[go: up one dir, main page]

WO2004085649A1 - Faktor prfb (peptide chain release factor b) aus bacillus licheniformis und dessen verwendung zur steigerung der proteinbildungsrate - Google Patents

Faktor prfb (peptide chain release factor b) aus bacillus licheniformis und dessen verwendung zur steigerung der proteinbildungsrate Download PDF

Info

Publication number
WO2004085649A1
WO2004085649A1 PCT/EP2004/001950 EP2004001950W WO2004085649A1 WO 2004085649 A1 WO2004085649 A1 WO 2004085649A1 EP 2004001950 W EP2004001950 W EP 2004001950W WO 2004085649 A1 WO2004085649 A1 WO 2004085649A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
prfb
factor
protein
seq
particularly preferably
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2004/001950
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Maren Hintz
Roland Freudl
Jörg FEESCHE
Roland Breves
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of WO2004085649A1 publication Critical patent/WO2004085649A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present application relates to the factor PrfB (peptide chain release factor B; RF-2) from Bacillus licheniformis and to all factors PrfB which are at least 93% identical at the amino acid level and at least 80% identical at the DNA level. It also relates to the additional provision of the PrfB factor and / or a PrfB factor whose activity has been improved in order to increase the protein formation rate in processes for protein production by gram-positive or gram-negative bacteria.
  • PrfB peptide chain release factor B
  • genes for the proteins of interest are introduced into host cells and transcribed, translated and, if necessary, secreted by the membranes in question into the periplasm or the surrounding medium.
  • Host cells established especially for this purpose are gram-negative bacteria, such as, for example, Escherichia coli or Klebsiella, or gram-positive bacteria, such as, for example, species of the genera Staphylococcus or Bacillus.
  • bacterial systems for protein production are selected which are established and inexpensive to ferment, which promise a high product formation rate and which ensure correct folding, modification, etc. of the protein to be produced. The latter is all the more probable as the relationship with the organism originally producing the protein of interest increases. Suitable systems are determined experimentally in individual cases. A high product formation rate is particularly desirable for economic reasons.
  • the translocation is naturally preceded by protein synthesis, which is also indicated in FIG. 5.
  • the The resulting peptide chain is kept in an unfolded state by cytoplasmic proteins with chaperone function and transported to the membrane. Then the transport of the peptide through the membrane is catalyzed with ATP consumption (Mitchell, O, Oliver, D. (1993): "Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase", Mol. Microbiol ., Volume 10 (3), pages 483-497), where SecA acts as an energy-supplying component (ATPase).
  • the signal peptide After overcoming the membrane, the signal peptide is split off by the activity of a signal peptidase and the extracellular protein is thus detached from the membrane.
  • the exoproteins In the case of gram-positive bacteria, the exoproteins are discharged directly into the surrounding medium. In Gram-negative bacteria, the proteins are then usually in the periplasm and further modifications are required to achieve their release into the surrounding medium.
  • the protein formation rate can be achieved by overexpression of the factor PrsA involved in the translocation.
  • the two applications WO 99/04406 A1 and WO 99/04407 A1 teach that protein production by gram-positive bacteria can be increased by an increased expression of the transmembrane proteins SecG or SecDF.
  • the application WO 01/81597 A1 relates to processes for the production of recombinant proteins by gram-negative bacteria, which are characterized in that the products are released into the surrounding medium. This is achieved in that, at the same time as the transgene-regulating system, a second system becomes active, which partially opens the outer membrane of the bacteria.
  • a second system becomes active, which partially opens the outer membrane of the bacteria.
  • the factor PrfB (peptide chain release factor B; also RF2) is known as part of the apparatus for protein synthesis from the prior art, both in gram-positive and in gram-negative bacteria. In connection with translation, he is responsible in particular for the detachment of the finished translated proteins from the ribosome, that is to say for the termination of the translation. This is indicated by an arrow in FIG. 5. However, the connection with the translocation also shown there and explained above is only indirect, namely that the prfB gene is expressed in many bacteria simultaneously with a gene for a translocation protein (cf. Ex. 1 and FIG. 3). According to the publication by Herbort et al.
  • subtilis are compared and a five-domain structure is proposed for them Interaction of this factor with the mitochondrion.
  • Domain V of the respective factor should have the task of to interact with the stop codon of the mRNA, and the domain I reaching approximately to amino acid 110 of the PrfB from B. subtilis is said to bind to the ribosome, at the point of contact of the two ribosomal subunits, near the L7 / L12 finger of the mediate large subunit.
  • the PrfB factor has therefore already been isolated and sequenced from various microorganisms.
  • sequences in question are usually stored in generally accessible databases, for example at the National Center for Biotechnlogy Information (NCBI), National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA; accessible via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
  • NCBI National Center for Biotechnlogy Information
  • those from E. coli and Bacillus subtilis have the registration numbers Q8XD56 and NP_391409.
  • the factor PrfB has not yet been described from B. licheniformis.
  • PrfB PrfB
  • B. licheniformis No commercial applicability has yet been proposed for PrfB, especially not for the molecules from B. licheniformis or highly homologous ones.
  • the provision of this factor in excess to increase the protein synthesis rate and thus the yield of protein produced overall has not yet been described in the prior art. It would come into consideration for the fermentative production of proteins and processes based thereon for protein production.
  • the object was to establish, in addition to the systems described in the prior art, a further system by which the processes for protein production by fermentation of bacteria can be further improved in terms of an increased yield.
  • the solution to this problem according to the invention shows two fundamental aspects. On the one hand, it is solved by providing a factor PrfB (peptide chain release factor B) with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 2 given amino acid sequence has a certain homology.
  • the other basic aspect consists in the provision of methods for protein production by fermentation of bacteria, which are generally characterized in that the factor PrfB (peptide chain release factor B) is present in the cells producing the protein with a higher activity than naturally in these cells , This second aspect brings this factor to an important commercial application. Because, as was surprisingly found in the model system B. licheniformis, an increased PrfB activity leads overall to an increase in the yield of protein production (example 3).
  • the cited first aspect of the present invention relates to a factor PrfB (peptide chain release factor B) with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 2 amino acid sequence indicated has a homology of at least 93% identity.
  • Example 1 of the present application shows how, based on a known p / ⁇ sequence, that of an unknown PrfB can be found.
  • that from B. licheniformis was identified on the basis of the sequence known for B. subtilis.
  • Both the amino acid and the protein sequence of the PrfB from B. subtilis are stored in the known databases; they are also listed under SEQ ID NO. Specify 9 and 10.
  • the DNA sequence can be used as a probe to find the homologs in question in other organisms.
  • the other sequences specified in the sequence listing can also be used for the same purpose. It is thus possible for the person skilled in the art to find further PrfB using routine methods and in particular based on Example 1.
  • a regulatory specialty of PrfB is that there is a reading frame shift in the associated gene.
  • E. coli this is, for example, in the publication "Identification of the mutations in the prfB gene of Escherichia coli K12, which confer UGA suppressor activity "by Wu, ED, Inokuchi, H. and Ozeki, H., in Jpn. J. Genet. (1990), Volume 65 (3), pages 115 to 119.
  • a correct one B. licheniformis PrfB is obtained only by skipping the T in position 73 during the transcription and only continuing from the following position, which regulates the expression of this factor, as is also noted in the sequence listing of the present application. This applies both to the wild type sequence from B. licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO. 1 and 2) described in Example 1 and to the mutant B. licheniformis E described in Example 2 (SEQ ID NO. 3 and 4).
  • B. halodurans are in SEQ ID NO. 5 and 6, but also, for example, in the GenBank database (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www3.ncbi.nlm.nih.gov) under the numbers NC_002570 and E48100 specified. There is no reading frame shift here. For this, this gene or protein has the special feature that the initiation codon TTG is translated with the amino acid methionine.
  • this gene codes prfB for a factor which, as stated in the introduction, takes on the physiologically important function of catalyzing the termination of translation in the course of protein biosynthesis. In this sense, it is a peptide chain release factor B.
  • homologs with at least 93% identity at the amino acid level are claimed according to the invention.
  • this factor can be used commercially in particular in that it can serve to increase the yield in protein production by culture of microorganisms.
  • those PrfB are particularly preferred which have an advantageous effect in terms of increasing the yield in protein production by culture of microorganisms.
  • These include in particular those variants of wild-type enzymes which have been improved with Mutagense with regard to this possible use.
  • PrfB with an amino acid sequence that corresponds to that in SEQ ID NO. 2 amino acid sequence increasingly preferred a homology of 94%, 94.5% 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5% 98%, 98.5%, 99%, 99 , 5% identity and particularly preferably 100% identity.
  • the PrfB from ß. licheniformis DSM 13 has been investigated in Examples 2 and 3 B. licheniformis E. As stated there and also shown in FIGS. 1 and 2, it is characterized by numerous mutations, of which only two, however, penetrate to the amino acid level. These are the two positions that are in homologous positions 71 and 100 of the mature protein according to SEQ ID NO. 2 correspond and there the amino acids asparagine (N) or serine (S). Compared to the wild-type molecule, the PrfB is from ß. licheniformis E is a double variant S71N / N100S.
  • this mutation has an advantageous effect on the protein formation or at least protein secretionates. Without wishing to be bound by this theory, one might assume that this effect is due to improved intramolecular interactions within this factor. Because of the fact that PrfB is technically important in accordance with the invention as a factor that improves protein production, such variants are particularly preferred.
  • the factor PrfB is not actually obtained from ⁇ . licheniformis DSM 13 but that of the associated nucleic acid. This is also in SEQ ID NO. 1 and compared to that of prfB from ß. licheniformis E indicated in Figure 2. Since this has not been previously described and the next similar gene, namely the prfB from ß. subtilis has a similarity of 78.5% identity at the DNA level, the protection range extends to correspondingly more similar nucleic acids.
  • nucleic acid with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO. 1 nucleotide sequence increasingly preferred a homology of 82.5%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 87.5%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 92, 5%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 98%, 99%, 99.5% identity and particularly preferably 100% identity.
  • nucleic acid in question has one, preferably both, positions which are in homologous positions 71 and 100 of the mature protein according to SEQ ID NO. 2 correspond, encoded for the amino acids asparagine (N) or serine (S).
  • the protection also applies to the associated nucleic acids. This is because the present invention is realized in particular via these if, for example, the relevant factor is to be provided in an increased activity in a specific cell.
  • embodiments of the present invention are nucleic acids coding for a factor PrfB with a nucleotide sequence which corresponds to that in SEQ ID NO. 1 indicated nucleotide sequence have a homology of at least 80% identity.
  • nucleic acids coding for a factor PrfB are increasingly preferred, which correspond to those in SEQ ID NO. 1 indicated nucleotide sequence a homology of 82.5%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 87.5%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 92.5% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 98%, 99%, 99.5% identity and particularly preferably 100% identity.
  • nucleic acids coding for a factor PrfB which are characterized in that they have one, preferably both, positions which are in homologous positions 71 and 100 of the mature protein according to SEQ ID NO. 2 correspond, for which amino acids encode asparagine (N) or serine (S).
  • the present invention is accomplished by providing the vectors concerned. Because the genes in question can be characterized, cultivated and introduced into host cells. Accordingly, vectors which contain one of the nucleic acids described above, in particular those which encode PrfB for one of the factors described above.
  • Preferred such vectors are characterized in that they are cloning vectors and / or expression vectors, preferably those that can be kept stable in the derived bacterial strains after transformation.
  • the cloning vectors in particular are used for characterization, for example by sequencing or permanent storage.
  • Expressin vectors implement the present invention by causing the transformed cells to produce the protein in question. In this way, they are effective according to the invention. It is particularly advantageous if in this way permanently transformed strains are obtained which, for example, can be developed into a group of derived, related strains by additionally transforming them with other genes for proteins of interest intended for production. Replication origins and resistance markers present on the plasmids in particular allow the plasmids in question to be kept stable in the cells.
  • the prB gene is under the control of an inducible promoter. In this way, the rate of protein formation can be increased from outside at a certain point in time.
  • the invention is also implemented by cells which have been obtained by transformation with one of the nucleic acids described or which are derived from such a cell, in particular by transformation with one of the vectors described.
  • this first aspect of the invention is to mention methods for producing a factor PrfB described above. Because of such processes you get this factor in its pure form. In accordance with what has been said above, this takes place molecular-biologically using one of the nucleic acids described, particularly preferably using one of the vectors described and very particularly preferably using a previously described cell containing or expressing this gene. Because these steps are usually used to obtain the factor in pure form.
  • the second aspect of the present invention consists in methods for protein production by culturing bacteria, which are characterized in that the factor PrfB (peptide chain release factor B) has a higher activity in the cells producing the protein than naturally in these Cells.
  • PrfB peptide chain release factor B
  • Methods for protein production by culturing bacteria are known per se. In principle, all protein production processes can be further improved in this way. This applies in particular to processes which are based on cultivation in liquid media and, in particular, on fermentation.
  • the implementation of the present invention is not restricted solely to the factors PrfB provided with the present application.
  • all PrfB that function in the cells intended for protein production can be used. This seems all the more promising the closer the PrfB in question is to the PrfB present endogenously in these cells.
  • a preferred method for protein production by culturing bacteria is characterized in that the higher PrfB activity is due to additional expression of the gene prfB coding for this factor PrfB.
  • Example 3 This is illustrated by Example 3, where, in addition to the endogenous prfB, a prfB is introduced on a plasmid which carries a constitutive promoter for this prfB.
  • the protein formation rate is increased compared to the comparison strain transformed with the empty vector.
  • a particularly preferred method is characterized in that the additional expression of the factor PrfB is due to additional copies of the gene prfB in the genome of the bacteria in question, preferably because of their stable establishment in the derived bacterial strains after previous transformation.
  • a stable establishment can be achieved, for example, by means of suitable selection markers located on the vectors with the pfß gene or by integrating the prfB into the bacterial chromosome. This would eliminate the selection, also made in Example 3, of an externally added substance.
  • Example 3 suggests that it makes sense to do this in ß. licheniformis DSM endogenous gene prfB against the point mutated gene from ß. licheniformis E. This can be done, for example, by homologous recombination.
  • a correspondingly preferred method according to the invention is thus characterized in that in the cells producing the protein the endogenous factor PrfB has been replaced by a PrfB with higher activity, preferably by replacing at least one endogenously present p / fß gene by the one for the PrfB with higher P / fß gene encoding activity.
  • the elements provided with the present application are used here and in all other previously described methods for protein production by culturing bacteria. Because, as shown in the examples in particular, these are useful tools for this.
  • Such methods are characterized in that the additional PrfB activity by a factor of PrfB according to the invention from ß. licheniformis related factor is achieved, preferably with the aid of a nucleic acid carried out in this connection, particularly preferably with the aid of a corresponding vector and very particularly preferably by means of a correspondingly transformed cell.
  • This cell is therefore the producer of a protein of interest, which additionally provides a PrfB according to the invention and is therefore improved in terms of its product formation rate.
  • a preferred method according to the invention is characterized in that the cells producing the protein are gram-positive bacteria, preferably of the genera Staphylococcus, Corynebacteria or Bacillus, especially of the species Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii or ß. lentus, and especially around strains of ß. licheniformis or ß. amyloliquefaciens.
  • the cells producing the protein are gram-positive bacteria, preferably of the genera Staphylococcus, Corynebacteria or Bacillus, especially of the species Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii or ß. lentus, and especially around strains of ß. lichen
  • an increase in performance according to the invention can be expected in particular if the factor PrfB which improves protein synthesis works well with the relevant protein synthesis machinery. There is a high probability of this if the PrfB originally comes from a related organism. This applies to the wild-type sequences of the PrfB provided and those PrfB which, based on these wild-type sequences, have been improved with regard to their performance increase in protein synthesis, in particular via point mutagenesis.
  • Such a method for gram-positive microorganisms is thus characterized in that the additional PrfB activity is achieved by a factor PrfB, the wild-type sequence of which comes from a gram-positive bacterium.
  • Such a method is preferred if it is characterized in that the additional PrfB activity is achieved by a factor PrfB which comes from the same genus as the gram-positive bacteria producing the protein, preferably from the same species, particularly preferably from the same strain.
  • PrfB is used which is based on the wild-type sequence. licheniformis, B. halodurans or ß. subtilis, preferably a wild-type sequence according to SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 or SEQ ID NO. 10, particularly preferably encoded by a sequence which differs from a wild-type sequence according to SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5 or SEQ ID NO. 9 derives.
  • the cells producing the protein are Gram-negative bacteria, preferably of the genera E. coli or Klebsieila, in particular strains of Escherichia coli K12, Escherichia coli B or Klebsieila planticola, and especially derivatives of the strains Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E. coli XL-1 or Klebsieila planticola (Rf).
  • E. coli or Klebsieila preferably of the genera E. coli or Klebsieila, in particular strains of Escherichia coli K12, Escherichia coli B or Klebsieila planticola, and especially derivatives of the strains Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E. coli XL-1 or Klebsieila planticola (Rf).
  • methods based on these organisms are characterized in that the additional PrfB activity is achieved by a factor PrfB, the wild-type sequence of which comes from a gram-negative bacterium.
  • those methods are further preferred which are characterized in that the additional PrfB activity is achieved by a factor PrfB which comes from the same genus as the gram-negative bacteria producing the protein, preferably from the same species, particularly preferably from the same strain.
  • the present application also provides a concrete starting point for this, which is accordingly preferred, namely the p / f ⁇ sequence from the gram-negative model organism E. coli.
  • methods of this type are preferred which are characterized in that a PrfB is used which is derived from the wild-type sequence from Escherichia coli, preferably from the wild-type sequence according to SEQ ID NO. 8, particularly preferably encoded by a sequence which differs from a wild-type sequence according to SEQ ID NO. 7 derives.
  • PrfB performance-improved variants of PrfB are of particular interest according to the invention.
  • the PrfB was made from ß in Example 2.
  • licheniformis which has the exchanges S71N and N100S compared to the wild type.
  • Preferred protein production processes according to the invention are thus characterized in that an activity-improved variant of a factor PrfB is used, preferably one which is in one, particularly preferably both, positions in positions 71 and 100 of the mature protein according to SEQ ID NO. 2 correspond to the amino acids asparagine (N) or serine (S).
  • the gene coding for the protein produced is naturally present in the cells producing the protein, preferably this protein is naturally formed by these cells.
  • transgenes that is to say those which have been introduced into suitable host cells and are expressed by them. Because this enables strains optimized for production to be used for various purposes and the known molecular biological methods can be used to produce optimized proteins that do not occur in nature in this form.
  • the gene coding for the protein produced has been introduced into the progenitor cells of the bacteria used for the production by transformation, preferably via an expression vector, particularly preferably because of its stable establishment in the derived bacterial strains. Two examples are shown in Example 3.
  • Example 3 the protein formation rate can be determined by measuring the activity in question in the supernatant.
  • an alternative that is possible according to the invention also consists in disrupting the relevant protein-producing cells after the actual production and thereby obtaining the product.
  • preferred methods are characterized in that the protein produced is secreted.
  • protein production processes which are characterized in that the protein produced is a non-enzyme, preferably a pharmacologically relevant protein, particularly preferably insulin or calcitonin.
  • enzymes are also of great technical importance, for example for biotransformation, i.e. chemical synthesis using enzymatic catalysts or as effective components in detergents and cleaning agents.
  • those methods are also claimed which are characterized in that the protein produced is an enzyme, preferably a hydrolytic enzyme or an oxidoreductase, particularly preferably a protease, amylase, hemicellulase, cellulase, lipase, cutinase , Oxidase, peroxidase or laccase.
  • the representatives that are preferably produced for use in detergents and cleaning agents are listed below.
  • proteases those of the subtilisin type are preferred, for example the alkaline protease from Bacillus lentus.
  • the protease from Bacillus lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1) is derived from the variants listed under the name BLAP ® , which are described in particular in WO 92/21760 A1, WO 95/23221 A1, WO 02/088340 A2 and WO 03 / 038082 A2.
  • gibsonii go from the patent applications WO 03/054185 A1, WO 03/056017 A2, WO 03/055974 A2 and. WO 03/054184 A1.
  • amylases which can be produced according to the invention are the ⁇ -amylases from Bacillus licheniformis, from ⁇ . amyloliquefaciens or from ß. stearothermophilus and their further developments, especially for use in detergents and cleaning agents.
  • the ⁇ -amylase from Bacillus sp. A 7-7 DSM 12368
  • CGTase cyclodextrin glucanotransferase
  • amylolytic enzymes are in the focus of the present application, which belong to the sequence space of ⁇ -amylases, which is defined in the application WO 03/002711 A2, and those which are described in the application WO 03/054 * 177 A2. Fusion products of the molecules mentioned are also meant, for example those from the application DE 10138753 A1.
  • Lipases or cutinases can also be produced according to the invention, for example the lipases originally obtainable from Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) or developed further, in particular those with the amino acid exchange D96L or the lipases or cutinases whose starting enzymes were originally isolated from Pseudomonas mendocina and Fusarium solanii.
  • cellulases that can be produced by natural producers are those from Bacillus sp. CBS 670.93 and CBS 669.93 as disclosed in WO 96/34092 A2.
  • further enzymes can be produced according to the invention, which are summarized under the term hemicellulases.
  • mannanases xanthan lyases
  • pectin lyases pectinases
  • pectin esterases pectate lyases
  • xyloglucanases xylanases
  • pullulanases ß-glucanases.
  • Detergent and cleaning agent enzymes also include oxidoreductases, for example oxidases, oxygenases, catalases, peroxides, such as halo-, chloro-, bromo-, lignin, glucose or manganese peroxidases, dioxygenases or laccases (Phenol oxidases, polyphenol oxidases) or all other enzymes described in the prior art for this area of application.
  • oxidoreductases for example oxidases, oxygenases, catalases, peroxides, such as halo-, chloro-, bromo-, lignin, glucose or manganese peroxidases, dioxygenases or laccases (Phenol oxidases, polyphenol oxidases) or all other enzymes described in the prior art for this area of application.
  • an important implementation of the invention is to use the PrfB factor to increase the yield in protein production by culturing bacteria by increasing the PrfB activity in the cells producing the protein. This happens, for example, by the fact that this factor is presented in the affected cells in a larger number or with a higher activity.
  • a preferred use is that in which the factor PrfB is derived from a factor of SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8 or 10 and particularly preferably in the homology range of the PrfB of ⁇ mentioned at the outset. licheniformis falls or has the corresponding preferred properties.
  • Such use is advantageously achieved via the associated nucleic acids, for example by introducing them into the protein-producing cells or the precursor cells using molecular biological methods.
  • According to the invention is therefore a use of a nucleic acid coding for the factor PrfB to increase the yield in protein production by culturing bacteria by additionally expressing this gene.
  • nucleic acid coding for the factor PrfB being derived from a nucleic acid of SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7 or 9; it particularly preferably falls into the described homology range of the prfB gene from ⁇ . licheniformis.
  • preferred uses according to the invention are additionally characterized in that they are based on a Transformation is based on the nucleic acid coding for the factor PrfB, preferably because of its stable establishment in the derived bacterial strains after the previous transformation.
  • preferred uses are characterized in that they are gram-positive bacteria, preferably of the genera Staphylococcus, Corynebacteria or Bacillus, in particular of the species Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens , B. globigii or ß. lentus, and especially around strains of ß. licheniformis or ß. amyloliquefaciens.
  • uses according to the invention which are characterized in that they are gram-negative bacteria, preferably of the genera E. coli or Klebsiella, in particular strains of Escherichia coli K12, of Escherichia coli B or Klebsiella planticola, and very particularly of derivatives of Strains Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E coli XL-1 or Klebsiella planticola (Rf).
  • E. coli or Klebsiella preferably of the genera E. coli or Klebsiella, in particular strains of Escherichia coli K12, of Escherichia coli B or Klebsiella planticola, and very particularly of derivatives of Strains Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM109, E coli XL-1
  • a performance-improved variant of a factor PrfB or a nucleic acid coding therefor is used, preferably one which is in one, particularly preferably both, positions in positions 71 and 100 of the mature protein according to SEQ ID NO. 2 correspond, which carries or codes for the amino acids asparagine (N) or serine (S).
  • the protein produced is a non-enzyme, preferably a pharmacologically relevant protein, particularly preferably for insulin or calcitonin.
  • the protein produced is an enzyme, preferably a hydrolytic enzyme or an oxidoreductase, particularly preferably one Protease, amylase, hemicellulase, cellulase, lipase, cutinase, oxidase, peroxidase or laccase.
  • an enzyme preferably a hydrolytic enzyme or an oxidoreductase, particularly preferably one Protease, amylase, hemicellulase, cellulase, lipase, cutinase, oxidase, peroxidase or laccase.
  • licheniformis which is available, for example, from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) under order number 13, and to control chromosomal DNA from ß.
  • Mun ⁇ . licheniformis On the chromosomal DNA of ⁇ treated with the restriction enzyme Mun ⁇ . licheniformis, a single fragment of approximately 5.5 kB in size was identified, while the chromosomal DNA was digested by ⁇ . subtilis with Mun ⁇ die for ß. expected fragments.
  • the resistance encoded by the vector was selected.
  • the method of blue / white screening selection plates contained 80 ⁇ g / ml X-Gal was used to identify clones which had taken up a vector with an insert.
  • 200 clones were obtained, of which 5 clones could be identified by colony hybridization, which ß. Hcheniformis secA gene carried. These were checked by renewed Southern blot analysis with the probe described above and a vector derived from pHSG575 with which the secA gene of .beta. licheniformis bearing 5.5 kB Mun ⁇ fragment continued under the name pHMH1.
  • the cloned 5.5 kB area was initially characterized by restriction mapping.
  • single and double digests of pHMH1 were carried out with various enzymes and those fragments which carry parts of the sec / 4 / p.fß operon were identified by means of Southern blot analysis.
  • the resulting restriction map was supplemented after complete sequencing of the 5.5 kB fragment (see below) and can be seen in FIG. 4.
  • the 5.5 kB fragment shown in FIG. 4 was sequenced in partial sequences according to standard methods.
  • the partial sequences showed strong homologies to the following genes from ß. subtilis: fliT (coded for a flagella protein), orf189 / yvyD (unknown function), secA (translokase-binding subunit; ATPase) and prfB (peptide chain release factor 2), in exactly the same gene sequence as in ß. subtilis. These genes are also shown in Figure 4.
  • ß is derived from the application WO 91/02792 A1.
  • licheniformis strain from the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (http://www.atcc.org). There he is called ß. licheniformis ATCC 53926 and ß in connection with the present application.
  • licheniformis E It is originally from the ß strain via mutagenesis. licheniformis DSM 641 and is characterized by its advantageous culture and protein synthesis performance.
  • the p / f ⁇ gene from this ⁇ is analogous to the procedure in Example 1.
  • licheniformis E have been isolated and sequenced. It is under SEQ ID NO. 3 and in Figure 2 compared to the prfB from ß. licheniformis DSM 13 shown.
  • the prfB from this strain has some point mutations compared to the B. licheniformis DSM 13 strain, but in most cases these are silent mutations. Only the exchanges in positions 213 and 300 affect the amino acid sequence: At the amino acid level, this results in ß. licheniformis E opposite ß. licheniformis DSM 13 the two amino acid exchanges S71N and N100S. The relevant codons are highlighted in Figure 2 and the derived amino acids in Figure 1.
  • SEQ ID NO. 4 shows the relevant amino acid sequence. It is like that of FIG. 1, in turn, for the prfB of ⁇ . adapted licheniformis characteristic reading frame change in DNA position 73 (see. Example 1). Both SEQ ID NO. 4 and FIG. 1 thus show the complete amino acid sequence as it results after completely correct / n-v / Vo translation.
  • PrfB is actually an interesting candidate to influence protein synthesis in Bacillus licheniformis
  • the genes prfB from ß. licheniformis DSM13 and from ß. licheniformis E were each together with that for the secreted protease subtilisin from ß. lentus (BLAP), which has been described in the application WO 91/02792 A1, in the host strain ⁇ . licheniformis (DSM 13) expressed.
  • BLAP secreted protease subtilisin from ß. lentus
  • DSM 13 the extracellular to which subtilisin from ß serves as an indicator of protein production and secretion. protease activity due to lentus.
  • the prfB genes from ß were first used, starting from the respective chromosomal DNA. licheniformis DSM13 and from ß. licheniformis E amplified by PCR and cloned via the restriction sites Sa / I and BamH ⁇ in the Escherichia coli I Bacillus subtilis sbutie vector pCU3. Then a part of the chloramphenicol resistance cassette originally present in the vector pCU3 was cut out with the restriction enzymes Mun ⁇ and ⁇ / col and exchanged for an erythromycin resistance cassette. This erythromycin resistance cassette had previously been amplified by means of PCR and corresponding primers from the vector pE194.
  • pCU3Ery-p / fß The resulting construct pCU3Ery-p / fß is shown in Figure 6.
  • the respective gene prfB is under the control of a constitutive promoter. Indeed, depending on the prfB contained, there were two vectors, pCU3Ery-p / fß (DSM13) and pCU3Ery-p / fß (E).
  • the trunk ß. licheniformis DSM13 which had previously been transformed with the vector pCB56C mentioned in WO 91/02792 A1 (ß. licheniformis DSM 13 pCB56) and thus on an expression vector the subtilisin gene from ß. lentus (BLAP) was then transformed with these two constructs and for control with the pCU3Ery empty vector without p / fß.
  • subtilisin activities of the transformants obtained were cultivated in a shake flask at a constant pH of 7.2 over a period of 3 days. For this purpose, samples were taken after 48.5 and after 72.5 h to determine the subtilisin activities in the culture supernatant. The activity was determined photometrically using the peptide substrate Suc-Ala-Ala- Pro-Phe-pNA (AAPF). The result is summarized in the following Table 1: Table 1: Subtilisin activities of ß. licheniformis DSM13 pCB56C with simultaneous pfß expression.
  • the activity of the formed is determined in U / ml of the supernatant
  • Figure 1 Alignment of the PrfB from B. licheniformis E with the wild-type sequence of the PrfB from B. halodurans at the amino acid level.
  • PrfB_Baclich_ E Variant S71 N / N100S of the PrfB from ß. licheniformis
  • PrfB_Bachalo wild-type sequence of the PrfB from B. halodurans
  • PrfB have a homology of 63.2% identity at the amino acid level.
  • the wild type sequence of PrfB from ß. licheniformis has DSM 13 on both
  • Positions 71 and 100 represent the two amino acids S and N, respectively, resulting in the same homology values. These two positions are highlighted.
  • FIG. 2 Alignment of the DNA sequences of the PrfB from B. licheniformis E, that is to say the variant S71N / N100S according to the invention, with the wild-type sequence of the PrfB as obtained from B. licheniformis DSM 13.
  • prfB_Baclich_ E Sequence of the variant S71N / N100S from ß. licheniformis
  • EprfB_Baclich_DSM wild-type sequence of the PrfB from ß. licheniformis DSM 13
  • Consensus Consensus sequence The codons that relate to the two amino acid exchanges S71N and N100S are highlighted. The
  • Figure 3 Location of prfB in ß. licheniformis
  • the prfB gene is also in the sec / 4 region and a coherent mRNA is formed, so that one can also speak of a secA / fß operon.
  • Figure 4 Restriction map of the locus of prfB in B. licheniformis
  • Example 1 the gene prfB and an orf are located in the immediate vicinity of secA on an approximately 5.5 kB fragment which is obtained from the genomic DNA of ⁇ by restriction with Mun. licheniformis can be obtained.
  • Figure 5 Schematic representation of the translation / translocation apparatus of gram-positive bacteria.
  • PrfB acts on the detachment of the protein just formed from the ribosome.
  • Figure 6 The vector pCU3Ery-p / fß
  • this vector increases the protein formation rate via the constitutive expression of the gene prfB.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft den Faktor PrfB (peptide chain release factor B; RF2) aus Bacillus licheniformis sowie alle mindestens zu 93% auf Aminosäure-Ebene und mindestens zu 80% auf DNA-Ebene identischen Faktoren PrfB. Diese und prinzipiell alle PrfB können zur Steigerung der Proteinbildungsrate bei Verfahren zur Proteinherstellung durch grampositive oder gramnegative Bakterien genutzt werden, inbesondere die, deren Sequenzen mit der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt werden. Dabei handelt es sich um die aus den Spezies B. licheniformis, B. halodurans, B. subtilis und Escherichia coli. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist somit die zusätzliche Bereitstellung des Faktors PrfB zur Steigerung der Proteinbildungsrate bei Verfahren zur Proteinherstellung durch grampositive oder gramnegative Bakterien. Besonders vorteilhaft sind hierfür in ihrer Aktivität verbesserte Faktoren PrfB. Eine hinsichtlich ihrer Aktivität verbesserte Variante wurde mit den Aminosäureaustauschen S71N/N100S in homologer Lage zur Wildtypsequenz des PrfB aus B. licheniformis gefunden.

Description

FAKTOR PRFB ( PEPTIDE CHAIN RELEASE FACTOR B) AUS BACILLUS LICHENIFORMIS UND DESSEN VERWENDUNG ZUR STEIGERUNG DER PROTEINBILDUNGSRATE
Die vorliegende Anmeldung betrifft den Faktor PrfB (peptide chain release factor B; RF- 2) aus Bacillus licheniformis sowie alle mindestens zu 93% auf Aminosäure-Ebene und mindestens zu 80% auf DNA-Ebene identischen Faktoren PrfB. Sie betrifft ferner die zusätzliche Bereitstellung des Faktors PrfB und/oder eines in seiner Aktivität verbesserten Faktors PrfB zur Steigerung der Proteinbildungsrate bei Verfahren zur Proteinherstellung durch grampositive oder gramnegative Bakterien.
Gentechnische Verfahren zur Proteinherstellung sind im Stand der Technik seit langem etabliert. Hierfür werden die Gene für die interessierenden Proteine in Wirtszellen eingebracht und von diesen transkribiert, translatiert und gegebenenfalls durch die betreffenden Membranen in das Periplasma, beziehungsweise das umgebende Medium sekretiert. Besonders zu diesem Zweck etablierte Wirtszellen sind gramnegative Bakterien, wie beispielsweise Escherichia coli oder Klebsiella, oder grampositive Bakterien, wie beispielsweise Spezies der Gattungen Staphylococcus oder Bacillus.
Bei gentechnischen Verfahren zur Proteinherstellung werden zunächst die natürlichen Fähigkeiten der zur Produktion eingesetzten Mikroorganismen zur Synthese und gegebenenfalls zur Sekretion der Proteine ausgenutzt. Grundsätzlich werden als bakterielle Systeme zur Proteinherstellung solche ausgewählt, die etabliert und kostengünstig in der Fermentation sind, die eine hohe Produktbildungsrate versprechen und die eine korrekte Faltung, Modifizierung etc. des herzustellenden Proteins gewährleisten. Letzteres ist mit zunehmender Verwandtschaft mit dem das interessierende Protein ursprünglich produzierenden Organismus umso wahrscheinlicher. Im Einzelfall werden geeignete Systeme experimentell ermittelt. Eine hohe Produktbildungsrate ist dabei aus wirtschaftlichen Gründen besonders erstrebenswert.
Zur Steigerung der aus dem jeweils gewählten System erzielbaren Ausbeute an gebildetem Protein sind zahlreiche sich ergänzende und überwiegend auch gleichzeitig anwendbare Strategien erarbeitet worden. Hierzu gehören beispielsweise Optimierungen, die (1.) auf den physiologischen Zustand der jeweils gewählten Wirtszellen einwirken, etwa die Nährmedienzusammensetzung oder Prozeßparameter wie die Belüftung (beispielsweise EP 211241 A2), (2.) genetische Optimierungen, wie beispielsweise Anpassungen in der Codon-Usage, Erhöhung der Kopienzahl des Transgens, etwa durch Verwendung sogenannter Multicopynumber-Plasmide (beispielsweise DD 277468 A1), oder Erhöhung der Lebensdauer der zugehörigen mRNA und (3.) die Erhöhung der Transkriptions- und/oder der Translationsrate, etwa durch Etablierung geeigneter Kontrollelemente. So ist beispielsweise gemäß WO 92/19721 A2 eine Regulation über Faktoren beziehungsweise Gene möglich, die auf die Transkription wirken.
Diese zuletzt genannte Strategie setzt also an der Sekretion der gebildeten Proteine in das Periplasma (bei gramnegativen Bakterien) beziehungsweise in das umgebende Medium (sowohl bei gramnegativen als auch bei grampositiven Bakterien) an, die prinzipiell in dem Aufsatz von A.J. Driessen (1994): "How proteins cross the bacterial cytoplasmic membrane" in J. Membr. Biol., Band 142(2). Seite 145-159 beschrieben ist. Der dazu notwendige Sekretionsapparat besteht aus einer Reihe unterschiedlicher, hauptsächlich membranassoziierter Proteine. Hierzu gehören z.B. bei Bacillus subtilis die Proteine SecA, DF, E, G und Y (van Wely, K.H., Swaving, J., Freudl, R., Driessen, A.J. (2001): "Translocation of proteins across the cell envelope of Gram-positive bacteria", FEMS Microbiol Rev. 2001, Band 25(4), Seite 437-454). Voraussetzung für die Translokation ist, daß die auszuschleusenden Proteine N-terminal über ein Signalpeptid verfügen (Park, S., Liu, G., Topping, T.B., Cover, W.H., Randall, L.L. (1988): "Modulation of folding pathways of exported proteins by the leader sequence", Science, Band 239, Seite 1033-1035). Eine in Hinblick auf die vorliegende Anmeldung ergänzte Darstellung des Translokationsapparats ist in Figur 5 gezeigt.
Eine neuere Untersuchung von B.v.d.Berg et al. (2004; Nature, Band 427, Seiten 36 bis 44) beschreibt die Röntgenstruktur der Translokase, das heißt des SecY-Komplexes aus Methanococcus jannaschii als Modell für den entsprechenden Komplex in anderen Organismen.
Der Translokation vorgeschaltet ist naturgemäß die Proteinsynthese, die ebenfalls in Figur 5 angedeutet ist. Nach der an den Ribosomen erfolgten Translation wird die entstandene Peptidkette durch cytoplasmatische Proteine mit Chaperon-Funktion in einem ungefalteten Zustand gehalten und zur Membran transportiert. Dann wird unter ATP-Verbrauch der Transport des Peptids durch die Membran katalysiert (Mitchell, O, Oliver, D. (1993): "Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase", Mol. Microbiol., Band 10(3), Seite 483-497), wobei SecA als energieliefernde Komponente (ATPase) fungiert. Nach Überwindung der Membran wird das Signalpeptid durch die Aktivität einer Signalpeptidase abgespalten und damit das extrazelluläre Protein von der Membran abgelöst. Bei grampositiven Bakterien erfolgt auf diese Weise die Ausschleusung der Exoproteine direkt ins umgebende Medium. Bei gramnegativen Bakterien befinden sich die Proteine anschließend in der Regel im Periplasma und es bedarf weiterer Modifikationen, um ihre Freisetzung in das umgebende Medium zu erreichen.
Nach der Lehre von WO 94/19471 A1 kann die Proteinbildungsrate durch Überexpression des an der Translokation beteiligten Faktors PrsA erzielt werden. Die beiden Anmeldungen WO 99/04406 A1 und WO 99/04407 A1 lehren, die Proteinproduktion durch grampositive Bakterien könne durch eine verstärkte Expression der Transmembranproteine SecG beziehungsweise SecDF gesteigert werden.
Die Anmeldung WO 01/81597 A1 betrifft Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine durch gramnegative Bakterien, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Produkte in das umgebende Medium abgegeben werden. Dies wird demnach dadurch erreicht, daß gleichzeitig zu dem das Transgen regulierenden System ein zweites System aktiv wird, das die äußere Membran der Bakterien partiell öffnet. Hierbei handelt es sich um Systeme, die natürlicherweise nicht mit dem Proteinsynthese oder -Tanslokationsapparat vergesellschaftet sind, sondern im Gegenteil einen eher pathologischen Zustand der Zelle kennzeichnen, beispielsweise das Colicin- oder das Kil-System.
Der Faktor PrfB (peptide chain release factor B; auch RF2) ist als Teil des Apparats zur Proteinsynthese aus dem Stand der Technik bekannt, und zwar sowohl bei grampositiven als auch bei gramnegativen Bakterien. Er ist im Zusammenhang mit der Translation insbesondere für die Ablösung der fertig translatierten Proteine vom Ribosom, das heißt für die Termination der Translation verantwortlich. Dies ist in Figur 5 über einen Pfeil angedeutet. Der Zusammenhang mit der ebenfalls dort dargestellten und oben erläuterten Translokation ist jedoch nur indirekt gegeben, nämlich darüber, daß das Gen prfB in vielen Bakterien gleichzeitig mit einem Gen für ein Translokationsprotein exprimiert wird (vgl. Bsp. 1 und Figur 3). Nach der Publikation von Herbort et al. (1999; "Temporal expression of the Bacillus subtilis secA gene, encoding a central component of the preprotein translocase", J. Bacteriol., Band 1_81 (2), Seiten 493-500) liegt das zugehörige Gen prfB bei B. subtilis hinter dem für den Faktor SecA als zweites auf einem bicistronischen Operon. Nach diesem Artikel werden beide Gene zusammenhängend und gegen Ende der exponentiellen Wachstumsphase maximal exprimiert, was mit der höchsten Sekretionsrate von Exoenzymen einhergeht. In der stationären Wachstumsphase nimmt die Bildungsrate von SecA, und damit auch von PrfB demgegenüber wieder deutlich ab.
Die Arbeit von Karow et al. (1998; "Suppression of TGA mutations in the Bacillus subtilis spollR gene by prfB mutations", J. Bacteriol., Band 180 (16), Seiten 4166-70) offenbart die Aminosäuresequenzen der PrfB aus den Mikroorganismen B. subtilis, Streptomyces coelicolor, E. coli, Salmonella typhimurium und Haemophilus influenzae.
Die Publikation „Sequence comparison of new prokaryotic and mitochondrial members of the polypeptide chain release factor family predicts a five-domain model for release factor structure" (H.J.Pel et al. (1992); Nucl. Acids Res., Band 20, Seiten 4423 bis 4428) verweist auf verschiedene im Stand der Technik beschriebene Peptidkettenablösungsfaktoren B (PrfB), insbesondere auf die Ähnlichkeiten zwischen solchen, die aus Mitochondrien und aus Prokaryonten erhalten werden können. Zum einen wird darin die Regulation der Expression dieses Gens in E. coli, Salmonella typhimurium und B. subtilis durch eine Leserahmenmutation dargestellt. Zum anderen werden darin die Sequenzen der Faktoren mRF-1 aus Mitochondrien, und RF-1 und RF- 2 aus B. subtilis miteinander verglichen und für diese eine Fünfdomänenstruktur vorgeschlagen. Darauf aufbauend wird ein Modell der Wechselwirkung dieses Faktors mit dem Mitochondrium entwickelt. So soll der Domäne V des jeweiligen Faktors die Aufgabe zukommen, mit dem Stop-Codon der mRNA in Wechselwirkung zu treten, und die bis ungefähr zur Aminosäure 110 des PrfB aus B. subtilis reichende Domäne I soll die Bindung ans Ribosom, an der Berührungsstelle der beiden ribosomalen Untereinheiten, nahe dem L7/L12-Finger der großen Untereinheit vermitteln. Der Faktor PrfB ist also bereits aus verschiedenen Mikroorganismen isoliert und sequenziert worden. Die betreffenden Sequenzen sind zumeist in allgemein zugänglichen Datenbanken hinterlegt, beispielsweise bei dem National Center for Biotechnlogy Information (NCBI), National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA; zugänglich über http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Beispielsweise die aus E. coli und aus Bacillus subtilis tragen dort die Eintragungsnummern Q8XD56 beziehungsweise NP_391409. Aus B. licheniformis ist der Faktor PrfB dagegen bislang noch nicht beschrieben worden.
Für PrfB ist bislang auch noch keine gewerbliche Anwendbarkeit vorgeschlagen worden, insbesondere nicht für den aus B. licheniformis oder hierzu hochhomologe Moleküle. Insbesondere die Bereitstellung dieses Faktors im Überschuß zur Steigerung der Proteinsyntheserate und damit der Ausbeute an insgesamt hergestelltem Protein ist im Stand der Technik noch nicht beschrieben worden. Sie käme für die fermentative Herstellung von Proteinen und darauf aufbauende Verfahren zur Protein-Herstellung in Betracht. Ebensowenig gibt es Literatur über die Modifizierung von PrfB durch Punktmutagenese und eine auf diese Weise mögliche Steigerung der Syntheserate von fermentativ hergestellten Proteinen.
Es stellte sich die Aufgabe, zusätzlich zu den im Stand der Technik beschriebenen Systemen ein weiteres System zu etablieren, nach welchem die Verfahren zur Proteinherstellung durch Fermentation von Bakterien hinsichtlich einer erhöhten Ausbeute weiter verbessert werden können.
Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe zeigt zwei grundsätzliche Aspekte. Zum einen wird sie durch Bereitstellung eines Faktors PrfB (Peptide chain release factor B) mit einer Aminόsäuresequenz gelöst, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz eine gewisse Homologie aufweist. Der andere grundsätzliche Aspekt besteht in der Bereitstellung von Verfahren zur Proteinherstellung durch Fermentation von Bakterien, die allgemein dadurch gekennzeichnet sind, daß der Faktor PrfB (peptide chain release factor B) in den das Protein herstellenden Zellen in einer höheren Aktivität als natürlicherweise in diesen Zellen vorliegt. Dieser zweite Aspekt führt diesen Faktor einer wichtigen gewerblichen Anwendung zu. Denn wie im Modellsystem B. licheniformis überraschenderweise gefunden wurde, führt eine erhöhte PrfB-Aktivität insgesamt zu einer Ausbeutesteigerung bei der Proteinherstellung (Beipiel 3). Ohne an diese Theorie gebunden sein wollen, könnte man vermuten, daß dieser Effekt darauf zurückzuführen ist, daß eine Erhöhung der PrfB- Aktivität die Ablösung neu gebildeter Aminosäureketten von den Ribosomen beschleunigt und somit die betreffenden Ribosomen rascher für die Synthese weiterer Proteine zur Verfügung stehen. Anhand jeder einzelnen mRNA dürften somit mehr Proteine synthetisiert werden als im Vergleich zum normalen intrazellulären PrfB- Aktivitätsniveau.
Der genannte erste Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Faktor PrfB (Peptide chain release factor B) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz eine Homologie von mindestens 93% Identität aufweist.
Wie einleitend bereits dargestellt sind im Stand der Technik bereits Faktoren PrfB aus verschiedenen Mikroorganismen beschrieben worden. Ihre Funktion im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese ist wohlbekannt und wird beispielsweise durch Figur 5 illustriert. Überraschenderweise ist der Faktor PrfB aus Bacillus licheniformis bislang noch nicht beschrieben worden.
In Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung ist dargestellt, wie ausgehend von einer bekannten p/ ß-Sequenz die eines unbekannten PrfB gefunden werden kann. In diesem Fall wurde auf der Grundlage der für B. subtilis bekannten Sequenz diejenige aus B. licheniformis identifiziert. Sowohl die Aminosäure- als auch die Proteinsequenz des PrfB aus B. subtilis sind in den bekannten Datenbanken hinterlegt; zusätzlich werden sie unter SEQ ID NO. 9 und 10 angeben. Insbesondere die DNA-Sequenz kann als Sonde verwendet werden, um in weiteren Organismen die betreffenden Homologe zu finden. Zu dem gleichen Zweck können auch die übrigen im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen verwendet werden. Dem Fachmann ist es somit über Routine-Methoden und insbesondere in Anlehnung an Beispiel 1 möglich, weitere PrfB aufzufinden.
Eine regulatorische Besonderheit von PrfB besteht, wie in Beispiel 1 ebenfalls erläutert ist, darin, daß im zugehörigen Gen eine Leserahmenverschiebung vorliegt. Für E. coli ist dies beispielsweise in der Publikation "Identification of the mutations in the prfB gene of Escherichia coli K12, which confer UGA suppressor activity" von Wu, E.D., Inokuchi, H. und Ozeki, H., in Jpn. J. Genet. (1990), Band 65(3), Seiten 115 bis 119 beschrieben. Ein korrekter PrfB von B. licheniformis wird nur dadurch erhalten, daß bei der Transkription das T in Position 73 übersprungen und sie erst ab der nachfolgenden Position fortgesetzt wird. Hierüber wird, wie auch im Sequenzprotokoll der vorliegenden Anmeldung jeweils angemerkt ist, die Expression dieses Faktors reguliert. Dies gilt sowohl für die in Beispiel 1 beschriebene Wildtypsequenz aus B. licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO. 1 und 2) als auch für die der in Beispiel 2 beschriebenen Mutante B. licheniformis E (SEQ ID NO. 3 und 4).
Die DNA- und Aminosäure-Sequenzen für B. halodurans sind in SEQ ID NO. 5 und 6, beispielsweise aber auch in der Datenbank GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www3.ncbi.nlm.nih.gov) unter den Nummern NC_002570 beziehungsweise E48100 angegeben. Hier liegt keine Leserahmenverschiebung vor. Dafür weist dieses Gen beziehungsweise Protein die Besonderheit auf, daß das Initiationscodon TTG mit der Aminosäure Methionin übersetzt wird.
Die beiden nachfolgend im Sequenzprotokoll offenbarten, wie einleitend erläutert aber auch allgemein zugänglichen Faktoren sind die Faktoren PrfB aus E. coli und B. subtilis. Sie weisen wiederum die genannte Leserahmenmutation auf. Und zwar wird bei E coli das T in Position 76 und in B. subtilis das T in Position 73 überlesen, um einen vollständigen PrfB zu synthetisieren. Dadurch ergeben sich die unter SEQ ID NO. 8 beziehungsweise 10 angegebenen Aminosäuresequenzen.
In all diesen Organismen ist zumindest über Homologievergleiche nachgewiesen, daß dieses Gen prfB für einen Faktor codiert, der wie einleitend dargestellt die physiologisch wichtige Funktion übernimmt, im Verlaufe der Proteinbiosynthese die Termination der Translation zu katalysieren. In diesem Sinne handelt es sich um einen Peptide chain release factor B.
Die Recherchen in den öffentlich zugänglichen Datenbanken (GenBank: National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; EMBL-European Bioinformatics Institute (EBI) in Cambridge, Großbritannien) mit den nach Beispiel 1 aus ß. licheniformis DSM 13 erhaltenen Seqenzen ergaben folgende am nächsten verwandte Gene beziehungsweise Faktoren: Das nächstähnliche Gen ist das prfB aus ß. subtilis. Homologievergleiche auf DNA- und auf Aminosäureebene ergaben hierfür Ähnlichkeiten von 78,5, beziehungsweise 92,4% Identität. Der zweitähnlichste, vorbeschriebene Faktor ist PrfB aus ß. halodurans mit 63% und der drittähnlichste der aus E. coli mit 45,7% Identität auf Aminosäure-Ebene.
Aus diesem Grund werden erfindungsgemäß Homologe mit mindestens 93% Identität auf Aminosäure-Ebene beansprucht. Hierzu gehören sowohl Wildtyp-Enzyme als auch Varianten, die beispielsweise durch gezielte oder ungezielte Mutagenese erhalten werden können.
Die gewerbliche Einsetzbarkeit dieses Faktors besteht erfindungsgemäß insbesondere darin, daß er zur Erhöhung der Ausbeute bei der Proteinherstellung durch Kultur von Mikroorganismen dienen kann. Aus diesem Grund sind innerhalb des genannten Homologiebereichs insbesondere solche PrfB bevorzugt, die hinsichtlich der Ausbeuteerhöhung bei der Proteinherstellung durch Kultur von Mikroorganismen eine vorteilhafte Wirkung zeigen. Hierzu zählen ganz besonders solche Varianten von Wildtypenzymen, die über Mutagense hinsichtlich dieser Einsatzmöglichkeit verbessert worden sind.
Zunehmend bevorzugt sind solche Faktoren PrfB mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt eine Homologie von 94%, 94,5% 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5% 98%, 98,5%, 99%, 99,5% Identität und besonders bevorzugt 100% Identität aufweisen.
Denn umso ähnlicher sind sie damit dem gefundenen und in den Beispielen als erfindungsgemäß einsetzbar beschriebenen PrfB aus ß. licheniformis DSM 13.
Als Variante des PrfB aus ß. licheniformis DSM 13 ist in den Beispielen 2 und 3 B. licheniformis E untersucht worden. Er zeichnet sich, wie dort dargelegt und auch in den Figuren 1 und 2 dargestellt ist, durch zahlreiche Mutationen aus, von denen aber nur zwei auf die Aminosäure-Ebene durchschlagen. Dabei handelt es sich um die beiden Positionen, die in homologer Lage den Positionen 71 und 100 des maturen Proteins nach SEQ ID NO. 2 entsprechen und dort die Aminosäuren Asparagin (N) beziehungsweise Serin (S) aufweisen. Gegenüber dem Wildtypmolekül handelt es sich bei dem PrfB aus ß. licheniformis E also um eine Doppelvariante S71N/N100S.
Wie in Beispiel 3 belegt ist, wirkt sich diese Mutation vorteilhaft auf die Proteinbildungsoder zumindest Proteinsekretionsate aus. Ohne an diese Theorie gebunden sein wollen, könnte man vermuten, daß dieser Effekt auf verbesserte intramolekulare Interaktionen innerhalb dieses Faktors zurückzuführen ist. Aufgrund der erfindungsgemäß technisch bedeutenden Einsatzmöglichkeit von PrfB als ein die Proteinherstellung verbessernder Faktor sind solche Varianten besonders bevorzugt.
In Beispiel 1 ist nicht eigentlich die Gewinnung des Faktors PrfB aus ß. licheniformis DSM 13 sondern die der zugehörigen Nukleinsäure beschrieben. Diese ist auch in SEQ ID NO. 1 und im Vergleich zu der von prfB aus ß. licheniformis E in Figur 2 angegeben. Da diese nicht vorbeschrieben worden ist und das nächstähnliche Gen, nämlich das prfB aus ß. subtilis eine Ähnlichkeit von 78,5% Identität auf DNA-Ebene aufweist, erstreckt sich der Schutzbereich auf entsprechend ähnlichere Nukleinsäuren.
Beansprucht werden also alle Faktoren PrfB, die von einer Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz codiert werden, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz eine Homologie von mindestens 80% Identität aufweist.
Zunehmend bevorzugt sind solche, die von einer Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz codiert werden, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz zunehmend bevorzugt eine Homologie von 82,5%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 87,5%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 92,5%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 99%, 99,5% Identität und besonders bevorzugt 100% Identität aufweisen.
Entsprechend dem oben Gesagten gilt dies insbesondere für leistungsverbesserte Varianten eines Faktors PrfB, insbesondere solche, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die betreffende Nukleinsäure für eine, vorzugsweise beide Positionen, die in homologer Lage den Positionen 71 und 100 des maturen Proteins nach SEQ ID NO. 2 entsprechen, für die Aminosäuren Asparagin (N) beziehungsweise Serin (S) codiert.
Entsprechend diesen Ausführungen gilt der Schutz auch für die zugehörigen Nukleinsäuren. Denn insbesondere über diese wird die vorliegende Erfindung realisiert, wenn beispielsweise in einer bestimmten Zelle der betreffende Faktor in einer erhöhten Aktivität bereitgestellt werden soll.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind dementsprechend für einen Faktor PrfB codierende Nukleinsäuren mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz eine Homologie von mindestens 80% Identität aufweisen.
Hierunter sind die für einen Faktor PrfB codierenden Nukleinsäuren zunehmend bevorzugt, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz eine Homologie von 82,5%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 87,5%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 92,5%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 99%, 99,5% Identität und besonders bevorzugt 100% Identität aufweisen.
Dies gilt insbesondere für einen Faktor PrfB codierende Nukleinsäuren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie für eine, vorzugsweise beide Positionen, die in homologer Lage den Positionen 71 und 100 des maturen Proteins nach SEQ ID NO. 2 entsprechen, für die Aminosäuren Asparagin (N) beziehungsweise Serin (S) codieren.
Jeweils sehr hochverwandte, in diesem Schutzbereich liegende erfindungsgemäße Gene werden erhalten, wenn durch Deletion des den Leserahmen verschiebenden Nukleotids ein durchgehendes Leseraster erzeugt wird. Dies könnte zum einen die Bildungsrate des betreffenden Faktors und damit seine intrazelluläre Aktivität steigern und zum anderen das betreffende Gen für den Einsatz in einem Mikroorganismus prädestinieren, der in vivo nicht über solch eine Leserahmenverschiebung innerhalb des Gens prfB verfügt.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die vorliegende Erfindung durch die Bereitstellung betreffender Vektoren verwirklicht. Weil dadurch die betreffenden Gene charakterisiert, kultiviert und in Wirtszellen eingebracht werden können. Dementsprechend werden Vektoren, der eine der oben beschriebenen Nukleinsäuren enthalten, insbesondere solche, die für einen der oben beschriebenen Faktoren PrfB codieren.
Bevorzugte derartige Vektoren sind dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei ihnen um Klonierungsvektoren und/oder um Expressionsvektoren handelt, vorzugsweise um solche, die nach Transformation stabil in den abgeleiteten Bakterienstämmen gehalten werden können.
Denn insbesondere die Klonierungsvektoren dienen der Charakterisierung, etwa durch Sequenzierung oder der dauerhaften Lagerung. Expressinsvektoren verwirklichen die vorliegende Erfindung, indem sie die transformierten Zellen dazu bringen, das betreffende Protein zu bilden. Auf diese Weise werden sie erfindungsgemäß wirksam. Besonders vorteilhaft ist es, wenn hierdurch dauerhaft transformierte Stämme erhalten werden, die beispielsweise zu einer Schar von abgeleiteten, verwandten Stämmen weiterentwickelt werden können, indem sie zusätzlich mit jeweils anderen Genen für interessierende, für die Produktion gedachte Proteine transformiert werden. Insbesondere auf den Plasmiden vorhandene Replikationsursprünge und Resistenzmarker erlauben es, daß die betreffenden Plasmide stabil in den Zellen gehalten werden können. Bei Expressionsvektoren ist es zuaätzlich besonders vorteilhaft, wenn das prB-Gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht. Hierdurch kann die Steigerung der Proteinbildungsrate zu einem bestimmten Zeitpunkt von außen vorgenommen werden.
Entsprechend dem oben Gesagten wird die Erfindung auch durch Zellen verwirklicht, die durch Transformation mit einer der beschriebenen Nukleinsäuren erhalten worden sind oder sich von solch einer Zelle ableitet, insbesondere durch Transformation mit einem der beschriebenen Vektoren.
Hierunter sind solche bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie einen der beschriebenen Faktoren PrfB produzieren. Dies dient einerseits der Gewinnung und biochemischen Charakterisierung dieses Proteins. Andererseits sind eben solche Zellen, die ein erfindungsgemäßes PrfB produzieren und somit intrazellulär über eine höhere PrfB-Aktivität als Wildtypzellen verfügen, besonders leistungsfähig hinsichtlich der Proteinbildungsrate.
Als letzte Ausführungsform dieses ersten Erfindungsaspekts sind Verfahren zur Herstellung eines oben beschriebenen Faktors PrfB zu nennen. Denn durch solche Verfahren erhält man diesen Faktor in seiner reinen Form. Entsprechend dem oben Gesagten geschieht dies molekularbiologisch unter Einsatz einer der beschriebenen Nukleinsäuren, besonders bevorzugt unter Einsatz eines der beschriebenen Vektoren und ganz besonders bevorzugt unter Einsatz einer zuvorbeschriebenen, dieses Gen enthaltenden beziehungsweise exprimierenden Zelle. Denn über diese Schritte erfolgt üblicherweise die Gewinnung des Faktors in Reinform.
Wie oben bereits erwähnt besteht der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung in Verfahren zur Proteinherstellung durch Kultivierung von Bakterien, die dadurch gekennzeichnet sind, daß der Faktor PrfB (peptide chain release factor B) in den das Protein herstellenden Zellen in einer höheren Aktivität als natürlicherweise in diesen Zellen vorliegt.
Dies macht den Faktor PrfB gegenüber seinen Beschreibungen im Stand der Technik, die bislang eher akademischen Charakter besessen haben, wirtschaftlich interessant. Mit ihm steht neben anderen Möglichkeiten, die eingangs dargestellt worden sind, ein weiterer Ansatzpunkt zur Verfügung, über den die Proteinherstellung durch Kultivierung von Bakterien hinsichtlich ihrer Ausbeute verbessert werden kann. Bislang sind insbesondere Verbesserungen vorgenommenen worden, die (1.) auf den physiologischen Zustand der jeweils gewählten Wirtszellen einwirken, (2.) genetische Optimierungen, oder (3.) die Erhöhung der Transkriptions-, Translations- oder der Translokationsrate darstellen (s.o.). Es steht zu erwarten, daß der nun zur Verfügung gestellte neue Ansatzpunkt mit den bisherigen Techniken kombiniert werden kann und somit bislang bereits befriedigende Ausbeuten weiter gesteigert werden können. In Einzelfällen, wo eine der bisherigen Methoden nicht erfolgreich gewesen sein mag, stellt dieser neue Ansatz eine neue Alternative dar.
Verfahren zur Proteinherstellung durch Kultivierung von Bakterien sind an sich bekannt. Es können also prinzipiell alle Proteinherstellungsverfahren auf diese Weise weiter verbessert werden. Insbesondere gilt dies für Verfahren, die auf der Kultivierung in flüssigen Medien und hierunter insbesondere auf der Fermentation beruhen.
Da für keines dieser Verfahren die Bedeutung des Faktors PrfB zuvor diskutiert worden ist, ist die Verwirklichung der vorliegenden Erfindung nicht allein auf die mit der vorliegenden Anmeldung zur Verfügung gestellten Faktoren PrfB beschränkt. Prinzipiell können alle in den für die Proteinherstellung gedachten Zellen funktionierenden PrfB eingesetzt werden. Dies scheint umso erfolgversprechender, je näher verwandt der betreffende PrfB mit dem jeweils endogen in diesen Zellen vorhandenen PrfB ist. Ein bevorzugtes Verfahren zur Proteinherstellung durch Kultivierung von Bakterien ist dadurch gekennzeichnet, daß die höhere PrfB-Aktivität auf zusätzliche Expression des für diesen Faktor PrfB codierenden Gens prfB zurückzuführen ist.
Dies wird durch Beispiel 3 veranschaulicht, wo zusätzlich zu dem endogenen prfB auf einem Plasmid ein prfB eingebracht wird, welches für dieses prfB einen konstitutiven Promotor trägt. Bereits in dem Fall, wo das endogene prfB in einer zweiten identischen Kopie vorgelegt wird (pCU3Ery-p/fß(DSM13)), ist die Proteinbildungsrate gegenüber dem mit dem leeren Vektor transformierten Vergleichsstamm erhöht.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist dabei dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche Expression des Faktors PrfB auf zusätzliche Kopien des Gens prfB im Genom der betreffenden Bakterien zurückzuführen ist, vorzugsweise aufgrund deren stabilen Etablierung in den abgeleiteten Bakterienstämmen nach vorangegangener Transformation.
Denn die stabile Transformation mit diesem leistungssteigernden Element ermöglicht es, wie oben ausgeführt, nach demselben Prinzip Produktionsstämme für eine Vielzahl verschiedener interessierender Produkte herzustellen. Eine stabile Etablierung kann beispielsweise über geeignete, auf den Vektoren mit dem pfß-Gen gelegenen Selektionsmarkern oder durch Integration des prfB ins bakterielle Chromosom erzielt werden. Hierdurch würde die, auch in Beispiel 3 vorgenommene Selektion über eine extern zugesetzte Substanz entfallen.
Besonders vorteilhaft ist es, einen endogenen PrfB, der in dem möglicherweise aus anderen Gründen interessanten Produktionsstamm weniger aktiv ist, gegen einen leistungsfähigeren PrfB zu ersetzen. So legt etwa Beispiel 3 nahe, daß es sinnvoll ist, das in ß. licheniformis DSM endogen vorhandene Gen prfB gegen das punktmutierte Gen aus ß. licheniformis E auszutauschen. Dies kann beispielsweise über eine homologe Rekombination erfolgen. Zusätzlich ergibt sich die Möglichkeit, beispielsweise über die oben ausgeführten Vektoren zusätzliche Genkopien in die betreffende Zelle einzubringen und damit über den Gendosiseffekt eine zusätzliche Leistungssteigerung zu erzielen. Ein entsprechend bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist somit dadurch gekennzeichnet, daß in den das Protein herstellenden Zellen der endogene Faktor PrfB durch einen PrfB mit höherer Aktivität ersetzt worden ist, vorzugsweise unter Ersatz mindestens eines endogen vorhandenen p/fß-Gens durch das für den PrfB mit höherer Aktivität codierende p/fß-Gen.
Vorteilhafterweise wird hierbei und bei allen anderen bisher beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Proteinherstellung durch Kultivierung von Bakterien auf die mit der vorliegenden Anmeldung zur Verfügung gestellten Elemente zurückgegriffen. Denn diese stellen, wie insbesondere in den Beispielen gezeigt, brauchbare Werkzeuge dafür dar.
Derartige Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche PrfB-Aktivität durch einen erfindungsgemäß mit dem Faktor PrfB aus ß. licheniformis verwandten Faktor erzielt wird, vorzugsweise mit Hilfe einer in diesem Zusammenhang ausgeführten Nukleinsäure, besonders bevorzugt mit Hilfe eines entsprechenden Vektors und ganz besonders bevorzugt durch eine entsprechend transformierte Zelle. Bei dieser Zelle handelt es sich also um den Produzenten eines interessierenden Proteins, die zusätzlich einen erfindungsgemäßen PrfB bereitstellt und damit hinsichtlich ihrer Produktbildungsrate verbessert ist.
Aufgrund der großen Bedeutung, die grampositiven, und hierunter bestimmten grampositiven Bakterien bei der technischen Proteinherstellung zukommt, ist ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den das Protein herstellenden Zellen um grampositive Bakterien handelt, vorzugsweise der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii oder ß. lentus, und ganz besonders um Stämme von ß. licheniformis oder ß. amyloliquefaciens.
Wie oben gesagt ist insbesondere dann eine erfindungsgemäße Leistungssteigerung zu erwarten, wenn der die Proteinsynthese verbessernde Faktor PrfB mit der betreffenden Proteinsynthesemaschinerie gut zusammenarbeitet. Hierfür besteht besonders dann eine hohe Wahrscheinlichkeit, wenn der PrfB ursprünglich aus einem verwandten Organismus stammt. Dies betrifft also die Wildtyp-Sequenzen der bereitgestellten PrfB und solche PrfB, die ausgehend von diesen Wildtyp-Sequenzen hinsichtlich ihrer Leistungssteigerung in der Proteinsynthese verbessert worden sind, insbesondere über Punktmutagenese.
Ein derartiges Verfahren für grampositive Mikroorganismen ist somit dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche PrfB-Aktivität durch einen Faktor PrfB erreicht wird, dessen Wildtypseqenz aus einem grampositiven Bakterium stammt.
Bevorzugt ist ein derartiges Verfahren, wenn es dadurch gekennzeichnet ist, daß die zusätzliche PrfB-Aktivität durch einen Faktor PrfB erreicht wird, der aus derselben Gattung wie die das Protein herstellenden grampositiven Bakterien stammt, vorzugsweise aus derselben Spezies, besonders bevorzugt aus demselben Stamm.
Besonders leicht zu realisierende, weil mit der vorliegenden Anmeldung zur Verfügung gestellte derartige Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß ein PrfB eingesetzt wird, der sich von der Wildtypsequenz aus ß. licheniformis, B. halodurans oder ß. subtilis ableitet, vorzugsweise einer Wildtypsequenz nach SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 beziehungsweise SEQ ID NO. 10, besonders bevorzugt codiert von einer Sequenz, die sich von einer Wildtypsequenz nach SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5 beziehungsweise SEQ ID NO. 9 ableitet.
Denn hierbei handelt es sich die betreffenden Wildtyp-Sequenzen aus den genannten grampositiven Mikroorganismen. Im Falle eines anderen grampositiven Bakteriums erscheint es dennoch vielversprechend, die Leistungssteigerung ersteinmal mit einem der hier angegebenen Faktoren beziehungsweise Gene zu versuchen. Vorteilhafterweise werden hiervon leistungsverbesserte Varianten eingesetzt. Insbesondere die Wahlmöglichkeit zwischen den Seqenzen aus ß. halodurans und den anderen Bacilli bietet einen guten Ansatzpunkt, weil in den zuletzt genannten Fällen in vivo über eine Leserahmenverschiebung reguliert wird, bei ß. halodurans aber nicht (s.o.). Diese Eigenheit sollte vorteilhafterweise mit den entsprechenden Regulationsfähigkeiten des Wirtsorganismus korrelieren. Andernfalls bietet sich, wie bereits oben gesagt, die Möglichkeit, über Punktmutagenese einen durchgängigen Leserahmen zu erzeugen und entsprechende Vorteile zu erzielen. Insbesondere für die Charakterisierung von Genen und Proteinen im Labormaßstab aber auch für die großtechnische Produktion werden auch gramnegative Bakterien eingesetzt. Entsprechend ihrer Bedeutung sind auch entsprechende erfindungsgemäße Proteinherstellungsverfahren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Derartig bevorzugte Verfahren mit den zuvor dargestelltten Eigenschaften sind zusätzlich dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den das Protein herstellenden Zellen um gramnegative Bakterien handelt, vorzugsweise der Gattungen E. coli oder Klebsieila, insbesondere um Stämme von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsieila planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsieila planticola (Rf).
Entsprechend dem für die grampositiven Organismen Gesagten sind Verfahren auf der Grundlage dieser Organismen dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche PrfB- Aktivität durch einen Faktor PrfB erreicht wird, dessen Wildtypseqenz aus einem gramnegativen Bakterium stammt.
Weiter bevorzugt sind dementsprechend solche Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die zusätzliche PrfB-Aktivität durch einen Faktor PrfB erreicht wird, der aus derselben Gattung wie die das Protein herstellenden gramnegativen Bakterien stammt, vorzugsweise aus derselben Spezies, besonders bevorzugt aus demselben Stamm.
Auch hierfür liefert die vorliegende Anmeldung einen konkreten Ansatzpunkt, der dementsprechend bevorzugt ist, nämlich die p/fß-Sequenz aus dem gramnegativen Modellorganismus E. coli. Entsprechend dem zu den übrigen Sequenzen Gesagten sind derartige Verfahren bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß ein PrfB eingesetzt wird, der sich von der Wildtypsequenz aus Escherichia coli ableitet, vorzugsweise von der Wildtypsequenz nach SEQ ID NO. 8, besonders bevorzugt codiert von einer Sequenz, die sich von einer Wildtypsequenz nach SEQ ID NO. 7 ableitet.
Wie bereits angesprochen sind insbesondere leistungsverbesserte Varianten von PrfB von erfindungsgemäßem Interesse. Als solch eine Variante wurde in Beispiel 2 der PrfB aus ß. licheniformis beschrieben, der gegenüber dem Wildtyp die Austausche S71N und N100S aufweist. Bevorzugte erfindungsgemäße Proteinherstellungsverfahren sind somit dadurch gekennzeichnet, daß eine aktivitätsverbesserte Variante eines Faktors PrfB eingesetzt wird, vorzugsweise eine, die in einer, besonders bevorzugt beiden Positionen, die in homologer Lage den Positionen 71 und 100 des maturen Proteins nach SEQ ID NO. 2 entsprechen, die Aminosäuren Asparagin (N) beziehungsweise Serin (S) trägt.
Eine Vielzahl technischer Proteinherstellungsverfahren baut auf den von den betreffenden Mikroorganismen natürlicherweise gebildeten Faktoren auf. So wurden beispielsweise die wirtschaftlich bedeutenden Subtilisine als solche Faktoren gefunden, die von Bacilli, die mit ß. subtilis verwandt sind, gebildet und sekretiert werden. Wenn also nicht nur die betreffenden Gene vorhanden sondern auch abgelesen werden, handelt es sich um bevorzugte Verfahren.
Entsprechend bevorzugte Verfahren sind folglich dadurch gekennzeichnet, daß das für das hergestellte Protein codierende Gen natürlicherweise in den das Protein herstellenden Zellen vorhanden ist, vorzugsweise dieses Protein von diesen Zellen natürlicherweise gebildet wird.
Demgegenüber gewinnen solche Proteinherstellungsverfahren zunehmend an Bedeutung, die auf sogenannten Transgenen aufbauen, also solchen, die in geeignete Wirtszellen eingebracht worden sind und von diesen exprimiert werden. Denn hierdurch können für die Produktion optimierte Stämme für verschiedene Zwecke ausgenutzt werden und es können über die bekannten molekularbiologischen Methoden optimierte Proteine hergestellt werden, die in dieser Form in der Natur nicht vorkommen.
Dementsprechend bevorzugte Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß das für das hergestellte Protein codierende Gen durch Transformation in die Vorläuferzellen der zur Herstellung eingesetzten Bakterien eingebracht worden ist, vorzugsweise über einen Expressionsvektor, besonders bevorzugt aufgrund dessen stabiler Etablierung in den abgeleiteten Bakterienstämmen. Zwei Beispiele gehen aus Beispiel 3 hervor.
Sowohl für endogen codierte Proteine als auch für solche die von Transgenen abgeleitet sind, ist es besonders vorteilhaft, wenn sie aus dem umgebenden Kulturmedium isoliert und damit aufgereinigt werden können. So konnte etwa auch in Beispiel 3 die Erhöhung der Proteinbildungsrate durch Messung der betreffenden Aktivität im Überstand bestimmt werden. Eine erfindungsgemäß mögliche Alternative besteht jedoch auch darin, die betreffenden das Protein herstellenden Zellen im Anschluß an die eigentliche Produktion aufzuschließen und dadurch das Produkt zu erhalten.
Entsprechend bevorzugte Verfahren sind folglich dadurch gekennzeichnet, daß das hergestellte Protein sekretiert wird.
Von ganz besonderem Interesse sind erfindungsgemäße Verfahren, die auf bestimmte, durch die Kultivierung der Mikroorganismen hergestellte Produkte ausgerichtet sind. Entsprechend bevorzugt sind somit Proteinherstellungsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei dem hergestellten Protein um ein Nicht-Enzym handelt, vorzugsweise um ein pharmakologisch relevantes Protein, besonders bevorzugt um Insulin oder Calcitonin.
Aber auch Enzyme sind von großer technischer Bedeutung, beispielsweise für die Biotransformation, das heißt die chemische Synthese über enzymatische Katalysatoren oder als wirksame Komponenten in Wasch- und Reinigungsmitteln. Also werden erfindungsgemäß auch solche Verfahren beansprucht, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei dem hergestellten Protein um ein Enzym handelt, vorzugsweise um ein hydrolytisches Enzym oder um eine Oxidoreduktase, besonders bevorzugt um eine Protease, Amylase, Hemicellulase, Cellulase, Lipase, Cutinase, Oxidase, Peroxidase oder Laccase. Hiervon seien die für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln bevorzugt produzierten Vertreter im folgenden ausgeführt.
Prinzipiell können derartigen Mitteln zur Steigerung der Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung alle im Stand der Technik etablierten Enzyme eingesetzt werden. Unter den Proteasen sind solche vom Subtilisin-Typ bevorzugt, beispielsweise die Alkalische Protease aus Bacillus lentus. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1) leiten sich die unter der Bezeichnung BLAP® geführten Varianten ab, die insbesondere in WO 92/21760 A1, WO 95/23221 A1 , WO 02/088340 A2 und WO 03/038082 A2 beschrieben werden. Weitere erfindungsgemäß herstellbaren Proteasen aus verschiedenen Bacillus sp. und ß. gibsonii gehen aus den Patentanmeldungen WO 03/054185 A1, WO 03/056017 A2, WO 03/055974 A2 und . WO 03/054184 A1 hervor. Beispiele für erfindungsgemäß herstellbare Amylasen sind die α-Amylasen aus Bacillus licheniformis, aus ß. amyloliquefaciens oder aus ß. stearothermophilus sowie deren, insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Weiterentwicklungen. Desweiteren sind für diesen Zweck die in der Anmeldung WO 02/10356 A2 offenbarte α-Amylase aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) und die in der Anmeldung WO 02/44350 A2 beschriebene Cyclodextrin-Glucanotransferase (CGTase) aus ß. agaradherens (DSM 9948) hervorzu heben. Ferner liegen die amylolytischen Enzyme im Blickfeld der vorliegenden Anmeldung, die dem Sequenzraum von α-Amylasen angehören, der in der Anmeldung WO 03/002711 A2 definiert wird, und die, die in der Anmeldung WO 03/054*177 A2 beschrieben werden. Ebenso sind Fusionsprodukte der genannten Moleküle gemeint, beispielsweise die aus der Anmeldung DE 10138753 A1.
Erfindungsgemäß können auch Lipasen oder Cutinasen hergestellt werden, beispielsweise die ursprünglich aus Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) erhältlichen, beziehungsweise weiterentwickelten Lipasen, insbesondere solche mit dem Aminosäureaustausch D96L oder die Lipasen beziehungsweise Cutinasen, deren Ausgangsenzyme ursprünglich aus Pseudomonas mendocina und Fusarium solanii isoliert worden sind.
Ferner ist insbesondere für die technische Behandlung von Textilien, aber auch für Waschmittel an Cellulasen gedacht, beispielsweise Endoglucanase, und/oder Cellobiohydrolasen. Beispielsweise auch durch die natürlichen Produzenten herstellbare Cellulasen sind die aus Bacillus sp. CBS 670.93 und CBS 669.93, wie sie in WO 96/34092 A2 offenbart werden. Ferner können erfindungsgemäß weitere Enzyme hergestellt werden, die unter dem Begriff Hemicellulasen zusammengefaßt werden. Hierzu gehören beispielsweise Mannanasen, Xanthanlyasen, Pektinlyasen (=Pektinasen), Pektinesterasen, Pektatlyasen, Xyloglucanasen (=Xylanasen), Pullulanasen und ß-Glucanasen.
Ebenfalls zu den Wasch- und Reinigungsmittel-Enzymen zählen Oxidoreduktasen, beispielsweise Oxidasen, Oxygenasen, Katalasen, Peroxϊdasen, wie Halo-, Chloro-, Bromo-, Lignin-, Glucose- oder Mangan-peroxidasen, Dioxygenasen oder Laccasen (Phenoloxidasen, Polyphenoloxidasen) oder alle anderen im Stand der Technik für dieses Einsatzgebiet beschriebenen Enzyme.
Die vorliegende Erfindung wird nicht allein durch die bislang ausgeführten Substanzen und Verfahren sondern auch durch bestimmte Verwendungsmöglichkeiten der genannten Substanzen realisiert. Sie werden ebenfalls und entsprechend den bisherigen Ausführungen in den Schutzbereich der vorliegenden Anmeldung einbezogen.
So besteht eine wichtige Umsetzung der Erfindung darin, den Faktor PrfB zur Erhöhung der Ausbeute bei der Proteinherstellung durch Kultivierung von Bakterien durch Erhöhung der PrfB-Aktivität in den das Protein herstellenden Zellen zu verwenden. Dies geschieht beispielsweise dadurch, daß dieser Faktor in den treffenden Zellen in größerer Zahl oder mit einer höheren Aktivität vorgelegt wird.
Eine bevorzugte Verwendung ist die, wobei der Faktor PrfB von einem Faktor der SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8 oder 10 abgeleitet ist und besonders bevorzugt in den eingangs ausgeführten Homologiebereich des PrfB von ß. licheniformis fällt beziehungsweise die entsprechend bevorzugten Eigenschaften aufweist.
Solch eine Verwendung wird günstigerweise über die zugehörigen Nukleinsäuren erreicht, etwa indem sie über molekularbiologische Methoden in die proteinherstellenden Zellen beziehungsweise die Vorläuferzellen eingebracht werden. Erfindungsgemäß ist somit eine Verwendung einer für den Faktor PrfB codierenden Nukleinsäure zur Erhöhung der Ausbeute bei der Proteinherstellung durch Kultivierung von Bakterien durch zusätzliche Expression dieses Gens.
Vorteilhafterweise greift man dabei auf die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen und als entsprechend günstig erkannten Sequenzen zurück. Dementsprechend bevorzugt ist jede derartige Verwendung einer Nukleinsäure, wobei die für den Faktor PrfB codierende Nukleinsäure von einer Nukleinsäure der SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7 oder 9 abgeleitet ist; besonders bevorzugt fällt sie in den beschriebenen Homologiebereich des Gens prfB aus ß. licheniformis.
Entsprechend den molekularbiologischen Möglichkeiten sind erfindungsgemäß bevorzugte Verwendungen zusätzlich dadurch gekennzeichnet, daß sie auf einer Transformation mit der für den Faktor PrfB codierenden Nukleinsäure beruht, vorzugsweise aufgrund deren stabiler Etablierung in den abgeleiteten Bakterienstämmen nach vorangegangener Transformation.
Aufgrund der oben dargestellten Bedeutung grampositiver Bakterien sind entsprechend bevorzugte Verwendungen dadurch gekennzeichnet, daß es sich um grampositive Bakterien handelt, vorzugsweise der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii oder ß. lentus, und ganz besonders um Stämme von ß. licheniformis oder ß. amyloliquefaciens.
Entsprechendes gilt für erfindungsgemäße Verwendungen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um gramnegative Bakterien handelt, vorzugsweise der Gattungen E. coli oder Klebsiella, insbesondere um Stämme von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
Weiter bevorzugt sind analog dem oben Gesagten derartige Verwendungen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß eine leistungsverbessete Variante eines Faktors PrfB oder eine hierfür codierende Nukleinsäure eingesetzt wird, vorzugsweise eine, die in einer, besonders bevorzugt beiden Positionen, die in homologer Lage den Positionen 71 und 100 des maturen Proteins nach SEQ ID NO. 2 entsprechen, die Aminosäuren Asparagin (N) beziehungsweise Serin (S) trägt beziehungsweise hierfür codiert.
Da derartige Verwendungsmöglichkeiten insbesondere im Zuammenhang mit der Herstellung wirtschaftlich bedeutender Proteine relevant sind, sind besonders solche derartigen Verwendungen bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei dem hergestellten Protein um ein Nicht-Enzym handelt, vorzugsweise um ein pharmakologisch relevantes Protein, besonders bevorzugt um Insulin oder Calcitonin.
Entsprechendes gilt für derartige Verwendungen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei dem hergestellten Protein um ein Enzym handelt, vorzugsweise um ein hydrolytisches Enzym oder um eine Oxidoreduktase, besonders bevorzugt um eine Protease, Amylase, Hemicellulase, Cellulase, Lipase, Cutinase, Oxidase, Peroxidase oder Laccase.
Beispiele
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1
Isolierung des Gens prfB aus ß. licheniformis
Identifizierung des prfiB-Locus in B. licheniformis
Zur Identifizierung des sec>4/p/7B-Locus in ß. licheniformis wurde über PCR eine Gensonde anhand der bekannten Sequenz des p/fß-sec.4-Genorts von ß. subtilis (Datenbank "Subtilist" des Institut Pasteur, 25,28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, Frankreich; http://genolist.pasteur.fr/SubtiList ; Stand: 16.8.2002) abgeleitet. Dieser Genort ist auch in Figur 3 dargestellt. Die erhaltene Sonde war 3113 bp lang und umfaßte zusätzlich die ersten 451 bp des N-terminalen Bereichs des Gens prfB. Anschließend wurden Präparationen von chromosomaler DNA von ß. licheniformis, der beispielsweise von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) unter der Bestellnummer 13 erhältlich ist, und zur Kontrolle chromosomale DNA von ß. subtilis mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und einer Southern-Hybridisierung mit der genannten Sonde unterworfen. An der mit dem Restriktionsenzym Mun\ behandelten chromosomalen DNA von ß. licheniformis wurde ein einziges Fragment in der Größe von ca. 5,5 kB identifiziert, während der Verdau der chromosomalen DNA von ß. subtilis mit Mun\ die für ß. subtilis erwarteten Fragmente lieferte.
Klonierung des identifizierten Bereich aus B. licheniformis DSM13
Chromosomale DNA desselben Stamms ß. licheniformis wurde isoliert, präparativ mit Mun\ verdaut und der DNA-Bereich um 5,5 kB über Agarosegel-Elektrophorese isoliert sowie die Nucleinsäuren daraus mit kommerziell erhältlichen Kits extrahiert. Das erhaltene Gemisch von Mu/il-geschnittenen DNA-Fragmenten wurde in die mit Mun\ kompatible EcoRI-Schnittstelle des Low-copy-number-Vektors pHSG575 (beschrieben in: "High-copy-number and low-copy-number vectors for lacZ alpha-complementation and chloramphenicol- or kanamycin-resistance selection"; S. Takeshita; M. Sato; M. Toba; W. Masahashi; T. Hashimoto-Gotoh; Gene (1987), Band 61., Seiten 63-74) ligiert und in E. coli JM109 (erhältlich von der Firma Promega, Mannheim, Deutschland) transformiert.
Es wurde auf die vom Vektor kodierte Resistenz selektiert. Zusätzlich diente die Methode des Blau/Weiß-Screenings (Selektionsplatten enthielten 80 μg/ml X-Gal) zur Identifizierung von Klonen, die einen Vektor mit Insert aufgenommen hatten. Darüber wurden 200 Klone erhalten, von denen über Koloniehybridisierung 5 Klone identifiziert werden konnten, die das ß. Hcheniformis-secA-Gen trugen. Diese wurden durch erneute Southern-Blot-Analyse mit der oben beschriebenen Sonde überprüft und ein von pHSG575 abgeleiteter Vektor mit dem das secA-Gen von ß. licheniformis tragenden, 5,5 kB umfassenden Mun\ Fragment unter der Bezeichnung pHMH1 fortgeführt.
Restriktionsanalyse
Der klonierte 5,5 kB-Bereich wurde zunächst über Restriktionskartierung charakterisiert. Hierzu wurden mit verschiedenen Enzymen Einzel- und Doppelverdaus von pHMH1 durchgeführt und mittels Southern-Blot-Analyse solche Fragmente identifiziert, die Teile des sec/4/p.fß-Operons tragen. Die daraus resultierende Restriktionskarte wurde nach vollständiger Sequenzierung des 5,5 kB Fragments (siehe unten) ergänzt und ist in Figur 4 zu sehen.
Sequenzanalyse
Das in Figur 4 gezeigte 5,5 kB große Fragment wurde in Teilsequenzen nach Standard- Methoden sequenziert. Die Teilsequenzen zeigten starke Homologien zu folgenden Genen aus ß. subtilis: fliT (codiert für ein Flagellen-Protein), orf189/yvyD (unbekannte Funktion), secA (Translokase-bindende Untereinheit; ATPase) und prfB (Peptide Chain Release Factor 2), in genau der gleichen Genabfolge wie bei ß. subtilis. Diese Gene sind ebenfalls in Figur 4 gezeigt.
In der Sequenz wurde auch ein offener Leserahmen im Bereich von Bp 4177-5278 gefunden, der für ein 366 Aminosäuren großes Protein codiert. Im Bereich -14 bis -8 zum Translationsstart befindet sich homolog zu dem entsprechenden Bereich im ß. subtilis- Genom eine mögliche Ribosomen-Bindestelle (GAGGTGA). Diese aus ß. licheniformis DSM 13 ermittelte DNA-Sequenz ist unter SEQ ID NO. 1 dargestellt; die abgeleitete Aminosäuresequenz geht aus SEQ ID NO. 2 hervor.
Dazu ist zu bemerken, daß in zahlreichen Spezies, und offensichtlich auch in ß. licheniformis die Expression von prfB auf eine besondere Weise reguliert wird: Dabei erfolgt innerhalb des Gens ein Wechsel des Leserahmens. Aus diesem Grunde ist die Zahl der in SEQ ID NO. 1 angebenen Positionen um 1 höher als eine Vielfache von Drei. Bei vollständiger //7- Vo-Synthese dieses Faktors werden die ersten 72 Nukleotide, also die, die für die ersten 24 Aminosäuren codieren, korrekt transkribiert, dann das T in Position 73 übersprungen und zur Erzeugung eines durchgängigen Leserahmens die Transkription ab Position 74 mit dem Codon GAC (entsprechend Asp 25) bis zum Ende des Gens fortgesetzt. In SEQ ID NO. 2 ist die zusammenhängende Aminosäuresequenz des PrfB aus B. licheniformis DSM 13 wiedergegeben, wie er nach diesem Beispiel erhalten wurde. Diese Sequenz und insbesondere der Wechsel des Leserahmens werden durch Homologievergleiche mit den Sequenzen anderer Faktoren PrfB aus den einschlägigen Datenbanken unterstützt.
Recherchen in öffentlich zugänglichen Datenbanken (GenBank: National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; EMBL-European Bioinformatics Institute (EBI) in Cambridge, Großbritannien) ergaben als nächstähnliches Gen das prfB aus ß. subtilis. Homologievergleiche auf DNA- und auf Aminosäureebene ergaben hierfür Ähnlichkeiten von 78,5, beziehungsweise 92,4% Identität. Für den PrfB aus ß. halodurans wurden 63% und für den aus E. coli 45,7% Identität auf Aminosäure-Ebene bestimmt.
Aufgrund dieser Werte kann ferner davon ausgegangen werden, daß das PrfB aus ß. licheniformis dieselbe biochemische Aktivität wie insbesondere das PrfB von ß. subtilis ausübt und damit dieselbe physiologische Funktion übernimmt.
Beispiel 2
Die Variante S71N/N100S
Aus der Anmeldung WO 91/02792 A1 geht ein spezieller ß. licheniformis-Stamm hervor, der bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (http://www.atcc.org) hinterlegt worden ist. Er trägt dort die Bezeichnung ß. licheniformis ATCC 53926 und im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung ß. licheniformis E. Er ist ursprünglich über Mutagenese von dem Stamm ß. licheniformis DSM 641 abgeleitet worden und zeichnet sich durch vorteilhafte Kultur- und Proteinsyntheseleistungen aus.
Analog dem Vorgehen in Beispiel 1 ist das p/fß-Gen aus diesem ß. licheniformis E isoliert und sequenziert worden. Es ist unter SEQ ID NO. 3 und in Figur 2 im Vergleich zu dem prfB aus ß. licheniformis DSM 13 dargestellt. Wie in Figur 2 zu sehen ist, weist das prfB aus diesem Stamm gegenüber dem Stamm B. licheniformis DSM 13 einige Punktmutationen auf, die in den meisten Fällen jedoch stille Mutationen sind. Lediglich die Austausche in den Positionen 213 und 300 wirken sich auf die Aminosäuresequenz aus: Auf Aminosäure-Ebene ergeben sich somit für ß. licheniformis E gegenüber ß. licheniformis DSM 13 die beiden Aminosäure-Austausche S71N und N100S. Die betreffenden Codons sind in Figur 2 und die abgeleiteten Aminosäuren in Figur 1 hervorgehoben.
Auch SEQ ID NO. 4 zeigt die betreffende Aminosäuresequenz. Sie ist wie die von Figur 1 wiederum an den für prfB von ß. licheniformis charakteristischen Leserahmenwechsel in DNA-Position 73 angepaßt (vgl. Beispiel 1). Sowohl SEQ ID NO. 4 als auch Figur 1 zeigen somit die vollständige Aminosäuresequenz, wie sie sich nach vollständig korrekter /n-v/Vo-Translation ergibt.
Es liegt nahe, daß die guten Protein-Syntheseleistungen des Stammes ß. licheniformis E zumindest zu einem Teil auf diese beiden Aminosäureautausche S71N und N100S im Faktor PrfB zurückzuführen sind.
Beispiel 3
Messung der Bildungsrate von extrazellulärer Protease bei gleichzeitiger
Expression des p/fß-Gens
Um zu untersuchen, ob PrfB tatsächlich ein interessanter Kandidat ist, um darüber gezielt Einfluß auf die Proteinsynthese in Bacillus licheniformis zu nehmen, wurden die Gene prfB aus ß. licheniformis DSM13 und aus ß. licheniformis E wurden jeweils zusammen mit dem für die sekretierte Protease Subtilisin von ß. lentus (BLAP), die in der Anmeldung WO 91/02792 A1 beschrieben worden ist, in dem Wirtsstamm ß. licheniformis (DSM 13) zur Expression gebracht. Als Indikator für die Proteinherstellung und -Sekretion dient in diesem System die extrazelluläre, auf das Subtilisin aus ß. lentus zurückzuführende Proteaseaktivität.
Dafür wurden ausgehend von der jeweiligen chromosomalen DNA zunächst die prfB- Gene aus ß. licheniformis DSM13 und aus ß. licheniformis E mittels PCR amplifiziert und über die Restriktionsschnittstellen Sa/I und BamH\ in den Escherichia coli I Bacillus subtilis-Sbutie Vektor pCU3 Moniert. Anschließend wurde ein Teil der ursprünglich im Vektor pCU3 vorliegenden Chloramphenicol-Resistenzkassette mit den Restriktionsenzymen Mun\ und Λ/col ausgeschnitten und gegen eine Erythromycin- Resistenzkassette ausgetauscht. Diese Erythromycin-Resistenzkassette war zuvor mittels PCR und entsprechenden Primern aus dem Vektor pE194 amplifiziert worden. Das hierdurch erhaltene Konstrukt pCU3Ery-p/fß ist in Figur 6 dargestellt. Das jeweilige Gen prfB steht darin unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors. In der Tat handelte es sich je nach dem enthaltenem prfB um zwei Vektoren, um pCU3Ery- p/fß(DSM13) und um pCU3Ery-p/fß(E).
Der Stamm ß. licheniformis DSM13, der zuvor mit dem in WO 91/02792 A1 genannten Vektor pCB56C transformiert worden war (ß. licheniformis DSM 13 pCB56) und somit auf einem Expressionsvektor das Subtilisin-Gen aus ß. lentus (BLAP) enthielt, wurde dann mit diesen beiden Konstrukten und zur Kontrolle mit dem pCU3Ery-Leervektor ohne p/fß transformiert.
Zur Bestimmung der prfB-Wirkung wurden die Subtilisin-Aktivitäteή der erhaltenen Transformanten bei Kultivierung im Schüttelkolben bei konstantem pH-Wert von 7,2 über einen Zeitraum von 3 Tagen hin untersucht. Dazu wurden nach 48,5 und nach 72,5 h Proben zur Bestimmung der Subtilisin-Aktivitäten im Kulturüberstand genommen. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte photometrisch mit Hilfe des Peptidsubstrats Suc-Ala-Ala- Pro-Phe-pNA (AAPF). Das Ergebnis ist in folgender Tabelle 1 zusam mengfaßt: Tabelle 1 : Subtilisin-Aktivitäten von ß. licheniformis DSM13 pCB56C bei gleichzeitiger pfß-Expression.
Angegeben ist jeweils die in U / ml des Überstands ermittelte Aktivität des gebildeten
Subtilisins.
Figure imgf000030_0001
Diese Werte zeigen, daß die zusätzliche Expression des Faktors PrfB aus dem Wildtyp- Stamm DSM 13 durch das Plasmid pCU3Ery-p/fß(DSM13), das heißt durch die intrazelluläre Erhöhung der PrfB-Aktivität die Produktbildungsrate bereits steigert. Eine zusätzliche Steigerung erkennt man bei Verwendung des Faktors PrfB S71N/N100S, wie er ausgehend von dem Plasmid pCU3Ery-pr B(E) gebildet wird.
Beschreibung der Figuren
Figur 1: Alignment des PrfB aus B. licheniformis E mit der Wildtypsequenz des PrfB aus B. halodurans auf Aminosäure-Ebene.
Darin bedeuten:
PrfB_Baclich_ E: Variante S71 N/N100S des PrfB aus ß. licheniformis
PrfB_Bachalo: Wildtypsequenz des PrfB aus B. halodurans
Consensus: Consensus-Sequenz
Diese beiden PrfB weisen auf Aminosäure-Ebene eine Homologie von 63,2% Identität auf. Die Wildtypsequenz von PrfB aus ß. licheniformis DSM 13 besitzt an den beiden
Positionen 71 und 100 die beiden Aminosäuren S, beziehungsweise N, wodurch sich dieselben Homologiewerte ergeben. Diese beiden Positionen sind hervorgehoben.
Figur 2: Alignment der DNA-Sequenzen des PrfB aus B. licheniformis E, das heißt der erfindungsgemäßen Variante S71N/N100S, mit der Wildtypsequenz des PrfB, wie sie aus B. licheniformis DSM 13 erhalten wird.
Darin bedeuten: prfB_Baclich_ E: Sequenz der Variante S71N/N100S aus ß. licheniformis EprfB_Baclich_DSM: Wildtypsequenz des PrfB aus ß. licheniformis DSM 13Consensus: Consensus-SequenzDie Codons, die die beiden Aminosäure-Austausche S71N und N100S betreffen, sind hervorgehoben. Die
Unterschiede sind jeweils auf ein verändertes Nukleotid in den Positionen 213 und 300 zurückzuführen.
Figur 3: Genort von prfB in ß. licheniformis
Man erkennt, daß in der sec/4-Region auch das Gen prfB liegt und eine zusammenhängende mRNA gebildet wird, so daß auch von einem secA /fß-Operon gesprochen werden kann.
Figur 4: Restriktionskarte des Genorts von prfB in B. licheniformis
Wie in Beispiel 1 dargestellt befinden sich in unmittelbarer Nachbarschaft zu secA das Gen prfB und ein orf auf einem ca. 5,5 kB großen Fragment, das durch Restriktion mit Mun\ aus der genomischen DNA von ß. licheniformis erhalten werden kann. Figur 5: Schematische Darstellung des Translations/Translokations-Apparats grampositiver Bakterien.
Sinngemäß nach van Wely, K.H., Swaving, J., FreudI, R., Driessen, A.J. (2001); "Translocation of proteins across the cell envelope of Gram-positive bacteria", FEMS Microbiol Rev. 2001, Band 25(4), Seite 437-54; PrfB wurde hinzugefügt. PrfB wirkt, wie über einen Pfeil dargestellt ist, auf die Ablösung des gerade gebildeten Proteins vom Ribosom.
Figur 6: Der Vektor pCU3Ery-p/fß
Dieser Vektor bewirkt, wie in Beispiel 3 beschrieben ist, über die konstitutive Expression des Gens prfB eine Steigerung der Proteinbildungsrate.

Claims

Patentansprüche
1. Faktor PrfB (Peptide chain release factor B) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz eine Homologie von mindestens 93% Identität aufweist.
2. Faktor PrfB nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt eine Homologie von 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Identität und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
3. Variante eines Faktors PrfB nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in einer, vorzugsweise beiden Positionen, die in homologer Lage den Positionen 71 und 100 des maturen Proteins nach SEQ ID NO. 2 entsprechen, die Aminosäuren Asparagin (N) beziehungsweise Serin (S) vorliegen.
4. Faktor PrfB, codiert von einer Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz eine Homologie von mindestens 80% Identität aufweist.
5. Faktor PrfB nach Anspruch 4, codiert von einer Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz zunehmend bevorzugt eine Homologie von 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5% Identität und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
6. Variante eines Faktors PrfB nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die betreffende Nukleinsäure für eine, vorzugsweise beide Positionen, die in homologer Lage den Positionen 71 und 100 des maturen Proteins nach SEQ ID NO. 2 entsprechen, für die Aminosäuren Asparagin (N) beziehungsweise Serin (S) codiert.
7. Für einen Faktor PrfB codierende Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz eine Homologie von mindestens 80% Identität aufweist.
8. Für einen Faktor PrfB codierende Nukleinsäure nach Anspruch 7 mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz zunehmend bevorzugt eine Homologie von 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist.
9. Für einen Faktor PrfB codierende Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie für eine, vorzugsweise beide Positionen, die in homologer Lage den Positionen 71 und 100 des maturen Proteins nach SEQ ID NO. 2 entsprechen, für die Aminosäuren Asparagin (N) beziehungsweise Serin (S) codiert.
10. Vektor, der eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 7 bis 9 enthält, insbesondere einen, der für einen Faktor PrfB nach einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert.
11. Vektor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen Klonierungsvektor und/oder um einen Expressionsvektor handelt, vorzugsweise um einen, der nach Transformation stabil in den abgeleiteten Bakterienstämmen gehalten werden kann.
12. Zelle, die durch Transformation mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 7 bis 9 erhalten worden ist oder sich von solch einer Zelle ableitet, insbesondere durch Transformation mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 10 oder 11.
13. Zelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Faktor PrfB nach einem der Ansprüche 1 bis 6 produziert.
14. Verfahren zur Herstellung eines Faktors PrfB nach einem der Ansprüche 1 bis 6 unter Einsatz einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 7 bis 9, besonders unter Einsatz eines Vektors nach einem der Ansprüche 10 oder 11 , ganz besonders bevorzugt unter Einsatz einer Zelle nach einem der Ansprüche 12 oder 13.
15. Verfahren zur Proteinherstellung durch Kultivierung von Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß der Faktor PrfB (peptide chain release factor B) in den das Protein herstellenden Zellen in einer höheren Aktivität als natürlicherweise in diesen Zellen vorliegt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die höhere PrfB- Aktivität auf zusätzliche Expression des für diesen Faktor PrfB codierenden Gens prfB zurückzuführen ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche Expression des Faktors PrfB auf zusätzliche Kopien des Gens pyfß im Genom der betreffenden Bakterien zurückzuführen ist, vorzugsweise aufgrund deren stabilen Etablierung in den abgeleiteten Bakterienstämmen nach vorangegangener Transformation.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß in den das Protein herstellenden Zellen der endogene Faktor PrfB durch einen PrfB mit höherer Aktivität ersetzt worden ist, vorzugsweise unter Ersatz mindestens eines endogen vorhandenen p/fß-Gens durch das für den PrfB mit höherer Aktivität codierende p/fß-Gen.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche PrfB-Aktivität durch einen Faktor PrfB nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erzielt wird, vorzugsweise mit Hilfe einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 7 bis 9, besonders bevorzugt mit Hilfe eines Vektors nach einem der Ansprüche 10 oder 11 , ganz besonders bevorzugt durch eine Zelle nach einem der Ansprüche 12 oder 13.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den das Protein herstellenden Zellen um grampositive Bakterien handelt, vorzugsweise der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii oder B. lentus, und ganz besonders um Stämme von ß. licheniformis oder ß. amyloliquefaciens.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche PrfB-Aktivität durch einen Faktor PrfB erreicht wird, dessen Wildtypseqenz aus einem grampositiven Bakterium stammt.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dafS die zusätzliche PrfB-Aktivität durch einen Faktor PrfB erreicht wird, der aus derselben Gattung wie die das Protein herstellenden grampositiven Bakterien stammt, vorzugsweise aus derselben Spezies, besonders bevorzugt aus demselben Stamm.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß ein PrfB eingesetzt wird, der sich von der Wildtypsequenz aus ß. licheniformis, B. halodurans oder ß. subtilis ableitet, vorzugsweise von einer Wildtypsequenz nach SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 beziehungsweise SEQ ID NO. 10, besonders bevorzugt codiert von einer Sequenz, die sich von einer Wildtypsequenz nach SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5 beziehungsweise SEQ ID NO. 9 ableitet.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den das Protein herstellenden Zellen um gramnegative Bakterien handelt, vorzugsweise der Gattungen E. coli oder Klebsiella, insbesondere um Stämme von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E coli RV308, FS. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche PrfB-Aktivität durch einen Faktor PrfB erreicht wird, dessen Wildtypseqenz aus einem gramnegativen Bakterium stammt.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dali die zusätzliche PrfB-Aktivität durch einen Faktor PrfB erreicht wird, der aus derselben Gattung wie die das Protein herstellenden gramnegativen Bakterien stammt, vorzugsweise aus derselben Spezies, besonders bevorzugt aus demselben Stamm.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß ein PrfB eingesetzt wird, der sich von der Wildtypsequenz aus Escherichia coli ableitet, vorzugsweise von der Wildtypsequenz nach SEQ ID NO. 8, besonders bevorzugt codiert von einer Sequenz, die sich von einer Wildtypsequenz nach SEQ ID NO. 7 ableitet.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß eine aktivitätsverbesserte Variante eines Faktors PrfB eingesetzt wird, vorzugsweise eine, die in einer, besonders bevorzugt beiden Positionen, die in homologer Lage den Positionen 71 und 100 des maturen Proteins nach SEQ ID NO. 2 entsprechen, die Aminosäuren Asparagin (N) beziehungsweise Serin (S) trägt.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das für das hergestellte Protein codierende Gen natürlicherweise in den das Protein herstellenden Zellen vorhanden ist, vorzugsweise dieses Protein von diesen Zellen natürlicherweise gebildet wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß das für das hergestellte Protein codierende Gen durch Transformation in die Vorläuferzellen der zur Herstellung eingesetzten Bakterien eingebracht worden ist, vorzugsweise über einen Expressionsvektor, besonders bevorzugt aufgrund dessen stabiler Etablierung in den abgeleiteten Bakterienstämmen.
31. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, daß das hergestellte Protein sekretiert wird.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem hergestellten Protein um ein Nicht-Enzym handelt, vorzugsweise um ein pharmakologisch relevantes Protein, besonders bevorzugt um Insulin oder Calcitonin.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem hergestellten Protein um ein Enzym handelt, vorzugsweise um ein hydrolytisches Enzym oder um eine Oxidoreduktase, besonders bevorzugt um eine Protease, Amylase, Hemicellulase, Cellulase, Lipase, Cutinase, Oxidase, Peroxidase oder Laccase.
34. Verwendung des Faktors PrfB zur Erhöhung der Ausbeute bei der Proteinherstellung durch Kultivierung von Bakterien durch Erhöhung der PrfB-Aktivität in den das Protein herstellenden Zellen.
35. Verwendung nach Anspruch 34, wobei der Faktor PrfB von einem Faktor der SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8 oder 10 abgeleitet ist, besonders bevorzugt nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
36. Verwendung einer für den Faktor PrfB codierenden Nukleinsäure zur Erhöhung der Ausbeute bei der Proteinherstellung durch Kultivierung von Bakterien durch zusätzliche Expression dieses Gens.
37. Verwendung nach Anspruch 36, wobei die für den Faktor PrfB codierende Nukleinsäure von einer Nukleinsäure der SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7 oder 9 abgeleitet ist, besonders bevorzugt nach einem der Ansprüche 7 bis 9.
38. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß sie auf einer Transformation mit der für den Faktor PrfB codierenden Nukleinsäure beruht, vorzugsweise aufgrund deren stabiler Etablierung in den abgeleiteten Bakterienstämmen nach vorangegangener Transformation.
39. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um grampositive Bakterien handelt, vorzugsweise der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii oder ß. lentus, und ganz besonders um Stämme von ß. licheniformis oder ß. amyloliquefaciens.
40. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um gramnegative Bakterien handelt, vorzugsweise der Gattungen E. coli oder Klebsiella, insbesondere um Stämme von Escherichia coli K12, von Escherichia coli B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
41. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß eine leistungsverbessete Variante eines Faktors PrfB oder eine hierfür codierende Nukleinsäure eingesetzt wird, vorzugsweise eine, die in einer, besonders bevorzugt beiden Positionen, die in homologer Lage den Positionen 71 und 100 des maturen Proteins nach SEQ ID NO. 2 entsprechen, die Aminosäuren Asparagin (N) beziehungsweise Serin (S) trägt beziehungsweise hierfür codiert.
42. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem hergestellten Protein um ein Nicht-Enzym handelt, vorzugsweise um ein pharmakologisch relevantes Protein, besonders bevorzugt um Insulin oder Calcitonin.
43. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 42, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem hergestellten Protein um ein Enzym handelt, vorzugsweise um ein hydrolytisches Enzym oder um eine Oxidoreduktase, besonders bevorzugt um eine Protease, Amylase, Hemicellulase, Cellulase, Lipase, Cutinase, Oxidase, Peroxidase oder Laccase.
PCT/EP2004/001950 2003-03-04 2004-02-27 Faktor prfb (peptide chain release factor b) aus bacillus licheniformis und dessen verwendung zur steigerung der proteinbildungsrate Ceased WO2004085649A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2003109555 DE10309555A1 (de) 2003-03-04 2003-03-04 Faktor PrfB (Peptide chain release factor B) aus Bacillus licheniformis und Steigerung der Proteinbildungsrate durch Erhöhung der PrfB-Aktivität
DE10309555.1 2003-03-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004085649A1 true WO2004085649A1 (de) 2004-10-07

Family

ID=32891873

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2004/001950 Ceased WO2004085649A1 (de) 2003-03-04 2004-02-27 Faktor prfb (peptide chain release factor b) aus bacillus licheniformis und dessen verwendung zur steigerung der proteinbildungsrate

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE10309555A1 (de)
WO (1) WO2004085649A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012139964A1 (de) * 2011-04-13 2012-10-18 Henkel Ag & Co. Kgaa Expressionsverfahren

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN120158456A (zh) * 2023-10-18 2025-06-17 河南农业大学 玉米ZmmtRF2a基因突变标记、鉴定引物及其在调控籽粒发育中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HERBORT, M. ET AL.: "Temporal Expression of the Bacillus subtilis secA Gene, Encoding a Central Component of the Preprotein Translocase", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 181, no. 2, January 1999 (1999-01-01), pages 493 - 500, XP002292890 *
KAROW, M.L. ET AL.: "Suppression of TGA Mutations in the Bacillus subtilis spoIIR Gene by prfB Mutations", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 180, no. 16, August 1998 (1998-08-01), pages 4166 - 4170, XP002292889 *
UNO, M. ET AL.: "Functional specificity of amino acid at position 246 in the tRNA mimicry domain of bacterial release factor 2", BIOCHIMIE, vol. 78, no. 11-12, 1996, pages 935 - 943, XP002292888 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012139964A1 (de) * 2011-04-13 2012-10-18 Henkel Ag & Co. Kgaa Expressionsverfahren
CN103608457A (zh) * 2011-04-13 2014-02-26 巴斯夫欧洲公司 表达方法
US9663798B2 (en) 2011-04-13 2017-05-30 Basf Se Expression method

Also Published As

Publication number Publication date
DE10309555A1 (de) 2004-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60115958T2 (de) Zwillingsarginin translokation in bacillus
EP1282716A1 (de) Verfahren zur herstellung rekombinanter proteine durch gram-negative bakterien
DE68928899T2 (de) Leadersequenz zur induzierung einer posttranslationalen modifikation von polypeptiden in bakterien, sowie dafür kodierendes gen
EP1419255A2 (de) Eine neue gruppe von $g(a)-amylasen sowie ein verfahren zur identifizierung und gewinnung neuer $g(a)-amylasen
DE2931999A1 (de) Herstellung und anwendung von neukombinierten plasmiden mit genen fuer alkalische phosphatasen
EP2418276B1 (de) Mikroorganismenstamm zur Produktion von rekombinanten Proteinen
DE3650477T2 (de) Produktion von Cystinreste enthaltenden aktiven Proteinen
EP1599579B1 (de) Ein translokationsenzym als selektionsmarker
DE69229336T2 (de) Residuelle protease-iii
EP2267007B1 (de) Neue, Polyaminosäuren bildende oder abbauende Genprodukte von Bacillus licheniformis und darauf aufbauende verbesserte biotechnologische Produktionsverfahren
DE112019000467T5 (de) Rekombinanter Mikroorganismus, Verfahren zu dessen Herstellung und seine Anwendung bei der Herstellung von Coenzym Q10
EP2340306B1 (de) Expressionsverstärkte nukleinsäuren
WO2004085649A1 (de) Faktor prfb (peptide chain release factor b) aus bacillus licheniformis und dessen verwendung zur steigerung der proteinbildungsrate
WO2001066776A2 (de) Neuartige l-form-bakterienstämme, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur herstellung von genprodukten
DE69634853T2 (de) Ftsy-exprimierende gram-positive mikroorganismen mit verbesserten sekretionseigenschaften
DE69333564T2 (de) Nisine
DE69829670T2 (de) Erhöhung der proteinproduktion in gram-positiven mikroorganismen
DE68915204T2 (de) Biosynthetisches Verfahren zur Herstellung von chemischen Verbindungen.
EP1263974B1 (de) Wirts-vektor-systeme zur phosphatregulierten überproduktion von polypeptiden in bacillus
DE102004032995A1 (de) Neue, sekretierte Genprodukte von Bacillus licheniformis und darauf aufbauende verbesserte biotechnologische Produktionsverfahren
DE102004013988A1 (de) Der Faktor RecA aus Bacillus licheniformis und recA-inaktivierte Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion
EP3041820B1 (de) [s,s]-edds biosynthesegene und -proteine und verfahren zur biosynthese von [s,s]-edds
DE102023212139A1 (de) Substratspezifische adhäsive Peptide
WO2008006734A2 (de) Uv-sensitive sicherheitsstämme für die biotechnologische produktion
AU2005217093A1 (en) Generation of recombinant genes in prokaryotic cells by using two extrachromosomal elements

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
DPEN Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)