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WO2004093899A1 - Produit immunomodulateur obtenu a partir d'une culture de bifidobacterium et compositions le contenant - Google Patents

Produit immunomodulateur obtenu a partir d'une culture de bifidobacterium et compositions le contenant Download PDF

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Publication number
WO2004093899A1
WO2004093899A1 PCT/FR2004/000875 FR2004000875W WO2004093899A1 WO 2004093899 A1 WO2004093899 A1 WO 2004093899A1 FR 2004000875 W FR2004000875 W FR 2004000875W WO 2004093899 A1 WO2004093899 A1 WO 2004093899A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
product according
aqueous substrate
immunomodulatory
immunomodulatory product
bifidobacterium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2004/000875
Other languages
English (en)
Inventor
Valérie PETAY
Francis Lecroix
Emmanuel Perrin
Charles Gontier
Jean-Pierre Blareau
Marie-Bénédicte ROMOND
Elisabeth Singer
Marie-Françoise ODOU
Catherine Demailly-Mullie
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gervais Danone SA
Original Assignee
Gervais Danone SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gervais Danone SA filed Critical Gervais Danone SA
Priority to EP04742462A priority Critical patent/EP1615657A1/fr
Publication of WO2004093899A1 publication Critical patent/WO2004093899A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/19—Dairy proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Definitions

  • the present invention relates to an immunomodulatory product obtained from a culture of Bifidobacterium, to its use, in particular as a medicament or food ingredient, as well as to pharmaceutical or food compositions containing it.
  • the genus Bifidobacterium belongs to the family of Actinomycetaceae; it combines bacilli with Qram positive, strict anaerobes, fermenting glucose by the way of fructose 6-phosphate phosphoketolase. Their optimal growth pH is between 6 and 7, and their optimal growth temperature is between 37 and 46 ° C.
  • Bifidobacteria are part of the normal human intestinal flora, and are known to have many beneficial health effects. It is known in particular that breastfed infants, who have an intestinal flora in which bifidobacteria predominate, are more resistant to infections and in particular have a lower risk of diarrhea than infants fed with conventional industrial milk preparations.
  • the preparation process described in this international application does not make it possible to prepare food products other than milk products and requires implementation conditions which are restrictive from an industrial point of view, in particular the maintenance of aerobic culture conditions, maintaining the culture medium at an osmotic pressure corresponding to 0.93 to 0.97 of water activity (AW), and / or maintaining the culture medium at a temperature between 40 and 48 ° C.
  • AW water activity
  • Clostridium perfringens is an anaerobic, Gram-positive, spore-forming bacterium which is very widespread in the environment (soil, water, air, dust) but is also common in humans and animals (flora of the intestine, vagina, upper airways ).
  • the bacteria Clostridium perfringens are responsible for the release of toxins and enzymes in the digestive tract which cause tissue damage. The production of these different toxins is associated with sporulation. Spores persist in soil, sediments and surfaces exposed to human and animal faecal pollution and their presence in water is a criterion for faecal contamination.
  • Clostridium perfringens is responsible for gas gangrene, food poisoning and necrotizing enteritis.
  • Clostridium perfringens remains the main agent of gas gangrene. It is generally post-traumatic (following accidents) but can also be post-operative (especially in visceral septic surgery), purely medical (following a muscular injection) or even spontaneous (on colon cancer). Gas gangrene is fatal in 25 to 60% of cases.
  • Clostridium perfringens is involved in 10 to 15% of food poisoning. Contamination occurs through ingestion of foods such as meat, milk, fruits and vegetables which are frequently contaminated with this bacteria. Once ingested, if the conditions are appropriate, the body produces toxins in the gastrointestinal tract and cause symptoms which are characterized, for the common form of infection, by intense intestinal cramps, acute abdominal pain, diarrhea, nausea, vomiting, and fever. Clostridium perfringens is also responsible for a severe digestive condition called necrotizing enteritis, especially in young children or newborns. In the absence of appropriate treatment, it is followed by peritonitis or shock which is often fatal, death resulting from infection and necrosis of the intestine and resulting septicemia. It may therefore be advantageous to be able to have an immunomodulatory product making it possible to control the proliferation of Clostridium perfringens.
  • the inventors have also set themselves the goal of providing a food or pharmaceutical composition having a regulatory effect on the intestinal microflora, in particular at the expense of the development of pathogenic bacterial species, in particular Clostridium perfringens.
  • the present invention therefore has for first object an immunomodulatory product characterized in that it is obtained according to a preparation process comprising the following steps: - seeding and incubation, under aerobic or anaerobic conditions, preferably anaerobic, and at a temperature of between 30 and 40 ° C, of Bifidobacterium comprising at least the brief Bifidobacterium strain 1-2219 in an aqueous substrate having a pH of between 6 and 8 approximately, and comprising at least the following ingredients: i) permeate whey, ii) a whey protein hydrolyzate, iii) lactose,
  • the filtered fraction obtained by implementing the process in accordance with the invention has immunomodulatory properties; it makes it possible in particular to stimulate the proliferation of Bifidobacterium and to decrease the population of Clostridium perfringens within the intestinal flora.
  • the whey permeate used in the composition of the aqueous substrate may be in the form of a powder, obtained by ultrafiltration of whey, after drying (by spray or by any other drying technique), of the fraction liquid, demineralized or not, which crosses the membrane during the ultrafiltration of the whey.
  • whey protein hydrolysates which can be used in the context of the present invention can be obtained by the methods usually used for the preparation of protein hydrolysates, in particular by enzymatic hydrolysis of whey proteins using proteases such as trypsin, chymotrypsin, etc.
  • proteases such as trypsin, chymotrypsin, etc.
  • Many concentrates or isolates of serum proteins as well as hydrolysates of whey proteins, suitable for the implementation of the invention are known in themselves and available commercially.
  • the aqueous substrate is preferably filtered on membranes, such as for example on polyethersulfone membranes, having a cut-off threshold of between 100 and 300 kDa, then the autoclave permeate at a temperature of approximately 120 ° C. for approximately 30 minutes in order to avoid any undesirable bacterial contamination of the culture medium.
  • membranes such as for example on polyethersulfone membranes, having a cut-off threshold of between 100 and 300 kDa
  • the pH of the aqueous substrate can be adjusted to the desired value using any basifying agent conventionally used by those skilled in the art such as, for example, soda or potash.
  • the Bifidobacterium are preferably sown in the aqueous substrate at a rate of 1.10 4 to 4.10 9 colony forming units (CFU) per ml of substrate.
  • This seeding can be carried out for example by adding to the aqueous substrate, in suitable proportions, a frozen concentrate of Bifidobacterium, or a preculture on medium allowing the growth of bifidobacteria.
  • the pH of the aqueous substrate is maintained at a value between approximately 6 and 8 throughout the incubation period, and even more preferably between 6.5 and 7.5. Maintaining the pH is preferably achieved by continuous neutralization of the aqueous substrate using an alkalizing agent as described above or by a dilute ammonia solution (preferably half).
  • the temperature of the substrate is maintained at a value of between 37 and 40 ° C. for the entire duration of the incubation, the latter generally being between 10 and 20 hours.
  • the ingredients of the aqueous substrate are present in the following amounts: i) whey permeate: from 3 to 80 g approximately and even more preferably from 40 to 60 g approximately, ii ) whey protein hydrolyzate: from 2 to 80 g approximately and even more preferably from 5 to 15 g approximately, iii) lactose: from 5 to 50 g approximately and even more preferably from 10 to 30 g approximately, these quantities being given by liter of said aqueous substrate.
  • the aqueous substrate can also comprise at least one additional ingredient chosen from yeast extracts, buffer salts and cysteine hydrochloride.
  • the aqueous substrate comprises a buffer salt
  • this is preferably chosen from sodium dihydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate and then preferably represents from 0.5 to 5 g approximately and even more preferably from 1.5 to 3 g approximately per liter of aqueous substrate.
  • the aqueous substrate comprises a yeast extract
  • this then preferably represents from 0.5 to 5 g approximately, and even more preferably from 1.5 to 3 g approximately per liter of aqueous substrate.
  • the aqueous substrate comprises cysteine hydrochloride
  • the latter then preferably represents from 100 to 500 mg approximately and even more preferably from 200 to 400 mg approximately per liter of aqueous substrate.
  • the elimination of Bifidobacterium from the culture medium can be carried out for example by microfiltration, or by centrifugation of the aqueous substrate.
  • the elimination of Bifidobacterium from the medium of culture is carried out by centrifugation of the aqueous substrate, for example at a speed of 3000 g for a period of approximately 1 hour.
  • the method further comprises, after the step of eliminating Bifidobacterium, an additional step of destroying the residual enzymatic activities contained in the aqueous substrate after incubation, for example by heat treatment of it at a temperature of about 75 ° C for about 3 minutes.
  • the step of ultrafiltration of the aqueous substrate is preferably carried out on polyethersulfone membranes, at a temperature below about 60 ° C.
  • the concentrated retentate thus obtained is preferably washed several times, for example with permuted water before being finally reconcentrated before being dehydrated, for example by lyophilization.
  • the buffer used for dissolving the dehydrated retentate is preferably chosen from buffers having a pH between 6 and 8 such as for example the Tris buffer adjusted to the desired pH by addition of hydrochloric acid.
  • gels which can be used to carry out the exclusion chromatography is not critical as long as they have an exclusion threshold of 600 kDa.
  • gels composed of dextran and crosslinked agarose such as the product sold under the trade name Superdex® 200 by the company Amersham Biosciences.
  • the salts present in the filtered fraction can also optionally be removed by ultrafiltration on a membrane having a cutoff threshold of approximately 10 kDa.
  • the filtered fraction constituting the immunomodulatory product can be used directly or frozen or lyophilized for conservation and subsequent use.
  • This filtered fraction consists of a complex of polysaccharides and proteins in which the carbohydrate fraction represents from 10 to 20% by weight approximately, the protein fraction representing approximately from 80 to 90% by weight relative to the total weight of said complex.
  • the carbohydrate fraction of the filtered fraction has the following monosaccharide composition (expressed in molar ratios compared to rhamnose): galactose: 11 to 14; mannose: 2 to 5; glucose: 3 to 6; N-acetyl galactosamine: 2.5 to 4.5; N-acetyl glucosamine 0.5 to 1.5; neuraminic acid: 4.5 to 6.5 and rhamnose: 1.
  • the subject of the invention is also the immunomodulatory product obtained according to the method described above as a medicament, and in particular as an immunomodulatory medicament.
  • Another object of the invention is a pharmaceutical composition characterized in that it contains, as active principle, at least one immunomodulatory product obtained according to the method described above, and at least one pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable means any support which, while retaining the immunomodulatory product obtained according to the process according to the invention, its properties, particularly its immunomodulatory properties, makes it possible to convey said product.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can be in any dosage form desired for oral administration to humans or animals, such as for example in liquid form for a syrup or a solution, a spray, or in the form solid, for example a powder, a tablet, a capsule, a capsule, a powder spray, in their various forms, immediate or programmed release, a gum, a paste, granules, or in any other form suitable for administration by orally.
  • the immunomodulatory product obtained according to the process according to the invention can also be incorporated, as an ingredient, in food compositions. Consequently, the subject of the invention is also a food composition, characterized in that it contains, as an ingredient, at least one immunomodulatory product obtained according to the process according to the invention.
  • Such food compositions can be intended for human or animal consumption and can in particular be in the form of a milk or not preparation, fermented or not, of animal or vegetable origin, including in particular infant formulas or for adults and seniors, and in particular in the form of infant formula, liquid or powdered milk, products fresh, cereals, cookies (fodder), small jars, desserts, etc. or even in the form of food or dietetic products for adults, including hospital products, or nutritional supplements.
  • FIG. 1 shows the chromatogram obtained after injection on a column packed with a Superdex® 200 gel of a culture medium fermented for 15 hours with the strain
  • CNCM 1-2219 absorbance in millivolts as a function of time elapsed in minutes
  • CNCM 1-2219 or by the short strain B.
  • CFPL Cold Generation of the Faculty of Pharmacy of Lille
  • C7 absorbance in millivolts as a function of the time elapsed in minutes
  • a culture medium is prepared containing the following ingredients:
  • the culture medium is ultrafiltered on Centramate® cassettes sold by the company PALL, fitted with polyethersulfone membranes having a cut-off threshold of 200 kDa and the permeate is autoclave for 30 minutes at 120 ° C.
  • the pH of the culture medium is then adjusted to a value of 6.5 using a solution of ammonia diluted to a quarter.
  • the culture medium is then inoculated with the bifidobacteria at a rate of 6% o (v / v) of a frozen concentrate of the short Bifidobacterium strain CNCM 1-2219 containing 5.10 10 CFU of bifidobacteria per ml of frozen concentrate.
  • the initial population of bacteria is 3.10 8 CFU of bifidobacteria per ml of culture medium.
  • Bifidobacteria are cultivated anaerobically, at a temperature between 37 and 40 ° C.
  • the pH of the culture medium is regulated at 6.5 using a solution of ammonia diluted to a quarter.
  • the culture time is 15 hours, and the population of Bifidobacterium at the end of the culture is approximately 2.10 CFU per ml of culture medium.
  • the bacteria are eliminated from the fermented culture medium by centrifugation for 1 hour at 3000 g.
  • the residual enzymatic activities contained in the centrifugation supernatant are destroyed by a thermal treatment for 3 minutes at 75 ° C.
  • the supernatant is ultrafiltered on Centramate® cassettes sold by the company PALL, fitted with polyethersulfone membranes having a cutoff threshold of 300 kDa at a temperature of approximately 40 ° C. It is thus concentrated 3 times, then washed 3 times with deionized water. During the last wash, a 7-fold concentration of the part retained by the membrane is operated. This gives a concentrate called retentate. The retentate is dehydrated by lyophilization, then taken up in a Tris NaCl buffer at pH 8.
  • composition of the retentate is studied by exclusion chromatography.
  • retentate is injected at a flow rate of 0.6 ml per minute on a column of Superdex® 200 gel sold by the company Amersham Biosciences and having an exclusion threshold of 600 kDa, coupled to a UV detector at diode array (200-300 nm).
  • the signal integration is carried out using the KromaSystem® 2000 software sold by the company Kontron Instruments. Two fractions are thus separated: a fraction excluded from the gel is eluted after 12.5 minutes at from the injection and a filtered fraction is eluted from 16 to 32 minutes from the injection.
  • FIG. 1 represents the absorbance (in millivolts) as a function of the time elapsed (in minutes) since the injection of the retentate on the column.
  • Figures 2 and 3 represent the chromatograms obtained after analysis of a retentate from a culture carried out as described above and a retentate from a culture carried out under the same conditions but with a different strain of bifidobacteria (B. brief CFPL C7).
  • FIG. 2 represents the absorbance (in millivolts) as a function of the time elapsed (in minutes) since the injection on the column of retentates corresponding to the two cultures carried out respectively with the strain B. brief CNCM 1-2219 and with the strain B brief CFPL C7.
  • the separation is carried out by chromatography on a column of Superdex® 200 gel 50 mm in diameter and 100 cm in height, fed at a flow rate of 5 ml per minute and having an exclusion threshold of 600 kDa.
  • the fractions are collected by 10 ml and their absorbance is measured at 280 nanometers.
  • a filtered fraction of molecular weight between 200 and 600 kDa (retention time from 187 to 370 minutes +/- 10%).
  • the salts are removed from the filtered fraction or active part by ultrafiltration using a membrane having a cutoff threshold of 10 kDa.
  • the filtered fraction is concentrated at the 3 ee washing so as to return to its level of concentration in the retentate. This fraction can then be stored in frozen or lyophilized form. The excluded fraction can also be kept in the same way.
  • Example 2 The lyophilized powder of filtered fraction as prepared above in Example 1 (10 mg) is taken up in pure anhydrous hydrazine (200-300 microliters). The mixture is incubated overnight at 110 ° C., dried under a stream of nitrogen and taken up in 1 ml of water. The solution is then fractionated by gel permeation on a column
  • Fractogel TSK sold under the reference HW40 by the company Merck and the elution is carried out in water.
  • the presence of sugars in the various fractions collected is sought by the orcinol method and by thin layer chromatography.
  • the results obtained show that the majority of the sugars are in the fraction not retained on the gel (> 10 kDa) and migrate shortly after thin layer chromatography.
  • the carbohydrate part of the filtered fraction therefore constitutes a polysaccharide with a molar mass greater than 10 kDa.
  • the carbohydrate part of the filtered fraction represents approximately 12% to 16% by mass thereof.
  • the molar composition of the carbohydrate fraction of the active part is determined by gas chromatography after methanolysis using a mixture of 0.5 M hydrochloric acid and methanol for 24 hours at 80 ° C.
  • Example FI A sample of the filtered fraction (Sample FI), coming from a test carried out according to Example 1, is analyzed.
  • the FI sample contains more galactose and glucose than the C7 and ML samples.
  • EXAMPLE 3 STUDY OF THE IMMUNOMODULATORY ACTIVITY OF THE FILTERED FRACTION OF THE RETENTAT
  • mice which are second generation mice from a line of axenic animals, in which an adult human intestinal flora is implanted (from the CDTA, Center for Distribution, Typing & Archiving of animals, CNRS, Louis, France).
  • mice are kept in isolators to avoid any modification of their new intestinal flora. Upon receipt, the mice are 8-10 weeks old. An adaptation time of at least 2 weeks is left to the mice after reception to remove any stress due to transport and for them to acclimatize to their new environment.
  • mice have sterile water as a drink.
  • the food used as a food base is a standard diet of RO3 granules sold by the company UAR, sterilized by irradiation, containing 25% of proteins, 49.8% of carbohydrates, 5% of lipids and 4 % cellulose.
  • mice which will receive, during the 15 days of the test, the filtered fraction of the brief Bifidobacterium metabolites CNCM 1-2219 (active part) at the place water from baby bottles, 6 ml per day and per mouse, while two other groups respectively receive the excluded fraction or continue to receive water (control group).
  • a daily change of the bottles is carried out in order to avoid any modification of the composition of the products to be tested by bacterial proliferation.
  • Feces are collected for analysis before treatment (T0), and on the 7th and 15 th day during the administration of the product (T7 and T15).
  • T0 the 7th and 15 th day during the administration of the product
  • T7 and T15 Each product is tested on a batch of at least 6 mice and the evolution of the bacteria Bifidobacterium and Clostridium perfringens is monitored in the intestinal flora of the mice.
  • the stool samples are taken in sterile hemolysis tubes and are weighed aseptically then diluted in pre-reduced Ringer's solution diluted to a quarter and supplemented with cysteine hydrochloride (0.3 g / 1), so as to obtain dilutions to the tenth ranging from 10 "1 to 10 " 4 .
  • the content is finally deposited at the rate of 100 ⁇ l per dish, on different culture media contained in petri dishes:
  • Beerens medium (Be) (composed of 35 g / 1 of Columbia agar base, 5 g / 1 of glucose, 0.3 g / 1 of cysteine hydrochloride, 0.5% propionic acid and adjusted to pH 5 ) for finding and counting Bifidobacterium, after spreading dilutions ranging from 10 " to 10 " ;
  • CC Columbia medium (composed of 35 g / l of Columbia base (Difco), 15 g / l of agar; adjusted to pH 7.3 and autoclave 15 minutes at 120 ° C) for the search and counting of Clostridium spores, after spreading of heated dilutions ranging from 10 "1 to 10 " 2 .
  • the search and the counting of Bifidobacterium is carried out on the pre-reduced medium Be inoculated directly while the spores of Clostridium perfringens are sought after heating dilutions at 75 ° C for 10 minutes and inoculation on agar CC supplemented with glucose (5 g / 1) , in cysteine hydrochloride (0.3 g / 1) and in horse blood (5% v / v, sold by the company Eurobio).
  • the spreading is carried out using sterile glass beads on the indicated media and the reading of the media is carried out after 5-7 days of anaerobic incubation at 37 ° C.
  • the identification of the bacteria is carried out on the one hand after description of the colonies obtained on each of the media and on the other hand using a Gram stain.
  • galectins-1 and -3 The measurement of the expression of galectins-1 and -3 is carried out on the mice with adult human flora described above.
  • mice At the age of 12-14 weeks, the start of the experiment, two groups of mice are formed, a group of mice which will receive, throughout the duration of the experiment, the filtered fraction containing the brief Bifidobacterium metabolites CNCM 1-2219 instead of baby bottle water, 10 ml per day and per mouse while another group of mice will continue to receive water (control group). 21 th day, the mice are sacrificed to carry a biological study on the expression of galectines- 1 and -3, evaluated by assaying the mRNA encoding these galectins by quantitative RT-PCR (Polymerase Chain Reaction).
  • the modification of the expression of galectins-1 and -3 in the lungs constitutes an indicator of the effect of the metabolites produced by the brief Bifidobacterium strain CNCM 1-2219 contained in the filtered fraction.
  • Galectins-1 and -3 are measured in the lungs of mice having been sacrificed as described above.
  • a fraction of lung (a lobe) is removed sterile from each mouse.
  • the lobe thus removed is then placed in a petri dish previously treated for 24 hours with a sterile solution of water and
  • the organ lobe is then perfused a first time with PBS buffer using a syringe and a sterile needle. The lobe is then transferred to another box of
  • RNA stabilization solution sold under the reference RNALater® by the company Qiagen
  • Total RNA is extracted from the tissues after cell lysis according to the protocol for using the RNeasy protect® extraction kit sold under the reference 7126 by the company Qiagen. To do this, the stabilization solution is removed and a tungsten ball treated with DEPC as well as 600 microliters of a lysis solution (RLT buffer contained in the kit) are added. The sample is then ground using a RETSCH MM2000 mill, then centrifuged at 13,000 g for 3 minutes at 4 ° C. The supernatant is then placed in a 1.5 ml tube containing 600 microliters of 70% ethanol and then homogenized.
  • Quantitative RT-PCR is performed using the qPCR TM Core Kit sold by the company Eurogentec in a reference thermal cycler Abi Prism 7700 (Sequence Detection System, Applied Biosystems) sold by the company Perkin Elmer.
  • the reaction mixture summarized in the following Table IV is carried out:
  • the reaction mixture is subjected to the following program: 10 minutes at 65 ° C to remove secondary structures from RNA, 30 minutes at 42 ° C to activate reverse transcriptase, 10 minutes at 95 ° C to activate polymerase, 15 seconds at 95 ° C to denature the DNA strands and 1 minute at 61 ° C for hybridization and elongation from the primers. Forty cycles are performed for the last two stages.
  • galectins-1 and -3 are evaluated relative to the expression of a reference gene, such as that coding for ⁇ -actin, the expression of which is constant.
  • Anti-sense 5'-AAG CTC TTG GCG TCC GAG G-3 '(SEQ ID n ° 5)
  • Probe 5'-TCG CCA GCA ACC TGA ATC AAC CTG-3' (SEQ ID n ° 6)
  • Galectin-3 5'-AAG CTC TTG GCG TCC GAG G-3 '(SEQ ID n ° 5)
  • Anti-sense 5'-GAT CAT GGC GTG GTT AGC-3 '(SEQ ID n ° 8)
  • Anti-sense 5'-GGG ATG TTT GCT CCA ACC AAC-3 '(SEQ ID n ° 11)
  • RNAs were extracted using the protocol previously described for the lung of the batches of mice to be tested. The different extracts thus obtained are then collected for each organ in order to constitute a pool serving as a calibrator throughout the duration of the analysis.
  • the samples to be tested are deposited in duplicate and the standard range produced from the calibrator sample is deposited in triplicate.

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Abstract

La présente invention est relative à un produit immunomodulateur obtenu à partir d'une culture de Bifidobacterium, à son utilisation, notamment à titre de médicament ou d'ingrédient alimentaire, ainsi qu'aux compositions pharmaceutiques ou alimentaires le contenant.

Description

PRODUIT IMMUNOMODULATEUR OBTENU À PARTIR D'UNE CULTURE DE BIFIDOBACTERIUM ET COMPOSITIONS LE CONTENANT
La présente Invention est relative à un produit immunomodulateur obtenu à partir d'une culture de Bifidobacterium, à son utilisation, notamment à titre de médicament ou d'ingrédient alimentaire, ainsi qu'aux compositions pharmaceutiques ou alimentaires le contenant.
Le genre Bifidobacterium fait partie de la famille des Actinomycetaceae ; il regroupe des bacilles à Qram positif, anaérobies stricts, fermentant le glucose par la voie de la fructose 6-phosphate phosphocétolase. Leur pH optimal de croissance est compris entre 6 et 7, et leur température optimale de croissance est comprise entre 37 et 46°C.
Les bifidobactéries font partie de la flore intestinale humaine normale, et on leur reconnaît de nombreux effets bénéfiques pour la santé. Il est notamment connu que les nourrissons alimentés au sein, qui possèdent une flore intestinale dans laquelle les bifidobactéries prédominent, résistent mieux aux infections et présentent notamment un risque de diarrhée plus faible que les nourrissons nourris avec des préparations lactées industrielles classiques.
Le rôle des bifidobactéries dans cette résistance accrue aux infections n'a pas été complètement élucidé. Différentes études indiquent qu'elles possèdent un pouvoir immunomodulateur qui impliquerait des substances polysaccharidiques associées à la paroi bactérienne, ou sécrétées par les bactéries au cours de la fermentation anaérobie. Gomez et al., (FEMS Microbiol. Lett., 1988, 56, 47-52) décrivent l'effet immunomodulateur de fractions exocellulaires riches en polysaccharides produites par Bifidobacterium adolescentis ; la demande de brevet FR 2 652 590 décrit un exopolymère immunopotentiateur de nature polysaccharidique produit par une souche du continuum Bifidobacterium infantis longum ; Honoso et al. (Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61, 312-316 et Bioscience Microflora, 1998, 17, 97- 104) décrivent des polysaccharides immunopotentiateurs produits par différentes espèces de Bifidobacterium. L'action immunomodulatrice des bifidobactéries se manifeste également par la régulation de la micro flore intestinale, en particulier au détriment du développement d'espèces bactériennes pathogène. Romond et al. (Anaerobe, 1997, 3, 137-143 et J. Dairy Sci., 1998, 81, 1229-1235) décrivent ainsi des fractions riches en glycoprotéines, produites par Bifidobacterium brève en conditions de fermentation anaérobie, et induisent in vivo un effet régulateur de la microflore intestinale.
On trouve ainsi sur le marché de nombreux produits fermentes par des bifidobactéries, éventuellement associées à d'autres bactéries lactiques, et dont l'ingestion permet de bénéficier des effets immunomodulateurs des bifidobactéries et de leurs produits de fermentation.
Cependant, et dans le cas particulier de l'alimentation infantile, ceux-ci présentent l'inconvénient d'être trop acides et de présenter, notamment dans le cas des produits en poudre, un aspect non-homogène après reconstitution, du fait de la coagulation des protéines du lait par l'acidité générée lors de la fermentation. Ils sont donc parfois mal acceptés par l'enfant et par la mère.
Afin de remédier à ces inconvénients, il a déjà été proposé dans la demande internationale WO 01/01785, un procédé de préparation d'un produit lacté immunostimulant par bioconversion, sans fermentation et donc sans acidification du produit final, d'un substrat laitier à l'aide de bifidobactéries, et en particulier de la souche Bifidobacterium brève, déposée selon le Traité de Budapest, le 31 mai 1999, sous le numéro 1-2219 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) tenue par l'Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, à Paris. Cependant, le procédé de préparation décrit dans cette demande internationale ne permet pas de préparer des produits alimentaires autres que des produits lactés et nécessite des conditions de mise en oeuvre contraignantes d'un point de vue industriel, notamment le maintien de conditions de culture aérobies, le maintien du milieu de culture à une pression osmotique correspondant à 0,93 à 0,97 d'activité de l'eau (AW), et/ou le maintien du milieu de culture à une température comprise entre 40 et 48°C.
Par ailleurs, Clostridium perfringens est une bactérie anaérobie, Gram-positif, sporulée qui est très répandue dans l' environnement (sol, eau, air, poussières) mais est aussi commensale de l'Homme et des animaux (flore de l'intestin, du vagin, des voies aériennes supérieures...). Les bactéries Clostridium perfringens sont responsables de la libération de toxines et d'enzymes dans le tractus digestif qui provoquent l'endommagement de tissus. La production de ces différentes toxines est associée à la sporulation. Les spores persistent dans le sol, les sédiments et les surfaces exposées à la pollution fécale humaine et animale et leur présence dans l'eau est un critère de contamination fécale.
Clostridium perfringens est responsable de gangrènes gazeuses, de toxi-infections alimentaires et d'entérites nécrosantes.
Bien que d'autres germes soient impliqués dans la survenue d'une myonécrose, Clostridium perfringens reste l'agent principal de la gangrène gazeuse. Elle est généralement post-traumatique (consécutive à des accidents) mais peut aussi être post-opératoire (surtout en chirurgie septique viscérale), purement médicale (consécutive à une injection musculaire) ou encore spontanée (sur cancer colique). La gangrène gazeuse est mortelle dans 25 à 60 % des cas.
Clostridium perfringens est impliquée dans 10 à 15 % des toxi- infections alimentaires. La contamination se fait par ingestion d'aliments tels que la viande, le lait, les fruits et les légumes qui sont fréquemment contaminés par cette bactérie. Une fois ingérés, si les conditions sont appropriées, l'organisme produit des toxines dans le tractus gastro-intestinal et provoquent les symptômes qui sont caractérisés, pour la forme commune d'infection, par d'intenses crampes intestinales, des douleurs abdominales aiguës, des diarrhées, des nausées, des vomissements et de la fièvre. Clostridium perfringens est également responsable d'une affection digestive sévère appelée entérite nécrosante surtout chez le jeune enfant ou le nouveau-né. En absence de traitement approprié, elle est suivie d'une péritonite ou d'un état de choc qui est souvent fatal, la mort provenant de l'infection et de la nécrose de l'intestin et de la septicémie qui en résulte. II peut donc être intéressant de pouvoir disposer d'un produit immunomodulateur permettant de contrôler la prolifération de Clostridium perfringens.
C'est donc afin de remédier à l'ensemble des inconvénients que présentent les produits décrits dans l'art antérieur et de pourvoir à un produit immunomodulateur pouvant être incorporé dans tout type de produit alimentaire ou être utilisé pour la préparation de compositions pharmaceutiques immunomodulatrices, que les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de l'Invention.
Les Inventeurs se sont également donné pour but de pourvoir à une composition alimentaire ou pharmaceutique ayant un effet régulateur de la microflore intestinale, en particulier au détriment du développement d'espèces bactériennes pathogènes, notamment Clostridium perfringens.
La présente Invention a donc pour premier objet un produit immunomodulateur caractérisé par le fait qu'il est obtenu selon un procédé de préparation comprenant les étapes suivantes : - l'ensemencement et l'incubation, en conditions aérobies ou anaérobies, préférentiellement anaérobies, et à une température comprise entre 30 et 40°C environ, de Bifidobacterium comprenant au moins la souche Bifidobacterium brève 1-2219 dans un substrat aqueux présentant un pH compris entre 6 et 8 environ, et comprenant au moins les ingrédients suivants : i) du perméat de lactosérum, ii) un hydrolysat de protéines de lactosérum, iii) du lactose,
- l'élimination des Bifidobacterium du substrat aqueux ;
- l'ultrafiltration du substrat aqueux sur des membranes de filtration ayant un seuil de coupure compris entre 100 et 300 kDa pour obtenir un rétentat concentré ;
- la déshydratation du rétentat concentré, de préférence par lyophilisation ;
- la mise en solution du rétentat déshydraté dans un tampon ; - la chromatographie d'exclusion sur gel sur colonne présentant un seuil d'exclusion de 600 kDa de la solution du rétentat ;
- la récupération de la fraction filtrée à l'issue de la chromatographie qui constitue le produit immunomodulateur.
La fraction filtrée obtenue en mettant en œuvre le procédé conforme à l'Invention présente des propriétés immunomodulatrices ; elle permet en particulier de stimuler la prolifération des Bifidobacterium et de diminuer la population en Clostridium perfringens au sein de la flore intestinale. Selon l'Invention, le perméat de lactosérum entrant dans la composition du substrat aqueux peut se présenter sous la forme d'une poudre, obtenue par ultrafiltration de lactosérum, après séchage (par spray ou par toute autre technique de séchage), de la fraction liquide, déminéralisée ou non, qui franchit la membrane lors de l'ultrafiltration du lactosérum.
Les hydrolysats de protéines de lactosérum utilisables dans le cadre de la présente Invention, peuvent être obtenus par les méthodes habituellement utilisées pour la préparation des hydrolysats de protéines, notamment par hydrolyse enzymatique des protéines de lactosérum à l'aide de protéases telles que la trypsine, la chymotrypsine, etc.. De nombreux concentrés ou isolats de protéines sériques de même que des hydrolysats de protéines de lactosérum, convenant pour la mise en œuvre de l'Invention sont connus en eux-mêmes et disponibles dans le commerce.
Avant son utilisation, le substrat aqueux est de préférence filtré sur membranes, telles que par exemple sur des membranes en polyéthersulfone, ayant un seuil de coupure compris entre 100 et 300 kDa, puis le perméat autoclave à une température d'environ 120°C pendant environ 30 minutes de façon à éviter toute contamination bactérienne indésirable du milieu culture.
Avant emploi, le pH du substrat aqueux peut être ajusté à la valeur désirée à l'aide de tout agent alcalinisant classiquement utilisé par l'homme du métier tel que par exemple la soude ou la potasse.
Les Bifidobacterium sont, de préférence, ensemencés dans le substrat aqueux à raison de 1.104 à 4.109 unités formant colonies (UFC) par ml de substrat. Cet ensemencement peut s'effectuer par exemple par addition au substrat aqueux, dans des proportions adaptées, d'un concentré congelé de Bifidobacterium, ou d'une pré culture sur milieu permettant la croissance de bifidobactéries.
Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, le pH du substrat aqueux est maintenu à une valeur comprise entre 6 et 8 environ pendant toute la période d'incubation, et encore plus préférentiellement entre 6,5 et 7,5. Le maintien du pH est de préférence réalisé par une neutralisation en continu du substrat aqueux à l'aide d'un agent alcalinisant tel que décrit précédemment ou par une solution d'ammoniaque diluée (de préférence au demi). Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, la température du substrat est maintenue à une valeur comprise entre 37 et 40°C environ pendant toute la durée de l'incubation, celle-ci étant généralement comprise entre 10 et 20 heures. Selon une forme de réalisation préférée du procédé conforme à l'Invention, les ingrédients du substrat aqueux sont présents dans les quantités suivantes : i) perméat de lactosérum : de 3 à 80 g environ et encore plus préférentiellement de 40 à 60 g environ, ii) hydrolysat de protéines de lactosérum : de 2 à 80 g environ et encore plus préférentiellement de 5 à 15 g environ, iii) lactose : de 5 à 50 g environ et encore plus préférentiellement de 10 à 30 g environ, ces quantités étant données par litre dudit substrat aqueux. Selon une forme de réalisation particulière de l'Invention, le substrat aqueux peut comprendre en outre au moins un ingrédient additionnel choisi parmi les extraits de levure, les sels tampon et le chlorhydrate de cystéine.
Lorsque le substrat aqueux comprend un sel tampon, celui-ci est préférentiellement choisi parmi le dihydrogénophosphate de sodium et le dihydrogénophosphate de potassium et représente alors de préférence de 0,5 à 5 g environ et encore plus préférentiellement de 1,5 à 3 g environ par litre de substrat aqueux.
Lorsque le substrat aqueux comprend un extrait de levure, celui-ci représente alors de préférence de 0,5 à 5 g environ, et encore plus préférentiellement de 1,5 à 3 g environ par litre de substrat aqueux.
Lorsque le substrat aqueux comprend du chlorhydrate de cystéine, celui-ci représente alors de préférence de 100 à 500 mg environ et encore plus préférentiellement de 200 à 400 mg environ par litre de substrat aqueux.
A la fin de la période d'incubation, l'élimination des Bifidobacterium du milieu de culture peut être réalisée par exemple par microfiltration, ou par centrifugation du substrat aqueux. Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, l'élimination des Bifidobacterium du milieu de culture est réalisée par centrifugation du substrat aqueux, par exemple à une vitesse de 3000 g pendant une durée d'environ 1 heure.
Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, le procédé comporte en outre, après l'étape d'élimination des Bifidobacterium, une étape supplémentaire de destruction des activités enzymatiques résiduelles contenues dans le substrat aqueux après incubation, par exemple par un traitement thermique de celui- ci à une température d'environ 75°C pendant environ 3 minutes.
L'étape d'ultrafiltration du substrat aqueux est de préférence réalisée sur des membranes en polyéthersulfone, à une température inférieure à 60°C environ. A la fin de l'étape d'ultrafiltration, le rétentat concentré ainsi obtenu est de préférence lavé plusieurs fois, par exemple à l'eau permutée avant d'être finalement reconcentré avant d'être déshydraté par exemple par lyophilisation.
Le tampon utilisé pour la mise en solution du rétentat déshydraté est de préférence choisi parmi les tampons présentant un pH compris entre 6 et 8 tels que par exemple le tampon Tris ajusté au pH voulu par ajout d'acide chlorhydrique.
La nature des gels utilisables pour réaliser la chromatographie d'exclusion n'est pas critique à partir du moment que ceux-ci présentent un seuil d'exclusion de 600 kDa. A titre de gel on peut notamment utiliser les gels composés de dextrane et d'agarose réticulé tels que le produit vendu sous la dénomination commerciale Superdex® 200 par la société Amersham Biosciences.
Les sels présents dans la fraction filtrée peuvent en outre éventuellement être éliminés par ultrafiltration sur une membrane présentant un seuil de coupure d'environ 10 kDa.
Enfin, la fraction filtrée constituant le produit immunomodulateur peut être utilisée directement ou congelée ou lyophilisée pour conservation et utilisation ultérieure.
Cette fraction filtrée est constituée d'un complexe de polysaccharides et de protéines dans lequel la fraction glucidique représente de 10 à 20 % en poids environ, la fraction protéique représentant environ de 80 à 90 % en poids par rapport au poids total dudit complexe.
Selon l'Invention, la fraction glucidique de la fraction filtrée présente la composition en monosaccharides suivante (exprimée en rapports molaires par rapport au rhamnose) : galactose : 11 à 14 ; mannose : 2 à 5 ; glucose : 3 à 6 ; N-acétyl galactosamine : 2,5 à 4,5 ; N-acétyl glucosamine 0,5 à 1,5 ; acide neuraminique : 4,5 à 6,5 et rhamnose : 1.
L'Invention a également pour objet le produit immunomodulateur obtenu selon le procédé décrit précédemment à titre de médicament, et en particulier à titre de médicament immunomodulateur.
Un autre objet de l'Invention est une composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle renferme, à titre de principe actif, au moins un produit immunomodulateur obtenu selon le procédé décrit précédemment, et au moins un support pharmaceutiquement acceptable.
Par pharmaceutiquement acceptable on entend tout support qui tout en conservant au produit immunomodulateur obtenu selon le procédé conforme à l'Invention ses propriétés, particulièrement ses propriétés immunomodulatrices, permet de véhiculer ledit produit. La composition pharmaceutique selon l'Invention peut se présenter sous toute forme galénique souhaitée pour une administration par voie orale à l'homme ou à l'animal, comme par exemple sous forme liquide pour un sirop ou une solution, un spray, ou sous forme solide comme par exemple une poudre, un comprimé, une gélule, une capsule, un spray poudre, dans leurs formes diverses, libération immédiate ou programmée, une gomme, une pâte, des granulés, ou sous toute autre forme adaptée à l'administration par voie orale.
Le produit immunomodulateur obtenu selon le procédé conforme à l'Invention peut également être incorporé, à titre d'ingrédient, dans des compositions alimentaires. Par conséquent, l'Invention a également pour objet une composition alimentaire caractérisée par le fait qu'elle renferme, à titre d'ingrédient, au moins un produit immunomodulateur obtenu selon le procédé conforme à l'Invention.
De telles compositions alimentaires peuvent être destinées à l'alimentation humaine ou animale et peuvent notamment se présenter sous forme d'une préparation lactée ou non, fermentée ou non, d'origine animale ou végétale, y compris notamment les formules infantiles ou pour adultes et seniors, et en particulier sous forme d'une préparation lactée infantile, de lait liquide ou en poudre, de produits frais, de céréales, de biscuits (fourrage), de petits pots, de desserts, etc ou bien encore sous forme de produits alimentaires ou diététiques pour adultes, dont les produits hospitaliers, ou de compléments nutritionnels.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation du produit immunomodulateur conforme à l'Invention, ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles :
- la figure 1 représente le chromatogramme obtenu après injection sur une colonne garnie d'un gel de Superdex® 200 d'un milieu de culture fermenté pendant 15 heures par la souche
Bifidobacterium brève CNCM 1-2219 (absorbance en millivolts en fonction du temps écoulé en minutes) ;
- la figure 2 compare les chromatogrammes obtenus après injection sur une colonne garnie d'un gel de Superdex® 200 d'un milieu de culture fermenté par la souche Bifidobacterium brève
CNCM 1-2219 ou par la souche B. brève CFPL (Collection de la Faculté de Pharmacie de Lille) C7 (absorbance en millivolts en fonction du temps écoulé en minutes) ;
- la figure 3 représente un agrandissement de la figure 2. EXEMPLE 1 : PREPARATION D'UN PRODUIT IMMUNOMODULATEUR OBTENU PAR CULTURE DE BIFIDOBACTERIUM
On prépare un milieu de culture contenant les ingrédients suivants :
- 50 g/1 de perméat de lactosérum,
- 10 g/1 d'hydrolysat de protéines de lactosérum, - 20 g/1 de lactose,
- 2 g/1 d'extrait de levure,
- 2.5 g/1 de dihydrogénophosphate de potassium,
- 0,3 g/1 de chlorhydrate de cystéine.
Le milieu de culture est ultrafiltré sur cassettes Centramate® vendues par la société PALL, munies de membranes en polyéthersulfone ayant un seuil de coupure de 200 kDa et le perméat est autoclave pendant 30 minutes à 120°C. Le pH du milieu de culture est alors ajusté à une valeur de 6,5 à l'aide d'une solution d'ammoniaque diluée au quart.
Le milieu de culture est ensuite ensemencé avec les bifidobactéries à raison de 6 %o (v/v) d'un concentré congelé de la souche de Bifidobacterium brève CNCM 1-2219 contenant 5.1010 UFC de bifidobactéries par ml de concentré congelé. La population initiale en bactéries est de 3.108 UFC de bifidobactéries par ml de milieu de culture. Les bifidobactéries sont cultivées en anaérobiose, à une température comprise entre 37 et 40°C. Pendant la culture, le pH du milieu de culture est régulé à 6,5 au moyen d'une solution d'ammoniaque diluée au quart. Le temps de culture est de 15 heures, et la population de Bifidobacterium en fin de culture est environ de 2.10 UFC par ml de milieu de culture.
En fin de culture, les bactéries sont éliminées du milieu de culture fermenté par une centrifugation de 1 heure à 3000 g. Les activités enzymatiques résiduelles contenues dans le surnageant de centrifugation sont détruites par un traitement thermique de 3 minutes à 75°C.
Le surnageant est ultrafiltré sur cassettes Centramate® vendues par la société PALL, munies de membranes en polyéthersulfone ayant un seuil de coupure de 300 kDa à une température de 40°C environ. Il est ainsi concentré 3 fois, puis lavé 3 fois à l'eau permutée. Pendant le dernier lavage, on opère une concentration de 7 fois de la partie retenue par la membrane. On obtient ainsi un concentré appelé rétentat. Le rétentat est déshydraté par lyophilisation, puis repris dans un tampon Tris- NaCl à pH 8.
1) Etude de la composition du rétentat obtenu
La composition du rétentat est étudiée par chromatographie d'exclusion.
Pour ce faire, 25 μl de rétentat sont injectés à un débit de 0,6 ml par minute sur colonne de gel Superdex® 200 vendu par la société Amersham Biosciences et présentant un seuil d'exclusion de 600 kDa, couplée à un détecteur UV à barrette de diodes (200-300 nm). L'intégration du signal est réalisée à l'aide du logiciel KromaSystem® 2000 vendu par la société Kontron Instruments. Deux fractions sont ainsi séparées : une fraction exclue du gel est éluée après 12,5 minutes à partir de l'injection et une fraction filtrée est éluée de 16 à 32 minutes à partir de l'injection.
Les résultats obtenus sur le rétentat après 15 heures de fermentation sont reportés sur la figure 1 annexée qui représente Pabsorbance (en millivolts) en fonction du temps écoulé (en minutes) depuis l'injection du rétentat sur la colonne.
Ces résultats représentent un chromatogramme typique montrant la fraction exclue et la fraction filtrée du rétentat ainsi analysé.
Les figures 2 et 3 représentent les chromatogrammes obtenus après analyse d'un rétentat issu d'une culture réalisée comme décrite précédemment et d'un rétentat issu d'une culture réalisée dans les mêmes conditions mais avec une souche différente de bifidobactéries (B. brève CFPL C7).
La figure 2 représente l' absorbance (en millivolts) en fonction du temps écoulé (en minutes) depuis l'injection sur la colonne des rétentats correspondants aux deux cultures réalisées respectivement avec la souche B. brève CNCM 1-2219 et avec la souche B. brève CFPL C7. Ces résultats montrent que, contrairement au rétentat de la culture réalisée avec la souche de B. brève CNCM I- 2219, le chromatogramme du rétentat de la culture réalisée avec la souche de B. brève CFPL C7 ne présente aucun pic correspondant à la fraction exclue et à la fraction filtrée du rétentat. En revanche, la figure 3 qui représente un agrandissement de la figure 2, montrent qu'il est nécessaire d'agrandir considérablement l'échelle d'absorbance de la figure 2 pour faire apparaître la fraction exclue et la fraction filtrée du rétentat correspondant à la culture réalisée avec la souche B. brève CFPL C7. Ces résultats démontrent ainsi que la souche B. brève CFPL C7 ne présente pas le potentiel de production de principes actifs que représente la souche B. brève CNCM 1-2219. 2) Préparation de la fraction filtrée du rétentat
Le rétentat concentré, préalablement repris dans un tampon Tris- NaCl pH 8, est soumis à une chromatographie préparative. La séparation est réalisée par chromatographie sur colonne de gel Superdex® 200 de 50 mm de diamètre et 100 cm de hauteur, alimentée à un débit de 5 ml par minute et présentant un seuil d'exclusion de 600 kDa. Les fractions sont collectées par 10 ml et leur absorbance est mesurée à 280 nanomètres.
Deux fractions sont ainsi séparées : - une fraction exclue du gel de poids moléculaire supérieur à 600 kDa (temps de rétention de 130 à 180 minutes +/- 10 %),
- une fraction filtrée de poids moléculaire compris entre 200 et 600 kDa (temps de rétention de 187 à 370 minutes +/- 10 %). Les sels sont éliminés de la fraction filtrée ou partie active par une ultrafiltration en utilisant une membrane présentant un seuil de coupure de 10 kDa.
La fraction filtrée est concentrée lors du 3e e lavage de façon à revenir à son niveau de concentration dans le rétentat. Cette fraction peut ensuite être conservée sous forme congelée ou lyophilisée. La fraction exclue peut également être conservée de la même manière.
EXEMPLE 2 : ANALYSE DE LA COMPOSITION GLUCIDIQUE DE LA PARTIE ACTIVE (FRACTION FILTREE PREPAREE A PARTIR D'UNE CULTURE DE BIFIDOBACTERIUM
La poudre lyophilisée de fraction filtrée telle que préparée ci-dessus à l'exemple 1 (10 mg) est reprise par de l'hydrazine anhydre pure (200-300 microlitres). Le mélange est incubé une nuit à 110°C, séché sous flux d'azote et repris dans 1 ml d'eau. La solution est ensuite fractionnée par perméation de gel sur colonne
Fractogel TSK, vendue sous la référence HW40 par la société Merck et l'élution est réalisée en eau. La présence de sucres dans les différentes fractions recueillies est recherchée par la méthode à l'orcinol et par chromatographie sur couche mince. Les résultats obtenus (non représentés) montrent que la majorité des sucres est dans la fraction non retenue sur le gel (>10 kDa) et migre peu après chromatographie sur couche mince. La partie glucidique de la fraction filtrée constitue donc un polysaccharide de masse molaire supérieure à 10 kDa. La partie glucidique de la fraction filtrée représente environ 12 % à 16 % en masse de celle-ci.
La composition molaire de la fraction glucidique de la partie active est déterminée par chromatographie en phase gazeuse après méthanolyse à l'aide d'un mélange de 0,5 M d'acide hydrochlorique et de méthanol pendant 24 heures à 80°C.
Un échantillon de la fraction filtrée (Echantillon FI), provenant d'un essai réalisé selon l'exemple 1 , est analysé.
A titre de comparaison, les mêmes analyses ont été réalisées sur un échantillon où la souche Bifidobacterium brève CNCM 1-2219 a été remplacée par la souche Bifidobacterium brève CFPL C7 (Echantillon C7) cultivée dans les mêmes conditions, ainsi que sur un échantillon où la souche Bifidobacterium brève CNCM I- 2219 a été cultivée sur un milieu lactose non conforme à l'Invention (Echantillon milieu lactose : ML) de composition suivante :
- 60 g/1 de lactose,
- 2 g/1 d'extrait de levure,
- 0,3 g/1 de chlorhydrate de cystéine.
Les étapes suivantes d'extraction et de purification étant comparables en tout point à celles décrites précédemment.
Les rapports molaires en monosaccharides donnés (exprimés par rapport au rhamnose) obtenus pour la fraction filtrée de ces différents échantillons sont regroupés dans le Tableau I suivant :
TABLEAU I
Figure imgf000014_0001
* : échantillon comparatif ne faisant pas partie de l'Invention On peut constater que la répartition des sucres de l'échantillon FI est différente de celles de l'échantillon C7 correspondant à la culture d'une souche de Bifidobacterium différente de la souche Bifidobacterium brève CNCM 1-2219 sur un milieu conforme à l'Invention et à celle de l'échantillon ML correspondant à la souche Bifidobacterium brève CNCM 1-2219 cultivée sur un milieu lactose non conforme à l'Invention.
En particulier, l'échantillon FI renferme plus de galactose et de glucose que les échantillons C7 et ML. EXEMPLE 3 : ETUDE DE L'ACTIVITE IMMUNOMODULATRICE DE LA FRACTION FILTREE DU RETENTAT
1) Effet de la fraction filtrée sur la flore intestinale des souris
L'effet de la fraction filtrée (partie active), obtenue selon le procédé décrit ci-dessus à l'exemple 1, sur l'évolution de la flore intestinale des souris a été étudié.
Le test a été réalisé sur des souris mâles C3H qui sont des souris de deuxième génération d'une lignée d'animaux axéniques, auxquelles est implantée une flore intestinale humaine adulte (provenant du CDTA, Centre de Distribution, Typage & Archivage animal, CNRS, Orléans, France).
Les souris sont maintenues dans des isolateurs pour éviter toute modification de leur nouvelle flore intestinale. A leur réception, les souris sont âgées de 8 à 10 semaines. Un temps d'adaptation d'au moins 2 semaines est laissé aux souris après réception pour supprimer tout stress dû au transport et pour qu'elles s'acclimatent à leur nouvel environnement.
Pendant toute cette durée d'adaptation et jusqu'au début de l'expérience, ces souris disposent d'eau stérile comme boisson.
Pendant toute la durée de l'expérience, la nourriture utilisée comme base alimentaire est un régime standard de granulés RO3 vendus par la société UAR stérilisés par irradiation, contenant 25 % de protéines, 49,8 % de glucides, 5 % de lipides et 4 % de cellulose.
A l'âge de 12 semaines, début de l'expérience, on constitue plusieurs groupes, un groupe de souris qui recevra pendant les 15 jours d'essai la fraction filtrée des métabolites de Bifidobacterium brève CNCM 1-2219 (partie active) à la place de l'eau des biberons, à raison de 6 ml par jour et par souris, pendant que deux autres groupes recevront respectivement la fraction exclue ou continueront de recevoir de l'eau (groupe contrôle).
Un changement quotidien des biberons est réalisé afin d'éviter toute modification de la composition des produits à tester par prolifération bactérienne. Les selles sont récoltées pour l'analyse avant le traitement (T0), puis au 7eme et au 15eme jour durant l'administration du produit (T7 et T15). Chaque produit est testé sur un lot d'au moins 6 souris et on suit l'évolution des bactéries Bifidobacterium et Clostridium perfringens dans la flore intestinale des souris.
Les prélèvements de selles sont faits dans des tubes à hémolyse stériles et sont pesés aseptiquement puis dilués en solution préréduite de Ringer diluée au quart et supplémentée en chlorhydrate de cystéine (0,3 g/1), de façon à obtenir des dilutions au dixième allant de 10"1 à 10"4. Le contenu est enfin déposé à raison de 100 μl par boîte, sur différents milieux de culture contenus dans des boîtes de Pétri :
- Milieu de Beerens (Be) (composé de 35 g/1 de base gélose Columbia, 5 g/1 de glucose, 0,3 g/1 de chlorhydrate de cystéine, 0,5 % d'acide propionique et ajusté à pH 5) pour la recherche et le dénombrement de Bifidobacterium, après étalement de dilutions allant de 10" à 10" ;
- Milieu Columbia (CC) (composée de 35 g/1 de base Columbia (Difco), 15 g/1 d'agar ; ajusté à pH 7,3 et autoclave 15 minutes à 120 °C) pour la recherche et le dénombrement des spores de Clostridium, après étalement de dilutions chauffées allant de 10"1 à 10"2.
La recherche et la numération de Bifidobacterium est effectuée sur le milieu préréduit Be ensemencé directement alors que les spores de Clostridium perfringens sont recherchées après chauffage des dilutions à 75°C pendant 10 minutes et ensemencement sur gélose CC supplémentée en glucose (5 g/1), en chlorhydrate de cystéine (0,3 g/1) et en sang de cheval (5 % v/v, vendu par la société Eurobio).
L'étalement est réalisé à l'aide de billes de verre stériles sur les milieux indiqués et la lecture des milieux est réalisée après 5-7 jours d'incubation en anaérobiose à 37°C. L'identification des bactéries est réalisée d'une part après description des colonies obtenues sur chacun des milieux et d'autre part à l'aide d'une coloration de Gram.
Les résultats concernant l'évolution de Bifidobacterium et de
Clostridium perfringens dans les selles des souris sont reportés respectivement dans les Tableaux II et III suivants : TABLEAU II
Figure imgf000017_0001
* . p<0,025
TABLEAU III
Figure imgf000017_0002
** : p<0,05
Dans ces tableaux, les résultats obtenus sont exprimés en moyenne et écart-type du log du nombre d'UFC/g de selles, et n est le nombre de souris utilisées pour chaque produit et jours testés (comparaison de rang par test de
Wilcoxon pour échantillons appariés), les astérisques indiquent les résultats significatifs par rapport au temps T0. Dans ces tableaux, le chiffre mentionné entre parenthèse correspond au nombre de souris dans lesquelles est présente la bactérie en question au dessus du seuil de détection. Les résultats correspondants au milieu non ensemencé sont similaires à la valeur obtenue à T0 et restent constants au cours du temps pendant les 15 jours de l'expérience (résultats non représentés dans les tableaux).
Ces résultats montrent que l'administration de l'une quelconque des deux fractions (exclue ou filtrée) conduit effectivement à une augmentation des Bifidobacterium mais que seule la fraction filtrée est efficace pour provoquer une diminution de la population en Clostridium perfringens au sein de la flore intestinale des souris. 2) Effet de la fraction filtrée sur l'expression des galectines 1 et 3
La mesure de l'expression des galectines- 1 et -3 est effectuée sur les souris à flore humaine adulte décrites précédemment.
A l'âge de 12-14 semaines, début de l'expérience, on constitue deux groupes de souris, un groupe de souris qui recevra pendant toute la durée de l'expérience la fraction filtrée contenant les métabolites de Bifidobacterium brève CNCM 1-2219 à la place de l'eau des biberons, à raison de 10 ml par jour et par souris pendant qu'un autre groupe de souris continuera de recevoir de l'eau (groupe contrôle). Au 21eme jour, les souris sont sacrifiées pour réaliser une étude biologique sur l'expression des galectines- 1 et -3, évaluée par le dosage de l'ARNm codant pour ces galectines par RT-PCR quantitative (Polymerase Chain Réaction).
La modification de l'expression des galectines- 1 et -3 dans les poumons constitue un indicateur de l'effet des métabolites produits par la souche de Bifidobacterium brève CNCM 1-2219 contenus dans la fraction filtrée.
Les galectines- 1 et -3 sont doségs dans les poumons de souris ayant été sacrifiées comme décrit précédemment.
Pour ce faire, une fraction de poumon (un lobe) est prélevée stérilement sur chaque souris. Le lobe ainsi prélevé est ensuite déposé dans une boîte de Pétri préalablement traitée pendant 24 heures avec une solution stérile d'eau et de
DEPC (DiEthyl PyroCarbonate, vendu par la société Sigma) à 1/1000. Le lobe d'organe est alors perfusé une première fois avec du tampon PBS à l'aide d'une seringue et d'une aiguille stérile. Le lobe est ensuite transféré dans une autre boîte de
Pétri contenant 200 microlitres de PBS additionné de 50 unités d'inhibiteur de RNase (vendu par la Société Applied Biosystems) et est perfusé à nouveau avec cette solution. Le lobe est enfin découpé en tranches inférieures à 5 mm qui sont déposées dans un tube Biopur® (Eppendorf) contenant 0,5 ml d'une solution de stabilisation de l'ARN, vendue sous la référence RNALater® par la société Qiagen, puis stockées au congélateur à — 20°C jusqu'à l'analyse. a) Extraction des ARN totaux des poumons
L'ARN total est extrait des tissus après lyse cellulaire selon le protocole d'utilisation du kit d'extraction RNeasy protect® vendu sous la référence 7 126 par la société Qiagen. Pour ce faire, la solution de stabilisation est retirée et une bille de tungstène traitée au DEPC ainsi que 600 microlitres d'une solution de lyse (tampon RLT contenu dans le kit) sont ajoutés. L'échantillon est ensuite broyé à l'aide d'un broyeur RETSCH MM2000, puis centrifugé à 13000 g pendant 3 minutes à 4°C. Le surnageant est alors placé dans un tube de 1,5 ml contenant 600 microlitres d'éthanol à 70 % puis homogénéisé. Une partie de cette solution (700 microlitres) est ensuite déposée sur une colonne de filtration qui permet d'accrocher les ARN, pour être centrifugée à 8000 g pendant 1 minute à 4°C. Après avoir vidé le tube collecteur, 700 microlitres d'un tampon de lavage (tampon RW1 contenu dans le kit) sont ajoutés sur la colonne qui sera centrifugée à 8000 g pendant 1 minute à 4°C. Le tube collecteur est à nouveau vidé et 500 microlitres d'un second tampon de lavage contenant de l'éthanol à 70 % (tampon RPE contenu dans le kit) est ajouté sur la colonne pour être centrifugée à 8000 g pendant 1 minute à 4°C. Cette dernière étape est renouvelée mais en effectuant une centrifugation à 13 000 g pendant 2 minutes à 4°C. Enfin, 30 microlitres d'un tampon d'élution permettant de décrocher les ARN de la colonne (tampon RNase free contenu dans le kit) sont ajoutés sur la colonne. L'éluat est alors centrifugé à 8 000 g pendant 1 minute à 4°C après avoir été incubé à température ambiante pendant 5 minutes. L'étape d'élution est à nouveau effectuée et les échantillons ainsi obtenus sont congelés rapidement à -80°C.
Une quantité équivalente à une unité de DNase, vendue par la société Boehringer, est ajoutée à chaque échantillon qui est ensuite incubé au bain- marie à 37°C pendant 15 minutes.
Afin d'évaluer la quantité d'ARN total des échantillons, ceux-ci sont dilués au l/8eme dans de l'eau stérile qui est placée dans une microcuve permettant la lecture de l' absorbance à 260 nm sur un spectrophotomètre UV de référence Genquant, vendu par la société Pharmacia. Pour obtenir la concentration en ARN total des échantillons, la valeur de la densité optique (DO) ainsi obtenue est multipliée par le facteur de dilution et par 40 (une unité de DO = 40 microgramme/ml d'ARN). b) RT-PCR quantitative utilisant la méthodologie Taq Man®
La RT-PCR quantitative est réalisée à l'aide du kit qPCR™ Core Kit vendu par la société Eurogentec dans un thermocycleur de référence Abi Prism 7700 (Séquence Détection System, Applied Biosystems) vendu par la société Perkin Elmer. Le mélange réactionnel résumé dans le tableau IV suivant est réalisé :
TABLEAU IV
Figure imgf000020_0001
* produit fourni dans le kit qPCR Core Kit
Le mélange réactionnel est soumis au programme suivant : 10 minutes à 65°C pour éliminer les structures secondaires des ARN, 30 minutes à 42°C pour activer la transcriptase inverse, 10 minutes à 95°C pour activer la polymérase, 15 secondes à 95°C pour dénaturer les brins d'ADN et 1 minute à 61 °C pour l'hybridation et l'élongation à partir des amorces. Quarante cycles sont effectués pour les deux dernières étapes.
L'expression des galectines-1 et -3 est évaluée par rapport à l'expression d'un gène de référence, tel que celui codant pour la β-actine dont l'expression est constante.
Les sondes et les amorces utilisées et choisies grâce au logiciel Primer Express® vendu par la société Perkin Elmer sont les suivantes : Galectine-1 :
Sens : 5'-TCA ATC ATG GCC TGT GGT CTG-3' (SEQ ID n° 4)
Anti-sens : 5'-AAG CTC TTG GCG TCC GAG G-3' (SEQ ID n° 5) Sonde : 5'-TCG CCA GCA ACC TGA ATC AAC CTG-3' (SEQ ID n° 6) Galectine-3 :
Sens : 5'-AAT GGC AGA CAG CTT TTC G-3' (SEQ ID n° 7)
Anti-sens : 5'-GAT CAT GGC GTG GTT AGC-3' (SEQ ID n° 8)
Sonde : 5 '-TTC CAC TTT AAC CGC CGC TTC AAT GAG AAC-3'
(SEQ ID n° 9) β-actine :
Sens : 5'-TGG CGC TTT TGA CTC AGG ATT-3' (SEQ ID n° 10)
Anti-sens : 5'-GGG ATG TTT GCT CCA ACC AAC-3' (SEQ ID n° 11)
Sonde : 5'-GCC GTC GCC TTC ACC GTT CCA GTT TTT-3' (SEQ ID n° 12) Afin de valider chaque microplaque soumise aux cycles de PCR, un calibreur est préparé à partir de poumons d'un lot de 6 souris C3H à flore humaine soumises à un régime alimentaire standard (eau stérile et granules RO3) sur lesquelles un lobe a été prélevé. Les ARN totaux ont été extraits à l'aide du protocole précédemment décrit pour le poumon des lots de souris à tester. Les différents extraits ainsi obtenus sont ensuite rassemblés pour chaque organe afin de constituer un pool servant de calibreur pendant toute la durée de l'analyse.
Lors de l'analyse, les prélèvements à tester sont déposés en duplicate et la gamme étalon réalisée à partir de l'échantillon calibreur est déposée en triple.
Une moyenne est alors réalisée à partir de chaque prélèvement et pour l'échantillon calibreur.
Les résultats de l'expression relative de la galectine-1 et -3 par rapport à la β-actine dans le poumon des souris sont regroupés dans le Tableau V suivant : TABLEAU V
Figure imgf000022_0001
Dans le tableau V : - a = nombre de souris par lot ;
- = médiane de l'expression relative de galectine ;
- c = résultats extrêmes d'expression relative de galectine ;
- la valeur désignée par la lettre U est la valeur statistique du test U de Mann-Whitney ; - p indique le seuil de significativité de la méthode.
Ces résultats montrent qu'une augmentation significative de l'expression de la galectine-1 est observée dans les poumons des souris pour lesquelles l'eau de boisson a été substituée par la fraction filtrée.
En revanche, aucune modification de l'expression de la galectine-3 n'est observée dans les poumons des souris pour lesquelles l'eau de boisson a été substituée par la fraction filtrée.
L'ensemble de ces résultats démontre que la fraction filtrée (produit immunomodulateur obtenu selon le procédé conforme à l'Invention) a un effet immunomodulateur et permet d'augmenter la population de Bifidobacterium et de diminuer la population en Clostridium perfringens.

Claims

REVENDICATIONS
1. Produit immunomodulateur caractérisé par le fait qu'il est obtenu selon un procédé de préparation comprenant les étapes suivantes : - l'ensemencement et l'incubation, en conditions aérobies ou anaérobies et à une température comprise entre 30 et 40°C environ, de Bifidobacterium comprenant au moins la souche Bifidobacterium brève 1-2219 dans un substrat aqueux présentant un pH compris entre 6 et 8 environ, et comprenant au moins les ingrédients suivants : i) du perméat de lactosérum, ii) un hydrolysat de protéines de lactosérum, iii) du lactose
- l'élimination des Bifidobacterium du substrat aqueux ;
- l'ultrafiltration du substrat aqueux sur des membranes de filtration ayant un seuil de coupure compris entre 100 et 300 kDa pour obtenir un rétentat concentré ;
- la déshydratation du rétentat concentré ;
- la mise en solution du rétentat déshydraté dans un tampon ;
- la chromatographie d'exclusion sur gel sur colonne présentant un seuil d'exclusion de 600 kDa de la solution du rétentat ;
- la récupération de la fraction filtrée à l'issue de la chromatographie qui constitue le produit immunomodulateur.
2. Produit immunomodulateur selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les Bifidobacterium sont ensemencés dans le substrat aqueux à raison de 1.104 à 4.109 unités formant colonies par ml de substrat.
3. Produit immunomodulateur selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait le fait que la température du substrat est maintenue une valeur comprise entre 37 et 40°C pendant toute la durée de l'incubation.
4. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que le pH du substrat aqueux est maintenu à une valeur comprise entre 6 et 8 pendant toute la période d'incubation.
5. Produit immunomodulateur selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le pH du substrat aqueux est maintenu à une valeur comprise entre 6,5 et 7,5 pendant toute la période d'incubation.
6. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les ingrédients du substrat aqueux sont présents dans les quantités suivantes : i) perméat de lactosérum : de 3 à 80 g, ii) hydrolysat de protéines de lactosérum : de 2 à 80 g, iii) lactose : de 5 à 50 g ces quantités étant données par litre dudit substrat aqueux.
7. Produit immunomodulateur selon la revendication 6, caractérisé par le fait que les ingrédients du substrat aqueux sont présents dans les quantités suivantes : i) perméat de lactosérum : de 40 à 60 g, ii) hydrolysat de protéines de lactosérum : de 5 à 15 g, iii) lactose : de 10 à 30 g ces quantités étant données par litre dudit substrat aqueux.
8. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le substrat aqueux comprend en outre au moins un ingrédient additionnel choisi parmi les sels tampon, les extraits de levure et le chlorhydrate de cystéine.
9. Produit immunomodulateur selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le substrat aqueux comprend un sel tampon choisi parmi le dihydrogénophosphate de sodium et le dihydrogénophosphate de potassium qui représente de 0,5 à 5 g par litre de substrat aqueux.
10. Produit immunomodulateur selon la revendication 8, caractérisé par le fait l'extrait de levure représente de 0,5 à 5 g par litre de substrat aqueux.
11. Produit immunomodulateur selon la revendication 8, caractérisé par le fait que le chlorhydrate de cystéine représente de 100 à 500 mg par litre de substrat aqueux.
12. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'élimination des Bifidobacterium du milieu de culture est réalisée par microfiltration ou par centrifugation du substrat aqueux.
13. Produit immunomodulateur selon la revendication 12, caractérisé par le fait que l'élimination des Bifidobacterium du milieu de culture est réalisée par centrifugation du substrat aqueux.
14. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que le procédé comporte en outre, après l'étape d'élimination des Bifidobacterium, une étape supplémentaire de destruction des activités enzymatiques résiduelles contenues dans le substrat aqueux après incubation.
15. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la chromatographie d'exclusion est réalisée sur un gel de dextrane et d'agarose réticulé.
16. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la fraction filtrée est constituée d'un complexe de polysaccharides et de protéines dans lequel la fraction glucidique représente de 10 à 20 % en poids, la partie protéique représentant de 80 à 90 % en poids par rapport au poids total dudit complexe.
17. Produit immunomodulateur selon la revendication 16, caractérisé par le fait que la fraction glucidique de la fraction filtrée présente la composition en monosaccharides suivante (exprimée en rapports molaires par rapport au rhamnose) : galactose : 11 à 14 ; mannose : 2 à 5 ; glucose : 3 à 6 ; N-acétyl galactosamine : 2,5 à 4,5 ; N-acétyl glucosamine 0,5 à 1,5 ; acide neuraminique : 4,5 à 6,5 et rhamnose : 1.
18. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des revendications précédentes, à titre de médicament.
19. Produit immunomodulateur selon l'une quelconque des revendications précédentes, à titre de médicament immunomodulateur.
20. Composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle renferme, à titre de principe actif, au moins un produit immunomodulateur obtenu selon le procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 17, et au moins un support pharmaceutiquement acceptable.
21. Composition pharmaceutique selon la revendication 20, caractérisée par le fait qu'elle est destinée à l'administration par voie orale et qu'elle se présente sous forme liquide ou solide.
22. Composition alimentaire caractérisée par le fait qu'elle renferme, à titre d'ingrédient, au moins un produit immunomodulateur obtenu selon le procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 17.
23. Composition alimentaire selon la revendication 22, caractérisée par le fait qu'elle se présente sous la forme d'une préparation lactée ou non, fermentée ou non, d'origine animale ou végétale, y compris de formules infantiles, pour adultes ou pour seniors.
24. Composition alimentaire selon la revendication 23, caractérisée par le fait qu'elle se présente sous la forme de lait liquide ou en poudre, de produits frais, de céréales, de biscuits (fourrage), de petits pots, de desserts, de produits hospitaliers, de produits diététiques ou de compléments nutritionnels.
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