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WO2004098639A1 - ＴＧＦβ由来アポトーシス調節方法 - Google Patents

ＴＧＦβ由来アポトーシス調節方法 Download PDF

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WO2004098639A1
WO2004098639A1 PCT/JP2004/006518 JP2004006518W WO2004098639A1 WO 2004098639 A1 WO2004098639 A1 WO 2004098639A1 JP 2004006518 W JP2004006518 W JP 2004006518W WO 2004098639 A1 WO2004098639 A1 WO 2004098639A1
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WO
WIPO (PCT)
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apoptosis
bim
gene
expression
cells
Prior art date
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Application number
PCT/JP2004/006518
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English (en)
French (fr)
Inventor
Tetsu Akiyama
Takatoshi Hiroko
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Taisho Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Taisho Pharmaceutical Co Ltd
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2510/00—Detection of programmed cell death, i.e. apoptosis

Definitions

  • the present invention relates to a method for regulating apoptosis derived from TGF] 3. More specifically, the present invention relates to a method for regulating apoptosis by using a gene that is highly expressed when apoptosis is induced by TGF-. The present invention also relates to a method of screening a drug. Background art.
  • Apoptosis refers to the process by which cells are found to die in programmed cell death in the development, differentiation and maturation of cells and individuals or in cell death induced under various circumstances. Apoptosis is thought to occur under various physiological conditions. Its morphological characteristics include lack of contact with surrounding cells, cytoplasmic enrichment, chromatin condensation and nucleus condensation associated with endonuclease activity, nuclear segmentation, and the like. Disappearance of microvilli on the surface and smoothing of the cell surface (formation of blisters on the cell surface: membrane blebbing) are also observed.
  • Apoptosis has been shown to have an important role in various diseases, and various attempts have been made in recent years to diagnose, prevent and treat these diseases by inducing or suppressing apoptosis of cells. Have been.
  • Apoptosis also called programmed cell death, refers to a type of cell death that occurs in many tissues as a normal physiological process, and is triggered by the activation of the genetic program in the cell itself. Finally, these apoptotic cells are not inflamed and are taken up by surrounding phagocytes. (Shuichi Nagata, 9 98) Experimental Medicine, Vol. 16, 1242-1246). Apoptosis is known to be involved not only in normal physiological processes but also in the development of serious diseases such as cancer, autoimmune diseases, and neurodegenerative diseases. Therefore, development of methods for inducing or inhibiting apoptosis as therapeutic methods for the above-mentioned diseases and drugs useful for these methods are desired.
  • apoptosis induction for example, the process of inducing apoptosis by binding of Fas antigen and ligand for tumor necrosis factor receptor to those receptors located on the surface of animal cells (Nagata, S. et al. (1997) Cell, 88, 355-365) and that killing of cancer cells by anticancer drugs or X-ray irradiation occurs by activating an intracellular pathway that induces apoptosis (Haldar, S., et al. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4507-4511) has been elucidated in detail. Disclosure of the invention
  • the level of apoptosis or its expression can be analyzed by analyzing the expression level, structure and function of each cell, and analyzing its expression product. It will be possible to elucidate the pathology of related diseases and to establish diagnostic and treatment methods for them.
  • a first object of the present invention is to identify a protein useful for searching for an apoptosis-suppressing substance and a pro-apoptotic substance and a gene encoding the same, and to use the gene to make apoptosis derived from TGF / 3. To provide a way to regulate
  • a second object of the present invention is to provide a method for screening for an apoptosis-suppressing substance or an apoptosis-promoting substance that acts on the gene as a target, and to provide an apoptosis-suppressing substance or an apoptosis-promoting substance.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems, and have proceeded with comprehensive isolation of genes whose expression is induced by TGF-] 3 using a microarray.
  • Bim was identified as a gene showing a significant difference in expression level due to TGF- did.
  • the present inventors have further studied and demonstrated that the RNAi effect of Bim can suppress TGF-] 3-induced apoptosis.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • a method for regulating TGF / 3-derived apoptosis which comprises regulating the expression or function of apoptosis-inducing protein B im.
  • a method for suppressing apoptosis which comprises inhibiting expression and Z or function of apoptosis-inducing protein Bim.
  • An apoptosis-suppressing agent comprising a substance that inhibits expression or function of apoptosis-inducing protein Bim.
  • a method for promoting apoptosis which comprises increasing expression and / or function of apoptosis-inducing protein Bim.
  • An apoptosis-promoting agent comprising a substance that enhances expression or function of apoptosis-inducing protein Bim.
  • An apoptosis diagnostic agent comprising an oligonucleotide containing at least 10 contiguous nucleotides in the nucleotide sequence of the apoptosis-inducing gene Bim, or an antisense oligonucleotide having a sequence complementary to the oligonucleotide.
  • An apoptosis-suppressing agent comprising an antisense oligonucleotide having a sequence complementary to an oligonucleotide containing at least 10 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of the apoptosis-inducing gene Bim.
  • An apoptosis inhibitor comprising a double-stranded RNA containing at least 10 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of RNA transcribed from the nucleotide sequence of the apoptosis-inducing gene Bim, or DNA encoding the same.
  • RNAI reagent having SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7.
  • GGCCCCUACC UCCCUACAGA C AGAGC C A (SEQ ID NO: 7)
  • RNAi reagent consisting of AGA CAGAGCCA (SEQ ID NO: 7).
  • FIG. 1 shows the experimental results of the induction of Bim expression by TGF- / 31.
  • FIG. 2 shows the results of experiments on the effect of Smad on Bim's reporter construction.
  • FIG. 3 provides an overview of Bim's reporter construction.
  • FIG. 4 shows the results of experiments on the effect of a deletion mutant of Bim on apoptosis induced by TGF- / 31.
  • FIG. 5 shows the results of experiments on the effect of a dominant negative mutant of Bim on apoptosis induced by Bim.
  • Figure 6 shows the results of experiments on the effect of a dominant negative mutant of Bim on apoptosis induced by TGF-] 31.
  • FIG. 7 shows an outline of construction of a vector that expresses Bim RNAi.
  • FIG. 8 shows the results of experiments on the effect of BimRNAi on Bim-induced apoptosis.
  • FIG. 9 shows the results of experiments on the effect of BimRNAi on TGF- / 31-induced apoptosis.
  • the apoptosis-inducing protein (Bim) and the apoptosis-inducing gene (Bim) used in the present invention used in the present invention are an apoptosis-inducing protein derived from any organism including a mammal such as a human, and a gene thereof. .
  • the sequence of the Bim gene is known in various organisms. For example, O'Connor, L., (1998) EMB0 J, 17, 384-395, Mami, U., (2001) FEBS Letters, 509, 135 —141, and Michela, M., (2002) Mol. Cell. Biol, 22, 3577-3589.
  • Bel-2 family molecules have been identified that have been implicated in the control of apoptosis.
  • the structural feature of this family molecule is that it has several domains called BH1, BH2, BH3, and BH4 that have high homology to Bel-2, and from its structure and function, it has three subfamilies. are categorized.
  • Bel-2 subfamily (Bel-2, Bel-xL), which has BH1, BH2, BH3, and BH4 domains and has apoptosis-suppressing activity
  • Bax subfamily (Bax which has BH1, BH2, and BH3 domains and has apoptosis-promoting activity) And Bak)
  • BH3 only proteins (Bim, Bik, Bad, Bid, Hrk / DP5, Noxa, Puma, Bmf) that have only the BH3 domain and have a pro-apoptotic effect.
  • BH3 only protein binds to the Bel-2 subfamily and Bax subfamily via the BH3 domain and promotes apoptosis.
  • the apotosis gene (Bim) used in the present invention belongs to the BH3 only protein.
  • a human-derived apoptosis-inducing protein (Bim) can be particularly preferably used.
  • the amino acid sequence and the base sequence of the human-derived apoptosis-inducing protein (Bim) are known, and examples thereof are shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing. Shows the DNA nucleotide sequence and amino acid sequence of Bim s in SEQ ID NO: 1 and 2 shows the DNA nucleotide sequence and Amino acid sequence of Bim AD in SEQ ID NO: 3 and 4.
  • apoptosis-inducing protein (B im) or apoptosis-inducing gene (B im) j has not only the above-mentioned naturally occurring wild-type protein and wild-type gene but also an activity of inducing apoptosis. To the extent that they include all such variants or homologs.
  • the mutant or homologous proteins include the following.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having 95% or more homology with the amino acid sequence of a wild-type Bim protein and having an activity of inducing apoptosis;
  • the range of "one to several" in the "amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted and / or added” is not particularly limited, but is, for example, 1 to 20 and preferably 1 to 1 It means about 0, more preferably about 1 to 7, more preferably about 1 to 5, and particularly preferably about 1 to 3.
  • the amino acid sequence having a homology of 95% or more means that the amino acid homology is at least 95% or more, and the homology is preferably 96% or more. % Or more, more preferably 97% or more.
  • protein having an activity to induce apoptosis means a protein having an activity capable of promoting TGF- induced apoptosis.
  • Whether a protein has the activity to promote the induction of apoptosis by TGF- can be determined, for example, by introducing DNA encoding the protein into cells capable of inducing apoptosis by TGF-.
  • apoptosis is induced by adding TGF- to the expressed cells and inducing apoptosis, it can be detected by examining whether or not the overexpression of the DNA increases the number of cells that induce apoptosis.
  • mutant genes or homologous genes include the following.
  • a gene comprising a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted and / or added in the nucleotide sequence of a wild-type Bim gene, and encoding a protein having an activity of inducing apoptosis;
  • ⁇ one or several '' in the ⁇ base sequence in which one or several bases are deleted, substituted and Z or added in the base sequence '' as used herein is not particularly limited. It means about 60, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, even more preferably 1 to 10, and particularly preferably about 1 to 5.
  • hybridize under stringent conditions means that a probe is labeled under normal conditions (for example, when a probe is labeled with DIG DNA Labeling kit (Cat No. 1 75033 manufactured by Boehringer Mannheim). Hybridized in DIGE asy Hyb solution (Boehringer's Mannheim Cat. No. 1603558) at 32 ° C, containing 0.5 XSSC solution at 50 (0.1% [w / v] SDS) ), Under conditions where the membrane is washed (1330 is 0.15 M Na C 1, 0.015 M sodium citrate) under Southern hybridization conditions, as long as it hybridizes to the B im gene. .
  • DNA that hybridizes under stringent conditions includes the probe and DNA having a certain degree of homology with the nucleotide sequence of the DNA to be used as the DNA, for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, further preferably 93% or more, particularly preferably Is a DNA having a homology of 95% or more, most preferably 98% or more.
  • the method for obtaining the Bim gene used in the present invention is not particularly limited. Based on the nucleotide sequence and amino acid sequence information shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing of this specification, appropriate probes and primers are prepared, and human cDNA library is prepared using them.
  • a desired gene can be isolated by selecting a desired clone from those (prepared from appropriate cells in which the gene of the present invention is expressed) in accordance with a conventional method.
  • the gene of the present invention can also be obtained by the PCR method.
  • a chromosomal DNA or cDNA library derived from human cultured cells is used as type II, and PCR is performed using a pair of primers designed to amplify the desired Bim gene.
  • PCR reaction conditions can be set as appropriate, and include, for example, 94 ° C for 30 seconds (denaturation), 55 ° C for 30 seconds to 1 minute (annealing), and 72 ° C for 2 minutes (extension).
  • the reaction step may be one cycle, for example, conditions in which 30 cycles are performed, and then the reaction is performed for 7 minutes at 72 ° C.
  • the amplified DNA fragment is transferred to an appropriate vector that can be propagated in a host such as E. coli.
  • Operations such as preparation of the above-described probe or primer, construction of a cDNA library, screening of a cDNA library, and cloning of a target gene are known to those skilled in the art. It can be carried out according to the method described in Molecular Clawing, 2nd edition, Current 'Protocolnoles' in Molecular Biology.
  • one or several bases have a deletion, substitution, Z or addition base sequence, and induce apoptosis.
  • (Mutant gene) that encodes a protein having an active activity can also be produced by any method known to those skilled in the art, such as chemical synthesis, genetic engineering techniques, or mutagenesis.
  • a mutated DNA can be obtained by using a DNA having the base sequence of the Bim gene and introducing a mutation into these DNAs.
  • the method can be carried out using a method in which DNA having the base sequence of the Bim gene is brought into contact with a drug as a mutagen, a method of irradiating ultraviolet rays, a genetic engineering technique, or the like.
  • Site-directed mutagenesis which is one of the genetic engineering techniques, is useful because it is a technique that can introduce a specific mutation at a specific position, and is useful in molecular cloning, second edition, current protocol / lesion. ⁇ In ⁇ Molecular ⁇ Biology, etc.
  • the DNA mutant can be used in the present invention as long as it encodes a protein having an activity of inducing apoptosis.
  • the gene comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions to the base sequence of the Bim gene and that encodes a protein having an activity of inducing apoptosis, as described above, under the conditions described above. It can be obtained by performing a co-original hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern plot hybridization method, or the like under a certain hybridization condition.
  • an apoptosis inhibitor using an antibody against an apoptosis-inducing protein is provided.
  • a polyclonal antibody or a polyclonal antibody may be used as long as it can specifically bind to the apoptosis-inducing protein. May be any of monoclonal antibodies.
  • Polyclonal antibodies can be prepared by separating and purifying serum obtained from animals immunized with the antigen.
  • Monoclonal antibodies are prepared by fusing antibody-producing cells obtained from an animal immunized with an antigen with myeloma cells to produce a hybridoma, and culturing the hybridoma or administering the hybridoma to an animal to cause the animal to develop ascites carcinoma. Then, the above-mentioned culture solution or ascites can be separated and purified.
  • the antigen can be obtained by purifying the protein of the present invention from various human cultured cells, or by transforming a recombinant vector containing a DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a mutant sequence thereof or a protein having a part thereof into E. coli.
  • the protein can be prepared by introducing into a host such as yeast, animal cells or insect cells, expressing the DNA, and separating and purifying the protein.
  • the antigen can also be prepared by synthesizing a peptide having a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 using an amino acid synthesizer.
  • the antigen may be directly administered subcutaneously, intravenously, or intraperitoneally to a non-human mammal such as a rabbit, a goat, a rat, a mouse, a hamster, or the like. It can be administered to whole limpet by binding to a carrier protein with high antigenicity such as mosinin, bovine serum albumin, bovine chilogue purine, etc., or Freund's complete adjuvant (Comp 1 ete Freund's Adjuvant), It is also preferable to administer with an appropriate adjuvant such as an aluminum hydroxide gel or a pertussis vaccine.
  • a carrier protein with high antigenicity such as mosinin, bovine serum albumin, bovine chilogue purine, etc.
  • Freund's complete adjuvant Comp 1 ete Freund's Adjuvant
  • an appropriate adjuvant such as an aluminum hydroxide gel or a pertussis vaccine.
  • the antigen can be administered 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, and the ability of the serum to react with the antigen used for immunization is determined by measuring the antibody titer according to an enzyme immunoassay or the like.
  • a non-human mammal whose serum shows a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization can be used as a source of serum or antibody-producing cells.
  • a polyclonal antibody can be prepared by separating and purifying the above serum.
  • Monoclonal antibodies include the antibody-producing cells and non-human mammal-derived myeloma cells.
  • the hybridoma is prepared by culturing the hybridoma and culturing the hybridoma, or administering the hybridoma to an animal to cause the animal to become ascites cancer, and separating and purifying the culture solution or ascites. it can.
  • As antibody-producing cells, spleen cells, lymph nodes, and antibody-producing cells in peripheral blood can be used, and spleen cells can be particularly preferably used.
  • Myeloma cells include the 8-azaguanine-resistant mouse (derived from BALB / c) myeloma cell line P3—X63Ag8—U1 (P3-U1) strain [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1-7 (1978)], P 3-NS 1 / ⁇ -Ag 41 (NS-1) strain [European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)], SP 2 / 0-Ag 14 (S P_2) strain [Nature, 276, 269-270 (1978)], P3-X63-Ag8653 (6553) strain [J. Immunology, 123, 1548-1550 (1979)], P3-X63-Ag8 ( X 63) Strains [Nature, 256, 495-497 (1975)] and the like can be used.
  • Hybridoma cells can be prepared by the following method. First, antibody-producing cells and myeloma cells are mixed, suspended in a HAT medium [a medium in which hypoxanthine, thymidine and aminobuterin are added to a normal medium], and cultured for 7 to 14 days. After the cultivation, a portion of the culture supernatant is removed, and those that react with the antigen but do not react with the protein containing no antigen are selected by enzyme immunoassay or the like. Next, cloning is performed by the limiting dilution method, and those with a stable and high antibody titer determined by the enzyme immunoassay are selected as monoclonal antibody-producing hybridoma cells. Monoclonal antibodies can be prepared by administering a culture solution obtained by culturing hybridoma cells or hybridoma cells into the peritoneal cavity of an animal and causing the animal to undergo ascites cancer to separate and purify the ascites.
  • HAT medium a medium in which hypoxant
  • Methods for separating and purifying polyclonal or monoclonal antibodies include centrifugation, ammonium sulfate precipitation, caprylic acid precipitation, or DEAE-Sepharose column, anion exchange column, protein A or G-column, or gel filtration column. Processing by chromatography or other methods used alone or in combination There is a way to do.
  • antibody used herein includes not only full-length antibodies but also fragments of the antibodies.
  • the antibody fragment is preferably a functional fragment, for example, F (ab,) 2 , F ab ′ and the like.
  • F (ab,) 2 and F ab ' are produced by treating immoglobulin with a protease (for example, pepsin or papain), and are used between the two H chains in the hinge region. Is an antibody fragment that is produced by digestion before and after the disulfide bond existing in E. coli.
  • humanized antibody or a humanized antibody When the antibody of the present invention is used for administration to humans, it is preferable to use a humanized antibody or a humanized antibody in order to reduce immunogenicity.
  • humanized antibodies and humanized antibodies can be prepared using mammals such as transgenic mice.
  • mammals such as transgenic mice.
  • humanized antibodies see, for example, Morrison, S.L. et al.
  • a humanized chimeric antibody can be produced by combining the V region of a mouse antibody and the C region of a human antibody by genetic recombination.
  • a humanized antibody can be produced by substituting a region other than the complementarity determining site (CDR) from a mouse monoclonal antibody with a sequence derived from a human antibody.
  • CDR complementarity determining site
  • an antibody capable of specifically binding to the apoptosis-inducing protein (Bim) identified in the present invention and inhibiting its function can be used as an apoptosis inhibitor.
  • the antibody of the present invention is used in the form of a pharmaceutical composition as an apoptosis inhibitor, the antibody is used as an active ingredient, and a pharmaceutically acceptable carrier and diluent
  • a pharmaceutical composition can be prepared using, for example, immunogenic adjuvants, stabilizers or excipients.
  • the apoptosis inhibitor containing the antibody of the present invention can be sterilized by filtration, lyophilized, and formulated into a dosage form in a dosage vial or a stabilized aqueous preparation.
  • Administration to a patient can be performed by a method known to those skilled in the art, such as intraarterial injection, intravenous injection, and subcutaneous injection.
  • the dosage depends on the weight and age of the patient and the method of administration. Although it fluctuates depending on, for example, those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the dose of the antibody as an active ingredient is generally in the range of about 0.1 ⁇ g to 100 mg per kg of body weight at a time.
  • the antibody of the present invention exhibits a therapeutic effect on diseases associated with promotion of apoptosis by suppressing apoptosis.
  • the base sequence information of the Bim gene revealed by the present invention for example, by using a probe or a primer having a partial or entire base sequence of the gene, it is possible to obtain Bim in various human tissues.
  • the expression of the im gene can be detected.
  • the expression of the Bim gene can be detected by a conventional method such as Northern blotting or RT-PCR.
  • the Bim gene identified in the present invention is a gene involved in inducing apoptosis in cells. As will be described later, apoptosis is involved in various diseases, so that apoptosis-related diseases can be diagnosed by detecting the expression of the Bim gene.
  • the primer is not particularly limited as long as it can specifically amplify only the Bim gene, and can be appropriately set based on known sequence information of the Bim gene.
  • an oligonucleotide containing at least 10 contiguous nucleotides in the base sequence of the Bim gene, and an antisense oligonucleotide having a sequence complementary to the oligonucleotide can be used as a probe or primer.
  • an oligonucleotide having a continuous nucleotide sequence of 10 to 60 residues, preferably 10 to 40 residues in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the oligonucleotide, Antisense oligonucleotides having complementary sequences can be used.
  • the above-described oligonucleotides and antisense oligonucleotides can be produced by a conventional method using a DNA synthesizer.
  • the oligonucleotide or the antisense oligonucleotide for example, a part of the mRNA to be detected In the base sequence, a sense primer corresponding to the base sequence at the 5 'end, and an antisense primer corresponding to the base sequence at the 3' end can be mentioned.
  • the sense primer or antisense primer is an oligonucleotide whose melting temperature (Tm) or the number of bases does not extremely change, and includes those having about 10 to 60 bases. Those having about 40 bases are preferred.
  • derivatives of the above-described oligonucleotides can also be used. For example, a methyl form or a phosphorothioate form of the oligonucleotide can also be used.
  • apoptosis of cells can be suppressed by introducing the antisense oligonucleotide into cells to suppress transcription and translation of the Bim gene. That is, according to the present invention, there is provided an apoptosis inhibitor comprising an antisense oligonucleotide having a sequence complementary to an oligonucleotide containing at least 10 consecutive nucleotides in the base sequence of the Bim gene.
  • the method for introducing an antisense oligonucleotide into cells can be performed in the same manner as the method for introducing a recombinant vector.
  • the method for detecting cell apoptosis is not particularly limited, and examples include microscopic observation, TUNEL method, DNA ladder detection method, quantification of DNA fragmentation rate, and measurement of cell size distribution.
  • the TUNEL method is a method for detecting a cut end of DNA caused by apoptosis by labeling it with biotin-digoxigenin using term inaldeoxynucl eotidyltransferase (TdT).
  • TdT inaldeoxynucl eotidyltransferase
  • the DNA ladder detection method detects chromatin DNA fragmentation caused by apoptosis by extracting DNA from cells and performing agarose gel electrophoresis. The fragmented DNA is detected in a ladder form. .
  • Quantification of DNA fragmentation rate is a method in which only fragmented low-molecular-weight DNA is extracted and DNA is quantified using diphenylamine.
  • Cell size distribution measurement This is a method in which the contraction or fragmentation of cells due to one cis and the increase of small-sized cells are measured using a particle size measuring device such as Coulter multisizer. By these methods, it is possible to detect whether or not cells are undergoing apoptosis.
  • antisense oligonucleotide of the present invention By using the above-described antisense oligonucleotide of the present invention to suppress apoptosis by suppressing transcription or translation of the Bim gene, a disease in which promotion of apoptosis is involved in the disease state (for example, , Neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease).
  • a disease in which promotion of apoptosis is involved in the disease state for example, Neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease.
  • antisense oligonucleotides can be injected into the affected area or the whole body of a patient together with a suitable carrier (eg, ribosome or cholesterol) with high affinity for cell membranes, which is used to assist in uptake into cells.
  • a suitable carrier eg, ribosome or cholesterol
  • the above-mentioned disease can be treated by injecting into a patient's cell to suppress apoptosis.
  • RNAi instead of using the antisense oligonucleotide described in (4) above.
  • RNAi RNAinterference
  • dsRNA double-stranded RNA
  • a double-stranded RNA containing at least 10 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of RNA transcribed from the nucleotide sequence of the apoptosis-inducing gene (Bim gene) of the present invention, or encodes the same.
  • DNA is provided.
  • the DNA encoding the double-stranded RNA include a DNA having an inverted repeat of an apoptosis-inducing gene (Bim gene) or a partial sequence thereof.
  • RNAi reagent of the present invention is an RNAi reagent having SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, particularly (SEQ ID NO: 6) — (linker sequence) 1 (SEQ ID NO: 7).
  • RN Ai reagent is an RNAi reagent having SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, particularly (SEQ ID NO: 6) — (linker sequence) 1 (SEQ ID NO: 7).
  • the inverted repeat sequence refers to a sequence in which the target gene and its inverted sequence are juxtaposed via an appropriate sequence. Specifically, when the target gene has a double strand consisting of the following n base sequences,
  • the reverse arrangement has the following arrangement:
  • the inverted repeat sequence is a sequence in which the above two types of sequences are arranged via an appropriate sequence.
  • the inverted repeat sequence there are two cases: a case where the sequence of the target gene is upstream of the sequence of the reverse sequence and a case where the sequence of the reverse sequence is upstream of the sequence of the target gene.
  • the inverted repeat sequence used in the present invention may be any of the above, but preferably, the inverted sequence is located upstream of the sequence of the target gene.
  • the sequence existing between the sequence of the target gene and its reverse sequence is a region that forms a hairpin loop when transcribed into R ⁇ .
  • the length of this region is not particularly limited as long as a hairpin loop can be formed, but is generally from Obp to 700 bp, preferably about 0 to 300 bp, more preferably about 0 to 100 bp. is there.
  • a restriction enzyme site may be present in this sequence.
  • the inverted repeat sequence of the target gene can be expressed in mammalian cells by incorporating the inverted repeat sequence of the target gene downstream of the promoter sequence operable in the mammal.
  • the promoter sequence used in the present invention is not particularly limited as long as it can operate in mammals.
  • an apoptosis inhibitor comprising the above-described double-stranded RNA or DNA.
  • Diseases in which promotion of apoptosis is involved in disease states by suppressing transcription and Z or translation of the Bim gene using the above-described double-stranded RNA or DNA to suppress apoptosis eg, Alzheimer's disease
  • the above-described double-stranded RNA or DNA is used together with a suitable carrier having high affinity for cell membranes (eg, ribosome, cholesterol, etc.), which is used to assist in uptake into cells.
  • the above-mentioned diseases can be treated by administering the compound systemically by injection or the like and taking it into the cells of the patient to suppress apoptosis.
  • the dose of the double-stranded RNA or DNA as an active ingredient is generally in the range of about 0.1 ⁇ g to 10 mg / kg body weight at a time.
  • apoptosis using the apoptosis-inducing protein of the present invention (3) an apoptosis inhibitor using an antibody against the apoptosis-inducing protein (Bim), (4) an oligonucleotide and an antisense oligonucleotide As described in (5) Inhibition of apoptosis by leotide and (5) RNAi, apoptosis can be suppressed by inhibiting the expression or function of the apoptosis-inducing protein (Bim) of the present invention. is there. Thus, all methods for suppressing apoptosis by inhibiting the expression and / or function of the apoptosis-inducing protein of the present invention are within the scope of the present invention.
  • the method for suppressing apoptosis include treatment of a disease accompanied by promotion of apoptosis, and a method for suppressing cell death due to apoptosis.
  • a method for suppressing cell death due to apoptosis For example, the following (a) production of a useful protein, and (B) Transplanted cells Examples of use are described.
  • Cell lines that produce useful proteins may cause cell death due to cytotoxicity of the proteins produced during long-term culture.
  • protein production can be performed more efficiently by removing serum from the culture solution, but there is a problem that cell death is induced in the absence of serum. It is known that much of such cell death is due to apoptosis. Therefore, by suppressing apoptosis by the method of the present invention, it becomes possible to increase the production efficiency of useful proteins.
  • a technique is used in which nerve cells and dopamine-producing cells of a dead fetus are transplanted into the brain of a patient.
  • cell transplantation methods such as blood transfusion, bone marrow transplantation, and eXViVo methods in gene therapy, are used to introduce autologous or other cells into patients.
  • Transplanted cells generally undergo cell death due to apoptosis and the like, and are difficult to maintain for long periods. Therefore, by suppressing apoptosis by the method of the present invention, an effect can be obtained in organ transplantation or cell transplantation therapy.
  • an apoptosis inhibitor comprising a substance that inhibits the expression or function of the apoptosis-inducing protein of the present invention is also within the scope of the present invention.
  • Specific examples of the substance that inhibits the expression and / or function of the apoptosis-inducing protein of the present invention include the antibody described in (4) above, the antisense oligonucleotide described in (5) herein, and Examples include, but are not limited to, the double-stranded RNA described in (6) or the DNA encoding the same.
  • a method of promoting apoptosis by increasing the expression and / or function of the apoptosis-inducing protein (Bim) is also within the scope of the present invention.
  • apoptosis-promoting agents comprising Z or a substance that increases function are also within the scope of the present invention.
  • Methods for increasing the expression and Z or function of apoptosis-inducing protein (B im) include a method for introducing a gene encoding B im into cells, and a factor that acts on the promoter region of the gene to increase its expression. Alternatively, a method of introducing a gene encoding the gene into a cell may be used.
  • Whether or not apoptosis is suppressed or promoted and the degree thereof are determined by methods such as the microscopic observation, TUNEL method, DNA ladder detection method, quantitative determination of DNA fragmentation rate, and measurement of cell size distribution described above. Can be detected.
  • a substance that suppresses or promotes apoptosis can be screened by using a change in the expression and / or function of the apoptosis-inducing protein (Bim) identified by the present invention as an index.
  • Bim apoptosis-inducing protein identified by the present invention.
  • cells containing the gene encoding Bim are cultured together with TGF_j3 in the presence or absence of the test substance, and the expression of the Bim in accordance with the presence or absence of the test substance is determined.
  • a substance that suppresses or promotes apoptosis can be screened using the change in Z or function as an index.
  • the expression level of the apoptosis-inducing protein at the mRNA level can be measured by a conventional method such as Northern blot or RT-PCR, and the expression level at the protein level can be determined by 3) It can be performed by usual immunoassay such as Western blot or ELISA using the described antibody. Specifically, it can be carried out by a conventional method known to those skilled in the art described in Molecular Clawing Second Edition or Ryrent Protocols' in. Molecular Biology.
  • the analysis of the change in the function of the apoptosis-inducing protein can be analyzed by measuring the presence or absence or degree of inhibition or promotion of apoptosis induction.
  • the above measurement of apoptosis induction the above-mentioned microscopic observation, TUNEL method, DNA ladder detection method, quantification of DNA fragmentation rate, cell size distribution measurement It can be carried out according to fixed conditions.
  • test substance Any substance can be used as a test substance to be subjected to the screening method of the present invention.
  • the type of the test substance is not particularly limited, and may be an individual low-molecular-weight synthetic compound, a compound present in a natural product extract, or a synthetic peptide.
  • the test compound may also be a compound library, phage display library or combinatorial library.
  • the test substance is preferably a low-molecular compound, and a compound library of low-molecular compounds is preferable.
  • the construction of a compound library is known to those skilled in the art, and a commercially available compound library can also be used.
  • Apoptosis is not only a normal physiological process, but also the development of serious diseases such as cancer, autoimmune diseases (eg, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, etc.) and neurodegenerative diseases. It is known to be involved. For example, malignant transformation of cancer cells is thought to be caused by the inhibition of apoptotic processes in cancer cells and the continued growth of cells that should have died (Harris, CC, (1996) J. Natl. Cancer). Instit., 88, 1442-1445).
  • Autoimmune diseases are also caused by the fact that immune cells that respond to their own antigens, which are supposed to be eliminated by apoptosis during development, are not eliminated by abnormal apoptosis control (Rieux- Laucat, F. et al., (1995) Science, 268, 1347-1349).
  • Neurodegenerative diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's chorea, etc.
  • have been attributed to abnormally enhanced apoptosis (Wolozin, B., et al., ( 1996) Science, 274, 1710-1713).
  • the above-mentioned apoptosis inhibitor of the present invention is considered to be particularly effective as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases.
  • the apoptosis-promoting substance is considered to be particularly effective as a therapeutic agent for various cancers and as a therapeutic agent for autoimmune diseases such as rheumatism.
  • the therapeutic agent for a disease involving apoptosis containing the apoptosis-suppressing substance and the apoptosis-promoting substance as effective components according to the present invention can be orally or parenterally administered whole or locally.
  • Parenteral administration methods include infusion Injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dose varies depending on the age, administration route and number of administrations, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Formulations suitable for parenteral administration include, for example, those containing additives such as stabilizers, buffers, preservatives, and isotonic agents, and those containing pharmaceutically acceptable carriers and additives. May be.
  • additives such as stabilizers, buffers, preservatives, and isotonic agents
  • pharmaceutically acceptable carriers and additives May be.
  • examples of such carriers and additives include water, organic solvents, high molecular compounds (collagen, polyvinyl alcohol, etc.), stearic acid, human serum albumin (HSA), mannitol, turbitol, lactose, surfactants, etc. But are not limited to these.
  • JRS Oligotex-dT30
  • G3PDH was used as a loading control and PAI-1 was used as a positive control for the TGF-] 31 response.
  • the 0RF of Bim was searched by httg of BLASTN of NCBI, and the BAC clone RP11-438K19 was selected. RP11-438K19 was confirmed to be normal in comparison with the DNA sequence of the NCBI human genome, and a DNA fragment 5.7 kb upstream of Bim's 0RF (base sequence is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing) was confirmed. A reporter was introduced into the pGL3 promoter vector (Promega). Figure 3 shows an overview of Bim's reporter construction.
  • Example 4 Effect of Smad on Bim's Reporter Construction
  • TGF-II 10 hours after the introduction of the reporter, 10 ng TGF-II (R & D) was added to the solution at a concentration of / ml, and the mixture was allowed to stand for 24 hours.
  • the luciferase was measured using a Dual-Luciferase Repoter Assay system (Promega) and luciferase assay was performed.
  • the results in Figure 2 suggest that Bim activates transcription in a Smad3- and Smad4-dependent manner
  • Example 5 Effect of Bim deletion mutant on apoptosis induced by TGF- / 31
  • the deletion mutant was prepared by PCR using Bim AD cDNA as a template.
  • BMprimer 15 -ATATGAATTCATGGCAAAGCAACCTTCTG-3 '(SEQ ID NO: 8) BMprimer 25, -ATATGAATTCGGGGCCCCTACCTCCCTACA-3' (SEQ ID NO: 9) BMprimer 35 ' 3 '(SEQ ID NO: 1) BMprimer 5 5' -ATATCTCGAGGTTAAACTCGTCTCCGATAC-3 '(SEQ ID NO: 1) BMprimer 6 5' -ATATCTCGAGTCAATGCATTCTCCACACCAG-3 '(SEQ ID NO: 1)
  • Bim s AN30 The amino acid sequence from the 31st to the 76th in the amino acid sequence of Bim s
  • Bim s AN51 Amino acid sequence with Leu Gly Lys added to the C-terminal of the amino acid sequence from position 52 to position 76 in the amino acid sequence of Bim s
  • Bim s AN61 Amino acid sequence with the addition of Leu Gly Lys at the C-terminus of the amino acid sequence from position 62 to position 76 in the amino acid sequence of Bim s
  • Bim s A C70 Amino acid sequence from 1st to 70th amino acid in Bim s amino acid sequence
  • BH3 Bim s Amino acid sequence from 62nd Amino acid sequence up to 70th
  • Fig. 4 shows the results. From the results of FIG. 4, the apoptosis that will be induced by TGF-31 it was shown to be due connexion suppressed for gene transfer Bim s delta N51.
  • Example 6 Effect of dominant negative mutant of Bim on apoptosis induced by Bim
  • Bim s AN51 was suggested to be a dominant negative variant variant of Bim.
  • Example 7 Effect of dominant negative mutant of Bim on apoptosis induced by TGF- ⁇ 1
  • RNAi of Bim was create synthetic Origo (Bim RNAi F1 and Bim RNAi Rl) from 92 th Bim s based on 123 th DNA base sequence.
  • FIG. 7 shows an outline of the construction of a vector that expresses Bim RNAi.
  • Example 10 Effect of Bim RNAi on apoptosis induced by TGF-] 31 0.01 ⁇ g of pSHAG—BimRNAi together with 0.25 ⁇ g of LacZ expression plasmid was added to 1 ⁇ 10 4 Hep3B cells TM Gene transfer was performed using Transfection Reagent (QIAGEN). Eighteen hours after the gene transfer, the medium was replaced with a DMEM medium (0% FBS), TGF-1 was added to a concentration of 5 ng / ml, and the cells were cultured for 24 hours. Twenty-four hours after treatment with TGF-j31, the cells were fixed with 1% daltaraldehyde and stained with X-gal. The results are shown in FIG. The results in Figure 9 suggest that apoptosis induced by TGF-] 31 is inhibited by Bim RNAi, and that Bim plays an important role in TGF-] 31-induced apoptosis. Was. Industrial applicability
  • a novel apoptosis-inducing gene has been identified.
  • expression of the present gene in each tissue can be detected, and an apoptosis-inducing protein can be produced by genetic engineering.
  • the gene of the present invention it is possible to diagnose an apoptosis-related disease and to screen for an apoptosis inhibitor or promoter.
  • the gene of the present invention is extremely useful for developing a method for preventing and treating a disease using a gene therapy antisense oligonucleotide for the purpose of suppressing apoptosis.

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Abstract

　本発明は、アポトーシス抑制物質およびアポトーシス促進物質を探索するのに有用なタンパク質及びそれをコードする遺伝子を同定し、当該遺伝子を利用することによってＴＧＦβに由来するアポトーシスを調節する方法を提供することである。本発明によれば、アポトーシス誘導タンパク質Ｂｉｍの発現および／又は機能を調節することを含む、ＴＧＦβ由来のアポトーシスを調節する方法が提供される。

Description

明細書
T G F β由来アポトーシス調節方法 技術分野
本発明は、 T G F ]3に由来するアポトーシスの調節方法に関する。 より詳細に は、 本発明は、 T G F— によるアポトーシス誘導の際に高発現する遺伝子を利 用してアポトーシスを調節する方法に関する。 本発明はまた、 薬剤のスクリー二 ング方法にも関する。 背景技術 .
アポトーシスは、 細胞及び個体の発生、 分化、 成熟におけるプログラムされた 細胞死において、 または、 種々の状況下に誘導される細胞死において、 認められ る細胞が死に至る過程を意味する。 アポトーシスは、 生理学上の種々の条件下に 起こるとされている。 その形態学的特徴としては、 周囲の細胞との接触の欠乏、 細胞質の濃縮化、 ェンドヌクレアーゼの活性に関連したクロマチンの凝縮及び核 凝縮、 核の分節化等を挙げることができ、 更に細胞表面の微絨毛の消失、 細胞表 面の平滑化 （細胞表面の水泡形成： membranece blebbing) 等も観察される。 また エンドヌクレアーゼ活性により、 D NAが断片化する現象も観察され、 アポプテ ィック体の細胞の最終断片は、 隣接する細胞により貪食される機構として論じら れている [Immunology Today, Z (4)， 115— 119 (1986) ] 。
アポトーシスは、 各種多様な疾患において重要な係わりを有することが明らか にされてきており、 細胞のアポトーシスを誘導または抑制することにより、 これ ら疾患の診断、 予防及ぴ治療を図る試みが近年種々行なわれている。
アポトーシスとは、 プログラム細胞死とも言われ、 正常な生理学的過程として 多くの組織で起こるある種の細胞死を指し、 細胞自身に備わっている遺伝的プロ グラムの活性化によって引き起こされる。 そして、 最終的にこれらアポトーシス を起こした細胞は、 炎症を起こしたりすることもなく、 周辺の食細胞によって取 り除かれる （長田重一、 998) 実験医学、 Vol. 16、 1242-1246)。 アポトーシス は、 正常な生理学的過程以外にも、 癌、 自己免疫疾患、 神経変性疾患等の重篤な 疾患の発症にも関与していることが知られている。 そこで、 上記疾患の治療法と してアポトーシスを誘導または阻害する方法およびこれらの方法に有用な薬剤の 開発が切望されている。 アポトーシスの誘導メカニズムに関しては、 これまでに 例えば、 Fas抗原や腫瘍壌死因子レセプターのリガンドが動物細胞表面に局在す るそれらのレセプターと結合することにより、 アポトーシスを誘導する過程 (Nagata, S. , (1997) Cell, 88, 355-365) や、 抗癌剤や X線照射による癌細胞 の殺傷がアポトーシスを誘導する細胞内経路を活性化することによって起こるこ と （Haldar, S. , et al.， (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92， 4507—4511) が詳細に解明された。 発明の開示
細胞のアポトーシス誘導時に活性化されて特異的に発現される遺伝子が提供さ れれば、 各細胞でのその発現レベルや構造及び機能解析、 並びにその発現産物に 関する解析を行なうことにより、 アポトーシスまたはその関連疾患の病態を解明 したり、 その診断おょぴ治療方法を確立することが可能になる。
本発明の第一の目的は、 アポトーシス抑制物質およびアポトーシス促進物質を 探索するのに有用なタンパク質及ぴそれをコードする遺伝子を同定し、 当該遺伝 子を利用することによって T G F /3に由来するアポトーシスを調節する方法を提 供することである。
本発明の第二の目的は、 上記遺伝子を標的として作用するアポトーシス抑制物 質またはアポトーシス促進物質をスクリーニングする方法、 並びにアポトーシス 抑制物質またはアポトーシス促進物質を提供することにある。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意検討し、 マイクロアレイを用い て、 TGF- ]3によって発現誘導される遺伝子の網羅的な単離を進めてきた。 その過 程において、 TGF- により発現量に有意な差を示す遺伝子として、 B i mを同定 した。本発者らはさらに研究を進め、 B imの RNAi効果によって、 TGF- ]3によつ て誘導されるアポトーシスを抑制できることを実証した。 本発明はこれらの知見 に基づいて完成したものである。
即ち、 本発明によれば、 以下の発明が提供される。
(1) アポトーシス誘導タンパク質 B imの発現おょぴ 又は機能を調節するこ とを含む、 TGF /3由来のアポトーシスを調節する方法。
(2) アポトーシス誘導タンパク質 B imの発現および Z又は機能を阻害するこ とを含む、 アポトーシスを抑制する方法。
(3) アポトーシス誘導タンパク質 B imの発現おょぴ Z又は機能を阻害する物 質を含む、 アポトーシス抑制剤。
(4) アポトーシス誘導タンパク質 B i mの発現および/'又は機能を増大する ことを含む、 アポトーシスを促進する方法。
(5) アポトーシス誘導タンパク質 B i mの発現おょぴ Z又は機能を増大する 物質を含む、 アポトーシス促進剤。
(6) アポトーシス誘導遺伝子 B i mの塩基配列中の連続する少なくとも 10 ヌクレオチドを含むォリゴヌクレオチド、 又は該ォリゴヌクレオチドに相捕的な 配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、 アポトーシス診断薬。
(7) アポトーシス誘導遺伝子 B i mの塩基配列中の連続する少なくとも 10 ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相捕的な配列を有するアンチセンスォ リゴヌクレオチドを含む、 アポトーシス抑制剤。
(8) アポトーシス誘導遺伝子 B i mの塩基配列から転写される RNAの塩基 配列中の連続する少なくとも 10ヌクレオチドを含む二本鎖 RNA、 またはそれ をコードする DN Aを含む、 アポトーシス抑制剤。
(9) アポトーシス誘導タンパク質 B i mの発現および Z又は機能の変化を指 標として、 アポトーシスを抑制又は促進する物質をスクリ一ユングする方法。
(10) アポトーシス誘導タンパク質 B i mをコードする遺伝子を有する細胞 を TGF— /3と一緒に、 被験物質の存在下および非存在下において培養し、 被験 物質の有無に応じた当該アポトーシス誘導タンパク質 B i mの発現おょぴ 又は 機能の変化を指標として、 アポトーシスを抑制又は促進する物質をスクリーニン グする、 （9) に記載の方法。
(1 1) 配列番号 6及び配列番号 7を有する R N A i試薬。
UGGCUCUGUC UGUAGGGAGG UAGGGGCC (配列番号 6) ；
GGCCCCUACC UCCCUACAGA C AGAGC C A (配列番号 7)
(1 2) (UGGCUCUGUC UGUAGGGAGG UAGGGGCC (配列番号 6)) - (リンカ一配列） ― （GGCCCCUACC UCCCUAC
AGA CAGAGCCA (配列番号 7)) からなる RNA i試薬。 図面の簡単な説明
図 1は、 TGF- /31による Bimの発現誘導の実験結果を示す。
図 2は、 Bimのレポーターコンストラクシヨンに対する Smadの効果に関する実 験結果を示す。
図 3は、 Bimのレポーターコンストラクションの概要を示す。
図 4は、 TGF-/31によって誘導されるアポトーシスに対する Bimの欠失変異体 の効果に関する実験結果を示す。
図 5は、 Bimによって誘導されるアポトーシスに対する Bimのドミナントネガ ティブ変異体の効果に関する実験結果を示す。
図 6は、 TGF- ]31によって誘導されるアポトーシスに対する Bimのドミナント ネガティブ変異体の効果に関する実験結果を示す。
図 7は、 Bimの RNAiを発現する vectorの構築の概要を示す。
図 8は、 Bimによって誘導されるアポトーシスに対する BimRNAiの効果に関す る実験結果を示す。
図 9は、 TGF-/31によって誘導されるアポトーシスに対する BimRNAiの効果に 関する実験結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について詳細に説明する。
( 1 ) 本発明で利用するアポトーシス誘導タンパク質 （B i m) 及ぴアポトーシ ス誘導遺伝子 （B i m) について
本発明で利用する本発明で利用するアポトーシス誘導タンパク質 （B i m) お よびアポトーシス誘導遺伝子 （B i m) は、 ヒトなどの哺乳動物を含む任意の生 物に由来するアポトーシス誘導タンパク質およびその遺伝子である。 B i m遺伝 子は各種生物においてその配列が公知であり、例えば、 O' Connor, L.， (1998) EMB0 J, 17, 384-395、 Mami, U. , (2001) FEBS Letters, 509, 135—141、 および Michela, M. , (2002) Mol. Cell. Biol, 22, 3577- 3589などに記載されている。
これまでに、 アポトーシスの制御に関係する数多くの Bel- 2フアミリー分子が 同定されている。 このファミリー分子の構造的特徴は、 Bel- 2 に高い相同性を有 する BH1、 BH2、 BH3、 BH4と呼ばれるドメインのいくつかを有することであり、 そ の構造おょぴ機能から 3つのサブファミリーに分類される。 BH1、 BH2、 BH3、 BH4 ドメインを有しアポトーシス抑制作用をもつ Bel- 2 サブファミ リー （Bel - 2、 Bel- xL)、 BH1、 BH2、 BH3 ドメインを有しアポトーシス促進作用をもつ Baxサブフ アミリー （Bax、 Bak)、 そして BH3 ドメインのみを有しアポトーシス促進作用を もつ BH3 only タンパク質 （Bim、 Bik、 Bad、 Bid, Hrk/DP5、 Noxa、 Puma, Bmf) で ある。 BH3 only タンパク質は BH3 ドメインを介して Bel- 2サブファミリーおよび Bax サブファミ リーと結合しアポトーシスを促進する。 本発明で利用するアポト 一シス遺伝子 （Bim) は BH3 only タンパク質に属する。
本発明では特に好ましくは、 ヒト由来のアポトーシス誘導タンパク質（B i m) を対象とすることができる。 ヒ ト由来のアポトーシス誘導タンパク質 （B i m) のァミノ酸配列と塩基配列は公知であり、 その一例を配列表の配列番号 1から 4 に記載する。 Bimsの DNA塩基配列とアミノ酸配列を配列番号 1と 2に示し、 BimAD の DNA塩基配列とァミノ酸配列を配列番号 3と 4に示す。 本明細書で 「アポトーシス誘導タンパク質 （B i m) 又はアポトーシス誘導タ 遺伝子（B i m) j と言う場合、上記した天然に存在する野生型タンパク質や野生 型遺伝子のみならず、 アポトーシスを誘導する活性を有する限りは、 それらの変 異体又は相同体の全てを包含するものとする。
変異体タンパク質又は相同体タンパク質としては、 以下のものが挙げられる。
( a ) 野生型の B i mタンパク質のアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、 置換及ぴ Z又は付 (J口されたァミノ酸配列からなり、 かつアポトーシ スを誘導する活性を有するタンパク質；又は
( b ) 野生型の B i mタンパク質ののアミノ酸配列と 9 5 %以上の相同性を有す るァミノ酸配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質： 本明細書で言う 「アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置 換及ぴ 又は付加されたアミノ酸配列」 における 「1から数個」 の範囲は特には 限定されないが、 例えば、 1から 2 0個、 好ましくは 1から 1 0個、 より好まし くは 1から 7個、 さらに好ましくは 1から 5個、 特に好ましくは 1から 3個程度 を意味する。
本明細書で言う 「 9 5 %以上の相同性を有するァミノ酸配列とは」 とは、 アミ ノ酸の相同性が少なくとも 9 5 %以上であることを意味し、 相同性は好ましくは 9 6 %以上、 より好ましくは 9 7 %以上である。
本明細書で言う 「アポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質」 とは、 T G F— によるアポトーシス誘導を促進できる活性を有するタンパク質を意味す る。
あるタンパク質が T G F— によるアポトーシス誘導を促進できる活性を有す るか否かは、 例えば T G F— によってアポトーシスが誘導され得る細胞に、 上 記タンパク質をコードする D NAを導入して一過性に過剰発現させ、 該細胞に T G F— を添加してアポトーシスを誘導した際に当該 D NAの過剰発現が、 ァポ トーシスを誘導する細胞の数を増やすか否かを調べることにより検出することが できる。 また、 変異体遺伝子又は相同体遺伝子としては、 以下のものが挙げられる。
( a ) 野生型の B i m遺伝子の塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠失、 置換及び/又は付加された塩基配列からなり、 かつアポトーシスを誘導する活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子；又は
( b ) 野生型の B i m遺伝子の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリ ダイズする塩基配列からなり、 かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパ ク質をコードする遺伝子：
本明細書で言う 「塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠失、 置換及び Z 又は付加された塩基配列」 における 「1もしくは数個」 の範囲は特には限定され ないが、 例えば、 1から 60個、 好ましくは 1から 30個、 より好ましくは 1か ら 20個、 さらに好ましくは 1から 10個、 特に好ましくは 1から 5個程度を意 味する。
本明細書で言う 「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする」 とは、 通 常の条件下 （例えば D I G DNA L a b e l i n g k i t (ベーリンガー · マンハイム社製 C a t No. 1 1 75033) でプローブをラベルした場合に、 32°Cの D I G E a s y Hy b溶液（ベーリンガー'マンハイム社製 C a t N o. 1603558)中でハイプリダイズさせ、 50での0. 5 X S S C溶液（0. 1 % [w/v] SDSを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（1 330は0. 1 5M N a C 1 , 0. 01 5 M クェン酸ナトリウムである） でのサザンハイブ リダィゼーシヨンで、 B i m遺伝子にハイプリダイズする程度であればよい。 ハ イブリダイゼ一ンョンは、 Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. , 1989 (以下、 モレキ ユラ一クローニング第 2版と略言己)、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement：！〜 38, John Wiley & Sons (1987—1997) (以下、 カレント 'プロトコ ールズ 'イン 'モレキュラー ·バイオロジーと略す） 等に記載されている方法に 準じて行うことができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DN Aとしては、 プローブと して使用する DN Aの塩基配列と一定以上の相同性を有する DN Aが挙げられ、 例えば 80%以上、 好ましくは 85%以上、 より好ましくは 90%以上、 さらに 好ましくは 93%以上、 特に好ましくは 95%以上、 最も好ましくは 98%以上 の相同性を有する DN Aが挙げられる。
(2) 本発明で用いる遺伝子の取得
本発明で用いる B i m遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書の配列表 の配列番号 1〜4に記載した塩基配列おょぴァミノ酸配列の情報に基づいて適当 なブロープやプライマーを調製し、 それらを用いて、 ヒト cDNAライプラリー
(本発明の遺伝子が発現される適当な細胞より常法に従い調製したもの） から所 望クローンを選択することにより、 所望の遺伝子を単離することができる。
PCR法により本発明の遺伝子を取得することもできる。 例えば、 ヒト培養細 胞由来の染色体 DNAまたは cDNAライブラリーを鍚型として使用し、 所望の B i m遺伝子を増幅できるように設計した 1対のプライマーを使用して P C Rを 行う。
PCRの反応条件は適宜設定することができ、 例えば、 94°Cで 30秒間 （変 性）、 55°( で30秒〜1分間 （アニーリング）、 72 °Cで 2分間 （伸長） からな る反応工程を 1サイクルとして、 例えば 30サイクル行った後、 72°Cで 7分間 反応させる条件などを挙げることができる。 次いで、 増幅された DNA断片を、 大腸菌等の宿主で增幅可能な適切なベクター中にクローユングすることができる。 上記したブロープ又はプライマーの調製、 cDNAライブラリーの構築、 cD NAライブラリ一のスクリ一ユング、 並びに目的遺伝子のクローニングなどの操 作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローユング第 2版、カレント ' プロトコーノレズ 'イン .モレキュラー .バイオロジー等に記載された方法に準じ て行うことができる。
本明細書中上記した B i m遺伝子の塩基配列において 1もしくは数個の塩基が 欠失、 置換及び Z又は付加された塩基配列からなり、 かつアポトーシスを誘導す る活性を有するタンパク質をコードする遺伝子 （変異遺伝子） は、 化学合成、 遺 伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製するこ ともできる。 例えば、 B i m遺伝子の塩基配列を有する D N Aを利用し、 これら D N Aに変異を導入することにより変異 D N Aを取得することができる。 具体的 には、 B i m遺伝子の塩基配列を有する D N Aに対し、 変異原となる薬剤と接触 作用させる方法、 紫外線を照射する方法、 遺伝子工学的手法等を用いて行うこと ができる。 遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に 特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、 モレキユラ一クロー二 ング第 2版、 カレント ·プロトコ一/レズ ·イン ·モレキュラー ·バイオロジー等 に記載の方法に準じて行うことができる。
上述の通り、 B i m遺伝子の塩基配列において、 種々の人為的処理、 例えば部 位特異的変異導入、 変異剤処理によるランダム変異、 制限酵素切断による D NA 断片の変異 ·欠失 ·連結等により、 部分的に D N A配列が変化したものであって も、 これら D N A変異体がアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質をコ 一ドする D N Aであれば、 本発明で使用することができる。
本明細書中上記した、 B i m遺伝子の塩基配列とストリンジェン な条件下で ハイプリダイズする塩基配列からなり、 かつアポトーシスを誘導する活性を有す るタンパク質をコードする遺伝子は、 上述した条件下で、 一定のハイブリダィゼ ーション条件下でコ口-一 ·ハイブリダィゼーシヨン法、 プラークハイプリダイ ゼーション法、 あるいはサザンプロットハイプリダイゼーシヨン法などを行うこ とにより得ることができる。
( 3 ) アポトーシス誘導タンパク質 （B i m) に対する抗体を用いたアポトーシ ス抑制剤
本発明によれば、 アポトーシス誘導タンパク質 （B i m) に対する抗体を用い たアポトーシス抑制剤が提供される。 本発明の抗体としては、 上記のアポトーシ ス誘導タンパク質に特異的に結合できるものであれば、 ポリクローナル抗体また はモノクローナル抗体のいずれでもよい。
ポリクローナル抗体は、 抗原を免役した動物から得られる血清を分離、 精製す ることにより調製することができる。 モノクローナル抗体は、 抗原を免疫した動 物から得られる抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリ ドーマを作製 し、 該ハイプリ ドーマを培養するか、 動物に投与して該動物を腹水癌化させ、 上 記の培養液または腹水を分離、 精製することにより調製することができる。
抗原は、 各種ヒト培養細胞から本発明のタンパク質を精製するか、 配列番号 2 に記載のアミノ酸配列またはその変異配列またはそれらの一部を有するタンパク 質をコードする D NAを含む組換えベクターを大腸菌、 酵母、 動物細胞または昆 虫細胞などの宿主に導入して、該 D N Aを発現させて得られるタンパク質を分離、 精製することにより調製できる。 また、 抗原は、 配列番号 2に示されるアミノ酸 配列の部分配列を有するぺプチドをァミノ酸合成機を用いて合成することによつ て調製することもできる。
免疫方法としては、 抗原をゥサギ、 ャギ、 ラット、 マウスまたはハムスター等 などの非ヒト哺乳動物の皮下、静脈内または腹腔内にそのまま投与してもよレ、が、 抗原をスカシガイへモシァニン、 キーホールリンペッ トへモシァニン、 牛血清ァ ルブミン、 牛チログ口プリン等の抗原性の高いキャリアタンパク質と結合して投 与したり、フロインドの完全アジュパント （C o m p 1 e t e F r e u n d ' s A d j u v a n t ) ,水酸化アルミニウムゲル、百日晐菌ワクチン等の適当なアジ ュパントとともに投与することも好ましい。
抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜2週間おきに 3〜1 0回行うことができ る。 各投与後 3〜7日目に眼底静脈叢より採血し、 該血清が免疫に用いた抗原と 反応する力否かを酵素免疫測定法等に従レ、、抗体価を測定することにより調べる。 免疫に用いた抗原に対し、 その血清が十分な抗体価を示す非ヒト哺乳動物を、 血 清または抗体産生細胞の供給源として使用することができる。 ポリクローナル抗 体は、 上記の血清を分離、 精製することにより調製することができる。
モノクローナル抗体は、 該抗体産生細胞と非ヒト哺乳動物由来の骨髄腫細胞と を融合させてハイプリ ドーマを作製し、 該ハイプリ ド マを培養するか、 動物に 投与して該動物を腹水癌化させ、 該培養液または腹水を分離、 精製することによ り調製することができる。 抗体産生細胞としては、 脾細胞、 リンパ節、 末梢血中 の抗体産生細胞を使用することができ、 特に好ましくは脾細胞を使用することが できる。
骨髄腫細胞としては、 8—ァザグァニン耐性マウス （BALB/c由来） 骨髄 腫細胞株である P 3— X63Ag 8— Ul (P 3—U1) 株 [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1-7 (1978) ]、 P 3-NS 1/ \ -Ag 41 (N S— 1 ) 株 [European J. Immunology, 6, 511—519 (1976) ]、 S P 2/0-Ag 14 (S P_ 2)株 [Nature, 276， 269-270(1978)]、 P 3 -X 63 -Ag 8653 (6 53)株 [J. Immunology, 123, 1548—1550(1979)]、 P 3 -X 63 -Ag 8 (X 63) 株 [Nature, 256, 495-497 (1975) ] 等のマウス由来の株化細胞を用いることができ る。
ハイプリ ドーマ細胞は、 以下の方法により作製できる。 先ず、 抗体産生細胞と 骨髄腫細胞を混合し、 HAT培地 [正常培地にヒポキサンチン、 チミジンおょぴ アミノブテリンを加えた培地]に懸濁したのち、 7〜 14日間培養する。培養後、 培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などにより、 抗原に反応し、 抗原を含まな いタンパク質には反応しないものを選択する。 次いで、 限界希釈法によりクロー ニングを行い、 酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモ ノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマ細胞として選択する。 モノクローナル抗体 は、 ハイプリ ドーマ細胞を培養して得られる培養液、 またはハイプリ ドーマ細胞 を動物の腹腔内に投与して該動物を腹水癌化させて得られる腹水から分離、 精製 することにより調製できる。
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を分離、精製する方法としては、 遠心分離、 硫安沈殿、 力プリル酸沈殿、 または DEAE—セファロースカラム、 陰イオン交換カラム、 プロテイン A若しくは G—カラム、 若しくはゲル濾過カラ ム等を用いるクロマトグラフィー等による方法を、 単独または組み合わせて処理 する方法があげられる。
本明細書で抗体と言う場合、 全長の抗体だけではなく抗体の断片も包含するも のとする。抗体の断片とは、機能性の断片であることが好ましく、例えば、 F (a b，） 2、 F a b' などが挙げられる。 F (a b，） 2、 F a b' とは、 ィムノグロ ブリンを、 蛋白分解酵素 （例えば、 ペプシン又はパパイン等） で処理することに より製造されるもので、 ヒンジ領域中の 2本の H鎖間に存在するジスルフィド結 合の前後で消化されて生成される抗体断片である。
本発明の抗体をヒトに投与する目的で使用する場合は、 免疫原性を低下させる ために、 ヒト型化抗体あるいはヒト化抗体を用いることが好ましい。 これらのヒ ト型化抗体ゃヒト化抗体は、 トランスジエニックマウスなどの哺乳動物を用いて 作製することができる。 ヒト型化抗体については、 例えば、 Morrison, S. L. et al.
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984)〕、 野ロ浩 〔医学のあゆみ 16 7 : 457-462 (1993)〕 に記載されている。 ヒト化キメラ抗体は、 マウ ス抗体の V領域とヒト抗体の C領域を遺伝子組換えにより結合し、 作製すること ができる。 ヒト化抗体は、 マウスのモノクローナル抗体から相補性決定部位 （C DR) 以外の領域をヒト抗体由来の配列に置換することによって作製できる。 さらに、 上記のうち、 本発明で同定されたアポトーシス誘導タンパク質 （B i m) に特異的に結合してその機能を阻害できる抗体については、 アポトーシス抑 制剤として使用することができる。
本発明の抗体をアポトーシス抑制剤として医薬組成物の形態で使用する場合に は、 上記抗体を有効成分として使用し、 さらに薬学的に許容可能な担体、 希釈剤
(例えば、免疫原性アジュパントなど）、安定化剤または賦形剤などを用いて医薬 組成物を調製することができる。 本発明の抗体を含むアポトーシス抑制剤は、 濾 過滅菌および凍結乾燥し、 投薬バイアルまたは安定化水性調製物中に投薬形態に 製^ W化することができる。
患者への投与は、 たとえば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射などの当業者 に公知の方法により行うことができる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法 などにより変動するが、 当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能 である。 有効成分である抗体の投与量としては、 一般的には一回につき体重 1 k gあたり 0 . 1 μ g ~ l 0 O m g程度の範囲である。 本発明の抗体は、 アポトー シスを抑制することにより、 アポトーシス促進に関連する疾患に対する治療効果 を示す。
( 4 ) オリゴヌクレオチド及ぴアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明によって明らかにされた B i m遺伝子の塩基配列情報を基にすれば、 例 えば該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を有するプローブまたはプライマーを利 用することにより、 各種のヒト組織における B i m遺伝子の発現を検出すること ができる。 B i m遺伝子の発現の検出は、 ノザンブロットまたは R T— P C R等 の常法により行うことができる。 本発明で同定された B i m遺伝子は細胞のアポ トーシスの誘導に関与する遺伝子である。 後述する通り、 アポトーシスは種々の 疾患に関与しているため、 B i m遺伝子の発現を検出することによりアポトーシ ス関連疾患を診断することができる。
P C Rを行なう場合、 プライマーは、 B i m遺伝子のみを特異的に増幅できる ものであれば特に限定されず、 公知の B i m遺伝子の配列情報に基づき適宜設定 することができる。 例えば、 B i m遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも 1 0ヌクレオチドを含むォリゴヌクレオチド、 並びに該ォリゴヌクレオチドに相補 的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドをプローブまたはプライマー として使用することができる。 より具体的には、 配列番号 1に記載の塩基配列中 の連続した 1 0〜 6 0残基、 好ましくは 1 0〜 4 0残基の塩基配列を有するォリ ゴヌクレオチド、 並びに該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセ ンスオリゴヌクレオチドを使用することができる。
上記したオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 D NA 合成機を用いて常法により製造することができる。 該オリゴヌクレオチドまたは アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、 例えば、 検出したい mR NAの一部の 塩基配列において、 5' 末端側の塩基配列に相当するセンスプライマー、 3， 末 端側の塩基配列に相当するアンチセンスプライマー等を挙げることができる。 セ ンスプライマーおょぴアンチセンスプライマーとしては、それぞれの融解温度（ T m) ぉょぴ塩基数が極端に変わることのないオリゴヌクレオチドであって、 10 〜60塩基程度のものが挙げられる、 10〜40塩基程度のものが好ましい。 ま た、 本発明においては、 上記したオリゴヌクレオチドの誘導体を用いることも可 能であり、 例えば、 該ォリゴヌクレオチドのメチル体やフォスフォロチォエート 体等を用いることもできる。
さらに本発明では、 上記したアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入し て B i m遺伝子の転写や翻訳を抑制することにより細胞のアポトーシスを抑制す ることができる。 即ち、 本発明によれば、 B i m遺伝子の塩基配列中の連続する 少なくとも 10ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相捕的な配列を有する アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、 アポトーシス抑制剤が提供される。 アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への導入方法は、 組換えベクターの導 入方法と同様にして行うことができる。 また、 細胞のアポトーシス検出法として は特に限定されないが、 顕微鏡観察、 TUNE L法、 DNAラダー検出法、 DN Aの断片化率の定量、 細胞のサイズ分布測定等が挙げられる。
顕微鏡観察では、 アポトーシスに特徴的な細胞形態変化、 例えば核の濃縮、 ク ロマチンの凝縮、 細胞小器官の萎縮、 アポトーシス小体の形成、 細胞全体の収縮 等を観察する。 TUNE L法は、 アポトーシスによって生ずる DNAの切断末端 を t e rm i n a l d e o xynu c 1 e o t i dy l t r a n s f e r a s e (T dT) を用いてビォチンゃジゴキシゲニンで標識することにより検出する 方法である。 DNAラダー検出法は、 アポトーシスによっておこるクロマチン D NAの断片化を、 細胞から DNAを抽出し、 ァガロースゲル電気泳動をすること により検出する方法で、 断片化した DNAがラダー （はしご） 状に検出される。 DNAの断片化率の定量は、 断片化した低分子 DNAのみを抽出し、 ジフエニル アミンを用いて DN Aの定量を行う方法である。 細胞サイズ分布測定は、 アポト 一シスにより細胞の収縮や断片化がおこり小さなサイズの細胞が増加するのを、 コー,レター ·マノレチサィザー（Co u l t e r mu l t i s i z e r)等の粒子 サイズ測定装置を利用して測定する方法である。 これらの方法により、 細胞がァ ポトーシスをおこしているかどうかを検出することができる。
上記した本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、 B im遺伝子の 転写おょぴ Zまたは翻訳を抑制してアポトーシスを抑制することにより、 アポト 一シスの促進が病態に関与している疾患 （例えば、 アルツハイマー病などの神経 変性疾患など） を治療することができる。 例えば、 アンチセンスオリゴヌクレオ チドは、 細胞への取り込みを助けるために使用される、 細胞膜との親和性の高い 適当な担体 （例えばリボソームやコレステロール等） と一緒に患者の患部又は全 身に注射などにより投与し、 患者の細胞に取り込ませてアポトーシスを抑制する ことにより、 上記疾患を治療することができる。 有効成分であるアンチセンスォ リゴヌクレオチドの投与量としては、一般的には一回につき体重 1 k gあたり 0. 1 μ g〜l 0 Omg程度の範囲である。
(5) RNA iによるアポトーシス抑制
さらに本発明では、 上記 （4) に記載したアンチセンスオリゴヌクレオチドを 使用する代わりに RNA iを利用してアポトーシスを抑制することも可能である。
RNA i (RNAinterference) とは、 ある標的遺伝子の一部をコードする m RNAの一部を二本鎖にした RNA (double strandedRNA： d s RNA) を細 胞へ導入すると、 標的遺伝子の発現が抑制される現象を言う。
即ち、 本発明によれば、 本発明のアポトーシス誘導遺伝子 （B im遺伝子） の 塩基配列から転写される RNAの塩基配列中の連続する少なくとも 10ヌクレオ チドを含む二本鎖 RNA、 またはそれをコードする DNAが提供される。 二本鎖 RNAをコードする DNAとしては、 例えば、 アポトーシス誘導遺伝子 （B im 遺伝子） またはその部分配列の逆向き反復配列を有する D N Aを挙げることがで きる。 このような逆向き反復配列を有する DN Aを哺乳動物の細胞に導入することに より、 細胞内で標的遺伝子の逆向き反復配列を発現させることができ、 これによ り RNA i効果により標的遺伝子 （B i m遺伝子） の発現を抑制することが可能 になる。
本発明の RN A i試薬の具体例としては、配列番号 6及び配列番号 7を有する R NA i試薬、 特には、 （配列番号 6) — （リンカ一配列） 一 （配列番号 7) からな る RN A i試薬が挙げられる。
逆向き反復配列とは、 標的遺伝子並びにその逆向きの配列が適当な配列を介し て並列している配列を言う。 具体的には、 標的遺伝子が、 以下に示す n個の塩基 配列から成る 2本鎖を有する場合、
J. ι_Α- ― 3
3 ' -ΥΧΥ2 Υη一 Α—δ'
その逆向き配列は以下の配列を有する。
5， ~ΥηΥη -! Υ2Υ「3，
n — i ι―
(ここで、 Xで表される塩基と Yで表される塩基において、 添え字の数字が同じ ものは互いに相補的な塩基である）
逆向き反復配列は上記 2種の配列が適当な配列を介した配列である。 逆向き反 復配列としては、 標的遺伝子の配列が逆向き配列の上流にある場合と、 逆向き配 列が標的遺伝子の配列の上流にある場合の 2つの場合が考えられる。 本発明で用 いる逆向き反復配列は上記の何れでもよいが、 好ましくは、 逆向き配列が標的遺 伝子の配列の上流に存在する。
標的遺伝子の配列とその逆向き配列の間に存在する配列は、 R Ν Αに転写され た際にヘアピンループを形成する領域である。 この領域の長さは、 ヘアピンルー プを形成できる限り特には限定されないが、 一般的には、 O b pから 700 b p であり、 好ましくは 0〜 300 b p程度、 より好ましくは 0〜100 b p程度で ある。 この配列の中には制限酵素部位が存在していてもよい。 本発明では、 哺乳動物で作動可能なプロモーター配列の下流に標的遺伝子の逆 向き反復配列を組み込むことにより、 哺乳動物の細胞内において標的遺伝子の逆 向き反復配列を発現させることができる。 本発明で用いるプロモーター配列は、 哺乳動物で作動可能であれば特に限定されない。
さらに本発明によれば、 上記した二本鎖 RNAまたは DNAを含むアポトーシ ス抑制剤が提供される。 上記した二本鎖 RNAまたは DNAを用いて、 B im遺 伝子の転写および Zまたは翻訳を抑制してアポトーシスを抑制することにより、 アポトーシスの促進が病態に関与している疾患 （例えば、 アルツハイマー病など の神経変性疾患） を治療することができる。 例えば、 上記した二本鎖 RNAまた は DNAは、 細胞への取り込みを助けるために使用される、 細胞膜との親和性の 高い適当な担体 （例えばリボソームやコレステロール等） と一緒に患者の患部又 は全身に注射などにより投与し、 患者の細胞に取り込ませてアポトーシスを抑制 することにより、 上記疾患を治療することができる。 有効成分である二本鎖 RN Aまたは DNAの投与量としては、 一般的には一回につき体重 1 k gあたり 0. 1 μ g〜l Omg程度の範囲である。
(6) 本発明のアポトーシス誘導タンパク質を利用したアポトーシスの制御 本明細書中の （3) アポトーシス誘導タンパク質 （B i m) に対する抗体を用 いたアポトーシス抑制剤、 （4)オリゴヌクレオチド及ぴアンチセンスオリゴヌク レオチド、 及び （5) RNA iによるアポトーシス抑制、 に記載した通り、 本発 明のアポトーシス誘導タンパク質 （B im) の発現おょぴノ又は機能を阻害する ことにより、 アポトーシスを抑制することが可能である。 このように本発明のァ ポトーシス誘導タンパク質の発現および 又は機能を阻害することによりアポト 一シスを抑制する方法は全て本発明の範囲内のものである。
アポトーシスを抑制する方法の具体例としては、 アポトーシスの促進を伴う疾 病の治療の他、 アポトーシスによる細胞死を抑制する方法を挙げることができ、 例えば、 以下の （a) 有用タンパク質の生産、 及び （b) 移植細胞 ·移植臓器に 記載の利用例などが挙げられる。
( a ) 有用タンパク質の生産
抗体産生細胞株 （ハイプリ ドーマ） やウィルスベクター産生細胞株などの有用 タンパク質を生産する細胞株は、 長期間培養している間に生産されるタンパク質 の細胞障害性により細胞死を引き起こす場合がある。 また、 これらの細胞株では 培養液中の血清を取り除くことでタンパク質の生産をより効率的に行うことが可 能であるが、 血清非存在下では細胞死を誘導してしまうという問題がある。 この ような細胞死の多くはアポトーシスによるものであることが知られている。 従つ て、 本発明の手法によりアポトーシスを抑制することにより、 有用タンパク質の 生産効率を上昇させることが可能になる。
( b ) 移植細胞 .移植臓器
パーキンソン病の治療の際、 死亡胎児の神経細胞やドーパミン生産細胞を患者 の脳内に移植する手法が用いられている。 また輸血や骨髄移植、 遺伝子治療にお ける e X V i V o法など自家若しくは他者の細胞を患者に導入する細胞移植療 法も行われている。 移植細胞は、 一般的にアポトーシスなどによる細胞死を起こ し、 長期維持が困難である。 従って、 本発明の手法によりアポトーシスを抑制す ることにより、 臓器移植や細胞移植療法において効果をあげることができる。
, さらに、 本発明のアポトーシス誘導タンパク質の発現おょぴ Z又は機能を阻害 する物質を含むアポトーシス抑制剤も本発明の範囲内である。 本発明のアポトー シス誘導タンパク質の発現および/又は機能を阻害する物質の具体例としては、 本明細書中上記 （4 ) に記載の抗体、 （5 ) に記載のアンチセンスオリゴヌクレオ チド、 及ぴ （6 ) に記載の二本鎖 R N Aまたはそれをコードする D N Aなどが挙 げられるが、 これらに限定されるものではない。
さらに上記とは反対に、 アポトーシス誘導タンパク質 （B i m) の発現および /又は機能を増大することによってアポトーシスを促進する方法も本発明の範囲 内であり、 同様にアポトーシス誘導タンパク質 （B i m) の発現および Z又は機 能を増大する物質を含むアポトーシス促進剤も本発明の範囲内である。 アポトーシス誘導タンパク質 （B i m) の発現および Z又は機能を増大する方 法としては、 B i mをコードする遺伝子を細胞に導入する方法、 該遺伝子のプロ モーター領域に作用してその発現を増大する因子またはそれをコ一ドする遺伝子 を細胞に導入する方法などが挙げられる。
また、 アポトーシスの抑制または促進の有無並びにその程度は、 本明細書中上 記した顕微鏡観察、 TUNE L法、 DNAラダー検出法、 DNAの断片化率の定 量、 細胞のサイズ分布測定などの手法により検出することができる。
(7) アポトーシス調節物質のスクリーニング方法
本発明により同定されたアポトーシス誘導タンパク質 （B im) の発現および 又は機能の変化を指標とすることにより、 アポトーシスを抑制又は促進する物 質をスクリーニングすることができる。 スクリーニングの一例としては、 B im をコードする遺伝子を有する細胞を TGF_j3と一緒に、 被験物質の存在下およ ぴ非存在下において培養し、 被験物質の有無に応じた当該 B imの発現おょぴ Z 又は機能の変化を指標として、 アポトーシスを抑制又は促進する物質をスクリー ユングすることができる。
アポトーシス誘導タンパク質の： mRNAレベルでの発現量の測定は、 ノザンブ ロットまたは RT— PCR等の常法により行うことができ、 またタンパク質レべ ルでの発現量の測定は、 本明細書中上記 （3) 記載の抗体を用いたウェスタンブ ロット又は EL I S A等の通常の免疫分析により行なうことができる。 具体的に は、 モレキュラークローユング第 2版又は力レント · プロ トコールズ 'イン .モ レキユラ一 ·バイオロジー等に記載された当業者に公知の常法により行うことが できる。
また、 アポトーシス誘導タンパク質の機能の変化の分析は、 アポトーシス誘導 が抑制または促進の有無または程度を測定することにより分析することができる。 アポトーシス誘導の上記測定については、 本明細書中上記した顕微鏡観察、 TU NEL法、 DNAラダー検出法、 DNAの断片化率の定量、 細胞のサイズ分布測 定等により行なうことができる。
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質としては任意の物質を使用す ることができる。 被験物質の種類は特に限定されず、 個々の低分子合成化合物で もよいし、 天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、 合成ペプチドでもよい。 あるいは、 被験化合物はまた、 化合物ライブラリー、 ファージディスプレーライ ブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。 被験物質は、 好まし くは低分子化合物であり、 低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。 化合 物ライブラリ一の構築は当業者に公知であり、 また市販の化合物ライブラリ一を 使用することもできる。
アポトーシスは、 正常な生理学的過程以外にも、 癌、 自己免疫疾患 （例えば、 全身性エリテマトーデス、慢性関節リゥマチ、多発性硬化症等など）、神経変性疾 患等の重篤な疾患の発症にも関与していることが知られている。 例えば、 癌細胞 の悪性化は、 癌細胞におけるアポトーシスの過程が阻害され、 本来死滅するべき 細胞が増殖し続けることによって引き起こされると考えられている（Harris, C. C. , (1996) J. Natl. Cancer Instit. , 88, 1442-1445)。 また、 自己免疫疾患は、 本 来、 発生過程でアポトーシスによって除去されるはずの自己の抗原に対して反応 する免疫細胞が、 アポトーシス制御の異常により除去されなくなったことが原因 で発症する (Rieux-Laucat, F. et al. , (1995) Science, 268, 1347-1349)。 神経 変性疾患 （例えば、 アルツハイマー病、 パーキンソン病、 筋萎縮性側索硬化症、 ハンチントン舞踏病など） は、 アポトーシスの異常な亢進が原因と考えられてい る （Wolozin, B. , et al. , (1996) Science, 274, 1710 - 1713)。
従って、 上記した本発明のアポトーシス抑制物質は、 特に神経変性疾患の治療 剤として有効であると考えられる。 また、 アポトーシス促進物質は、 特に各種の 癌の治療ゃリゥマチなどの自己免疫疾患の治療剤として有効であると考えられる。 上記の本発明によるアポトーシス抑制物質及びアポトーシス促進物質を有効成 分として含むアポトーシスが関与する疾患の治療薬は、 経口または非経口的に全 身又は局所的に投与することができる。 非経口的な投与方法としては、 点滴など の静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射などを挙げることができる。 患者の年齢、 症状により適宜投与方法を選択することができる。 その投与量は、 年齢、 投与経路、 投与回数により異なり、 当業者であれば適宜選択できる。
非経口投与に適した製剤形態として、 例えば安定剤、 緩衝剤、 保存剤、 等張化 剤等の添加剤を含有したものは挙げられ、 さらに薬学的に許容される担体や添加 物を含むものでもよい。 このような担体及び添加物の例として、 水、 有機溶剤、 高分子化合物 （コラーゲン、 ポリビュルアルコールなど）、 ステアリン酸、 ヒト血 清アルブミン （H S A)、 マンニトール、 ツルビトール、 ラクトース、 界面活生剤 などが挙げられるが、 これらに限定されるものではない。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によ つて限定されるものではない。 実施例
実施例 1 ： TGF - /3標的遺伝子のスクリーニング
2 X 106の A549細胞に 10 mlの Opti MEM培地 （0. 02%FBS) を加え、 24時間後、 1 ng/mlになるように TGF- β 1 (R&D) を加え 1時間放置した。 Total RNAの回収に は RNeasy Mini kit (QIAGEN) を用い、 poly (A) +R A の調製には Oligotex- dT30 (super) (JRS) を使用した。 その後、 TGF- /3 1 を 1時間処理した A549 細胞の Poly (A) +R Aから作成した cDNAから、 TGF- ]3 1 を処理していない A549細胞の Poly (A) +R Aから作成した cDNAを差し引くことによりサブトラクシヨンを行つ た。 サブ トラクシヨ ンは CL0NTECH PCR- Select™ cDNA Subtraction Kit (CL0NTECH) のプロトコールに従って行つた。サブトラクシヨンにより得られたラ イブラリーを PCRし、 マイクロアレイを作成した。 マイクロアレイには、 プロ一 プとして、 TGF- j3 1を 1時間処理した A549細胞から回収した Poly (A) +RNAを Cy5 でラベルした cDNAと TGF - i3 1を処理していない A549細胞から回収した Poly (A) +R Aを Cy3でラベルした cDNAを使用し、 1つのマイクロアレイに対して両プロ ープをハイプリダイゼーションすることで発現の変化する遺伝子を解析した。 そ の結果、 TGF- ]3 1により発現量に有意な差を示す新規遺伝子として、 Bimを同定し た。 実施例 2 ： TGF- j3 1による Bimの発現誘導
Bimが TGF- β処理により発現誘導されることを確認するために Bimの 0RF (配 列表の配列番号 3に示す BimADの O R F)の領域をプローブとしてノーザンハイブ リダイゼーシヨンを行った。 R A回収のために、 A549細胞は Opti MEM培地、 HaCaT 細胞と Hep3B細胞と HUH7細胞は DMEM培地で培養した。 2 X 106の細胞に 10 mlの 適当な培地 （0. 02 % FBS) を加え、 24時間後、 1 ng/mlになるように TGF- 1 (R&D) を加え 1時間放置した。 Total RNAの回収には RNeasy Mini kit (QIAGEN) を用い、 poly (A) +RNAの調製には Oligotex- dT30 (super) (JRS)を使用した。 ノーザンハイ ブリダイゼーシヨンには、 TGF- i3 1を 1時間処理した細胞と未処理の細胞から回 収した Poly (A) +RNA 2 を使用し、 Bimの 0RFの領域をプローブとした。 G3PDH はローデイングコントロールとして、 PAI- 1は TGF- ]3 1応答のポジティブコント ロールとして使用した。
結果を図 1に示す。 図 1の結果から、 全ての細胞で TGF- ;3 1によって Bimの発 現が誘導されることが示された。 実施例 3 ： Bimのレポーターコンストラクシヨン
Bimの 0RFを NCBIの BLASTNの httgで検索し、 BACクローン RP11- 438K19を選 択した。 RP11- 438K19が NCBIの human genomeの DNA塩基配列と比較して異常が ないことを確認し、 Bimの 0RFより 5. 7kb上流までの DNA断片 （塩基配列を配列 表の配列番号 5に示す） を pGL3 promoter vector (Promega) に導入したレポ一 ターを作成した。 図 3に Bimのレポーターコンストラクションの概要を示す。 実施例 4 ： Bimのレポーターコンストラクションに対する Smadの効果
Bim のレポーターコンストラクションを 1 X 105の Hep3B細胞に Effectene™ Transfection Reagent (QIAGEN) を使用して遺伝子導入した。 コント口一ルには pGL3 basic vector, ポジティブコントロールには 3TPLux、 インターナルコント ロールには pRLTKを使用した。 遺伝子導入には、 1 wellにっきレポーターを 0· 1 g、発現ベクターを 0. 1 g、ィンターナルコントロ ^"ルを 0. 001 μ g使用した。 レポーターを導入して 18時間後、 10 ng/mlになるように TGF- ΐ (R&D) を加え、 24 時間放置した。 ルシフェラーゼの測定は Dual -Luciferase Repoter Assay system (Promega) を使用した。ルシフェラーゼアツセィを行った。 結果を図 2に 示す。 図 2の結果から、 Bimは Smad3と Smad4依存的に転写が活性化することが 示唆された。 実施例 5 ： TGF- /3 1によって誘導されるアポトーシスに対する Bimの欠失変異体 の効果
(l)Bimの欠失変異体の構築
欠失変異体は BimAD の cDNAをテンプレートとして PCRにより作成した。
BMprimer 1 5， -ATATGAATTCATGGCAAAGCAACCTTCTG-3 ' (配列番号 8 ) BMprimer 2 5， -ATATGAATTCGGGGCCCCTACCTCCCTACA-3' (配列番号 9 ) BMprimer 3 5 ' -ATATGMTTCATGCGCCCAGAGATATGGA-3 ' (配列番号 1 0 ) BMprimer 4 5 ' -ATATGAATTCTTGCGGCGTATCGGAGACG-3 ' (配列番号 1 1 ) BMprimer 5 5 ' -ATATCTCGAGGTTAAACTCGTCTCCGATAC-3 ' (配列番号 1 2 ) BMprimer 6 5 ' -ATATCTCGAGTCAATGCATTCTCCACACCAG-3 ' (配列番号 1 3 )
Bims AN30 ： Bimsのアミノ酸配列中の 31番目から 76番目までのアミノ酸配列の
C末に Leu Gly Lysが付加したアミノ酸配列
Bims AN51 ： Bimsのアミノ酸配列中の 52番目から 76番目までのアミノ酸配列の C末に Leu Gly Lysが付加したァミノ酸配列
Bims AN61 ： Bimsのアミノ酸配列中の 62番自から 76番目までのアミノ酸配列の C末に Leu Gly Lysが付加したァミノ酸配列
Bims A C70 ： Bimsのアミノ酸配列中の 1番目から 70番目までのアミノ酸配列 BH3 ： Bimsのァミノ酸配列中の 62番目から 70番目までのァミノ酸配列
(2) TGF- /31によって誘導されるアポトーシスに対する Bimの欠失変異体の効果 LacZ発現 plasmidとともに上記（1)で構築したそれぞれの Bim欠失変異体を 1 X104の Hep3B細胞に Effectene™ Transfection Reagent (QIAGEN) を使用して 遺伝子導入を行つた。遺伝子導入には、発現べクターを 0.1 μ g、 LacZ発現 plasmid を 0.025 使用した。 遺伝子導入して 18時間後、 DMEM培地 （0 % FBS) に交換 し、 5 ng/mlになるように TGF- ]31を加え 24時間培養した。 TGF- β 1を処理して 24時間後、 1% グルタルアルデヒドで固定し、 X - gal染色した。 本研究では well 上の全ての青色に染色された細胞をカウントし、 青色に染色された細胞を生存し た細胞とした。 結果を図 4に示す。 図 4の結果から、 TGF- 31 によって誘導され るアポトーシスは Bims Δ N51の遺伝子導入によつて抑制されることが示された。 実施例 6 ： Bimによって誘導されるアポトーシスに対する Bimのドミナントネガ ティブ変異体の効果
0.025 μ gの LacZ発現 plasmidとともに 0· 05 μ gの Bim発現 plasmidと 0.01 μ g、 0.025jug、 O.OS/zg 0. l zgの BimsAN51発現 plasmidを 1X104の Hep3B細胞に Effectene™ Transfection Reagent (QIAGEN) を使用して遺伝子導入を行った。 遺伝子導入して 24時間後、 1 % ダルタルアルデヒドで固定し、 X_gal染色した。 結果を図 5に示す。図 5の結果から、 Bimによつて誘導されるアポトーシスは Bims ΔΝ51 dose dependentに抑制され、 BimsAN51は Bimのドミナントネガティブ変 異体であることが示唆された。 実施例 7 ： TGF- β 1によって誘導されるアポトーシスに対する Bimのドミナント ネガティブ変異体の効果
0.025 /zgの LacZ発現 vectorとともに 0.01jug、 0.025 ^gN 0.05 ^g, 0.1 μ g の BimsAN51発現 vector を 1X104の Hep3B細胞に Effectene™ Transfection Reagent (QIAGEN) を使用して遺伝子導入を行った。 遺伝子導入して 18時間後、 DMEM培地 （0 % FBS) に交換し、 5 ng/mlになるように TGF- ;3 1を加え 24時間培 養した。 TGF- ΐを処理して 24時間後、 1 % ダルタルアルデヒドで固定し、 X- gal 染色した。 結果を図 6に示す。 図 6の結果から、 TGF /3 1 によって誘導されるァ ポトーシスは Bims A N51 dose dependentに抑制され、 Bimは TGF- 1によって誘 導されるアポトーシスに対し重要な働きをしていることが示唆された。 実施例 8 ： Bimの RNAiを発現する vectorの構築
Bimの RNAiを発現する vectorは、 Bimsの 92番目から 123番目の DNA塩基配列 をもとに合成ォリゴ （Bim RNAi F1と Bim RNAi Rl) を作成した。 アニーリングに は、 48 μ ΐ O annealing buffer [100 mM potassium acetate, 30 mM HEPES-K0H
(pH7. 4)、 2 mM Mg acetate] に、 1 μ 1の Bim RNAi Fl (100 pmol) と 1 μ 1の Bim RNAi Rl (100 pmol) を加え、 95°Cで 4分、 70°Cで 10分処理した後、 室温で 30 分放置した。 その後、 ァニーリングした合成オリゴを pSHAGの e RI- aa HIサ ィトに揷入した （pSHAG- BimRNAi)。 図 7に、 Bimの RNAiを発現する vectorの構 築の概要を示す。
合成オリゴ
Bim RNAi Fl
5 -tggctctgtctgtagggaggtaggggccgaagcttgggcccctacctccctacagacagagccacaat ttttt -3， (配列番号 1 4 )
Bim RNAi Rl
5 ' -gatcaaaaaattgtggctctgtctgtagggaggtaggggcccaagcttcggcccctacctccctacag acagagccacg - 3， (酉己歹 lj番号 1 5 ) 実施例 9 ： Bimによって誘導されるアポトーシスに対する Bim RNAiの効果
0. 025 gの LacZ発現 plasmidとともに 0. 05 gの Bim発現 plasmidと 0. 01 μ g、 0. 025 μ g、0. 05 μ g、0. 1 μ gの pSHAG- BimRNAiを 1 X 104の Hep3B細胞に Effectene™ Transfection Reagent (QIAGEN) を使用して遺伝子導入を行つた。遺伝子導入し て 24時間後、 1 % グルタルアルデヒドで固定し、 X- gal染色した。 結果を図 8に 示す。図 8の結果から分かるように、 Bimによつて誘導されるアポトーシスは Bim の R Aiによつて抑制された。 · 実施例 1 0 ： TGF- ]3 1によって誘導されるアポトーシスに対する Bim RNAiの効果 0. 025 μ gの LacZ発現 plasmidとともに 0. 1 μ gの pSHAG— BimRNAiを 1 X 104の Hep3B細胞に Effectene™ Transfection Reagent (QIAGEN) を使用して遺伝子導 入を行った。 遺伝子導入して 18時間後、 DMEM培地 （0 % FBS) に交換し、 5 ng/ml になるように TGF- 1を加え 24時間培養した。 TGF - j3 1を処理して 24時間後、 1 % ダルタルアルデヒドで固定し、 X- gal 染色した。 結果を図 9に示す。 図 9の結果 から、 TGF- ]3 1によって誘導されるアポトーシスは Bimの RNAiによって抑制され、 Bimは TGF- ]3 1によって誘導されるアポトーシスに対し重要な働きをしているこ とが示唆された。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 新規なアポトーシス誘導遺伝子が同定された。 本発明の遺伝 子を利用することにより、 本遺伝子の各組織での発現を検出したり、 アポトーシ ス誘導タンパク質を遺伝子工学的に製造することができる。 さらに、 本発明の遺 伝子を利用することにより、 アポトーシス関連疾患の診断及ぴアポトーシス抑制 剤または促進剤をスクリーニングすることができる。 更に、 本発明の遺伝子は、 ァポトーシス抑制を目的とする遺伝子治療ゃァンチセンスオリゴヌクレオチドを 用いた疾患の予防法及び治療法の開発に極めて有用である。

Claims

請求の範囲
1. アポトーシス誘導タンパク質 B i mの発現およぴ/ /又は機能を調節する ことを含む、 TGF i3由来のアポトーシスを調節する方法。
2. アポトーシス誘導タンパク質 B i mの発現およびノ又は機能を阻害する ことを含む、 アポトーシスを抑制する方法。
3. アポトーシス誘導タンパク質 B i mの発現および/又は機能を阻害する 物質を含む、 アポトーシス抑制剤。
4. アポトーシス誘導タンパク質 B i mの発現おょぴ Z又は機能を増大する ことを含む、 アポトーシスを促進する方法。
5. アポトーシス誘導タンパク質 B i mの発現および/又は機能を増大する 物質を含む、 アポトーシス促進剤。
6. アポトーシス誘導遺伝子 B i mの塩基配列中の連続する少なくとも 10 ヌクレオチドを含むォリゴヌクレオチド、 又は該ォリゴヌクレオチドに相補的な 配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、 アポトーシス診断薬。
7. アポトーシス誘導遺伝子 B i mの塩基配列中の連続する少なくとも 10 ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相捕的な配列を有するアンチセンスォ リゴヌクレオチドを含む、 アポトーシス抑制剤。
8. アポトーシス誘導遺伝子 B i mの塩基配列から転写される RNAの塩基 配列中の連続する少なくとも 10ヌクレオチドを含む二本鎖 RNA、 またはそれ をコードする DNAを含む、 アポトーシス抑制剤。
9. アポトーシス誘導タンパク質 B i mの発現および/又は機能の変化を指 標として、 アポトーシスを抑制又は促進する物質をスクリーニングする方法。
10. アポトーシス誘導タンパク質 B imをコードする遺伝子を有する細胞 を TGF_i3とー緒に、 被験物質の存在下および非存在下において培養し、 被験 物質の有無に応じた当該アポトーシス誘導タンパク質 B i mの発現おょぴ Z又は 機能の変化を指標として、 アポトーシスを抑制又は促進する物質をスクリーニン グする、 請求項 9に記載の方法。
1 1 . 配列番号 6及び配列番号 7を有する R N A i試薬。
1 2 . (配列番号 6 ) — （リンカ一配列） 一 （配列番号 7 ) からなる R N A
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