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WO2004007069A1 - Membran, vorrichtung und verfahren zum entfernen von proteasen aus flüssigkeiten - Google Patents

Membran, vorrichtung und verfahren zum entfernen von proteasen aus flüssigkeiten Download PDF

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WO2004007069A1
WO2004007069A1 PCT/EP2003/006366 EP0306366W WO2004007069A1 WO 2004007069 A1 WO2004007069 A1 WO 2004007069A1 EP 0306366 W EP0306366 W EP 0306366W WO 2004007069 A1 WO2004007069 A1 WO 2004007069A1
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WO
WIPO (PCT)
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membrane
coupled
proteases
membranes
membrane body
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP2003/006366
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English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang Demmer
Dietmar Nussbaumer
Hans-Heinrich HÖRL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sartorius AG
Original Assignee
Sartorius AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to US10/516,405 priority patent/US8343350B2/en
Publication of WO2004007069A1 publication Critical patent/WO2004007069A1/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3814—Affinity chromatography of the substrate or cofactor-enzyme type

Definitions

  • the invention relates to a membrane for removing proteases from liquids, in particular from biological liquids and pharmaceutical solutions, consisting of a microporous membrane body.
  • the invention further relates to a device for removing proteases from liquids, in particular from biological liquids and pharmaceutical solutions, with a plurality of membranes connected in series.
  • the invention further relates to a method for removing proteases from liquids, in particular from biological liquids and pharmaceutical solutions, by microfiltration with microporous chemically activated membranes.
  • Contamination with bacteria or fungi can easily be prevented, for example, by filtering the solution through a sterile-filtering microporous membrane with a nominal pore size of 0.2 ⁇ m, for example.
  • Viruses can be by chemical treatment or by application of a strongly basic ion exchanger. Endotoxins can also be removed by a basic ion exchanger or by ultrafiltration.
  • Proteases are enzymes that break down proteins and polypeptides. This is done by hydrolytic cleavage between neighboring amino acids, which are the building blocks of the proteins. This leads to a reduction in the formulated protein, e.g. an antibody and the occurrence of degradation products that produce undesirable effects in the patient treated with the formulation.
  • a genetically engineered antibody that is produced in an animal cell culture can accumulate in the cell and must be released from the cell into the process medium for further processing before processing. During this cell disintegration, cell-specific proteases are released, which can immediately break down the target proteins.
  • the disadvantage here is that the membrane used or the membrane body used is not electrically neutral but is negatively charged by a monomer used. Furthermore, it is difficult to find suitable inhibitors for other classes of proteases.
  • DE 44 32 628 AI discloses a modular dead-end filtration unit for the selective separation of substances from fluids by filtration on porous membrane absorbers. According to a specific adsorption, the individual substances to be separated are retained in the filter cassettes or membranes. With appropriate eluents, the adsorbed substances are selectively desorbed, eluted and collected. In the device or known method known from DE 44 32 628 A1, no inhibitor membranes are used, but rather ion-exchanging or dye-ligand-carrying membranes. With such an adsorptive application, it is difficult to adsorptively bind all classes of known proteases to the membrane body.
  • the object of the present invention is therefore to provide membranes for removing a large number of proteases from liquids, so that their action with regard to the liquids is prevented or at least slowed down. the.
  • the proteases should be removed quickly, efficiently and inexpensively. It should be possible to selectively remove acidic proteases, metalloproteases, cysteine proteases and serine proteases.
  • proteases selectively binding inhibitors are coupled to the membrane body by chemically activated groups.
  • Acidic proteases that have an aspartic acid residue in the active center can be adsorbed on the membrane body by an appropriate inhibitor.
  • pepstatin that efficiently inhibits pepsin can be coupled.
  • Metalloproteases that are a transition metal, e.g. Zinc in the active center can be adsorbed, for example, by bestatin, diprotin or EDTA, which are coupled to the membrane body.
  • Cysteine proteases that have a cysteine residue in the active center can be adsorbed by antipain, chymostatin or E 64, which are coupled to the membrane body.
  • Serine proteases which are the most important family because of their ubiquitous occurrence, can also be replaced by appropriate Inhibitors that are coupled to the membrane body are bound.
  • TLCK and p-aminobenzamidine can be used as efficient inhibitors.
  • the inhibitors mentioned above are small molecules, some peptide-like peptide analogs. They are all commercially available.
  • Another object of the invention is therefore to improve the known devices so that a large number of proteases can be removed from biological liquids and pharmaceutical solutions effectively and inexpensively.
  • the device Due to the formation of the membranes according to one of claims 1 to 9, the device has the advantages mentioned above.
  • the series connection or arrangement of a plurality of membranes one after the other ensures that the liquid to be processed flows sequentially through all the membranes.
  • the membranes can be adapted relatively easily to the respective separation problem.
  • the individual membranes each have a membrane body with another coupled inhibitor.
  • the individual membranes are installed in suitable housings for sequential flow.
  • Another object of the present invention is therefore to provide an efficient and inexpensive method for removing a large number of proteases.
  • inhibitors are coupled to the membranes via chemically activated groups, by means of which the proteases are adsorbed by selective binding and thereby removed from the liquid.
  • the selective connection enables an effective and inexpensive removal of a large number of proteases.
  • FIG. 1 A schematic representation of a device for removing proteases.
  • a device 1 for removing proteases essentially consists of a housing 2 and four microporous membranes 3, 4, 5, 6 arranged in series.
  • the first membrane 3 has a first membrane body 7, to which an inhibitor which binds acidic proteases is coupled via a chemically activated group.
  • an inhibitor which binds acidic proteases is coupled via a chemically activated group.
  • pepstatin is suitable as an efficient inhibitor for pepsin.
  • the second membrane 4 has a second membrane body 8, to which a metalloprotease inhibitor is coupled via a chemically activated group.
  • a metalloprotease inhibitor for example, bestatin, diprotin or EDTA can be used as inhibitors to be coupled.
  • the third membrane 5 has a third membrane body 9, to which a cysteine protease-binding inhibitor is coupled via a chemically activated group.
  • Antipain, chystatin or E 64 are suitable as inhibitors.
  • the fourth membrane 6 has a fourth membrane body 10, to which a serine protease-binding inhibitor is coupled via a chemically activated group.
  • TLCK or p-aminobenzamidine are suitable as inhibitors.
  • the liquid to be processed is supplied to the first membrane 3 via a connection 11 arranged on the housing 2, the corresponding acidic proteases being bound to the inhibitor of the first membrane body 7.
  • the liquid to be processed is then fed to the second membrane 4, with the inhibitor of the second membrane body 8, the corresponding metalloproteases are bound.
  • the liquid to be processed is then fed to the third membrane 5, the corresponding cysteine proteases being bound to the inhibitor of the third membrane body 9.
  • the liquid to be processed is fed to the fourth membrane 6, the corresponding serine proteases being bound to the inhibitor of the fourth membrane body 10.
  • the proteases provided are now selectively removed from the liquid to be processed, so that they can be used for further use via a drain 12.
  • the membranes 3, 4, 5, 6 with the bound proteases are discarded or disposed of.
  • the serine protease inhibitor p-aminobenzamidine (Sigma, Deisenhofen order no. A-7148 was dissolved in 0.05 M potassium phosphate buffer pH 8.0 at 20 mg / ml.
  • the membranes / membrane bodies were washed several times with PBS.
  • Three membranes with a diameter of 25 mm were placed in a filter holder (Sartorius part no. 16517 Trypsin from the bovine pancreas (SIGMA order no. T-8003 lot no. 28F-8065 was dissolved in PBS at 1 mg / ml.
  • Example 2 clearly shows the binding of trypsin to the membrane / membrane body loaded with the inhibitor.
  • the cysteine protease inhibitor leupeptin (Sigma, Deisenhofen order no. L-2023) was dissolved in 0.05 M potassium phosphate buffer pH 8.0 at 20 mg / ml.
  • the example clearly shows the binding of papain to the membrane / membrane body loaded with the inhibitor.

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Abstract

Membran und Vorrichtung zum Entfernen von Proteasen aus Flüssigkeiten, insbesondere aus biologischen Flüssigkeiten und pharmazeutischen Lösungen, bestehend aus einem mikroporösen Membrankörper, wobei Proteasen selektiv bindende Inhibitoren durch chemisch aktivierte Gruppen an den Membrankörper angekoppelt sind. Verfahren zum Entfernen von Proteasen aus Flüssigkeiten, insbesondere aus biologischen Flüssigkeiten und pharmazeutischen Lösungen, durch Mikrofiltration mit mikroporösen aktivierten Membranen, wobei an die Membranen Inhibitoren über chemisch aktivierte Gruppen angekoppelt werden, durch die die Proteasen durch selektive Anbindung entfernt werden.

Description

Membran, Vorrichtung und Verfahren zum Entfernen von Proteasen aus Flüssigkeiten
Die Erfindung betrifft eine Membran zum Entfernen von Proteasen aus Flüssigkeiten, insbesondere aus biologischen Flüssigkeiten und pharmazeutischen Lösungen, bestehend aus einem mikroporösen Membrankörper.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung zum Ent- fernen von Proteasen aus Flüssigkeiten, insbesondere aus biologischen Flüssigkeiten und pharmazeutischen Lösungen, mit einer Mehrzahl in Reihe geschalteter Membranen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Entfer- nen von Proteasen aus Flüssigkeiten, insbesondere aus biologischen Flüssigkeiten und pharmazeutischen Lösungen durch Mikrofiltration mit mikroporösen chemisch aktivierten Membranen.
Die Stabilität pharmazeutischer proteinhaltiger Lösungen ist von verschiedenen Faktoren und vor allem von der Art der Vorbehandlung abhängig. Es ist von größtmöglicher Bedeutung, dass Kontaminationen aller Art aus diesen Lösungen entfernt werden, da die regulatorischen Behörden zahlreiche Kontrollen dieser Prozeduren vorschreiben.
Eine Verunreinigung mit Bakterien oder Pilzen kann beispielsweise leicht dadurch verhindert werden, dass die Lösung durch eine sterilfiltrierende mikroporöse Membran mit bspw. nomineller Porenweite von 0,2 μm filtriert wird. Viren können durch chemische Behandlung oder durch Anwendung eines stark basischen Ionenaustauschers abgereichert werden. Endotoxine können ebenfalls durch einen basischen Ionenaustauscher oder durch Ultrafiltration entfernt werden.
Proteasen sind Enzyme, welche Proteine und Polypeptide abbauen. Dies geschieht durch hydrolytische Spaltung zwischen benachbarten Aminosäuren, welche die Bausteine der Proteine darstellen. Dies führt zur Reduktion des formulierten Proteins, z.B. eines Antikörpers und zum Auftreten von Abbauprodukten, die unerwünschte Effekte in dem mit der Formulierung behandelten Patienten erzeugen.
Während der Aufarbeitung (Down Stream Processing) eines Proteins, z.B. eines gentechnisch hergestellten Antikör- pers, der in einer Tierzellkultur produziert wird, kann der Antikörper in der Zelle akkumulieren und muss vor der Aufarbeitung aus der Zelle in das Prozessmedium für die weitere Aufarbeitung freigesetzt werden. Während dieser Zelldesintegration werden gleichzeitig zelleigene Proteasen frei- gesetzt, welche sofort die Zielproteine abbauen können.
Um die Wirkung dieser Proteasen zu unterbinden und zumindest zu verlangsamen, ist es bekannt, kleine synthetische Moleküle mit inhibitorischer Wirkung und sehr hoher Affini- tat zum aktiven Zentrum der Proteasen zuzusetzen. Nachteilig dabei ist die potentielle Gefährlichkeit solcher Substanzen, ihre geringe Löslichkeit und geringe Stabilität in wässrigen Medien. Deshalb ist eine schnelle und effiziente Verteilung solcher Substanzen in großen Volumina umständ- lieh.
Weiterhin ist es bekannt, auf dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannten chromatographischen Trägern, wie kugelförmigen Gelen, geeignete Inhibitoren zu immobilisieren. Da die Entfernung wünschenswerterweise möglichst weit „up stream" in der Reinigungssequenz erfolgen soll, um den Produktverlust gering zu halten, werden für die Aufarbeitung Säulen mit großen Querschnitten benötigt. Dies macht den Schritt kosten- und arbeitsintensiv.
Aus der US 6,258,238 Bl ist es bekannt, einen kationischen Protease-Inhibitor durch Bulk-Adsorption an der Oberfläche einer semipermeablen Membran, die mindestens aus einem elektronegativen Polymer besteht, anzuordnen.
Nachteilig dabei ist, dass die dabei verwendete Membran bzw. der verwendete Membrankörper nicht elektrisch neutral sondern durch ein verwendetes Monomer negativ geladen ist. Weiterhin ist es schwierig geeignete Inhibitoren für andere Proteaseklassen zu finden.
Weiterhin ist aus der DE 44 32 628 AI eine modular aufgebaute Dead-End-Filtrationseinheit zur selektiven Abtrennung von Stoffen aus Fluiden durch Filtration an porösen Memb- ranabsorbern bekannt. Entsprechend einer spezifischen Adsorption werden die einzelnen abzutrennenden Stoffe in den Filterkassetten bzw. Membranen festgehalten. Mit entsprechenden Eluationsmitteln werden die adsorbierten Stoffe selektiv desorbiert, eluiert und aufgefangen. Bei der aus der DE 44 32 628 AI bekannten Vorrichtung bzw. bekannten Verfahren werden keine Inhibitor-Membranen verwendet, sondern ionenaustauschende bzw. farbstoffligandentragende Membranen. Bei einer derartigen adsorptiven Anwendung ist es schwierig alle Klassen von bekannten Proteasen an den Memb- rankörper adsorptiv anzubinden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Membranen zur Entfernung einer Vielzahl von Proteasen aus Flüssigkeiten bereitzustellen, so dass Ihre Wirkung bezüglich der Flüssigkeiten unterbunden oder zumindest verlangsamt wer- den. Die Entfernung der Proteasen soll schnell, effizient und kostengünstig erfolgen. Dabei soll es möglich sein, saure Proteasen, Metallo-Proteasen, Cystein-Proteasen und Serin-Proteasen selektiv zu entfernen.
Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 1 dadurch gelöst, dass Proteasen selektiv bindende Inhibitoren durch chemisch aktivierte Gruppen an den Membrankörper angekoppelt sind.
Die Verwendung derartiger Membranen hat den Vorteil, dass der konvektive Fluss durch solche Membranen höher ist im Vergleich zu entsprechenden Säulen, da die Diffusionslimi- tierung des Massentransportes praktisch vernachlässigbar ist. Die Menge an Inhibitor und die zur Kopplung benötigte Membranfläche kann auf die zu entfernende Menge Proteasen abgestimmt werden. Die Membran kann nach Gebrauch verworfen werden, was Reinigungs- und Validierungs-Kosten spart.
Saure Proteasen, die einen Asparaginsäure-Rest im aktiven Zentrum besitzen, können durch einen entsprechenden Inhibitor an den Membrankörper adsorbiert werden. So kann beispielsweise Pepstatin, dass effizient Pepsin inhibitiert, angekoppelt werden. Metallo-Proteasen, die ein Übergangsme- tall, wie z.B. Zink, im aktiven Zentrum besitzen, können beispielsweise durch Bestatin, Diprotin oder EDTA, die an die Membrankörper angekoppelt werden, adsorbiert werden.
Cystein-Proteasen, die einen Cystein-Rest im aktiven Zent- rum besitzen, beispielsweise Papain aus der Papaya-Frucht, können durch Antipain, Chymostatin oder E 64, die an den Membrankörper angekoppelt werden, adsorbiert werden.
Serin-Proteasen, die wegen ihres ubiquitären Vorkommens wichtigste Familie, können ebenfalls durch entsprechende Inhibitoren, die an den Membranköper angekoppelt werden, gebunden werden. Als effiziente Inhibitoren kommen TLCK und p-Aminobenzamidin in Frage. Die oben erwähnten Inhibitoren sind kleine Moleküle, zum Teil peptidartige Peptid-Analoga . Sie sind alle kommerziell erhältlich.
Für die Cystein- und Serin-Proteasen existieren weiterhin große proteinartige Inhibitoren, wie Aprotinin, Sojabohnen- , Trypsin-Inhibitoren oder alpha-2-Makroglobulin. Zudem ist eine riesige Anzahl weiterer Inhibitoren in der Literatur beschrieben, die auf die erfindungsgemäße Weise verwendbar sind.
Die bekannten Vorrichtungen weisen die oben beschriebenen Nachteile auf.
Weitere Aufgabe der Erfindung ist es daher, die bekannten Vorrichtungen so zu verbessern, dass eine Vielzahl von Proteasen aus biologischen Flüssigkeiten und pharmazeutischen Lösungen effektiv und kostengünstig entfernt werden können.
Diese weitere Aufgabe wird erfindungsgemäß in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 10 dadurch gelöst, dass die Membranen nach einem der Ansprüche 1 bi>s 9 ausgebildet sind.
Durch die Ausbildung der Membranen nach einem der Ansprüche 1 bis 9 weist die Vorrichtung die oben genannten Vorteile auf. Insbesondere wird durch die Reihenschaltung bzw. An- Ordnung einer Mehrzahl von Membranen hintereinander gewährleistet, dass die zu prozessierende Flüssigkeit nacheinander alle Membranen sequentiell durchströmt. Die Membranen können dem jeweiligen Trennproblem relativ einfach ange- passt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die einzelnen Membranen jeweils einen Membrankörper mit einem anderen angekoppelten Inhibitor auf.
Auf diese Weise kann das jeweilige Proteasespektrum der verschiedenen zu prozessierenden Flüssigkeiten für die Aufarbeitung berücksichtigt werden.
Zur einfachen Handhabung werden die einzelnen Membranen zur sequentiellen Durchströmung in geeignete Gehäuse eingebaut.
Die bekannten Verfahren zur Entfernung von Proteasen weisen die oben genannten Nachteile auf.
Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein effizientes und kostengünstiges Verfahren zum Entfernen einer Vielzahl von Proteasen anzugeben.
Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 13 dadurch gelöst, dass an die Membranen Inhibitoren über chemisch aktivierte Gruppen angekoppelt werden, durch die die Proteasen durch selektive Anbindung adsorbiert und dadurch aus der Flüssigkeit entfernt werden.
Durch die selektive Anbindung wird eine effektive und kostengünstige Entfernung einer Vielzahl von Proteasen ermöglicht.
Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung und der beigefügten Zeichnung, in denen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beispielhaft veranschaulicht sind.
Figur 1: Eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zum Entfernen von Proteasen. Eine Vorrichtung 1 zum Entfernen von Proteasen besteht im Wesentlichen aus einem Gehäuse 2 und vier in Reihe angeordneten mikroporösen Membranen 3, 4, 5, 6.
Die erste Membran 3 weist einen ersten Membrankörper 7 auf, an dem ein saure Proteasen bindender Inhibitor über eine chemisch aktivierte Gruppe angekoppelt ist. Beispielsweise ist Pepstatin als effizienter Inhibitor für Pepsin geeig- net.
Die zweite Membran 4 weist einen zweiten Membrankörper 8 auf, an dem ein Metallo-Proteasen bindender Inhibitor über eine chemisch aktivierte Gruppe angekoppelt ist. Für die Metallo-Proteasen kommen beispielsweise Bestatin, Diprotin oder EDTA als anzukoppelnde Inhibitoren in Frage.
Die dritte Membran 5 weist einen dritten Membrankörper 9 auf, an dem ein Cystein-Proteasen bindender Inhibitor über eine chemisch aktivierte Gruppe angekoppelt ist. Als Inhibitoren sind beispielsweise Antipain, Chy ostatin oder E 64 geeignet .
Die vierte Membran 6 weist einen vierten Membrankörper 10 auf, an dem ein Serin-Proteasen bindender Inhibitor über eine chemisch aktivierte Gruppe angekoppelt ist.
Als Inhibitoren kommen beispielsweise TLCK oder p- Aminobenzamidin in Frage.
Die zu prozessierende Flüssigkeit wird über einen am Gehäuse 2 angeordneten Anschluss 11 der ersten Membran 3 zugeführt, wobei an den Inhibitor des ersten Membrankörpers 7 die entsprechenden sauren Proteasen gebunden werden. Die weiter zu prozessierende Flüssigkeit wird anschließend der zweiten Membran 4 zugeführt, wobei an den Inhibitor des zweiten Membrankörpers 8 die entsprechenden Metallo- Proteasen gebunden werden. Die weiter zu prozessierende Flüssigkeit wird anschließend der dritten Membran 5 zugeführt, wobei an den Inhibitor des dritten Membrankörpers 9 die entsprechenden Cystein-Proteasen gebunden werden. Schließlich wird die weiter zu prozessierende Flüssigkeit der vierten Membran 6 zugeführt, wobei an den Inhibitor des vierten Membrankörpers 10 die entsprechenden Serin- Proteasen gebunden werden.
Aus der zu prozessierenden Flüssigkeit sind nunmehr die vorgesehenen Proteasen selektiv entfernt, so dass diese ü- ber einen Abfluss 12 einer weiteren Verwendung zugeführt werden kann. Die Membranen 3, 4, 5, 6 mit den gebundenen Proteasen werden weggeworfen bzw. entsorgt.
Die folgenden Beispiele zeigen die Möglichkeit der Kupplung verschiedener Inhibitoren an eine chemisch aktivierte Membran bzw. Membrankörper und stellen deshalb keinerlei Ein- schränkung der Erfindung dar. Die Prozeduren folgen dabei im Wesentlichen dem Protokoll beschrieben in: G.T. Herman- son, A.K. Mallia, P.K. Smith, Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press 1992, p. 119
Beispiel 1:
Der Serin-Protease Inhibitor p-Aminobenzamidin (Sigma, Dei- senhofen Best. Nr. A-7148 wurde in 0,05 M Kalium-Phosphat- Puffer pH 8,0 zu 20 mg/ml gelöst. Zehn epoxy aktivierte Membranen der Abmessung 25 mm Durchmesser des Typs 18706 der Fa. Sartorius AG wurden in dieser Lösung bei 45°C über Nacht inkubiert. Die Membranen/Membrankörper wurden mit PBS mehrfach gewaschen. Drei Membranen mit einem Durchmesser von 25 mm wurden in einen Filterhalter (Sartorius Teil Nr. 16517 eingelegt. Trypsin vom Rinderpankreas (SIGMA Best. Nr. T-8003 Lot Nr. 28F-8065 wurde in PBS zu 1 mg/ml gelöst. 10 ml dieser Lösung wurde über die Membranen mittels Schwerkraft filtriert. Die Membranen wurden mit 10 ml PBS gewaschen. Das gebundene Trypsin wurde mit 3 ml 0,1 M Gly- zin eingestellt auf pH 3,0 mit HC1 eluiert. Die enzymati- sche Aktivität des Trypsins in den verschiedenen Fraktionen wurde mit dem synthetischen Substrat Benzoyl-Arginin- Ethylester (BAEE) einem bekannten Substrat für Trypsin in einem UV- Spektrophotometer bestimmt. Diese wurden mit Aktivitäten von Trypsinlösungen bekannter Konzentration verglichen.
In eine Quarzküvette wurde folgendes pipettiert : 0,85 ml einer Lösung von 0,05 M Tris eingestellt mit HC1 auf pH 8,5, 0,2 ml einer Lösung von 2 mg/ml BAEE in Wasser und 0,05 ml Probe. Die Zunahme der Absorption bei 253 nm wurde über 30 Sekunden verfolgt.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten und sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1 : Bindung von Trypsin an eine mikroporöse mit Epo- xygruppen funktiohalisierte Membrane
Figure imgf000011_0001
Der Versuch wurde mit gleichem Ergebnis 2 x wiederholt.
Das Beispiel zeigt klar die Bindung von Trypsin an der mit dem Inhibitor beladenen Membrane/Membrankörper. Beispiel 2:
Der Cystein-Protease Inhibitor Leupeptin (Sigma, Deisenho- fen Best. Nr. L-2023) wurde in 0,05 M Kalium-Phosphat- Puffer pH 8,0 zu 20 mg/ml gelöst. Zehn epoxy aktivierte Membranen/Membrankörper der Abmessung 25 mm Durchmesser des Typs 18706 der Fa. Sartorius AG wurden in dieser Lösung bei 45°C über Nacht inkubiert. Die Membranen wurden mit PBS mehrfach gewaschen. Drei Membranen mit einem Durchmesser von 25 mm wurde in einen Filterhalter (Sartorius Teil Nr. 16517 eingelegt. Papain aus Papaya carica (Merck Art. Nr. 7144 Ch. 911 F739244, 30 000 USP - U/mg) wurde zu 2 mg/ml in folgendem gelöst: 1,1 mM EDTA, 0,67 mM Mercaptoethanol, 5,5 mM Cystein 50 mM Na-Azetat pH 5,5; = Komplett und mindestens 30 min bei RT stehen gelassen. Die enzymatische Aktivität des Papains in den verschiedenen Fraktionen wurde mit dem synthetischen Substrat Benzoyl-Arginin-Nitroanilid (BANA) , einem bekannten Substrat für Papain in einem UV- Spektrophotometer bestimmt. Diese wurden mit Aktivitäten von Papainlösungen bekannter Konzentration verglichen.
In eine Quarzküvette wurde folgendes pipettiert :
0,5 ml Enzy lösung 0,05 ml 25 mg/ml BANA in DMSO, 0,45 ml
Komplett .
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten und sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2 : Bindung von Papain an eine mikroporöse mit Leupeptin funktionalisierte Membrane
Figure imgf000012_0001
Der Versuch wurde mit gleichem Ergebnis 2 x wiederholt.
Das Beispiel zeigt klar die Bindung von Papain an der mit dem Inhibitor beladenen Membrane/Membrankörper.

Claims

Patentansprüche
1. Membran zum Entfernen von Proteasen aus Flüssigkeiten, bestehend aus einem mikroporösen Membrankörper, dadurch ge- kennzeichnet, dass Proteasen selektiv bindende Inhibitoren durch chemisch aktivierte Gruppen an den Membrankörper (7, 8, 9, 10) angekoppelt sind.
2. Membran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein saure Proteasen bindender Inhibitor an den Membrankörper (7) angekoppelt ist.
3. Membran nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Pepstatin an den Membrankörper (7) angekoppelt ist.
4. Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Metallo-Proteasen bindender Inhibitor an dem Membrankörper (8) angekoppelt ist.
5. Membran nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Bestatin, Diprotin oder EDTA an den Membrankörper (8) angekoppelt ist.
6. Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn- zeichnet, dass ein Cystein-Proteasen bindender Inhibitor an den Membrankörper (9) angekoppelt ist.
7. Membran nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass An- tipain, Chymostatin, Leupeptin oder E64 an den Membrankörper (9) angekoppelt ist.
8. Membran nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein Serin-Proteasen bindender Inhibitor an den Membrankörper (10) angekoppelt ist.
9. Membran nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass TLCK oder p-Aminobenzamidin an den Membrankörper (10) angekoppelt ist.
10. Vorrichtung zum Entfernen von Proteasen aus biologischen Flüssigkeiten und pharmazeutischen Lösungen mit einer Mehrzahl in Reihe geschalteter Membranen, dadurch gekennzeichnet, dass die Membranen (3, 4, 5, 6) nach einem der Ansprüche 1 bis 9 ausgebildet sind.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen Membranen (3, 4, 5, 6) jeweils einen Membrankörper (7, 8, 9, 10) mit einem anderen angekoppelten Inhibitor aufweisen.
12. Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Membranen (3, 4, 5, 6) in ein zur sequentiellen Durchströmung der Membranen (3, 4, 5, 6) geeignetes Gehäuse (2) eingebaut sind.
13. Verfahren zum Entfernen von Proteasen aus biologischen Flüssigkeiten und pharmazeutischen Lösungen durch Mikrofilt- ration mit mikroporösen aktivierten Membranen, dadurch gekennzeichnet, dass an die Membranen (3, 4, 5, 6) Inhibitoren über chemisch aktivierte Gruppen angekoppelt werden, durch die die Proteasen durch selektive Anbindung entfernt werden.
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