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WO2004083231A2 - Utilisation de ligands peptidiques de recepteurs de la membrane plasmique et de leurs analogues pour moduler l'activite des mitochondries - Google Patents

Utilisation de ligands peptidiques de recepteurs de la membrane plasmique et de leurs analogues pour moduler l'activite des mitochondries Download PDF

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WO2004083231A2
WO2004083231A2 PCT/FR2004/000578 FR2004000578W WO2004083231A2 WO 2004083231 A2 WO2004083231 A2 WO 2004083231A2 FR 2004000578 W FR2004000578 W FR 2004000578W WO 2004083231 A2 WO2004083231 A2 WO 2004083231A2
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WO
WIPO (PCT)
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mitochondria
peptide
activity
mitochondrial
ligand
Prior art date
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PCT/FR2004/000578
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Gérard Morel
Aude Debon
Cécile VIVANCOS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Publication date
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Publication of WO2004083231A3 publication Critical patent/WO2004083231A3/fr
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    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Definitions

  • the present invention relates to the use of peptide ligands of plasma membrane receptors and their analogs to modulate (activate / inhibit) the activity of mitochondria.
  • Peptide hormones, growth factors, neuropeptides and cytokines are released peptide factors, either in the blood or near their site of action. They act via specific receptors present on the surface of target cells.
  • the binding of these peptide ligands to their receptor (s) leads to two events: on the one hand, the transduction of an intracellular signal induces a cascade of phosphorylations of cytoplasmic substrates involved in different cell signaling pathways, which lead to a biological effect in the target cell (proliferation, differentiation, metabolic effect, apoptosis, secretion of factors, etc.), and on the other hand, the internalization of the ligand-receptor complex induces the decrease in the number of receptors present on the surface of target cells and the degradation of the ligand by the lysosomal system or its exocytosis by the Golgi apparatus, which lead to the desensitization of cells to the ligand signal.
  • growth hormone or GH for growth hormone which has an anabolic effect on protein metabolism, has been used in particular to increase weight gain and milk production in animals (Request EP 0 278 103), or to treat the loss of muscle mass associated with mitochondrial encephalopathy (Caroll et al. Clinical Endocrinology, 1997, 47, 113-117).
  • hormones thyroliberin (TRH), somatocrinin (GRF), corticoliberin (CRH), growth hormone (GH), somatostatin, angiotensin II, vasopressin, VIP (intestinal vasoactive peptide) , insulin, prolactin, natriuretic peptide (ANP) 7), growth factors (neurons (NGF), epithelial cells (EGF), fibroblasts (FGF) and platelet-derived growth factor (PDGF) Among the peptides detected in the nucleus, there may be mentioned: hormones (thyroliberin (TRH), somatocrinin (GRF), corticoliberin (CRH), growth hormone (GH), somatostatin, angiotensin II, vasopressin, VIP (intestinal vasoactive peptide) , insulin, prolactin, natriuretic peptide (ANP) 7), growth factors (neurons (NGF), epitheli
  • cytokines interferons ⁇ , ⁇ , ⁇ , interleukins .
  • ROS free radicals
  • peptide ligands of plasma membrane receptors which are known to exert their biological effect via the signal transduced by the ligand-receptor bond, are also capable of being internalized and picked up by the mitochondria and of regulating directly the activity of these mitochondria.
  • recombinant growth hormone can be taken up in vitro by a fraction of purified mitochondria.
  • peptide ligands of membrane receptors and their analogs represent new drugs useful for modulating (activating or inhibiting) specifically the activity of mitochondria.
  • Such molecules have applications in the medical field, in particular for the treatment of growth disorders, metabolic diseases, obesity, cancer, mitochondrial diseases, necrosis and degeneration, and for prevention aging, as well as in the food industry, in particular to improve animal development, meat production (by reducing lipogenesis) and milk production.
  • the subject of the invention is therefore a medicament for modulating the activity of mitochondria, characterized in that it comprises a molecule selected from the group consisting of: a) a peptide ligand of a receptor of the plasma membrane or a analog of said ligand, associated with a mitochondrial targeting peptide, b) a polynucleotide encoding the peptide ligand or the analog defined in a), and c) a recombinant vector comprising the polynucleotide defined in b).
  • modulator of the activity of the mitochondria is meant an activator or an inhibitor (partial or total inhibition).
  • peptide ligand is meant any peptide substance acting via specific receptors present on the surface of target cells.
  • analogue means, relative to a peptide ligand, a peptide having a structure related to that of said peptide ligand but which may have a similar (agonist) or opposite (antagonist) activity, with respect to the receptor of said peptide ligand.
  • said peptide ligand or said analog are associated with said mitochondrial targeting peptide, either by a covalent bond such as a peptide bond between the NH 2 and COOH ends of said ligand and said peptide, or by a non-covalent bond such as an ionic bond or hydrophobic.
  • - mitochondrial activity is understood to mean: cellular energy metabolism and thermogenesis, apoptosis and the production of free radicals
  • said diseases are selected from the group consisting of: cancer, metabolic diseases or syndromes, growth disorders, obesity, mitochondrial diseases, necrosis and degeneration , and aging.
  • Metabolic diseases or syndromes are as defined in: Tonkin et al, 2003. The Science and Public Affairs Forum. World Health Organization World Health Organization (1999). Report of WHO consultation: definition of metabolic syndrome in definition, diagnosis, end classification of diabetes mellitus and its complication. I. Diagnosis and classification of Diabetes mellitus. World Health organization, Department of Noncommunicable Disease Surveillance, Geneva; Lemieux et al., Circulation, 2000, 102: 179-184; Haffner et al., J. Am. Med. Ass., 1990, 263: 2893-2898.
  • said peptide ligand is selected from the group consisting of: peptide hormones, growth factors, neuropeptides, cytokines and their analogs.
  • peptide ligands By way of nonlimiting example of these peptide ligands, the following may be cited: hormones (somatostatin, GRF, CRH, GH, angiotensin II, vasopressin, VIP, insulin, prolactin, ANP), growth factors (NGF, PDGF, EGF, FGF), neuropeptides (NPY, substance P) and cytokines (interferons ⁇ , ⁇ , ⁇ , interleukins).
  • hormones somatostatin, GRF, CRH, GH, angiotensin II, vasopressin, VIP, insulin, prolactin, ANP
  • growth factors NGF, PDGF, EGF, FGF
  • NPY neuropeptides
  • cytokines interferons ⁇ , ⁇ , ⁇ , interleukins.
  • one of the ends (-NH 2 or -COOH) of the amino acid sequence of said ligand or one of its analogs is associated with said mitochondria
  • nucleic acid (polynucleotide) molecule of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a eukaryotic host cell
  • choice of an appropriate vector depends on the envisaged use for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of the sequence in extrachromosomal form or else integration into the chromosomal material of the host ), as well as the nature of the host cell.
  • said recombinant vector is an expression vector in which said polynucleotide is placed under the control of regulatory elements for appropriate transcription and translation.
  • viral vectors such as adenoviruses, retroviruses, lentiviruses and AAVs, in which the sequence of interest has been inserted, may be used.
  • Said peptides, their analogs and the nucleic acid molecules encoding said peptides and their analogs can also be introduced into host cells, either by using physical methods such as electroporation or microinjection, either by associating them with any substance (s) allowing the passage of the plasma membrane, such as transporters such as nanotransporters, liposomes, lipids or cationic polymers.
  • these methods can advantageously be combined, for example by using electroporation associated with liposomes.
  • the said peptide ligand is associated with at least one means allowing its penetration into the cells, as defined above (nanotransporter, liposomes, lipids or cationic polymers).
  • said peptide ligands are preselected by a screening process comprising at least the following steps:
  • the mitochondria are purified by means known in themselves; for example they are prepared as described in Ardail et al., J. Biol. Chem., 1993, 268, 25985-25992.
  • the effect of said ligand on the activity of the mitochondria is evaluated by any suitable means known in itself to those skilled in the art.
  • the activity of mitochondria is evaluated by measuring respiratory activity, free radicals (ROS) or apoptosis.
  • ROS free radicals
  • the overall respiratory activity is measured by oxygenography and the activity of the enzymatic complexes of the respiratory chain (NADH dehydrogenase, succinate dehydrogenase, ubiquinol cytochrome c reductase, cytochrome c oxidase) is measured by spectrophotometry, in the presence of a suitable substrate.
  • NADH dehydrogenase succinate dehydrogenase
  • ubiquinol cytochrome c reductase cytochrome c oxidase
  • Free radicals are measured by assaying antioxidant enzymes (catalase, gluthation peroxidase, superoxide dismutase), by quantifi- cation of lipid peroxidation (determination of malondialdehyde) and / or oxidation of proteins (determination of carbonyl derivatives). Free radicals are also measured by whole cell fluorometry, using a 2,7-dichlorodihydrofluoroscein diacetate probe (DCFDA), whose excitation wavelength is 501 nm and emission at 521 nm; H O 2 cleaves the probe, thus releasing fluoroscéine, a compound emitting at 521 nm.
  • DCFDA 2,7-dichlorodihydrofluoroscein diacetate probe
  • free radicals are measured by fluorometry on isolated mitochondria; homovanillic acid reacting with H 2 O uses horseradish peroxidase as catalyst and thus makes it possible to measure the production of HO by measuring the fluorescence emission at 420 nm.
  • Mitochondrial activity can also be assessed by measuring the degree of apoptosis by one of the following methods: analysis of the fate of nuclear DNA by agarose gel electrophoresis, measurement of the sensitivity of PTP (Permeability Transition Pore) with calcium using a non-permeable and calcium-sensitive fluorescent probe (Calcium Green-5N), detection in western blot, of the presence of the proteins Bax and Bcl2 in the cytosolic and mitochondrial compartments and of the presence of the cytochrome c and caspase 9 cleaved in the cytosol, and measuring the activity of caspase 3 by detecting the fluorescence emission resulting from the cleavage, by this enzyme, of an appropriate substrate.
  • the present invention also relates to the use of a modulator of the activity of mitochondria as defined above, for the preparation of a medicament.
  • said medicament is intended for the treatment of diseases as defined above.
  • the present invention also relates to an agrifood product, characterized in that it comprises a modulator of the activity of the mitochondria as defined above. According to an advantageous embodiment of said product, it is used to improve animal development, in particular stature development. According to another advantageous embodiment of said product, it is used to increase muscle mass.
  • said product it is used to increase the production of milk.
  • said animals are mammals or birds reared for the production of meat (cattle, sheep, goats, pigs, poultry, etc.), or else mammals reared for the production of milk (cattle, sheep, goats ).
  • the present invention also relates to the use of a modulator of the activity of mitochondria as defined " above, as an agri-food product.
  • said food product is intended for applications as defined above.
  • the invention encompasses the use of isolated peptides and their analogs, proteins comprising said peptides and their analogs, as well as the use of recombinant vectors encoding said peptides, their analogs and the foregoing proteins.
  • peptide ligand or its analogs, associated with a mitochondrial targeting peptide, as well as the polynucleotides and the recombinant vectors derived from the above, as defined above, are prepared by the conventional techniques known to those skilled in the art.
  • the amino acid sequence corresponding to the fusion (N-terminal or C-terminal) between the peptide ligand (or the analog) and the mitochondrial targeting peptide can be synthesized in solid phase, according to the Fmoc technique, originally described by Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc, 1964, 85: 2149-) and the peptides obtained are purified by high performance liquid chromatography in reverse phase,
  • the nucleotide sequence coding for the fusion (N-terminal or C-terminal) between the peptide ligand (or the analog) and the mitochondrial addressing peptide can be obtained by PCR or RT-PCR or else by screening of libraries DNA by hybridization with a homologous probe, following the prototypes standard schools such as those described in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA).
  • the nucleotide sequences are amplified by PCR using an appropriate primer pair, then the cDNA obtained is cloned into a eukaryotic or prokaryotic expression vector, under the control of transcriptional regulatory elements. and appropriate translation.
  • said vector can comprise sequences (labels or tags) fused in phase with the 5 ′ and / or 3 ′ end of said insert, useful for immobilization, and / or detection and / or purification of the protein. expressed from said vector.
  • sequences labels or tags
  • said vectors are constructed and introduced into host cells by conventional recombinant DNA and genetic engineering methods, which are known per se.
  • the protein produced in the cells modified by the recombinant vector is optionally purified by any appropriate means, in particular by affinity chromatography.
  • the medicament and the agri-food product according to the invention are used by the enteral (oral, sublingual), parenteral (subcutaneous, intramuscular, intravenous) or local (cutaneous, nasal, ocular) routes. They can be in the form of tablets, simple or coated, capsules, granules, syrup, suppositories, injections, ointments, creams, gels, aerosol, which are prepared according to the usual methods .
  • the molecules as defined above are associated with excipients usually used in pharmaceutical compositions, such as talc, gum arabic, lactose, starch, magnesium stearate, cocoa butter , aqueous vehicles or not, fatty substances of animal or vegetable origin, paraffinic derivatives, glycols, various wetting agents, dispersants or emulsifiers, preservatives.
  • excipients usually used in pharmaceutical compositions, such as talc, gum arabic, lactose, starch, magnesium stearate, cocoa butter , aqueous vehicles or not, fatty substances of animal or vegetable origin, paraffinic derivatives, glycols, various wetting agents, dispersants or emulsifiers, preservatives.
  • the useful dosage varies according to the intended application, the route and the rhythm of administration, as well as the nature and the weight of the target species (human or animal).
  • the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to examples of the use of growth hormone to modulate the activity of the mitochondria according to the present invention.
  • - Figure 1 illustrates the incorporation of I-hGH, in vivo, by the total liver (A) or the mitochondrial fraction (B), 15 min after the intravenous injection.
  • A 35% of the 125 I-hGH incorporated by the liver is detected in the mitochondrial fraction.
  • B Analysis by a competitive test as described in Example 1, of the binding of 125 I-hGH to the mitochondria of isolated adult rats; 90% of the growth hormone is specifically incorporated by the mitochondrial fraction.
  • the values represent the average of 3 independent measurements ⁇ standard error to the mean (SEM). * statistically significant value P ⁇ 0.01,
  • FIG. 2 illustrates the incorporation of I-hGH, in vitro, by the mitochondrial fraction, as described in Example 1.
  • A kinetics of incorporation of 125 I-hGH by the mitochondrial fractions; the maximum incorporation corresponds to an incubation period of between 10 min and 30 min. The values represent the average of 3 measurements ⁇ SEM. * statistically significant values P ⁇ 0.01.
  • B incorporation of 125 I-hGH by mitochondrial fractions incubated for 10 min with increasing concentrations of rGH (10 nM to 500 nM), in the presence of I-hGH used as tracer; the saturation curve reaches a plateau for concentrations above 300 nM. The values represent the average of 4 independent measurements ⁇ standard error to the mean (SEM).
  • FIG. 3 illustrates the analysis by SDS-PAGE, of the incorporation of 125 I-hGH by the mitochondria.
  • the mitochondrial translocation was carried out as described in Example 1.
  • the mitochondrial fraction isolated from the liver was incubated, 30 min at 37 ° C., in the presence of rGH and of I-hGH and then separated by electrophoresis. polyacrylamide gel in the presence of SDS (SDS-PAGE).
  • Lane 1 mitochondrial fraction incubated with i25 I-hGH and 100 nM rGH.
  • Lane 2 mitochondrial fraction incubated with I25 I-hGH and 300 nM rGH.
  • Lane 3 125 I-hGH,
  • FIG. 4 illustrates the analysis by immunostaining in electron microscopy of the localization of growth hormone in the mitochondria: mitochondria purified from rat liver were incubated with 100 nM of rGH (A) or without rGH ( B) then included in hydrophilic resin, as described in Example 1; immunostaining using gold particles 10 nm in diameter is detected inside the mitochondria, in the matrix and in the internal membrane, both in the control (B) and in the mitochondria incubated for 10 min with rGH (A) and the density of the labeling increases with the concentration of rGH,
  • FIG. 5 illustrates the inhibitory effect of growth hormone on respiration (state 3), analyzed by oxygenography as described in example 1.
  • Isolated mitochondria corresponding to 750 ⁇ g of proteins were introduced into the electrochemical chamber (volume of 1500 ⁇ l) and pre-incubated for 0, 5 and 10 min at 37 ° C, with or without rGH. Succinate and ADP were then added at final concentrations of 5 mM and 100 ⁇ M, respectively.
  • D Control.
  • jffl GH lOnM.
  • JD GH 50 nM.
  • B GH 100 nM. * statistically significant values P ⁇ 0.05,
  • FIG. 6 illustrates the direct effects of growth hormone on the 4 enzyme complexes of the respiratory chain.
  • A NADH dehydrogenase.
  • B Succinate dehydrogenase (SDH).
  • C Ubiquinol cytochrome c reductase.
  • D cytochrome c oxidase (COX).
  • the enzymatic activities were measured by spectrophotometry, starting from fractions of isolated hepatic mitochondria, as described in Example 1. For each experiment, the mitochondria were incubated at 37 ° C. in the presence of increasing concentrations of growth hormone ( rGH). The results expressed as a percentage relative to the control, represent the mean ⁇ SEM. : incubation without rGH.
  • D incubation in the presence of 10 nM rGH. •: incubation in the presence of 50 nM rGH.
  • r incubation in the presence of 100 nM rGH,
  • FIG. 7 illustrates the effect of growth hormone on the inhibition of cytochrome c oxidase (COX) activity, analyzed by a polarographic method, as described in Example 1.
  • the mitochondrial fractions were pre- incubated without rGH ( ⁇ ) or in the presence of 100 nM rGH, for 1 min (D), 5 min ( ⁇ ) and 10 min (k) and the COX activity was recorded for 15 min.
  • the results expressed as a percentage relative to the control, represent the mean ⁇ SEM of 3 independent experiments. * statistically significant values P ⁇ 0.05, and
  • FIG. 8 illustrates the kinetics of activation of cytochrome c oxidase by growth hormone, measured on the BRL-GHR line ! - 638 .
  • the cells were incubated in the presence of 50 nM or in the absence of growth hormone; maximum stimulation of cytochrome c oxidase activity corresponds to an incubation period of 10 min.
  • the values represent the mean ⁇ SEM of 5 independent experiments. * significant difference (P ⁇ 0.05).
  • EXAMPLE 1 MATERIALS AND METHODS
  • rGH Human recombinant growth hormone
  • NHPP National Hormone of Pituitary Program
  • DAKO National Hormone of Pituitary Program
  • BIORAD The nitrocellulose membranes (Hybond-C), the detection system for Western-blot (ECL plus) and the anti-rabbit IgG immunoglobulins coupled with peroxidase were supplied by AMERSHAM BIOSCIENCES EUROPE GmbH. All reagents used for biochemical and polarographic analyzes were supplied by SIGMA-ALDRICH.
  • mice Male WISTAR rats (IFF A-CREDO) weighing 250 to 300 g are raised at room temperature with alternating 12 hours of light and 12 hours of darkness. The animals receive a diet based on granules and water at will.
  • the animals were anesthetized with halothane and received an intravenous injection of 0.5 ml of PBS containing 4.4 ⁇ 10 cpm of I-hGH with or without a factor 100 excess unlabeled recombinant growth hormone.
  • the rats were sacrificed by decapitation 15 min after the injection.
  • the rats' livers were then removed and then washed in isolation buffer (250 mM sucrose, 10 mM Hepes, pH 7.4, 1 mM EDTA).
  • BRL-GRHuas A cell line stably expressing the protein corresponding to positions 1 to 638 of the amino acid sequence of the growth hormone receptor thus obtained is hereinafter called BRL-GRHuas.
  • the rat liver mitochondria are prepared as described in Ardail et al., J. Biol. Chem., 1993, 263, 25985-25992.
  • livers are immersed in ice-cold isolation buffer and the mitochondria are separated by differential centrifugation then washed extensively in isolation medium before being purified.
  • the crude mitochondria extract is deposited on a gradient of 20 ml of Hepes 25 M buffer, pH 7.4 containing 225 mM mannitol, 1 mM EDTA, 1% BSA and 30% Percoll.
  • the gradients are centrifuged for 30 min at 95,000 g as described in Vance, J. Biol. Chem., 1990, 265, 7248-7256, then a thick strip containing the purified mitochondria is taken from the lower 2/3 of the tube.
  • the purified mitochondria are washed extensively in isolation buffer, so as to remove the Percoll.
  • the mitochondrial protein concentration determined using the protein assay kit (BIORAD reference 500-0113) and a BSA standard, is approximately 60 to 90 mg / ml.
  • the integrity of the isolated mitochondria was determined by oxygenography using a Clark type oxygen electrode.
  • the controlled respiratory ratios (state 3 of breathing / state 4 of breathing) measured from different mitochondria preparations are of the order of 5.5 to 6.5.
  • Purified mitochondria fractions were stimulated for 10 min at 37 ° C in the presence of 100 nM GH in isolation buffer, or unstimulated.
  • the mitochondria suspension was centrifuged at 8,500 g and the pellet was washed twice in 0.1 M phosphate buffer pH 7.4, at + 4 ° C.
  • the pellet was then cut into small pieces and fixed for 30 min at room temperature in 100 mM phosphate buffer pH 7.4 containing 4% paraformaldehyde and 0.1% glutanolddehyde.
  • the samples were then washed 3 times in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4, dehydrated by successive incubations of 15 min, in the presence of increasing alcohol concentrations: 30%, 50%, 70% and 95 % and gradually included, at room temperature, in hydrophilic resin (LR-White, FLUKA) / 95% alcohol mixtures: 3 baths of 60 min in mixtures 1: 2, 1: 1 and 2: 2.
  • the samples were finally included in the pure resin for 90 min and the polymerization was carried out in gelatin capsules, for 24 h at 60 ° C.
  • Ultra-thin sections (70 nm) were made using a micro-tome (Ultracut S, LEICA) and then transferred to 200 mesh nickel grids covered with collodion and carbonaceous.
  • Immunocytological detection of rGH was carried out using an anti-rGH guinea pig IgG at a dilution 1/100, in 100 mM phosphate buffer, pH 7.4 containing 300 mM NaCl, 0, 05% Tween-20 and 0.5% BSA. The labeling is revealed by anti-guinea pig IgG immunoglobulins coupled to gold particles 10 nm in diameter.
  • Reagents Staining (British Biocell) are used to l / 50th in 20 mM Tris buffer, 300 mM NaCl, 0.05% Tween-20, 0.5% BSA, pH 8.2. The contrast was achieved by incubation, for 30 min in a solution of uranyl acetate (4%, pH 7.0) then the grids were analyzed using an electron microscope (CM120, PHILIPS), operating at 80 kV.
  • Coupled intact mitochondria were resuspended in incubation buffer (250 mM sucrose, 20 mM KO, 5 mM MgCl 2 , 10 mM K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 , pH 7.4) at a concentration of 60 mg / ml of mitochondrial proteins.
  • incubation buffer 250 mM sucrose, 20 mM KO, 5 mM MgCl 2 , 10 mM K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 , pH 7.4
  • the mitochondrial fractions were treated with succinate and ADP to stimulate respiration.
  • the mitochondria are incubated in the presence of increasing concentrations of unlabeled growth hormone (10 nM to 500 nM) and of 125 I-hGH as a tracer, for 10 min at 37 ° C., with shaking.
  • the growth hormone non-specifically bound to the external membrane of the mitochondria is eliminated by centrifugation at 8500 g for 10 min in an acid buffer (Glycine-HCl, pH 3.0).
  • the mitochondria are then washed once in isolation buffer and dissolved in 100 mM NaOH, 0.1% SDS and transferred to tubes suitable for ⁇ spectrometry.
  • the kinetics are carried out under the same conditions; the mitochondria being incubated for 0 min to 30 min in the presence of 150 nM rGH.
  • the BRL cells are cultured at confluence in Ham F12 medium supplemented with 10% fetal calf serum, 50 IU / ml penicillin and 50 ⁇ g / ml streptomycin.
  • the confluent cells are incubated at 37 ° C for 12 h in serum-free medium before the addition of rGH (50 nM) at the times indicated. After stimulation with rGH, all the steps are carried out at + 4 ° C.
  • the medium is removed and the cells are washed with 50 mM Tris, pH 7.4, 9% o NaCl and harvested at a final concentration of 10 cells / ml.
  • the cells are then centrifuged at 2000 g for 10 min, and the pellet is resuspended in 250 ⁇ l of 25 mM Tris-HCl, pH 7.4.
  • the protein concentration determined using the kit (500-0113, BIORAD) and a BSA standard is approximately 10 mg / ml.
  • the cell extract was hydrolyzed for 1 h on ice, in Tris buffer containing 3% dodecyl maltoside and then centrifuged for 5 min at 3000 g. The supernatant was collected and the cytochrome c oxidase activity was evaluated by spectrophotometric measurement of the oxidation of cytochrome c at 550 nm.
  • the reduced substrate was obtained by ion exchange chromatography (Sephadex G25 column, PHARMACIA).
  • a solution including 10 mM KH 2 PO 4 , pH 7.4, 100 mM L-ascorbic acid and 10% of the oxidized cytochrome c was loaded onto the column and the substrate was eluted in the presence of phosphate buffer.
  • the test was carried out in 100 mM phosphate buffer pH 7.0 containing 5 to 10 ⁇ l of cellular homogenate (50 to 100 ⁇ g of proteins) and 30 ⁇ l of reduced cytochrome c were added to initiate the reaction.
  • NADH dehydrogenase activity (complex I) was evaluated, using a phosphate buffer (10 mM K-phosphate, pH 8, 0.5 mM NADH, 20 mM phosphatidylcholine) and from 20 ⁇ to 40 ⁇ l d 'homogenate (100 ⁇ g to 200 ⁇ g of mitochondrial proteins). The reaction was initiated after equilibration by the addition of 10 mM ubiquinone, then followed at 340 nm.
  • the succinate dehydrogenase activity (complex II) was measured at 600 nm.
  • the reaction medium containing 50 mM KH 2 PO 4 , pH 7.4, 1% o Triton X-100, 3 mM KCN, 20 ⁇ g / ml rotenone and 10 ⁇ l to 20 ⁇ l of homogenate was incubated 10 min at 37 ° C, then added 0.18 mM DCIP and 1.3 mM PMS and the reaction was initiated by adding succinate (20 mM).
  • the ubiquinol cytochrome c reductase activity was evaluated by measuring the reduction in cytochrome c at 550 nm for 2 min.
  • the decylubiquinol solution was prepared at a concentration of 21.4 mM, as described in Rieske et al., Methods, Enzymal., 1967, 10, 239-245.
  • the reaction medium contains 35 mM KH 2 PO 4 , pH 7.2, 5 mM MgCl 2 , 2.5 mg / ml BSA, 0.2 mM KCN, 20 ⁇ M oxidized cytochrome c, 10 ⁇ g / ml rotenone and 15 ⁇ g to 30 ⁇ g of mitochondrial proteins.
  • the reaction was balanced for 5 min at 37 ° C and initiated by the addition of decylubiquinol (20 ⁇ M).
  • the cytochrome c oxidase activity was evaluated by measuring the oxidation of cytochrome c at 550 nm, for 1 min.
  • An oxidized cytochrome c solution (1 mM) was diluted to a concentration of 50 ⁇ M in a volume of 10 ml of 25 mM KH 2 PO 4 buffer, pH 7.4.
  • One ml of this solution was reduced by a slight excess of sodium dithionite.
  • small amounts of the reduced solution were added to 9 ml of the initial oxidized cytochrome c solution (50 ⁇ M) until achieve 80 to 90% reduction.
  • the test was carried out using a ml of reduced cytochrome c to which 5 to 10 ⁇ l of homogenate (5 to 10 ⁇ g of proteins) were added to initiate the reaction.
  • the reaction medium for measuring respiration is a medium saturated with ambient air containing 250 mM sucrose, 1 mM EGTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 and 1 mg / ml of BSA free of free fatty acids.
  • the respiration substrates (in the form of sodium salts) are: succinate (5 mM) and glutamate (5 mM) supplemented with malate (2.5 mM).
  • Inhibitors of electron transport in the respiratory chain are used to measure the parameters of oxidative phosphory lation at specific coupling sites; the addition of rotenone (5 ⁇ M) to inhibit site 1, allows the measurement of sites 2 and 3 in the presence of succinate (10 mM), and the addition of malonate (10 mM) which inhibits site 2 allows the measurement sites 1 and 3 in the presence of malate / pyruvate.
  • 75 ⁇ g of mitochondrial proteins were added to the chamber containing 1.5 ml of incubation buffer, then the mixture was incubated for 0, 5, and 10 min in the presence of 10, 50 and 100 nM rGH.
  • the breathing control state (state 4) was initiated by adding 15 ⁇ l of substrate.
  • the active state of respiration (state 3) was initiated by adding 100 ⁇ M of ADP.
  • the electrode was calibrated using demineralized water and incubation buffer, as a function of the oxygen content of the water (Hizuka et al., J. Biol. Chem. 256, 4591-4597).
  • Oxygen consumption was calculated from the recording plot and expressed in nmol of oxygen atoms, per min, per mg of proteins (Postel-Viany et al., Endocrinology, 1982, 111, 244-251 ).
  • the ADP / O ratio was calculated by measuring the total oxygen consumption during the "draw" of phosphorylation.
  • FIGS. 1A and 1B show that the amount of radioactivity detected in the mitochondrial fraction represents 35% of the total radioactivity incorporated by the liver (FIG. 1B). 15 min after the injection, the specific signal detected in the mitochondria (FIG. 1A) represents 91% of the total radioactivity detected in the mitochondrial fraction, and this in a highly significant way (P ⁇ 0.01), demonstrating the capacity of the mitochondria to accumulate growth hormone early.
  • Oxygen consumption by the mitochondrial fractions was measured by oxygenography using succinate as the substrate for respiration.
  • the mitochondria were stored in a medium containing bovine albumin devoid of free fatty acids (free-fatty-acid-BSA) capable of inducing decoupling of the mitochondria.
  • free-fatty-acid-BSA bovine albumin devoid of free fatty acids
  • the inhibition of cytochrome c oxidase activity is maximal and statistically significant from 5 min with a concentration of hormone 10 nM growth (30%, P ⁇ 0.05). For concentrations of 50 nM and 100 nM, the growth hormone is effective for 15 min while 30 min are necessary for the restoration of the basal rate of cytochrome c oxidase activity with a concentration of 10 nM.
  • the inhibition of succinate dehydrogenase activity in terms of time and intensity, is similar to that obtained on the activity of cytochrome c oxidase in the presence of increasing doses of growth hormone, under the same experimental conditions. Maximum inhibition is reached in 5 min with a concentration of 100 nM (30%) and in 15 min with a concentration of 10 nM (25%).
  • the intensity of the effects of growth hormone on the activities of cytochrome c oxidase and succinate dehydrogenase depend on the concentration and the duration of incubation.
  • cytochrome c oxidase COX
  • decoupled mitochondria non-phosphorylated
  • TMPD / ascorbate substrate
  • the effect is rapid and transient (5 min), since the effect on the activity of cytochrome c oxidase is no longer detectable for pre-incubation times greater than 10 min ( Figure 7).
  • the decrease in oxygen consumption is a function of the pre-incubation time and the action of growth hormone persists only during the first 15 minutes of incubation ( P ⁇ 0.05).

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Abstract

Ligand peptidique d'un récepteur de la membrane plasmique ou analogue, associés à un peptide d'adressage mitochondrial, comme médicament ou produit agroalimentaire modulateur de l'activité des mitochondries. Utilisations dans le traitement du cancer, de l'obésité, des maladies ou syndromes métaboliques, des troubles de la croissance, des maladies mitochondriales, de la nécrose et de la dégénération, et du vieillissement, ainsi que pour améliorer le développement et augmenter la masse musculaire et la production de lait, chez l'animal.

Description

UTILISATION DE LIGANDS PEPTIDIQUES DE RECEPTEURS DE LA
MEMBRANE PLASMIQUE ET DE LEURS ANALOGUES POUR MODULER
L'ACTIVITE DES MITOCHONDRIES
La présente invention est relative à l'utilisation de ligands pepti- diques de récepteurs de la membrane plasmique et de leurs analogues pour moduler (activer/inhiber) l'activité des mitochondries.
Les hormones peptidiques, facteurs de croissance, neuropeptides et cytokines sont des facteurs peptidiques libérés, soit dans le sang, soit à proximité de leur site d'action. Ils agissent via des récepteurs spécifiques présents à la surface de cellules cibles. La liaison de ces ligands peptidiques à leur(s) récepteur(s) entraîne deux événements : d'une part, la transduction d'un signal intracellulaire induit une cascade de phosphorylations de substrats cytoplasmiques impliqués dans différentes voies de signalisation cellulaire, qui conduisent à un effet biologique dans la cellule cible (prolifération, différenciation, effet métabolique, apoptose, sécrétion de facteurs..), et d'autre part, l'internalisation du complexe ligand-récepteur induit la diminution du nombre de récepteurs présents à la surface des cellules cibles et la dégradation du ligand par le système lysosomal ou son exocytose par l'appareil de Golgi, qui conduisent à la désensibilisation des cellules au signal du ligand.
Parmi ces hormones, l'hormone de croissance (ou GH pour Growth hormone) qui possède un effet anabolisant sur le métabolisme protéique, a notamment été utilisée pour augmenter la prise de poids et la production de lait chez l'animal (Demande EP 0 278 103), ou bien pour traiter la perte de masse musculaire associée à l'encéphalopathie mitochondriale (Caroll et al. Clinical Endocrinology, 1997, 47, 113- 117). L'étude du devenir de ces peptides, après leur internalisation au niveau de la membrane plasmique, a montré qu'une fraction de ces peptides était également localisée dans le cytoplasme, l'appareil de Golgi et les granules sécrétoires, le noyau et les mitochondries.
Parmi les peptides détectés dans le noyau, on peut citer : des hormones (thyrolibérine (TRH), somatocrinine (GRF), corticolibérine (CRH), hormone de croissance (GH), somatostatine, angiotensine II, vasopressine, VIP (peptide vasoactif intestinal), insuline, prolactine, peptide natriurétique (ANP)...), des facteurs de croissance (des neurones (NGF), des cellules épithéliales (EGF), des fïbroblastes (FGF) et facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF)...), des neuropeptides (neuropeptide Y (NPY), substance P...), des cytokines (interférons α, β, γ, interleukines...), (More , Biochemical Pharmacology, 1994, 47, 63-76 ; Sadir et al., Cytokine, 2001, 14, 19-26). En outre, il a été montré que certains de ces peptides avaient un effet sur l'activité nucléaire, à la fois sur la transcription et le cycle cellulaire, notamment sur : l'activation -par activation de la transduction du signal - de la transcription de certains gènes, incluant des oncogènes comme c-fos, (NGF, TRH, GH...), la synthèse de l'ADN (substances P et , vasopressine, bombésine) et la proli- fération cellulaire (prolactine, FGF, GH,...), la synthèse d'ARN (insuline, GRF,..), la sensibilité de la chromatine à la digestion par les nucléases (EGF, angiotensine II...), la transcription des gènes ribosomaux (FGF...) et l'activation de l'ARN polymérase I
(EGF...), (Morel et al., précité ; Lobie et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 21330-21339).
Certains de ces peptides ont également été détectés dans les mito- chondries, notamment l'hormone de croissance (Mertani et al, Neuroendocrinology, 1996, 63, 257-268), l'interféron γ (Sadir et al, précité) et le peptide natriurétique (Bachar et al., Pflugers Arch, 1992, 422, 204-206). En revanche, ucune fonction n'a été associée à la présence de ceg peptides dans les mitochondries.
L,es mitochondries jouent un rôle essentiel dans le métabolisme énergétique des cellules et la tb.ermogénèse du fait qu'elles possèdent l'ensemble des complexes en_-ymatiques de la chaîne respiratoire. En outre, elles sont impliquées dans la différenciation cellulaire et le développement, du fait d§ leur rôle essentiel dans l'induction de l'apoptose (Loeffler et Kroemer, Exp. Cell ïyss., 2000, 256, 19- 26). Elles sont également impliquées dans la production de radicaux libres (ROS pour Reactive Oxygen Species).
Alors qu'il a été proposé que la régulation du fonctionnement mitochondrial était sous la dépendance de la transduction du signal intracellulaire induit par la liaison des ligands peptidiques à leur(s) récepteur(s) de la membrane plasmique, les inventeurs ont montré que, de manière surprenante, des ligands peptidiques de récepteurs de la membrane plasmique qui sont connus pour exercer leur effet biologique par l'intermédiaire du signal transduit par la liaison ligand-récepteur, sont également capables d'être internalisés et captés par les mitochondries et de réguler directement l'activité de ces mitochondries. Par exemple, les inventeurs ont montré que l'hormone de croissance recombinante peut être captée in vitro par une fraction de mitochondries purifiées. En présence de doses croissantes d'hormone de croissance, cette capture se traduit par une diminution de l'activité de deux des quatre complexes enzymatiques de la chaîne respiratoire, à savoir : le complexe IN (cytochrome c oxydase (COX)) et le complexe II (succinate déshydrogénase (SDH)), et ce de manière dose dépendante, dans un délai inférieur à 15 minutes.
Du fait de leur rôle direct sur l'activité des mitochondries, en l'absence de récepteur membranaire, les ligands peptidiques de récepteurs membra- naires et leurs analogues représentent de nouvelles drogues utiles pour moduler (activer ou inhiber) spécifiquement l'activité des mitochondries. De telles molécules ont des applications, dans le domaine médical, notamment pour le traitement des troubles de la croissance, des maladies métaboliques, de l'obésité, du cancer, des maladies mitochondriales, de la nécrose et de la dégénération, et pour la prévention du vieillissement, ainsi que dans le domaine agro-alimentaire, notamment pour améliorer le développement animal, la production de la viande (par réduction de la lipogénèse) et la production du lait.
L'invention a en conséquence pour objet, un médicament modulateur de l'activité des mitochondries, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule sélectionnée dans le groupe constitué par : a) un ligand peptidique d'un récepteur de la membrane plasmique ou un analogue dudit ligand, associés à un peptide d'adressage mitochondrial, b) un polynucléotide codant pour le ligand peptidique ou l'analogue défini en a), et c) un vecteur recombinant comprenant le polynucléotide défini en b).
Au sens de la présente invention :
- on entend par modulateur de l'activité des mitochondries, un acti- vateur ou un inhibiteur (inhibition partielle ou totale). - on entend par ligand peptidique, toute substance peptidique agissant via des récepteurs spécifiques présents à la surface de cellules cibles. - on entend par analogue, relativement à un ligand peptidique, un peptide possédant une structure apparentée à celle dudit ligand peptidique mais pouvant posséder une activité similaire (agoniste) ou opposée (antagoniste), vis-à -vis du récepteur dudit ligand peptidique. - ledit ligand peptidique ou ledit analogue sont associés audit peptide d'adressage mitochondrial, soit par une liaison covalente comme une liaison peptidique entre les extrémités NH2 et COOH dudit ligand et dudit peptide, soit par une liaison non-covalente comme une liaison ionique ou hydrophobe.
- on entend par activité des mitochondries : le métabolisme éner- gétique cellulaire et la thermogénèse, l'apoptose et la production de radicaux libres
(ou ROS).
Selon un mode de réalisation avantageux dudit médicament, les dites maladies sont sélectionnées dans le groupe constitué par : le cancer, les maladies ou syndromes métaboliques, les troubles de la croissance, l'obésité, les maladies mito- chondriales, la nécrose et la dégénération, et le vieillissement.
Les maladies ou syndromes métaboliques sont tels que définis dans : Tonkin et al, 2003. The Science and Public Affairs Forum. World Health Organisation World Health Organisation (1999). Report of WHO consultation : définition of metabolic syndrome in définition, diagnosis, end classification of diabètes mellitus and its complication. I. Diagnosis and classification of Diabètes mellitus. World Health organisation, Department of Noncommunicable Disease Surveillance, Geneva ; Lemieux et al., Circulation, 2000, 102 : 179-184 ; Haffner et al., J. Am. Med. Ass., 1990, 263: 2893-2898.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit médicament, ledit ligand peptidique est sélectionné dans le groupe constitué par : les hormones peptidiques, les facteurs de croissance, les neuropeptides, les cytokines et leurs analogues.
A titre d'exemple non limitatif de ces ligands peptidiques, on peut citer les suivants : des hormones (somatostatine, GRF, CRH, GH, angiotensine II, vasopressine, VIP, insuline, prolactine, ANP), des facteurs de croissance (NGF, PDGF, EGF, FGF), des neuropeptides (NPY, substance P) et des cytokines (interférons α, β, γ, interleukines). Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit médicament, l'une des extrémités (-NH2 ou -COOH) de la séquence en acides aminés dudit ligand ou de l'un de ses analogues est associée audit peptide d'adressage mitochondrial, par une liaison peptidique. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux dudit médicament, ledit peptide d'adressage mitochondrial est sélectionné dans le groupe constitué par :
- RRIVVLHGYKAVKEVLLNHK (SEQ ID NO : 1), correspondant aux positions 74 à 95 de la séquence du cytochrome P450 2E1 de rat (CYP2E1), - MLSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQ (SEQ ID NO : 2), correspondant aux positions 1 à 24 de la séquence de la superoxyde-dismutase humaine contenant du manganèse (MnSOD),
- MASVWQRLGFYASLLKRQLNGGPDVIKWERRVIPGCTRS (SEQ ID NO : 3), correspondant aux positions 1 à 39 de la séquence de la Leucyl- ARNt synthétase humaine, et
- les peptides d'au moins 5 acides aminés, de préférence de 5 à 20 acides aminés, de manière préférée de 7 à 15 acides aminés, inclus dans les peptides précédents (SEQ ID NO : 1, 2 ou 3).
De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique (polynucléotide) d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans lequel ledit polynucléotide est placé sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés. On peut utiliser entre autres, des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lenti- virus et les AAV, dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt. On peut également introduire lesdits peptides, leurs analogues et les molécules d'acides nucléiques codant lesdits peptides et leurs analogues (isolées ou insérées dans un vecteur plasmidique) dans des cellules-hôtes, soit en utilisant des méthodes physiques telles que l'électroporation ou la microinjection, soit en les associant à toute(s) substance(s) permettant le passage de la membrane plasmique, tels que des transporteurs comme les nanotransporteurs, des liposomes, des lipides ou des polymères cationiques. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l'électroporation associée à des liposomes.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux dudit médicament, ledit ligand peptidique est associé à au moins un moyen permettant sa pénétration dans les cellules, tel que défini ci-dessus (nanotransporteur, liposomes, lipides ou des polymères cationiques). Avantageusement, lesdits ligands peptidiques sont pré-sélectionnés par un procédé de criblage comprenant au moins les étapes suivantes :
- la mise en contact d'un ligand peptidique d'un récepteur de la membrane plasmique ou de l'un de ses analogues, avec une fraction de mitochondries purifiées, - la mesure par tout moyen approprié, de l'effet dudit ligand ou dudit analogue sur l'activité des mitochondries, et
- la sélection des ligands capables de moduler l'activité des mitochondries.
Les mitochondries sont purifiées par des moyens connus en eux- mêmes ; par exemple elles sont préparées comme décrit dans Ardail et al., J. Biol. Chem., 1993, 268, 25985-25992.
L'effet dudit ligand sur l'activité des mitochondries est évalué par tout moyen approprié connu en lui même de l'Homme du métier. Par exemple, l'activité des mitochondries est évaluée par mesure de l'activité respiratoire, des radi- eaux libres (ROS) ou de l'apoptose.
De manière plus précise, l'activité respiratoire globale est mesurée par oxygraphie et l'activité des complexes enzymatiques de la chaîne respiratoire (NADH déshydrogénase, succinate déshydrogénase, ubiquinol cytochrome c réduc- tase, cytochrome c oxydase) est mesurée par spectrophotométrie, en présence d'un substrat approprié.
Les radicaux libres (ROS) sont mesurés par dosage des enzymes anti-oxydantes (catalase, gluthation peroxydase, superoxyde dismutase), par quantifi- cation de la peroxydation lipidique (dosage du malondialdéhyde) et/ou de l'oxydation des protéines (dosage de dérivés carbonyles). Les radicaux libres sont également mesurés en fluorométrie sur cellules entières, à l'aide d'une sonde diacétate de 2,7- dichlorodihydrofluoroscéine (DCFDA), dont la longueur d'onde d'excitation se situe à 501 nm et d'émission à 521 nm ; l'H O2 clive la sonde, libérant ainsi la fluoroscéine, composé émettant à 521 nm. Alternativement, les radicaux libres sont mesurés en fluorométrie sur mitochondries isolées ; l'acide homovanillique réagissant avec H2O utilise la peroxydase de raifort comme catalyseur et permet ainsi de mesurer la production de H O en mesurant l'émission de fluorescence à 420 nm. L'activité mitochondriale peut également être évaluée par mesure du degré d'apoptose par l'une des méthodes suivantes : analyse du devenir de l'ADN nucléaire par électrophorèse en gel d'agarose, mesure de la sensibilité du PTP (Permeability Transition Pore) au calcium à l'aide d'une sonde fluorescente non perméante et sensible au calcium (Calcium Green-5N), détection en western-blot, de la présence des protéines Bax et Bcl2 dans les compartiments cytosolique et mitochondrial et de la présence du cytochrome c et de la caspase 9 clivée dans le cytosol, et mesure de l'activité de la caspase 3 par la détection de l'émission de fluorescence résultant du clivage, par cette enzyme, d'un substrat approprié.
En outre, les variations d' autofluorescence du NADH et des flavo- protéines observées en microscopie confocale biphotonique peuvent également donner des indications sur le fonctionnement des mitochondries.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'activité des mitochondries tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un médicament. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit médicament est destiné au traitement des maladies telles que définies ci-dessus.
La présente invention a également pour objet, un produit agroalimentaire, caractérisé en ce qu'il comprend un modulateur de l'activité des mitochondries tel que défini ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux dudit produit, il est utilisé pour améliorer le développement animal, notamment le développement staturo- pondéral. Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit produit, il est utilisé pour augmenter la masse musculaire.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit produit, il est utilisé pour augmenter la production de lait. Conformément à l'invention, lesdits animaux sont des mammifères ou des oiseaux élevés pour la production de viande (bovin, ovin, caprin, porcin, volaille ..), ou bien des mammifères élevés pour la production de lait (bovin, ovin, caprin,...).
La présente invention a également pour objet, l'utilisation d'un modulateur de l'activité des mitochondries tel que défini" ci-dessus, à titre de produit agro-alimentaire.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit produit agro-alimentaire est destiné aux applications telles que définies ci-dessus.
L'invention englobe l'utilisation de peptides isolés et de leurs analogues, de protéines comprenant lesdits peptides et de leurs analogues, ainsi que l'utilisation de vecteurs recombinants codant lesdits peptides, leurs analogues et les protéines précédents.
Le ligand peptidique ou ses analogues, associés à un peptide d'adressage mitochondrial, ainsi que les polynucléotides et les vecteurs recombinants dérivés des précédents, tels que définis ci-dessus, sont préparés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier.
De manière plus précise :
- la séquence en acides aminés correspondant à la fusion (N- terminale ou C-terminale) entre le ligand peptidique (ou l'analogue) et le peptide d'adressage mitochondrial peut être synthétisée en phase solide, selon la technique Fmoc, originellement décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc, 1964, 85: 2149-) et les peptides obtenus sont purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse,
- la séquence nucléotidique codant pour la fusion (N-terminale ou C-terminale) entre le ligand peptidique (ou l'analogue) et le peptide d'adressage mitochondrial peut être obtenue par PCR ou RT-PCR ou bien par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, en suivant les proto- coles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Par exemple, les séquences nucléotidiques sont amplifiées par PCR à l'aide d'une paire d'amorces appropriée, puis l'ADNc obtenu est clone dans un vecteur d'expression eucaryote ou procaryote, sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés. En outre, ledit vecteur peut comprendre des séquences (étiquettes ou tag) fusionnées en phase avec l'extrémité 5' et/ou 3' dudit insert, utiles pour l'immobilisation, et/ou la détection et/ou la purification de la protéine exprimée à partir dudit vecteur. Ces vecteurs sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes. La protéine produite dans les cellules modifiées par le vecteur recombinant est éventuellement purifiée par tout moyen approprié, notamment par chromatographie d'affinité.
Le médicament et le produit agro-alimentaire selon l'invention sont utilisés par voie entérale (orale, sublinguale), parenterale (sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse) ou locale (cutanée, nasale, oculaire). Il peuvent se présenter sous la forme de comprimés, simples ou dragéifiés, de gélules, de granules, de sirop, de suppositoires, de préparations injectables, de pommades, de crèmes, de gels, d'aérosol, lesquels sont préparés selon les méthodes usuelles. Dans ces formes galéniques, les molécules telles que définies ci- dessus sont associées à des excipients habituellement employés dans des compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
La posologie utile varie en fonction de l'application envisagée, de la voie et du rythme d'administration, ainsi que de la nature et du poids de l'espèce-cible (humaine ou animale).
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'utilisation de l'hormone de croissance pour moduler l'activité des mitochondries selon la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre l'incorporation d' I-hGH, in vivo, par le foie total (A) ou la fraction mitochondriale (B), 15 min après l'injection intraveineuse. A : 35 % de l'l25I-hGH incorporée par le foie est détecté dans la fraction mitochondriale. B : Analyse par un test en compétition comme décrit à l'exemple 1, de la liaison de l'125I-hGH aux mitochondries de rat adultes isolées ; 90 % de l'hormone de croissance sont incorporés de façon spécifique par la fraction mitochondriale. Les valeurs représentent la moyenne de 3 mesures indépendantes ± erreur standard à la moyenne (SEM). * valeur statistiquement significative P < 0,01,
- la figure 2 illustre l'incorporation d' I-hGH, in vitro, par la fraction mitochondriale, comme décrit à l'exemple 1. A : cinétique d'incorporation de l'125I-hGH par les fractions mitochondriales ; l'incorporation maximale correspond à une durée d'incubation comprise entre 10 min et 30 min. Les valeurs représentent la moyenne de 3 mesures ± SEM. * valeurs statistiquement significatives P < 0,01 . B : incorporation d'125I-hGH par des fractions mitochondriales incubées pendant 10 min avec des concentrations croissantes de rGH (10 nM à 500 nM), en présence d' I- hGH utilisé comme traceur ; la courbe de saturation atteint un plateau pour des concentration supérieures à 300 nM. Les valeurs représentent la moyenne de 4 mesures indépendantes ± erreur standard à la moyenne (SEM). * valeurs statistiquement significatives P < 0,05, - la figure 3 illustre l'analyse par SDS-PAGE, de l'incorporation d'125I-hGH par les mitochondries. La translocation mitochondriale a été effectuée comme décrit à l'exemple 1. La fraction mitochondriale isolée à partir du foie a été incubée, 30 min à 37 °C, en présence de rGH et d' I-hGH puis séparée par électro- phorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE). Piste 1 : fraction mitochondriale incubée avec de l'i25I-hGH et 100 nM de rGH. Piste 2 : fraction mitochondriale incubée avec de l'I25I-hGH et 300 nM de rGH. Piste 3 : l25I-hGH,
- la figure 4 illustre l'analyse par immunomarquage en microscopie électronique de la localisation de l'hormone de croissance dans les mitochondries : des mitochondries purifiées à partir de foie de rat ont été incubées avec 100 nM de rGH (A) ou sans rGH (B) puis incluses dans de la résine hydrophile, comme décrit à l'exemple 1 ; l' immunomarquage à l'aide de particules d'or de 10 nm de diamètre est détecté à l'intérieur des mitochondries, dans la matrice et dans la membrane interne, à la fois dans le contrôle (B) et dans les mitochondries incubées pendant 10 min avec rGH (A) et la densité du marquage augmente avec la concentration en rGH,
- la figure 5 illustre l'effet inhibiteur de l'hormone de croissance sur la respiration (état 3), analysé par oxygraphie comme décrit à l'exemple 1. Des mito- chondries isolées correspondant à 750 μg de protéines ont été introduites dans la chambre électrochimique (volume de 1500 μl) et pré-incubées pendant 0, 5 et 10 min à 37 °C, avec ou sans rGH. Du succinate et de l'ADP ont ensuite été ajoutés à des concentrations finales de respectivement, 5 mM et 100 μM. D : Contrôle. jffl : GH lOnM. JD : GH 50 nM. B : GH 100 nM. * valeurs statistiquement significatives P < 0,05,
- la figure 6 illustre les effets directs de l'hormone de croissance sur les 4 complexes enzymatiques de la chaîne respiratoire. A : NADH déshydrogénase. B : Succinate déshydrogénase (SDH). C : Ubiquinol cytochrome c réductase. D : cytochrome c oxydase (COX). Les activités enzymatiques ont été mesurées par spectrophotométrie, à partir de fractions de mitochondries hépatique isolées, comme décrit à l'exemple 1. Pour chaque expérience, les mitochondries ont été incubées à 37 ° C en présence de concentrations croissantes d'hormone de croissance (rGH). Les résultats exprimés en pourcentage par rapport au contrôle, représentent la moyenne ± SEM. : incubation sans rGH. D : incubation en présence de 10 nM rGH. • : incu- bation en présence de 50 nM rGH. r : incubation en présence de 100 nM rGH,
- la figure 7 illustre l'effet de l'hormone de croissance sur l'inhibition de l'activité cytochrome c oxydase (COX), analysée par une méthode polarographique, comme décrit à l'exemple 1. Les fractions mitochondriales ont été pré-incubées sans rGH (^) ou en présence de 100 nM rGH, pendant 1 min (D), 5 min (β) et 10 min ( k) et l'activité COX a été enregistrée pendant 15 min . Les résultats exprimés en pourcentage par rapport au contrôle, représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. * valeurs statistiquement significatives P < 0,05, et
- la figure 8 illustre la cinétique d'activation de la cytochrome c oxydase par l'hormone de croissance, mesurée sur la lignée BRL-GHR!-638. Les cellules ont été incubées en présence de 50 nM ou en l'absence d'hormone de croissance ; la stimulation maximale de l'activité cytochrome c oxydase correspond à un période d'incubation de 10 min. Les valeurs représentent la moyenne ± SEM de 5 expériences indépendantes. * différence significative (P< 0,05). EXEMPLE 1 : MATERIELS ET METHODES
1) Matériels L'hormone de croissance humaine (hGH) marquée à l'iode 125 a été fournie par NEN ; l'activité spécifique correspond à 100-150 μCi/μg de protéine.
L'hormone de croissance recombinante humaine (rGH) et l'anticorps primaire dirigé contre l'hormone de croissance humaine ont été fournis, respectivement par le NHPP (National Hormone of Pituitary Program) et par DAKO. Les marqueurs de poids moléculaire prémarqués ont été fournis par
BIORAD. Les membranes de nitrocellulose (Hybond-C), le système de détection pour Western-blot (ECL plus) et les immunoglobulines de chèvre anti-IgG de lapin couplées à la peroxydase ont été fournis par AMERSHAM BIOSCIENCES EUROPE GmbH. Tous les réactifs utilisés pour les analyses biochimiques et polarographiques ont été fournis par SIGMA- ALDRICH.
2) Traitement des rats à l,125I-hGH
Des rats mâles WISTAR (IFF A-CREDO) de 250 à 300 g sont élevés à température ambiante avec une alternance de 12h de lumière et de 12h d'obscurité. Les animaux reçoivent une alimentation à base de granulés et de l'eau à volonté. Pour les expériences avec un traceur, les animaux ont été anesthésiés avec de l'halothane et ont reçu une injection intraveineuse de 0,5 ml de PBS contenant 4,4x10 cpm d' I- hGH avec ou sans un excès d'un facteur 100 d'hormone de croissance recombinante non-marquée. Les rats ont été sacrifiés par décapitation 15 min après l'injection. Les foies des rats ont ensuite été prélevés puis lavés dans du tampon d'isolement (250 mM sucrose, 10 mM Hepes, pH 7,4, 1 mM EDTA).
3) Transfection de l'ADNc codant pour le récepteur de l'hormone de croissance
L'ADNc codant pour le récepteur de l'hormone de croissance
(Mathews et al, J. Biol. Chem., 1989, 264, 9905-9910) a été clone dans un vecteur d'expression contenant « l'enhancer » de SV40 et le promoteur de la métallothionéine Ha humaine. Le vecteur ainsi obtenu et le plasmide pIPB-1 contenant le gène de résistance à la néomycine sous le contrôle transcriptionnel du promoteur de la thymi- dine kinase (Môller et al, J. Biol. Chem., 1992, 267, 23403-23408) ont été co- transfectés dans des cellules BRL 3A, à l'aide de lipofectine.
Des cellules transfectées de façon stable ont ensuite été sélectionnées en présence de G418 (1 mg/ml). La lignée de cellules BRL 3 A exprimant de façon stable la protéine correspondant aux positions 1 à 638 de la séquence en acides aminés du récepteur de l'hormone de croissance ainsi obtenue, est dénommée ci-après BRL-GRHuas.
4) Préparation de mitochondries hépatiques
Les mitochondries de foie de rat sont préparées comme décrit dans Ardail et al., J. Biol. Chem., 1993, 263, 25985-25992.
De manière plus précise, les foies sont plongés dans du tampon d'isolement glacé et les mitochondries sont séparées par centrifugations différentielles puis lavées extensivement dans du milieu d'isolement avant d'être purifiées.
L'extrait brut de mitochondries est déposé sur un gradient de 20 ml de tampon Hepes 25 M, pH 7,4 contenant 225 mM mannitol, 1 mM EDTA, 1 % BSA et 30 % Percoll. Les gradients sont centrifugés 30 min à 95 000 g comme décrit dans Vance, J. Biol. Chem., 1990, 265, 7248-7256, puis une bande épaisse contenant les mitochondries purifiées est prélevée à partir des 2/3 inférieurs du tube. Les mitochondries purifiées sont lavées extensivement dans du tampon d'isolement, de façon à éliminer le Percoll. La concentration en protéines mitochondriales, déterminée à l'aide du kit de dosage de protéines (BIORAD référence 500-0113) et d'un étalon de BSA, est d'environ 60 à 90 mg/ml. L'intégrité des mitochondries isolées a été déterminée par oxygraphie à l'aide d'une électrode à oxygène du type Clark. Les rapports respiratoires contrôles (état 3 de la respiration/état 4 de la respiration) mesurés à partir de différentes préparations de mitochondries sont de l'ordre de 5,5 à 6,5.
5) Immunomarquage en microscopie électronique
Des fractions de mitochondries purifiées ont été stimulées pendant 10 min à 37°C en présence de 100 nM de GH dans du tampon d'isolement, ou non stimulées. La suspension de mitochondries a été centrifugée à 8 500 g et le culot a été lavé 2 fois dans du tampon 0,1 M phosphate pH 7,4, à +4°C. Le culot a ensuite été coupé en petits morceaux et fixé pendant 30 min à température ambiante dans du tampon 100 mM phosphate pH 7,4 contenant 4 % de paraformaldéhyde et 0,1 % de glutanoldéhyde. Puis les échantillons ont été lavés 3 fois dans du tampon 0,1 M phosphate, pH 7,4, déshydratés par des incubations successives de 15 min, en présence de concentrations croissantes d'alcool : 30 %, 50 %, 70 % et 95 % et incluses progressivement, à température ambiante, dans des mélanges résine hydrophile (LR- White, FLUKA)/alcool à 95 % : 3 bains de 60 min dans des mélanges 1:2, 1 :1 et 2:2. Les échantillons ont enfin été inclus dans la résine pure pendant 90 min et la polymérisation a été réalisée dans des capsules de gélatine, pendant 24 h à 60°C.
Des coupes ultrafines (70 nm) ont été réalisées à l'aide d'un micro- tome (Ultracut S, LEICA) puis transférées sur des grilles de nickel de 200 mesh recouvertes de collodion et carbonées. La détection immunocytologique de la rGH a été réalisée à l'aide d'une IgG de cochon d'Inde anti-rGH à la dilution 1/100, dans du tampon 100 mM phosphate, pH 7,4 contenant 300 mM NaCl, 0,05 % Tween-20 et 0,5 % BSA. Le marquage est révélé par des immunoglobulines anti-IgG de cochon d'Inde couplée à des particules d'or de 10 nm de diamètre. Les réactifs d' immunomarquage (BRITISH BIOCELL) sont utilisés au l/50e dans du tampon 20 mM Tris, 300 mM NaCl, 0,05 % Tween-20, 0,5 % BSA, pH 8,2. Le contraste a été réalisé par incubation, pendant 30 min dans une solution d'acétate d'uranyle (4 %, pH 7,0) puis les grilles ont été analysées à l'aide d'un microscope électronique (CM120, PHILIPS), fonctionnant à 80 kV.
6) Incorporation de l'hormone de croissance par les mitochondries
Des mitochondries intactes couplées ont été remises en suspension dans du tampon d'incubation (250 mM sucrose, 20 mM KO, 5 mM MgCl2, 10 mM K2HPO4/KH2PO4, pH 7,4) à une concentration de 60 mg/ml de protéines mitochon- driales. Pour les expériences dose-effet avec un traceur radioactif, les fractions mitochondriales ont été traitées avec du succinate et de l'ADP pour stimuler la respiration. Les mitochondries sont incubées en présence de concentrations croissantes d'hormone de croissance non marquée (10 nM à 500 nM) et d'125I-hGH comme traceur, pendant 10 min à 37°C, sous agitation. L'hormone de croissance liée de façon non-spécifique à la membrane externe des mitochondries est éliminée par centrifugation à 8500 g pendant 10 min dans un tampon acide (Glycine-HCl, pH 3,0). Puis les mitochondries sont lavées une fois dans du tampon d'isolement et solubilisées dans 100 mM NaOH, 0,1 % SDS et transférées dans des tubes adaptés à la spectrométrie γ. Les cinétiques sont réalisées dans les mêmes conditions ; les mitochondries étant incubées pendant 0 min à 30 min en présence de 150 nM rGH. 7) Analyse par SDS-PAGE de l'125I-hGH captée par les mitochondries Le poids moléculaire de l' I-hGH captée par les mitochondries a été déterminé par SDS-PAGE, à partir de mitochondries hépatiques de rats traitées à l'1 5I-hGH et de fractions de mitochondries hépatiques incubées en présence d'I25I- hGH comme précisé ci-dessus. Les échantillons et l'hormone iodée ont été dilués dans 50 mM Tri-HCl, pH 6 ,8 contenant 90 % (V/V) glycérol, 0,05 % Bleu de Bromophénol, 3 % (P/V) SDS, dénaturés par chauffage à 95°C pendant 5 min et chargés sur un gel de polyacrylamide contenant un gel de concentration à la concentration de 4 % et un gel de séparation à la concentration de 15 %. La migration des échantillons a été réalisée pendant 1 h à 40 mA, puis les gels ont été séchés et auto- radiographiés (film AR-5, KODAK). 8) Analyse de l'activité cytochrome c oxydase dans la lignée BRL-GRH ι-638
Les cellules BRL sont cultivées à confluence dans du milieu F12 de Ham additionné de 10 % de sérum de veau foetal, 50 Ul/ml pénicilline et 50 μg/ml streptomycine. Les cellules confluentes sont incubées à 37°C, pendant 12 h dans du milieu sans sérum avant l'addition de rGH (50 nM) aux temps indiqués. Après stimu- lation par la rGH, toutes les étapes sont réalisées à + 4°C. Le milieu est enlevé et les cellules sont lavées avec 50 mM Tris, pH 7,4, 9 %o NaCl et récoltées à une concentration finale de 10 cellules/ml. Les cellules sont ensuite centrifugées à 2000 g pendant 10 min, et le culot est remis en suspension dans 250 μl de 25 mM Tris-HCl, pH 7,4. La concentration en protéines, déterminée à l'aide du kit (500-0113, BIORAD) et d'un étalon de BSA est d'environ 10 mg/ml. L'extrait de cellules a été hydrolyse pendant 1 h sur la glace, dans du tampon Tris contenant 3 % de dodécyle maltoside puis centrifugé 5 min à 3000 g. Le surnageant a été récolté et l'activité cytochrome c oxydase a été évaluée par mesure spectrophotométrique de l'oxydation du cytochrome c à 550 nm. Le substrat réduit a été obtenu par chromatographie échangeuse d'ions (colonne Sephadex G25, PHARMACIA). Une solution incluant 10 mM KH2PO4, pH 7,4, 100 mM acide L-ascorbique et 10 % du cytochrome c oxydé a été chargée sur la colonne puis le substrat a été élue en présence de tampon phosphate. L'essai a été réalisé dans du tampon 100 mM phosphate pH 7,0 contenant 5 à 10 μl d'homogénat cellulaire (50 à 100 μg de protéines) et 30 μl de cytochrome c réduit ont été ajoutés pour initier la réaction.
9) Analyse de l'activité des marqueurs enzymatiques de la chaîne respiratoire L'activité enzymatique des différents complexes de la chaîne respiratoire a été analysée par spectrophotométrie, à 37° C, à partir de fractions mitochondriales incubées pendant 5, 10 ou 15 min en présence de concentrations croissantes de rGH (10, 50 et 100 nM).
L'activité NADH déshydrogénase (complexe I) a été évaluée, à l'aide d'un tampon phosphate (10 mM K-phosphate, pH 8, 0,5 mM NADH, 20 mM phosphatidylcholine) et de 20 μ à 40 μl d'homogénat (100 μg à 200 μg de protéines mitochondriales). La réaction a été initiée après équilibration par addition de 10 mM d'ubiquinone, puis suivie à 340 nm.
L'activité succinate déshydrogénase (complexe II) a été mesurée à 600 nm. Le milieu réactionnel contenant 50 mM KH2PO4, pH 7,4, l%o Triton X-100, 3 mM KCN, 20 μg/ml roténone et 10 μl à 20 μl d'homogénat a été incubé 10 min à 37° C, puis additionné de 0,18 mM DCIP et 1,3 mM PMS et la réaction a été initiée par addition de succinate (20 mM).
L'activité ubiquinol cytochrome c réductase (complexe III) a été évaluée par mesure de la réduction du cytochrome c, à 550 nm pendant 2 min. La solution de décylubiquinol a été préparée à la concentration de 21,4 mM, comme décrit dans Rieske et al., Methods,Enzymal., 1967, 10, 239-245. Le milieu réactionnel contient 35 mM KH2PO4, pH 7,2, 5 mM MgCl2, 2,5 mg/ml BSA, 0,2 mM KCN, 20 μM cytochrome c oxydé, 10 μg/ml roténone et 15 μg à 30 μg de protéines mitochon- driales. La réaction a été équilibrée pendant 5 min à 37°C et initiée par addition de décylubiquinol (20 μM).
L'activité cytochrome c oxydase (complexe IV) a été évaluée par mesure de l'oxydation du cytochrome c à 550 nm, pendant 1 min. Une solution de cytochrome c oxydé (1 mM) a été diluée à la concentration de 50 μM dans un volume de 10 ml de tampon 25 mM KH2PO4, pH 7,4. Un ml de cette solution a été réduit par un léger excès de dithionite de sodium. Puis de petites quantités de la solution réduite ont été ajoutées à 9 ml de la solution initiale de cytochrome c oxydé (50 μM) jusqu'à atteindre 80 à 90 % de réduction. L'essai a été réalisé à partir d'un ml de cytochrome c réduit auquel 5 à 10 μl d'homogénat (5 à 10 μg de protéines) ont été ajoutés pour initier la réaction.
10) Analyse polarographique de la consommation d'oxygène L'oxygène a été dosé à l'aide d'une électrode à oxygène du type
Clark (modèle DW1, HANSATECH INSTRUMENTS LABORATORIES), dans une chambre en verre d'un volume de 1,5 ml, thermostatée (37°C ± 2°C), sous agitation constante. Le milieu réactionnel pour la mesure de la respiration est un milieu saturé en air ambiant contenant 250 mM sucrose, 1 mM EGTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 et 1 mg/ml de BSA dépourvue d'acides gras libres. Les substrats de la respiration (sous forme de sels de sodium) sont : le succinate (5 mM) et le glutamate (5 mM) additionné de malate (2,5 mM). Des inhibiteurs du transport des électrons de la chaîne respiratoire sont utilisés de façon à mesurer les paramètres de la phosphory lation oxydative de sites de couplages spécifiques ; l'addition de roténone (5 μM) pour inhiber le site 1, permet la mesure des sites 2 et 3 en présence de succinate (10 mM), et l'addition de malonate (10 mM) qui inhibe le site 2 permet la mesure des sites 1 et 3 en présence de malate/pyruvate. 75 μg de protéines mitochondriales ont été ajoutés dans la chambre contenant 1,5 ml de tampon d'incubation puis le mélange a été incubé pendant 0, 5, et 10 min en présence de 10, 50 et 100 nM rGH. L'état contrôle de la respiration (état 4) a été initié par addition de 15 μl de substrat. Après une min d'incubation, l'état actif de la respiration (état 3) a été initié par addition de 100 μM d'ADP. L'électrode a été calibrée à l'aide d'eau déminéralisée et de tampon d'incubation, en fonction du contenu en oxygène de l'eau (Hizuka et al., J. Biol. Chem. 256, 4591-4597). La consommation d'oxygène a été calculée à partir du tracé d'enregistrement et exprimée en nmol d'atomes d'oxygène, par min, par mg de protéines (Postel-Viany et al., Endocrinology, 1982, 111, 244-251). Le rapport ADP/O a été calculé en mesurant la consommation totale d'oxygène pendant le « puise »de phosphorylation.
11) Analyse statistique
Toutes les valeurs expérimentales sont exprimées par la moyenne ± SEM. Les résultats sont analysés par le test ANOVA ou par le t-test. Les résultats sont considérés comme significatifs pour P < 0,05. EXEMPLE 2 : MISE EN EVIDENCE DE L'INCORPORATION DE L'HORMONE DE CROISSANCE HUMAINE (hGH) PAR DES MITOCHONDRIES ISOLEES (figures 1 à 4)
L'internalisation spécifique de l'hormone de croissance, in vivo, dans les mitochondries hépatiques a été démontrée par co-injection d'hormone de croissance humaine radiomarquée ( I-hGH) avec un excès d'hormone de croissance recombinante (rGH). Les résultats présentés aux figures 1A et 1B montrent que la quantité de radioactivité détectée dans la fraction mitochondriale représente 35 % de la radioactivité totale incorporée par le foie (figure 1B). 15 min après l'injection, le signal spécifique détecté dans les mitochondries (figure 1A) représente 91 % de la radioactivité totale détectée dans la fraction mitochondriale, et ce de manière hautement significative (P < 0,01), démontrant la capacité des mitochondries à accumuler l'hormone de croissance de façon précoce.
L'incorporation spécifique de l'hormone de croissance, in vitro, dans les mitochondries, a été démontrée par incubation de fractions mitochondriales isolées en présence d'hormone de croissance recombinante non-marquée (rGH) et d'l25I-hGH utilisée comme traceur. Chaque expérience a été réalisée avec des mitochondries fonctionnelles, incubées dans un environnement favorable à la respiration. La radioactivité effectivement présente dans les mitochondries a été analysée après des lavages acides permettant d'éliminer l'excès d'hormone et l'hormone fixée à la surface des mitochondries. La cinétique d'incorporation d' I-hGH (figure 2A) suit une courbe de saturation présentant une augmentation rapide entre t = 0 min et t = 5 min (80 %) puis une stabilisation entre t = 10 min et t = 30 min ; l'analyse statistique montre que la capture est significative dès 5 min par rapport à t = 0 min, reflétant le niveau basai (P < 0,01). L'incorporation d' I-hGH par des fractions mitochondriales, en présence de concentrations croissantes de rGH, suit une courbe du type sigmoïde (Figue 2B) qui atteint un plateau aux concentrations comprises entre 300 nM et 500 nM. La concentration optimale de rGH permettant d'obtenir 50 % d'incorporation d'125I-hGH (point d'inflexion) correspond à une valeur de 200 nM. L'analyse statistique montre que la capture est significativement différente du taux basai à partir de 150 nM et jusqu'à à 500 nM de rGH (P < 0,05). Pour déterminer la forme de l'hormone de croissance qui est inter- nalisée, le poids moléculaire du produit radioactif détecté dans la fraction mitochondriale a été déterminé, à partir des mitochondries incubées, in vitro, en présence de rGH, par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) et révélé par autoradiographie. La figure 3 montre que les échantillons migrent avec un poids moléculaire apparent correspondant à celui de l'hormone de croissance native mono-iodée (22 kDa) et que l'intensité du signal augmente avec la concentration en GH. Ces résultats indiquent que la radioactivité émise par les mitochondries provient d' 125I-hGH native. Ces résultats ont été confirmés par immunocytologie en microscopie électronique, sur des fractions mitochondriales hautement purifiées incluses en résine hydrophile. L'immunoréactivité correspondant à l'hormone de croissance, visualisée par des particules d'or de 10 nm, est localisée à l'intérieur des mitochondries, dans la matrice et/ou la membrane interne (figure 4). Le signal détecté dans les contrôles, et qui est augmenté de façon significative par incubation avec de l'hormone de croissance exogène (rGH), correspond a celui de l'hormone de croissance endogène.
La mise en évidence, à partir de fractions de mitochondries hautement purifiées, de sites internes de la mitochondrie accessibles par la rGH confirme donc les résultats obtenus avec l' 125I-hGH. L'ensemble de ces résultats démontre que les mitochondries sont capables d'incorporer l'hormone de croissance in vitro et in vivo, indiquant que la mitochondrie pourrait représenter une cible directe des effets de cette hormone. EXEMPLE 3 : MISE EN EVIDENCE DE L'EFFET DIRECT DE L'HORMONE DE CROISSANCE HUMAINE SUR L'ACTIVITE RESPIRATOIRE DE MITOCHONDRIES ISOLEES
1) Effet global de l'hormone de croissance, in vitro, sur la chaîne respiratoire (figure 5)
La consommation d'oxygène par les fractions mitochondriales a été mesurée par oxygraphie en utilisant le succinate comme substrat de la respiration. D'une manière classique, les mitochondries ont été conservées dans un milieu contenant de l'albumine bovine dépourvue d'acides gras libres (free- fatty- acid- BSA) susceptibles d'induire un découplage des mitochondries. Les résultats présentés à la figure 5 montrent que l'état 3 de la respiration (respiration en présence d' ADP) est diminué en présence d'hormone de croissance alors que l'état 4 (respiration basale) n'est pas affecté. L'effet de l'hormone de croissance sur l'efficacité des phosphoryla- tions oxydatives est immédiatement détectable pour les concentrations de 50 nM et 100 nM et significativement différente des contrôles (P< 0 ,05). L'inhibition est maximale (40 %) après 10 min d'incubation. Une réduction de l'état 3 a également été observée avec une concentration de 10 nM mais aucune différence significative n'a pu être montrée dans ces conditions.
Ces résultats indiquent que la mitochondrie est une cible directe des effets de l'hormone de croissance sur la respiration cellulaire.
2) Effet direct de l'hormone de croissance, in vitro, sur les complexes enzymatiques de la chaîne respiratoire (figures 6 et 7)
Les effets à court terme de l'hormone de croissance, in vitro, sur l'activité des mitochondries ont été évalués par l'analyse biochimique, en spectro- photométrie, des 4 complexes enzymatiques de la chaîne respiratoire, à savoir : complexe I (NADH déshydrogénase), complexe II (succinate déshydrogénase), complexe III (ubiquinol cytochrome c réductase) et complexe IV (cytochrome c oxydase). Les cinétiques de réponse à la stimulation par l'hormone de croissance ont été réalisées pendant 15 ou 30 min à 37°C. Dans chaque essai, les contrôles effectués correspondant à l'incubation de fractions mitochondriales dans les mêmes conditions expérimentales avec omission de l'hormone de croissance. Ces contrôles n'étant pas affectés par la température et la durée d'incubation, ont servi de référence pour l'analyse statistique (figure 6). Deux des quatre activités enzymatiques testées, celles des complexes I et II, n'ont montré aucune variation significative quelque soit la période d'incubation testée et la concentration de l'hormone de croissance utilisée (Figure 6A et 6C). En revanche, l'incubation de fractions mitochondriales en présence de l'hormone de croissance conduit à une importante réduction des activités enzymatiques de la cytochrome c oxydase (COX) et de la succinate déshydrogénase (SDH), (Figure 6B et 6D), Les effets de l'hormone de croissance sur ces deux complexes dépendent à la fois du temps et de la concentration d'hormone utilisée.
L'inhibition de l'activité cytochrome c oxydase est maximale et statistiquement significative dès 5 min avec une concentration d'hormone de croissance de 10 nM (30 %, P< 0 ,05). Pour des concentrations de 50 nM et 100 nM, l'hormone de croissance est efficace pendant 15 min alors que 30 min sont nécessaires à la restauration du taux basai de l'activité de la cytochrome c oxydase avec une concentration de 10 nM. L'inhibition de l'activité succinate déshydrogénase, en termes de temps et d'intensité, est similaire à celle obtenue sur l'activité de la cytochrome c oxydase en présence de doses croissantes d'hormone de croissance, dans les mêmes conditions expérimentales. L'inhibition maximale est atteinte en 5 min avec une concentration de 100 nM (30 %) et en 15 min avec une concentration de 10 nM (25 %). L'intensité des effets de l'hormone de croissance sur les activités de la cytochrome c oxydase et de la succinate déshydrogénase sont fonction de la concentration et de la durée d'incubation.
L'activité de la cytochrome c oxydase (COX) a également été analysée sur des mitochondries découplées (non-phosphorylées), par une méthode pola- rographique, à l'aide du substrat TMPD/ascorbate. Avec les mitochondries incubées en présence de 100 nM de rGH, on observe une diminution de la consommation d'oxygène dépendante de la durée d'incubation, qui confirme les résultats de l'analyse biochimique précédente. L'effet est rapide et transitoire (5 min), étant donné que l'effet sur l'activité de la cytochrome c oxydase n'est plus détectable pour les durées de pré-incubation supérieures à 10 min (figure 7). Pour les durées de pré-incubation inférieures à 10 min, la diminution de la consommation d'oxygène est fonction de la durée pré-incubation et l'action de l'hormone de croissance persiste uniquement pendant les 15 premières minutes de l'incubation (P < 0,05).
Ces résultats confirment que l'hormone de croissance induit une diminution de l'activité de la cytochrome c oxydase.
3) Effet de l'hormone de croissance sur l'activité de la cytochrome oxydase, in vitro, sur des cellules entières exprimant le récepteur de l'hormone de croissance (figure 8)
L'effet de l'hormone de croissance sur l'activité de la cytochrome c oxydase a également été analysée in vitro sur la lignée BRL-GH !-638 exprimant le récepteur de l'hormone de croissance, après une stimulation de 60 min par l'hormone de croissance. L'analyse cinétique présentée à la figure 8 montre que la stimulation de l'activité basale, en réponse à l'hormone de croissance est significative à t = 5 min et maximale à t = 10 min (50 % au dessus de la valeur des contrôles, P< 0,05). Avec les durées d'incubation supérieures, l'activation diminue progressivement et n'est plus détectable à t = 60 min. La stimulation de l'activité respiratoire via la transduction du signal est transitoire et peut vraisemblablement être inhibée par l'intemalisation du peptide.
Ces résultats démontrent que la capture in vitro de l'hormone de croissance par les mitochondries isolées à une signification fonctionnelle qui se traduit par une action directe sur l'activité mitochondriale. D'une manière plus générale, ils montrent qu'un ligand peptidique pénètre dans la mitochondrie et agit à l'intérieur même de l'organite sans interaction avec le récepteur spécifique membranaire.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Médicament modulateur de l'activité des mitochondries, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule sélectionnée dans le groupe constitué par : a) un ligand peptidique d'un récepteur de la membrane plasmique ou un analogue dudit ligand, associés à un peptide d'adressage mitochondrial, b) un polynucléotide codant pour ledit ligand peptidique ou ledit analogue défini en a), ou c) un vecteur recombinant comprenant le polynucléotide défini en b). 2°) Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est destiné au traitement des maladies sélectionnées dans le groupe constitué par : le cancer, les maladies ou syndromes métaboliques, les troubles de la croissance, l'obésité, les maladies mitochondriales, la nécrose et la dégénération, et le vieillissement. 3°) Médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ligand peptidique est sélectionné dans le groupe constitué par : les hormones peptidiques, les facteurs de croissance, les neuropeptides, les cytokines et leurs analogues.
4°) Médicament selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit ligand peptidique est sélectionné dans le groupe constitué par les facteurs suivants : somatostatine, thyrolibérine, somatocrinine, corticolibérine, hormone de croissance, angiotensine II, vasopressine, peptide vasoactif intestinal, insuline, prolactine, peptide natriurétique, facteur de croissance des neurones, des cellules épithéliales, des fibro- blastes, facteur de croissance dérivé des plaquettes, neuropeptide Y , substance P, interférons α, β, γ et interleukines. 5°) Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'une des extrémités dudit ligand ou dudit analogue est associée audit peptide d'adressage mitochondrial, par une liaison peptidique.
6°) Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit peptide d'adressage mitochondrial est sélectionné dans le groupe constitué par:
- RRIVVLHGYKAVKEVLLNHK (SEQ ID NO : 1)
- MLSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQ (SEQ ID NO : 2), - MASVWQRLGFYASLLKRQLNGGPDVIKWERRVIPGCTRS (SEQ ID NO : 3), et
- les peptides d'au moins 5 acides aminés, de préférence de 5 à 20 acides aminés, de manière préférée de 7 à 15 acides aminés, inclus dans les peptides précédents.
7°) Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite molécule telle que définie en a), b) ou c) est associée à un moyen permettant la pénétration dans les cellules, sélectionné dans le groupe constitué par : les nanotransporteurs, les liposomes, les lipides cationiques ou les polymères cationiques.
8°) Médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que lesdits ligands peptidiques ou leurs analogues sont pré-sélectionnés par un procédé de criblage comprenant au moins les étapes suivantes :
- la mise en contact d'un ligand peptidique d'un récepteur de la membrane plasmique ou de l'un de ses analogues, avec une fraction de mitochondries purifiées,
- la mesure par tout moyen approprié de l'effet dudit ligand ou de son analogue sur l'activité des mitochondries, et
- la sélection des ligands capables de moduler l'activité des mitochondries.
9°) Utilisation d'un modulateur de l'activité des mitochondries tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 8, pour la préparation d'un médicament.
10°) Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement des maladies telles que définies à la revendication 2.
11°) Produit agro-alimentaire, caractérisé en ce qu'il comprend un modulateur de l'activité des mitochondries tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 8. 12°) Produit selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est utilisé pour améliorer le développement animal. 13°) Produit selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est utilisé pour augmenter la masse musculaire.
14°) Produit selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est utilisé pour augmenter la production de lait. 15°) Utilisation d'un modulateur de l'activité des mitochondries tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 8, à titre de produit agro-alimentaire.
16°) Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit produit est destiné aux applications telles que définies à l'une quelconque des revendications 13 à 15.
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