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WO2004087899A1 - Procede d’obtention de cellules dendritiques et de cellules t regulatrices - Google Patents

Procede d’obtention de cellules dendritiques et de cellules t regulatrices Download PDF

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WO2004087899A1
WO2004087899A1 PCT/FR2004/000770 FR2004000770W WO2004087899A1 WO 2004087899 A1 WO2004087899 A1 WO 2004087899A1 FR 2004000770 W FR2004000770 W FR 2004000770W WO 2004087899 A1 WO2004087899 A1 WO 2004087899A1
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WO
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cells
dendritic cells
vitro
population
differentiation
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PCT/FR2004/000770
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Inventor
Hervé GROUX
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Sangamo Therapeutics SA
Original Assignee
TxCell SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]

Definitions

  • the invention relates to a method for obtaining Tri cells from T cells using specialized dendritic cells, which are also objects of the invention.
  • central tolerance is a well-established mechanism that involves deletion of self-reactive T cells after interaction with dendritic cells (DC) derived from the bone marrow.
  • DC dendritic cells
  • Tr regulatory T cells
  • DC Dendritic cells
  • APCs professional antigen presenting cells
  • DCs also have an important role in controlling the adaptive immune response, since distinct subsets of DCs, depending on their phenotype and functional maturation, induce different Th responses. They are capable of activating CD4 + helper cells and CD 8+ killer cells in vivo.
  • Tri cells T regulatory 1 (WO 97 / 42324). These T cells have a weak proliferative response, are highly secretory of IL-10 and regulate the Th1 and Th2 responses in vitro and in vivo. These Tri cells are particularly advantageous for the treatment of autoimmune and / or inflammatory diseases, when it is desired to modulate the immune system.
  • the treatments currently used in these diseases are either palliative treatments (insulin in the case of diabetes, antihistamine in the case of allergic disorders) or systemic treatments with anti-inflammatory drugs (ALNS) and / or immunosuppressants (glucocorticoids, cyclosporine, antibody).
  • palliative treatments insulin in the case of diabetes, antihistamine in the case of allergic disorders
  • ALNS systemic treatments with anti-inflammatory drugs
  • immunosuppressants glucocorticoids, cyclosporine, antibody
  • helper T lymphocytes also called helper T lymphocytes (T helpers).
  • Thl lymphocytes involved in the development of the cellular immune response, produce pro-inflammatory cytokines such as interleukin-2 (IL-2) and interferon ga ma (IFN ⁇ ) and show effects macrophage activators; Th2 lymphocytes, which produce cytokines such as interleukins IL-4, IL-6, IL-10 and IL-13, promote the secretion of antibodies.
  • IL-2 interleukin-2
  • IFN ⁇ interferon ga ma
  • Th2 lymphocytes which produce cytokines such as interleukins IL-4, IL-6, IL-10 and IL-13, promote the secretion of antibodies.
  • Tri cells when re-stimulated by the antigen used for their mduction, proliferate only slightly, produce very high amounts of IL-10, very small amounts of IL-2, and do not produce LL-4.
  • activated Tri cells When activated Tri cells are grown in the presence of other CD4 + T cells they suppress proliferation of these cells in response to an antigen; this effect results from the secretion of cytokines, and in particular of IL-10, by the Tr lymphocytes, and not from a direct action of these on the CD4 + T cells; it can therefore be obtained without having to know the antigen responsible for the proliferation of these cells. This has an important advantage in the case of autoimmune diseases, the treatment of which can thus be envisaged without it being necessary to know the exact antigen against which the pathogenic cells are directed.
  • Tri inhibitory cells are capable not only of preventing, but also to cure these different pathologies.
  • Tri cells obtained from the T cells of a patient can therefore potentially be used in the context of cell therapy to regulate the immune response in this patient. They can thus be used in particular to prevent or treat, not only the autoimmune and inflammatory diseases mentioned above, but also any other pathology characterized by an aberrant inflammatory response, such as diabetes, psoriasis, atherosclerosis, rheumatoid arthritis or asthma; they can also be used in the treatment of transplant rejection or of the graft versus host reaction.
  • Tri lymphocytes which is described in the publication of an inventor (Groux et al, Nature, 389, 737-742, 1997), requires repeated stimulation of the T cells with the antigen in the presence of LL -10. This method is relatively cumbersome to implement, and does not make it possible to quickly obtain, from a patient, a population of Tri lymphocytes which can be used in the context of a therapeutic treatment.
  • the invention thus aims to obtain in vitro, or in vivo, active Tri cells.
  • the document Jonuleit H et al. (J Exp Med. 2000 Nov 6; 192 (9): 1213-22) relates to the analysis of the influence of the state of maturation of dendritic cells on the differentiation of T cells.
  • the document Akbari O et al. (Nat Immunol. 2001 Aug; 2 (8): 725-31) relates to pulmonary dendritic cells producing IL-10 and mediating tolerance induced by respiratory exposure to an antigen. According to the abstract, the pulmonary dendritic cells of mice exposed to a respiratory antigen produce transiently IL-10. These phenotypically mature pulmonary dendritic cells, which produce 1TL-10, stimulate the development of CD4 + Trl-like cells which also produce significant amounts of IL-10.
  • the document Khanna A et al. J Immunol. 2000 Feb 1; 164 (3): 1346-54) relates to the study of the effects of progenitors of liver-derived dendritic cells on the production of cytokine by Thl and Th2-like cells in vitro and in vivo.
  • Takayama T et al. (Transplantation. 1998 Dec 27; 66 (12): 1567-74) aims to study the effects of retroviral administration of viral IL-10 in myeloid dendritic cells.
  • the document Wakkach et al. (J hnmrinol. 2001 Sep 15; 167 (6): 3107-13) relates to the influence of the functional mechanism of 1TL-10 on the differentiation of Tri cells and the importance of the co-stimulatory role of CD-2 in tolerance induction through differentiation of Tri cells.
  • the document Wakkach et al. (Eur Cytokine Netw. 2000 Jun; l 1 (2): 153-60.
  • the inventors have succeeded in demonstrating that dendritic cells obtained from precursor cells of bone marrow, are capable of inducing the differentiation of T cells into Tri cells, and thus obtaining them in sufficient quantity for a therapeutic treatment.
  • the invention thus relates to a process for obtaining in vitro a population of human dendritic cells capable of inducing the differentiation of human T cells into Tri cells, from human progenitor cells capable of differentiate into dendritic cells comprising: the culture of said progenitor cells in the presence of IL-10
  • the invention also relates to a method of in vitro differentiation of human T cells into Tri cells, comprising: the implementation of the method of obtaining in vitro a population of dendritic cells capable of inducing the differentiation of T cells in Tri cells, to obtain a population of dendritic cells, bringing said T cells into contact with said population of dendritic cells.
  • the invention also relates to a method of in vitro differentiation of human T cells into Tri cells, comprising: obtaining a population of human dendritic cells from human progenitor cells capable of differentiating into dendritic cells by culturing said progenitor cells in the presence of IL-10, bringing said T cells into contact with said population of dendritic cells obtained in the preceding step.
  • an antigen is present during the second step.
  • said progenitor cells are cells originating from the bone marrow.
  • said progenitor cells come directly from the peripheral circulation.
  • the culture medium also comprises GM-CSF (granulocyte / macrophage colony stimulating factor, factor stimulating colonies of granulocytes-macrophages) and / or a cytokine chosen from mterleukin 4 (IL-4 ) or interleukin 13 (IL-13).
  • GM-CSF granulocyte / macrophage colony stimulating factor, factor stimulating colonies of granulocytes-macrophages
  • IL-4 mterleukin 4
  • IL-13 interleukin 13
  • GM-CSF 5 to 50 ng / ml
  • IL-4 or IL-13 2 to 5 ng / ml
  • IL-10 300 to 600 ng / ml.
  • the method according to the invention makes it possible to obtain a population of specific dendritic cells, which induce peripheral tolerance of the T cells. These dendritic cells have a phenotype different from the dendritic cells obtained by maturation of progenitor cells in the absence of IL- 10.
  • the method according to the invention can also be characterized in that more than 15%, preferably more than 20%, more preferably more than 22%, or 25% of the cells in said population of dendritic cells is MHC II -CD80- CD86 l0W .
  • a cell is called CMH II-CD80-CD86 low when it has a surface expression level of the MHC II, CD80 and CD86 molecules lower than the average surface expression level of the same molecules observed for dendritic cells obtained in vitro. by differentiation in the absence of IL-10.
  • a density of these molecules, at the surface of the cells 5 times less important in the cells according to the invention, preferably 10 times less than on the cells obtained in the absence of IL-10.
  • the method according to the invention also makes it possible to obtain a population of dendritic cells such that more than 15%, preferably more than 20%, more preferably more than 22%, or 25% of the cells in said population has a low expression level of CD1 le, CD1 lb, CD14, non-expression of CD4 and pT ⁇ (compared to cells matured in the absence of IL-10, when these molecules are present on DC).
  • the dendritic cells obtained by the method according to the invention have a plasmacytoid morphology, the low expression of MHC II molecules, and low levels of expression of costimulation molecules, even after activation in vitro with LPS.
  • the cells obtained secrete high levels of IL-10 after activation.
  • mice Experiments in mice have made it possible to determine that the DCs obtained in large number by the method according to the invention can be found in the spleen and the lymph nodes of normal mice, and that they are in increased quantity in the spleen of transgenic mice for 1T1-10 (ILIO-Tg).
  • mice are CD45 + RB hl and have a low level of expression of CDllc, CDllb, Dec205, an absence of CD ⁇ alpha and
  • CD45 + RB 111 dendritic cells are mature and stable (retaining the mature phenotype for at least three days when cultured in the absence of cytokines).
  • the method according to the invention makes it possible to obtain a sufficient number of mature dendritic cells allowing the in vitro differentiation of T cells into Tri cells.
  • the invention also relates to a population of mature or immature dendritic cells, capable of being obtained by a method according to the invention, characterized in that more than 15%, preferably more than 20%, more preferably more by 22%, or 25% of the cells have a surface expression level of MHC II, CD80 and CD86 molecules lower than the average surface expression level of the same molecules observed for dendritic cells obtained in vitro by differentiation into the absence of IL-10.
  • Said population is of course an isolated population of cells, that is to say that it is not in its natural environment.
  • the inventors have been able to observe that the dendritic cells having a low expression of the MHC II and CD 86 molecules do not evolve when they are stimulated with LPS (lippopolysaccharide).
  • LPS laippopolysaccharide
  • the addition of this molecule induces an increase in expression of the antigen presentation molecules and of the T cell co-stimulatory molecules for the dendritic cells obtained in the absence of IL-10, the dendritic cells obtained by the process according to the invention do not react.
  • the invention relates to a population of mature or immature dendritic cells, capable of being obtained by a method according to the invention, characterized in that more than 15%, preferably more than 20%, more preferably more than 22%, or 25% of the cells have a level of surface expression of the MHC II and CD86 molecules, after stimulation with LPS, lower than the average level of surface expression of the same molecules observed for dendritic cells obtained in vitro by differentiation in the absence of IL-10, and stimulated by LPS.
  • the invention relates to a population of immature or mature dendritic cells, characterized in that more than 15%, preferably more than 20%, more preferably more than 22%, or 25% cells have a surface expression level of MHC II and CD86 molecules lower than the average surface expression level of the same molecules observed for dendritic cells obtained in vitro by differentiation in the absence of IL-10.
  • the invention relates to a population of immature or mature dendritic cells, characterized in that more than 20% of the cells have a surface expression level of the MHC II, CD80 and CD86 molecules lower than the average surface expression level of the same molecules observed for dendritic cells obtained in vitro by differentiation in the absence of dTL-10.
  • the invention thus relates to a population of mature or immature dendritic cells, characterized in that more than 15%, preferably more than 20%, more preferably more than 22%, or 25% of the cells have a level of surface expression of MHC II and CD86 molecules, after stimulation by LPS, lower than the average surface expression level of the same molecules observed for dendritic cells obtained in vitro by differentiation in the absence of IL-10, and stimulated by the LPS.
  • the invention also relates to a process for obtaining in vitro sorting cells from T cells, characterized in that it comprises a step of bringing said T cells into contact with a population of dendritic cells according to the invention.
  • said cells are of human origin.
  • the invention also relates to the use of Tri cells obtained in vitro by a method according to the invention, for the preparation of a medicament intended for use in the treatment of an autoimmune or inflammatory disease.
  • autoimmune diseases are diseases in which an infiltration of mononuclear cells is observed, an proliferation of fibroblasts and new blood vessels, leading to an increase in connective tissues, and tissue destruction.
  • chronic inflammatory diseases of the intestine We note in particular chronic inflammatory diseases of the intestine.
  • the invention also relates to the use of a population of cells according to the invention, for the preparation of a medicament capable of inducing in vivo the differentiation of T cells into active Tri cells for the treatment of a disease autoimmune or inflammatory.
  • the invention relates to the use of a population of cells according to the invention, said cells being drawn with an antigen recognized by cells of the immune system, in particular T cells in a disease ⁇
  • autoimmune or inflammatory for the preparation of a medicament for treating said autoimmune or inflammatory disease.
  • a gliadin peptide can be used for Crohn's disease, an antigen from myelin for multiple sclerosis.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition containing the dendritic cells according to the invention, optionally with a pharmaceutically suitable excipient.
  • the invention relates to the administration of dendritic cells according to the invention to a patient in vivo so as to obtain differentiated Tri cells, for treating an autoimmune or inflammatory disease.
  • the invention thus also relates to a process for obtaining cells
  • Sorting in an in vivo patient comprising the administration of IL-10 to said patient, and optionally GM-CSF and TNF alpha, in an amount and for a duration sufficient to obtain low CMH II-CD80-CD86 dendritic cells capable of induce the differentiation of T cells into Tri cells.
  • the invention also relates to a method of treating an autoimmune or inflammatory disease comprising the step of administering to a patient dendritic cells according to the invention, or Tri cells obtained in vitro from dendritic cells according to the invention. 'invention.
  • FIGURES Figure 1 IL-10 induces the differentiation of CDllc , 0W CD45RB + dendritic cells
  • Bone marrow cells were cultured with GM-CSF and TNF- ⁇ in the presence or absence of IL-10 (50 or 500 ng / ml) as indicated for 6 days, then activated for 24 h with LPS.
  • the bone marrow dendritic cells thus generated were stained with a biotinylated anti-CDl 1c antibody, then with a streptavidin-peroxidase (PE) conjugate.
  • PE streptavidin-peroxidase
  • the cells were then conjugated to an anti-CD45RB antibody coupled to FITC and analyzed by flow cytometry. The data represent the results of one representative study in seven.
  • the dendritic cells were sorted according to the expression of CD1 lc and CD45RB, as indicated in FIG. 1A.
  • the sorted cells indicated were centrifuged and stained with May Gr ⁇ ndwald Giemsa.
  • 1 - CDllc low CD45RB + dendritic cells after 6 days of differentiation 2 - CDllc low CD45RB + dendritic cells after activation by LPS, 3 - CDllc hlgh CD45RB " dendritic cells after 6 days of differentiation, 4 - CDl lc hlgh CD45RB dendritic cells + after activation by the LPS.
  • the sorted cells were stained with the antibodies labeled with FITC indicated, and reanalyzed with FACS; they were also stimulated by LPS (1 ⁇ g / ml) for 24 h, stained with the indicated ACm and reanalyzed.
  • the hatched histograms represent the cells stained with control ACMs of the corresponding isotype. The data represent the results of one in three representative experiments.
  • Figure 2 Identification of dendritic cells derived from IL-10 in vivo.
  • a population of dendritic cells was also prepared - with a cocktail containing anti-CD3 and CD 19 mAbs and sorted according to the expression ⁇ e CD11c and B220.
  • the cells were stimulated with LPS or CpG for 24 or 48 h and the supernatant was analyzed as indicated, to measure the possible secretion of IFN- ⁇ or of il-10.
  • FIG. 4 CD11c lo CD45RB + dendritic cells induce the differentiation of regulatory cells Tri in vitro. A) CDllc low CD45RB + cells process and present the antigen in vitro
  • T cells DO11-10 CD4 + were stimulated with DC CDl lc ⁇ CD45RB " and CDl lc low CD45RB + sorted in the presence of OVA peptide (0.6 ⁇ M) or OVA protein (500 or 250 ⁇ g / ml as indicated).
  • OVA peptide 0.6 ⁇ M
  • OVA protein 500 or 250 ⁇ g / ml as indicated.
  • the proliferative response or the secretion of LFN- ⁇ was analyzed on D3 or 48 h after stimulation, respectively. The results represent the average of 3 measurements and are expressed in ng / ml for LFN- ⁇ . The data are representative of 2 separate experiments with similar results. 15
  • Transgenic DO11-10 OVA TCR "virgin” T cells were differentiated for 3 weeks with DCs sorted CDllc hlgh CD45RB “ (white bars) or CDllc low CD45RB + (black bars), in the presence of OVA peptide.
  • cytokines were analyzed by ELISA in the culture supernatants.
  • the results represent the average of 3 measurements and are expressed in ng / ml for IL-10 and LFN- ⁇ and in pg / ml for IL-4
  • the data are representative of 5 separate experiments with similar results.
  • the dendritic cells were obtained by culture of bone marrow cells in the presence of GM-CSF, TNF-c ⁇ and IL-10. They were then sorted into two subsets: CDllc high CD45RB " and CDllc low CD45RB + .
  • the sorted dendritic cells were used to differentiate "virgin" CD4 + DO11-10 T cells, in a DC / T ratio of 1/20, in the presence of OV ⁇ peptide (0.6 ⁇ M).
  • T cells were harvested and stimulated with irradiated splenic APC and OVA peptide (0.3 ⁇ M) Forty-eight hours later, cytokines were analyzed by ELISA in the culture supernatants. The results represent the average of 3 measurements and are expressed in ng / ml. The data are representative of two separate experiments with similar results.
  • CD4 + T cells isolated from normal BALB / c mice were stimulated with irradiated BALB / c splenocytes and anti-CD3 mAbs (white bars).
  • CD4 + T cells differentiated by a single stimulation with CDl lc l ⁇ w CD45RB + or CDl lc H CD45RB " dendritic cells were stimulated by the OVA peptide and irradiated splenocytes.
  • CD4 + T cells isolated from C57B1 / 6 mice were differentiated with a soluble anti-CD3 ACm and sorted CDl lc l0W CD45RB + dendritic cells isolated from IL-10 "7" or C57B1 / 6 mice. After one week, the cells were harvested and stimulated with C57B1 / 6 splenocytes 17
  • CDllc low CD45RB + or CDllc ⁇ dendritic cells sorted isolated from normal BALB / c mice were loaded in vitro with OVA peptide and injected intravenously into mice previously reconstituted with T cells specific for OVA peptide.
  • A proliferative response
  • B production of cytokines
  • the proliferative response was measured by incorporation of H-thymidine during the last 12 hours of a 72 h culture.
  • the results represent the means of 3 measurements and are expressed in ng / ml. The data are representative of three separate experiments with similar results.
  • Figure 6 CDllc 10W CD45RB + dendritic cells induce tolerance in vivo
  • CDl lc low CD45RB + or CDllc ⁇ sorted dendritic cells isolated from normal BALB / c mice or differentiated in vitro as indicated, were loaded in vitro with OVA peptide and injected intravenously into mice previously reconstituted with T cells specific to the OVA peptide. A week later, the animals were immunized with OVA / alum, TT / alum or OV A / CFA, with a "booster" injection two weeks later. The analyzes were carried out four weeks after the first information.
  • mice were treated with CD11c low CD45RB + dendritic cells pulsed with OVA peptide. As a control, some mice received "virgin” T cells alone. One week after reconstitution, purified spleen CD4 + T cells from the reconstituted mice were transferred for adoption to normal BALB / c mice. As indicated, the animals not treated or having received the purified CD4 + T cells were then immunized with OVA alum. A "booster" injection was given two weeks later and the mice were analyzed four weeks after the first immunization.
  • T and B cells from peripheral blood mononuclear cells were removed with antibodies and magnetic beads and the remaining population was analyzed for expression of CD1 lc and CD4 by cytometry.
  • the squares represent the two populations defined as DCl and DC2 by "Siegal et al, 1999, Science, 281, 1835-7".
  • a square shows the population of tolerogenic CD (CDT).
  • CD34 + progenitor cells were differentiated in vitro with GM-CSF (800 U / ml) and 1TL-4 (1000 U / ml) in the presence or absence of IL-10
  • TDC and DCl cells were linked by FACS according to the expression of CDl lc and analyzed by cytofluorometry for the expression of HLA-DR, CD80 and CD86. The results show that TDCs express lower levels of these molecules than DCl cells.
  • TDC and DCl cells were sorted by FACS according to the expression of CD1 le and stimulated " by LPS for 24 h. The supernatants were then analyzed by ELISA for the presence of IL-10 and of IL- 12.
  • Figure 9 TDCs induce the differentiation of Tri cells secreting high levels of IL ⁇ l0
  • the T cells were harvested and stimulated with irradiated PBMCs, and an anti-CD3 monoclonal antibody (10 ⁇ g / ml). After 48 hours, the cytokines in the culture supernatants were analyzed by
  • CD4 + T cells In the lower compartment of a transwell system, purified human CD4 + T cells were stimulated by irradiated PBMCs and an anti-CD3 monoclonal anticoprs (white columns). In the upper compartment, CD4 + T cells differentiated with allogeneic TDC or DCl cells as indicated were stimulated with irradiated allogenic PBMCs. The coculture experiments were also carried out in the presence of mouse monoclonal antibody blocking anti-IL-10 (10 ⁇ g / ml) (chopped columns), monoclonal anti-TGF- ⁇ antibody (40 ⁇ g / ml) (columns black) or both (gray columns). After three days, the container was recovered and the proliferative response of the CD4 + T cells was measured by adding 0.5 ⁇ Ci of 3 H-thymidine during the last 12 hours of the 72 h culture.
  • BALB / cAnN mice were obtained from CERJ (Le Genest Saint Isle, France), DO11-10 homozygous mice were generously given to us by Dr. S. D. Hurst (DNAX Research Institute, Palo Alto, CA).
  • the BALB / c IL-10 transgenic mice were obtained using the hIL-10 cDNA under the control of the MHC class II promoter10 Ea. All the animals were bred under the usual aseptic conditions, in our pet shop. All mice were females 4 to 8 weeks old at the start of each experiment. Medium, antibodies and reagents
  • the medium used for the T cell cultures was Yssel medium (Yssel et al., 1984).
  • the dendritic cells were cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% of S VF (Roche, Meylan, France), 2 mM of L-glutamine, 1% of sodium pyruvate, 2 x 10 "5 M of 32-mercaptoethanol ( All of Invitrogen).
  • S VF SVF
  • 2 mM of L-glutamine 1% of sodium pyruvate
  • 2 x 10 "5 M of 32-mercaptoethanol All of Invitrogen.
  • HBSS medium without Ca "4" and Mg 4 "4- containing 2 mM of EDTA (all of Invitrogen) and collagenase D (Roche, Meylan, France).
  • mice GM-CSF, TNF- ⁇ and IFN- ⁇ came from R&D Systems, Abington, UK.
  • Recombinant mouse IL-10 and IL-4 were generously donated by Dr. R. L. Coffman, DNAX Research Institute, Palo Alto, CA.
  • the purification and the characterization of the DCs were carried out using anti-CD3 (17A2), anti-CD4 (GK1.5) anti-CD8 (53-6.7), anti-CD1 lb (Ml / 70), anti -CDllc (HL3), CD28 (37.51) anti-I-Ad (AMS-32.1), anti-CD62L (Mel-14), anti-CD80 (16-10A1), anti-CD86 (GL1), anti-B220 ( RA3-6B2), CD45RB (16A), anti-Grl (RB6-8C5) (All from Pharmingen Becton Dickinson) and DEC-205 (NLDC-145) (Serotec, UK.).
  • PE or -FITC 11B11
  • anti-IFN- ⁇ -PE XGM1.2
  • anti-IL-10-FITC JES-16E3
  • anti-IL-4 11B11
  • anti-IL-10 (2A5 ) purified anti-IFN- ⁇ (XGM1.2) and anti-IL-4
  • anti-IgE R35-72
  • anti-IgG1 A85-1 antibodies used for the analysis of OVA-specific serum IgGs were from Pharmingen Becton Dickinson.
  • the lysis buffer, metrizamide, LPS, peptide OVA 323.339 , ovalbumin and alum were from Sigma, Saint Quentin Fallavier, France. Flow cytometry
  • Phenotypic analysis of the DC subsets was performed by double or triple staining with biotinylated anti-CD11c antibodies, followed by streptavidin-Cy-Chromium, anti-CD45RB coupled to PE and a third antibody coupled at FITC. All the staining steps were carried out at 4 ° C. in PBS buffer with 0.1% BSA and 0.02 mM NaN3. After three washes, the labeled cells were analyzed on a FACScan (Becton Dickinson).
  • mAbs anti-IL-4-FITC or -PE, anti-IFN- ⁇ -PE and anti-IL-10-FITC, or control antibodies of corresponding isotype, all at 5 ⁇ g / ml.
  • the samples were analyzed on a FACScan (Becton Dickinson).
  • Dendritic cells derived from bone marrow (DC-MO) DC-MO were generated from spinal progenitors, as previously described, with some modifications (Inaba et al., 1992). In short, the bone marrow was extracted by rinsing the shins and femurs before removing the red blood cells with 0.83% ammonium chloride.
  • the cells were cultured at 37 ° C., on 24-well plates (Becton Dickinson) (10 6 cells / ml / well), in complete RPMI medium supplemented with 10 ng / ml of recombinant murine GM-CSF and 2, 5 ng / ml of recombinant murine TNF- ⁇ , with or without murine recombinant IL-10 (500 ng / ml).
  • the DC-MOs were harvested on D6. Purification of spleen dendritic cells
  • Spleens were cut into small fragments which were digested with collagenase D (1 mg / ml) in HBSS for 20 min at 37 ° C., with constant stirring.
  • the digested fragments were filtered on a .0.7 ⁇ m grid (Becton-
  • CD4 + T cells were enriched by negative selection by means of magnetic beads with a mixture of anti-CD8, anti-B220 and anti-CD1 lb mAbs.
  • the CD4 + / Mell4 ⁇ ght T cells were then sorted by flow cytometry using 23
  • TCR transgenic T cells were sorted T cell populations typically 99% positive for the two markers.
  • Differentiation of TCR transgenic T cells by dendritic cells The in vitro T cell differentiation tests were carried out in Yssel medium. The primary stimulation cultures were established by activating purified CD4 + T cells (2.5 ⁇ 10 5 ) by populations of sorted dendritic cells, pulsed with the peptide OVA 323-339 (0.6 ⁇ M ) in a total volume of 1 ml, on 24-well plates (Becton Dickinson).
  • the cells were multiplied, harvested on D7, washed three times, counted and restimulated by populations of freshly sorted dendritic cells + 0.3 ⁇ M of peptide OVA 323.339 for the second differentiation. The same procedure was applied for the third differentiation cycle. After differentiation, the T cells were harvested, washed and restimulated with 0.3 ⁇ M of OVA 323-339 and irradiated spleen CPA. T cell proliferation was measured by the incorporation of 3 H-thymidine during the last 12 hours of the 72 h incubation. The production of IL-4, IL-10 and LFN- ⁇ was measured by ELISA in the supernatants collected 48 h after the restimulation of the T cells. Transwell experiments
  • CD4 + T cells isolated from normal BALB / c mice were stimulated with 10 6 irradiated splenocytes from BALB / c mice and anti-CD3 mAbs (10 ⁇ g / ml).
  • CD4 + T cells differentiated by a single stimulation with dendritic cells were stimulated with 0.3 ⁇ M of OVAp and 10 6 irradiated splenocytes.
  • the basket was removed and the T cells from the lower wells were transferred (in triplicate) to 96-well plates. The proliferative response was analyzed by the incorporation of 3 H-1hymidine during the last 12 hours of culture. Cytology
  • CDl lc l0W CD45RB + and CDl lc high CD45RB " sorted, generated in vitro or isolated from spleens of BALB / c mice, were incubated for 24 h with LPS (1 ⁇ g / ml) in the presence of GM-CSF ( 10 ng / ml)
  • the freshly sorted or stimulated DCs were centrifuged (Cytospin2, Shandon) and stained with May-Gr ⁇ nwald-Giemsa.
  • RNA of the sorted DC subsets (1 ⁇ 10; purity> 99%) was prepared with TRIZOL (Life Technologies), as described elsewhere (Cottrez et al., 1994), and any possible trace of Contaminating chromosomal DNA was digested with DNase I, following the manufacturer's instructions (Gene Hunter, Nashville, TX). Then the RNA was reverse transcribed with an oligo (dT) 12-18 and the reverse transcriptase Superscript II (Life Technologies), as described elsewhere (Cottrez et al., 1994).
  • Quantitative real-time PCR was performed with the SYBR Green PCR Core Reagents Kit, on special 96-well microtiter plates (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France) in an ABI PRISM 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) , following the manufacturer's instructions.
  • the fluorescence signals were generated during each PCR cycle by direct incorporation of SYBR Green into the double-stranded DNA chain, to give quantitative information in real time.
  • Primers (MWG Biotech, Ebersberg, Germany) encompassing exon-intron junctions were designed to avoid amplification of genomic DNA and to give amplicons of 100 to 150 bp, in order to increase the efficiency of amplification by PCR.
  • All primers were used under conditions which avoided the formation of dimers, and the fidelity of the amplification products was checked by electrophoresis and enzyme restriction maps. All the cDNAs were titrated on the value of the average expression of 4 different ordinary genes (housekeeping).
  • the experimental conditions of the PCR were as follows: 10 min at 94 ° C, and 40 cycles of 30 s at 94 ° C, 30 s at 60 ° C and 30 s at 72 ° C for each amplification, in a final volume of 20 ⁇ l.
  • the expression of the target genes was measured, after normalization of the RNA concentrations, with the 4 ordinary genes and the values are expressed as factors of increase in the expression compared to a negative control.
  • mice were immunized by intraperitoneal injection, on D7, of 50 ⁇ g of OVA / alum per animal. Two weeks later, a "booster" was carried out by injecting 25 ⁇ g of OVA / alum per animal.
  • DC-induced tolerance was analyzed based on the proliferation and secretion of purified spleen CD4 + T cell cytokines stimulated by irradiated splenocytes (2500 rad) and OVA (250 ⁇ g / ml) or the peptide OVA 323.339 ( 0.3 ⁇ M).
  • Anti-OVA antibodies were measured by ELISA on the sera collected each week after the first immunization. Transfer of tolerance
  • the spleen CD4 + T cells from control or tolerated mice were purified by negative depletion with magnetic beads. Then, 10 6 cells were transferred intravenously into normal BALB / c mice. These were then immunized with OV A / alum as described above. The levels of anti-OVA antibodies, the proliferation of spleen T cells and the secretion of cytokines were analyzed as above. Cytokine assays
  • IL-4, IL-10 and LFN- ⁇ were assayed by a sandwich ELISA method, as described elsewhere (Cottrez et al., 2000).
  • ELISA plates (Polylabo, France) were covered with appropriate anti-cytokine mAbs in carbonate buffer and incubated at 4 ° C overnight. The reactions were blocked for 30 min at room temperature with 150 ⁇ l of 20% PBS / FCS in each well; 50 ⁇ l of diluted supernatants of CD4 + T cells stimulated in vitro were then added to the wells, before incubating the plates at 4 ° C. overnight. After a washing step, 50 ⁇ l of the biotinylated antibody from the second step was added to each well.
  • the plates were incubated for 1 h at room temperature and washed.
  • the enzyme conjugate (streptavidin-peroxidase) was then added to each well.
  • the plates were incubated at room temperature for 1 h, washed, and 100 ⁇ l of substrate (ABTS, 1 mg / ml) were added per well.
  • the plates were read on an ELISA reader at 405 nm, after color formation (Labsystems iEMS reader, Helsinki, Finland).
  • the anti-OVA IgE level was measured by two-stage sandwich ELISA, as described (Cottrez et al., 2000). The sera were added, at various dilutions, to the wells coated with anti-IgE ACm (R35-72, Becton Dickinson, Mountain View, CA). The OVA-specific IgEs were revealed by OVA coupled to digoxigenin (prepared according to the manufacturer's instructions, Roche) and the Fab-anti-digoxigenin fragment coupled to peroxidase (Roche). After a final incubation of 1 h, 50 ⁇ l of substrate were added to each well. Analysis of anti-OVA serum IgGl The ELISA plates were incubated overnight at 4 ° C.
  • Example 2 IL-10 induces the differentiation of a distinct subset of PC.
  • IL-10 induces the differentiation of Tri cells by an indirect effect (Wakkach et al., 2001). Since DCs are essential actors in the differentiation of T cells, we analyzed the effect of IL-10 on the differentiation of DCs from progenitor cells from bone marrow cultured in the presence of GM-CSF and of TNF-c (preliminary experiments have shown that the presence of TNF-o; does not influence the phenotype and the function of DCs, but nevertheless helps to increase the yield and the viability of dendritic cell populations [data not shown] ). The addition of IL-10 on day 0 of the culture induced the differentiation of a population of DC with a low expression of CD11c and a high expression of CD45RB (FIG. 1A). On the other hand, in the absence of IL-10, the addition of GM-CSF and TNF- ⁇ induced the differentiation of 27
  • Example 3 Isolation of the Natural Equivalent of PCs Derived from IL-10
  • IL-10 Isolation of the Natural Equivalent of PCs Derived from IL-10
  • FIG. 2A Enriched spleen DC isolated from non-transgenic Tg IL-10 mice or BALB / c mice were analyzed for the expression of the specific marker for murine DC CD11c (FIG. 2A).
  • Tg IL-10 mice we observed a greater number of DCs weakly expressing CDl lc compared to normal BALB / c mice (FIG. 2 A) or to non-transgenic controls (data not shown).
  • the CD1 lc low spleen DCs strongly expressed the CD45RB marker (FIG. 2B). Furthermore, the DCs derived in vitro and the CDl lc 0W CD45RB + splenic DCs both have a plasmocytoid morphology (FIG. 2C-1), in contrast to the CD CD11c ⁇ gh which have small dendrites (FIG. 2C-3). After complete maturation with LPS, the two populations of spleen DC differ in fully mature DC with long dendrites ( Figures 2C-2 and 4). 28
  • CD CDc low CD45RB + represents a distinct subset of DC and the product of a separate developmental line, or if they represent an immature stage of more conventional DC
  • GM-CSF to increase lifespan and recovery rate
  • DC CDl lc low CD45RB + weakly express CDllb and DEC 205 and not CD8 ⁇ at all, which suggests that they do not belong to the "classic" line of myeloid (CDl lb ⁇ ) or lymphoid (CDSot) ) (Shortinan and Liu, 2002). Furthermore, - unlike a population of tolerogenic DC recently described differentiated from a B cell precursor, DC CDl lc lo CD45RB + are negative in B220 (Lu and 29
  • CD11c low CD45RB + was observed after a single stimulation, as shown by the intracytoplasmic analysis of the secretion of cytokines in the different subpopulations of T cells (FIG. 4C).
  • CD CDc low CD45RB + To analyze the functional properties of T cells obtained after a single stimulation by CD CDc low CD45RB + , transwell experiments were carried out. The T cells obtained after stimulation with CD CDc low CD45RB + DCs from BALB / c mice inhibited the proliferation of waiting CD4 + T cells (bystander) stimulated by irradiated splenocytes and an anti-CD3 monoclonal antibody (FIG. 4D).
  • FIG. 5 shows that the injection of DC CD11c 10W CD45RB + in BALB / c mice induces in vivo differentiation of Tri OVAp-specific cells. These cells were characterized by low 31
  • CD CD lc low CD45RB + or CDl lc 1 " ⁇ sorted, isolated from the spleen of BALB / c mice or obtained by differentiation in vitro, were pulsed with OVA peptide and injected into BALB / c mice with reconstituted T cells OVA- specific "virgin". A week later, the induction of tolerance was caused by two immunizations, 15 days apart, with the whole ovalbumin molecule in alum.
  • mice treated with ovalbumin in alum resulted in a Th2 response, with high secretion of IL-4 and low secretion of dTFN- ⁇ .
  • mice treated with DC CD11c Iow CD45RB + T cells secreted small amounts of LFN- ⁇ and IL-4 and a little EL-10.
  • mice treated with DC CDllc 1 " 211 differentiated in vitro and exhibited a Th1 response, with a predominant secretion of IFN- ⁇ .
  • Dendritic cells were differentiated from CD34 + progenitor cells with GM-CSF and 1TL-4 in the presence or absence of IL-10, as indicated. After 6 days, the dendritic cells were sorted according to the expression of CD1 le and labeled with the indicated antibodies.
  • the purified cells were also stimulated with LPS for 24 hours, then analyzed by cytofluorometry. 33
  • Tolerogenic dendritic cells differentiated in the presence of IL-10 expressed low levels of CD11c, and low levels of HLA-DR, CD80 and CD86 molecules.

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Abstract

L'invention concerne de nouvelles cellules dendritiques humaines, et un procédé d'obtention de cellules Trl à partir de cellules T grâce à ces cellules dendritiques spécialisées.

Description

PROCEDE D'OBTENTION DE CELLULES DENTRITIQUES ET DE CELLULES T REGULATRICES
L'invention concerne un procédé d'obtention de cellules Tri à partir de cellules T grâce à des cellules dendritiques spécialisées, qui sont également objets de l'invention.
L'induction d'une tolérance spécifique est cruciale pour le maintien de l'homéostasie immunitaire et la prévention des réactions auto-immunes. Il existe plusieurs mécanismes non redondants et non exclusifs par lesquels le système inMnunitaire distingue le soi du non-soi ou les antigènes étrangers banals des antigènes nocifs.
Dans le thymμs, la tolérance centrale est un mécanisme bien établi qui implique une délétion des cellules T autoréactives après interaction avec des cellules dendritiques (DC) dérivées de la moelle osseuse.
A la périphérie, les mécanismes impliqués sont l'induction de la mort cellulaire, le développement d'un état de non-réactivité (anergie) des cellules T, et une suppression active par les cellules T régulatrices (Tr) (Groux et al., 1997, Nature 389, 737-742). Toutefois, les mécanismes par lesquels les cellules Tr se forment in vivo et exercent leurs effets immunorégulateurs restent à définir et font l'objet d'intenses recherches.
Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules présentatrices d'antigènes (CPA) "professionnelles", spécialisées dans la capture, le traitement et le transport de l'antigène vers les organes lymphoïdes, où elles sensibilisent les cellules T spécifiques "naïves" (n'ayant jamais rencontré l'antigène). Les DC ont également un rôle important dans le contrôle de la réponse immune adaptive, étant donné que des sous-ensembles distincts de DC, selon leur phénotype et leur maturation fonctionnelle, induisent des réponses Th différentes. Elles sont capables d'activer des cellules auxiliaires CD4+ et des cellules tueuses CD 8+ in vivo.
Toutefois, compte tenu de la diversité des DC localisées au sein d'un même organe lymphoïde, l'on ne sait toutefois pas quelles sont les populations de DC qui sont capables d'induire ou de participer au mécanisme de tolérance immunitaire. Les inventeurs ont précédemment montré que les cellules T CD4+ humaines et murines, stimulées de façon réitérée en présence d'IL-10, se différencient en un nouveau sous-ensemble de cellules T CD4+, appelées cellules Tri (T regulatory 1) (WO 97/42324). Ces cellules T ont une faible réponse proliférative, sont fortement sécrétrices d'IL-10 et régulent les réponses Thl et Th2 in vitro et in vivo. Ces cellules Tri sont particulièrement intéressantes pour le traitement de maladies autoimmunes et/ou mflammatoires, lorsque l'on désire moduler le système immunitaire.
Les maladies auto-immunes sont dues à une dérégulation du système immunitaire, qui se traduit par une réponse iirrmune indésirable d'un organisme vis- à-vis de ses propres antigènes. On a tenté de manipuler les antigènes à l'origine de ces pathologies ou les cellules T agressives spécifiques de ces antigènes, mais les résultats obtenus ont souvent été très limités notamment par l'absence d'une connaissance de tous les antigènes impliqués dans la pathologie concernée. En effet, les auto antigènes proprement dits, ou les antigènes responsables des désordres inflammatoires et auto-immuns ne sont pas toujours connus, . ou peuvent être différents d'un individu à l'autre (part de l'héritage génétique).
Les traitements utilisés actuellement dans ces maladies sont soit des traitements palliatifs (insuline dans le cas du diabète, anti-histaminique dans le cas des désordres allergiques) soit des traitements systémiques par des antiinflammatoires (ALNS) et/ou des immunosuppresseurs (glucocorticoïdes, cyclosporine, anticorps...). Il y a donc clairement un besoin pour un traitement immunosuppresseur puissant mais limité à l'organe atteint ou plus précisément à la zone d'hyperactivité du système immunitaire.
Parmi les nombreux agents impliqués dans la régulation de la réponse immune, on citera les lymphocytes T CD4+, également dénommés lymphocytes T auxiliaires (T helpers). On distingue classiquement 2 types principaux de lymphocytes T auxiliaires: les lymphocytes Thl, impliqués dans le développement de la réponse i mune cellulaire, produisent des cytokines pro-inflammatoires telles que l'interleukine-2 (IL-2) et l'interféron ga ma (IFNγ) et présentent des effets activateurs des macrophages; les lymphocytes Th2, qui produisent des cytokines telles que les interleukines IL-4, IL-6, IL- 10 et IL-13, favorisent la sécrétion d'anticorps.
Les cellules Tri, lorsqu'elles sont re-stimulées par l'antigène utilisé pour leur mduction, ne prolifèrent que faiblement, produisent des quantités très élevées d'IL-10, de très faibles quantités d'LL-2, et ne produisent pas d'LL-4. Lorsque des cellules Tri activées sont cultivées en présence d'autres cellules T CD4+ elles suppriment la prolifération de celles-ci en réponse à un antigène; cet effet résulte de la sécrétion de cytokines, et notamment d'IL-10, par les lymphocytes Tr, et non d'une action directe de ceux-ci sur les cellules T CD4+ ; il peut donc être obtenu sans avoir à connaître l'antigène responsable de la prolifération de ces cellules. Ceci présente un avantage important dans le cas de maladies auto-immunes, dont on peut ainsi envisager le traitement sans qu'il soit nécessaire de connaître l'antigène exact contre lequel sont dirigées les cellules pathogéniques. II a ainsi été observé, dans un modèle expérimental de maladie de Crohn chez la souris dans lequel les cellules pro-inflammatoires sont dirigées contre des bactéries commensales de la flore digestive, que l'administration aux animaux des cellules Tri dirigées contre l'ovalbumine, accompagnée de l'administration d'ovalbumine dans la nourriture, permettait de prévenir l'instauration d'une inflammation chronique du colon.
D'autre part, dans des travaux sur différents modèles animaux de maladie de Crohn, de sclérose en plaques, ou de réaction du greffon contre l'hôte, les inventeurs ont montré que les cellules inhibitrices Tri étaient capables non seulement de prévenir, mais aussi de guérir ces différentes pathologies. Des cellules Tri obtenues à partir des cellules T d'un patient sont donc potentiellement utilisables dans le cadre d'une thérapie cellulaire pour réguler la réponse immunitaire chez ce patient. Elles sont ainsi utilisables notamment pour prévenir ou soigner, non seulement les maladies auto-immunes et inflammatoires mentionnées ci-dessus, mais également toute autre pathologie caractérisée par une réponse inflammatoire aberrante, comme le diabète, le psoriasis, l'athérosclérose, la polyarthrite rhumatoïde ou l'asthme; elles sont également utilisables dans le traitement des rejets de greffe ou de la réaction du greffon contre l'hôte. Ainsi, parmi les maladies auto-immunes dans lesquelles des cellules Tri peuvent être utilisées, on cite les maladies choisies dans le groupe constitué de l'hépatite active chronique, la maladie d'Addison, le syndrome anti-phospholipide, l'allergie atopique, la gastrite atrophique auto-immune, l'achlorhydrie auto- immune, la maladie céliaque, la maladie de Crohn, le syndrome de Cushings, la dermatomyosite , le diabète de type I, le lupus discoïde, l'érythématose, le syndrome de Goodpasture, la maladie de Grave, la thyroïdite d'Hashimoto, l'atrophie adrénale idiopathique, le diabète insulinodépendant, le syndrome de Lambert-Eaton, l'hépatite lupoïde, certains cas de lymphopénie, la sclérose en plaques, le pemphigus vulgaris ou foliacé, le pemphigoïde bulleux, l'anémie pernicieuse, l'uvéitite phacogénique, la polyarthrite, la cirrhose biliaire primaire, la cholangite sclérosante primaire, le psoriasis, le syndrome de Reiter, la polychondrite, rarthrite rhumatoïde, le syndrome de Schmidt, la sclérodermose, le syndrome de Sjogren, le Lupus Erythémateux Systémique, l'artérite de Takayasu, l'artérite temporaire, la thyrotoxicose, la résistance à l'insuline de type B , la colite ulcérative, la granulomatose de Wegener, la myasthénie gravis, la maladie de Guillain-Barré, l'uréite auto-immune, l'anémie auto-immune hémolytique, la thrombocytopénie auto-immune, l'oophorite auto-immune, la maladie de Behcet, la dermatite he étiforme, la polymyosite, la dermatomyosite, les spondyloarthropathies comme la spondylite ahkylosante, le vitiligo.
La méthode d'obtention des lymphocytes Tri qui est décrite dans la publication d'un inventeur (Groux et al, Nature, 389, 737-742, 1997), nécessite une stimulation répétée des cellules T avec l'antigène en présence d'LL-10. Cette méthode est relativement lourde à mettre en oeuvre, et ne permet pas d'obtenir rapidement, à partir d'un patient, une population de lymphocytes Tri utilisable dans le cadre d'un traitement thérapeutique.
On recherche ainsi toujours des procédés d'obtention de cellules Tri en quantité importante des cellules Tri. L'invention vise ainsi à obtenir in vitro, ou in vivo, des cellules Tri actives.
On connaît différents procédés d'obtention de cellules dendritiques à partir de moelle osseuse. Par exemple le brevet US 5,851,756 décrit l'obtention de cellules dendritiques à partir de cellules précurseurs en présence de GM-CSF, de M- CSF, de TNF-alpha, d'IL3, d'IL-1 alpha, d'IL-6. Mais cette demande ne décrit ni ne suggère la capacité de certaines CD à induire la différenciation de cellules T en cellules Tri .
Le document Steinbrink K et al. (J Immunol. 1997 Nov 15;159(10):4772-80) a pour objet l'étude de l'effet de l'interleukine 10 (IL- 10) sur les cellules dendritiques matures ou immatures. L'abrégé précise que les résultats obtenus dans cette étude laissent suggérer que 1TL-10 convertit les cellules dendritiques immatures en cellules présentatrices d'antigènes, tolérogènes, qui peuvent être un outil utile dans la thérapie de patients présentant des maladies allergiques ou auto- immunes.
Le document Enk A Het et al. (J Immunol. 1993 Sep l;151(5):2390-8) est relatif à l'étude de l'inhibition de la fonction des cellules de Langherans présentatrices d' antigènes par 1TL- 10.
Le document Jonuleit H et al. (J Exp Med. 2000 Nov 6;192(9):1213-22) a pour objet l'analyse de l'influence de l'état de maturation de cellules dendritiques sur la différenciation de cellules T.
Le document Akbari O et al. (Nat Immunol. 2001 Aug;2(8):725-31) est relatif à des cellules dendritiques pulmonaires productrices d'IL-10 et médiatrices de la tolérance induites par une exposition respiratoire à un antigène. .D'après l'abrégé, les cellules dendritiques pulmonaires des souris exposées à un antigène respiratoire produisent de manière transitoire l'IL-lO. Ces cellules dendritiques pulmonaires phénotypiquement matures, qui produisent de 1TL-10, stimulent le développement de cellules CD4+ Trl-like qui produisent également des quantités importantes d'IL-10. Le document Khanna A et al. ( J Immunol. 2000 Feb 1;164(3): 1346-54) est relatif à l'étude des effets des progéniteurs des cellules dendritiques dérivés du foie sur la production de cytokine par les cellules de Thl et Th2-like in vitro et in vivo.
Le document Takayama T et al. (Transplantation. 1998 Dec 27;66(12):1567- 74) a pour objet l'étude des effets de radrninistration rétrovirale d'IL-10 virale dans les cellules dendritiques myéloïdes.
La demande de brevet interantionale publiée le 21 novembre 2002 sous le numéro WO 02/092793 (Cottrez Françoise ; INSERM ; Wakkach Abdelilah) a pour objet un procédé de préparation de lymphocytes Tri régulateurs spécifiques d'antigène dans lequel les cellules T CD4+ sont mises en culture en présence d'un antigène inducteur et de cellules présentatrices exprimant une molécule du CMHI, une molécule de LFA-3 humain, lesdites cellules présentatrices d'antigène artificiel n'exprimant aucune des molécules de co-stimulation B7-1, B7-2, B7-H1, CD40, CD23 ou ICAM-l.
Le document Wakkach et al. (J hnmrinol. 2001 Sep 15;167(6):3107-13) est relatif à l'émde du mécanisme fonctionnel de 1TL-10 sur la différenciation de cellules Tri et l'importance du rôle co-stimulatoire de CD-2 dans l'induction de la tolérance à travers la différenciation des cellules Tri. Le document Wakkach et al. (Eur Cytokine Netw. 2000 Jun;l 1(2): 153-60.
Review) est une revue qui a trait aux différentes fonctions de l'fl-10.
Le document Lu et al.( J Immunol. 2001 Jun 15;166(12):7042-52) a trait à une population de cellules dendritiques DEC205+B220+CD-19" dérivées du foie qui induisent la différenciation en cellules Tri et l'apoptose de cellules T activées.
De manière surprenante et avantageuse, les inventeurs ont réussi à démontrer que des cellules dendritiques obtenues à partir de cellules précurseurs de moelle osseuse, sont capables d'induire la différenciation de cellules T en cellules Tri, et de les obtenir ainsi en quantité suffisante pour un traitement thérapeutique. Ainsi, selon un premier aspect, l'invention concerne ainsi un procédé d'obtention in vitro d'une population de cellules dendritiques humaines capables d'induire la différenciation de cellules T humaines en cellules Tri, à partir de cellules progénitrices humaines capables de se différencier en cellules dendritiques comprenant : la culture desdites cellules progénitrices en présence d'IL-10
(interleukine 10), pour obtenir ladite population de cellules dendritiques. L'invention se rapporte également à un procédé de différentiation in vitro de cellules T humaines en cellules Tri, comprenant : la mise en œuvre du procédé d'obtention in vitro d'une population de cellules dendritiques capables d'induire la différenciation de cellules T en cellules Tri, pour obtenir une population de cellules dendritiques, la mise en présence desdites cellules T avec ladite population de cellules dendritiques. L'invention se rapporte encore à un procédé de différentiation in vitro de cellules T humaines en cellules Tri, comprenant : l'obtention d'une population de cellules dendritiques humaines à partir de cellules progénitrices humaines capables de se différencier en cellules dendritiques par mise en culture desdites cellules progénitrices en présence d' IL- 10, la mise en présence desdites cellules T avec ladite population de cellules dendritiques obtenue à l'étape précédente. De préférence, un antigène est présent lors de la seconde étape. De préférence, lesdites cellules progénitrices sont des cellules issues de la moelle osseuse. L'homme du métier connaît les protocoles permettant d'isoler des cellules progénitrices de cellules dendritiques de la moelle osseuse, et on peut notamment se référer à Inaba et al. (1992, J Exp Med 776', 1693).
Dans un autre mode de réalisation, lesdites cellules progénitrices sont directement issues de la circulation périphérique.
Dans un mode préféré de réalisation, le milieu de culture comprend en outre du GM-CSF (granulocyte/macrophage colony stimulating factor, facteur stimulateur de colonies de granulocytes-macrophages) et/ou une cytokine choisie parmi l'mterleukine 4 (IL-4) ou l'interleukine 13 (IL-13). Dans un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, le milieu de culture comprend les quantités suivantes de facteurs de croissance :
GM-CSF : 5 à 50 ng/ml, IL-4 ou IL-13 : 2 à 5 ng/ml, IL-10 : 300 à 600 ng/ml. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir une population de cellules dendritiques spécifiques, qui induisent une tolérance périphérique des cellules T. Ces cellules dendritiques présentent un phénotype différent des cellules dendritiques obtenues par maturation de cellules progénitrices en l'absence d'IL-10. Ainsi, le procédé selon l'invention peut également être caractérisé en ce que plus de 15 %, de préférence plus de 20 %, de façon plus préférée plus de 22 %, ou 25 % des cellules dans ladite population de cellules dendritiques est CMH II-CD80- CD86l0W. Une cellule est dite CMH II-CD80-CD86low lorsqu'elle présente un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II, de CD80 et CD86 inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10. On envisage en particulier une densité de ces molécules, à la surface des cellules, 5 fois moins importantes chez les cellules selon l'invention, de façon préférée 10 fois moins importante que sur les cellules obtenues en l'absence d'IL-10.
Le procédé selon l'invention permet également d'obtenir une population de cellules dendritiques telle que plus de 15 %, de préférence plus de 20 %, de façon plus préférée plus de 22 %, ou 25 % des cellules dans ladite population présente un faible niveau d'expression de CD1 le, CD1 lb, CD14, une non expression de CD4 et pTα (par rapport aux cellules maturées en l'absence d'IL-10, lorsque ces molécules sont présentes sur les DC).
Plus précisément, les cellules dendritiques obtenues par le procédé selon l'invention présentent une morphologie plasmacytoïde, la faible expression des molécules CMH II, et de faibles niveaux d'expression de molécules de costimulation, même après une activation in vitro avec du LPS. En particulier, les cellules obtenues sécrètent des niveaux élevés d'IL-10 après activation.
Des expériences chez la souris ont permis de déterminer que l'on peut trouver les DC obtenues en grand nombre par le procédé selon l'invention dans la rate et les ganglions de souris normales, et qu'elles sont en quantité accrue dans la rate de souris transgéniques pour 1T1-10 (ILIO-Tg).
Notons que chez la souris, ces DC sont CD45+RBhl et présentent un faible niveau d'expression de CDllc, CDllb, Dec205, une absence de CDδalpha et de
B220.
Ces cellules dendritiques CD45+RB111 sont matures et stables (conservant le phénotype mature pendant au moins trois jours lorsqu'elles sont cultivées en absence de cytokines). Le procédé selon l'invention permet d'obtenir un nombre suffisant de cellules dendritiques matures permettant la différentiation in vitro de cellules T en cellules Tri. L'invention se rapporte aussi à une population de cellules dendritiques matures ou immatures, susceptibles d'être obtenues par un procédé selon l'invention, caractérisée en ce que plus de 15 %, de préférence plus de 20 %, de façon plus préférée plus de 22 %, ou 25 % des cellules présentent un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II, de CD80 et CD86 inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10.
Ladite population est bien entendu une population isolée de cellules, c'est-à- dire qu'elle n'est pas dans son environnement naturel. Les inventeurs ont pu observer que les cellules dendritiques présentant une faible expression des molécules CMH II et CD 86 n'évoluent pas lorsqu'elles sont stimulées avec le LPS (lippopolysaccharide). Notamment, alors que l'ajout de cette molécule induit une augmentation d'expression des molécules de présentation d'antigène et des molécules co-stimulatrices des cellules T pour les cellules dendritiques obtenues en l'absence d'IL-10, les cellules dendritiques obtenues par le procédé selon l'invention ne réagissent pas.
Ainsi, dans un autre mode de réalisation, l'invention se rapporte à une population de cellules dendritiques matures ou immatures, susceptibles d'être obtenues par un procédé selon l'invention, caractérisée en ce que plus de 15 %, de préférence plus de 20 %, de façon plus préférée plus de 22 %, ou 25 % des cellules présentent un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II et CD86, après stimulation par le LPS, inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10, et stimulées par le LPS. D'une façon plus générale, l'invention se rapporte à une population de cellules dendritiques immatures ou matures, caractérisée en ce que plus de 15 %, de préférence plus de 20 %, de façon plus préférée plus de 22 %, ou 25 % des cellules présentent un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II et CD86 inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10.
Egalement, l'invention se rapporte à une population de cellules dendritiques immatures ou matures, caractérisée en ce que plus de 20 % des cellules présentent un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II, de CD80 et CD86 inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence dTL-10. L'invention se rapporte ainsi à une population de cellules dendritiques matures ou immatures, caractérisée en ce que plus de 15 %, de préférence plus de 20 %, de façon plus préférée plus de 22 %, ou 25 % des cellules présentent un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II et CD86, après stimulation par le LPS, inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10, et stimulées par le LPS.
L'invention se rapporte également à un procédé d'obtention in vitro de cellules Tri à partir de cellules T, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en présence desdites cellules T avec une population de cellules dendritiques selon l'invention.
Dans un mode de réalisation préféré, lesdites cellules sont d'origine humaine.
L'invention se rapporte également à l'utilisation de cellules Tri obtenues in vitro par un procédé selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à être utilisé dans le traitement d'une maladie autoimmune ou inflammatoire. Une liste de maladies auto-immune a été donnée plus haut ; les maladies inflammatoires sont des maladies dans lesquelles on observe une infiltration de cellules mononucléaires, une prolifération de fibroblastes et de nouveaux vaisseaux sanguins, menant à une augmentation des tissus connectifs, et une destruction tissulaire. On note notamment les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.
L'invention se rapporte également à l'utilisation d'une population de cellules selon l'invention, pour la préparation d'un médicament capable d'induire in vivo la différenciation de cellules T en cellules Tri actives pour le traitement d'une maladie autoimmune ou mflammatoire.
Enfin, l'invention se rapporte à l'utilisation d'une population de cellules selon l'invention, lesdites cellules étant puisées avec un antigène reconnu par des cellules du système immunitaire, en particulier des cellules T dans une maladie π
auto-immune ou inflammatoire, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter ladite maladie auto-immune ou inflammatoire. En particulier, on peut utiliser un peptide de gliadine pour la maladie de Crohn, un antigène provenant de la myéline pour la sclérose en plaques. L'invention se rapporte également à une composition pharmaceutique contenant les cellules dendritiques selon l'invention, éventuellement avec un excipient pharmaceutiquement approprié.
Dans un mode de réalisation de l'invention, l'invention se rapporte à l'administration des cellules dendritiques selon l'invention chez un patient in vivo de manière à obtenir des cellules Tri différenciées, pour traiter une maladie autoimmune ou inflammatoire.
L'invention concerne ainsi également un procédé d'obtention de cellules
Tri chez un patient in vivo comprenant l'administration d'IL-10 audit patient, et éventuellement de GM-CSF et de TNF alpha, en quantité et pendant une durée suffisantes pour obtenir des cellules dendritiques CMH II-CD80-CD86low capables d'induire la différenciation des cellules T en cellules Tri .
Enfin, l'invention concerne aussi une méthode de traitement d'une maladie autoimmune ou inflammatoire comprenant l'étape d'administration à un patient de cellules dendritiques selon l'invention, ou de cellules Tri obtenues in vitro à partir de cellules dendritiques selon l'invention.
DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : L'IL-10 induit la différenciation des cellules dendritiques CDllc,0WCD45RB+
A) Des cellules de moelle osseuse ont été cultivées avec du GM-CSF et du TNF-α en présence ou en l'absence d'IL-10 (50 ou 500 ng/ml) comme indiqué pendant 6 jours, puis activées pendant 24 h avec du LPS. Les cellules dendritiques de moelle osseuse ainsi générées ont été colorées avec un anticorps anti-CDl lc biotinylé, puis avec un conjugué de streptavidine-peroxydase (PE). Les cellules ont ensuite été conjuguées à un anticorps anti-CD45RB couplé au FITC et analysées par cytométrie de flux. Les données représentent les résultats d'une étude représentative sur sept. B) Les cellules dendritiques ont été triées en fonction de l'expression de CDl lc et de CD45RB, comme indiqué sur la figure 1A. Les cellules triées indiquées ont été centrifugées et colorées au May Grϋndwald Giemsa. 1 - cellules dendritiques CDllclowCD45RB+ après 6 jours de différenciation, 2 - cellules dendritiques CDllclowCD45RB+ après activation par le LPS, 3 - cellules dendritiques CDllchlghCD45RB" après 6 jours de différenciation, 4 - cellules dendritiques CDl lchlghCD45RB+ après activation par le LPS.
C) Les cellules dendritiques obtenues après différenciation in vitro en présence de GM-CSF et de TNF-o; avec ou sans IL- 10, ont été triées en fonction de l'expression de CDl le et de CD45RB, comme indiqué sur la figure 1 A. Les cellules triées ont été colorées avec les anticorps marqués au FITC indiqués, et réanalysées au FACS ; elles ont également été stimulées par le LPS (1 μg/ml) pendant 24 h, colorées avec les ACm indiqués et réanalysées. Les histogrammes hachurés représentent les cellules colorées avec les ACm témoins d'isotype correspondant. Les données représentent les résultats d'une expérience représentative sur trois. Figure 2 : Identification des cellules dendritiques dérivées de l'IL-10 in vivo.
A) Des cellules dendritiques (DC) spléniques de souris BALB/c ou C57B1/6 transgéniques pour l'IL-10, IL- 10 _/" et normales ont été isolées, enrichies par déplétion cellulaire avec un cocktail d'anticorps (ACm anti-B220, Grl et CD3) et l'expression de surface du marqueur spécifique CDl 1 a été analysée par cytométrie de flux.
B) Des préparations de DC enrichies par déplétion cellulaire avec un cocktail d'anticorps (ACm anti-B220, Grl et CD3) ont été isolées de la rate de souris BALB/c ou C57B1/6 transgéniques pour l'IL-10, IL- 10 _/~ et normales et analysées pour l'expression de CDl lc-cy5 et de CD45RB-PE afin de distinguer deux populations de DC séparées. Les pourcentages dans les différents quadrants sont indiqués. Les résultats - de plus de 10 expériences - sont typiques. Aucune différence n'a été observée entre les souris BALB/c non transgéniques et les témoins. C) Les cellules CDl lclow CD45RB+ (1) et CDllchighCD45RB_ (3) triées isolées de la rate de souris BALB/c ont été centrifugées et colorées au May- Grϋnwald-Giemsa. Les cellules CDllclowCD45RB+ (2) et CDl lchighCD45RB" (4) 14
également été stimulées par le CpG (lμM) en présence de GM-CSF pendant 24 h, colorées avec les ACm indiqués et réanalysées (histogrammes pleins). Les Mstogrammes hachurés représentent les ACm témoins d'isotype correspondant.
D-E) Profil de cytokines des différentes sous-populations de cellules dendritiques
B) Dans une première série d'expériences, les sous-ensembles de cellules dendritiques CDllcωghCD45RB" (histogrammes vides) et CDllclowCD45RB+ (histogrammes pleins) ont été triés en fonction de l'expression de CDllc et CD45RB à partir de cellules dendritiques spléniques enrichies avec un cocktail d'ACm anti-CD3, B220 et Grl. Les cellules CDllchigllCD45RB" (histogrammes hachurés blancs) et CDl lclowCD45RB+ (histogrammes hachurés noirs) triées ont également été stimulées avec du LPS (1 μg/ml) en présence de GM-CSF pendant 24 h. Une RT-PCR quantitative en temps réel a été effectuée sur les différents échantillons et comparée à un témoin négatif pour chaque produit de transcription donné analysé. Les valeurs sont exprimées en facteurs d'augmentation de l'expression par rapport à un témoin négatif et représentent les moyennes ± ET de trois échantillons distincts.
E) Une population de cellules dendritiques a également été préparée - avec un cocktail contenant des ACm anti-CD3 et CD 19 et triée en fonction de l'expression αe CDllc et B220. Les cellules ont été stimulées avec du LPS ou du CpG pendant 24 ou 48 h et le surnageant a été analysé comme indiqué, pour mesurer la sécrétion éventuelle d'IFN-αou d'il- 10.
Figure 4 : Les cellules dendritiques CDllclo CD45RB+ induisent la différenciation des cellules régulatrices Tri in vitro. A) Les cellules CDllclowCD45RB+ traitent et présentent l'antigène in vitro
Des cellules T DO11-10 CD4+ ont été stimulées avec des DC CDl lcω CD45RB" and CDl lclow CD45RB+ triées en présence de peptide OVA (0.6 μM) ou de protéine OVA (500 ou 250 μg/ml comme indiqué). La réponse proliférative ou la sécrétion d'LFN-γ a été analysée à J3 ou 48 h après stimulation, respectivement. Les résultats représentent la moyenne de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml pour l'LFN-γ. Les données sont représentatives de 2 expériences distinctes avec des résultats similaires. 15
B) Analyse des cytokines sécrétées par des populations de cellules T CD4 activées avec des cellules dendritiques triées ex vivo
Des cellules T transgéniques DO11-10 OVA TCR "vierges" ont été différenciées pendant 3 semaines avec des DC triées CDllchlghCD45RB" (barres blanches) ou CDllclowCD45RB+ (barres noires), en présence de peptide OVA. Les cellules dendritiques ont été isolées de souris BALB/c normales à différents rapports DC/T comme indiqué. Après trois semaines de culture, les cellules T ont été récoltées et stimulées avec des splénocytes BALB/c irradiés et du peptide OVA (0,3 μM). Quarante-huit heures plus tard, les cytokines ont été analysées par ELISA dans les surnageants de culture. Les résultats représentent la moyenne de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml pour l'IL-10 et l'LFN-γ et en pg/ml pour l'IL-4. Les données sont représentatives de 5 expériences distinctes avec des résultats similaires.
B) Cytokines sécrétées par des populations de cellules T CD4 différenciées avec des cellules dendritiques dérivées in vitro
Les cellules dendritiques ont été obtenues par culture de cellules de moelle osseuse en présence de GM-CSF, de TNF-cϋ et IL- 10. Elles ont ensuite été triées en deux sous-ensembles : CDllchighCD45RB" et CDllclowCD45RB+. Les cellules dendritiques triées ont été utilisées pour différencier des cellules T CD4+ DO11-10 "vierges", dans un rapport DC/T de 1/20, en présence de peptide OVÂ (0,6 μM). Au bout d'une semaine, les cellules T ont été récoltées et stimulées avec des CPA spléniques irradiées et du peptide OVA (0,3 μM). Quarante-huit heures plus tard, les cytokines ont été analysées par ELISA dans les surnageants de culture. Les résultats représentent la moyenne de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml. Les données sont représentatives de deux expériences distinctes avec des résultats similaires.
C). Dosage des cytokines intracellulaires de cellules T DO 11 -10 "vierges" stimulées avec du peptide OVA et des DC triées CDl lclowCD45RB+ ou CDllchighCD45RB- Les cellules dendritiques CDl lclowCD45RB+ et CDl lchighCD45RB" ont été isolées de souris BALB/c normales, triées sur FACS et mises en co-culture avec des cellules T DOl 1-10 "vierges" en présence de peptide OVA. Sept jours plus tard, les cellules ont été récoltées et stimulées pendant 6 h avec des ACm anti-CD3 et CD28 16
réticulés. De la monensine a été ajoutée pendant les 4 dernières heures de culture. Les cellules ont ensuite été fixées et colorées pour le dosage des cytokines intracellulaires par ACm spécifiques couplés au FITC ou à la PE, comme indiqué. On présente ici une expérience représentative sur trois. B) Fonction régulatrice des cellules T différenciées avec des cellules dendritiques CDllclowCD45RB+
Dans le compartiment inférieur d'un système transwell, des cellules T CD4+ purifiées isolées de souris BALB/c normales ont été stimulées avec des splénocytes BALB/c irradiés et des ACm anti-CD3 (barres blanches). Dans le compartiment supérieur, des cellules T CD4+ différenciées par une stimulation unique avec des cellules dendritiques CDl lclόwCD45RB+ ou CDl lcHCD45RB" ont été stimulées par le peptide OVA et des splénocytes irradiés. Des expériences de co-culture ont également été conduites en présence d'ACm de souris anti-IL-10 (10 μg/ml) (barres hachurées blanches), d'ACm de souris anti-TGF- (40 μg/ml) (barres noires) ou des deux (barres grises). Trois jours plus tard, le panier a été retiré et la réponse proliférative des cellules T CD4+ spectatrices a été mesurée après un puise avec 0,5
3 μCi de H-thymidine pendant les 12 dernières heures de la culture de 72 h. Les résultats représentent les moyennes ± ET de trois mesures d'une expérience représentative sur trois. . __.) La sécrétion. d'IL-10 n'est pas requise pour la différenciation des cellules
Tri par les cellules dendritiques CDl le 0WCD45RB+
Des cellules T DO11-10 CD4+ "vierges" ont été différenciées pendant une semaine avec des cellules dendritiques CDl lclo CD45RB+ en présence ou en l'absence de cellules T anti-ILlOR. Au bout d'une semaine, les cellules ont été récoltées et stimulées avec des splénocytes BALB/c irradiés et du peptide OVA (0,3 μM). Quarante-huit heures plus tard, les cytokines ont été analysées par ELISA dans les surnageants de culture. Les résultats représentent la moyenne de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml pour l'IL-10 et lTFN-γ et en pg/ml pour l'IL-4. Les données sont représentatives de 5 expériences distinctes avec des résultats similaires. De même, des cellules T CD4+ "vierges" isolées de souris C57B1/6 ont été différenciées avec un ACm anti-CD3 soluble et des cellules dendritiques CDl lcl0WCD45RB+ triées isolées de souris IL-10"7" ou C57B1/6. Au bout d'une semaine, les cellules ont été récoltées et stimulées avec des splénocytes C57B1/6 17
irradiés et un ACm anti-CD3 soluble (10 μg/ml). Quarante-huit heures plus tard, les cytokines ont été analysées par ELISA dans les surnageants de culture. Les résultats représentent la moyenne de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml pour l'IL-10 et lTFN-γ et en pg/ml pour l'IL-4. Figure 5 : Les cellules dendritiques CDllelowCD45RB+ induisent la différenciation des cellules Tri in vivo.
Des cellules dendritiques CDllclowCD45RB+ ou CDllcω triées isolées de souris BALB/c normales ont été chargées in vitro avec du peptide OVA et injectées par voie intraveineuse à des souris préalablement reconstituées avec des cellules T spécifiques du peptide OVA. Une semaine plus tard, la réponse proliférative (A) et la production de cytokines (B) des cellules T CD4+ spléniques stimulées par le peptide OVA (0,3 μM) et les CPA spléniques irradiés ont été testées. La réponse proliférative a été mesurée par rincorporation de H-thymidine pendant les 12 dernières heures d'une culture de 72 h. Pour les dosages de cytokines, les résultats représentent les moyennes de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml. Les données sont représentatives de trois expériences distinctes avec des résultats similaires. Figure 6 : Les cellules dendritiques CDllcl0WCD45RB+ induisent une tolérance in vivo
Des cellules dendritiques CDl lclowCD45RB+ ou CDllc^ triées, isolées de souris BALB/c normales ou différenciées in vitro comme indiqué, ont été chargées in vitro avec du peptide OVA et injectées par voie intraveineuse à des souris préalablement reconstituées avec des cellules T spécifiques du peptide OVA. Une semaine plus tard, les animaux ont été immunisés avec de l'OVA/alun, du TT/alun ou de l'OV A/CFA, avec une injection "de rappel" deux semaines plus tard. Les analyses ont été effectuées quatre semaines après la première iinrnunisation.
A) Les IgE et IgGl spécifiques de l'OVA ont été dosées par ELISA sur un pool de sérums de chaque groupe de 5 souris et les résultats exprimés en moyennes de trois mesures. Les résultats présentés sont ceux d'une expérience représentative sur trois. B) Des cellules T CD4+ spléniques purifiées, isolées de souris reconstituées et immunisées, ont été stimulées in vitro avec le peptide OVA (0,3 μM) (barres blanches) ou la protéine OVA (250 μg/ml) (barres noires). La réponse proliférative a été mesurée par l'incorporation de 3H-thymidine pendant les 12 dernières heures 18
d'une culture de 72 h. Les données sont représentatives de trois expériences distinctes.
C) 48 heures après la restimulation, comme décrit en B, les surnageants de culture ont été recueillis et les cytokines dosées par ELISA. Les résultats représentent les moyennes de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml. Les données sont représentatives de trois expériences distinctes avec des résultats similaires. Figure 7 : Les cellules T CD4+ isolées de souris rendues tolérantes par des cellules dendritiques CBllclowCB45RB+ sont capables de transférer la tolérance à l'antigène Des souris BALB/c reconstituées avec des cellules T OVA-spécifiques
"vierges" ont été traitées par des cellules dendritiques CDllclowCD45RB+ puisées avec du peptide OVA. A titre de contrôle, certaines souris ont reçu des cellules T "vierges" seules. Une semaine après la reconstitution, des cellules T CD4+ spléniques purifiées des souris reconstituées ont fait l'objet d'un transfert adoptif à des souris BALB/c normales. Comme indiqué, les animaux non traités ou ayant reçu les cellules T CD4+ purifiées ont ensuite été irmnunisés avec de l'OVA alum. Une injection "de rappel" a été pratiquée deux semaines plus tard et les souris ont été analysées quatre semaines après la première immunisation.
A) Les IgGl spécifiques de l'OVA ont été dosées par ELISA sur un pool de sérums de chaque groupe de 5 souris et les résultats sont exprimés en moyennes de trois mesures. Les résultats présentés sont ceux d'une expérience représentative sur trois. . ..
B) Des cellules T CD4+ spléniques purifiées de souris reconstituées et immunisées ont été stimulées in vitro par la protéine OVA (250 μg/ml) (barres noires) ou le milieu seul (barres blanches). La réponse proliférative a été mesurée par l'incorporation de 3H-thymidine pendant les 12 dernières heures d'une culture de 72 h. Les données sont représentatives de trois expériences distinctes.
C) 48 heures après la restimulation, comme décrit en B, les surnageants de culture ont été recueillis et les cytokines dosées par ELISA. Les résultats représentent les moyennes de 3 mesures et sont exprimés en ng/ml. Les données sont représentatives de trois expériences distinctes avec des résultats similaires. 19
Figure 8 : Analyse de cellules dendritiques humaines tolérogènes (TDC)
A) on a supprimé les cellules T et B de cellules mononucléaires périphériques sanguines (PBMC) avec des anticorps et des billes magnétiques et la population restante a été analysée pour l'expression de CDl lc et CD4 par cytométrie. Les carrés représentent les deux populations définies comme DCl et DC2 par « Siegal et al, 1999, Science, 281, 1835-7 ». Un carré montre la population de DC tolérogènes (TDC).
B) des cellules progénitrices CD34+ ont été différentiées in vitro avec du GM-CSF (800 U/ml) et de 1TL-4 (1000 U/ml) en présence ou en absence d'IL-10
(200 u/ml) comme indiqué dans l'exemple 8. on a entouré les populations de TDC et DCl.
C) Les cellules TDC et DCl ont été liées par FACS selon l'expression de CDl lc et analysées par cytofluorométrie pour l'expression de HLA-DR, CD80 et CD86. Les résultats montrent que les TDC expriment de niveaux de ces molécules plus bas que les cellules DCl .
D) Les cellules TDC et DCl ont été triées par FACS selon l'expression de CDl le et stimulées "par le LPS pendant 24 h. Les surnageants ont alors été analysés par ELISA pour la présence d'IL-10 et d'LL-12. Figure 9 : TDC induisent la différentiation de cellules Tri sécrétant de haut niveaux d'ILτl0
A) Analyse des cytokines secrètes par les populations de cellules T CD4+ activées avec les cellules dendritiques triées.
Les cellules T CD4+ humaines ont été stimulées pendant trois semaines avec des cellules triées allogéniques DCl (colonnes blanches) ou TDC (colonnes noires). Les DCs ont été isolées à partir de cultures in vitro en présence (TDC) ou en absence (DCl) d'IL-10 et utilisées à différents ratios DC/T comme indiqué.
Après la culture pendant trois semaines, les cellules T ont été récoltées et stimulées avec des PBMC irradiés, et un anticorps monoclonal anti -CD3 (10 μg/ml). Après 48 heures, les cytokines dans les surnageants de culture ont été analysées par
ELISA. Les résultats représentent les moyennes de trois déterminations ey sont exprimés en ng/ml. 20
B) Fonction régulatrice des cellules T différentiées avec les TDC.
Dans le compartiment inférieur d'un système transwell des cellules humaines T CD4+ purifiées ont été stimulées par des PBMC irradiés et un anticoprs monoclonal anti-CD3 (colonnes blanches). Dans le compartiment supérieur, des cellules T CD4+ différentiées avec des cellules TDC ou DCl allogéniques comme indiqué ont été stimulées avec des PBMC allogéniques irradiés. Les expériences de coculture ont aussi été mise en oeuvre en présence d'anticorps monoclonal de souris bloquant anti-IL-10 (10 μg/ml) (colonnes hachées), anticorps monoclonal anti-TGF- β (40 μg/ml) (colonnes noires) ou des deux (colonnes grises). Après trois jours, on a récupéré le récipient et la réponse proliférative des cellules T CD4+ a été mesurée par ajout de 0,5 μCi de 3H-thymidine pendant les 12 dernières heures de la culture de 72 h.
EXEMPLES
Exemple 1 : procédures expérimentales Souris
Les souris BALB/cAnN ont été obtenues auprès du CERJ (Le Genest Saint Isle, France), les souris DO11-10 homozygotes nous ont été généreusement données par le Dr S. D. Hurst (DNAX Research Institute, Palo Alto, CA). Les souris transgéniques BALB/c IL- 10 ont été obtenues en utilisant l'ADNc hIL-10 sous le contrôle du promoteurlO du CMH de classe II Ea. Tous les animaux ont été élevés dans les conditions aseptiques courantes, dans notre animalerie. Toutes les souris étaient des femelles âgées de 4 à 8 semaines au début de chaque expérience. Milieu, anticorps et réactifs
Le milieu utilisé pour les cultures de cellules T était le milieu Yssel (Yssel et al., 1984). Les cellules dendritiques ont été cultivées dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10% de S VF (Roche, Meylan, France), 2 mM de L-glutamine, 1% de pyruvate de sodium, 2 x 10"5 M de 32-mercaptoéthanol (tous d'Invitrogen). Pour la purification des cellules dendritiques, nous avons utilisé du milieu HBSS sans Ca"4" et Mg4"4- contenant 2 mM d'EDTA (tous d'Invitrogen) et de la collagénase D (Roche, Meylan, France). 21
Le GM-CSF, le TNF-α et l'IFN-γ recombinants de souris venaient de R&D Systems, Abington, R-U. L'IL-10 et l'IL-4 recombinantes de souris ont été généreusement offertes par le Dr R. L. Coffman, DNAX Research Institute, Palo Alto, CA. La purification et la caractérisation des DC ont été effectuées au moyen d'anticorps anti-CD3 (17A2), anti-CD4 (GK1.5) anti-CD8 (53-6.7), anti-CDl lb (Ml/70), anti-CDllc (HL3), CD28 (37.51) anti-I-Ad (AMS-32.1), anti-CD62L (Mel-14), anti-CD80 (16-10A1), anti-CD86 (GL1), anti-B220 (RA3-6B2), CD45RB (16A), anti-Grl (RB6-8C5) (Tous de Pharmingen Becton Dickinson) et de DEC-205 (NLDC-145) (Serotec, R-U.).
Les dosages de cytokines ont été effectués au moyen d'anticorps anti-IL-4-
PE ou -FITC (11B11), anti-IFN-γ-PE (XGM1.2), anti-IL-10-FITC (JES-16E3), anti-IL-4 (11B11) et anti-IL-10 (2A5) purifiés, anti-IFN-γ (XGM1.2) et d'anti-IL-4
(24G2), d'anti-IL-10 (SXC1), d'anti-IFN-γ (R4-6A2) biotinylés (Tous de Pharmingen Becton Dickinson).
Les anticorps anti-IgE (R35-72) et anti- IgGl (A85-1) utilisés pour l'analyse des IgG sériques spécifiques de l'OVA étaient de Pharmingen Becton Dickinson.
Le tampon de lyse, la métrizamide, le LPS, le peptide OVA 323.339, l'ovalbumine et l'alun étaient de Sigma, Saint Quentin Fallavier, France. Cytométrie de flux
L'analyse phénotypique des sous-ensembles de DC a été effectuée par double ou triple coloration avec des anticorps biotinylés anti-CDllc, suivis de streptavidine-Cy-Chrome, d'anti-CD45RB couplés à la PE et d'un troisième anticorps couplé au FITC. Toutes les étapes de coloration ont été conduites à 4°C dans du tampon PBS avec 0,1% de SAB et 0,02 mM de NaN3. Après trois lavages, les cellules marquées ont été analysées sur un FACScan (Becton Dickinson).
Coloration des cytokines intracellulaires
L'analyse des cytokines intracellulaires par cytométrie de flux a été effectuée comme décrit (Groux et al., 1997). Les cellules (106/ml) ont été activées pendant 6 h avec des ACm anti-CD3 et anti-CD28 immobilisés. La monensine a été ajoutée à
10 μg/ml et, 4 h plus tard, les cellules ont été récoltées, lavées et fixées dans du formaldéhyde à 2%. Pour la coloration intracellulaire, les cellules ont été incubées 22
avec les ACm suivants : anti-IL-4-FITC ou -PE, anti-IFN-γ-PE et anti-IL-10-FITC, ou des anticorps témoins d'isotype correspondant, tous à 5 μg/ml. Les échantillons ont été analysés sur un FACScan (Becton Dickinson). Cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (DC-MO) Les DC-MO ont été générées à partir de progéniteurs médullaires, comme décrit précédemment, avec quelques modifications (Inaba et al., 1992). En bref, la moelle osseuse a été extraite par rinçage de tibias et de fémurs avant d'éliminer les globules rouges avec 0,83 % de chlorure d'ammonium. Les cellules ont été cultivées à 37°C, sur des plaques à 24 puits (Becton Dickinson) (106 cellules/ml/puits), dans du milieu RPMI complet supplémenté avec 10 ng/ml de GM-CSF recombinant murin et 2,5 ng/ml de TNF-α recombinant murin, avec ou sans IL- 10 recombinante murine (500 ng/ml). Les DC-MO ont été récoltées à J6. Purification des cellules dendritiques spléniques
Des rates ont été découpées en menus fragments qui ont été digérés par la collagénase D (1 mg/ml) dans du HBSS pendant 20 mn à 37°C, sous agitation constante. Les fragments digérés ont été filtrés sur grille de .0,7 μm (Becton-
Dickinson) et la suspension cellulaire a été lavée deux fois dans le milieu de purification. Les cellules ont alors été déposées en couche sur un gradient de
• métrizamide et centrifugées à 600 g pendant 10 min. Les cellules concentrées à l'interface ont été récupérées, lavées une fois et remises en suspension dans le milieu de purification, pour dissocier les DC des lymphocytes. Les différentes lignées de cellules T, les cellules B et les granulocytes ont été déplétées en traitant les cellules de basse densité récupérées, pendant 30 min à 4°C, avec un mélange d'anticorps monoclonaux composé d'antï-CD3, d'anti-B220 et d'anti-GR-1. Les cellules positives ont été récupérées magnétiquement, après incubation pendant 1 h à 4°C avec des billes magnétiques recouvertes d'Ig anti-rat, dans un rapport de 10 billes pour 1 cellule. Préparation des cellules T transgéniques TCR "vierges"
Des cellules T spléniques de souris DO 11.10 transgéniques OVA TCR ont été préparées comme décrit ailleurs (Groux et al., 1997). En bref, des cellules T CD4+ ont été enrichies par sélection négative au moyen de billes magnétiques avec un mélange d'ACm anti-CD8, anti-B220 et anti-CDl lb. Les cellules T CD4+/Mell4 πght ont ensuite été triées par cytométrie de flux en utilisant des 23
anticorps anti-CD4-PE et anti-CD62L-FITC (Mell4). Les populations de cellules T triées étaient typiquement positives à 99 % pour les deux marqueurs. Différenciation des cellules T transgéniques TCR par les cellules dendritiques Les essais in vitro de différenciation des cellules T ont été effectués dans du milieu Yssel. Les cultures primaires de stimulation ont été établies en procédant à une activation de cellules T CD4+ "vierges" purifiées (2,5 x 105) par des populations de cellules dendritiques triées, puisées avec le peptide OVA 323-339 (0,6 μM) dans un volume total de 1 ml, sur des plaques de 24 puits (Becton Dickinson). Les cellules ont été multipliées, récoltées à J7, lavées trois fois, comptées et restimulées par des populations de cellules dendritiques fraîchement triées + 0,3 μM de peptide OVA 323.339 pour la seconde différenciation. La même procédure a été appliquée pour le troisième cycle de différenciation. Après la différenciation, les cellules T ont été récoltées, lavées et restimulées avec 0,3 μM d'OVA 323-339 et des CPA spléniques irradiées. La prolifération des cellules T a été mesurée par l'incorporation de 3H-thymidine au cours des 12 dernières heures de l'incubation de 72 h. La production d'IL-4, d'IL-10 et d'LFN-γ a été mesurée par ELISA dans les surnageants recueillis 48 h après la restimulation des cellules T. Expériences transwell
Dans le compartiment inférieur d'un système transwell (0,4 μm Costar- Dutscher, Brumath, France), 106 cellules T CD4+ purifiées isolées de souris BALB/c normales ont été stimulées avec 106 splénocytes irradiés de souris BALB/c et des ACm anti-CD3 (10 μg/ml). Dans le compartiment supérieur, des cellules T CD4+ différenciées par une stimulation unique avec des cellules dendritiques ont été stimulées avec 0,3 μM d'OVAp et 106 splénocytes irradiés. Trois jours plus tard, le panier a été retiré et les cellules T des puits inférieurs ont été transférées (en triple) dans des plaques à 96 puits. La réponse proliférative a été analysée par l'incorporation de 3H-1hymidine au cours des 12 dernières heures de culture. Cytologie
Les DC CDl lcl0WCD45RB+ et CDl lchighCD45RB" triées, générées in vitro ou isolées de rates de souris BALB/c, ont été incubées pendant 24 h avec du LPS (1 μg/ml) en présence de GM-CSF (10 ng/ml). Les DC fraîchement triées ou stimulées ont été centrifugées (Cytospin2, Shandon) et colorées au May-Grϋnwald-Giemsa. 24
Dosage par RT-PCR quantitative en temps réel
L'ARN total des sous-ensembles de DC triées (1 x 10 ; pureté >99%) a été préparé avec du TRIZOL (Life Technologies), comme décrit ailleurs (Cottrez et al., 1994), et toute trace éventuelle d'ADN chromosomique contaminant a été digérée par la DNase I, en suivant les instructions du fabricant (Gène Hunter, Nashville, TX). Puis l'ARN a fait l'objet d'une transcription inverse avec un oligo(dT)12— 18 et la transcriptase inverse Superscript II (Life Technologies), comme décrit ailleurs (Cottrez et al., 1994). La PCR quantitative en temps réel a été effectuée avec la trousse SYBR Green PCR Core Reagents Kit, sur des plaques de microtitrage spéciales, à 96 puits (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France) dans un appareil ABI PRISM 5700 Séquence Détection System (Applied Biosystems), en suivant les instructions du fabricant. Les signaux de fluorescence ont été générés pendant chaque cycle de PCR par incorporation directe du SYBR Green dans la chaîne d'ADN bicaténaire, pour donner des informations quantitatives en temps réel. Des amorces (MWG Biotech, Ebersberg, Allemagne) englobant les jonctions exons-introns ont été conçues pour éviter l'amplification de l'ADN génomique et donner des amplicons de 100 à 150 pb, afin d'accroître l'efficacité de l'amplification par PCR. Toutes les amorces ont été utilisées dans des conditions qui ont évité la formation de dimères, et la fidélité des produits d'amplification a été vérifiée par électrophorèse et cartes de restriction enzymatique. Tous les ADNc ont été titrés sur la valeur de l'expression moyenne de 4 différents gènes ordinaires (housekeeping). Les conditions expérimentales de la PCR étaient les suivantes : 10 mn à 94°C, et 40 cycles de 30 s à 94°C, 30 s à 60°C et 30 s à 72°C pour chaque amplification, dans un volume final de 20 μl. L'expression des gènes cibles a été mesurée, après normalisation des concentrations d'ARN, avec les 4 gènes ordinaires et les valeurs sont exprimées en facteurs d'augmentation de l'expression par rapport à un témoin négatif. Immunisation et transfert adoptif de cellules T OVA-specifiques CD4+ et de sous-ensembles DC 2,5x106 cellules T OV A-spécifiques "vierges" de souris ont été transférées par voie intraveineuse à des souris BALB/c ; 3xl05 DC CDllclowCD45RB+ ou CDllchlghCD45RB" triées, générées in vitro ou isolées de rates de cellules BALB/c, ont été incubées avec le peptide OVA323.339 à 4°C pendant 2 heures, lavées et 25
injectées par voie intraveineuse aux souris ayant reçu les cellules T transférées. Ces souris ont été immunisées par injection intrapéritonéale, à J7, de 50 μg d'OVA/alun par animal. Deux semaines plus tard, un "rappel" a été effectué en injectant 25 μg d'OVA/alun par animal. La tolérance induite par les DC a été analysée d'après la prolifération et la sécrétion de cytokines de cellules T CD4+ spléniques purifiées stimulées par des splénocytes irradiés (2500 rad) et l'OVA (250 μg/ml) ou le peptide OVA323.339 (0,3 μM). Les anticorps anti-OVA ont été mesurés par ELISA sur les sérums recueillis chaque semaine après la première immunisation. Transfert de la tolérance
Les cellules T CD4+ spléniques de souris témoins ou rendues tolérantes ont été purifiées par déplétion négative avec des billes magnétiques. Puis, 106 cellules ont été transférées par voie intraveineuse dans des souris BALB/c normales. Celles- ci ont ensuite été immunisées avec de l'OV A/alun comme décrit plus haut. Les taux d'anticorps anti-OVA, la prolifération des cellules T spléniques et la sécrétion des cytokines ont été analysés comme précédemment. Dosages des cytokines
L'LL-4, l'LL-10 et l'LFN-γont été dosés par une méthode ELISA en sandwich, comme décrit ailleurs (Cottrez et al., 2000). En bref, des plaques ELISA (Polylabo, France) ont été recouvertes d'ACm anti-cytokines appropriés en tampon carbonate et incubées à 4°C pendant une nuit. Les réactions ont été bloquées pendant 30 min à température ambiante avec 150 μl de PBS/SVF à 20% dans chaque puits ; 50 μl de surnageants dilués des cellules T CD4+ stimulées in vitro ont ensuite été ajoutés aux puits, avant d'incuber les plaques à 4°C pendant une nuit. Après une étape de lavage, 50 μl de l'anticorps biotinylé de la seconde étape ont été ajoutés dans chaque puits. Les plaques ont été incubées pendant 1 h à température ambiante et lavées. Le conjugué enzymatique (streptavidine-peroxydase) a ensuite été ajouté dans chaque puits. Les plaques ont été incubées à température ambiante pendant 1 h, lavées, et 100 μl de substrat (ABTS, 1 mg/ml) ont été ajoutés par puits. Les plaques ont été lues sur un lecteur ELISA à 405 nm, après formation de la couleur (Labsystems iEMS reader, Helsinki, Finlande). 26
Analyse des IεE sériques anti-OVA .
Le taux d'IgE anti-OVA a été mesuré par ELISA en sandwich à deux étapes, comme décrit (Cottrez et al., 2000). Les sérums ont été ajoutés, à différentes dilutions, dans les puits recouverts d'ACm anti-IgE (R35-72, Becton Dickinson, Mountain View, CA). Les IgE spécifiques de l'OVA ont été révélées par de l'OVA couplée à la digoxigénine (préparée en suivant les instructions du fabricant, Roche) et du fragment Fab-anti-digoxigénine couplé à la peroxydase (Roche). Après une incubation finale de 1 h, 50 μl de substrat ont été ajoutés à chaque puits. Analyse des IgGl sériques anti-OVA Les plaques ELISA ont été incubées une nuit à 4 °C avec 100 μg/ml d'ovalbumine (Sigma) dans du PBS. Les sérums ont été ajoutés, à différentes dilutions, aux plaques pendant une nuit. Pour détecter les IgGl, nous avons utilisé un ACm biotinylé de rat (A85-1, Becton Dickinson) à 2 μg/ml. Après incubation et lavage, le conjugué streptavidine-peroxydase a été ajouté dans les puits. Enfin, les plaques ont été développées comme décrit ci-dessous. Les étalons pour IgGl spécifiques de l'OVA étaient des sérums poolés de souris BALB/c hyperimmunisées. La concentration d'IgGl spécifiques de l'OVA a été estimée par comparaison avec un étalon d'IgGl mesuré en parallèle sur les plaques recouvertes d'anti-IgGl.
Exemple 2 : L'IL-10 induit la différenciation d'un sous-ensemble distinct de PC.
On sait que l'IL-10 induit la différenciation des cellules Tri par un effet indirect (Wakkach et al., 2001). Etant donné que les DC sont des acteurs essentiels dans la différenciation des cellules T, nous avons analysé l'effet de l'IL-10 sur la différenciation des DC à partir de cellules progénitrices de la moelle osseuse cultivées en présence de GM-CSF et de TNF-c (les expériences préliminaires ont montré que la présence de TNF-o; n'influence pas le phénotype et la fonction des DC, mais aide toutefois à augmenter le rendement et la viabilité des populations de cellules dendritiques [données non présentées]). L'addition d'IL-10 au jour 0 de la culture a induit la différenciation d'une population de DC avec une faible expression de CDllc et une forte expression de CD45RB (figure 1A). En revanche, en l'absence d'IL-10, l'addition de GM-CSF et de TNF-α a induit la différenciation de 27
DC exprimant de fortes concentrations de CDl lc (figure 1A) (Inaba et al., 1992). Après triage des cellules au FACS en fonction de l'expression spécifique de CDllc et de CD45RB, les DC CDl lclowCD45RB+ différenciées in vitro présentaient une morphologie plasmocytoïde, avec une membrane plasmique lisse et un noyau excentrique (figure 1B-1). D'autre part, les DC CDl lc111211 avaient une morphologie différente, avec présence de petites dendrites (figure 1B-3). Après une nouvelle maturation avec le LPS, les deux populations ont acquis une morphologie de DC pleinement matures, avec de longues dendrites (figure 1B-2 et 4). L'analyse de l'expression des molécules du CMH II et des costimulateurs a révélé de faibles niveaux d'expression du CD80, du CD86 et de l'I-A sur les DC CDl 1 clowCD45RB+ (figure 1C) par rapport aux DC CDllc1"211. La maturation des cellules dendritiques avec le LPS n'a pas modifié le phénotype des DC CDllclowCD45RB+ (figure 1C), tandis qu'elle renforçait l'expression des molécules de CD80, CD86 et I-A sur les DC CDl le1"811. Ces résultats montrent que l'IL-10 induit la différenciation d'un sous- ensemble distinct de DC caractérisées par l'expression spécifique de CD45RB, qui présentent un phénotype pseudo-immature qui ne peut être modifié par une stimulation avec le LPS.
Exemple 3 : Isolement de l'équivalent naturel des PC dérivées par I'IL-10 Nous avons donc abordé la question de l'influence de l'IL-10 in vivo sur la différenciation des cellules dendritiques. Des DC spléniques enrichies isolées de souris Tg IL- 10 non transgéniques ou de souris BALB/c ont été analysées pour l'expression du marqueur spécifique des DC murines CDllc (figure 2A). Chez les souris Tg IL- 10, nous avons observé un plus grand nombre de DC exprimant faiblement le CDl lc par rapport aux souris BALB/c normales (figure 2 A) ou aux témoins non transgéniques (données non présentées). Comme pour les DC CDllclo différenciées in vitro en présence d'IL-10, les DC spléniques CDl lclow exprimaient fortement le marqueur CD45RB (figure 2B). Par ailleurs, les DC dérivées in vitro et les DC CDl lc0WCD45RB+ spléniques ont toutes deux une morphologie plasmocytoïde (figure 2C-1), contrairement aux DC CDllcωgh qui présentent de petites dendrites (figure 2C-3). Après une maturation complète avec le LPS, les deux populations de DC spléniques se différencient en DC pleinement matures avec longues dendrites (figures 2C-2 et 4). 28
Nous avons ensuite étudié l'expression des molécules I-Ad du CMH et des costimulateurs CD80 et CD86 sur les DC spléniques CDllclowCD45RB+ et CDl lclugllCD45RB" triées sur FACS, provenant de souris Tg IL- 10 et de souris BALB/c témoins. Comme le montre la figure 2D, nous avons constaté que les DC CDl lclo CD45RB+ purifiées ex vivo exprimaient faiblement les molécules du CMH de classe II, le CD80 et le CD86, par rapport aux DC CDllchighCD45RB". Pour déterminer si les DC CDllclowCD45RB+ représentent un sous-ensemble distinct de DC et le produit d'une lignée développementale séparée, ou si elles représentent un stade immature de DC plus conventionnelles, nous avons induit la maturation in vitro des DC isolées par des cultures à court terme en présence de GM-CSF (afin d'augmenter la durée de vie et le taux de récupération) et de LPS. Dans ces conditions, après maturation in vitro avec le LPS, les DC CDllclowCD45RB+ conservaient toujours une faible expression des molécules du CMH de classe II et du CD86, ce qui suggère que leur phénotype pseudo-immature est stable, à l'exception de la surexpression du CD80. En revanche, après incubation in vitro avec le LPS, les DC CDl lchlghCD45RB" montrent une maturation accrue, avec augmentation de l'expression des molécules du CMH de classe II et des deux costimulateurs (CD80 et CD86) (figure 2D). Globalement, ces résultats montrent que les DC CDl lclowCD45RB+ isolées de la rate représentent des équivalents in vivo des DC dérivées par l'IL-10.
Exemple 4 : Caractérisation phénotypique et sécrétion des cytokines du sous- ensemble de cellules dendritiques CDllclow CP45RB+
Pour mieux caractériser le sous-ensemble de DC CDllclowCD45RB+, nous avons analysé l'expression des différents marqueurs des cellules dendritiques sur les populations cellulaires CDl lclo CD45RB+ et CDllchighCD45RB- triées provenant de souris BALB/c (figure 3A). Les DC CDl lclowCD45RB+ expriment faiblement le CDllb et le DEC 205 et pas du tout le CD8α, ce qui suggère qu'elles n'appartiennent pas à la lignée "classique" des DC myéloïdes (CDl lb ^) ou lymphoïdes (CDSot) (Shortinan and Liu, 2002). Par ailleurs,- contrairement à une population de DC tolérogènes récemment décrite différenciée à partir d'un précurseur de cellule B, les DC CDl lclo CD45RB+ sont négatives en B220 (Lu et 29
al., 2001 ; Martin et al., 2002). Enfin, ces cellules n'expriment pas les marqueurs spécifiques des cellules T (CD4 et CD2) (données non présentées).
Une part importante de la fonction spécifique des DC est dictée par la sécrétion d'ensembles distincts de cytokines. Nous avons donc analysé, par RT-PCR quantitative, l'expression relative de plusieurs cytokines importantes sur des cellules dendritiques CDllclowCD45RB+ et CDllchighCD45RB" fraîchement triées ou activées par le LPS. Après activation par le LPS, les DC CDllclowCD45RB+ sécrétaient de l'IL-10 alors que les DC CDl lchighCD45RB" sécrétaient de l'IL-12. Les deux populations montraient une sécrétion d'LL-1/3, encore augmentée par l'activation par le LPS, mais ne sécrétaient pas d'LFN-α, même après 24 h d'activation par le LPS (figure 3B). Ces résultats montrent que les DC CDl lclowCD45RB+ représentent un sous-ensemble distinct de cellules dendritiques qui sécrètent principalement de l'IL-10 après activation.
Exemple 5 : Les PC CPllclow CP45RB+ différentient les cellules Tri in vitro
Pour analyser l'influence des différents sous-ensembles de DC sur l'amorçage et la différenciation de cellules T spécifiques jamais exposées à l'OVA ("vierges") isolées de souris DO11-10, plusieurs cycles de stimulation des cellules T ont été établis avec des DC CDllclowCD45RB+ ou CDl lchighCD45RB" triées isolées de la rate de souris BALB/c (figure 4A) ou différenciées in vitro (figure 4B). Les cellules T CD4+ "vierges" purifiées ont été stimulées par l'OVA (0,6 μM), à différents rapports DC/T, pendant une semaine. Puis les cellules T ont été récoltées, lavées et stimulées une nouvelle fois, dans les mêmes conditions, avec 0,3 μM d'OVA. Après une troisième stimulation dans les mêmes conditions, les populations de cellules T polarisées ont été récupérées, lavées et restimulées avec des splénocytes irradiés de souris BALB/c et 0,3 μM d'OVA pour analyser leur profil de cytokines (figure 4A). Nos résultats montrent que les DC CDl lclo CD45RB+ purifiées ex vivo ou différenciées in vitro, quel que soit le rapport DC/T utilisé, induisaient la différenciation de cellules Tri sécrétant fortement l'IL-10, faiblement lTFN-γ et pas d'IL-4 (ou alors en quantités négligeables) (Groux et al., 1997) (figures 4 A et B). Contrairement aux cellules dendritiques CDllclowCD45RB+, celles du sous-ensemble CDllchighCD45RB" amorçaient les cellules Thl qui sécrètent fortement lTFN-γ (figures 4A et B). Ces 30
résultats sont corrélés au profil de cytokines de la sous-population de cellules dendritiques, c-à-d. CDllclowCD45RB+, qui différencient les cellules Tri, sécrètent l'IL-10, alors que ι'IL-12 sécrétée par les DC CDllchighCD45RB" induit la différenciation des cellules Thl. Par ailleurs, la différenciation spécifique des cellules Tri avec les DC
CDllclowCD45RB+ a été observée après une stimulation unique, comme l'a montré l'analyse intracytoplasmique de la sécrétion de cytokines dans les différentes sous- populations de cellules T (figure 4C). Pour analyser les propriétés fonctionnelles des cellules T obtenues après une stimulation unique par les DC CDllclowCD45RB+, des expériences transwell ont été conduites. Les cellules T obtenues après stimulation par des DC CDllclowCD45RB+ de souris BALB/c ont inhibé la prolifération des cellules T CD4+ en attente (bystander) stimulées par des splénocytes irradiés et un anticorps monoclonal anti-CD3 (figure 4D). D'autre part, l'addition d'ACm inhibiteurs de souris anti-IL-10 et anti-TGF/3 a levé l'effet suppresseur de ces cellules T, confirmant la différenciation des cellules Tri au plan phénotypique et fonctionnel (figure 4D). A titre de contrôle, des populations de cellules Thl (induites par des DC CDllchigbCD45RB") n'ont pas eu d'effet inhibiteur sur la prolifération des cellules T CD4+ en attente (figure 4D). Globalement, ces résultats montrent que les DC CDllclowCD45RB+ induisent la différenciation des cellules Tri in vitro.
Exemple 6 ; Les PC CPllc'0WCP45RB+ induisent une tolérance antigénospécifique in vivo
Pour analyser la fonction in vivo des DC CDl lclowCD45RB+, nous avons utilisé un modèle chez la souris où des cellules T CD4+ spléniques OVA- spécifiques "vierges" de souris DO11-10 ont été transférées à des souris BALB/c normales. Ces souris ont ensuite été traitées avec des sous-ensembles purifiés de DC puisées avec de l'OVA in vitro. Une semaine plus tard, nous avons mesuré la réponse proliférative et la sécrétion de cytokines en réponse à la stimulation par l'OVAp de cellules T CD4+ spléniques purifiées des souris ayant fait l'objet du transfert. Comme pour les résultats in vitro, la figure 5 montre que l'injection de DC CDllcl0WCD45RB+ chez les souris BALB/c induit in vivo la différenciation de cellules Tri OVAp-spécifiques. Ces cellules se caractérisaient par une faible 31
réponse proliférative (figure 5 A) et une forte sécrétion d'IL-10 (figure 5B). A titre de contrôle, l'injection de DC CDl lchl h puisées avec l'OVA a induit la différenciation de cellules T à forte réponse proliférative et à forte sécrétion d'JFN-
Nous avons donc analysé la capacité des DC CDllclowCD45RB+ à mduire une tolérance in vivo. Des DC CDl lclowCD45RB+ ou CDl lc1"^ triées, isolées de la rate de souris BALB/c ou obtenus par différenciation in vitro, ont été puisées avec du peptide OVA et injectées à des souris BALB/c à cellules T reconstituées OVA- spécifiques "vierges". Une semaine plus tard, l'induction de la tolérance a été provoquée par deux immunisations, à 15 jours d'intervalle, avec la molécule d'ovalbumine intégrale dans de l'alun. Deux semaines après la dernière immunisation, l'analyse des IgE et IgGl sériques spécifiques de l'OVA a montré une nette réduction de la réponse chez les souris traitées avec les DC CDllclowCD45RB+ différenciées in vitro ou purifiées ex-vivo, par rapport aux souris immunisées témoins (figure 5A). L'induction de la tolérance a été confirmée par l'analyse de la réponse proliférative à l'ovalbumine de cellules T CD4+ isolées de la rate de souris immunisées. En fait, les cellules T CD4+ isolées de souris traitées avec les DC CDllclowCD45RB+ ont peu proliféré après stimulation par l'ovalbumine, comparées aux cellules T CD4+ isolées de la rate de souris., immunisées préalablement traitées ou non traitées par des DC CDllcHgl1. Par ailleurs, l'induction de la tolérance était antigénospécifique, étant donné que les cellules T des différents groupes de souris proliféraient massivement en réponse à une stimulation par la ConA (données non présentées). Enfin, l'analyse de la sécrétion des cytokines par les cellules T CD4+ spléniques a confirmé l'induction d'une tolérance. L'immunisation de souris par l'ovalbumine dans l'alun s'est traduite par une réponse de type Th2, avec une forte sécrétion d'IL-4 et une faible sécrétion dTFN-γ. En revanche, chez les souris traitées par DC CDllcIowCD45RB+, les cellules T sécrétaient de faibles quantités d'LFN-γ et d'IL-4 et un peu d'EL-10. Fait intéressant, les souris traitées par DC CDllc1"211 se différentiaient in vitro et présentaient une réponse de type Thl, avec une sécrétion prédominante d'IFN-γ. 32
Exemple 7 : La tolérance induite par les PC CDllclo CB45KB4" est transférable ux cellules T CB4+ spléniques
Nos résultats tendent à prouver que les DC CDl lclo CD45RB+ induisent une tolérance par la différenciation in vivo de cellules Tri antigénospécifiques. Par conséquent, nous avons ensuite évalué si des cellules T CD4+ spléniques isolées de souris exposées à des DC CDllclowCD45RB+ étaient capables de transférer la tolérance. Des DC CDllclowCD45RB+ isolées de la rate de souris BALB/c et puisées avec du peptide OVA in vitro, ont été injectées à des souris à cellules T reconstituées OVA-spécifiques "vierges". Sept jours plus tard, les cellules T CD4+ spléniques ont été purifiées et transférées à des souris BALB/c. Pour évaluer l'induction d'une tolérance, les souris ayant reçu le transfert ont ensuite été immunisées deux fois avec de l'OV A/alun. La figure 7 montre que les souris ayant reçu les cellules T CD4+ isolées de souris traitées avec des DC CDllclowCD45RB+ tolérogènes étaient incapables d'élaborer une réponse immune correcte contre la provocation antigénique, d'après les taux d'anticorps spécifiques anti-OVA dans le sérum et la faible réponse au rappel in vitro. En fait, les cellules T CD4+ isolées de ces animaux présentaient une faible réponse proliférative à la stimulation par l'antigène (figure 7B) et une modeste sécrétion d'IL-4 et d'IFN-γ, par rapport aux souris témoins (figure 7C). Toutefois, les cellules T CD4+ isolées de souris tolérantes sécrétaient plus fortement l'IL-10 (figure 7C). Ces résultats montrent que les DC CDl lclowCD45RB+ induisent la tolérance par la différenciation de cellules T régulatrices antigénospécifiques, capables de transférer la tolérance aux souris normales.
Exemple 8 ; cellules humaines
Des cellules dendritiques ont été différentiées à partir de cellules progénitrices CD34+ avec du GM-CSF et de 1TL-4 en présence ou en absence d'LL- 10, comme indiqué. Après 6 jours, les cellules dendritiques ont été triées en fonction de l'expression de CDl le et marquées avec les anticorps indiqués.
Les cellules purifiées ont aussi été stimulées avec du LPS pendant 24 heures, puis analysées par cytofluorométrie. 33
Les cellules dendritiques tolérogènes différentiées en présence d'IL-10 exprimaient de bas niveaux de CDllc, et de bas niveaux des molécules HLA-DR, CD80 et CD86.
L'activation avec le LPS n'a pas augmenté l'expression de HLA-DR et CD86 pour cette population, au contraire de l'effet du LPS sur les autres populations de DC testées.
Tableau: effet de l'activation avec le LPS sur les populations de cellules dendritiques triées différentiées en présence ou absence d'IL-10.
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000033_0002

Claims

34REVENPICATIONS
1. Procédé de différentiation in vitro de cellules T humaines en cellules Tri, comprenant : - l'obtention d'une population de cellules dendritiques humaines à partir de cellules progénitrices humaines capables de se différencier en cellules dendritiques par mise en culture desdites cellules progénitrices en présence d'IL-10,
" - la mise en présence desdites cellules T avec ladite population de cellules dendritiques obtenue à l'étape précédente.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules progénitrices sont issues du sang périphérique ou de la moelle osseuse.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend en outre du GM-CSF et/ou une cytokine choisie parmi l'LL-4 et l'IL- 13.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que plus de 20 % des cellules dans ladite population de cellules dendritiques est CMH II-CD80-
CD86low, présentant un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II, de CD80 et CD86 inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit niveau d'expression est au moins cinq fois inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend les facteurs de croissance GM-CSF (5 à 50 ng/ml), IL-4 ou IL-13 (2 à 5 ng/ml) , IL10 (300 à 600 ng/ml). 35
7. Population de cellules dendritiques matures ou immatures, susceptibles d'être obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que plus de 20 % des cellules présentent un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II, de CD80 et CD86 inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10.
8. Population de cellules dendritiques matures ou irmnatures, susceptibles d'être obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que plus de 20 % des cellules présentent un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II et CD86, après stimulation par le LPS, inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10, et stimulées par le LPS.
9. Population de cellules dendritiques immatures ou matures, caractérisée en ce que plus de 20 % des cellules présentent un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II, de CD80 et CD86 inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10.
10. Population de cellules dendritiques matures ou immatures selon la revendication 9, caractérisée en ce que plus de 20 % des cellules présentent un niveau d'expression surfacique des molécules du CMH II et CD86, après stimulation par le LPS, inférieur au niveau d'expression surfacique moyen des mêmes molécules observé pour des cellules dendritiques obtenues in vitro par différentiation en l'absence d'IL-10, et stimulées par le LPS.
11. Composition pharmaceutique comprenant une population de cellules selon l'une des revendications 7 à 10 et un véhicule pharmaceutique approprié. 36
12. Procédé d'obtention in vitro de cellules Tri à partir de cellules T humaines, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en présence desdites cellules T avec une population de cellules dendritiques selon l'une des revendications 7 à 10.
13. Utilisation de cellules Tri obtenues in vitro par un procédé selon l'une des revendications 1 à 6 ou 12, pour la préparation d'un médicament contre une maladie autoimmune ou mflammatoire.
14. Utilisation d'une population de cellules selon l'une des revendications 7 à 10, pour la préparation d'un médicament capable d'induire in vivo la différenciation de cellules T en cellules Tri actives, destiné au traitement d'une maladie autoimmune ou inflammatoire.
15. Utilisation d'une population de cellules selon l'une des revendications 7 à 10, lesdites cellules étant puisées avec un antigène reconnu par des cellules du système immunitaire, en particulier par des cellules T actives dans une maladie auto-immune ou inflammatoire, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter ladite maladie auto-immune ou inflammatoire.
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