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WO2004081047A1 - モノクローナル抗体及びこれを産生するハイブリドーマ - Google Patents

モノクローナル抗体及びこれを産生するハイブリドーマ Download PDF

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WO2004081047A1
WO2004081047A1 PCT/JP2004/003424 JP2004003424W WO2004081047A1 WO 2004081047 A1 WO2004081047 A1 WO 2004081047A1 JP 2004003424 W JP2004003424 W JP 2004003424W WO 2004081047 A1 WO2004081047 A1 WO 2004081047A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hepr
monoclonal antibody
human
antibody
hybridoma
Prior art date
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PCT/JP2004/003424
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English (en)
French (fr)
Inventor
Toshi Komurasaki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to AU2004220156A priority patent/AU2004220156B2/en
Priority to US10/548,591 priority patent/US7435590B2/en
Priority to CA002519105A priority patent/CA2519105A1/en
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    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung

Definitions

  • the present invention relates to a monoclonal antibody (monoclonal antibody; MoAb) that specifically recognizes human epiregulin (hEPR), a hy-prideoma that produces the MoAb, a polyclonal antibody that recognizes the MoAb and hEPR (
  • MoAb monoclonal antibody
  • hEPR human epiregulin
  • hy-prideoma that produces the MoAb
  • polyclonal antibody that recognizes the MoAb
  • the present invention relates to an immunoassay method for specifically detecting hEPR in a sample using hEPR-polyclonal antibody (hEPR-PoAb).
  • EGF epiregulin
  • EPR epiregulin
  • mRNA is extremely low in normal tissues except for placenta and monocytes, and is reported to be elevated in certain cancer cells (eg, The Journal of Biologi cal Chemistry, 1995, Vol. 270). , p. 7495-7500; see The Biochemical Journal, 1997, Vol. 326, p. 69-75).
  • EPR The protein of the EPR and other EGF family members, the identity of 24-50 0/0 Dearu that negligence ⁇ is in Rereru of Amino acid sequence (The Journal of Biological Chemistry, 1995 , Vol. 270, p. 7495-7500).
  • EPR has very high sequence homology between species.For example, in human and mouse EPR, only 6 amino acids out of 46 amino acid residues are different, and in the above polyclonal antibody, As described above, not only is the operation complicated, but they could not be identified and detected.
  • conventional detection has a sensitivity of at most lng / ml, making it impossible to detect EPR in vivo.
  • An object of the present invention is to establish a simple and highly sensitive method for detecting hEPR and use it for the detection of human tumors.
  • the present invention provides a method useful for detecting a tumor, which can easily detect the presence of hEPR at a picogram level.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have obtained two types of hybridomas (1C3, 3E8) that produce a monoclonal antibody (MoAb) that specifically recognizes hEPR. Furthermore, we established a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (SE-ISA) combining this MoAb and hEPR-PolyAb, and completed a detection system with high sensitivity and low throughput.
  • SE-ISA sandwich enzyme-linked immunosorbent assay
  • the present invention provides the following (1) to (9).
  • hEPR human epiregulin
  • a method for specifically detecting hEPR in a sample in vitro comprising using the monoclonal antibody according to (4) and a polyclonal antibody (hEPR-PoAb) recognizing hEPR.
  • kits for detecting a human tumor comprising the monoclonal antibody according to (4).
  • FIG. 1 shows the results of measuring the titer of an anti-hEPR monoclonal antibody produced by the hybridoma of the present invention by ELISA.
  • FIG. 2 shows the results of titration of a biotinylated anti-hEPR polyclonal antibody.
  • FIG. 3 shows the detection sensitivity of the sandwich ELISA (S-ELISA) system using the stepwise method and the simultaneous addition method.
  • Figure 4 shows the results of an investigation of the specificity of this method by S-ELISA using the 1C3 monoclonal antibody as the primary antibody.
  • EGF family molecules mice It did not react with type EPR but only with hEPR.
  • FIG. 5 shows the results of Western blot analysis of hEPR in human serum. Molecular weight marker One position (kilodalton; kDa) is shown on the left.
  • FIG. 6 shows the results of detecting h EPR in human serum by the S-ELISA method.
  • FIG. 7 shows the results of detecting hEPR in various cell culture solutions.
  • the term “hEPR” refers to a precursor, a mature form, or a fragment thereof of human epiregulin, unless otherwise specified.
  • the term “precursor” refers to a membrane-bound form before enzyme cleavage, and the term “mature” refers to a polypeptide consisting of 46 amino acids (SEQ ID NO: 1) separated from the cell membrane.
  • the fragment is a fragment having at least 20 amino acid residues, more preferably at least 30 amino acid residues of the polypeptide, and essentially has a sequence specific to human epiledarin.
  • a sequence specific to human epiredarin is not meant to be particularly limiting, for example, a sequence that is known to be different in the comparison between human epiledarin and mouse epiledarin number
  • Epiregulin human and "epiregulin mouse j" have the same amino acid sequence as EPR naturally occurring in humans and mice, but are always limited to proteins extracted from nature. It is intended to encompass, for example, recombinants and synthetic polypeptides.
  • the term “specifically recognizes” means that it recognizes (or binds) to hEPR, but does not substantially recognize non-human EPRs such as other EGF family proteins or mouse EPR (binding). No) that means.
  • precursor, mature and fragmentation of hEPR This means that the polypeptide is recognized (bound) by the recognized polypeptide, but is not substantially recognized (does not bind) by EGF, TGF- ⁇ , mouse EPR, and the like.
  • the binding affinity to other EGF family proteins or non-human EPR such as mouse EPR is 100-fold or more, preferably 1,000-fold or more, and more preferably 10,000-fold or more. It means having the above binding affinity.
  • substantially does not recognize (bind) means that the binding is not confirmed by the detection means usually used in the art and the detection method of the present invention.
  • the hEPR precursor and the polypeptide fragmented for each mature form and the sandwich ELISA (S-ELISA) method are positive. It means that it does not react (is not detected) with EGF, TGF-hi, or EPR derived from mammals other than humans such as mice.
  • an “antibody” is a polyclonal antibody (PoAb) or monoclonal antibody (MoAb) that specifically binds to hEPR and hEPR fragment consisting of a full-length molecule, or a partial fragment of these antibodies (for example, degraded by papain or pepsin). Fragments obtained
  • the hybridoma and monoclonal antibody according to the present invention can be produced as follows.
  • those skilled in the art can use a method appropriately modified based on the following description and a technique known in the art.
  • the amino acid sequence of hEPR serving as an antigen and the nucleotide sequence encoding the same are described in W094 / 29340.
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • EPR is described as a tumor cell growth inhibitory factor.
  • an expression vector containing a fragment of DNA SEQ ID NO: 2
  • a host cell for example, but not limited to, preferably, Bacillus brevis and expressing it.
  • the culture was concentrated 20-fold using an ultrafiltration membrane (1000 kDa), and the pH was adjusted to 7.4 with 1 M Tris-HCl (pH 8.0) It can be purified using an anion exchange column such as a Q-sepharose column.
  • the pH of the flow-through fraction is adjusted to 5.0 and purified with a cation exchange column, for example, Sepharose.
  • purification to a single band by electrophoresis can be performed by performing purification by reversed-phase column chromatography (C4 column).
  • hEPR can be chemically synthesized based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, for example, by a solid phase method (Merrifield, J. Am. Chem. So, Vol. 85, p. 2185 (1963)). . Chemical synthesis by the solid phase method can be usually performed by a standard method using an automatic peptide synthesizer.
  • the antigen peptide solution is immunized to a warm-blooded animal by itself or a carrier and a diluent by administering about 4 to 6 times in total.
  • Warm-blooded animals used include, for example, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats and the like. It is preferable that a sample blood be collected at the time when the subcutaneous immunization is performed three times to measure the antibody titer.
  • the measurement of the antibody titer in the serum can be performed by immobilizing the peptide used as the antigen on a 96-titer / microtiter plate and performing ELISA.
  • Purification methods include, for example, ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography using an anion exchanger such as DEAE cellulose, gel filtration, affinity chromatography using an active adsorbent such as protein A / G, etc. Purification methods can be mentioned, and specificity for hEPR can be improved by purifying using a column on which hEPR is immobilized.
  • Monoclonal antibody-producing cells are prepared by selecting individuals with antibody titers from warm-blooded animals immunized with the antigen, collecting spleen or lymph nodes 2 to 5 days after final immunization, and producing the antibody contained in them. By fusing the cells to myeloma cells, MoAb antibody-producing hybridoma cells can be prepared. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler et al. (Nature, 256, 495 (1975)). Examples of bone marrow heavy cells include, but are not limited to, PAI, P3U1 (Human Science Research Resources Punk (Health Science Research Resources Bank; HSRRB), Japan, Catalog No. JCRB0113 and JCRB0708).
  • fusion promoter examples include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus (HVJ), and preferably PEG having a molecular weight of 1,000 to 6,000. Efficient cell fusion can be achieved by adding at a concentration of about 10-80% and incubating at 20-40 ° C.
  • RPMI 1640 medium containing 10 to 20% fetal bovine serum can be used.
  • the cultivation is usually performed under 5% CO 2 at a culture temperature of 20 to 40 ° C for 5 days to 3 weeks.
  • the culture supernatant is recovered from the wells in which the hybridoma cells have been cultured, and antibodies that react with the antigen peptide can be selected by ELISA.
  • Color is developed using (TMB; Funakoshi) as a substrate. After stopping the reaction with an acid, measure the absorbance at 450/540 nm, select an antibody with a value of about 3 and perform cloning by limiting dilution.
  • the desired hybridoma cells thus obtained can be cultured to obtain MoAb from the culture supernatant.
  • the hybridoma cells can be administered intraperitoneally to, for example, a mouse (Balb / c), and MoAb can be obtained from the ascites fluid.
  • the monoclonal antibody of the present invention the above-mentioned hybridoma, in particular, the epitope recognized by the monoclonal antibody produced by the hybridoma having the accession numbers FERMBP-086647 and FERMBP-084648 is recognized. And a monoclonal antibody that specifically recognizes hEPR.
  • the epitope recognized by this monoclonal antibody contains amino acid residues contained in the above-described sequence unique to hEPR.
  • the present invention also provides a method for specifically detecting hEPR in a sample in vitro, which comprises using the monoclonal antibody of the present invention and a polyclonal antibody (hEPR-PoAb) recognizing hEPR.
  • the sample include blood fluids, body fluids, extracts from tissues, etc. collected from a subject.
  • the method is preferably, but not limited to, an S-ELISA method, which comprises contacting a sample which may contain hEPR as an antigen with the monoclonal antibody of the present invention; And a step of bringing the antigen-antibody complex into contact with a polyclonal antibody.
  • the above steps may be performed sequentially (stepwise method) or simultaneously (simultaneous addition method).
  • the S-ELISA method is described, for example, in “Monoclonal Antibodies, Hybridomas and ELISAJ (Tatsuo Iwasaki et al., Kodansha Scientific)”.
  • the detection method of the present invention has extremely high detection sensitivity and can specifically detect hEPR of 10 pg / ml or more. (About 20-30 pg / ml), sufficient detection is possible.
  • the present invention also provides an in vitro method for detecting hEPR-expressing cells, particularly human tumors, using the monoclonal antibody of the present invention. Since hEPR is secreted from the cell membrane after being expressed in cells, it can be detected in extracellular fluid, and the sample does not necessarily need to contain the cells themselves.
  • the above method includes a step of bringing a human-derived sample into contact with the monoclonal antibody of the present invention, and a step of detecting the presence of hEPR in the sample using the presence or absence of binding to the monoclonal antibody as an index.
  • the target human tumor include, but are not limited to, lung cancer, colorectal cancer, bladder cancer, uterine cancer, colon cancer and the like. Since the detection method of the present invention is characterized by high sensitivity, detection can be performed simply and quickly without the need for an operation such as concentration of a sample. This method can be detected by S-ELISA etc.
  • the hEPR concentration in the sample is lOpg / ml or more.However, for sufficient detection, the hEPR concentration in the sample must be 25 pg / ml or more. preferable.
  • the detection method of the present invention the presence or absence and expression level of hEPR in a specific tumor cell or the like is determined, and further, the relationship between the expression of hEPR and the mechanism of tumor development is clarified. Can contribute. Furthermore, the presence or absence of the tumor in a specific subject can be easily detected based on data on the expression levels in tumor cells and normal cells that highly express hEPR.
  • the present invention also provides a kit for detecting a human tumor, comprising the above-described monoclonal antibody of the present invention.
  • the kit of the present invention may appropriately contain a polyclonal antibody, a buffer, a coloring reagent, a labeling reagent, a diluent, and the like, in addition to the monoclonal antibody of the present invention.
  • the kit of the present invention is a kit for performing S-ELISA.
  • hEPR Recombinant hEPR (lmg / ml) (prepared according to the method described in W094 / 29340) Emulsion was performed by adding the same amount of Freund's complete adjuvant to 100 ⁇ l of a physiological saline solution, and emulsified to obtain a mouse (Balb / c 6 weeks old). Immunized on the back. Two weeks later, 50 ⁇ l of lmg / ml antigen peptide (hEPR) physiological saline solution and Freund's incomplete adjuvant were emulsified by sonication, and booster immunization was performed. Thereafter, booster immunization was performed every week.
  • hEPR lmg / ml antigen peptide
  • lymphocytes were removed in RPMI1640 medium (containing penicillin and streptomycin), and subjected to erythrocyte treatment with 0.17 M ammonium chloride.
  • the removed lymphocytes were fused with the myeloma P3U1 strain derived from mouse myeloma by the polyethylene glycol method (PEG shelf 0) to produce hybridoma cells.
  • the obtained hybridoma cells were suspended in HAT medium containing one feeder cell, dispensed into a 96-well plate (Nunc), and cultured for 15 days.
  • Example 2 Screening of monoclonal antibody Culture supernatants were collected from the wells in which the hybridoma cells obtained in Example 1 were cultured, and MoAbs reacting with the antigen peptide were selected by ELISA.
  • HRP horseradish peroxidase
  • TMB Tetra Methyl Bendidine Microwell Peroxidase Substrate
  • mice (Balb / c) to which 0.5 ml of pristane was intraperitoneally administered 7 days and 3 days before, respectively, were intraperitoneally injected with the selected hybridoma cells of MoAb, 1C3, and 3E8, and about 10 days later, ascites was collected.
  • the collected ascites was left at room temperature for 30 minutes, allowed to stand at 4 ° C, centrifuged at 15000 X rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the titers of the two selected MoAbs by ELISA.
  • Recombinant hEPR in the amount indicated on the horizontal axis was immobilized on a microwell plate, and 1C3 or 3 ⁇ 8 (1 ⁇ g / ml) was added.
  • 1C3 or 3 ⁇ 8 (1 ⁇ g / ml) was added.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the obtained hybridoma producing MoAblC3 and 3E8 was transferred to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary on September 25, 2004 (Tsukuba, Ibaraki Prefecture 1-1-1-1 Central 6) and deposited under accession numbers FERM P-19033 and FERMP-19034, respectively.
  • hEPR (1 mg / ml) physiological saline solution 1 nil and 1 nil Freund's complete adjuvant (Difco) were emulsified by sonication to give a white heron (Japanese white, weight 2.7 kg, female; Nippon Claire). Immunization was divided into more than 10 places on the back.
  • the antiserum was salted out with ammonium sulfate at 40 ° C., dialyzed against 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), and purified with Protein-G column (Amersham-Pharmacia) to obtain an IgG fraction.
  • NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow (Amersham-Pharmacia) 1 mg of recombinant hEPR was combined with 1 mg of sperm in a conventional manner according to the instruction manual to prepare a column. .
  • the IgG fraction obtained above was adjusted to ⁇ 80, circulated through this column for at least 10 hours, and the antibody adsorbed on the column was eluted with 50 mM Glysine-HCl (pH.2.5) /0.15 MnaCl. The pH was returned to neutral with M Tris, and dialyzed against 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) /0.15 M to obtain an hEPR-specific antibody.
  • the specific antibody was biotinylated by a conventional method using a biotinylation reagent (Amersham-Pharmacia).
  • the titer of biotinylated anti-hEPR-PoAb was measured by the following method. hEPR was immobilized on 5-fold diluted 9 6 Ueru microphone port plate 200 ng / m l of (100 ⁇ 1 / well) in the highest concentration.
  • biotinylated anti-hEPR-PoAb (0.125 g / m 1-1 ⁇ g / ml (50% PROC ACE (Dainippon Pharmaceutical)) : 100 ⁇ l / well): Add 2 ⁇ l of Avidin-HRP (Amersham-Pharmacia) 1000-fold diluted solution and react at room temperature for 30 min. . After the addition of TMB, the reaction was allowed to proceed at room temperature for 30 minutes, the reaction was stopped with 4N-sulfuric acid, and the absorbance at 450-540 nm was measured to detect the titer against the immobilized antigen in the same manner as in Example 2. As a result, all showed a reaction depending on the antigen concentration, and it was confirmed that the titers were usable (Fig. 2).
  • Monoclonal antibody, 1C3 at 1 g / ml concentration in 100 ⁇ l / well microplate The mixture was added, incubated at 4 ° C for 24 hours, and immobilized. 0. l% 50 containing Tween20 mM Tris-HCl, and washed 3 times with pH7.5 (TBST) 200 1 / W ell. Next, 25% block ace 200 1 / well was added and incubated at 4 ° C for 24 hours to perform blocking.
  • hEPR of an antigen and a biotinylated anti-hEPR-PoAb were added simultaneously, and reacted at room temperature for 2 hours.
  • EGF-like growth factor heparin-binding growth factor; HB-EGF
  • betacellenoline betacellulin; BTC
  • amphiregulin amphiregulin; AR
  • -a (heregulin- ⁇ ; HRG-a): All are purchased from R & D or Sigma), mouse-type EPR (manufactured similarly to human-type EPR), or human-type EPR are displayed on the horizontal axis. The added amount was added together with a biotinylated anti-hEPR-PoAb (2 ⁇ g / ml, 50 ⁇ l / well; finall ⁇ g / ml) as an antigen. Six types of EGF family members and mouse EPR are the highest concentration
  • Human serum (Rockland INC.) was diluted 10-fold using 50 mM Tris-HC1 buffer pH 7.4 (Gibco BRL). Recombinant hEPR was added to this diluted serum, and the final concentration was lane l: Opg / ral, lane2: 8 pg / ml, lane3: 40 pg / ml, lane4: 200 pg / ml, and lane5: 1000 pg / ml. To prepare a sample.
  • the sample thus obtained was electrophoresed using SDS-PAGE (SDS polyacrylaraide gel electrophoresis), transferred to a PVDF membrane (Daiichi Kagaku), and then each antibody recognizing hEPR, anti-hEPR-PoAb,
  • HEPR was detected at ⁇ 8.2 kilodaltons (kDa) (Fig. 5).
  • kDa kilodaltons
  • a band was observed at about 28 kDa in PoAb and 1C3 MoAb, it was considered to be a nonspecific detection band because it was also detected in the antigen (1) lane.
  • the monoclonal antibody, 1C3 or 3E8, was applied to a 100 ⁇ l / well microphone plate at a concentration of l / ig / ml and incubated at 4 ° C for 24 hours to fix. 0.1% plate
  • Block Ace was added at 200 1 / well, and incubated at 4 ° C. for 24 hours to perform blocking. After washing 3 times with TBST 200 ⁇ 1 / well, hEPR was diluted with 2-fold serial than the highest concentration 400p g / ml of using two-fold dilutions human sera were added at 50 ⁇ 1 / well. At the same time, biotinylated anti-hEPR-PoAb (2 ⁇ g / ml) was added at 50 ⁇ l / well, and the mixture was incubated at room temperature for 2 hours.
  • FIG. As shown, it has been made sufficiently detectable to hEPR of both 25 P g / ml concentration of 1C3 ⁇ Pi 3E8.
  • Mouse iC38, RAW 264.7, NIH3T3 clone T7, MoAb-3 and human (T-24, A-549, HCT116, colo205, colo201, HeLa, Drawing 9, A431, SK-BR-3, MDA -HEPR by S-ELISA using a culture solution of various cultured cells derived from MB-468, KB, TR-13) at 10 6 cells / 10 ml / dish for 3 days in the presence of 10% fetal bovine serum was detected.
  • 1C3 MoAb (l / zg / ml) was immobilized at 100 ⁇ l / well, and after blocking, 50 ⁇ l of various cell culture medium ⁇ ⁇ 1 / well and biotinylated anti-hEPR-PoAb (2 ⁇ g / ml) Co-added at 1 / well and incubated for 2 hours at room temperature. Subsequent operations were performed in the same manner as in Example 4. For control, serum with or without hEPR (10% FBS, human serum, 0.1% BSA (hEPR lng / ral), human serum (EPR lng / ral)) The operation was performed.
  • mouse EPR-producing cell NIH3T3 clone T7 did not show absorption of A450 nm, whereas human cancer cells A-549 (human lung cancer cells) and HCT116 ( High hEPR production was confirmed in human colon cancer), colo201 (human colon cancer), colo205 (human colon cancer) and T-24 (human bladder cancer) (Fig. 7). It was confirmed that hEPR can be specifically detected.
  • HeLa human cervical cancer
  • NB69 human neuroblastoma
  • KB human epidermal cancer (oral)
  • A431 human epidermal cancer (epidermal)
  • SK-BR-3 human In breast cancer
  • MDA-MB-468 human breast cancer
  • TR-13 human kidney cancer
  • the present invention makes it possible to provide a system for specifically and highly sensitively detecting hEPR present in a living body such as human blood or tissue, and is useful for cancer diagnosis or the like which detects the presence of hEPR-expressing tumor cells. It is. Furthermore, it is expected that the method of the present invention will contribute to elucidation of the presence or absence of hEPR expression, and furthermore, the relationship between the expression of hEPR and the mechanism of tumor development.

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Abstract

本発明は、hEPRの簡便な高感度検出法を確立し、hEPRを発現するヒト腫瘍の新規検出法を提供する。具体的には、本発明は、ヒト型エピレグリン（human epiregulin；hEPR）を特異的に認識するモノクローナル抗体、及びこれを産生するハイブリドーマ、該抗体を用いたhEPRの高感度検出法を提供する。

Description

明 細 書 モノク口ーナル抗体及びこれを産生するハイブリ ドーマ 技術分野
本発明は、 ヒト型ェピレグリン （human epiregul in； hEPR) を特異的に認識す るモノクローナル抗体（monoclonal antibody； MoAb)、 該 MoAbを産生するハイプ' リ ドーマ、 該 MoAb と hEPR を認識するポリクローナル抗体 (hEPR - polyclonal ant ibody； hEPR- PoAb) を用いたサンプル中の hEPRを特異的に検出する免疫学的 測定方法に関する。 背景技術
従来、 癌細胞において特異的かつ高頻度に出現する遺伝子異常があることが知 られており、 これに起因して発現する蛋白質がみっかれば、 それは癌診断、 治療 の標的分子となり得ると考えられている。その中で、上皮成長因子 EGF (epi dermal growth factor) ファミリーに属する分子群とその受容体 ErbBファミリー分子群 は、 癌の増殖、 悪性化に関与する分子として癌診断や治療の標的とされてきた ( J. Cl in. Oncol. , 17， 2639-2648 (1999)； Biochem. Biophys. Acta.， 1198, 165 - 184 (1994) Science, 244, 707-712 (1989)； Anti cancer Res. , 20： 91-95 (2000) ; Front Biosc i. , 1；6：0685-707 (2001) )。
EGFファミ リーメンバーであるェピレグリン （epiregul in； EPR) は、 in vitro 試験において、 正常細胞の増殖を促進し、 ある種の癌細胞に対し増殖を抑制する という b unctionalな性質を持ち、 その発現 （mRNA) は、 胎盤、 単球を除き正 常組織において極めて低く、 ある種の癌細胞では亢進していることが報告されて レ、る（例えば The Journal of Biologi cal Chemi stry, 1995, Vol . 270, p. 7495-7500； The Biochemi cal Journal, 1997， Vol . 326, p. 69-75を参照のこと）。
また、 臨床においても、 膀胱癌、 膝臓癌において発現が亢進しており、 有用な 癌診断マーカーになることが指摘されている （例えば Biochemi cal and biophysical research communi cations, 2000, Vol. 14, 273 (3) , p. 1019-1024； Anticancer research, 2000, Jan - Feb, 20 1A9 : p. 91- 95 ; Cancer research, 2001, Vol. 61, p. 6227 - 6233を参照のこと）。
これまで、 ヒ ト型ェピレグリ ン ( hEPR ) を認識するポリ ク ローナル抗体 (hEPR-PoAb) を用いて、 EPR ポリペプチドを検出した報告はある (例えば The Journal of Biologi cal Chemi stry, 1995, Vol. 270, p. 7495-7500； The Biochemi cal Journal, 1997, Vol. 326, p. 69- 75 を参照のこと） 、 濃縮操作を必要とする、 ラジオアイソトープラベルが必要など、 スループッ トのよい、 高感度検出方法は なく、 また、 生体中の EPRポリペプチドを検出したという報告もない。 従って、 hEPRの簡便な高感度検出法が確立できれば、 癌診断法として、 癌の早期発見に有 用な手段となり得る。 発明の開示
EPR と他の EGFファミリーメンバーのタンパク質とは、 ァミノ酸配列の同一性 24—500/0でぁることカ失卩られてレヽる (The Journal of Biological Chemistry, 1995, Vol. 270, p. 7495- 7500参照）。また、 EPRは種間の配列相同性が非常に高く、 例えばヒ トとマウスの EPRでは 46個のァミノ酸残基中 6個のァミノ酸が異なるだ けであり、 上記のポリク口ーナル抗体では、 上記のように操作が煩雑なだけでな く、 これらを識別して検出することができなかった。 更に、 従来の検出では感度 が高々 lng/ml程度であり、 生体内における EPRの検出は不可能であった。
本発明は、 hEPRの簡便な高感度検出法を確立し、 ヒ ト腫瘍の検出に役立てるこ とを課題とする。 特に、 腫瘍の検出等のために有用な、 ピコグラムレベルの hEPR の存在を簡便に検出できる方法を提供する。
本発明者らは、 上記課題を解決するべく鋭意研究した結果、 hEPRを特異的に認 識するモノクローナル抗体 （MoAb) を産生するハイプリ ドーマ 2種類 （1C3、 3E8) を取得するに至った。 更に、 この MoAb と hEPR-PolyAbを組み合わせた Sandwich Enzyme-l inked immunosorbent assay 法 (S- Eし ISA) を確立し、 咼感度で且つノヽィ スループッ トな検出システムを完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 以下の （1 ) 〜 （9 ) を提供する。
( 1 ) ヒ ト型ェピレダリン （human epiregul in； hEPR) を特異的に認識するモ ノクローナル抗体を産生するハイブリ ドーマ。
(2) 受託番号 FERM B P— 0 8 64 7である、 上記 （ 1 ) に記載のハイ ブリ ドーマ。
(3) 受託番号 FERM B P— 08 64 8である、 上記 （1) に記載のハイ ブリ ドーマ。
(4) 上記 （1) 〜 （3) のいずれかに記載のハイプリ ドーマにより産生され るモノクローナノレ抗体。
(5) 上記 （2) または （3) に記載のハイプリ ドーマにより産生されるモノ クローナル抗体によって認識されるェピトープを認識し、かつ hEPRを特異的に認 識するモノクローナル抗体。
(6) 上記 （4) に記載のモノクローナル抗体と hEPRを認識するポリクローナ ル抗体 （hEPR-PoAb) を用いることを特徴とする、 サンプル中の hEPRを in vitro で特異的に検出する方法。
(7) 上記（4) に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、 hEPR を発現する細胞の in vitro検出方法。
(8) hEPRを発現する細胞がヒ ト腫瘍である、 上記 （7) に記載の方法。
(9) 上記 （4) に記載のモノクローナル抗体を含む、 ヒ ト腫瘍の検出のため のキット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2003-070864号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、本発明のハイプリ ドーマの産生する抗 hEPRモノクローナル抗体の力価 を ELISA法により測定した結果を示す。
図 2は、 ピオチン化抗 hEPRポリクローナル抗体の力価測定の結果を示す。 図 3は、 ステップワイズ法及ぴ同時添加法を用いたサンドイ ッチ ELISA (S-ELISA) 系の検出感度を示す。
図 4は、一次抗体として 1C3 モノクローナル抗体を用いた S- ELISA法による本 方法の特異性の検討結果を示す。 本システムでは、 EGF ファミリー分子、 マウス 型 EPRとは反応せず、 hEPRとのみ反応した。
図 5は、 ヒ ト血清中 hEPRのウェスタンプロッ ト解析結果を示す。分子量マーカ 一位置 （キロダルトン； k Da) を左側に示した。
図 6は、 ヒ ト血清中の h EPRを S-ELISA法により検出した結果を示す。
図 7は、 各種細胞培養液中の hEPRを検出した結果を示す。 発明を実施するための形態
以下に本発明をより詳細に説明するが、 当業者であれば本明細書の記載に基づ き、 当分野において公知の技術を用いて本発明を種々の態様で実施することが可 能であり、 本発明は下記の形態に特に限定されるものではない。
本明細書において、 「hEPR」 とは、 特に断らない限りにおいてヒ ト型ェピレグリ ンの前駆体、 成熟体又はその断片をさす。 また、 「前駆体」 とは、 酵素切断前の膜 結合型の形態をいい、 「成熟体」 とは、 細胞膜から分離したアミノ酸 4 6残基から なるポリペプチド （配列番号 1 ) を意味する。 断片としては該ポリペプチドのァ ミノ酸残基 2 0個以上、 より好ましくは 3 0個以上の断片であり、 ヒ ト型ェピレ ダリンに特有の配列を必須に有する。 ヒ ト型ェピレダリンに特有の配列とは、 特 に限定することを意味するものではないが、 例えば、 ヒ ト型ェピレダリンとマウ ス型ェピレダリンとの比較において異なっていることが知られている、 配列番号
1のアミノ酸配列における 2番目、 11番目、 26〜29番目、 及び 39番目のァミノ 酸を含む配列である。 ヒ トとマウスでこれらの部位のアミノ酸残基が異なること は、同じ出願人の特許出願である W094/29340に記載されている。 これらの部位を 含むアミノ酸配列を有する断片は、 ヒ トとマウス由来の EPR断片で高次構造が異 なる。 尚、 「ヒ ト型ェピレグリン」 及ぴ 「マウス型ェピレグリン j とは、 ヒ ト及び マウスで天然に存在する EPRと同じアミノ酸配列を有するものであるが、 必ずし も天然から抽出したタンパク質に限定するものではなく、 例えば組み換え体、 合 成したポリぺプチドをも包含することを意図するものである。
「特異的に認識する」 とは、 hEPRには認識する （または、 結合する） が他の EGF ファミリーのタンパク質やマウス型 EPR等の非ヒ ト型 EPRには実質的に認識しな い （結合しない） ことを意味する。 例えば、 hEPRの前駆体、 成熟体そして断片化 されたポリペプチドとは認識する （結合する） 、 EGFや TGF- α、 マウス型 EPR 等とは実質的に認識しない （結合しない） ことを意味する。 具体的には、他の EGF フアミ リーのタンパク質やマウス型 EPR等の非ヒ ト型 EPRに対する結合親和性と 比較して 100倍以上、好ましくは 1, 000倍以上、更に好ましくは 10， 000倍以上の 結合親和性を有することをいう。
ここで、 「実質的に認識 （結合） しない」 とは、 当分野において通常用いられる 検出手段及び本発明の検出方法によって結合が確認されないことをいう。 具体的 には、 hEPR の前駆体、 成熟体ぞして断片化されたポリペプチドとサンドイッチ ELISA (S-ELISA) 法あるレ、はゥエスタンブロット法等で陽性反応を呈するが、 EGF フアミリーの EGFや TGF-ひ、またマウス等のヒ ト以外の哺乳動物由来の EPRとは 反応を示さない （検出されない） ことを意味する。
「抗体」 とは、 完全な全長分子からなる hEPR及び hEPR断片と特異的に結合す るポリクローナル抗体 （PoAb) 又はモノクローナル抗体 （MoAb)、 又はこれらの抗 体の部分フラグメント （例えばパパインまたはペプシンで分解して得られる断片
(Fabまたは F (ab' ) 2または Fab' ) 等を意味し、 後述するような製造方法に従つ て製造することができる。
本発明に係るハイプリ ドーマ及びモノクローナル抗体は、 以下のようにして作 製することができる。 尚、 当業者であれば、 以下の記載及び当分野において公知 の技術に基づき、 適宜改変した方法を用い得る。
( 1 ) 抗原の調製
抗原となる hEPR のアミノ酸配列及びこれをコードするヌクレオチド配列につ いては、 W094/29340に記載されている。 アミノ酸配列を配列番号 1に、 ヌクレオ チド配列を配列番号 2に示す。 尚、 W094/29340においては、 EPRを腫瘍細胞増殖 阻害因子と記載している。
ヒ ト型リコンビナント EPRは、 W094/29340に記載のように、 hEPRをコードする
DNA (配列番号 2 ) の断片を含む発現ベクターを構築し、 宿主細胞、 例えば、 限定 するものではないが好ましくは Baci llus brevi s菌に導入して発現させることに よって得ることができる。 Bacillus brevis 菌を用いて発現させた後、 培養液を 限外濾過膜（1000 kDa)を用いて 20倍に濃縮後、 p Hを 7. 4に 1 M Tris-HCl (pH 8. 0) を用いて調製し、 陰イオン交換カラム、 例えば、 Q - sepharoseカラムにより精製 を行うことができる。 この場合、 素通り画分の p Hを 5. 0に調整し、 陽イオン交 換カラム、 例えば S- sepharoseにより精製する。 次に逆相カラムクロマトグラフ ィー（C4 カラム）による精製を行うことで電気泳動法による単一バンドまで精製 することができる。
あるいはまた、 hEPRは、 配列番号 1に示すアミノ酸配列に基づき、 例えば固相 法 (Merrifield, J. Am. Chem. So ， Vol. 85， p. 2185 (1963) ) によって化学合 成することができる。 固相法による化学合成は、 通常ペプチド自動合成器を用い て標準的な方法で行うことができる。
( 2 ) ポリクローナル抗体の調製
抗原ペプチド溶液を、 温血動物に対してそれ自体あるいは担体、 希釈剤ととも に計 4〜 6回程度投与することにより免疫する。用いられる温血動物は、例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモッ ト、 マウス、 ラッ ト等が挙げられる。 3回皮下免疫を行 つた時点で試採血を行い、 抗体価を測定することが好ましい。 血清中の抗体価の 測定は、 抗原として用いたペプチドを 96 ゥェ/レのマイクロタイタープレートに 固定し、 ELISA 法によって行うことができる。 抗体価が十分上昇したことを確認 した後、 全採血し、 通常行われる方法により抗体を分離精製することができる。 精製方法は、 例えば硫安塩析法、 DEAEセルロース等の陰イオン交換体を利用する ィオン交換ク口マトグラフィー、 ゲル濾過法、 プロテイン A/Gなどの活性吸着剤 によるァフィ二ティーク口マトグラフィ一等の精製法を挙げることができ、 さら に hEPRを固相化したカラムを用いて精製することにより hEPRに対する特異性を 向上させることができる。
( 3 ) モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体産生細胞の作製は、 抗原を免疫された温血動物から抗体価 の認められた個体を選択し、 最終免疫の 2〜5 日後に脾臓又はリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、 MoAb抗体 産生ハイプリ ドーマ細胞を調製することができる。 融合操作は既知の方法、 例え ば Kohler等の方法 （Nature, 256、 495 (1975) ) に従い実施できる。 骨髄重細胞 としては、 限定するものではないが、 例えば PAI、 P3U1 (ヒューマンサイエンス 研究資源パンク（Health Sci ence Research Resources Bank ; HSRRB)、日本、 カタ ログ No. JCRB0113及ぴ JCRB0708) などが挙げられる。 融合促進剤としては、 ポリ エチレングリコール (PEG)やセンダイウィルス (HVJ) をあげることができるが、 好ましくは分子量 1000〜6000 の PEGである。 10〜80%程度の濃度で添加し、 20 〜40°Cでィンキュベー卜することにより、 効率よく細胞融合を実施できる。
モノクロ一ナル抗体の選別は、公知の方法に準じて行うことができる。通常 HAT
(ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行 なわれる。 選別及ぴ育種用培地としては、 例えば、 10〜20%の牛胎児血清を含む RPMI 1640培地などを用いることができる。 培養は、 通常 5%炭酸ガス下、 培養温 度 20〜40°Cにて 5 日〜 3週間行なわれる。
ハイプリ ドーマ細胞を培養したゥエルから培養上清を回収し、 ELISA 法によつ て抗原ぺプチドと反応がある抗体を選択することができる。まず 96ゥヱルプレー トに抗原ペプチドを固相化した後、 仔牛血清でブロッキングする。 ハイブリ ドー マ糸田月包の上?胄を、 Mouse Immunoglobul ins/HRP (Amersham-Pharmacia)と 37°C、 1 時間反応させた後、 Tetra Methyl Bendidine Microwel l Peroxidase Substrate
(TMB ;フナコシ）を基質に用いて発色させる。酸で反応を停止させた後、 450/540nm の吸光度を測定して 3程度の値がでた抗体を選択し， 限界希釈法によるクロー二 ングを行う。
かく して得られる目的とするハイプリ ドーマ細胞を培養してその培養上清より MoAbを得ることができる。あるいはハイブリ ドーマ細胞を例えばマウス（Balb/c) に腹腔内投与し、 その腹水中から MoAbを得ることもできる。
モノクローナル抗体の精製は上記の通常の p0Ab の分離精製と同様に行うこと ができる。
尚、本発明の hEPRを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する好適なハ イブリ ドーマとして、 本発明者等は 2種のハイブリ ドーマを平成 1 4年 9月 2 5 日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （茨城県つく ば巿東 1一 1— 1 中央第 6 ) にそれぞれ受託番号 F E R M P— 1 9 0 3 3及 ぴ F E R M P— 1 9 0 3 4として寄託し、 更に平成 1 6年 2月 2 7日にそれぞ れ受託番号 F E RM 8 ?— 0 8 6 4 7及び £ 1 1^ B P— 0 8 6 4 8として ブタぺスト条約に基づく国際寄託に移管している。
更に、 本発明のモノクローナル抗体として、 上記のハイブリ ドーマ、 特に受託 番号 F E R M B P— 0 8 6 4 7及び F E R M B P— 0 8 6 4 8のハイブリ ド 一マにより産生されるモノクローナル抗体によって認識されるェピトープを認識 し、 かつ hEPRを特異的に認識するモノクローナル抗体が包含される。 このモノク ローナル抗体によって認識されるェピトープは、上記 hEPRに特有の配列に含まれ るアミノ酸残基を含む。
本発明はまた、上記本発明のモノクローナル抗体と hEPRを認識するポリクロー ナル抗体（hEPR - PoAb)を用いることを特徴とする、サンプル中の hEPRを in vitro で特異的に検出する方法を提供する。 サンプルとしては、 被験者から採取した血 液、 体液、 組織等からの抽出液等が挙げられる。 該方法は、 限定するものではな いが、好ましくは S - ELISA法であり、抗原となる hEPRを含む可能性のあるサンプ ルと本発明のモノクローナル抗体とを接触させる工程と、 該工程で生成する抗原 一抗体複合体とポリクローナル抗体とを接触させる工程を含むサンドィツチアツ セィである。 上記の工程を順次行っても （ステップワイズ法）、 また同時に行って も （同時添加法） 良い。 S- ELISA 法については、 例えば 「単クローン抗体、 ハイ プリ ドーマと ELISAJ (岩崎辰夫ら、 講談社サイエンティフィック） に記載されて おり、 当業者であれば本明細書の記載に基づいて本発明の方法を実施することが できる。 本発明の検出方法は非常に検出感度が高く、 10pg/ml以上の hEPRであれ ば特異的に検出することが可能であるので、生体内における hEPRの発現濃度（20 〜30pg/ml程度） であれば充分な検出が可能である。
本発明はまた、 上記本発明のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、 hEPRを発現する細胞、 特にヒ ト腫瘍の in vitroにおける検出方法を提供する。 hEPRは、 細胞において発現した後、 細胞膜から分泌されるため、 細胞外液におけ る検出が可能であり、 サンプルは必ずしも細胞自体を含有する必要はない。
上記方法は、 ヒ ト由来のサンプルと本発明のモノクローナル抗体を接触させる 工程と、サンプル中の hEPRの存在を該モノクローナル抗体との結合の有無を指標 として検出する工程とを含む。 対象となるヒ ト腫瘍としては、 例えば肺癌、 大腸 癌、 膀胱癌、 子宮癌、 結腸癌等が挙げられるが、 特に限定するものではない。 本発明の検出方法は感度が高いことを特徴とするため、 サンプルの濃縮等の操 作を必要とせず、 検出を簡便かつ迅速に行うことができる。 本方法は、 サンプル 中の hEPR濃度が lOpg/ml以上の場合に、 S - ELISA法等で検出することができるが、 充分な検出にはサンプル中の hEPR濃度が 25pg/ml以上であることが好ましい。 本発明の検出方法を使用して、特定の腫瘍細胞等における hEPRの発現の有無及 ぴ発現レベルを決定し、更には hEPRの発現と腫瘍発生とのメカニズムとの関連性 等についての解明にも寄与することができる。 更に、 hEPRを高発現する腫瘍細胞 と正常細胞における発現量に関するデータに基づいて、 特定の被験者におけるそ の腫瘍の有無を容易に検出することができる。
本発明はまた、 上記本発明のモノクローナル抗体を含む、 ヒ ト腫瘍の検出のた めのキットを提供する。
本発明のキットには、 上記本発明のモノクローナル抗体の他、 ポリクローナル 抗体、 緩衝剤、 発色試薬、 標識試薬、 希釈液等を適宜含めることができる。 好ま しくは、 本発明のキットは、 S- ELISAを行うためのキットである。
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、 上記したように、 本 発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例 1 ハイプリ ドーマの作製
リコンビナント hEPR (lmg/ml) (W094/29340号に記載の方法に従って作製） 100 μ 1 の生理食塩水溶液にフロイント完全アジュバントを同量添加してェマルジョ ン化し、マウス（Balb/c 6週齢）の背中に免疫した。 2週間後に、 50 μ 1の l mg/ml 抗原ペプチド （hEPR) 生理食塩水溶液とフロイント不完全アジュパントを超音波 処理によってェマルジヨン化したものを追加免疫し、 以降 1週間毎に追加免疫を 行った。 免疫後 40日目に脾臓を摘出し、 RPMI1640培地（ぺニシリン， ストレプト マイシン入り）中でリンパ球を取り出し、 0. 17Mの塩化アンモニゥムで赤血球処理 を行った。 取り出したリンパ球をポリエチレングリコール法 (PEG棚 0) によりマ ゥス骨髄腫由来のミエローマ細胞 P3U1株と融合させ、ハイプリ ドーマ細胞を作製 した。 得られたハイブリ ドーマ細胞をフィーダ一細胞入りの H A T培地に懸濁し て 96穴プレート （Nunc) に分注し、 15 日間培養した。
実施例 2 モノクローナル抗体のスクリーニング 実施例 1で得られたハイブリ ドーマ細胞を培養したゥエルから培養上清を回収 し， ELISA法によって抗原ぺプチドと反応がある MoAbを選択した。
まず 96ゥヱルプレートに 100 ," 1の ΙΟ μ g/ml抗原べプチドを添加し、 4 °C、一 晚固相化後、 200 1 の 10%仔牛血清で 37°C、 一晚ブロッキングを行った。 ハイ ブリ ドーマ細胞の上清 100 μ 1 を添加して 37°C、 2時間反応させた後、 西洋ヮサ ビペルォキシダーゼ (HRP) 修飾抗マウス抗体 （Amersham- Pharmacia) を 1000倍 に希釈して 37°C、 1時間反応させ、 Tetra Methyl Bendidine Microwel l Peroxidase Substrate (TMB ;フナコシ） を基質に用いて発色させた。
ΙΟΟ μ Ιの 4 Ν硫酸を添加して反応を停止させた後、 450 - 540nmの吸光度を測定 して吸光度 3程度の値がでた MoAb、 1C3及び 3E8を選択し、 限界希釈法によるク 口一ユングを行った。
7 日前、 3 日前にそれぞれ 0. 5mlのプリスタンを腹腔内投与したマウス（Balb/c) に選択した MoAb、 1C3、 3E8のハイプリ ドーマ細胞を腹腔内注射し、 約 10 日後に 腹水を採取した。 採取した腹水は室温で 30分おいた後、 4°Cでー晚静置し、 15000 X rpm、 10分間遠心して上清を回収した。
選択した 2種の MoAbの力価を ELISA法により測定した結果を図 1に示す。横軸 に表示された量のリコンビナント hEPRをマイクロウェルプレートに固相化させ、 1C3または 3Ε8 ( 1 μ g/ml)を添加して反応後、西洋ヮサビペルォキシダーゼ（HRP) 修飾抗マウス抗体、 及び TMBを用いて発色させた。 その結果、 2種類の MoAb とも 濃度依存性の反応を示した。
尚、得られた MoAblC3、 3E8を産生するハイブリ ドーマを平成 1 4年 9月 2 5日 付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （茨城県つくば 巿東 1— 1— 1 中央第 6 ) にそれぞれ受託番号 F E RM P— 1 9 0 3 3及び F E R M P— 1 9 0 3 4として寄託した。
実施例 3 ポリクローナル抗体の調製
リ コンビナント hEPR ( 1 mg/ml) 生理食塩水溶液 1 nil と 1 nilのフロイント完全 アジュバント （Difco) を超音波処理によってェマルジヨン化し、 ゥサギ （日本白 色、 体重 2. 7kg、 雌； 日本クレア） の背中 10箇所以上に分けて免疫した。 1ヶ月 後に 0. 5 mlのリコンビナント hEPR ( 1 mg/ml) 生理食塩水溶液 1 ml と同量のフロ イント不完全アジュバント （Sigma) を超音波処理によってェマルジヨン化したも のを用いて同様に 2次免疫し、以降 1週間毎に lmlの l mg/mlリコンビナント hEPR 生理食塩水溶液と 1 ml のフロイント不完全アジュバントを超音波処理によって ェマルジヨン化したものを追加免疫した。 採血は免疫した 1週間後に行い、 採取 した血液はパスツールピぺッ トでよく撹拌し室温で 1時間おいた後、 4°Cでー晚静 置の後、 5, 000 X g 10分間遠心して抗血清を得た。
抗血清を 40¾硫安塩析し、 50mM Tris-HCl (pH8.0)でー晚透析後、 Protein - G力ラ ム （Amersham- Pharmacia) により精製し、 IgG 画分を得た。 さらに抗体を精製す るァこめに NHS - activated Sepharose 4 Fast Flow (Amersham - Pharmacia) 糸勺 1 ral に対し、 リコンビナント hEPR lmgを取扱説明書の記載に基づいて通常の方法で 結合させカラムを作製した。 上記で得た IgG画分を ρΗ8· 0に調製し、 このカラム に 10 時間以上循環し、 カラムに吸着した抗体を 50mM Glysine-HCl (pH. 2.5) /0. 15MnaCl で溶出し、 すぐに 1 M Tris で pHを中性にもどし、 50mM phosphate buffer (pH. 7.4) /0.15Mにて透析し、 hEPR特異抗体とした。
特異抗体をピオチン化試薬 (Amersham-Pharmacia) を用いて通常用レ、られてレヽ る方法によりピオチン化した。 ビォチン化抗 hEPR- PoAbの力価は、 以下の方法で 測定した。 hEPRを 200ng/ml (100 μ 1/well) を最高濃度に 5倍希釈し 9 6ゥエル マイク口プレートに固相化した。 25%プロックエース (大日本製薬； 200 μ 1/well) でプロッキング後、 ビォチン化抗 hEPR-PoAb (0. 125 g/m 1〜1 μ g/ml (50%プロ ックエース （大日本製薬） を用いて希釈） ： 100μ 1/well) を添加して室温で 2時 間反応後、 Avidin-HRP (Amersham-Pharmacia) 1000倍希釈液 100μ 1/wellを添加 し、 室温で 30分反応させた。 TMB添加後、 室温で 30分反応後、 4N -硫酸で反応を 止め、 450- 540nm の吸光度を測定して実施例 2と同様に固相化した抗原に対する 力価を検出した。 その結果、 いずれも抗原濃度依存性の反応を示し、 使用可能な 力価であることを確認した （図 2)。
実施例 4 サンドイッチ ELISA系の確立
実施例 2で得られたモノクローナル抗体、 及ぴ実施例 3で得られたポリクロー ナル抗体を用いた ELISA系を作製した。
モノクローナル抗体、 1C3を 1 g/ml濃度で 100 μ 1/wellマイクロプレートに 添加して 4°Cで 24時間インキュベートし、 固相化した。 0. l%Tween20 を含む 50 mM Tris-HCl, pH7.5 (TBST) 200 1/Well で 3回洗浄した。 次に、 25%ブロック エース 200 1/wellを添加し、 4°Cで 24時間ィンキュベートしてブロッキングを 行った。
ステップワイズ法 （Stepwise method) と して、 TBST 200 μ 1/wellでウエノレを 3 回洗浄後、 hEPRを 1 ng/mlより 2倍系列で希釈して添加後、 室温で 2時間反応さ せ、 次にビォチン化抗 hEPR- PoAb(l i g/ml ； 100 μ 1/well)を添加し、 室温で 2時 間反応させた。
また、 同時添加法 （Same time method) として、 抗原の hEPR とピオチン化抗 hEPR-PoAbを同時添加し、 室温で 2時間反応させた。
TBSTでゥヱルを 5回洗浄後、 ァビジン- HRP (Amer sham- Pharmacia) 1000倍希釈 液 ΙΟΟμΙ/well を添加し、 室温で 30 分反応させた後、 4N -硫酸で反応を止め、 450/540nm の吸光度を測定した。 その結果、 同時添加法とステップワイズ法で検 出感度に差がなく、 いずれも感度が生体内存在量を測定するのに十分な感度 (25pg/ml) であった （図 3)。 一次抗体として 3E8を用いて同様な試験を行った 場合も同様な結果を得た。
実施例 5 サンドイッチ ELISA系の特異性
実施例 4に示した方法 （同時添加法） で本システムの特異性を確認した。
一次抗体として 1C3 MoAb (Ιμ g/ml, 100 μ 1/well) を固相化させ、 25%ブロッ クエース（200 1/well)でプロッキング後、 EPRの属する EGFファミリーメンバー の分子群 （6 種類；表皮成長因子 （epidermal growth factor; EGF), トランスフ ォ1 ~ミング成長因子 (transforming growth factor - ct ;TGF- α )、 へノ リ ン結合
EGF 様成長因子 （heparin - binding EGF- like growth factor ;HB-EGF) , ベータセ ノレリン （betacellulin;BTC), アンフィ レグリ ン （amphiregulin;AR), ヘレダリン
- a (heregulin-α； HRG-a) ：いずれも R&D社、 または Sigma社より購入）、 マウ ス型 EPR (ヒ ト型 EPRと同様に製造）、 またはヒ ト型 EPRをそれぞれ横軸に表示さ れた量で抗原としてピオチン化抗 hEPR-PoAb (2μ g/ml、 50 μ 1/well ； finall μ g/ml) と共に添加した。 EGFファミ リーメンバー 6種類とマウス型 EPRは最高濃度
200ng/mlから 4段階の 5倍希釈系列で添加した （100μ l/well)。 ヒ ト型 EPRは最 高濃度 200pg/mlから同様に 4段階 5倍希釈系列で添加した。 次いで、 avi din- HRP と反応させた後、 TMBを用いて発色させた。
その結果、 図 4に示すように、 hEPRは高感度に検出したが、 他の分子、 すなわ ち EGFファミ リ一分子及びマウス型 EPRは 1000倍高い濃度でも全分子ともに検出 せず、 本サンドィツチ ELISA系の特異性が確認できた。 一次抗体として 3E8を用 いて同様な試験を行った場合も同様な結果を得た。
実施例 6 ヒ ト血清中のヒ ト型 EPRのウェスタンブロッ ト解析
ヒ ト血清 （Rockland INC. ) を 50mM Tri s - HC1 buffer pH7. 4 (Gibco BRL) を用 いて 10倍に希釈した。 この希釈血清にリコンビナント hEPRを添加し、 最終濃度 力 lane l： Opg/ral, lane2 : 8pg/ml 、 lane3： 40pg/ ml 、 lane4： 200pg/ml 、 lane5 : 1000pg/ml になるように 5倍系列で希釈して試料を作製した。 こうして得 られた試料を SDS- PAGE (SDS polyacrylaraide gel electrophores i s) を用レヽて電 気泳動し、 PVDF膜（第一化学）に転写した後、 hEPRを認識する各抗体、抗 hEPR- PoAb、
MoAblC3、 及ぴ 3E8 ( 1 μ g/ml ) を用いてィ ム ノ ブ ロ ッ テ イ ン グ.法
(J. Biol . Chem. , 270, 7495-7500)により角军析した結果、各抗体ともに特異的に 3. 7
〜8· 2キロダルトン（kDa) の位置に hEPRを検出した（図 5 )。 尚、 PoAbと 1C3 MoAb において約 28 k Daにパンドが認められたが、 抗原 （一） のレーンでも検出されて いることから非特異的検出パンドと考えられた。
実施例 7 ヒ ト血清中ヒ ト型 EPRの ELISA法による検出
モノクローナル抗体、 1C3或いは 3E8を l /i g/ml濃度で 100 μ 1/wel lマイク口 プレートに添力 Bし、 4°Cで 24時間インキュベートして固着した。 プレートを 0. 1%
Tween 20 を含む 50mM Tris-HCl, pH7. 5 (TBST) 200 1/wel lで 3回洗浄した後、
25%プロックエースを 200 1/wellで添加し、 4°Cで 24時間ィンキュベードしブ口 ッキングを行った。 TBST 200 μ 1/wellで 3回洗浄後、 2倍希釈ヒ ト血清を用いて hEPRを最高濃度 400pg/mlより 2倍系列で希釈し、 50 μ 1/wellで添加した。 同時 にピオチン化抗 hEPR- PoAb ( 2 μ g/ml) を 50 μ 1/wel lで添加し、 室温で 2時間ィ ンキュベー卜した。 TBSTで 5回洗浄後、 Avidin-HRP (Araersham-Pharmac ia) 1000 倍希釈液 100 / l/wel lを添加し、 室温で 30分反応させた後、 4N -硫酸で反応を止 め、 TMB を用いて発色させて 450/540nmの吸光度を測定した。 その結果、 図 6に 示すように、 1C3及ぴ 3E8のいずれも 25Pg/ml濃度の hEPRを十分検出可能であつ た。
実施例 8 培養ヒ ト癌細胞の産生する EPRの検出
マウス (iC38、 RAW264. 7、 NIH3T3クローン T7、 MoAb-3)及ぴヒ ト （T— 24、 A— 549、 HCT116、 colo205、 colo201、 HeLa、画 9、 A431、 SK - BR - 3、 MD A - MB - 468、 KB、 TR- 13) 由来の各種培養細胞を、 106個/ 10 ml/dishで 3 日間、 10%牛胎児血清存在下培養 した培養液を用いて、 S-ELISAによる hEPRの検出を行った。
1C3 MoAb ( l /z g/ml)を 100 μ 1/wellで固相化させ、 ブロッキング後、 各種細胞 培養液 δθ μ 1/well とピオチン化抗 hEPR- PoAb ( 2 μ g/ml) を 50 μ 1/wel lで同時 添加し、 室温で 2時間インキュベートした。 以降の操作は実施例 4と同様に行つ た。 尚、 対照のために hEPRを添加した、 またはしていない血清 （10% FBS、 ヒ ト 血清、 0. 1%BSA (hEPR lng/ral) , ヒ ト血清（EPR lng/ral) ) で同様の操作を行った。 その結果、 マウス型 EPR産生細胞 NIH3T3クローン T7をはじめ、 マウス細胞の 培養液では A450nm の吸収は認められなかったのに対し、 ヒ ト型癌細胞では A - 549 (ヒ ト肺癌細胞）、 HCT116 (ヒ ト大腸癌）、 colo201 (ヒ ト大腸癌）、 colo205 (ヒ ト大腸癌）、 T-24 (ヒ ト膀胱癌） においていずれも高い hEPRの産生が確認さ れ （図 7 )、 培養液中の hEPRを特異的に検出できることが確認された。 尚、 HeLa (ヒ ト子宮頸癌）、 NB69 (ヒ ト神経芽細胞腫）、 KB (ヒ ト表皮癌（口腔））、 A431 (ヒ ト表皮癌（表皮））、 SK-BR-3 (ヒ ト乳癌）、 MDA-MB-468 (ヒ ト乳癌）、 TR-13 (ヒ ト腎 癌） のヒ ト癌細胞の培養液では検出できなかった。 産業上の利用の可能性
本発明により、 ヒ ト血液中、組織中等の生体内に存在する hEPRを特異的かつ高 感度に検出するシステムの提供が可能となり、 hEPRを発現する腫瘍細胞の存在を 検出する癌診断等に有用である。更に、本発明の方法を用い、 hEPRの発現の有無、 更には hEPR の発現と腫瘍発生とのメカニズムとの関連性等についての解明にも 寄与することが期待される。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許おょぴ特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1. ヒ ト型ェピレグリン （human epiregulin； hEPR) を特異的に認識するモ ノク口ーナル抗体を産生するハイブリ ドーマ。
2. 受託番号 FERM B P— 08 64 7である、 請求項 1に記載のハイブ リ ドーマ。
3. 受託番号 FERM B P— 0 8 648である、 請求項 1に記載のハイブ リ ドーマ。
4. 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載のハイブリ ドーマにより産生される モノクローナル抗体。
5. 請求項 2または 3に記載のハイプリ ドーマにより産生されるモノクロ一 ナル抗体によって認識されるェピトープを認識し、かつ hEPRを特異的に認識する モノクローナノレ抗体。
6. 請求項 4に記載のモノクローナル抗体と hEPRを認識するポリクローナル 抗体 （hEPR - PoAb) を用いることを特徴とする、 サンプル中の hEPR を in vitro で特異的に検出する方法。
7. 請求項 4に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、 hEPR を発現する細胞の in vitro検出方法。
8. hEPRを発現する細胞がヒ ト腫瘍である、 請求項 7に記載の方法。
9. 請求項 4に記載のモノクローナル抗体を含む、 ヒ ト腫瘍の検出のための キット。
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