配列などを本発明におけるインスレーター配列として用いることができる。複数のインスレーター配列を併用してもよい。複数のインスレー夕一配列を併用する場合には、一種類のインスレー夕一配列のみを使用しても、複数種類のインスレーター配列を組み合わせて使用してもよい。尚、これまでにインスレーター配列として、ヒト；8グロビン HS1~5、二ヮ卜リ /3グロビン HS4 (chi cken β -glo bi n HS4)、ショウジョゥバエ ■ ジプシーレトロトランスポゾン（Drosophi l a gyp sy retrotransposon), ゥ二 . ァリールスルファタ一ゼ 5 ' フランキング領域（se a urchin 5' f lanking region of ary I su I f atase), ヒ卜 T細胞受容体 α/ δの阻害因子 α ό (blocking element / d of human T - cel l receptor α/δ )、ァフリカツメガエル · 40S リボソーム RNA遺伝子リピー卜オーガナイザー（repeat organizer of Xenopus 40S r i bosoma I RNA gene) 等が知りれている。

インスレーター配列を使用する場合に用いられる哺乳類人工染色体前駆体（第 2ベクター）の具体例としては、機能配列として ΙοχΡ等の挿入用配列を有し、当該揷入用配列の 5 '側にインスレーター配列を有するものを挙げることができる。揷入用配列の 5'側ではなく 3'側にインスレーター配列を配置した哺乳類人工染色体前駆体（第 2ベクター）としてもよく、或いは、挿入配列を挟むように両側にインスレーター配列を配置した哺乳類人工染色体前駆体（第 2ベクター）としてもよい。さらに、いずれの位置に配置する場合においても、複数のインスレ一ター配列を連続的に又は他の配列を介在させて配置することとしてもよい。

(宿主細胞）

第 1 ベクター及び第 2ベクターを導入する宿生細胞としては、その中で両べクター間の組換えが行われるものが使用される。例えばヒ卜線維芽肉腫細胞株である HT1080細胞、 HeLa細胞、 CH0細胞、 K- 562細胞等を宿主細胞として使用することができる。 (哺乳類染色体の作製方法）

本発明の哺乳類人工染色体（MAC) の作製方法は、（1)哺乳類セントロメァ配列を含む第 1 ベクターと、機能配列を含む第 2ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第 1 工程、（2)形質転換細胞を選択する第 2工程、及び（3)選択された形質転換細胞の中から MACを保有する細胞を選択する第 3工程を含む。

第 1 工程における第 1 ベクターと第 2ベクターの導入方法は特に限定されるものではないが、これら二つのベクターを同時に哺乳類宿主細胞に導入することが好ましい。哺乳類宿主細胞内でのベクター間の組換えを効率的に行うためである。また、導入操作が簡便化されるからである。二つのベクターを同時に導入するためには、例えば導入操作に先立って両ベクターを混合しておき、そして宿主細胞への導入を行えばよい。導入に供する第 1 ベクターと第 2ベクターの量比は、機能配列を発現可能に保持した MACが適切に形成されるように、例えば第 1 ベクター：第 2ベクターをモル比で約 1 0 ： 1 〜約 1 ： 1 0とする。好ましくは第 1 ベクター：第 2ベクターを約 1 ： 1 とする。ここで、第 1 ベクターが少な過ぎる場合には活性のあるセン卜ロメァを含む MACが形成されないおそれがあり、他方第 2べクターが少な過ぎる場合には MACに機能配列が取り込まれないおそれがある。一方で、第 2ベクタ一の量を多くすることで効率的に機能配列を取り込ませ、その結果、機能配列を複数コピー保持する MACが構築されることを期待できる。後述の実施例で示されるように、本発明の作製方法によれば目的遺伝子を複数コピー保持する哺乳類人ェ染色体の構築に成功している。目的遺伝子を複数コピー有する MACでは必然的に目的遺伝子の発現トータル量が多くなる。従って、本発明の MACを目的遺伝子の導入用ベクターとして使用する場合において、導入細胞内での高い発現効果が得られる。このことは本発明の MACを遺伝子治療用のベクタ一として用いる場合に特に有益である。薬剤又は薬剤の候補化合物の作用 · 効果を評価するための材料として用いる場合においても同様に有益である。宿主細胞への各ベクターの導入方法は特に限定されず、リポフエクシヨン（Fel gner, P.し et al . , Proc. Nat l . Acad. Sci. U. S. A. 84, 7413 - 7417 (1984) )、リン酸カルシウムを利用したトランスフエクシヨン、マイクロインジェクション（G raessmann, M. & Graessmann, A. , Proc. Nat I . Acad. Sci . U. S. A. 73, 366-370 (1 976))、エレクト口ポーレーシヨン（Potter, H. et al . , Proc. Natl . Acad. Sci . U. S.A. 81， 7161- 7165 (1984))等の方法を採用することができる。宿主細胞内では第 1 ベクターと第 2ベクターとの間で組換えが生じ、その結果として第 1 ベクター由来のセントロメァ配列と第 2ベクター由来の機能配列とを備えた MACが形成される。第 1 ベクターと第 2ベクターを導入した後に形質転換細胞（形質転換体）が選択される（第 2工程）。形質転換細胞の選択は、第 1 ベクター又は第 2ベクターに予め挿入しておいた選択マーカー遺伝子を利用してベクター導入後の細胞を選択的に培養することにより行うことができる。尚、両ベクターを導入後の細胞群から任意に細胞を分離した結果、分離した細胞が形質転換細胞である場合における当該分離する操作も本発明にいう「形質転換細胞の選択」に含まれる。形質転換細胞を選択した後に MACを保有する細胞が選択される（第 3工程）。かかる選択操作は MACに特異的なプロ一ブゃ抗体などを用いた検出法によって行うことができる。具体的には、例えば第 1 ベクターが含む哺乳類セン卜ロメァ配列の少なくとも一部に対して特異的にハイブリダィズするプローブを用いた in s i tuハイブリダィゼーシヨン法によって行うことができる。この工程において第 2 ベクターが適切に組込まれて MACが形成されていることを確認するために、第 2 ベクターに特異的な配列（例えば機能配列）の少なくとも一部に対して特異的にハイプリダイズするプロ一プを用いて同様のハイプリダイゼーション分析を併せて行うことが好ましい。以上において使用される各プローブの検出には蛍光物質、. 放射性物質などを利用できる。プローブの標識に蛍光物質を用いる方法は FISH(F luorescence in situ hybridization)法と呼ばれ、安全かつ簡便に MACを検出できる（Lawrence, J. B. et al. Cel l 52:51-61, 1998; Takahashi, E. et a!. Jp n. J. Hum. Genet. 34:307-311, 1989)。

第 3工程に加えて、機能配列が適切に組込まれた MACが形成されていることを確認する工程を行うことが好ましい。かかる確認工程は、例えば機能配列が目的遺伝子を含む場合には当該遺伝子の発現産物を検出することによって行うことができる。以上の作製方法で得られる哺乳類人工染色体（MAC) は非選択条件下においても極めて安定的に維持される。尚、ここでの「非選択条件」とは、 MAC が存在する細胞のみの生存を可能にするような選択操作を行わない条件をいう。

使用する前駆体ベクター及び宿主細胞の種類等によっても異なるものと予想されるが、本発明の作製方法によれば宿ま細胞への DNAコンストラクト（第 1 べクター及び第 2ベクター）の導入操作後、非選択条件下、約 30 日経過後（約 30継代後）に細胞（集団）の約 95%以上に MACを保有させることが可能であり、しかも MACが 1 コピーのみ存在する状態を維持できる（後述の実施例を参照）。最終的に得られる形質転換細胞（哺乳類細胞）が保有する MACの数は少ないほど好ましく、核あたリーつの MACを保有していることが特に好ましい。本発明の作製方法によれば、効率的に核あたリーつの哺乳類人工染色体を保有する形質転換細胞を得ることが可能である。本発明の他の局面は、以上の方法によって作製される哺乳類人工染色体（MAC) を保有する形質転換細胞（形質転換体）を提供する。かかる形質転換細胞は MAC を他の細胞に移入する際の供給源として利用することができる。また、それ自身を生体に導入するなど、哺乳類人工染色体を生体内に導入するための運搬体として利用することもできる。

(哺乳類人工染色体の性質）

本発明において構築される哺乳類人工染色体（MAC) は以下の性質を備える。即ち、（1 )哺乳類複製起点、哺乳類セン卜ロメァ配列、及び機能配列（目的遺伝子及びその制御領域をコードする配列又は所望の配列を挿入するための挿入用配列）を有する、（2)哺乳類細胞中で複製される、（3)宿主細胞の染色体外に維持される、 (4)細胞分裂の際に娘細胞に伝達される、及び（5)環状又は線状である。 MAC の形態は、環状ベクター（BAC又は PAC) を前駆体として作製した場合はテロメァ配列を含まないために環状となる。他方、線状ベクター（酵母人工染色体）を前駆体として作製した場合は、十分に機能するテロメァ配列がその両端に備えられれば線状形態をとリ、それ以外の場合には環状形態をとるものと考えられる。尚、哺乳類複製起点は哺乳類セン卜ロメァ配列内に存在していてもよい。以上の諸性質を備えることにより、本発明の MACはそれが導入される哺乳類細胞内で染色体として機能しつつ、細胞分裂の際に実質的な構造変化を伴うことなく娘細胞へと適切に分配されて維持される。

また、本発明の MACでは所望の目的遺伝子をその制御領域とともに保持させることができ、目的遺伝子を導入細胞内で効率よく発現させることができる。尚、後述の実施例で示されるように、目的遺伝子として GCH 1遺伝子を使用した例において、染色体上に存在している場合と同様の発現制御が実現されている。本発明の哺乳類人工染色体は、哺乳類細胞以外の細胞（例えば酵母細胞、大腸菌などの細菌）で自律的に複製し分配されることを可能にする DNA配列を有していてもよい。このような DNA配列を有することにより、本発明の MACは哺乳類細胞以外の細胞においても染色体として機能する。従って、本発明の MACをシャ卜ルベクターとして利用し得る。哺乳類セン卜ロメァ配列は CENP- B box配列を含んでいることが好ましい。 CEN P-B box を高頻度に有する領域を含んでいることが特に好ましい。さらには、哺乳類セントロメァ配列がヒ卜 21番染色体のアルファサテライ卜領域由来の配列、特に α21- 1 アルフォイド領域の配列を含んでいることが好ましい。後述の実施例に示されるように、本発明者らは BACを前駆体として用いた系においてヒ卜 GCH1 (EC 3.5.4.16;GCH1) をコードする約 180kbの遺伝子を発現可能に保持するヒ卜人工染色体（human artif icial chromosome: HAC) の作製に成功している。ヒ卜 GCH1 遺伝子の一つは染色体上で 14q22.1- q22.2 に位置し、 60kb 以上に亘る 6個のェクソンから構成される（図 1 ) (lchinose et al. 1995; Hub bard et al. 2001)。 GCH1 は後述の各種酵素反応での必須コファクターであるテ卜ラヒドロビ才プテリンの生合成経路における第 1 段階酵素であり、種々の高等生物に存在している（Nichol et al. 1985; Tanaka et al. 1989; Werner et al.

1990)。テトラヒドロピオプテリンは GCH1、 6 -ピルボイル-テ卜ラヒドロプテリン合成酵素（EC 4.6.1.10; PTPS) 及びセピアプテリン還元酵素（EC 1.1.1.153 SR) による三段階の反応によって GTPから合成される。これらの酵素の中で主要な制御ボイン卜は GCH1 であって、その発現は転写段階においてはサイトカイン誘導の支配下にあり（Werner et al. 1993)、翻訳後段階においてはフィードバック制御タンパク質である GFRPの支配下にある。テトラヒド口ビ才プテリンは芳香族アミノ酸ヒドロキシラーゼ、即ち、フエ二ルァラニンヒドロキシラーゼ（EC 1.1 4.16.2; PAH), ドーパミン合成における第 1 段階かつ律速酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ（EC 1.14.16.3； TH)、セロ卜ニン生合成に関与する卜リブトファン 5-ヒドロキシラーゼ（EC 1.14.16.4; TPH) のナチュラル ' コファクタ一として機能する。テ卜ラヒドロビ才プテリンは一酸化窒素合成酵素（N0S) の三つの分子形のすべてに必須でもある（Kaufman 1993)。 GCH1 活性、テトラヒドロビ才プテリンレベル、及び/又は TH活性の低下が黒質線状体（nigrostriatum) ドーパミンニューロンにおけるドーパミン欠乏の原因となり、そして遺伝的ドーパ応答性ジストニー (dopa - respons i ve dy s ton i a： DRD、セガワ症候君 ( I ch i nose et al. 1994) やパーキンソニズ厶のようないくつかの有名な臨床的症状を引き起こす。したがって、その真の制御領域を含んだ GCH1遺伝子を保持する哺乳類人工染色体は GCH1遺伝子の欠損を修復することに間違いなく有用であって、同時に in vivo における GCH1 の複雑な制御メカニズムについての詳細な研究を容易にするであろう。

(哺乳類人工染色体の移入）

哺乳類人工染色体（MAC)の哺乳類細胞への導入は例えば次の方法で行うことができる。

まず、 MACを保有する宿主細胞から MACを分離し、分離された MACを哺乳類細胞（ターゲット細胞）に導入する。 MAC の分離は、例えば次の方法によって行うことができる。まず MACを保有する宿主細胞の懸濁液を調製し、そして核酸成分を抽出する。その後フイコールなどを用いた密度勾配遠心法によって染色体が含まれる画分を取得する。続いて、フィルタ一等を用いて分子量の小さい人工染色体を分離する。

分離された MACを哺乳類細胞へ導入する方法としてはリポフエクション、リン酸カルシウムを利用したトランスフエクシヨン、マイクロインジェクション、ェレクトロポーレーションなどから適宜好適な方法を選択することができる。細胞融合を利用した以下の方法で MACを哺乳類細胞へ導入することもできる。まず、 MACを保有する宿主細胞と微小核形成能を有する哺乳類細胞とを融合させ、続いて融合細胞の中から微小核形成能を有し且つ MACを保有するハイプリッド細胞（雑種細胞）を選択する。ここで、微小核形成能を有する哺乳類細胞としては、例えばマウス A9細胞 (American Type Cul ture Col lect ion, Manassas, VA 2011 0-2209)、マウス ES細胞、 CHO細胞等を用いることができる。細胞融合は PEG (P olyethlene Glycol)を用いて行うことができる。目的のハイブリッド細胞の選択は、マウス A9を使用した場合を例に採れば、融合に使用した宿主細胞に特異的な選択マーカーとゥヮバインとを利用した選択培養によって行うことができる。次に、選択されたハイブリッド細胞から微小核を形成させる。一般的にはコルセミド処理をして微小核多核細胞を形成させ、続いてサイトカラシン B処理及び遠心処理をして微小核体を得る。微小核体は、 PEG を利用した融合法等によって哺乳類細胞（ターゲット細胞）と融合される。以上の工程によって哺乳類細胞への MACの移入（導入）が行われ、 MACを保有する哺乳類細胞が得られる。

ここでのターゲット細胞としては、ヒト又は非ヒ卜哺乳動物（マウス、ラットなど）の特定組織を形成する細胞（線維芽細胞、内皮細胞、心筋細胞）、生殖細胞 (受精卵を含む）、胚性幹細胞（embryonic stem eel I ： ES 細胞）、胚性生殖細胞 (embryonic germ cel l ： EG 細胞）、組織幹細胞（造血系幹細胞、間葉系幹細胞、神経系幹細胞、骨系幹細胞、軟骨系幹細胞、上皮系幹細胞、肝幹細胞など）などが用いられる。これらの幹細胞に対して特定の組織の細胞へと分化するように誘導処理を施した細胞をターゲッ卜細胞として用いることもできる。このような夕ーゲット細胞としては、例えば神経系幹細胞に血小板由来増殖因子（PDGF)、毛様体由来神経栄養因子（DNTF) 及びトリョードサイロニン（T3 ) を用いてそれぞれニューロン、ァス卜口サイ卜及びオリゴデンドロサイ卜へと分化誘導した細胞、間葉系幹細胞にデキサメタゾン及びァスコルビン酸をなどを用いて骨芽細胞へと分化誘導した細胞、間葉系幹細胞を TGF— の存在下で培養して軟骨細胞へと分化誘導した細胞が挙げられる。本発明の MACを導入する細胞として、魚類（メダカ、ゼブラフィッシュなど）、両生類（アフリカッメガエルなど）、鳥類（ニヮ卜リ、ゥズラなど）など、哺乳類以外の脊椎動物の細胞を用いることもできる。ターゲット細胞への MACの移入は i n v i t ro、 i n v i v o又は ex v i voで行われる。例えば生体内の細胞に対して直接、哺乳類人工染色体（MAC) の移入を行うことにより、又は生体外で MACを移入した細胞を生体に導入することにより、生体を構成する所望の部位（例えば、心臓、肺等の特定の組織）に MACを導入できる。その結果、導入部位において MACに保持された機能配列からの発現が行われる。このように、 MAC を外来遺伝子を生体内へと導入するためのベクターとして利用できる。 MAC はクローニング許容サイズが大きいことから、特に制御領域を含む大きな外来遺伝子を導入するためのベクターとして好適に利用することができる。より具体的には、本発明の哺乳類人工染色体（MAC) は例えば遺伝子治療用のベク夕一として利用され得る。即ち、欠損遺伝子の機能補填を目的として外来遺伝子を導入することや、異常遺伝子の発現を抑制又はその発現産物の作用を抑制する目的で外来遺伝子を導入すること等に本発明の MACを利用することができる。本発明の MACはそれを導入した細胞内で安定して維持されることから、導入遺伝子が安定的、かつ長期的に発現され、優れた治療効果が期待される。また、本発明の MACを利用すれば制御領域を含んだ、サイズの大きな外来遺伝子を導入可能であるから、それを導入した細胞内で本来の制御領域に支配された遺伝子発現を行うことができる。この観点からも優れた治療効果が期待される。また、本発明の MACは所望の遺伝子の機能又はその作用メカニズムを解明するための手段をも提供する。特に、サイズが大きいがために従来のベクターでは遺伝子導入を行うことができなかった遺伝子の機能又は作用メカニズムを解明するための手段を提供する点で有用である。即ち、機能が未知の又は作用メカニズムが未知の遺伝子の研究手段も提供する。特に本発明の MACは、外来遺伝子をその本来の制御領域に支配された発現が可能なように保持できることから、組織特異的発現機構の解析や、マウスなどモデル動物個体に導入したヒ卜遺伝子の発現解析、阻害剤や促進剤の開発などに威力を発揮すると考えられる。後述の実施例で示されるように、本発明者らは、 ES細胞を利用して上記本発明の哺乳類人工染色体（MAC) が導入されたマウス個体（キメラマウス）の作出に成功した。尚、 XY核型の ES細胞を用いたキメラマウス（才ス）の作出に加え、 X0 核型の ES細胞を用いたキメラマウス（メス）の作出にも成功した。これによつて、本発明の哺乳類人工染色体を形質転換動物の作出にも利用できることが確認された。このような成果に基づいて本発明の他の局面では、哺乳類人工染色体が導入されてなる非ヒ卜形質転換動物及びその作出方法が提供される。本発明における非ヒ卜形質転換動物にはマウス、ラッ卜等の齧歯目動物が含まれるがこれらに限定されるものではない。本発明の非ヒ卜形質転換動物はその発生段階で MACを導入することによリ作出される。作出方法としては、 ES細胞を利用する方法や受精卵の前核に直接核酸コンストラク卜（MAC)の注入を行うマイクロインジェクション法などを用いることができる。以下、本発明の非ヒ卜形質転換動物の作出方法の具体例として、マウス ES細胞を用いた方法を説明する。この方法ではまず、 MACを保有する ES細胞を調製する。かかる ES細胞の調製は上述の微小核融合法を利用して行うことができる。即ち、まず所望の構成の MACを保有する細胞（例えば HT1080) を用意し、これを微小核融合能を有する細胞（例えばマウス A9細胞）に融合して MACの移入を行う。その後、適切に MACが移入された細胞からコルセミド処理等によって微小核を形成させる。得られた微小核を、 PEGなどを利用して ES細胞と融合させる。そして融合細胞の中から MACを保有するものを選択する。以上のようにして調製された MAC保有 ES細胞をマウスの胚盤胞（プラストシスト）に導入する。即ち、まず交配後の雌マウスから卵巣ごと子宮全体を取り出した後、子宮内より胚盤胞を採取し、この胚盤胞の胚胞腔内にマイクロインジェクシヨンによって HAC保有 ES細胞を導入する。続いてインジェクションの終了した胚盤胞を子宮偽妊娠マウス（仮親）に移植し、自然分娩又は帝王切開により仔マウス（胎仔）を得る。尚、得られた仔マウスに MACが導入されていることは、仔マウスの毛色の観察や、使用した MACに特異的な配列を有するプローブを用いた DNA解析などによつて確認できる。く実施例 1 > アルフォイド- BACの構築

Belo-BACの Xholサイ卜に M I u卜 Sf i卜 Sac I I リンカーを挿入して pBAC- TANを作製した。 pBAC- TAN の No - Hindi I I サイ卜に、ともにブラスチシジン (Blasticidin)S 耐性遺伝子を含む断片である、 pCMV/Bsd (インビトロゲン）の Not卜 Hindll l 断片（1.3kb)又は pSV2bsr (科研製薬) の Pvu I卜 EcoR I 断片（2.6kb) を挿入することにより pBAC- CMV と pBAC- SVを作製した。 LL21 MC02 ライブラリー (Lawrence Li vermo re Laboratory)から得られたコスミドクローンである Q25F12 を Sf i I消化及び pBAC- TANの Sf ί Iサイ卜へクローニングすることによって約 25kb のな 21- 1 アルフォイド断片 25:配列番号 3 )を単離した。その結果得られた、アルフォイド配列がタンデム状に配列されてなる 50kb又は 100k bのアルフォイドィンサー卜を含んだアルフォイド- BACを Mlul 及び Sacl I /で消化し、続いてアルフォイド断片を pBAC-CMV又は pBAC- SVの Mlul- Sacl I サイ卜にそれぞれ挿入することにより、 50kb又は lOOkbのアルフォイド断片を含むアルフォイド- BACである SV/a 50及び CMV/a 100を構築した（図 3 )。

<実施例 2 > GCH1遺伝子座を含む HACの形成

ヒ卜 21番染色体由来の 11量体高次繰り返しユニット（11 monomer repeating units ：モノマー繰り返しュニッ卜）（Ikeno et al. 1994) からなる α 21-1 アルフォイドを ΗΤ1080細胞に導入することによって効率的に HACを作製することが可能である（Ikeno et aに 1998)。本実施例ではアルフォイド -BAC 及び GCH1- BAC を利用して、 GCH1遺伝子座を含み、正常に制御された遺伝子発現をする複数の HAC を作製した。本実施例で使用した BACを図 3に示した。 CMV/cMOOは lOOkbの α 21-1 アルフォイド配列と選択マーカーとしての CMV- Bsdを含み、そして SV/o;50 は 50kbの α21- 1 アルフォイド配列と SV2- Bsr選択マーカーを含み、上述の方法でそれぞれ構築された。 GCH1- BACは BACライプラリー（Genome sys tems) から取得され、それは GCH1遺伝子を含む〗80kbのゲノム DNA断片を有する。尚、 BAC-DNA の精製は CsCI密度勾配遠心法により行った。

いずれかのアルフォイド- BACと GCH1- BACをモル比で 1:1 となるように HT1080 細胞にリポフエクシヨンでコ卜ランスフエク卜し、形質転換細胞を選択した。具体的には、リポフエクタミン（ギブコ BRL) を使用して 0.5/zgのアルフォイド -BAC と O igの GCm- BAC (186L09, ゲノムシステム）を HT1080 ( 5x10⁵) にコ卜ランスフエクシヨンした。尚、この操作は製品使用説明書に従って行った。形質転換した細胞を 4 g/ml のプラスチシジン S (BS、科研製薬）で選択し、 10 日後にコロニーを採取した。染色体外分子として HACが存在していることを検出するために、 α21- 1 アルフォイド DNAと BACベクターをプローブとして用いた FISH法で BS-耐性細胞株を分祈した。具体的には、メタノールノ酢酸（3:1) による固定化後のメタフェイズ■ スプレッド（分裂中期染色体）をスライドガラス上に調製し、常法にしたがって FISHを行った。 HACを検出するために、プローブとしてピオチン標識 α21- 1 アルフォイド DNA (11- 4) (Ikeno et al. 1994) 及びジゴキシゲニン標識 Be I o- BACを用いた。この二色 FISHにおいてはピオチン標識 DNAを FITC結合アビジンによつて可視化し、他方ジゴキシゲニン標識 DNAを TRITC結合抗ジゴキシゲニン（ベーリンガーマンハイム）によって可視化した。ツァイス顕微鏡に設置した CCD力メラを用いて写真撮影した。 IPLab及び Adobe Photoshop 6.0を用いてイメージ加工した。

FISHの結果、 CMV/cx 100及び GCH1- BACのコトランスフエクションによって得られた 16の形質転換細胞株の中の 1 つ（HT/GCH2- 10)、及び SV/ <¾ 50及び GCH1- BAC のコ卜ランスフエクシヨンによって得られた 17の形質転換細胞株の中の 3つ（その中の一つは HT/GCH5- 18)は、分析した細胞の 95%以上において HACのコピーを核あたり一つ有していた。残りの細胞株では、導入された BACが HT1080の染色体に組込まれるか、又は FISH解析においてシグナルが検出できないものであった。構築された HACが GCH1遺伝子のゲノム断片を含むか否かを検討するために、 HAC を含む 4つの細胞株に対して GCH1遺伝子のェクソン 1及びェクソン 4〜6に対するプローブ（図 3 ) をハイブリダィズさせた。ェクソン 1用のプローブにはェクソン 1 を含む 13kbのビ才チン標識断片を、ェクソン 4~6用のプローブにはェクソン 4、 5及び 6を含む 8kbのジゴキシゲニン標識断片を用いた。

CMV/ 100 及び GCH1-BAC のコ卜ランスフエクシヨンによって得られた HT/GCH2- 10細胞株内の HAC上、及び SV/ α 50及び GCH1- BACのコ卜ランスフエクシヨンによって得られた HT/GCH5- 18細胞株内の HAC上において両プローブのシグナルがそれぞれ検出された（図 4)。これらの HAC上に検出された GCH1 シグナルは HT1080の染色体上の内在性遺伝子のそれよリも強いものであった。 HT/GCH2-10 及び HT/GCH5- 18のいずれにおいても導入遺伝子が HT1080の染色体内に組込まれたのは少数の細胞（5¾！未満）であったので、これらの細胞株は核あたり一コピーの HACを保有するようにサブクローニングして、それ（サブクローニングした細胞株）を更なる検討の対象として用いた。

<実施例 3 > HAC のセントロメァ /キネ卜コア構造及び有糸分裂における安定性

HAC のセン卜ロメァ /キネ卜コア構造を調べるために、必須セントロメァ /キネ卜コアタンパク質である CENP- A及び CEMP-E (Palmer et aに 1991； Yen et al . 1991； Ho龍 an et al. 2000) の存在を HT/GCH2- 10及び HT/GCH5- 18のメタフェイズ■ スプレッドを用いて間接免疫蛍光法で調べた。尚、間接免疫蛍光法は次のように行った。まず、低張処理及び 1¾パラホル厶アルデヒド固定化細胞を抗 CENP - A 抗体（Ando et al. 2002) 又は抗 CEMP- E (Santa Cruz) 抗体とともにインキュべ一卜した。各抗体の局在については FITC結合抗マウス IgGで可視化した。次の FISH解析分析のために、処理後の細胞を 1¾!パラホルムアルデヒドで固定し、続いてメタノール酢酸（3:1) で固定した。

間接免疫蛍光法による分析の結果、一対の姉妹染色分体に対応して対を形成するように CENP-Aシグナル及び CENP- Eシグナルが各 HAC上に検出され、そしてそのようなシグナルはすべての内在性染色体のセン卜ロメァにおいても同様に検出された（データ示さず）。次に、選択を行わない条件下における HT/GCH2- 10細胞株及び HT/GCH5- 1 8細胞株が保有する HACの有糸分裂における安定性を検討した。 HACの安定性は、それを保有する細胞を非選択条件下で約 30 日間培養することによリ評価した。具体的には、 BS選択を行わない条件下、培養 1 0 日後、 20 日後及び 30 日後の各細胞株からメタフェイズ■ スプレツドを調製し、 HACの存在を F I SHで分析した。サンプル日毎に各細胞株から調製された 50個の伸展染色体を分析し、 HACを保有する細胞の割合を決定した。 HAC の損失割合は次の式によって計算した。即ち、 N_n=N₀ X (1 -R) ⁿ、但し、 M_Dは選択条件下において HAC を保有するメタフェイズ ' スプレツドの数、 N„は非選択条件下、培養 n 日後において HACを保有するメタフェイズ ' スプレッドの数である。尚、 F I SH解析は上述の方法と同様に行った。非選択条件下、培養 30 日後において、 HT/GCH5- 1 8の分裂中期細胞の 95%が、また HT/GCH2- 1 0の分裂中期細胞の 80%が HACを保有しており、 HACのコピー数が非選択条件下で一つに維持された。いずれも細胞株においても宿主染色体への組み込みは観察されなかった。非選択条件下、培養 30 日後において HACを保有する細胞の割合を基に一日当たりの染色体損失を算出した。 HT/GCH5- 1 8及び HT/GCH2 - 1 0 におけるその値は、それぞれ 0. 2%及び 0 · 5ί¾であった。これらの結果は、各細胞株において HAC上に活性のあるセントロメァ /キネ卜コア構造が形成され、各 HAC が有糸分裂を通して安定に維持されたことを示すものである。 <実施例 4 > HACの DMA構造 HT/GCH2-10 内及び HT/GCH5- 18内の各 HACが環状であるか線状であるかを決定するために、プローブとしてテロメァ配列及び BACベクターを用いて FISHを行つた。 HAC上にテロメァシグナルは検出されず、他方で BACベクターのプローブでは染色された。これに対して、宿主細胞である HT1080由来の染色体の末端ははつきりとした斑点状に染色された。予想された通り、 BAC 由来 HAC は環状構造であると考えられた。次に、 HT/GCH2- 10、 HT/GCH5-18, 及びトランスフエクシヨンを行っていない Η 080細胞からそれぞれ単離した DNAを制限酵素処理することによリ HACの DNA 構成を分析した。各ゲノム DNAサンプル（5μ§;) を BamHI又は Stul で 4時間消化した後、常法に従ってゲル電気泳動に供した。そしてゲル内の DNAをナイロン膜に転写した後、 GCH1 ェクソン 6 (2. Ikb)から調製された ³²P標識 DNAプローブ（ェクソン 6 プローブ）及び GCH1 の上流領域（1.4kb、 GCH1-BACでの位置 595-1959) から調製された ³² P標識 DNAプローブ（USプローブ）をハイブリダィズさせた。その結果、 USプローブによって検出された BamHI 断片のサイズは、内在性 GCH1 遺伝子由来のものが 5. Okb、 GCH1- BAC由来のものが 3.5kbであった。これら 5.0kb 及び 3.5kb断片は HT/GCH2- 10及び HT/GCH5-18から調製された DNAにおいてほぼ等しいシグナル強度で検出された（図 5 (A))。一方、ェクソン 6プローブによつて検出された Stul 断片のサイズは、内在性 GCH1 由来のものが 24· 5kb、 GCH1-BAC 由来のものが 14.4kbであった。これら 24.5kb及び 14.4kb断片は HT/GCH5- 18から調製された DNA においてほぼ等しいシグナル強度で検出されたが、一方で HT/GCH2-10から調製された DNAについては内在性 GCH1 由来の断片に加えてサイズが異なる 3種類の断片が検出された（図 5 (B))。これらの結果は、本実施例において使用した HT1080細胞の核型が 3πであるので、 HT/GCH5- 18内の GCH1 保有 4

42

HACがトランスフエク卜された GCH1- BACDMAの約 3 コピーの集合によって構築されたことを示唆するものであり、一方で HT/GCH2- 10では GCH1 ェクソン 6の末端領域において再配列が生じ、しかし USプローブによって認識されたバンドの強度によって判断されるように、おそらく GCH1- BACを 3 コピー保有していることを示唆するものである。 HT/GCH2- 10内の GCH1 転写産物を RT- PCRで分析したところ、 GCH1遺伝子の内部再配列が確認された（データ示さず）。

HT/GCH2-10 と HT/GCH5- 18 内の GCH1- BAC及びアルフォイド BACのコピー数を GCH1ェクソン 6及び BACベクターをそれぞれプローブとして用いたドット八イブリダィゼーシヨンによって決定した。 HAC に含まれる各 BACの相対コピー数についてはハイブリダイゼーションのシグナル強度値から推定した。ここでの各シグナル強度値については各 DNAプローブを用いて決定し、 0. Ingの GCH1- BACDMAのシグナル強度値を基準にして標準化した（図 6 )。 GCH1 ェクソン 6 をプローブとして用いた場合には、 HT/GCH2-10及び HT/GCH5- 18から調製された DNAでは 0.5 で、また HT1080から調製された DNAでは 1 gで O. lngの GC - BACDNAと等しいハイブリダィゼーシヨン強度値を示した（図 6左欄）。本研究で使用した HT1080の核型が 3nであるので HT1080の染色体内において GCH1 遺伝子が 3 コピ一存在し、そして HT1080 から調製した DNA のシグナル強度値と等しい値が HT/GCH2-10及び HT/GCH5-18から調製した場合には半量の DNAで得られたという結果を考えれば、 HT/GCH2-10及び HT/GCH5- 18は GCH1遺伝子を 6 コピー（即ち、染色体上及び HAC上にそれぞれ 3 コピー）含有しなければならない。 BACの合計コピー数を BAC ベクタ一プローブを用いて得られた強度値から推定した。

HT/GCH2-10及び HT/GCH5- 18から調製された DNAでは 0.33 Sで 0· 1 ngの GCH1 -BAC DNA と等しいハイブリダィゼーシヨン強度値を示した。一方予想されたように、 HT1080から調製された DNAではシグナルが検出されなかった（図 6右欄）。それ 1134

43 故に、両 HACは GCH1遺伝子のコピー数のおおよそ 3倍の BACベクターのコピー数を有する。したがって、全 BACベクターのコピー数は細胞あたり約 9のはずである。即ち、 GCH1遺伝子の 3 コピーは GCH1- BACのかたちで存在し、 BACの残りの 6 コピーは両 HACにおいてアルフォイド BACのかたちで存在しているはずである。

<実施例 5 > HAC保有細胞株のマウス A9細胞への導入

クローン化したアルフォイド DNAを使用することによる、 HACの de novo形成がヒト線維芽細胞株である HT1080 内で成功している。神経細胞株における GCH1 遺伝子の正常な発現を確認するためには、 HT1080内に構築された HACを神経細胞株内に導入する必要がある。

微小核体介在性染色体導入（MMCT〉 (Fournier et al. 1997) を可能とするために HAC保有細胞株（HT7GCH5- 18) とマウス A9細胞株を PEGを用いて融合した。即ち、 HAC保有細胞株（5x10⁵)及びマウス A9細胞（5x10⁵)を共培養し、そして PEG/DMS0 溶液（シグマ）内で融合させた。続いて BS及びゥヮバイン（Ouabain)耐性細胞をそれぞれ BS (2.5 ig/ml) 及びゥヮバイン（3μΜ) で選択し、 BS及びゥヮバイン耐性細胞株を F I S Ηで分析した。 H A C及びヒ卜染色体を同定するためにそれぞれ B A C ベクタープローブ及び Alu反復配列プローブをメタフェイズ ' スプレツドにハイブリダィズさせた（図 7 (A))。結果、融合細胞株の一つである F/GCH5- 18は 8-10 個のヒ卜染色体とともに HACのコピーを 1 又は 2以上含んでいた。各融合細胞内の HACは非選択条件下で有糸分裂を通して安定して維持され、一日あたりの染色体損失は約 1%であった（データ示さず）。マウス細胞株内でのヒ卜染色体の有糸分裂における安定性は時として、マウス染色体のセン卜ロメァに位置し、機能的セン卜ロメァ配列として作用すると考えられているマイナーサテライト DMA を融合に供されるマウス細胞から獲得することによって得られる (Shen et al. 1997)。そこで、 HAC上のマウスマイナーサテライト DNAの存在の有無を FISHで調べた。 HAC上にマイナーサテライ卜 DNAのシグナルは検出されず、一方でマウス染色体のセントロメァでは強いシグナルが検出された（図 7 (B))。融合細胞株はコルセミド処理の条件で微小核体（マイクロセル）を形成することが可能であった（データ示さず）。それ故に、 HACは神経細胞株に導入可能であると考えられる。

<実施例 6>

HAC が保有する大きなゲノ厶断片内の導入遺伝子からの正常に制御された遺伝子発現が期待された。 HAC形成に使用された GCH1- BACは GCH1 ェクソン 1の 5'側上流領域から始まる lOOkbを越えるゲノム配列を含んでいた。そこで、 HT1080及び HACを保有するその派生株における GTPシクロヒドロラーゼ I (GCH1) 活性を測定した。先の報告によれば、線維芽細胞株における GCH1活性はほとんど検出されないが、 I F N -ァの誘導によってその活性は上昇するであろうと予測された

(Werner et al. 1990)。そこで、 HT1080、 HT/GCH2- 10及び HT/GCH5- 18における GCH1活性を IFN-ァの存在下及び非存在下で分析した（図 2)。尚、 GCH1活性の測定手順は次の通りとした。 IFN-_T非含有又は含有（ 250U/ml) の培養液を用いて 48 時間各細胞を培養した。培養後の細胞をトリプシン処理し、その後 PBS

(phosphate-buffered sal ine) で洗浄し、続いて 0.3M KCI、 2.5m EDTA, 及び 10%グリセロールを含む 0.1 M T r i s- HC I (pH 8 · 0)に溶解した。 GCH1活性の測定は既述の方法（Hibiya et al. 2000) に従った。

GCH1- HACを保有しない HT1080では IFN-ァ誘導をしない条件において GCH1活性はかろうじて検出できるレベルであった。一方、その活性は IFN-ァの添加によつて 15倍に上昇した。 HT/GCH2- 10細胞株では IFN-ァ誘導をしない条件において、 HACを保有しない HT1080の検出値の 3倍の GCH1 活性が認められた。 IFN-ァ誘導後は 30倍近くの活性の上昇がみられた。これに対して HT/GCH5- 18では IFM-了の非存在下において GCH1活性は 70倍にまで上昇し、 IFN-ァを添加することで更に約 5倍の活性の上昇がみられた。いずれの HT/GCH- HAC細胞株においてもその程度は異なるものの GCH1 活性の上昇が認められ、これは染色体構造及び/又は HAC 内の DNA 再配列における相違を反映したものであると考えられる。また、両 HT/GCH- HAC細胞株は依然として I FN-ァ誘導に感受性であって、それは真の染色体上の GCH1遺伝子の発現における応答性と同様であった。以上の実施例で示したように、アルフ才イド- BAC及び GCH1-BAC を約 1 ： 1 の DNA 割合で用いた簡易なコ卜ランスフエクシヨン法によって、 GCH1 遺伝子 (GCH1-HAC) を含む大きな DNA断片を含有した HACを得ることに成功した。この GCH1-HACはテロメァを含まない環状構造にも拘わらず、非選択条件下、 30継代以上の後においても 1 コピーが存在する状態に維持された。これは HACが細胞周期ごとに一度複製され、そして正確に娘細胞に分配されることを示唆するものである。 HAC はサイズがメガベース（cytological ly megabases in size) であって、トランスフエク卜された BAC DNAよりも約 10倍大きい。

HACの特性及びその de novo形成のメカニズムを調べるために HACの DNA構造を分析した。 BAC コンストラクトではレアカッター（制限酵素）切断部位のほとんど全てがメチル化されること、及び使用される細胞株が内在性の GCH1遺伝子座を含むことから、 GCH1遺伝子の全領域を対象とした制限酵素分析は困難であった。それ故に、我々は BACベクターと GCH1遺伝子座との連結部位に相当する領域を対象に制限酵素分析を行った。その結果、得られた二つの細胞株内の GCH1- HACはその構成分子として GCH1- BACを 3 コピーとアルフォイド- BACを 6 コピー含有して 3011134

46 いた（図 5、 6 )。 HAC形成の正確なメカニズムは不明であるが、 GCH1-HACは導入した DMAの多量体から構成され、これは導入分子としてアルフォイド- YAC又はァルフォイド -BACのみ（データ示さず）を用いて形成された HAC(lkeno et al. 1998) に類似するものであった。 HAC の形成の際に別個の BACの会合（集合）を伴うという事実は、 BAC分子の多量体化が BAC DNA 自身の増幅に加えて非特異的組換えに媒介され得ることを示唆した。大きなヒ卜ゲノム DNAを含む HACの形成については、過去に 140kb又は〗62kb の HPRT遺伝子座を使用した例が報告されている（Grimas et al. 2001； ej ia et al. 2001)。彼らは相補性に依存する HAT培地内において HPRT遺伝子欠損 HT1080 細胞株内に HPRT遺伝子を含む HACを得ている。組織及びステージ特異的な発現をする遺伝子（即ちハウスキーピング遺伝子ではない遺伝子）に対してはこのようなアプローチの HT1080 細胞における実現性は低いであろう。本実施例によれば BACに挿入された 50kb程度の小さな α21- 1 アルフォイド DNAによって HAC (セン卜ロメァ /キネトコア）を形成できることが示され、一方で 50%の HACが導入遺伝子を含んでいたことから、選択マーカ一を有しない大きな導入遺伝子を含有する BACを効率的に HACに組込むことができることが示された。したがって、 50kb のアルフォイド DNAを含むアルフォイド- BACと、直ちに利用可能な BACライブラリ一をそのまま利用することによリ、大きな所望のゲノム領域を含む HACを形成することが可能であるといえる。導入遺伝子が完全な状態であることは H A Cの形成の後に確認されるであろう。

CM プロモーター支配下の Bsd遺伝子を有する形質転換細胞の選択は BS耐性細胞の数を増加させるが、 HAC又は宿主染色体上への組込みに対する FISHシグナルは多くの形質転換細胞で検出されなかった（図 1 )。アルフォイド及び BACベクタ一配列をプローブとして用いたサザンハイプリダイゼーシヨン分析によって、こ " れらの細胞株は染色体のみに組込まれた Bsd遺伝子を保有することが示唆された。したがって、高発現プロモーターによって発現される様に組込まれた選択マーカ一は、 HAC 保有細胞株のスクリーニング用としては好ましいものではないと言える。遺伝子発現は染色体構造の影響を受ける。染色体への導入遺伝子の組み込みの結果、位置効果による斑入り（PEV) (Karpen 1994) として一般に知られている現象であるジーンサイレンシングがしばしば起こる。最近の分子学的解析によって、リジン 9上のヒストン H3のメチル化が HP1のクロマチンへのターゲティングの原因となり、そしてへテロクロマチン化及び遺伝子発現の抑制が引き起こされることか'報告されている（Platero et al. 1995; Bannister et al. 2001； Lachner et al. 2001 )。酵母及びハエにおいてセントロメァ /キネ卜コア又はその近隣におけるジーンサイレンシングも報告されており（Karpen & Al Ishi re 1997)、このようなジーンサイレンシングは哺乳類細胞でも生ずるものと予測された。最近本発明者らは、 HAC のアルフォイド配列内にひとたびセン卜ロメァ /キネ卜コア構造が形成されると、たとえ高発現プロモーターの制御下であっても HAC内に組込まれた短いマーカー遺伝子の発現が強く抑制されることを示した（Abe et al. 投稿中） _c したがって、 HAC 内で導入遺伝子を発現させようと思えば、セン卜ロメァ Zキネ卜コア構造との関係においてトポロジー的な問題を解決する必要がある。

HACからの GCH1 遺伝子の発現は GCH1遺伝子座又はその近隣のクロマチン構造と栢互に関連しているのかもしれない。そこで本発明者らはセン卜ロメァ /キネ卜コア構造がアルフォイド配列部分にのみ形成されたのか、それとも GCH1遺伝子座内へと拡がったのかを検証した。 CEMP- Aは機能的セントロメァ /キネ卜コアに必須のタンパク質であって、セントロメァ特異的ヌクレオソー厶のヒストン成分を構成するので（Paler et al. 1991； Howman et al. 2000)、我々は HACのクロマチン構造を抗 CENP- A抗体を用いたクロマチン免疫沈降（ChlP) 法（Ando et al. 2002)で分析した。 ChlP法は次のように行った。まず、 HT/GCH5- 18細胞株（5x10⁷) の核を単離し、 WB (20m HEPES(pH 8.0), 20mM KCI、 0.5mM EDTA、 0.5mM ジチ才スレイトール、 0·05ηιΜ フエ二ルメチルスルフォニルフルオリド）に溶解した。

Nase 消化後、可溶化されたクロマチンを既述の方法（Ando et al. 2002) に従ぃ抗 CENP- A抗体で免疫沈降した。

HeLa 細胞及び HT1080細胞を使用したそのような分析において全免疫沈降 DNA 中の 60〜80¾がアルフォイド配列に富んでいた。抗 CENP- A抗体を用いた分析の結果、全免疫沈降 DNA中において GCH1-HAC内のアルフォイド配列は豊富に存在することが認められたが、 GCH1領域はほとんど存在していなかった。これに対してァルフォイド配列からおよそ 3kb離れて存在する BACベクター配列もまた免疫沈降され、これによつてアルフォイド配列部分にセン卜ロメァ /キネ卜コア構造が形成され、周囲のアルフォイド配列でない領域に拡がったことが示唆された（デー夕示さず）。セン卜ロメァ /キネ卜コア構造が HAC内の GCH1遺伝子座に侵入することは、おそらく上流制御配列に備えられる未知の制御メカニズムによって阻止されたものと考えられる。 GCH1遺伝子はテ卜ラヒドロビ才プテリンの生合成経路における、第 1 段階かつ律速酵素をコードレ（Nichol et aし 1985)、当該酵素は芳香族アミノ酸ヒドロキシラーゼ（PAH、 TH、 TPH) 及び一酸化窒素シン夕一ゼのコファクターであって高等生物に存在する（Kaufma 1993)。 GCH1 遺伝子はドーパ応答性ジストニア（DRD Zセガワ病）（ lchinose et al. 1994) におけるドーパミン欠損の原因遺伝子である。 TH遺伝子の突然変異とともに GCH1 遺伝子の欠損が生ずると重篤な初期段階 3011134

49 ジストニアパーキンソニズ厶が引き起こされる（lchinose et al. 1999)。ヒト及びマウスの GCH1 遺伝子の上流制御配列についてはこれまでのところ限られた数の解析が行われたにすぎないが、 CCAATボックス及び TATAボックスが保存されていることが報告されている（ I chinose et al · 1995; Hubbard et al . 2002)。様々なげつ歯類及びヒ卜細胞において GCH1 遺伝子の発現が IFN-ァによって誘導され得ることが確認されている（Werner et al. 1990)。しかしながら、 IFN-ァのシグナル伝達を含んだ正確なメカニズムは未知のままである。ヒ卜 /3グロビン等いくつかの遺伝子の発現は、安定した組織特異的な開クロマチン構造の開始及び維持を担う遺伝子座調節領域（LCR) によって制御されることが知られている（Festentein et al. 1996; Mi lot et al. 1996)。本実施例で使用した GCH1- HACは GCH1遺伝子を含む〗80kbのゲノ厶断片を保持し、それ故に組織特異的発現のため及び近隣セン卜ロメァによる発現抑制効果を防ぐために必要な制御配列を含んでいると考えられる。上述のように、本発明者らは IFN-Tの存在下及び非存在下において HACからの GCH1遺伝子の発現を GTPシクロヒドロラーゼ活性を指標に測定した（図 2)。 IFN-ァの非存在下では、 HAC保有細胞株である HT/GCH2-10の GCH1 活性は HT1080のそれよりもほんの少し高いものであった。また、 IFN-ァの添加によって GCH1活性は約 30倍上昇した。もう一つの細胞株であつて HT1080の 2倍の数の GCH1遺伝子を保有する HT/GCH5-18の GCH1活性は IFM- ァ非存在下において HT1080のそれよりも 70倍高いものであった。そしてその活性は IFN-ァ誘導によってさらに 5倍上昇した。上述のように GCH2- 10HAC上の GCH1 遺伝子のいくつかは構造的異常を有することが示唆されたので、 HT/GCH2- 10 と HT1080 との間の僅かな活性の相違は完全な GCH1 遺伝子のコピー数が少ないことに対応するものであると考えられる。これらの結果によって、 GCH1の遺伝子発現は HACにおける GCH1遺伝子座に構築されるクロマチン構造の違いに影響を受ける一方で、 GCH1遺伝子の発現は依然として IFN-ァに応答性を有することが示されたしかしながら、 IFN-ァ誘導後の最終 GCH1活性レベルは細胞株間で同等であった。このことは GC 活性を適当な範囲内に維持するための複雑な細胞内制御システ厶が存在することを示唆するものである。 in vivoにおける GCH1発現の複雑な制御メカニズムを理解するために GCH1-HACは好適なシステムであると言える。アデノ随伴ウィルス（AAV) ベクターはヘルパーウィルス依存的増殖感染による遺伝子治療用として頻用される。 AAVベクターのクローニング許容サイズは通常、遺伝子発現に必要なそれ自身の制御配列を含まない cDNA を運搬するために十分なものに限られている（Dong et al. 1996)。 GCH1 はチロシンヒドロキシラーゼ (TH) 及び芳香族 Lアミノ酸デカルボキシラーゼ（AADC) とともに効率的なドーパミン生産に必須の酵素である。線状体において AAVからこれら三つの酵素を発現させることによって、霊長類パーキンソン病モデルにおいて比較的長期の行動回復が認められている（Muramatsu et al. 2002)。

最近、ェプスタイン ·バーウィルス (EBV) ベースのェピソー厶状ベクターは限られた哺乳類細胞株に対して HPRT遺伝子（115kb) を導入する能力があり、導入された遺伝子の発現は抑止されなかったとの報告がなされた（Wade- Martins et al. 2000)。しかしながら EBVベースのベクターは非選択条件下では HACよりも急速に失われていき、その複製はウィルス卜ランスァクチべ一夕である EBNA1の存在に依存する。したがって、臨床的遺伝子治療における EBVベクターの安全性についてはさらなる検討が必要である。 HAC は上記の遺伝子導入用ベクターについての問題を解決し得るものであり、さらに安全性の面でも有利なものである。本実施例において大きなゲノ厶遺伝子座を保持した HACは染色体外において維持され、調節された遺伝子発現を長期にわたって示した。それ故に TH、 AADC及び GCH1 を JP2003/011134

51 含有する HACはパーキンソン病の有望な治療戦略を提供し得る。

しかしながら、 BACを利用した HACの de novo形成がそれほど効率的に行われないこと、 HAC形成のための特定の細胞株が必要であること、及び HACのサイズが大きいことから、細胞又は組織の必要な部位に HACを輸送することには困難が伴う。 HACを遺伝子導入ベクターとして簡便に利用するためには HT1080内に構築された HACが適当な細胞株内へと導入されなければならない。 HACは微小核体（ミクロセル）の形成を可能とするマウス A9細胞を用いた關 CTによって導入することができる（Fournier et al. 1997)。上述の実施例に示したように、本発明者らは非選択条件下で HAC の検出し得る構造変化を伴うことなく有糸分裂において HACを安定的に維持するマウス A9細胞株を樹立することに成功した。この HACは A9細胞株から他の細胞株へと容易に導入可能であると考えられる。以上の実施例により、 GCH1遺伝子をそれ自身の制御領域とともに保持する HAC を GCH1- BAC及びアルフォイド -BACのコ卜ランスフエクションによって構築できることが示された。この GCH1- HACは制御された状態で GCH1遺伝子を発現し、したがって in vivoで GCH1の制御メカニズムを研究するための好適なシステムであることが証明された。 GCH1- HACについての更なる研究によって、セン卜ロメァ/ / キネトコァを構築するのに最低限必要なアルフォイド配列の数、 GCH1遺伝子の制御された状態での発現に必要な上流領域の構造、及び制御領域における転写因子の活性部位が明らかにされるであろう。本実施例で得られた結果はモデル動物又は臨床試験において将来 GCH1- HAC が遺伝子運搬ツールとして有用であることをも示すものである。

<実施例 7 > 微小核融合法による HACの ES細胞への移入

GCH1遺伝子を保持した HACを含有する HT1080細胞を細胞融合法でマウス A9細胞へ移入した。まず実施例 5と同様の手順で、 HAC 保有細胞株（HT/GCH2- 10) とマウス A9細胞を融合させ、 BS耐性且つゥヮバイン耐性の細胞株を選択した。選択された細胞株 F(A9/2- 10)4に終濃度 0.05yg/ml となるようにコルセミドを加えた後、 37°C、 5¾!C0₂の条件で 72hr培養した。卜リプシン処理によリ細胞を回収し、血清を含まない D-MEM培地に懸濁した。サイトカラシン Bを 20yg/ml になるように加えて 37°C、 5m in.放置した後、予め 37°Cに保温しておいた Percol を等量加えた。続いて遠心処理（ 15, 000rpm、 90min. ) を行い、微小核を回収した。回収した微小核を血清を含まない D- MEM 培地に懸濁した後、再び遠心処理（2，000rpm、 5min. ) を行い、得られた沈殿（微小核）を再度、血清を含まない D- MEM培地に懸濁した。この操作を 2回繰り返した後、微小核を含む沈殿に、卜リブシン処理にょリ回収した ES細胞 TT2 (C57BL/6XCBA) を加えて 1， 500 rpm、 5min.の遠心処理を行い、細胞と微小核を沈殿させた。上清を捨てた後、血清を含まない 1mlの D- MEM 培地を加えて懸濁させた。この状態で 10分間静置（室温）した。続いて、 1， 500 rpnu 5min.の遠心処理によって細胞と微小核を沈殿させ、上清を捨てた後に 1ml の PEG1500 (ロッシュ）を加えて懸濁させた。室温で 90秒間静置した後に血清を含まない D- MEM培地を 5ml 加え、遠心処理（1，000rpm、 5min. ) し、細胞を回収した。回収した細胞に血清を含まない D-MEM培地を 10ml 加えた後、 1, 000rpm、 5min. の遠心処理による洗浄を 2回行った。洗浄後の沈殿を ESM培地（D-MEM+非必須ァミノ酸（ Inv rogen ) +0. Im /3 - メルカプトエタノール +10³U/ml ESGR0(Chemi con)+ヌクレオシド）に懸濁し、得られた細胞懸濁液を、マイ卜マイシン C処理により増殖を停止させたフィーダ一細胞 SLB (角川祐造博士（藤田保健衛生大学： Fuj i ta Heal th Universi ty School of Medicine) より供与）上に播種した。培養開始から 24 時間経過した時点で、ブラス卜サイジン S を終濃度 4pg/ml で含む ESM培地に交換して培養を継続した。この選択操作を開始後 5 日目 T JP2003/011134

53 に ESM培地（4yg/m l ブラストサイジン S、 1 xHAT (S i gma) ) に交換し、更に 5日間培養を継続した。

得られたコロニーを単離し、マイ卜マイシン C処理により増殖を停止させたフィーダ一細胞 S LB上（24穴培養皿）に播種した。増殖した細胞の中から PCRを利用して BAC DMAを保有する細胞株を選択し、アルフォイド DNA、 BACベクター、 GCH 1 遺伝子、及びマウスマイナーサテライト DNAをプローブ（実施例 2、 5を参照）として用いた F I SH解析に供した。図 8 Aはアルフォイド DMA及び BACベクターをプローブとして用いた F I SH解析の結果である。緑がアルフォイド DMAのシグナル（矢印）、赤が BACベクターのシグナル（矢じリ）を示す。単離された ES細胞は HACを 1 コピー保有し、かつ正常核型を維持していることがわかる。

図 8 Bはヒ卜 GCH 1遺伝子のェクソン 1 領域と BACベクターをプローブとして用いた F I SH解析の結果である。 GCH1遺伝子の緑のシグナル（矢印）と BACベクタ一の赤のシグナル（矢じり）が HAC上に同時に検出された。

図 8 Cはマウスマイナーサテライ卜 DNA と BACベクターをプローブとして用いた F I SH解析の結果である。 HAC上にはマウスマイナ一サテライ卜 DNAのシグナル (—部を矢印で示す）が検出されなかった。尚、矢じりは BACベクターのシグナレを示す。

<実施例 8 > ES細胞における HACの安定性

ES細胞中での HACの安定性を、選択薬剤非存在下において長期に培養することによリ解析した。実施例 7で得られた HAC保有 ES細胞をブラス卜サイジン Sの存在下と非存在下で培養（20 日間）した後、 F I SH法を利用して HACを保有している細胞の割合をそれぞれ求めた。解析結果を図 9に示す。薬剤非存在下での長期培養後においても 8割以上の細胞が HACを 1 コピーの状態で保持していた。一回の細胞分裂あたリの染色体脱落率を計算したところ 0.2¾であって、 HT/GCH2- 10細胞における HACの場合とほぼ同程度の安定性を示した。尚、染色体脱落率 Rは次式により求めた。

N_n=N₀X (1-R)ⁿ く実施例 9 > 酵母人工染色体（YAC) を用いたヒト人工染色体（HAC) の構築前駆体として YACを用いてヒ卜 11番染色体の) 8グロビン遺伝子群（クラスター）全領域を保持するヒ卜人工染色体を以下の手順で構築した。使用した前駆体 YAC は次の通りである。

( 9 - 1 ) 前駆体 YAC

A201F4.3：ヒト /8グロビン遺伝子座を有する 150kbの YACであって、 A201F4の右腕部を改変し PGKneorが挿入されている（Keiji Tanimono, Douglas Engel より供与、 Nucleic Acid Research, 27; 3130-3137)。

7c5hTEL:ヒ卜 21番染色体アルフォイド領域由来の約 80kbのアルファサテライ卜配列（α21- 1) 及びマーカー遺伝子の SVbsrを含み、その両端に酵母テロメァ配列を備えかつその内側にヒ卜テロメァ配列を備える人工染色体前駆体 YACである。 7c5hTELを保有する酵母（Saccaromyces serevisiae EPY 305-5b a 7C5hTEL) は 1996年 8月 14日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現在は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、〒305-8566 茨城県つくば市東 1 丁目 1 番 3号中央第 6 ) に寄託されており（受託番号 FERM BP- 5625)、 7c5HteI はこの酵母株から調製される。尚、当該酵母株の作製方法については特表 2000-517182号公報を参照されたい。

F61 : HT1080に pTet- OFF (CL0NTECH) を導入し、 G418選択により樹立したテ卜ラサイクリン誘導発現系細胞である。 ( 9 - 2) 酵母人工染色体の精製

以下の手順で Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) を施行して 2種類の酵母人工染色体（A201F4.3 及び 7c5hTEいをそれぞれ分離した。 PFGE は Gene Nabigator (Amershara Pharmacia Biotech) を使用し、 0.7%ァガロースゲルにおいて 0.5xTBE、 180 Volt及び 15 second pu I seの条件で 15時間行った。 PFGEゲルより分離した YACDNAを電気泳動により Π低融点ァガロースゲルに移し、このゲルを lOmM Tris(pH 8.0)， 1m EDTA, 10OmM NaC I の緩衝液に 16時間浸漬した。 YAC DNA(O.3 g/0.3ml)に lOO gの E.col i tRNAを加えて 70°Cで 10分間加温してゲルを融解し、続いて 30Uの/? agarase(Sigma)を加えて 42°Cで 2h反応させることによりァガロースを消化した。これらに PFGE を施行して 7c5hTEL (90kb) 及び A201F4.3 (150kb) のバンドを確認した（図 1 0A)。

( 9— 3 ) YACの導入

精製した 7c5hTEL及び A201F4.3 を各 0.3 g混和した後、 Superf ect (Qi agen) を 60μ Ι 加えて穏やかに混和し、室温で 10分間反応させた。反応後の溶液を F61 細胞に添加した。培養液（10% FBS(Trace Scientific Ltd. , Noble Park, Austr a I i a) i n D-ME :Du I becco' s Modified Eagle Med i um(l nv i t rogen Corp. , Car I sba d， CA， USA)) を 90分後に一度交換した。 72時間後より 8 μ g/m I のブラスチシジン（Blast icidin)S添加培地で耐性株を選択的に培養し、形質転換株を分離した。その結果、 19個の形質転換株が得られた。

<実施例 1 0> 形質転換株に対する細胞遺伝学的解析

得られた形質転換株に α 21-1 プローブ（アルフォイドプローブ、配列番号 3の DNA断片をジゴキシゲニン標識したもの）及び YACの腕部のプローブ（PYAC5べクター（Dr. Maynard V. Olson (Wash i ngton Un i vers i ty) )を Xho I で切断して得られる約 8kb の DNA 断片（配列番号 4 ) をビ才チン標識したもの）を用いて FISH 法を施行した。その結果 1個の形質転換株においてミニ染色体の形成が認められ、そしてこのミニ染色体に α 21- 1 及び YAC の腕部の両方のシグナルが確認された (図 1 0 Β)。残りのクローンでは宿主染色体上にシグナルがみられるか、又は全くシグナルが検出されないかのいずれかであった。

—方、ミニ染色体が形成された形質転換株に対してヒト )8グロビンクラスター非コード領域の互いに異なる部位をそれぞれ認識する 3種類のプローブ（配列番号 5、配列番号 6、及び配列番号 7 ) を用いて FISH法を施行したところ、ミニ染色体上に各プローブからのシグナルが示された（図 1 1 )。尚、各プローブは A20 1F4.3を铸型として以下のプライマーで PCR反応（96°C30秒、 58°C40秒、 72°C10 分を 1サイクルとした 25サイクル）を行い、その結果増幅された DNAをビ才チン標識したものである。

配列番号 5のプローブ用プライマー

センス aagaccagatagtacagggcc tggc t ac (配歹リ番号 1 0 )

アンチセンス： aagattattcaaggttactatgaacacc (配列番号 1 1 )

配列番号 6のプローブ用プライマー

センス： tgctaatgcttcatctageiaacttatatcctttaattc (配列番号 1 2 )

アンチセンス： 11 tccac tcgagccaaccaggaa 11 cggcagt tac (配歹¹ J番号 1 3 ) 配列番号 7のプローブ用プライマー

センス： tgtaagaaggt tctctagaggc tctacagatagggag (配歹 IJ番号 1 4 )

アンチセンス： aagcagcacttgactcgagtatttttatacatgctctac (酉 fi列番号 1 5 ) また、テロメァ反復配列（配列番号 8の配列が繰り返されてなる約 500bpの配列）をジゴキシゲニン標識したものをプローブとして行った F I SH法ではミ二染色体上に 2点又は 4点のテロメァのシグナルが認められた（図 1 2 )。以上の結果から、アルファサテライ卜配列を有する人工染色体 YACとヒ卜 /?グ口ビンクラスター全領域を有する人工染色体 YACとを HT1080細胞に導入することによって、ヒ卜 j8グロビンクラスター全領域を保持するミニ染色体（ヒ卜人工染色体）を構築できることが確認された。

<実施例 1 1 > ファイバー FISHを用いた、ミニ染色体のマクロ構造の解析各 1x10^s個のマウス A9細胞とミニ染色体保有細胞を培養皿に播種し、これに 5 0¾ PEG (SIGMA)を 3ml 添加して 1 分間培養した。続いて 10 Mのゥヮバイン（Ouba in) , 5/i g/ml のブラスチシジン（Blast i c idin) Sを含む選択培地で培養し、ゥヮバイン及びブラスチシジン S耐性の形質転換株を取得した。上述の方法と同様に FISH法を施行したところ、得られた形質転換株の中にミニ染色体を保有し、かつ残りの染色体がマウス由来である形質転換株の存在が認められた。この形質転換株に対してアルフォイドプローブ（配列番号 3 ) 及び) 8グロビンプローブ（配列番号 5、配列番号 6、及び配列番号 9の混合）を用いて FISH解析を行った。尚、配列番号 9のプローブは A201F4.3を錶型として以下のプライマーで PCR反応（9 6°C30秒、 58°C40秒、 72°C 10分を 1 サイクルとした 25サイクル）を行い、その結果増幅された DNA断片をビ才チン標識したものである。

センス： tatacatacatacctgaatatg 、目歹 [I番号 1 6 )

アンチセンス tgtaggctgaagacgttaaaagaaacac (酉己列番号 1 7 )

FISH解析の結果、アルファサテライ卜配列のシグナルがミニ染色体以外の染色体上に認められなかったため（図 1 3 )、ミニ染色体のアルファサテライ卜配列に対するファイバ一 FISH解析が可能であった。そこで、ファイバー FISH解析を行つたところ、ミニ染色体上にグロビンとアルフォイド配列の複数のシグナルが不規則に並んでいることが確認された（図 1 4 )。 <実施例 1 2 > HACからの目的遺伝子の転写量の解析

次に、 βグロビン遺伝子を保持した HACを保有する細胞におけるグロビン遺伝子の転写量を解析した。

実施例 9と同様の手順で 7c5hTEL及び A201F4.3を白血球 Κ562細胞（ATCC CCL -243) に導入し、 jSグロビン遺伝子を保持した HACを保有する細胞（HAC保有 K5 62細胞）を得た。この HAC保有 K562細胞と、実施例 9で得られた HAC保有 HT10 80 細胞におけるグロビン遺伝子の発現状態を、 G_Tグロビンの転写量を指標として次のように解析した。尚、 7c5hTEL及び A201F4.3の導入操作を行う前、即ち H ACを保有しない HT1080細胞及び K562細胞を比較対照（コントロール）として用いた。

まず、各細胞から常法で RMAを抽出し、 MMLVの逆転写酵素及び 0Mgo(dT) 15プライマーを用いて cDMAを合成した。このようにして得られた各 cDNAを錶型として次のプライマーセッ卜 (Grグロビンのェクソン 2及びェクソン 3 ) を用いた R T-PCRを施行した。

センスプライマー： gatgccataaagcacctggatg (配歹 IJ番号 1 8 )

アンチセンスプライマー： ttgcagaataaagcctatccttga (配列番号 1 9 )

RT-PCR の結果を図 1 5の上段に示す。尚、）8 -ァクチン遺伝子に特異的な以下のプライマーを用いて同様に RT- PCRを行った結果を併せて示した。

センスプライマー： tcacccacactgtgcccatctacga (配列番号 2 0 )

アンチセンスプライマー： cagcggaaccgctcattgccaatgg (配列番号 2 1 ) 一方、リアルタイム PCR法にょリ各サンプルの G_Tグロビン遺伝子の転写量を定量した。リアルタイ厶 PCRは ABI PRISM 7700 (ABI アプライドバイオシステムズ社製）及び Qi agen Quant iTect SYBR Green PCR ki t(Cat 204143)を用いて行つた。また、増幅反応に利用するプライマ一としては上記の各プライマーを用いた。尚、各サンプルにおける /3ァクチン遺伝子の転写量を求め、これを基にサンプル間の細胞数の差を補正した。図 1 5の下段にリアルタイム PCR法による解析結果を示す。尚、 HAC非保有の H T1080の転写量を 1としたときの相対値として各サンプルにおける Gァグロビンの転写量を表した。 HACを導入したことにより、 GTグロビンの発現量が HT1080 をターゲット細胞とした場合では 1.5倍となり、他方 K- 562をターゲッ卜細胞として場合では 5倍以上となった。このように、いずれのターゲット細胞を用いた場合においても導入された HACからの GTグロビンの発現、即ち HAC に保持させた外来遺伝子の発現を確認できた。特に、 K- 562 を用いた場合においては極めて高い活性で外来遺伝子を発現できることが示された。く実施例 1 3 > HAC保有マウス（キメラマウス）の作出

実施例 7によって得られた HAC保有 ES細胞を培養して樹立された細胞株（HAC 保有 ES細胞株 TT2/GCH2- 10) を、 I CRマウス（日本クレア株式会社）から採取した 8細胞期胚あるいは胚盤胞期胚にインジェクション法により注入し、 ES細胞導入胚を仮親に移植した。その後、自然分娩により産仔を得た。生後 24時間のマウスから各臓器（脳、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、腎臓）を単離し、それぞれについてゲノム DNAを調製した。得られた DNAに対して FastStart Taq DNA polymerase (Roche) を用いて PCRを行い、 BAC由来の DNAを検出した。用いたプライマーの配列とサイクル（反応条件）は以下のとおりである。

BAC3aプライマー： catcgtctctctgaaaaatcg (配列番号 2 2 )

CHIPBAC3bプライマ一： aggaaacagcaaaac tgtgac (配列番号 2 3 )

サイクル： 95°C、 4分 X I、 95°C、 15秒、 55°C、 10秒、 72°C、 30秒 X 35、 72°C、 9分 X I PCR法による解析結果を図 1 6 (b)に示す。 1 5匹のマウスを解析した結果、この図に示されるように 7匹のマウスにおいて BAC DNAがすべての臓器において検出された。次に、 HAC保有 ES細胞を用いて作出したキメラマウス個体における GCH-HACの存在を確認するために、分裂期染色体標本を作製し F I SH解析を行った。まず、生後 24 時間のキメラマウスの頭と内臓以外の部分を PBS で洗った後に細片化し、 0. 05%トリプシン/ I mM E叮 A 存在下で 1 h r， 37°Cで保温した。トリプシン処理によリ細片から得られた細胞を遠心分離により回収し、 1 MFCS を含む DMEM培地で 2 回洗った。細胞を再度 10%FCSを含む DMEM中に浮遊させ、 37°C、 5%C0₂存在下で培養した。コンフルェン卜に近く増えた状態で TN 1 6を加え、分裂期に同調した後に分裂期染色体標本を作製した。

アルフォイド配列と BACベクター配列をプローブに用いて F I SHを行った結果、キメラマウス由来（ES 細胞由来）の細胞に人工染色体（GCH-HAC)が確認された（図 1 6 (c) )。尚、図 1 6 (a)は、得られたキメラマウスを示す図であり、毛色からキメラマウスであることを確認できる。く実施例 1 4 > HACの X0核型 ES細胞への移入、及びキメラマウスの作出実施例 7と同様の手順で、微小核融合法によって HACをマウス ES細胞に移入した。実施例 7では XY核型マウス ES細胞を用いたが、本実施例では X0核型のマウス ES細胞 TT2- F (相沢博士より供与）を用いた。微小核融合処理の後に得られた細胞を F I SH解析に供したところ、いくつかの細胞が期待通り HACを保有していた (データ示さず）。このようにして得られた HAC保有 ES細胞を培養して細胞株を樹立した後、この細胞株を用いて実施例 1 3と同様の手順でキメラマウスの作出を試みた。その結果、図 1 7に示すように、モザイク状の毛色のキメラマウス（メス）が得られた。

<実施例 1 5> 遺伝子挿入部位を有する哺乳類人工染色体の構築

遺伝子挿入部位と、インスレーター配列の候補としてのヒ卜 i8グロビン LCRを含む人工染色体を構築し、人工染色体におけるインスレーター配列の効果を検証した。

1 5 - 1 . DMAコンス卜ラク卜

(1) ヒト 0グロビン LCR

ヒ卜 /3グロビン遺伝子領域をカバ一する YACクローン（A201F4.3， Dr. Douglas Engel, No r t hwes t e rn Un i v.より供与）から 20836kb (GenBank data base NG000007 の 4818から 25654まで）を pTWV229ベクタ一（タカラバィ才株式会社）のマルチクローニング部位にクローン化した（TWV- LCR)。

(2) ァクセプター前駆体

pAc-lox71-bsr-pA ( Dr. Yamamura, Kumamoto Univ. より供与、 K i m i Arak i , Masatake Araki and Ken-ichi Yamamura (1997) ) の EcoRI- Xhol 1.7kb 断片を pSV2-bsrの EcoRI 部位に揷入して SV- bsr- Ιοχ71 を得た。 SV-bsr-lox71 の ApaLI 断片 6kbを pBeloBACの Sal I部位に挿入して BAC- bs r-l ox71 を構築した。

j8グロビン LCR (Locus control region, HS1〜5を含む）を加えた前駆体を構築するために、 TWV- LCRの Fspl 断片 20kbを BAC-bs r- 1 ox71 の Eco065l 部位に挿入した（BAC- LCR- Ιοχ71、図 1 8を参照）。尚、この前駆体 BAC- LCR- 1 ox71 の特徴は、 10x71部位の 5' 側に CAGプロモーター（各種哺乳類培養細胞、マウス個体において安定した遺伝子発現が期待できる）が配置され、組み換えの際に、プロモータ一を持たない（プロモーターレス）選択マーカー遺伝子と期待通りに組み換えが生じた時のみ、 CAG-選択マーカー遺伝子が構築され、遺伝子の発現が起こるようになっている。 11134

62

(3) アルフォイド前駆体

CMV- α 50(アルフォイド配列がタンデム状に配列されてなる約 50kbのアルフ才イドインサート（実施例 1 を参照）を含む）の SaM- Sal l (Cos， ΙοχΡ配列）を取り除いた前駆体を構築した（Δ θ! 50)。

(4) ドナープラスミド

pGK-puro (PGKプロモーター、 puro遺伝子、 PGK遺伝子の po I yA配列、アンピシリン耐性遺伝子、複製起点（ori) を含む大腸菌用ベクター）の Hindi I卜 Sai l 断片 1.2kb (puro 遺伝子の coding region) と I ox66-N I aczeo (Dr. Yamamura, Kumamoto Univ. よリ供与、 Kimi Arak i , Masatake Arak i and Ken- i ch i Yamamura (1997)の Hindi I l-Xhol 断片 3. Okb( Ιοχ66を含む）をライゲーシヨンし、 plox66 - puroを得た。 p I ox66 - puroより' Speト Kpn I 断片 1.2 kb ( I 0x66 - pu roカセッ卜）を平滑末端化し PTINV229 の Hindl l l 部位に挿入した（ TINV- 1 ox- pu ro)。 pEGFP-CI (clontech) の Ase卜 M I u I 断片 1.6kbを平滑末端化し、 TWV-lox-puro ( SaM部位に挿入した（Dn-EGFP)。

1 5 — 2. Lox部位を持つ人工染色体の構築

アルフォイド前駆体（厶 α 50)とァクセプター前駆体（BAC- bsr- Ιοχ7 あるいは BAC-LCR-lox71) を HT1080細胞に共導入し、薬剤（bs) 耐性細胞から FISHにより人工染色体を保有する細胞株を選び出した。

1 5 - 3 . 挿入部位を持つ哺乳類人工染色体への GFP遺伝子の挿入

10x15-13 細胞株（ /3グロビン LCR . Ιοχ71 を持つ人工染色体を保有する、 2x10⁵) に 1 i gの pCAG-Cre (Cre リコンピナ一ゼ遺伝子）と 1 gの Dn- EGFP ( Ιοχ66配列と EGFP遺伝子）をリボフェクトァミンプラス試薬（インビトロジェン）を用いてトランスフエクシヨンし、ピューロマイシンにより選択後、 FISHにより挿入した EGFPが人工染色体上に存在することを確認した。

1 5 - 4. 人工染色体からの EGFPの発現量の定量

ヒ卜 j8グロビン LCRを含まないァクセプター前駆体（BAC- bsr- 10x71 ox)を使用した場合には Dn- EGFPを挿入することに成功していないので、 pEGFP- C1 (Dn-EGFP の作製に用いた EGFP 遺伝子）を染色体上のランダムな場所に組み込んだ安定株 (pEGFPを HT1080に導入することによって得られる細胞株）と比較した。卜リブシン処理により個別にした各細胞の EGFPの蛍光強度を IPLabソフ卜（日本ローバ一）によリ定量した結果、人工染色体に挿入した EGFPの蛍光は染色体上数倍から十倍程度の EGFP蛍光を発していることがわかった（図 1 9)。本発明は、上記発明の実施の形態の説明に何ら限定されるものではなく、特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書における引用文献を以下に列挙する。

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本発明によれば、目的遺伝子に加えてその本来の制御領域をも含む巨大な DNA 領域を保持する哺乳類人工染色体が提供される。従って、哺乳類人工染色体に保持された遺伝子から本来の制御様式で遺伝子発現を行うことができる。

本発明の哺乳類人工染色体は、これを他の細胞に移入したり、或は胚性幹細胞などを経て個体レベルでの研究にも使用できる。従って、組織特異的遺伝子発現、経時的遺伝子発現の研究やモデル動物を使用したヒ卜型遺伝子の研究、薬剤（阻害剤、促進剤など）の開発などに極めて有用なツールとなる。

例えば、本発明の方法によって得られる、目的遺伝子を保持した人工染色体を保有する胚性幹細胞を利用すれば、目的遺伝子を発現するヒ卜人工染色体を保有した形質転換動物（キメラ動物を含む）を作出でき、単独遺伝子の発現様式を個体レベルで解析することが可能となる。また、本発明の HACを保有するクローン動物の作出も可能と考えられる。以上のようなヒ卜人工染色体を保有した形質転換動物は遺伝子治療のモデルとして利用され得る。更には、目的遺伝子に対する薬剤の効果を生理的条件下で解析することにも利用され得る。

本発明の哺乳類人工染色体は遺伝子治療用のベクタ—としても有用である。このように、本発明の哺乳類人工染色体は、目的遺伝子に加えてその本来の制御領域をも含む巨大な DMA領域を運搬するための単純かつ一般的な方法を提供するものである。

Claims

請求の範囲

1 . 哺乳類セン卜ロメァ配列を含む環状の第 1 ベクターと、機能配列を含む環状の第 2ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第 1 工程と、

形質転換細胞を選択する第 2工程と、及び

を含むことを特徴とする哺乳類人工染色体の作製方法。

2 . 哺乳類セン卜ロメァ配列及び哺乳類テロメァ配列を含む酵母人工染色体からなる第 1 ベクターと、機能配列を含む酵母人工染色体からなる第 2ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第 1 工程と、

形質転換細胞を選択する第 2工程と、及び

を含むことを特徴とする哺乳類人工染色体の作製方法。

3 . 前記第 1 ベクターが選択マーカー遺伝子を有し、前記第 2工程における形質転換細胞の選択は該選択マーカ一遺伝子を利用して行われる、請求の範囲第 1 又項は第 2項に記載の作製方法。

4 . 前記哺乳類セン卜ロメァ配列は、以下の配列が規則的間隔で複数個配列される領域を含む、請求の範囲第 1 項〜第 3項のいずれかに記載の作製方法、

5 ' -NTTCGNNNNANNCGGGN-3 ' ：配列番号 1 (但し、 Nは A , T， C，及び Gのいずれかである）。

5 . 前記哺乳類セン卜ロメァ配列はヒ卜染色体アルファサテライ卜領域由来の配列を含む、請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれかに記載の作製方法。

6 . 前記哺乳類セン卜ロメァ配列はヒト 2 1番染色体由来の 1 1量体繰返しュニッ卜を含む、請求の範囲第 5項に記載の作製方法。

7 . 前記哺乳類セン卜ロメァ配列のサイズは約 50kb以下である、請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれかに記載の作製方法。

8 . 前記機能配列が目的遺伝子及びその制御領域をコードする配列からなる、請求の範囲第 1項〜第 7項のいずれかに記載の作製方法。

9 . 前記目的遺伝子はハウスキーピング遺伝子以外の遺伝子である、請求の範囲第 8項に記載の作製方法。

1 0 . 前記目的遺伝子はヒ卜グアノシン三リン酸シクロヒドロラーゼ I の構造遺伝子である、請求の範囲第 8項に記載の作製方法。

1 1 . 前記機能配列はヒ卜 /3グロビン遺伝子群全領域をコードする配列である、請求の範囲第 8項に記載の作製方法。

1 2 . 前記機能配列は、所望の配列を特異的に挿入するための揷入用配列からなる、請求の範囲第 1 項〜第 7項のいずれかに記載の作製方法。

1 3 . 前記揷入用配列が Ι οχ Ρサイ卜若しくは FRTサイ卜又はこれらいずれかの配列の一部を改変した配列であって、前記所望の配列を挿入する機能を有する配列である、請求の範囲第 1 2項に記載の作製方法。

1 4 . 前記第 1 工程において導入する、前記第 1 ベクターと前記第 2ベクターの量比はモル比で約 1 0 ： 1 〜約 Ί ： 1 0の範囲にある、請求の範囲第 1 項〜第 1 3項のいずれかに記載の作製方法。

1 5 . 前記第 2ベクタ一として、それに含まれる機能配列が互いに異なる複数のベクターが使用される、請求の範囲第 1 項〜第 1 4項のいずれかに記載の作製方法。

1 6 . 前記第 2ベクターがインスレーター配列をさらに含む、請求の範囲第 1 項〜第 1 5項のいずれかに記載の作製方法。

1 7 . 請求の範囲第 1項〜第 1 6項のいずれかに記載の作製方法によって得られ、

1 8 . 請求の範囲第 1項〜 1 6項のいずれかに記載の作製方法によって得られ、哺乳類複製起点、哺乳類セントロメァ配列、哺乳類テロメァ配列、並びに目的遺伝子及びその制御領域をコードする機能配列を有し、

1 9 . 哺乳類複製起点、哺乳類セン卜ロメァ配列、並びに目的遺伝子（八ウスキーピング遺伝子を除く）及びその制御領域をコードする機能配列を有し、環状であって、哺乳類細胞中で複製され、宿主細胞の染色体外に維持され、及び細胞分裂の際に娘細胞に伝達される哺乳類人工染色体。

2 0 . 前記目的遺伝子はヒ卜グアノシン三リン酸シクロヒドロラーゼ I の構造遺伝子である、請求の範囲第 1 9項に記載の哺乳類人工染色体。

2 1 . 哺乳類複製起点、哺乳類セントロメァ配列、哺乳類テロメァ配列、並びに目的遺伝子（ハウスキーピング遺伝子を除く）及びその制御領域をコードする機能配列を有し、

2 2 . 前記機能配列はヒト ;8グロビン遺伝子群全領域からなる、請求の範囲第 2 1 項に記載の哺乳類人工染色体。

2 3 . 哺乳類複製起点、哺乳類セン卜ロメァ配列、及び所望の配列を特異的に挿入するための挿入用配列を有し、

2 4 . 哺乳類複製起点、哺乳類セン卜ロメァ配列、哺乳類テロメァ配列、及び所望の配列を特異的に挿入するための揷入用配列を有し、

2 5. 前記揷入用配列が ΙοχΡサイ卜若しくは F叮サイ卜又はこれらいずれかの配列の一部を改変した配列であって、前記所望の配列を挿入する機能を有する配列である、請求の範囲第 2 3項又は第 2 4項に記載の作製の哺乳類人工染色体。

2 6. 前記哺乳類セントロメァ配列は、以下の配列が規則的間隔で複数個配列される領域を含む、請求の範囲第 1 7項〜第 2 5項のいずれかに記載の哺乳類人ェ染色体、

5' - NTTCGNNMNANNCGGGN-3' ：配列番号 1 (但し、 Nは A, T， C,及び Gのいずれかである）。

2 7. 前記哺乳類セン卜ロメァ配列はヒ卜染色体アルファサテライト領域由来の配列を含む、請求の範囲第 1 7項〜第 2 5項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体。

2 8. 前記哺乳释セントロメァ配列はヒト 21番染色体由来の 11量体繰返しュニットを含む、請求の範囲第 2 7項に記載の哺乳類人工染色体。

2 9. 前記機能配列又は前記挿入用配列を複数個有する、請求の範囲第 1 7項〜第 2 8項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体。

3 0. インスレーター配列をさらに含む、請求の範囲第 1 7項〜第 2 9項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体。

3 1 . 請求の範囲第 1 7項〜第 3 0項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を自己の染色体外に保有する哺乳類細胞。

3 2 . 請求の範囲第 1 7項〜第 3 0項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を自己の染色体外に保有するヒ卜細胞。

3 3 . 請求の範囲第 1 7項〜第 3 0項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を自己の染色体外に保有する胚性幹細胞。

3 4 . 請求の範囲第 1項〜第 1 6項のいずれかに記載の作製方法によって得られる哺乳類人工染色体又は請求の範囲第 1 7項〜第 3 0項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体をターゲッ卜細胞としての哺乳類細胞に導入する工程を含む、ことを特徴とする、前記機能配列又は前記挿入用配列が長期間安定して維持可能な状態に導入された哺乳類細胞の作製方法。

3 5 . 哺乳類セン卜ロメァ配列を含む環状の第 1 ベクターと、機能配列を含む環状の第 2ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第 1 工程と、

形質転換細胞を選択する第 2工程と、

選択された細胞から前記哺乳類人工染色体を分離する第 4工程と、及び分離された前記哺乳類人工染色体をターゲッ卜細胞としての哺乳類細胞に導入する第 5工程と、を含む、哺乳類人工染色体を保有する哺乳類細胞の作製方法。

3 6 . 哺乳類セントロメァ配列及び哺乳類テロメァ配列を含む酵母人工染色体からなる第 1 ベクターと、機能配列を含む酵母人工染色体からなる第 2ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第 1 工程と、

形質転換細胞を選択する第 2工程と、

3 7 . 哺乳類セン卜ロメァ配列を含む環状の第 1 ベクターと、機能配列を含む環状の第 2ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第 1 工程と、

形質転換細胞を選択する第 2工程と、

3 8 . 哺乳類セン卜ロメァ配列及び哺乳類テロメァ配列を含む酵母人工染色体からなる第 1 ベクターと、機能配列を含む酵母人工染色体からなる第 2ベクターと、を哺乳類宿主細胞に導入する第 1 工程と、

形質転換細胞を選択する第 2工程と、

3 9 . 請求の範囲第 3 7項又は第 3 8項に記載の作製方法によって得られる微小核体とターゲット細胞としての哺乳類細胞とを融合させる工程、

4 0 . 請求の範囲第 1 7項〜第 3 0項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を保有する宿主細胞から哺乳類人工染色体を分離する工程と、及び

4 1 . 請求の範囲第 1 7項〜第 3 0項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体を保有する宿主細胞と、微小核形成能を有する哺乳類細胞と、を融合させる工程と、融合細胞の中から、微小核形成能を有し、かつ前記哺乳類人工染色体を保有するハイブリッド細胞を選択する工程と、及び

4 2 . 請求の範囲第 4 1項に記載の作製方法によって得られる微小核体とターゲッ卜細胞としての哺乳類細胞とを融合させる工程、

4 3 . 前記ターゲット細胞としての哺乳類細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、又は組織幹細胞である、請求の範囲第 3 4項、第 3 5項、第 3 6項、第 3 9項、第 4 0項、及び第 4 2項のいずれかに記載の哺乳類細胞の作製方法。

4 4 . 前記ターゲッ卜細胞としての哺乳類細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、又は組織幹細胞を、特定の組織の細胞へと分化するように誘導してなる細胞である、請求の範囲第 3 4項、第 3 5項、第 3 6項、第 3 9項、第 4 0項、及び第 4 2項のいずれかに記載の哺乳類細胞の作製方法。

4 5 . 前記ターゲット細胞としての哺乳類細胞は、哺乳類の受精卵である、請求の範囲第 3 4項、第 3 5項、第 3 6項、第 3 9項、第 4 0項、及び第 4 2項のいずれかに記載の哺乳類細胞の作製方法。

4 6 . 哺乳類人工染色体の作製に使用されるベクターであって、

サイズが約 50kb以下の哺乳類セン卜ロメァ配列、及び選択マーカ—遺伝子を含むベクター。

4 7 . 前記哺乳類セン卜ロメァ配列は、以下の配列が規則的間隔で複数個配列される領域を含む、請求の範囲第 4 6項に記載のベクター、

5 ' - NTTCGMNNNA關 CGGGN-3 ' ：配列番号 1 (但し、 Nは A， T， C，及び Gのいずれかである）。

4 8 . 前記哺乳類セントロメァ配列はヒ卜染色体アルファサテライ卜領域由来の配列を含む、請求の範囲第 4 6項又は第 4 7項に記載のベクター。

4 9 . 前記哺乳類セントロメァ配列はヒ卜 21番染色体由来の 1 1量体繰返しュニットを含む、請求の範囲第 4 8項に記載のベクター。

5 0 . 哺乳類人工染色体の作製に使用されるベクターであって、

Ι οχΡサイ卜若しくは FRTサイ卜又はこれらいずれかの配列の一部を改変した配列であって、前記所望の配列を挿入する機能を有する配列と、

インスレーター配列と、を含むベクター。

5 1 . 哺乳類人工染色体が導入されてなる、非ヒト形質転換動物。

5 2 . 前記哺乳類人工染色体が、請求の範囲第 1 7項〜第 1 9項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体である、請求の範囲第 5 1 項に記載の非ヒ卜形質転換動物。

5 3 . 哺乳類人工染色体が導入されてなる、 Χ0型マウス胚性幹細胞。

5 4 . 前記哺乳類人工染色体が、請求の範囲第 1 7項〜第 1 9項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体である、請求の範囲第 5 3項に記載の X0型マウス胚性幹細胞。

5 5 . 哺乳類人工染色体が導入されてなる、メスキメラマウス。

5 6 . 前記哺乳類人工染色体が、請求の範囲第 1 7項〜第 1 9項のいずれかに記載の哺乳類人工染色体である、請求の範囲第 5 5項に記載の、メスキメラマウス。