WO2004017069A1

WO2004017069A1 - バイオチップ分析装置およびオンライン分析システム

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Publication number: WO2004017069A1
Application number: PCT/JP2002/008312
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Inventors: Tohoru Hayashi; Toru Yamada; Shozo Ishizaka
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Publication date: 2004-02-26
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Description

明細 ^: バイオチップ分析装置およびオンライン分析システム技慨分野

本発明は、検体遺伝子試料を蛍光色素で標識し、これをバイオチップ基板上の多数の微小スポットに固相化して配置された別個の遺伝子または遺伝子産物と反応させ、この標識試料が結合したバイォチップの位置と結合の程度を測定する、パラレルァヅセィ法によるバイオチップの作製 '反応，読取りを行うバイオチップ分析装置に関し、特に、試料中に存在する遺伝子または遺伝子産物などの定量を行う遺伝子分析や、同様に蛋白質の分析、それに免疫学関連の分析などに利用される。

本発明は、バイオチップ作製に必要なデータを蓄積したデータべ一ス及びバイオチップ解析に関するプログラムを保有するバイオチップ情報セン夕と上記バイオチップ分析装置とをィンターネットなどのコンビュ一夕ネットワークを介して接続し、バイオチップの作製から解析を効率的に実施することができるバイオチップオンライン分析システムに関する。背景技術

近年、遺伝子分析や蛋白質の分析、それに免疫学関連の分野で多数の試料と検体試料とを同時並行的に反応させ個々に分析を行うパラレルアツセィ法が利用されるようになった。この分析法は、多数の生物試料を固相ィ匕し、独立して配置したガラス板又はプラスチック板或いはシリコンゥェハーであるバイオチップを利用する。この方法はデータを迅速に取得できること、試薬を節約できること、多数同時に解析できること、などの多くの利点がある。特にマイクロアレイや遺伝子チップと呼ばれる（以下バイォチップと総称する）、多数の遺伝子または遺伝子産物を基板上にプロッ卜した基板を用いたパラレル遺伝子解析法が特に注目を集め、広く利用されるようになった。

オリゴヌクレオチドによる遺伝子解析を例に挙げて説明する。なお、この解析法は、蛋白質の解析や免疫関連の分析などにも利用する事ができる従来バイオチップの作製、反応並びに読取りはそれそれ専用機を利用し別々に実施されていた。

以下にバイォチップの作製 ·反応 ·読取りに関しての問題点を説明する < バイオチップの作製法は、フォトリソグラフィ法、圧電技術を利用したジェットプリンティング法、メ力二カルマイクロスポット法などが開発されている。このうち、フォトリソグラフィ法は、半導体素子製造法の露光技術を利用してバイオチヅプを作製する技術である。この技術によるバイォチップ作製はガラス基板上の微小な所定のォリゴヌクレオチドの配列位置にフォトマスクを通して選択的に光照射を行い、マスクされていない領域を通過した光が 4種類の塩基に対応するホスホアミダイト試薬を活性化しカヅプリング反応を引き起こし、各力ヅプリングステヅプで所定の領域で塩基を一個づっ付加し基板上に直接ォリゴヌクレオチドを合成伸長させる。この方法は光活性化反応を利用して、基板上の微小スポツ卜に多数の配列の異なるオリゴヌクレオチドを直接合成する為、ォリゴヌクレォチドの配列データがあれば、バイオチップを作製できるという優れた長所がある。しかしながら、前記方法は半導体素子製造法に準じた大掛かりな装置を必要とする欠点を有するので、バイオチップのユーザーは専門メ —カーが製作したバイオチップを購入して利用しているのが現状である。フォトリソグラフィと光活性化力ヅプリング反応を利用した、オリゴヌクレオチドの合成に関しては、 Foder他（1991) Science^ Vol.251, P767 または Chee他（1996) Science^ Vol.274, P610に発表されている。しかし、発表された技術は、大掛かりな装置を必要とするものであったこの分野における小型化されたバイオチップ作製装置は、一例として、デジ夕ルマイクロミラ一デバイス（以下 D M Dと記す）を利用したものが特開 2000— 40660 に提案されている。 D M Dは、微小なマイクロミラ一を画素子とする反射型の空間光変調素子である。一例を挙げると、 1280 X 1024 個のマイク口ミラ一を二次元に配列したものが市販されている。しかし、信頼性の高いバイオチップの作製にはスポヅト位置によるバラツキを無くすこと、すなわち光学的条件として露光光の面内分布の一様性が重要である。上記光学的条件を確保するため、特閧 2000— 40660 に記載された装置では、フライアイレンズを用いたィンテグレー夕光学装置などの高価な光学装置を別に設置し、併用しなければならず、実用的ではない。空間光変調素子として D M Dを利用した露光方法並びに装置は、特開平 10-112579、特表 2001-500628 に提案されている。上記従来の露光技術は D M Dの構造上機能しない。即ち、第 4図に示す如く、 D M D全体を収束光で照明すると、傾動されたマイクロミラーにより選択された対象試料を照明する光は D M Dの設置面と平行な面 hには焦点を結ばず、共焦点光学系を構築することができない。また、第 5図に示す如く、 D M Dを平行光で照明した場合でも、対物レンズだけでは傾動されたマイク口ミラーにより選択された対象試料を照明する光がすべて一点に集光する。従って、試料の観察点は集光点から拡散されてくる光によって照明される。また D M Dを平行光で照明した場合には、マイクロミラ一による反射光の広がりを無視できない。，'

上記理由の他に、本来斜め方向から入射光を導入し照明されなければならない D M Dに対して垂直な入射光で照明されている。更には、マイクロミラ一は不安定な状態、すなわち傾動しない状態（電源の OKF状態）が利用されている。

特開 2000-40660に提案されている方法と装置には、バイオチヅプ作製装置として利用する露光装置において、露光面の位置によるバラヅキを排除し露光面の面内分布を一定にするための対策がなされていない。具体的には、外部にフライアイレンズなどを利用した高価な光学系を設置し、照明光を均一にする手段を別に設けなければならない。

次に、バイオチップの読取法並びにその装置に関する従来技術を説明する。フォトリソグラフィ一方法で製作されたバイオチップだけに係わらず、他の方法で製作されたバイオチップも蛍光標識した被検試料と反応させ、バイオチップ上の微小スポットに結合した試料の蛍光強度を検出する。この検出には共焦点走査蛍光検出装置が利用されている。

共焦点走査蛍光検出装置は、焦点深度が浅く、焦点のずれた観察点以外から射出される蛍光を除外できるので、精度の高いバイオチップ読み取りが可能である。しかし、蛍光を励起するビームを走査するか、試料自体を動かして走査しなければならない。ビームを走査する方式は、 F-theta レンズなどを利用し平らな検出フィ —ルドを作らなければならないこと、及び、大きな開口数の対物レンズの採用が難しいことが挙げられる。一方、試料を走査する方式は共焦点システムの浅い焦点深度に見合った平面性が保持されなければならないので、機械的及び光学的設計が複雑になる欠点がある。これを解決する走査手段として、空間光変調器として D M Dを利用した装置が走査型顕微鏡として、米国特許第 5，587,832ゃ特開平 11-194275などに開示されている。

この開示されている装置をバイオチップの読取りに利用すると、読取装置間でバラツキが出ることが問題であった。バイオチヅプのスポットが微小であるため、蛍光発光量の不足は避けられない。この蛍光発光量が不足すると、装置の照明光や検出感度が位置により異なってしまい、上記の問題が発生する。即ち、均一な照明による検出になっていないことが原因であるが、上記の二つの特許にはその対策がなされていない。また、バイオチップの作製及び読取りには、それそれ専用装置が存在し、個別に実施されているのが現状である。

本発明の主たる目的は、従来のパラレルアツセィ法を利用するバイオチップ分析の問題点を解決することで、バイォチップの作製 ·反応 ·読取りの機能を備えたバイォチップ分析装置を提供することである。

本発明の他の目的は、均一照明を実現する照明光補正機能を持たせた空間光変調素子を用いて、再現性の高いバイオチップの作製を可能にしたバィォチップ分析装置を提供することである。本発明の他の目的は、バイオチップの読取時において、照明励起光と検查感度の位置によるばらつきを無くし、高分解能で高速走査可能であり、高い信頼性を持たせたバイオチップ分析装置を提供することである。本発明の他の目的は、バイオチップに複数配置するヌクレオチド又はぺプチド又は糖鎖のスポットの配置とスポット上のヌクレオチド又はぺプチド又は糖鎖の 1次構造に関するデータをィン夕一ネットなどのコンビユー夕ネットワークを通じてバイオチップ分析装置に配信すると共に、ノィォチップ分析装置から検体との反応後に読取ったデータをコンビユー夕ネットワークを通じて回収して解析し、その結果を返すバイオチップォンライン分析システムを提供することである。発明の開示

本発明に係るバイオチップ分析装置は、バイオチップに複数配置するヌクレオチド又はぺプチド又は糖鎖のスポヅトの配置とスポット上のヌクレオチド又はべプチド又は糖鎖の 1次構造とから定まる露光パターンにより、露光照明用光源で照明した単一の空間光変調素子を制御してバイオチップ基板上のヌクレオチド又はぺプチド又は糖鎖を配する位置を選択的に露光し、複数種類の塩基又はアミノ酸又は糖を所定の位置に光活性化力ップリング反応を起こし、ヌクレオチド又はぺプチド又は糖鎖を合成伸長させてバイオチップを作製する手段と、作製したバイオチップと蛍光標識した被検試料とを反応させる手段と、蛍光励起光源を空間光変調素子に結像照明し、被検試料と反応させたバイオチップ上の微小域を選択的に照明して微小域から射出される蛍光だけを選択的に撮像する共焦点走査を行ってバイオチップを読取る手段とから構成されている。

本発明に係るバイオチップオンライン分析システムは、上記のバイオチップ分析装置と、バイオチップの配列デ一夕及び解析データを蓄積したデ一夕ベースおよびバイオチップ読取データを基に解析を行うサーバ装置が設備されたバイオチップ情報セン夕一とから成り、これらの装置がコンピュー夕ネットワークを介して接続されている。本システムにおいて、ノィォチップ分析装置は自ら所有するバイォチップ配列デ一夕、或いは要求に応じてサーバ装置から提供されるバイォチップ配列データを利用してバイオチップの作製、反応、読取りを行うと共に、サーバ装置はバイオチップ分析装置からバイオチップ読取デ一夕を回収し、解析を行い、その解析デ一夕をバイォチップ分析装置に返信する。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の第一の実施例に係る D M Dを用いたバイオチップ分析装置の光学系と制御系のシステム構成図である。

第 2図は、本発明の第二の実施例に係る反射型液晶パネルを用いたバイォチップ分析装置の光学系と制御系のシステム構成図である。

第 3図は、本発明の第三の実施例に係る二波長で分析可能なバイオチップ分析装置の光学系のシステム構成図である。

第 4図は、集束光で D M Dを照明した場合の焦点位置を示す図である。第 5図は、平行光で D M Dを照明した場合の焦点位置を示す図である。第 6図は、オンライン分析システムの概念図およびバイオチップの作製から解析までのフロ一図である。発明を実施するための最良の形態

本発明の実施例を添付の図面を参照しながら説明する。

第一の実施例におけるバイオチップ分析装置は、バイオチップ作製、被検試料との反応、及び読取りの一連の工程を実施することができる。本実施例は、バイォチップ作製時の露光とバイォチップ読取り時の蛍光励起用照明を共通の光学系で構成すると共に、バイォチップ作製時の露光光モニ夕とバイォチップ読取り時の撮像と励起光モニタを共通の光学系で構成しているバイォチヅプ分析装置である。

第 1図において、光学系の中央にはバイオチップ 1と対物レンズ 2と結像レンズ 3 と空間光変調素子である D M D 6が設置され、中心光軸が形成されている。対物レンズ 2 と結像レンズ 3は、バイォチヅプ 1の作製時および読取り時において、次のように作用する。作製時にはバイオチップ 1 を照明露光し、読取り時には D M D 6の表面をバイォチップ 1に結像させ、更にはバイオチップ 1のスポヅ卜から射出された蛍光を D M D 6表面に結像させる。

光源 20 からの光は射出端が斜めに切断されたファイバーォプティヅクプレート 24 に入射し、その射出端に平面状光源が形成される。平面状光源の実像はレンズ 25のレンズ機能によりダイクロイツクミラー 26を介して D M D 6 の鏡面に結像する。ファイバーォプティヅクプレ一ト 24の射出端、レンズ 25、 D M D 6の鏡面はシャインプルーフの条件を満足する。本実施例においては、シャインプルーフの条件するようにレンズにァオリを加えた結象系を採用したが、レンズをシフトした結像系を採用することもできる。

光源 20は、光源 A20、光源 B 20、光源 C 20から成り、読取時において二波長の蛍光励起と作製時において露光が可能になっている。 3つの光源を切替える為にミラー 23(23A,23B)が設置されている。ミラー 23Aが所定の位置に導入されたときは光源 A20 が、ミラー 23B が所定の位置（図中実線）に導入されたときは光源 B 20 がそれぞれ利用される。また、ミラ — 23A,23Bを図中破線の位置に退避させ、いずれのミラ一も導入されないときには露光用光源 C20が利用される。上記光学系の各波長の光源は必要に応じて増設することも可能である。

次に平面状光源の実施態様を説明する。平面状光源は、エレクトロルミネヅセンス（E L ) 素孑などの面発光体によっても構成できる。しかし、発光層が厚いと、試料に結像して照明した際に、試料厚み方向（Z方向）の像が大きくなつてしまい、 Z方向の分解能が上がらない。平面状光源は厚みが薄い物ほど、 Z方向の分解能をあげるのに有利である。以上の考察から、所定の光で照明した、散乱層が極めて薄い薄膜散乱体も平面状光源として利用可能である。薄膜散乱体は、例えば、 Light Shaping Duffuser (POC社米国 CA. Torrance) が知られている。

本発明は平面状光源を空間光変調素子に結像して照明し、この画素に対応させて撮像するので、空間光変調素子の画素 1個に付き発光点が 1個、または複数個対応していれば、 E L素子などの連続面発光体でなくとも、離散的な点光源の面上アレイを利用可能である。面上アレイは、例えば、 LEDや Laser Diodeの二次元アレイや所定の方法で照明されたマイク口レンズとピンホールの二次元アレイがある。面上アレイは、微細で十分点光源とみなせると共に、縮小光学系と組み合わせることによって、空間光変調素子の画素に対して 1対 1または 1対複数個対応する点光源の 2次元アレイによって構成する。

同様に多数の光ファイバ一を束にした光ファイバ一バンドルの一端から所定の光を入射させ、反対側の光射出端や、同様にファイバ一ォテイクプレートの光射出端、また同様にウレクサィトの光射出端は平面状光源として利用できる。例えば、 3〃径のファイバ一を束にしたファイバーォテイクプレートは、空間光変調素子の一つの画素に、 1本のファイバ一の射出端である点光源が 16~25個割り振られる。空間光変調素子の一つの画素は、 DMDの場合は 16 /角のマイクロミラ一である。反射型液晶パネルの場合は 13.5 角の液晶素子である。照明光補正手段を備えた場合は、空間光変調素子のどの画素にも最低 1個の点光源が割り振られればよい。撮像系は、撮像レンズ 27、フィル夕 28(28A,28B,28C)、 CCD29からなっており、バイオチップ 1の蛍光実像を撮像する。フィル夕 28は、撮像レンズ 27と C CD29の中間に選択可能に設置され、蛍光色素に応じた波長を透過する。例えば、 F I T C, Cy3、 Cy5 の蛍光色素にはそれそれ 520 nm、 570 nm、 670n mを中心波長とするバンドパスフィル夕が設置される。 DMD6 と撮像レンズ 27、 C C D 29はシャインプルーフの条件を満足する。この撮像系は励起光の均一化、或いは露光光の均一化の際にも利用される。同様に、光の面内分布の測定ではモニタとしても利用される。コンピュータ 'システム 3は、パラレルアツセィ用バイォチヅプ 1の分析に必要な D M D 6の制御、薬液管理、温度管理、 C C D 29の制御、露光光や励起光を均一化する照明光補正などのソフトウエア、オフラインで利用するバイォチヅプ 1の解析ソフトウエア、ユーザーィン夕一フェースソフトウェアを搭載し、ィン夕一ネヅトなどのネットワークに接続されているコンピュータ 30、表示装置 31、キーボード 32、ポインテングデバイス 33から構成される。

恒温薬液供給システム 4は、着装したバイォチップ 1が上蓋を形成し、かつ設定された温度に保つフロ一セル 41、コンピュー夕 30から制御される電磁弁 44が設置された反応試薬容器 42、洗浄液容器 43、被検試料の導入手段から構成されており、バイォチップ作製時の光活性化力ップリング反応の各ステップに同期して薬液や洗浄液を供給する。フローセル 41は、バイオチップ 1の作製時はもちろん被検試料との反応や読取時にも利用される。上記反応は遺伝子分析に利用する際には、特にハイブリダィズと呼ばれる。

バイオチップ 1の作製完了後、導入口 45から被検試料をフローセル 41 中に導入し反応させる。読取りは、バイオチップ 1をゥエツト状態、或いはドライ状態で行われる。ウエット状態での読取りは、高い蛍光収率になるという特長があり、液体中にバイオチップ 1をさらして行われる。ドラィ状態での読取りは、導入口 45からクリーンなドライ窒素ガスを導入し、バイオチップ 1を乾燥させて行われる。フロ一セル 41 の温度は、所定の設定が可能に構成されており、バイオチップ 1の読取り時の温度変化による影響が調べられる。また、装置全体を 10~20度傾けて使用するための調整ねじ（図示していない）が設けられている。これはフローセル中に生じた気泡を追い出し、安定にバイォチップ 1を分析するためである。

本実施例によれば、バイオチヅプ 1の分析操作を、フローセル 41からバイオチップ 1の着脱を行うことなく、すべて実施できるので、能率良くでき、かつ汚染が少ない。

空間光変調素子として採用した DMD6は、微小光偏向素子で、多数の微小なマイク口ミラ一が配列された構造になっている。個々のマイクロミラーは、個別にデジタル制御手段で所定の二つの角度傾動させることができる。すなわち、個々のマイクロミラーは二つの安定状態を持ち、外部から導入された光を二つの方向の光路に切り替える機能'を有する。 DMD6 は、マイクロミラーの酉 3歹!]が 800X600、 1024X768、 1280X1024、 1920 X 1080など数種あり、またマイクロミラ一を傾動する角度も ±10度と土 12度の 2種類が販売されており、いずれでも適用できる。 DMD6を制御することで、パターンによる露光（作製時）や共焦点走査蛍光検出（読取り時）を実現した。

DMD6は、バイオチップ作製時とバイオチップ読取り時の両方で利用されている。作製時には、光源部 20 を露光光源 Cに切換える。露光光源 Cの光はファイバ一ォプティヅクプレ一ト 24に入射し、射出端に形成された平面状光源が DMD6を結像照明する。この結像照明光は、露光パ夕 —ンに対応して傾動した DMD6のマイクロミラーによって反射される。この反射光は結像レンズ 3、対物レンズ 2を介して結像し、バイオチップ 1の所定のスポット位置が露光される。読取り時には、作製時に使用する露光光源 Cから波長の異なる蛍光励起光源 Aまたは Bに切換え、光路にミラ一 23Aまたは 23 Bを揷入する。光源 Aまたは Bの光は、ファイバーォプテックプレート 24に入射し、射出端に形成された平面状光源が D M D 6上に結像されて第 2光源となる。傾動されたマイクロミラーにより第 2光源の微小域が切り出され、結像レンズ 3と対物レンズ 2が形成する光路によって、バイオチップ上に縮小結像される。この結像点から射出された蛍光が上記の光路を逆進し、マイクロミラ一に結像する。マイクロミラ一上の像は、ダイクロイツクミラー 26 で蛍光だけに選別され撮像レンズ 27により再び結像されて C C D 29により撮像される。この際に蛍光フィルター 28 (28A,28B,28C) で混入した励起光を除外して S /Nを高める。

本実施例は、対物レンズ 2と結像レンズ 3とからなる縮小光学系を採用したが、これに限定されない。光学系はバイオチップ 1のサイズに応じて等倍光学系、或いは拡大光学系が取捨選択される。

バイオチップの作製時における、露光光の均一化について説明する。フローセル 41上に一様な蛍光板を設置し、個々のマイクロミラーに対応する蛍光強度を C C D 15 でモニタし、均一化する前の露光光の強度分布を測定する。ついで個々のマイクロミラーに対応する位置の露光光強度が一定値になるように、マイクロミラーごとの蛍光強度の逆数を算出し露光光補正テーブルを作成する。以下の二つの方法では露光光補正テーブルを利用する。

第一の方法は、マイクロミラーごとの露光時間を制御する。バイオチヅプの作製時には露光光補正テーブルが参照され、マイクロミラ一ごとの露光時間を可変制御して短縮、或いは延長する。第二の方法はすべてのマイク口ミラーで露光時間は一定に保つがマイク口ミラ一ごとにバイナリーパルス幅変調（BPWM) を施し強度変調する。作製時には露光光補正テーブルが参照されて、個々のマイクロミラーの反射光に強度補正が施され、全体で均一な露光光が得られる。この露光光補正方法はバイオチップの作製時だけでなく、後述の読取り時にも利用される。

バイオチップの読取り時における、共焦点光学系を形成する照明方法について説明する。光源からの光はファイバ一ォプチカルプレ一ト 24を通過し、その射出端面に平面状光源を発生させる。この平面状光源を D M D 6の表面に結像させると、 D M D 6 の表面に平面状光源の実像が生じる。 D M D 6上で選択された 1個のマイクロミラーが傾動することによって、抽出された平面状光源の微小領域（ 1 6 角）が対物レンズ 2を通してバィォチップ 1のスポッ卜に照明される。すなわち、選択されたマイクロミラーに結像した平面状光源は、バイオチップ 1の特定された読取り面の微小領域に対物レンズ 2を通して縮小結像され、上記微小領域を照明する。この微小領域から射出される蛍光だけが前述のマイクロミラ一を介して撮像される。傾動する 1個のマイク口ミラ一を D M D 6上で順次切換えて走査すると、バイオチップ 1が共焦点蛍光走査される。

前述の共焦点光学系の照明方法では走査されるマイクロミラーは 1個として説明したが、これに限定されない。他の方法としては、焦点ずれ光や迷光を除去する空間光変調機能を保持する程度に D M D 6上でマイクロミラーが十分離れていれば、複数のマイク口ミラーを同時に併進して走査することができる。例えば、 2000 個のマイクロミラーを併進して走査することにより高速化を実現できる。

共焦点蛍光走査手段と励起光補正手段とが単一の空間光変調素子によつて同時に実現されている。読取り時の照明光の強度分布は（一様な）均一な蛍光板によって調整する。均一化前の蛍光強度を測定し、励起光補正テーブルが作成される。励起光補正テーブルは照明光源の数だけ個別に設けられる。これらの励起光補正テーブルは、読取り時に利用される光源に応じて参照され、露光光補正の第 1の方法又は第 2の方法により、位置による照明光と検出感度のバラヅキが補正される。

上記の補正機能はコンピュータとそれに搭載されたソフトウェアによつて実現されている。

本発明の第二の実施例を説明する。第二の実施例は、 LCOS(Liquid Crystal on Silicon)と呼ばれている反射型液晶パネルを空間光変調素子として利用したバイオチップ分析装置である。

反射型液晶パネルは、個々の画素が微小な液晶セルであり、印加電圧（ァナログ量）で反射される光の偏光方向が制御される。反射型液晶パネルと PBS(Polarized Beam Splitter)とを組み合わせると空間光変調、強度変調に利用することができる。反射型液晶パネルは、例えば、サイズが 13.5 X 13.5〃の液晶セルを 1365 X 1024個集積されている。他にもさまざまな液晶セルサイズと集積数を有する反射型液晶パネルがある。本発明は透過型の液晶も利用可能である。透過型液晶パネルは画素の一部を TFT などのスィツチング素子が領有するので有効な画素領域が全面を覆えないため、画面全体を滑らかに制御できないので、. この事を考慮して設計する必要がある。

図 2は第二の実施例の光学系を示すもので、図 1に示すコンピュー夕システムと恒温薬液供給システムが省略されている。バイオチップの作製時に利用する露光用光源 20C とバイオチップの読取り時に利用する励起用光源 20Aが設置されている。これらの光源はミラ一 23C が光路に導入されることによって切り換えられる構成になっている。すなわちバイォチップ作製時にはミラ一 23C が光路からはずされて露光用光源 20C が使用され、バイオチップの読取り時にはミラー 23Cが光路に導入されて励起用光源 20Aが使用される。前記のいずれかの光源からの光はファイバーォプチツクプレ一ト 24 に導入され、その射出端に平面状光源が生じる。この平面状光源を反射型液晶パネル 60に結像する結像レンズ 25と、蛍光を透過し励起光や露光光を反射するダイクロイツクミラ一 26、偏光角によって光を分岐する PBS61が設置されている。バイオチヅプ 1と PBS61の間には、結像レンズ 3、対物レンズ 2が設置されている。反射型液晶パネル 60の表面は、 PBS61を介してバイオチップ 1の表面に結像される。 CCD29は、蛍光像の撮像、或いは照明光のモニターのために利用される。 CCD29 には、撮像レンズ 27によって反射型液晶パネル 60の表面が結像される。上記の光学系では、液晶セルに印加するアナログ電圧によって液晶セルからの反射光の偏光角度が制御される。光量は、制御された光の偏光角度によって透過又は反射される PBS61 の光の分岐作用によって制御される ( 具体的には液晶セルに電圧を印加しない状態では光源からの光が PBS61 を透過し、バイオチップを照明する。液晶セルに所定の最高電圧を印加した場合の光源からの光は PBS61 によって反射されバイオチップを照明しない。液晶セルに最高電圧以下の中間の電圧を印加した場合は、印加電圧に逆比例する光量でバイオチップを照明する。本実施例ではコンピュータ一のアナログ RGB 画像出力端子と液晶パネル制御基板 (図示せず）を接続した。空間光変調機能は、前述した個々の液晶セルを電圧制御することによって実現される。液晶セルを用いた空間光変調機能は、バイオチップの作製時の露光パターンを発生させるマスク機能又はバイォチップ読取り時の共焦点蛍光走査機能、或いはバイォチップ作製時と読取り時の両方に利用する照明光補正機能として利用される。これらの各機能については、第一の実施例と同一なので、その説明は省略する。

本発明の第三の実施例を説明する。第三の実施例は、機械的な切替えを行わないで二波長分析を可能にしたバイオチップ分析装置である。

—枚のバイオチップの読取りにおいて、 2波長の蛍光の読出しを必要する場合がある。例えば、同一臓器の病変部位の RNA と正常部位の： RNA を抽出し、各部位の RNAを逆転写した c DNAを波長の異なる 2種類の蛍光色素、例えば Cy3、 Cy5で標識した後、混合して、一枚のバイオチップに反応させ、それそれの比率を比較する分析などである。

図 3は第三の実施例の光学系を示すもので、コンピュータシステムと恒温薬液供給システムは省略されている。本実施例は、第一の実施例の蛍光励起用照明の光学系と撮像の光学系を波長ごとに独立して 2組配置した 2波長読取り可能なバイォチヅプ分析装置である。

光学系の中央には、バイオチヅプ 1 と対物レンズ 2と結像レンズ 3 と空間光変調素子である D M D 6が設置され、中心光軸が形成されている。対物レンズ 2 と結像レンズ 3とは、バイオチップ作製時にはバイオチップ 1 を照明露光する。また、その読み取り時には D M D 6の表面をバイオチップ 1に結像して所定のスポットを励起し、励起されたスポヅトから射出された蛍光を D M D 6表面に結像させる機能を有する。

蛍光検出波長の異なる A光学系 (左）と B光学系 (右)が中心光軸を対称に設置されている。 A光学系は光源 Aによる特定波長の蛍光励起用照明系と撮像系に加えて、光源 Cによる露光光照明系を構成している。 B光学系は A光学系とは異なる波長の蛍光励起用照明系と撮像系を構成している。両光学系には、蛍光励起用の光源 Aと： B、露光照明用の光源 C、ダイクロイヅクミラ一 26Aと 26 B、ノンドパスフィル夕一 28Aと 28Bのそれそれの波長ごとに異なる光学素子によって構成されている。その他の要素は同一である。ここでは、 A光学系のみを説明する。

A光学系は、切替え可能な特定波長の光源 Aと露光光の光源 Cを備え、切替えられた光源からの光をファイバ一ォプチカルプレート 24 に入射させ、その射出端に生じた平面光源の像を照明レンズ 25 によって D M D 6 の表面に結像する。照明レンズ 25 と D M D 6の間には、励起光または露光光を反射し、蛍光を透過させる為のダイクロイツクミラ一 26Aを設置する。

バイオチップ作製時には、光源 Cに切替えて第一の実施例と同様にバイォチップを作製する。バイオチップ読取時には、切替えた光源 Aの特定波長の励起光によって第一の実施例と同様にバイオチップ 1を読取る。以上の構成により、バイオチップ 1が共焦点蛍光走査され、バイオチヅプ 1の蛍光情報を読取ることができる。 A 光学系と B光学系の双方を利用したバイォチップの読取りについて具体例を基に説明する。例えば、 A光学系は蛍光色素として C y 3を利用した読取り、 B光学系は C y 5を利用した読取りを行う場合には、蛍光励起用の光源 Aと B、ダイクロイツクミラ一 26Aと 26B、バンドパスフィル夕一 28Aと 28Bをそれぞれの蛍光波長を 570 nm、 670 n mに適合したものを設置する。測定前に、均一な Cy3の蛍光板をバイオチヅプの換わりに設置し、 A光学系の補正テーブルを作成する。同様に Cy 5用の B光学系の補正テーブルを作成する。

バイオチップ 1を設置し、まず A光学系にて Cy3の蛍光情報を読取り、その後、 B光学系に切換えて Cy5の蛍光情報を読取る。

本実施例によれば、光源ゃフィル夕などの機械的な切り換えが不必要で、光源の点灯と使用する CCD の切り換えだけで、 2 波長の蛍光を順次測定できる。

本発明の他の実施形態を説明する。本実施形態は、上記の各実施例のバィォチップ分析装置を用いてバイオチップの作製と反応と読取りを実施するクライアントと、バイォチップの作製に必要なデ一夕のクライアントへの提供とクライアントからの読取りデ一夕に基づいてクライアン卜が要求するバイオチップ分析を実施するバイオチップ情報セン夕一とをコンピュー夕ネヅトワークに接続した、バイオチップ分析オンラインシステムを提供するものである。

本システムは、コンピュータネットワークを通じて、オリゴヌクレオチドの配列データのセットゃ蛋白質のアミノ酸の配列デ一夕のセットと、ヌクレオチド又はペプチド又は糖鎖の 1次構造とからなる情報を提供し、クライアントから読取り結果を回収し、分析結果を再びクライアントに返却する。上記オンラインシステムは、バイオチップの作製に必要な情報の提供および読取ったデータに基づく分析について課金する。

第 6図において、クライアント側には、本発明のバイオチップ分析装置が設置される。バイオチヅプ情報セン夕一には解析プログラムを内蔵したシステム本体と各種のバイォチップ作製デ一夕とバイオチップ解析デー夕を蓄積したデータベースが設備されている。バイオチップ分析装置のコンピュー夕 ·システム 3とバイォチヅプ情報セン夕一のシステム本体とをコンピュータネヅトワークで接続する。クライアントは複数存在するが一つだけ図示している。

システム本体には、バイオチヅプ作製対応処理プログラム、バイオチップ解析対応処理プログラムを内蔵し、バイオチップの作製データベース、解析デ一夕一ベースが設置されている。バイオチップ作製データペースにはバイォチップの作製に必要な遺伝子関連分析用と蛋白質分析関連用の塩基配列のセヅトゃアミノ酸配列のセヅト、その他にバイオチップ上でのスポッ卜の配列レイァゥトを所定のデータ構造が蓄積されている。バイォチップ解析データべ一スには解析を実施する上で参照される既知の遺伝子や蛋白質の分類情報が蓄積されている。

本システムの処理の流れについて、図 6を参照しながら説明する。クライアントは、バイオチップ作製の準備が終了した後、バイオチップ分析装置をバイオチップ情報セン夕ーに接続し、バイオチップ作製対応処理プログラムとネットヮ一クを通じて交信し、バイオチップのリストを要求するリスト表示されたバイオチップ、例えば環境ホルモン応答遺伝子分析用バィォチップなどの様に分析項目に応じたバイォチップを選択発注する。ノィォチップ情報セン夕—は、クライアントから受けたバイオチップ及び解析項目を基に課金を計算する。その後、選択されたバイオチップの各スポットの塩基配列データのセットとバイォチップ上でのスポットの配列レィアウトからなるバイオチップ作製データを送信し、料金を通知する。バィォチヅプ分析装置はバイォチップ作製デ一夕を受けると、バイオチップの製作を実施する。

作製したバイオチップは、手動またはバイオチップの完成のトリガー信号を受けて自動的に被検試料導入口から被検試料が導入され、ハイブリダィズなどの反応が実施される。バイオチップの反応終了のトリガ一信号を受けて自動的にバイオチップの読取りを開始し、読み取ったデ一夕をメモリに格納する。クライアントは、バイオチヅプ情報センタ一に対しバイオチップを指定して解析を要求する。バイオチップ情報センタ一は、クライアントの要求に応じてバイオチップ解析対応処理プログラムを起動し、クライアン卜に対して解析項目リストを送信する。解析項目リストは、可視化処理、クラス夕解析、構造階層解析、多型性の解析などの各種の処理や解析の項目が用意されている。クライアントは、表示された解析項目リス卜から所定の項目を選択して発注し、バイオチップ読取データを送信する。バイォチップ情報セン夕一は、指定のバイォチップの解析項目を受注し、課金計算を行う共にバイオチップの読取りデーターを受信し、選択された解析項目による処理や分析を行い、その結果を送信する。クライアントは、解析結果、課金情報を受信し、確認情報を表示し、その内容を確認してメモリに格納する。本システムは本発明のバイォチップ分析装置だけを限定的にクライアントとするものではない。本発明のバイオチップ分析装置やバイオチップ読取り装置、またはネットワークに対応した他の既存のバイオチップ作製或いは読取り専用機でも利用することができる。また、本システムは本発明のバイオチップ分析装置をネットワークに接続し、他の装置で作製したバイオチップの読取りから解析、或いは予め準備されたバイオチップ読取データから解析などの各種形態で利用することができる。更には、本システムを利用して、 C Dや D V Dなど記録媒体に記録したバイオチヅプ読取デ一夕を読取ってバイォチップ情報センターに解析を依頼することもできる。

本システムによれば、クライアント側でバイオチップ作製対応処理プ口グラムとの交信直後にバイオチップ解析対応処理プログラムと交信して作製および解析の発注手続を行うことで、バイオチップの作製、反応、読取、解析のバイオチップによる一連の分析が全自動で実施される。この全自動とは、上記一連の分析操作の途中でォペレ一夕の介在なく行われることである。本発明の他の実施形態

本発明は、上記実施例のバイオチップ分析装置に限定されるものでなく、バイオチップの作製、反応、読取りのいずれかの機能の単独或いは組み合わせによって構成される装置にも適用.できる。

また本発明は、バイオチヅプ以外にも従来のサザンプロット、ノーザンプロット法を、ラジオアイソト一プによる標識■検出でなく蛍光色素による標識 ·検出で行う場合の蛍光強度分布の測定に応用できる。上記のサザンブロット、ノ一ザンブロット法は、ハイプリダイゼーションを利用した解析手法である。上記の用途としては、例えばナイロンや二トロセルロース膜ゃゲル膜などの蛍光強度分布の測定がある。また、蛍光強度分布の測定だけでなく励起光を要しない化学発光物質で標識を行った実験の化学発光の強度分布を測定する用途にも利用できる。この際には照明光と検出感度の補正のために、本実施例で用いた均一な蛍光板の替わりに均一に化学発光する試料を利用する。産業上の利用可能性

( 1 ) バイオチップ分析装置

従来フォトリソグラフィ一法で用いられていたフォトマスクを利用することなしに空間光変調素子をソフトウェア上からの制御で実現される。露光光補正について、従来のフライアイレンズなどによるハードウェアによる照明の均一化法とは異なり、本発明は個々の装置ごとに露光光の補正するので、装置間のバラツキを排除することができると共に、光源の切替ゃ交換にも柔軟に対応することができる。また、露光光補正手段は、露光パターンを発生する空間光変調素子に、あわせもたせることが出きるので装置の小型化、低価格化に貢献する。

バイォチップの読取りは、従来の共焦点走査機能を空間光変調素子を利用してソフトウェア上からの制御で実現できる。また、空間光変調素子ごとに照明光強度を調整して照明光の面内分布を改善し、位置による照明光と検出感度のバラツキが補正される。 ( 2 ) バイオチップオンライン分析システム ―

クライアント側のバイオチップ分析装置とバイオチップ情報セン夕一のシステム本体をコンピュータネットワークで接続する。クライアントは、バイオチヅプ情報セン夕一に対してオンラインにより発注したバイオチヅプの配列データ及び一次構造データのセット情報をバイオチップ分析装置が受け取る。バイオチップ分析装置は、上記のセット情報を基にバイォチップの作製、反応、読取りの各工程を実施すると共に、バイオチップの読取りデータをバイォチップ情報セン夕一が回収し、クライアントが指定した解析項目に従ってバイオチップ解析を行う。その解析デ一夕をクライアントに送信する。これによりクライアン卜が手持ちの被検試料を分析できるようになる。

Claims

請求の範囲

1 . 単一の空間光変調素子と、

露光照明用光源と、

前記露光照明用光源で前記空間光変調素子を照明し、バイォチップに複数配置するヌクレオチド又はペプチド又は糖鎖のスポットの配列レイァゥトと各スポット上のヌクレオチド又はべプチド又は糖鎖の 1次構造とから定まる露光パターンにより前記空間光変調素子を制御してバイオチップ基板上のヌクレオチド又はべプチド又は糖鎖を配するスポット位置を選択的に露光し、複数種類の塩基又はアミノ酸又は糖を所定の位置に光活性化力ヅプリング反応を起こし、ヌクレオチド又はべプチド又は糖鎖の合成伸長を行うバイオチップ作製手段と、

前記作製されたバイオチップと蛍光標識した被検試料とを反応させるバイオチップ反応手段と、

蛍光励起光源と、

蛍光撮像を行う撮像手段と、

前記蛍光励起光源を前記空間光変調素子に結像照明し、前記バイオチツプ反応手段により被検試料と反応させたバイオチップ上の微小域を選択的に照明して前記微小域から射出される蛍光だけを前記撮像手段で選択的に撮像する共焦点走査を行うバイオチップ読取手段と、

前記各光源および前記手段を制御する制御手段と、

を備えていることを特徴とするバイオチップ分析装置。

2 . 請求項 1において、バイオチップ作製手段が露光照明用光源を利用して構成された第 1光学系と、バイォチップ読取手段が蛍光励起光源を利用して構成された、前記第 1光学系とは異なる第 2光学系とを備えていることを特徴とするバイオチップ分析装置。

3 . 請求項 1において、露光照明用光源、蛍光励起光源、バイオチップ作製手段、バイォチップ読取手段のそれそれの光学系を共通な光学系で構成し、前記露光照明用光源と蛍光励起光源を平面状光源とし、該平面状光源をバイォチップ作製のときに切り替える光源切替手段を備えていることを特徴とするバイオチップ分析装置。

4 . 請求項 1乃至 3のいずれかの記載において、

露光照明用光源で空間光変調素子を照明したとき、又は蛍光励起光源を空間光変調素子に結像照明したときの照明光強度の面内分布を測定する光強度測定手段と、前記測定した照明光強度の面内分布を基に前記空間光変調素子を制御し、バイオチップの照明光強度の面内分布を補正する照明光補正手段とを備えていることを特徴とするバイオチップ分析装置。

5 . 請求項 4において、照明光補正手段が第 1光学系及び第 2光学系に独立して設けられており、前記第 1光学系がバイオチップ作製時に露光照明用光源を利用して構成され、前記第 2光学系がバイォチップ読取時に蛍光励起光源を利用して構成され、前記第 1光学系とは異なることを特徴とするバイオチップ分析装置。

6 . 請求項 4において、照明光補正手段がバイオチップ作製及びバイオチップ読取の共通の光学系を利用し、前記バイオチップ作製時とバイオチップ読取時の光源切替えに併せて前記照明光補正手段を切替えることを特徴とするバイオチップ分析装置

7 . 単一の空間光変調素子と、露光照明用光源と、

前記露光照明用光源で前記空間光変調素子を照明し、バイオチップに複数配置するヌクレオチド又はぺプチド又は糖鎖のスポットの配列レイァゥトと各スポット上のヌクレオチド又はぺプチド又は糖鎖の 1次構造により前記空間光変調素子を制御してバイォチップ基板上のヌクレオチド又はべプチド又は糖鎖のスポット位置を選択的に露光し複数種類の塩基又はァミノ酸又は糖を所定の位置に光活性化力ップリング反応を起こし、ヌクレオチド又はぺプチド又は糖鎖の合成伸長を行うバイォチップ作製手段と、

照明光強度の面内分布を測定する光強度測定手段と、

前記測定した照明光強度の面内分布を基に前記空間光変調素子を制御し、バイオチップの照明光強度の面内分布を補正する照明光補正手段と、を備えていることを特徴とするバイオチップ分析装置。

8 . 請求項 1又は 7において、照明用光源が離散的な点光源の面上アレイであることを特徴とする装置。

9 . 請求項 1又は 7において、照明用光源が平面状光源で、前記平面状光源を前記空間光変調素子に結像照明することを特徴とする装置。

1 0 . 請求項 9において、平面状光源がファイバ一ォプティヅクプレートによって構成されていることを特徴とする装置。

1 1 . 請求項 9において、平面状光源がウレクサィトによって構成されていることを特徴とする装置

1 2 . 請求項 9において、平面状光源が薄膜散乱体によって構成されていることを特徴とする装置。

1 3 . 請求項 1において、蛍光励起光源が平面状光源であることを特徴とする装置。

1 4 . 単一の空間光変調素子と、

平面状光源と、

蛍光撮像を行う撮像手段と、

前記光源を前記空間光変調素子に結像し、前記バイオチップ反応手段により被検試料と反応させたバイオチップ上の微小域を選択的に照明して前記微小域から射出される蛍光だけを前記撮像手段で選択的に撮像する共焦点走査を行うバイオチップ読取手段と、

照明光強度の面内分布を測定する光強度測定手段と、

前記測定した照明光強度の面内分布を基に前記空間光変調素子を制御し、バイオチップの照明光強度の面内分布を補正する照明光補正手段と、を備えていることを特徴とするバイォチップ分析装置。

1 5 . 請求項 1、 7、 1 4のいずれかの記載において、空間光変調素子が D M Dであることを特徴とする装置。

1 6 . 請求項 1、 7、 1 4のいずれかの記載において、空間光変調素子が反射型液晶パネルであることを特徴とする装置。

1 7 . 請求項 1又は 7において、バイオチップを載置し、該バイオチヅプの温度管理下で作製、反応、読取りを行うフローセルと、前記バイオチップ上にヌクレオチド又はべプチド又は糖鎖を合成伸長させるための薬液を供給する手段と、を備えていることを特徴とする装置。

1 8 . 請求項 1又は 7において、照明光補正手段はあらかじめ均一な蛍光板を被露光試料の換わりに仮設し、空間光変調素子を構成する各画素毎に対応する補正前の露光光の分布を測定する手段と、

前記各画素に対応する補正前の露光光の強度の逆数を数表化し、記憶する手段と、

露光時に、上記の数表を参照して、所定の露光パターンに従って各画素を有効状態にする為に必要な露光時間を数表値で制御する手段と、を備えていることを特徴とする装置。

1 9 . 請求項 1又は 7において、照明光補正手段はあらかじめ均一な蛍光板を被露光試料の換わりに仮設し、空間光変調素子の各画素毎に対応する補正前の露光光の分布を'測定する手段と、

前記各画素毎に対応する補正前の露光光の強度の逆数を数表化し、記憶する手段と、

露光時に、前記数表を参照して、所定の露光パターンに従って各画素毎に強度変調を施し一定の露光時間内で露光光の積算強度を一定に制御する手段と、

,を備えていることを特徴とする装置。

2 0 . 請求項 1 8又は 1 9において、空間光変調素子が反射型液晶パネルであることを特徴とする装置。

2 1 . 請求項 1、 7、 1 4のいずれかの記載において、空間光変調素子が D M Dで構成され、

照明光補正手段はあらかじめ均一な蛍光板をバイォチヅプの換わりに仮設し、 D M Dの各マイクロミラー毎に対応する補正前の照明光の分布を測定する手段と、前記各マイク口ミラー毎に対応する補正前の照明光の強度の逆数を数表化し、記憶する手段と、

読取り時に、上記の数表を参照して、走査傾動する各マイクロミラーのサンプリング時間を数表値に比例して制御する手段と、

を備えていることを特徴とする装置。

2 2 . 請求項 1、 7、 1 4のいずれかの記載において、空間光変調素子が D M Dで構成され、

照明光補正手段はあらかじめ均一な蛍光板をバイォチップの換わりに仮設し、 D M Dの各マイク口ミラ一毎に対応する補正前の照明光の分布を測定する手段と、

前記各マイク口ミラー毎に対応する補正前の照明光の強度の逆数を数表化し、記憶する手段と、

読取り時に、上記の数表を参照して、走査傾動する各マイクロミラ一に強度変調を施し一定のサンプリング時間内で照明光の積算強度が一定になるよう制御する手段と、

を備えていることを特徴とする装置。

2 3 . 請求項 1又は 7において、空間光変調素子が反射型液晶パネルで構成され、

照明光補正手段があらかじめ均一な蛍光板を被露光試料の換わりに仮設し、前記反射型液晶パネルの各液晶セル毎に対応する補正前の露光光の分布を測定する手段と、

前記各液晶セル毎に対応する補正前の露光光の強度の逆数を数表化し、記憶する手段と、作製時に、上記の数表を参照して、所定の露光パターンに従ってオフする液晶セルの照明時間を数表値に比例して制御する手段と、

を備えていることを特徴とする装置。

2 4 . 請求項 1又は 7において、空間光変調素子が反射型液晶パネルで構成され、

前記各液晶セル毎に対応する補正前の露光光の強度の逆数を数表化し、記憶する手段と、

作製時に、上記の数表を参照して、所定の露光パターンに従ってオフする液晶セルの強度変調を施し一定の露光時間内で露光光の積算強度が一定になるよう制御する手段と、

を備えていることを特徴とする装置。

2 5 . 請求項 1 5において、 D M Dは複数のマイクロミラーが同時に併進走査されることを特徴とする装置。

2 6 . 請求項 1、 7、 1 4のいずれかの記載において、蛍光波長の異なるバイオチップ読取り系を 2組独立して配置したことを特徴とする装置。

2 7 . 請求項 1 ~ 6， 1 4のいずれかに記載されたバイオチップ分析装置と、バイオチヅプの配列デ一夕及び解析デ一夕を蓄積したデータベースおよびバイオチップ読取データを基に解析を行うバイオチップ解析手段を有するシステム本体をコンピュータネヅトワークに接続したバイォチップ情報センターと、を備え、前記バイオチップ分析装置は、少なくともバイオチップの読取りを行うと共に、前記システム本体は前記バイォチップ分析装置からバイオチップ読取デ一夕を回収し、解析を行い、その解析デ一夕を前記バイオチップ分析装置に返信することを特徴とするバイオチップオンライン分析システム o

2 8 . 請求項 2 7において、バイオチップ分析装置は、バイオチップ配列デ一夕を用いてバイォチップの作製を行う手段を備えていることを特徴とするバイォチップオンライン分析システム。

2 9 . 請求項 2 7において、バイオチップ分析装置は、バイオチップ配列データを用いてバイオチップを作製する手段と、該作製したバイオチップを反応させる手段とを備えていることを特徴とするバイォチップオンラィン分析システム。

3 0 . 請求項 2 7〜2 9のいずれかの記載において、バイオチップ配列デ一夕は、バイオチップ分析装置の要求に応じてシステム本体から配信されることを特徴とするバイオチヅプオンライン分析システム。