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WO2004007540A1 - Extraits membranaires de klebsiella presentant des proprietes avantageuses, et procede de production de ces extraits - Google Patents

Extraits membranaires de klebsiella presentant des proprietes avantageuses, et procede de production de ces extraits Download PDF

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Publication number
WO2004007540A1
WO2004007540A1 PCT/FR2003/002185 FR0302185W WO2004007540A1 WO 2004007540 A1 WO2004007540 A1 WO 2004007540A1 FR 0302185 W FR0302185 W FR 0302185W WO 2004007540 A1 WO2004007540 A1 WO 2004007540A1
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WO
WIPO (PCT)
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bacteria
lcos
extracts
kda
stage
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2003/002185
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English (en)
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WO2004007540A8 (fr
Inventor
Dominique Rigal
Daniel Masseau
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LCO SANTE
Original Assignee
LCO SANTE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LCO SANTE filed Critical LCO SANTE
Priority to AU2003271802A priority Critical patent/AU2003271802A1/en
Publication of WO2004007540A1 publication Critical patent/WO2004007540A1/fr
Publication of WO2004007540A8 publication Critical patent/WO2004007540A8/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/26—Klebsiella (G)
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    • A61K2039/55594—Adjuvants of undefined constitution from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to bacterial extracts, in particular extracts of Klebsiella, more particularly of Klebsiella pneumoniae, having advantageous properties, in particular, in several applications, increased activity compared to extracts of Klebsiella already known.
  • the process for producing these extracts is also part of the present invention.
  • This medication is composed of glycoprotein extracts obtained from a strain of Klebsiella p neumoniae (strain 01 K2 NCTC 5055). It is obtained after lysis of the bacterial walls, organic extraction, centrifugation and ultrafiltration.
  • the glyco-conjugate part is divided into 3 fractions: P1, F1, F2.
  • P1, of capsular origin represents approximately 50% of RU 41740, and has an average molecular weight of 95 kD,
  • F1 is of membrane origin and represents approximately 20% of RU 41740, and has an average molecular weight of 350 kD
  • F2 appears to be a part of P1.
  • RU 41740 does not cause a pyrogenic effect, as evidenced by the negativity of the Limulus test carried out with this compound.
  • RU 41740 has immunomodulatory activity. Its activity in humans has been demonstrated, in particular to stimulate the host's defenses in the case of chronic bronchitis (Fietta, Bersani et al. 1988), or to avoid delayed hypersensitivity reactions in affected patients. lymphomas (Lang, Gastaut et al. 1986). More recently, trials in mice have shown that parenteral administration of RU 41740 is effective in preventing the formation of intra-abdominal abscesses following infection (Finlay-Jones, Boyden et al.
  • Biostim is currently mainly prescribed to stimulate the immune system in children with respiratory infection.
  • RU 41740 has recently demonstrated two other advantageous properties of RU 41740.
  • This property of RU 41740, described in patent application No. FR 0100275, is of great interest in the field of cell therapy.
  • LCOS 1013 is composed of glycoprotein extracts obtained from the strain O1 K2 NCTC 5055 from Klebsiella pneumoniae. It is obtained by a process comprising stages of lysis of the bacterial walls, organic extraction, centrifugation and ultrafiltration, as described in Example 1.
  • the LCOS 1013 preparation protocol presents the advantage of not using mercurothiolate. This compound has, in addition to its lytic agent properties, antiseptic properties. Its elimination from the LCOS 1013 preparation protocol therefore leads to the need to carry out production under strict aseptic conditions, in order to protect the product from any bacterial contamination.
  • the LCOS 1013 preparation protocol presents, with respect to the process for preparing RU 41740, an additional step of molecular sieving with concentration (step 6 of Example 1), between the lysis step and the lyophilization steps and extractions. This step is carried out for example by tangential filtration, with a cutoff threshold of 40 to 60 kDa.
  • the immunological activity of these two active ingredients is also different.
  • the immunonephelometry test shows that LCOS 1013 has a different reactivity from RU 417401 when these products are reacted against an anti-RU 41740 immune serum, which means that the antigenic composition of these two products are different, at equivalent concentration (example 3).
  • the Applicant has also compared the activity of LCOS 1013 and RU 41740 in the maturation of dendritic cells obtained from monocytes (MODC) in vitro. Again, the LCOS 1013 proved to be significantly more efficient than the RU 41740, since (example 8).
  • the invention therefore relates firstly to a process for the preparation of bacterial extracts from encapsulated germs, comprising the following steps: a) culture of the bacteria, b) lysis of the bacteria, c) first molecular sieving, with concentration, d ) lyophilization of the concentrate e) extractions with organic solvents, f) re-solution, g) centrifugation, h) second molecular sieving, i) filtration j) lyophilization
  • the bacteria are Klebsiels, preferably Klebsiella pneumoniae.
  • the culture of the bacteria is preferably carried out at a pH below 6.7, for example at pH 6.5.
  • the stage of lysis of bacteria preferably lasts between 4 and 8 days, for example 6 days. More preferably, the lysis of the bacteria is carried out without adding a lysing agent comprising an antiseptic component. This allows on the one hand, a less polluting production for the environment and, on the other hand, to ensure greater health safety of the product, since it does not risk keeping traces of an antiseptic derivative.
  • the pH of the culture resulting from step a) is reduced to a value less than 6, for example at pH 5.8 ⁇ 0.1 before the addition of the lysing agents .
  • the first molecular sieving step, with concentration (step c) is an important step in the process of the invention.
  • this step leads to a concentration of a factor of between 1.5 and 3 of the lysed bacterial suspension resulting from step b), for example to a concentration of a factor 2.
  • This step c) leads to the elimination of the small unbound molecules, with a cutoff threshold preferably situated at 20 kDa, 70 kDa, or 100 kDa and, more preferably, at 50 kDa or around this value.
  • a cutoff threshold preferably situated at 20 kDa, 70 kDa, or 100 kDa and, more preferably, at 50 kDa or around this value.
  • cartridges which can be used for this are CARBOSEP type cartridges with a cut-off threshold of approximately 40 to 60 kDa.
  • step e) comprises an extraction with a ketone and an alcoholic extraction.
  • step e) comprises an extraction with acetone and an extraction with methanol, the volume used for each of these solvents being proportional to the mass of lyophilisate obtained from step d), so that
  • step f) of re-solution of the product from step e) is carried out without adding a substance with an antiseptic component.
  • the invention also relates to any product capable of being obtained by a process as described above.
  • a pharmaceutical composition comprising a product as described in the preceding paragraph, and intended to promote the maturation of dendritic cells (in vitro or in vivo), also forms part of the present invention.
  • the present invention also relates to a product capable of being obtained at the end of step c) of a process such as those described above.
  • a product will certainly have a lower purity than LCOS 1013, but it can be advantageously used for example in the manufacture of a cosmetic composition or of a composition intended for veterinary use.
  • Such pharmaceutical or veterinary compositions are also an integral part of the present invention.
  • FIG. 1 Summary diagram of the manufacturing steps of LCOS 1013.
  • Figure 2 Electrophoretic profiles of the various products mentioned in Example 2. The electrophoresis is carried out in SDS-PAGE, on polyacrylamid gel 8-16% Tris-Glycine, 1.5mm, 15 wells. Wells 1, 6, 11: Markers (200 kDa to 6 kDa) Wells 2 and 3: RU 41740 PA lot N ° 457 Wells 4 and 5: LCOS 1014 (Atomized stage) Wells 7 and 8: LCOS 1012 (Stage 11 of LCOS 1013) Wells 9 and 10: LCOS 1013 (Freeze-dried stage) Example 1: Manufacturing process for LCOS 1013
  • LCOS 1013 consists of a set of substances extracted from a culture lysate of Klebsiella pneumoniae. Its manufacturing method is based on the succession of stages or stages, d have the general schema and is presented below. Media that can be used for cultivation, as well as an indicative presentation of the progress of each stage, are described in more detail after this diagram. The manufacturing technique described below, purely by way of illustration, corresponds to an operating unit based on a volume of bacterial culture obtained in a fermenter of 600 liters.
  • the culture of the bacteria with a view to producing LCOS 1013 according to the succession of steps specified above, can be carried out using the culture media containing the following components:
  • the purpose of this stage is to carry out, on an agar medium in a Roux dish, the culture of Klebsiella pneumoniae necessary for the inoculation of a preculture in liquid medium, from a cryotube or a lyophilisate from the bank of job.
  • the work bank is made for example from a strain of Klebsiella pneumoniae from the Institut Pasteur, reference CIP 52.145.
  • the strain is revitalized by carrying out a bacterial suspension in the nutritive broth, from which boxes of Roux are inoculated, which are then incubated at 37 ° C + 0.5 for 20 to 24 hours.
  • a preculture is carried out in a 3-liter bottle, intended to inoculate a 35 I fermenter, which in turn is intended to inoculate a 600 I fermenter.
  • the first preculture is carried out in the preculture medium described above, to which a sterile glucose solution is added, at a rate of 30 ⁇ 10 g of glucose per 3 liters.
  • the second preculture is carried out in the culture medium for fermenter described above, to which 400 ⁇ 100 g of glucose are added.
  • Satellite vials containing respectively a sterile 10 N sodium hydroxide solution, a sterile solution of orthophosphoric acid diluted with Y ⁇ , and a sterile anti-foam solution can be used for the second preculture, in a fermenter, in order to in particular to maintain the pH around 6.5, throughout the duration of the preculture, that is to say approximately 5 hours at approximately 37 ° C., with stirring.
  • the object of this stage is to carry out in a fermenter, under defined conditions, a bacterial culture of content greater than or equal to 10 9 germs / ml, to allow subsequent extraction of a satisfactory quantity of product.
  • the suspension of germs contained in the 35 I fermenter is transferred to a 600 liter fermenter containing the fermenter culture medium described above, to which 5 kg of glucose have been added.
  • satellite tanks containing respectively a sterile 10 N sodium hydroxide solution and a sterile solution of orthophosphoric acid diluted to ⁇ A are used for the regulation of the pH around 6.5, thus than a satellite tank containing a sterile anti-foam solution.
  • the culture is carried out for approximately 7 hours, at 37 ° C ⁇ 1 ° C, with stirring.
  • the purpose of this stage is to inactivate the culture by the action of lysing agents and heating from 55 to 75 ° C. for a period greater than or equal to 40 minutes.
  • lysing agents used are the following:
  • the pH is brought to 5.8 ⁇ 0.3 using a sterile solution of orthophosphoric acid, then the above lysing agents are transferred to the culture.
  • the content of the fermenter is followed at a temperature of 65 ° C ⁇ 10 ° C and maintained for at least 40 minutes at this temperature with stirring.
  • the b iolysate o btenu e was then transferred to an industrial lysis tank (preheated to 65 ° C ⁇ 10 ° C), and maintained at this temperature for at least 20 minutes, before being brought back to 37 ° C ⁇ 2 ° C.
  • the lysis step consists in breaking the wall of bacteria by enzymatic way, which involves the release of the cytoplasmic constituents of the microbial cells. It is carried out by maintaining the pre-lyosed suspension of the previous stage, at 37 ° C ⁇ 2 ° C, in the lysis tank for at least 6 days
  • the volume of raw lysate is reduced by half to reduce the quantity to be treated in the following stages.
  • the concentration is carried out for example on an ultrafilter equipped with a CARBOSEP type filter cartridge with a cutoff threshold of 20 to 100 kDa, thus eliminating small unbound molecules.
  • the lyophilized LCOS 1013 lysate from stage 7 contains lipids which are partially removed by solid-liquid extraction, using acetone at room temperature. The product is recovered by centrifugation, then dried.
  • STAGE 9 Extraction with methanol:
  • the product obtained in stage 8 still contains residual lipids and pigments which are eliminated by solid-liquid extraction, using methanol at room temperature.
  • the product is recovered by centrifugation, then dried.
  • the ethanol extract from stage 9 is put back into aqueous solution, to allow the subsequent isolation of the product by centrifugation and ultrafiltration.
  • the crude suspension extract from stage 10 contains denatured proteins and water-insoluble matter which is removed by centrifugation.
  • the centrifuged product has a slightly colloidal appearance and is beige to brown in color.
  • This stage represents the essential stage of product isolation.
  • the product from stage 11 contains substances of different molecular sizes: mineral salts, proteins, glycoproteins, etc.
  • the macromolecules of PM> 300,000 constituting the product are isolated by ultrafiltration on a membrane with a cutoff threshold of 300 KD.
  • the product once introduced into the tank of the device, is continuously transported by means of a pump, in a closed circuit comprising an ultrafilter.
  • the medium is kept homogeneous by means of stirring.
  • the pressure created by the pump on the filter membrane forces part of the solute to pass through this membrane (permeate).
  • the retained part (retentate) remains in circulation. Knowing that we operate at constant volume, the loss of volume is constantly compensated for by the same volume of water.
  • the ultrafiltered solution At the end of the operation, the ultrafiltered solution.
  • the ultrafiltrate obtained is a slightly yellow translucent liquid solution.
  • stage 11 The clarification of the centrifugation supernatant obtained in stage 11 is refined by filtration through a nominal retention membrane of 1.2 ⁇ m.
  • the solution from stage 13 is then lyophilized, by a process comprising a freezing step, then the lyophilization proper.
  • the lyophilized glycoproteins have the appearance of a fluffy powder of white to cream color, hygroscopic.
  • STAGE 15 Mixing
  • the aim of this last step is to homogenize the lyophilized glycoproteins from stage 14.
  • Atomization can advantageously replace lyophilization and mixing (LCOS 1014).
  • Example 2 analysis of the electrophoretic profile of the new extract of Klebsiella pneumoniae LCOS 1013.
  • the objective of these experiments is to compare the electrophoretic profile of the lyophilized stage of the new extract of Klebsiella pneumoniae (LCOS 1013) and of RU 41740, the electrophoresis being carried out on SDS-PAGE gel.
  • LCOS 1013 wells 9 and 10
  • intermediate products for the manufacture of LCOS 1013 namely LCOS1012 (corresponding to the product obtained after stage 11 of the process described in example 1) (wells 7 and 8) and LCOS1014 (atomized stage) (wells 4 and 5).
  • - RU 41740 has a triplet of bands between 97.4 and 66.3 Kd, a triplet which is reduced to a doublet for LCOS 1013;
  • - RU 41740 has a second triplet of bands between 55.4 and 36.5 Kd, a triplet which is also present in LCOS 1013 but whose first two bands have a lower intensity in LCOS 1013 compared to bands of the same triplet in RU 41740.
  • Table 1 Densitometric analysis of the bands of molecular weight 97.4 Kd / 66.3 Kd and 55.4 Kd / 36.5 Kd appearing on the gel of FIG. 2.
  • Table 2 Densitometric analysis of the bands of molecular weight less than 36.5 Kd appearing on the gel of FIG. 2.
  • An asymmetry in the migration of the gel means that the Rf percentages of each of the markers on track 6 are greater than the Rf percentages of each of the markers deposited on track 11 by approximately 3%.
  • Table 1 summarizes the results obtained for the bands of molecular weight between 97.4 KDa and 55.4 KDa:
  • Table 2 which relates to the bands with a molecular weight less than 36.5 KDa, reveals that no significant difference appears between the bands corresponding to LCOS 1013 and to RU 41740.
  • the objective of these experiments is to measure the antigenic similarity between the two products.
  • This reactivate was measured by measuring the light scattered by a precipitate formed during the antigen-antibody reaction in a liquid medium, according to the technique.
  • the reactivity observed with respect to a product B identical to a product A against which the antibodies have been obtained must be greater than or equal to 75% of the reactivity observed with respect to product A; otherwise, this reflects a different chemical and / or structural composition between the two products.

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Abstract

L'invention porte sur des extraits bactériens, en particulier des extraits de Klebsiella, plus particulièrement de Klebsiella pneumoniae, présentant des propriétés avantageuses, notamment, dans plusieurs applications, une activité accrue par rapport aux extraits de Klebsiella déjà connus. Le procédé de production de ces extraits fait aussi partie de la présente invention.

Description

EXTRAITS MEMBRANAIRES DE KLEBSIELLA PRESENTANT DES PROPRIETES AVANTAGEUSES, ET PROCEDE DE PRODUCTION DE
CES EXTRAITS
L'invention porte sur des extraits bactériens, en particulier des extraits de Klebsiella, plus particulièrement de Klebsiella pneumoniae, présentant des propriétés avantageuses, notamment, dans plusieurs applications, une activité accrue par rapport aux extraits de Klebsiella déjà connus. Le procédé de production de ces extraits fait aussi partie de la présente invention.
Un médicament constitué d'extraits de Klebsiella pneumoniae, le RU 41740, est commercialisé sous la marque Biostim par les Laboratoires Cassenne (France). Ce médicament est composé d'extraits glycoprotéiques o btenus à p artir d 'une s ouche d e Klebsiella p neumoniae (souche 01 K2 NCTC 5055). Il est obtenu après lyse des parois bactériennes, extraction organique, centrifugation et ultrafiltration.
Il comprend : - des glyco-conjugués, en quantité supérieure à 60% ;
- des acides aminés ; et
- des lipides.
La partie glyco-conjuguée est divisée en 3 fractions : P1 , F1 , F2. P1, d'origine capsulaire, représente environ 50 % du RU 41740, et a un poids moléculaire moyen de 95 kD,
F1 est d'origine membranaire et représente environ 20 % du RU 41740, et a un poids moléculaire moyen de 350 kD
F2 semble être une partie de P1.
Le RU 41740 ne provoque pas d'effet pyrogène, comme en atteste la négativité du test au Limulus effectué avec ce composé. Le RU 41740 possède une activité immunomodulatrice. Son activité chez l'homme a été démontrée, notamment pour stimuler les défenses de l'hôte dans le cas de bronchites chroniques (Fietta, Bersani et al. 1988), ou pour éviter d es réactions d 'hypersensibilité retardée chez d es patients atteints de lymphomes (Lang, Gastaut et al. 1986). Plus récemment, des essais chez la souris ont montré qu'une administration parentérale de RU 41740 est efficace pour prévenir la formation d'abcès intra-abdominaux suite à une infection (Finlay-Jones, Boyden et al. 1993), et qu'une administration orale du RU 41740 protégeait les souris vis-à-vis d'infections expérimentales, principalement contre des bactéries Gram-négatives (Nimier, Wolff et al. 1999). Au niveau cellulaire, Garin et al ont montré l'effet du RU 41740 sur la modulation de molécules impliquées dans la présentation d e l 'antigène ( HLA-DR et H LA-DQ), I a capture d'endotoxine (CD 14) et l'activation (CD23) à la surface des monocytes (Garin, Bernaud et al. 1996). Par ailleurs, Estaquier et al. ont montré que le RU 41740 prolonge la survie des monocytes en culture, en limitant leur apoptose (Estaquier, Bloy et al. 1998)
Le Biostim est actuellement principalement prescrit pour stimuler les défenses immunitaires chez l'enfant atteint d'une infection respiratoire.
En outre, la demanderesse a récemment mis en évidence deux autres propriétés avantageuses du RU 41740. L'ajout de RU 41740 au milieu de culture de cellules dendritiques immatures obtenues in vitro à partir de monocytes permet leur maturation. Cette propriété du RU 41740, décrite dans la demande de brevet n° FR 0100275, présente un grand intérêt dans le domaine de la thérapie cellulaire.
Des modifications substantielles apportées au procédé de production du RU 41740, notamment dans le but d'améliorer la qualité sanitaire du produit, ont conduit la demanderesse à un nouveau produit, désigné sous le nom « LCOS 1013 ». De façon inattendue, la demanderesse a mis en évidence que ce nouvel extrait bactérien analogue du RU 41740, présente par rapport à ce dernier, outre une plus grande sécurité sanitaire, une efficacité accrue dans plusieurs des indications mentionnées ci-dessus. Le LCOS 1013 présente notamment une activité deux fois supérieure à celle du RU 41740 dans l'application mentionnée ci-dessus, à savoir la maturation des cellules dendritiques. Ces résultats montrent que de nouveaux extraits bactériens, notamment de Klebsiella, peuvent être employés avantageusement dans plusieurs nouvelles applications. Ces extraits bactériens, ainsi que leur procédé de production, sont l'objet de la présente invention.
En particulier, le LCOS 1013 est composé d'extraits glycoprotéiques obtenus à partir de la souche O1 K2 NCTC 5055 de Klebsiella pneumoniae. Il est obtenu par un procédé comportant des étapes de lyse des parois bactériennes, extraction organique, centrifugation et ultrafiltration, comme décrit à l'exemple 1. Par rapport au procédé de préparation du RU 41740, le protocole de préparation du LCOS 1013 présente l'avantage de ne pas utiliser de mercurothiolate. Ce composé possède, outre ses propriétés d'agent lytique, des propriétés antiseptiques. Son élimination du protocole de préparation du LCOS 1013 entraîne donc la nécessité d'effectuer la production en conditions d'asepsie stricte, afin de protéger le produit de toute contamination bactérienne. Par ailleurs, le protocole de préparation du LCOS 1013 présente par rapport au procédé de préparation du RU 41740, une étape supplémentaire de tamisage moléculaire avec concentration (stade 6 de l'exemple 1), entre l'étape de lyse et les étapes de lyophilisation et extractions. Cette étape est effectuée par exemple par filtration tangentielle, avec un seuil de coupure de 40 à 60 kDa.
Les modifications du procédé de préparation du LCOS 1013 par rapport à celui du RU 41740 conduisent à des différences de composition entre ces deux extraits. En effet, l'étude comparative entre le RU 41740 et le nouvel extrait de Klebsiella pneumoniae LCOS 1013 fait apparaître des différences au niveau structural et au niveau activité.
L'analyse électrophorétique en SDS-PAGE de ces deux principes actifs révèle une différence de composition de par le nombre de bandes détectées après coloration au bleu de Coomassie et de par l'intensité relative de chacune des bandes présentes dans le RU 41740 et le LCOS 1013 (exemple 2).
L'activité immunologique de ces deux principes actifs est également différente. Le test d'immunonéphélométrie montre que LCOS 1013 a une réactivité d ifférente d u R U 417401 orsque c es d eux p roduits sont mis en réaction vis-à-vis d'un immunsérum anti-RU 41740, ce qui signifie que la composition antigénique de ces deux produits est différente, à concentration équivalente (exemple 3).
Les analyses ci-dessus démontrent donc que le LCOS 1013 est un produit différent du RU 41740.
Les inventeurs ont ensuite comparé l'activité de ces deux produits en tant qu'agents de maturation des cellules dendritiques (exemple 8).
La demanderesse a aussi comparé l'activité du LCOS 1013 et du RU 41740 dans la maturation des cellules dendritiques obtenues à partir de monocytes (MODC) in vitro. Là encore, le LCOS 1013 s'est révélé nettement plus efficace que le RU 41740, puisque (exemple 8).
Tous ces résultats, présentés plus en détail dans les exemples ci-dessous, montrent bien que l 'activité d u LCOS 1013 est supérieure à celle du RU 41740 dans plusieurs applications possibles des extraits bactériens, notamment obtenus à partir de Klebsiella pneumoniae. La biocompatibilité et la bonne tolérance connues du RU 41740 permettent d'envisager une utilisation avantageuse de ces composés pour la fabrication de médicaments destinés à soigner diverses pathologies, d'autant plus que certaines des différences entre les protocoles des production du LCOS 1013 par rapport au RU 41740 rendent le nouveau composé a priori plus performant s ur I e p lan s anitaire, p uisque s on p rotocole d e fabrication ne nécessite pas l'utilisation d'antiseptique au cours de la lyse.
L'invention porte donc en premier lieu sur un procédé de préparation d'extraits bactériens à partir de germes capsulés, comportant les étapes suivantes : a) culture des bactéries, b) lyse des bactéries, c) premier tamisage moléculaire, avec concentration, d) lyophilisation du concentrât e) extractions par des solvants organiques, f) remise en solution, g) centrifugation, h) deuxième tamisage moléculaire, i) filtration j) lyophilisation
Dans une réalisation préférée du procédé ci-dessus, les bactéries sont des Klebsielles, de préférence des Klebsiella pneumoniae.
Dans les procédés de l'invention, la culture des bactéries est effectuée de préférence à pH inférieur à 6,7, par exemple à pH 6,5.
Dans une réalisation préférée des procédés ci-dessus, au moins 90% des bactéries s ont I ysées à l 'issue d e l 'étape b ). E n o utre, d ans ce nouveau procédé, l'étape de lyse des bactéries a une durée comprise préférentiellement entre 4 et 8 jours, par exemple de 6 jours. De manière encore préférée, la lyse des bactéries est effectuée sans ajout d'agent lysant comportant un composant antiseptique. Ceci permet d'une part, une production moins polluante pour l'environnement et, d'autre part, d'assurer une plus grande sécurité sanitaire du produit, puisqu'il ne risque pas d e conserver des traces d'un dérivé antiseptique.
Dans une réalisation particulière des procédés de l'invention, le pH de la culture issue de l'étape a) est ramené à une valeur inférieure à 6, par exemple à pH 5,8 ± 0,1 avant l'ajout des agents lysants.
L'étape de premier tamisage moléculaire, avec concentration (étape c) est une étape i mportante d ans I e p rocédé d e l 'invention. De façon préférée, cette étape conduit à une concentration d'un facteur compris entre 1,5 et 3 de la suspension bactérienne lysée issue de l'étape b), par exemple à une concentration d'un facteur 2.
Cette étape c) conduit à l'élimination des petites molécules non liées, avec un seuil de coupure situé de préférence à 20 kDa, 70 kDa, ou 100 kDa et, de manière encore préférée, à 50 kDa ou autour de cette valeur. Des exemples de cartouches utilisables pour cela sont des cartouches de type CARBOSEP d'un seuil de coupure d'environ de 40 à 60 kDa.
Dans une réalisation particulière du procédé de l'invention, l'étape e) comporte une extraction par une cétone et une extraction alcoolique. Par exemple, l'étape e) comporte une extraction par l'acétone et une extraction par le méthanol, le volume utilisé pour chacun de ces solvants étant proportionnel à la masse de lyophilisât issu de l'étape d), de telle façon que
10 x masse de lyophilisât (en kg) < volume de solvant (en I) < 20 x masse de lyophilisât (en kg)
Dans une réalisation préférée des procédés de l'invention, et toujours dans le soucis d'une bonne qualité sanitaire des produits obtenus, l'étape f) de remise e n solution d u p roduit issu de l'étape e) est effectuée sans ajout d'une substance comportant d'un composant antiseptique. L'invention porte également sur tout produit susceptible d'être obtenu par un procédé tel que décrit ci-dessus.
Une composition pharmaceutique comportant un produit tel que décrit au paragraphe précédent, et destinée à favoriser la maturation des cellules dendritiques (in vitro ou in vivo), fait également partie de la présente invention.
La présente invention porte aussi sur un produit susceptible d'être obtenu à l'issue de l'étape c) d'un procédé tel que ceux décrits ci-dessus. Un tel produit présentera certes une pureté moins grande que le LCOS 1013, mais il pourra être utilisé avantageusement par exemple dans la fabrication d'une composition cosmétique ou d'une composition destinée à un usage vétérinaire. De telles compositions pharmaceutiques ou vétérinaires sont également partie intégrante de la présente invention.
Les exemples et figures présentés ci-dessous illustrent certaines des différences entre le RU 41740 et le LCOS 1013, notamment du point de vue de leur composition, de leurs propriétés immunologiques. Ces exemples et figures sont présentés à titre illustratif et non limitatif, et permettront de mettre en évidence certains avantages et caractéristiques de la présente invention.
Légende des figures
Figure 1 : Schéma récapitulatif des étapes de fabrication du LCOS 1013. Figure 2 : Profils électrophorétiques des différents produits mentionnées à l'exemple 2. L'électrophorèse est réalisée en SDS-PAGE, sur gel de polyacrylamïde 8-16% Tris-Glycine, 1,5mm, 15 puits. Puits 1 , 6, 11 : Marqueurs (200 kDa à 6 kDa) Puits 2 et 3 : RU 41740 PA lot N°457 Puits 4 et 5 : LCOS 1014 (Stade atomisé) Puits 7 et 8 : LCOS 1012 (Stade 11 du LCOS 1013) Puits 9 et 10 : LCOS 1013 (Stade lyophilisé) Exemple 1 : Procédé de fabrication du LCOS 1013
A. PRESENTATION GENERALE DU LCOS 1013
Comme le RU 41740, le LCOS 1013 est constitué par un ensemble de substances extraites à partir d'un lysat de culture de Klebsiella pneumoniae. Son mode de fabrication repose sur la succession d'étapes ou s tades, d ont I e s chéma g énéral e st p résenté ci-dessous. Des milieux utilisables pour les cultures, ainsi qu'une présentation indicative du déroulement de chaque étape, sont décrits plus en détail après ce diagramme. La technique de fabrication décrite ci-après, à titre purement illustratif, correspond à une unité opératoire basée sur un volume de culture bactérienne obtenue dans un fermenteur de 600 litres.
B. DESCRIPTION DE DIFFÉRENTS MILIEUX UTILISABLES POUR LA CULTURE DES BACTERIES
La culture des bactéries, en vue de produire du LCOS 1013 suivant la succession d'étapes précisées ci-dessus, peut être effectuée en utilisant les milieux de culture contenant les composants suivants :
Bouillon Nutritif
- Peptone Papaïnique de Soja 4 +/- 2 g/l - Autolysat de levure 4 +/- 2 g/l
- Chlorure de Sodium 5 +/- 2 g/l
- Hydroxyde de Sodium qsp pour pH 7,4 ± 0,2
Boite de Roux
- Chlorure de Sodium 5 +/- 2 g/l - Glucose anhydre 5 +/- 2 g/l
- Autolysat de levure 12 +/- 3 g/l - Peptone Papaïnique de Soja 5 +/- 2 g/l
- Gélose 30 +/- 4 g/l
- Hydroxyde de Sodium qsp pour pH 7,5 ± 0,1
- Phosphate Dipotassique 4 +/- 2 g/l - Phosphate Monopotassique 0,5 à 0,8 g/l
Milieu de préculture
- Peptone Papaïnique de Soja 20+/- 2 g/l
- Autolysat de levure , 10+/- 2 g/l
- Chlorure de Sodium 5 +/- 2 g/l - Phosphate Dipotassique 3,5 +/- 1 g/l
- Phosphate Monopotassique 1 à 2 g/l
Milieu de culture pour fermenteur
- Autolysat de levure de boulangerie 10 +/- 2 g/l
- Chlorure de Sodium 5+/- 2 g/l - Peptone Papaïnique de Soja 20+/- 2 g/l
- Phosphate Dipotassique 3,5+/- 1 g/l
- Phosphate Monopotassique 1 à 2 g/l
C. DESCRIPTION DÉTAILLÉE DES DIFFÉRENTS STADES DE PRODUCTION DU LCOS 1013
STADE 1 : Préparation de l'inoculum
Ce stade a pour but de réaliser, sur milieu gélose en boîte de Roux, la culture de Klebsiella pneumoniae nécessaire à l'inoculation d'une préculture en milieu liquide, à partir d'un cryotube ou d'un lyophilisât issu de la banque de travail. La banque de travail est réalisée par exemple à partir d'une souche de Klebsiella pneumoniae de l'Institut Pasteur de référence CIP 52.145.
Pour cela, la souche est revivifiée en réalisant une suspension bactérienne dans le bouillon nutritif, à partir duquel on ensemence des boîtes de Roux, qui sont ensuite incubées à 37°C + 0,5 pendant 20 à 24 heures.
STADE 2 : Précultures
A partir de l'inoculum préparé au stade 1 , une préculture est effectuée en flacon de 3 litres, destinée à ensemencer un fermenteur de 35 I, lui-même destiné dans un deuxième temps à ensemencer un fermenteur de 600 I.
La première préculture est réalisée dans le milieu de préculture décrit ci- dessus, auquel on ajoute une solution stérile de glucose, à raison de 30 ± 10 g de glucose pour 3 litres. La deuxième préculture, de 35 litres, est effectuée dans le milieu de culture pour fermenteur décrit plus haut, auquel on ajoute 400 ± 100 g de glucose.
Des flacons satellites contenant respectivement une solution stérile d'hydroxyde de sodium 10 N, une solution stérile d'acide orthophosphorique dilué au Y∑, et une solution stérile d'anti-mousse, peuvent être utilisés pour la deuxième préculture, en fermenteur, afin notamment de maintenir le pH aux alentours de 6,5, pendant toute la durée de la préculture, soit environ 5 heures à environ 37°C, sous agitation.
STADE 3 : Culture en fermenteur
L'objet de cette étape est de réaliser en fermenteur, dans des conditions définies, une culture bactérienne de teneur supérieure ou égale à 109 germes /ml, pour permettre l'extraction ultérieure d'une quantité de produit satisfaisante.
Pour cela, la suspension de germes contenue dans le fermenteur de 35 I est transférée dans un fermenteur de 600 litres contenant le milieu de culture en fermenteur décrit plus haut, auquel on a ajouté 5 kg de glucose.
Comme pour la préculture de 35 litres, des cuves satellites contenant respectivement une solution stérile d'hydroxyde de sodium 10 N et une solution stérile d'acide orthophosphorique dilué au ΛA sont utilisées pour la régulation du pH aux alentours de 6,5, ainsi qu'une cuve satellite contenant une solution stérile d'anti-mousse. La culture est réalisée pendant environ 7 heures, à 37°C ± 1°C, sous agitation.
STADE 4 : Fin de culture et addition des agents lysants
Ce stade a pour but d 'inactiver la culture par l'action d'agents lysants et chauffage de 55 à 75°C pendant une durée supérieure ou égale à 40 minutes. Pour cela, les agents lysants utilisés sont les suivants :
- solution stérile de polysorbate 80,
- solution stérile d'EDTA,
- solution stérile de chlorydrate de lysozyme.
En fin de culture, le pH est amené à 5,8 ± 0,3 à l'aide d'une solution stérile d'acide orthophosphorique, puis les agents lysants ci-dessus sont transférés dans la culture.
Le contenu du fermenteur e st e nsuite p orté à I a t empérature d e 65°C ± 10°C et maintenu pendant au moins 40 minutes à cette température sous agitation. Le b iolysat o btenu e st a lors t ransféré d ans u ne c uve d e lyse industrielle (préchauffée à 65°C ± 10°C), et maintenu à cette température pendant au moins 20 minutes, avant d'être ramené à 37°C ± 2°C.
STADE 5 : Lyse L'étape de lyse consiste à rompre la paroi des bactéries par voie enzymatique, ce qui entraîne la libération des constituants cytoplasmiques des cellules microbiennes. Elle est effectuée en maintenant la suspension prélysée du stade précédent, à 37°C ± 2°C, dans la cuve de lyse au moins pendant 6 jours
STADE 6 : Tamisage moléculaire et concentration
Dans cette étape, le volume de lysat brut est réduit de moitié pour diminuer la quantité à traiter aux stades suivants. La concentration s'effectue par exemple sur un ultrafiltre équipé de cartouche filtrante de type CARBOSEP d'un seuil de coupure de 20 à 100 kDa, éliminant ainsi les petites molécules non liées.
STADE 7 : Lyophilisation du lysat
Afin d'obtenir le lysat brut issu du stade 6 sous forme solide permettant les extractions ultérieures aux solvants, une opération de lyophilisation est réalisée immédiatement après le stade de concentration. On obtient ainsi une poudre brune, collante au toucher.
STADE 8 : Extraction par l'acétone:
Le lysat de LCOS 1013 lyophilisé, issu du stade 7, contient des lipides que l'on élimine partiellement par l'extraction solide-liquide, en utilisant de l'acétone à température ambiante. Le produit est récupéré par centrifugation, puis séché. STADE 9 : Extraction par le méthanol :
Après extraction à l'acétone, le produit obtenu au stade 8 contient encore des lipides résiduels et des pigments que l'on élimine par extraction solide- liquide, en utilisant du méthanol à température ambiante.
Le produit est récupéré par centrifugation, puis séché.
STADE 10 : Remise en solution
"L'extrait m éthanol" i ssu du stade 9 est remis en solution aqueuse, pour permettre l'isolement ultérieur du produit par centrifugation et ultrafiltration.
STADE 11 : Centrifugation
L'extrait brut en suspension issu du stade 10 contient des protéines dénaturées et des matières insolubles dans l'eau que l'on élimine par centrifugation.
Le produit centrifugé est d'aspect légèrement colloïdal et de couleur beige à brun.
STADE 12 : Ultrafiltration
Ce stade représente l'étape essentielle de l'isolement du produit.
Le produit issu du stade 11 contient des substances de différentes tailles moléculaires : sels minéraux, protéines, glycoprotéines, etc...
Les macromolécules d e PM > 300000 constituant le produit sont isolées par ultrafiltration sur une membrane de seuil de coupure de 300 KD. Le produit, une fois introduit dans la cuve de l'appareil, est véhiculé en permanence au moyen d'une pompe, dans un circuit fermé comportant un ultrafiltre. Le milieu est maintenu homogène au moyen d'une agitation. La pression créée par la pompe sur la membrane filtrante, oblige une partie du soluté à traverser cette membrane (perméat).
La partie retenue (rétentat), reste en circulation. Sachant que l'on opère à volume constant, la perte de volume est compensée en permanence par l'apport d'un même volume d'eau.
En fin d'opération la solution ultrafiltrée.
L'ultrafiltrat obtenu est une solution liquide translucide légèrement jaune.
STADE 13 : Filtration
La clarification du surnageant de centrifugation obtenu au stade 11 est affinée par filtration sur membrane de rétention nominale de 1 ,2 μm.
On obtient ainsi une "solution de glycoproteines" opalescente, de couleur beige clair à crème.
STADE 14 : Lyophilisation
Afin de permettre une bonne conservation du produit, la solution issue du stade 13 est ensuite lyophilisée, par un procédé comportant une étape de congélation, puis la lyophilisation proprement dite.
Les glycoproteines lyophilisées ont l'aspect d'une poudre floconneuse de couleur blanche à crème, hygroscopique. STADE 15 : Mélange
Cette dernière étape a pour but d'homogénéiser les glycoproteines lyophilisées issues du stade 14.
L'atomisation peut se substituer avantageusement à la lyophilisation et au mélange (LCOS 1014).
Exemple 2 : analyse du profil électrophorétique du nouvel extrait de Klebsiella pneumoniae LCOS 1013.
L'objectif de ces expériences est de comparer le profil électrophorétique du stade lyophilisé du nouvel extrait de Klebsiella pneumoniae (LCOS 1013) et du RU 41740, l'électrophorèse étant réalisé sur gel SDS-PAGE.
1) Matériels et réactifs
- Gel de polyacrylamide 8 - 16 % Tris-Glycine, 1 ,5 mm, 15 puits (NOVEX, réf. : EC60485) ;
- Marqueurs standards (NOVEX, réf. : LC5677) ; - Tris-Glycine SDS sample buffer (2x) (NOVEX, réf. : LC2676) ;
- Tris-Glycine SDS running buffer (1 Ox) (NOVEX, réf. : LC2675) ;
- Solution de séchage (NOVEX, réf. : LC4025) ;
- Générateur LKB 2303 Multidrive XL (2WL57).
2) Produits testés
Les produits testés sont le RU 41740 (puits 2 et 3), le LCOS 1013 (puits 9 et 10), ainsi que des produits intermédiaires de la fabrication du LCOS 1013, à savoir le LCOS1012 (correspondant au produit obtenu à l'issue du stade 11 du procédé décrit dans l'exemple 1) (puits 7 et 8) et le LCOS1014 (stade atomisé) (puits 4 et 5). 3) Résultats
Le profil électrophorétique comparé des différents produits est montré à la figure 2.
La comparaison du puits correspondant au RU 41740 (puits 2 et 3) et des puits correspondants au LCOS 1013 (puits 9 et 10) permet de constater les différences suivantes entre les deux produits :
- Le RU 41740 présente un triplet de bandes comprises entre 97,4 et 66,3 Kd, triplet qui se réduit en un doublet pour le LCOS 1013 ;
- Le RU 41740 présente un second triplet de bandes comprises entre 55,4 et 36,5 Kd, triplet qui est également présent dans le LCOS 1013 mais dont les deux premières bandes ont une intensité inférieure dans le LCOS 1013 par rapport aux bandes du même triplet dans le RU 41740.
Afin d'affiner et de quantifier cette analyse, l'ensemble des pistes du gel ont été scannées puis analysées par le logiciel ONE-SCAN.
Pour chacune des bandes de chaque piste sont calculés les paramètres suivants :
- % du RF ;
- amplitude ; - intensité (Int OD) ;
- % de l'intensité relative (% Int OD).
L'analyse des données concernant les pistes 3 (RU 41740 lot n° 457) et 10 (LCOS 1013) figure dans les tableaux 1 et 2 ci-dessous. Tableau 1 : Analyse densitométrique des bandes de poids moléculaire 97,4 Kd / 66,3 Kd et 55,4 Kd / 36,5 Kd apparaissant sur le gel de la figure 2.
r
i-
-I g. α:
r
CM
H 111
_l α.
Figure imgf000019_0001
Tableau 2 : Analyse densitométrique des bandes de poids moléculaire inférieur à 36,5 Kd apparaissant sur le gel de la figure 2.
Figure imgf000020_0001
Une dissymétrie dans la migration du gel fait que les pourcentages Rf de chacun des marqueurs en piste 6 sont supérieurs aux pourcentages Rf de chacun des marqueurs déposés en piste 11 d'environ 3 %. Cette dissymétrie a été prise en compte pour établir une correspondance entre les bandes des pistes considérées, c'est-à-dire la piste 3 (RU 41740) et la piste 10 (LCOS 1 013). A insi, p ar e xemple, I a b ande n ° 1 3 de la p iste 3 (pourcentage Rf = 52,8) et la bande n° 15 de la piste 10 (pourcentage Rf = 49,8) correspondent toutes les deux à la première bande du premier triplet. Le tableau 1 résume les résultats obtenus pour les bandes de poids moléculaire compris entre 97,4 KDa et 55,4 KDa :
a) TRIPLET 1 :
L'analyse de l'intensité relative de chacune des bandes composant ce triplet montre que :
- la première bande de ce triplet présente dans le RU 41740 est quasiment inexistante dans le LCOS 1013 ;
- la deuxième bande de ce triplet est présente dans le RU 41740 avec une intensité 2 fois moindre par rapport à celle présente dans le LCOS 1013 ;
- la troisième bande de ce triplet est présente dans le RU 41740 avec une intensité 2 fois supérieure à celle présente dans le LCOS 1013.
b) TRIPLET 2 :
L'analyse de l'intensité relative de chacune des bandes composant ce triplet montre que les deux premières bandes composant ce triplet sont pratiquement inexistantes dans le LCOS 1013 en comparaison avec les deux premières bandes du triplet 2 du RU 41740.
Le tableau 2, qui concerne les bandes de poids moléculaire inférieur à 36,5 KDa, révèle qu'aucune différence significative n'apparaît entre les bandes correspondant au LCOS 1013 et au RU 41740.
Les profils électrophoretiques du RU 41740 et du LCOS 1013 présentent donc plusieurs différences, ce qui indique que la composition de ces deux produits est différente. Exemple 3 : Comparaison de l'activité immunologîque du LCOS 1013 et du RU 41740.
L'objectif de ces expériences est de mesurer la similitude antigénique entre les deux produits.
Pour cela, la réactivité d'anticorps produits contre le RU 41740 a été mesurée de façon comparative vis-à-vis du RU 41740 et du LCOS 1013.
Cette réactivé a été mesurée en mesurant la lumière diffusée par un précipité formé au cours de la réaction antigène-anticorps en milieu liquide, suivant la technique.
Selon cette technique, la réactivité observée vis-à-vis d'un produit B identique à un produit A contre lequel les anticorps ont été obtenus doit être supérieure ou égale à 75 % de la réactivité observée vis-à-vis du produit A ; dans le cas contraire, cela traduit une composition chimique et/ou structurale différente entre les deux produits.
Matériel et réactifs
- Néphélomètre ICS référencé 2 WF 19 ;
- Carte M33 ;
- Sérum anti-SB4 à 6 % ;
- Référence SB5, pentes = 0,995 RS 02 dosages = 0,956 RS 02
Résultats
Les résultats obtenus à concentration égale et sur produit sec (teneur en eau de 4,0 %) montrent que la réactivité des anticorps anti-RU 41740, vis- à-vis du LCOS 1013, est seulement de 33 % par rapport à leur réactivité vis-à-vis du RU 41740. Ceci traduit une différence de structure antigénique significative entre les deux produits. BIBLIOGRAPHIE
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'extraits bactériens à partir de germes capsulés, comportant les étapes suivantes : a) culture des bactéries, b) lyse des bactéries, c) premier tamisage moléculaire, avec concentration, d) lyophilisation du concentrât e) extractions par des solvants organiques, f) remise en solution, g) centrifugation, h) deuxième tamisage moléculaire, i) filtration, j) lyophilisation
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les bactéries sont des Klebsielles, de préférence des Klebsiella pneumoniae.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la culture des bactéries est effectuée à pH inférieur à 6,7.
4. Procédé selon les revendications 1 à 3, caractérisé en ce que au moins 90% des bactéries sont lysées à l'issue de l'étape b).
5. Procédé selon les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape de lyse des bactéries a une durée comprise entre 4 et 8 jours.
6. Procédé selon les revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la lyse des bactéries est effectuée sans ajout d'agent lysant comportant un composant antiseptique.
7. Procédé selon les revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le pH de la culture issue de l'étape a) est ramené à une valeur inférieure à 6 avant l'ajout des agents lysants.
8. Procédé selon les revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'étape c) conduit à une concentration d'un facteur compris entre 1 ,5 et 3 de la suspension bactérienne lysée issue de l'étape b), et de préférence d'un facteur 2.
9. Procédé selon les revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'étape c) conduit à l'élimination des petites molécules non liées, avec un seuil de coupure à 20 kDa, 50 kDa, 70 kDa, ou 100 kDa.
10. Procédé selon les revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'étape e) comporte une extraction par une cétone et une extraction alcoolique.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'étape e) comporte une extraction par l'acétone et une extraction par le méthanol, le volume utilisé pour chacun de ces solvants étant proportionnel à la masse de lyophilisât issu de l'étape d).
12. Produit susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
13. Composition pharmaceutique comportant un produit selon la revendication 12, et destinée à favoriser la maturation des cellules dendritiques.
14. Composition cosmétique comportant un produit susceptible d'être obtenu à l'issue de l'étape c) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
15. Composition destinée à un usage vétérinaire, caractérisée en ce qu'elle comporte un produit susceptible d'être obtenu à l'issue de l'étape c) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à
11.
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