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WO2004079354A1 - 細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法 - Google Patents

細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法 Download PDF

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WO2004079354A1
WO2004079354A1 PCT/JP2004/002951 JP2004002951W WO2004079354A1 WO 2004079354 A1 WO2004079354 A1 WO 2004079354A1 JP 2004002951 W JP2004002951 W JP 2004002951W WO 2004079354 A1 WO2004079354 A1 WO 2004079354A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hole
diaphragm
depression
forming
opening
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2004/002951
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masaya Nakatani
Hiroaki Oka
Fumiaki Emoto
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Panasonic Holdings Corp
Original Assignee
Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority claimed from JP2003062229A external-priority patent/JP3861831B2/ja
Application filed by Matsushita Electric Industrial Co Ltd filed Critical Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Priority to US10/513,392 priority Critical patent/US8257962B2/en
Priority to EP04718412.2A priority patent/EP1602922B1/en
Publication of WO2004079354A1 publication Critical patent/WO2004079354A1/ja
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Priority to US12/359,426 priority patent/US8202439B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp

Definitions

  • the present invention relates to an extracellular potential measuring device used for measuring extracellular potential or a physicochemical change occurring in cell activity and a method for producing the same, for example, a drug screening for detecting a reaction generated by a cell by a chemical substance.
  • candidate drugs are screened using patch clamp methods, fluorescent dyes or luminescence indicators, using the electrical activity of cells as an index.
  • the transport of ions through a single channel protein molecule in a microscopic part called a patch on the cell membrane attached to the tip of the micropit is electrically recorded by a microelectrode probe.
  • This method is one of the few methods that can examine the function of a single protein molecule in real time (for example, ⁇ o 1 ecu 1 ar Biol ogy oft he Cell third Editi on), Ga rl and Publishng Inc., New York, 1994, Bruce Alberts, et al., Japanese edition "Molecular Biology of Cells Third Edition", 181-182, 1995, Kyoikusha).
  • the electrical activity of cells can be measured by monitoring the movement of ions in cells using a fluorescent dye or luminescence indicator that emits light in response to a change in the concentration of specific ions.
  • the patch clamp method requires special techniques for the preparation and operation of micropipette, and it takes a lot of time to measure one sample, so that it is not suitable for high-speed screening of a large number of drug candidate compounds.
  • a method using a fluorescent dye or the like can screen a large number of drug candidate compounds at high speed, but requires a step of staining cells, and the measurement discolors the background due to the effect of the dye. The S / N ratio is poor due to the decolorization with time.
  • WO 02/055 563 discloses a conventional device for measuring extracellular potential using a substrate having cell holding means and an electrode provided on the holding means. With this device, high-quality data equivalent to the data obtained by the patch clamp method can be obtained, and a large amount of samples can be measured easily and at high speed, as with the method using fluorescent dyes.
  • FIG. 45 is a cross-sectional view of a conventional extracellular potential measuring device 49.
  • the culture solution 48 A is placed in the well 40, and the subject cell 47 is captured and held by the cell holding portion provided on the substrate 42.
  • the cell holding part includes a depression 41 formed in the substrate 42 and a through hole 44 communicating with the depression 41 via the opening 44A.
  • a measurement electrode 45 as a part of the sensor is arranged in the through hole 44, and the measurement electrode 45 outputs the potential of the culture solution 48B in the through hole 44 via the wiring.
  • the subject cell 47 is held in close contact with the opening 41A of the depression 41 by the suction pump from the side of the through hole 44.
  • the electric signal 49 A generated by the activity of the subject cell 47 is detected by the measurement electrode 45 provided in the through hole 44 without leaking into the culture solution 48 A in the well 40.
  • the through hole 44 is formed at the deepest part of the depression 41. Therefore, even when the subject cell 47 is held in the depression 41, if the cell membrane adheres to the middle part of the depression 41, the culture solution 48B in the through hole 44 will lose the well 40. It is electrically connected to the culture solution 48 B of the sample, and high-precision measurement cannot be performed.
  • the diameter of the depression 41 holding the subject cell 47 is about 10 to 30 and the diameter of the opening 44 B opening in the substrate 42 of the through hole 44 is 1 to 5 m, which is two diameters.
  • the openings 41 A and 44 B are respectively opened on both sides of the substrate 42. To form this shape accurately, two types of masks are required.
  • the second mask is used.
  • Through-holes 44 are formed by performing dry etching of photolithography.
  • dry etching is performed using the second mask after performing dry etching using the first mask, misalignment of the two masks occurs, and dry etching is performed separately using the two masks.
  • Device 49 is time-consuming to manufacture and incurs high costs.
  • the culture solution 48A is pressurized from the well 40 side or the culture solution 48B of the through hole 44 is held in order to hold the subject cell 47 in the depression 41. At least one of pressure reduction is required.
  • the culture solution 48 B needs to be brought into contact with the measurement electrode 45 by simultaneously introducing the culture solution 48 B into the recess 41 by a pressure difference.
  • the culture solution 48 B forms a meniscus shape at the opening 44 B of the through hole 44 and is stabilized.
  • an appropriate pressure difference value that can form the meniscus shape of the culture solution 48B is in a narrow range. That is, if the pressure difference deviates even slightly from the optimum value, the meniscus shape is destroyed, and the volume of the culture solution 48 B cannot be kept constant. Disclosure of the invention
  • the extracellular potential measurement device includes a diaphragm having a first surface and a second surface opposite to the first surface, and an electrode provided on the second surface of the diaphragm.
  • the diaphragm has a depression having an opening opening on the first surface, and a through-hole penetrating from the depression to the second surface of the diaphragm.
  • the through hole penetrates through the second surface of the diaphragm from a position closer to the opening of the dent than the deepest part of the dent.
  • the electrode is provided around the opening of the through hole on the second surface of the diaphragm.
  • FIG. 1 is a perspective view of the extracellular potential measurement device according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view of the extracellular potential measurement device according to the first embodiment.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of the extracellular potential measurement device according to the first embodiment.
  • FIG. 4 is an enlarged view of a main part of the extracellular potential measuring device according to the first embodiment.
  • FIG. 5 is an enlarged view of a main part of the extracellular potential measuring device according to the first embodiment.
  • FIG. 6 is an enlarged sectional view of a main part for describing the operation of the extracellular potential measuring device according to the first embodiment.
  • FIG. 7 is an enlarged cross-sectional view of a main part of the extracellular potential measurement device according to the first embodiment.
  • FIG. 8 is an enlarged cross-sectional view of a main part of the extracellular potential measurement device according to the first embodiment.
  • FIG. 4 is an enlarged sectional view of a main part of the extracellular potential measurement device in FIG.
  • FIG. 9B is an enlarged sectional view of a main part of the extracellular potential measurement device according to the first embodiment.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view of the device for measuring extracellular potential in the first embodiment.
  • FIG. 11 is an enlarged view of a main part of the extracellular potential measuring device according to the first embodiment.
  • FIG. 12 is a cross-sectional view for illustrating a method of manufacturing the extracellular potential measurement device according to the first embodiment.
  • FIG. 13 is a cross-sectional view for illustrating a method of manufacturing the extracellular potential measurement device according to the first embodiment.
  • FIG. 14 is a cross-sectional view for illustrating the method of manufacturing the extracellular potential measurement device in the first embodiment.
  • FIG. 15 is a cross-sectional view for illustrating the method of manufacturing the extracellular potential measurement device according to the first embodiment.
  • FIG. 16A is a cross-sectional view for illustrating the method for manufacturing the extracellular potential measurement device according to the first embodiment.
  • FIG. 16B is a cross-sectional view for illustrating the method for manufacturing the extracellular potential measurement device according to the first embodiment.
  • FIG. 16C is a cross-sectional view for illustrating the method for manufacturing the extracellular potential measurement device in the first embodiment.
  • FIG. 16D is a cross-sectional view for illustrating the method for manufacturing the extracellular potential measurement device in the first embodiment.
  • FIG. 17 is a cross-sectional view for illustrating a method of manufacturing the extracellular potential measurement device according to the first embodiment.
  • FIG. 18 is a cross-sectional view for illustrating a method of manufacturing the extracellular potential measurement device according to the first embodiment.
  • FIG. 19 is a cross-sectional view for illustrating the method for manufacturing the extracellular potential measurement device according to the first embodiment.
  • FIG. 20 is a cross-sectional view of another extracellular potential measurement device according to the first embodiment.
  • FIG. 21 is a cross-sectional view of still another extracellular potential measuring device according to the first embodiment.
  • FIG. 22 is a perspective view of the extracellular potential measurement device shown in FIG.
  • FIG. 23 is a perspective view of the extracellular potential measurement device shown in FIG.
  • FIG. 24 is a cross-sectional view of still another extracellular potential measuring device according to the first embodiment.
  • FIG. 25 is a perspective view of an extracellular potential measurement device according to Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 26 is a sectional view of the extracellular potential measurement device according to the second embodiment.
  • FIG. 27 is an enlarged view of a main part of the extracellular potential measurement device according to the second embodiment.
  • FIG. 28A is an enlarged cross-sectional view of a main part for describing the operation of the extracellular potential measurement device according to the second embodiment.
  • FIG. 28B is an enlarged cross-sectional view of a main part for describing the operation of the extracellular potential measurement device according to the second embodiment.
  • FIG. 29 is a cross-sectional view for illustrating a method of manufacturing the extracellular potential measurement device according to the second embodiment.
  • FIG. 30 is a cross-sectional view for illustrating a method of manufacturing the extracellular potential measurement device according to the second embodiment.
  • FIG. 31 is a cross-sectional view for illustrating the method for manufacturing the extracellular potential measurement device according to the second embodiment.
  • FIG. 32 is a cross-sectional view for illustrating a method of manufacturing the extracellular potential measurement device according to the second embodiment.
  • FIG. 33A is a cross-sectional view for illustrating the method for manufacturing the extracellular potential measurement device in the second embodiment.
  • FIG. 33B is a cross-sectional view for illustrating the method for manufacturing the extracellular potential measurement device according to the second embodiment.
  • FIG. 34 is a cross-sectional view for illustrating a method of manufacturing the extracellular potential measurement device according to the second embodiment.
  • FIG. 35 is a cross-sectional view of another extracellular potential measurement device according to the second embodiment.
  • FIG. 36 is an enlarged sectional view of a main part of the device for measuring extracellular potential shown in FIG.
  • FIG. 37A is a cross-sectional view for illustrating the method for manufacturing the extracellular potential measurement device shown in FIG. 35.
  • FIG. 37B is a cross-sectional view for illustrating the method of manufacturing the extracellular potential measurement device shown in FIG. 35A.
  • FIG. 38 is a cross-sectional view for illustrating the method of manufacturing the extracellular potential measurement device shown in FIG.
  • FIG. 39 is a cross-sectional view for illustrating the method for manufacturing the extracellular potential measurement device shown in FIG.
  • FIG. 40 is a cross-sectional view for illustrating a method of manufacturing the extracellular potential measurement device shown in FIG.
  • FIG. 41 is a perspective view of still another extracellular potential measuring device according to the second embodiment.
  • FIG. 42 is a perspective view of the extracellular potential measurement device shown in FIG.
  • FIG. 43 is a perspective view of still another extracellular potential measuring device according to the second embodiment.
  • FIG. 44 is a perspective view of still another extracellular potential measuring device according to the second embodiment.
  • FIG. 45 is a cross-sectional view of a conventional extracellular potential measuring device. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • FIG. 1 is a perspective view of an extracellular potential measurement device 51 according to Embodiment 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view of the device 51
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of the device 51 taken along line 3-3 in FIG.
  • FIG. 5 is an enlarged view of a main part of the device 51.
  • FIG. 12 to FIG. 21 are cross-sectional views for explaining a manufacturing process of the device 51.
  • FIGS. 22 and 23 are perspective views of another extracellular potential measuring device according to the first embodiment.
  • a concave portion 1A is formed in a silicon substrate 1
  • a diaphragm 2 is formed as a part of the substrate 1
  • a diaphragm 2 is supported by a convex portion 1C of the substrate 1.
  • the material of the diaphragm 2 is the same silicon as that of the substrate 1, and the thickness is about 2.
  • the depression 3 is formed of a hemispherical curved surface, and the diameter of the opening 3A opening on the surface of the substrate 1 is about 20 zm.
  • the recess 3 communicates with a through hole 4 having a uniform cross-sectional shape in the length direction penetrating the diaphragm 2.
  • Through hole 4 is provided at a position closer to the opening 3 A from the deepest portion 3 B of the depression 3 as shown in FIG. 3, it is inclined about 4 5 0 for da Iafuramu 2 in the thickness direction 2 A.
  • the through hole 4 has a circular cross section with a diameter of about 5 m or an elliptical cross section with a long diameter of about 5 m.
  • a plurality of detection electrodes 5 a and 5 b are formed on the surface 2 B in close proximity to the opening of the through hole 4.
  • 6 to 9A are enlarged cross-sectional views of a main part for describing the operation of the device 51.
  • FIG. 7 are enlarged sectional views of the dent 3, the through hole 4, and the detection electrodes 5a and 5b in the diaphragm 2.
  • FIG. 7 when the upper surface 2 C of the diaphragm 2 is filled with the culture solution 6 of the electrolyte, the depression 3 and the through hole 4 are filled with the culture solution 6 in this order.
  • the culture solution 6 jumps out of the through hole 4.
  • the pressure in the pressurization or decompression is set to an appropriate value, the culture solution 6 forms a meniscus shape from the opening at the tip of the through hole 4 and stabilizes.
  • the culture solution 6 comes into stable contact with the detection electrodes 5a and 5b.
  • Figure 5 As shown, the detection electrodes 5a and 5b are electrically insulated from each other. However, the culture solution 6 contacts the detection electrodes 5a and 5b by forming a meniscus shape from the through hole 4, and the electrodes 5a and 5b are electrically connected through the culture solution 6 which is an electrolyte. You.
  • the resistance value between the detection electrodes 5 a and 5 b is related to the ion concentration of the culture solution 6. Therefore, a change in the ion concentration of the culture solution 6 can be detected by a change in the resistance value between the detection electrodes 5a and 5b. Further, if the meniscus shape of the culture solution 6 is incomplete, the detection electrodes 5a and 5b are not sufficiently connected, and the resistance between them becomes large. Therefore, by measuring this resistance value, it can be determined whether or not the culture solution 6 has formed an appropriate meniscus shape in the through hole 4.
  • the test cells 8 are introduced together with the culture solution 6 and the space above the surface 2 C of the diaphragm 2 is pressurized or the space below the surface 2 B of the diaphragm 2 is depressurized,
  • the cells 8 are drawn into the cavity 3 together with the culture solution 6.
  • the subject cell 8 is drawn into the through-hole 4 side, and the cell membrane of the subject cell 8 is adsorbed so as to close the opening 4A opening into the depression 3 of the through-hole 4. Is done.
  • the opening 4A of the through hole 4 is formed at a position closer to the opening 3A than the deepest portion 3B of the depression 3.
  • the subject cell 8 when the subject cell 8 is slightly larger than the diameter of the opening 3A of the depression 3, as shown in FIG. 9A, a gap 3C is formed near the deepest part 3B, and the subject cell 8 Transform Wakasen. However, even in this case, the subject cell 8 can close the opening 4A of the through hole 4. That is, the subject cells 8 can be more reliably held in the depressions 3. Since the recess 3 is formed of a curved surface, the subject cell 8 can be efficiently held. After the test cells 8 are held in the depressions 3, the pressure above and below the diaphragm 2 is detected so that the culture solution 6 forms an appropriate meniscus shape at the opening 4 B of the through hole 4. It can be adjusted appropriately while measuring the resistance between b.
  • the subject cells 8 are stimulated.
  • This stimulus includes, for example, chemical stimuli such as chemicals and poisons, as well as physical stimuli such as mechanical displacement, light, heat, electricity, and electromagnetic waves.
  • the subject cell 8 actively responds to these stimuli, the subject cell 8 releases or absorbs various ions through an ion channel held by the cell membrane.
  • This reaction occurs where the test cells 8 are in contact with the culture solution 6, and ion exchange is also performed between the culture solution 6 in the through-hole 4 and the test cells 8.
  • the ion concentration of the culture solution 6 in the through hole 4 changes, and the change in the ion concentration can be detected by the resistance value between the detection electrodes 5a and 5b as described above.
  • a detection electrode 5 mainly composed of gold is formed on the surface 2B on the side of the recess 1A of the diaphragm 2 through the through hole 4. It is formed near the part.
  • FIG. 9B by measuring the voltage between the reference electrode 5c and the detection electrode 5 having the same potential as the culture solution 6 filling the upper surface 2C of the diaphragm 2, the ions in the through-hole 4 are measured. The change in concentration can be measured, and the extracellular potential of the subject cell 8 and the physicochemical change generated by the cell 8 can be measured.
  • the change in ion concentration can be measured not only by resistance but also by measuring other physical quantities such as current, charge, and potential.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view of another extracellular potential measuring device 52 according to the first embodiment.
  • the through hole 4 is provided at a position closer to the opening 3A than the deepest portion 3B in the recess 3, and is inclined at an angle of 45 ° with respect to the thickness direction 2A of the diaphragm 2. ing.
  • the through holes 10 a and 10 b are provided on the lower surface 2 B of the diaphragm 2 from the recess 3.
  • the detection electrodes 11a and 11b mainly composed of gold are provided in the through holes 10a and 10b, respectively.
  • the through holes 10a and 10b are formed apart from each other, the detection electrodes 11a and 11b can be easily formed.
  • the depression 3 and the through holes 10 a and 10 b are filled with the culture solution 6, and the culture solution 6 is penetrated by the pressure difference between the upper and lower portions of the diaphragm 2.
  • a meniscus shape is formed at the tip of 10a, 10b, and comes into contact with the detection electrodes 11a, 11b, respectively.
  • an appropriate meniscus shape is formed at the tip of the through holes 10a and 10b. The change in the ion concentration in the through holes 10a and 10b can also be seen.
  • the resistance between the detection electrodes 11a and lib is measured, so that the cell membrane of the test cell 8 covers the through holes 10a and 10b. Can be determined. For example, when the cell membrane blocks only the through-hole 10a and the through-hole 10b is not closed, between the detection electrode 11a and the reference electrode 52c that is in contact with the culture solution 6 above the diaphragm 2 The resistance value is high, and the resistance value between the detection electrode 11b and the reference electrode 52c is low. In this case, by measuring the resistance value between the reference electrode and the detection electrode 11a, the activity of the subject cell 8, which will be described later, can be measured.
  • test cell 8 blocks the through hole 11b and does not block the through hole 11a
  • the resistance between the reference electrode 52c and the detection electrode 11b is measured.
  • the activity of the subject somatic cells 8 can be measured. As described above, if the cell membrane of the subject cell 8 covers any of the through holes 10a and 10b, the activity of the cell 8 can be measured. Therefore, the probability that the activity can be measured is increased, and the reliability of the device is increased.
  • the subject cells 8 By applying a stimulus to the subject cells 8 from the outside while the cell membrane of the subject cells 8 is held so as to cover the through holes 10a and 10b, the subject cells 8 are activated and penetrate. Since the ion concentration in the holes 11a and 11b changes, the extracellular potential of the subject cell 8 or the physicochemical change generated by the cell 8 can be measured.
  • the through holes 4, 10a and 10b are formed at positions closer to the opening 3A than the deepest portion 3B of the depression 3. As shown in FIG. 21, the through hole 14 can be easily provided in the deepest portion 3B. In this case, it is necessary to appropriately adjust the diameter and shape of the depression 3 according to the subject cell 8 so that the subject cell 8 can easily reach the deepest part 3B.
  • the cross sections of the through holes 4, 10a, and 10b are round or elliptical, but may be rectangular or U-shaped.
  • FIGS. 22 and 23 are perspective views of a device for measuring extracellular potential in which the through holes 15 and 17 are rectangular and U-shaped.
  • the shape of the depression 16 is a semi-cylindrical shape with roundness.
  • the shape of the depression 18 is substantially hemispherical.
  • the semi-cylindrical depression 16 is used when the fixed shape of the subject cell 8 is elongated (for example, Ganglion cells derived from mussels.
  • the hemispherical recess 18 and the through hole 17 having a U-shaped cross section are effective when the subject cell 8 is easily deformed.
  • the subject cell 8 When the subject cell 8 is easily deformed, it may pass through the through hole 4 having a round cross section.
  • the minimum width of the opening 17A that opens into the depression 18 of the through hole 17 can be reduced without significantly reducing the volume of the culture solution 6 filling the inside of the U-shaped through hole 17. Therefore, it is possible to prevent the subject cell 8 from entering the through hole 17 and being destroyed.
  • the cross section of the through hole 17 may be a plurality of U-shapes, a plurality of rectangular shapes, or a combination thereof.
  • the diameters of the depressions 3, 16 and 18 and the through holes 4, 15 and 17 are determined by the size, shape and properties of the subject cells 8. By setting the diameter of the depressions 3, 16 and 18 to 10 to 100 m and the diameter of the through holes 4, 15 and 17 to 1 to 10 m, the diameter of about 5 to 100 zm Of the subject cells 8 can be measured.
  • FIGS. 12 to 21 are cross-sectional views for explaining a method of manufacturing the extracellular potential measurement device 51 in the first embodiment.
  • etching is performed by a predetermined depth from the lower surface 1B. Recess 1A is formed .. Lower surface 2B of diaphragm 2 is formed. The diaphragm 2 is supported by the projection 1C of the substrate 1. After that, the resist mask 12 is removed.
  • a resist mask 13 is formed on the upper surface 2C of the diaphragm 2 as shown in FIG.
  • the shape of the etching hole 13 A of the resist mask 13 is substantially the same as the desired cross-sectional shape of the through hole 4.
  • the diaphragm 2 is etched from the upper surface 2C only with a gas that promotes etching.
  • a gas that promotes etching For a silicon substrate 1, SF 6 , CF 4 , XeF 2, or the like can be used as a gas for promoting etching. These gases promote the etching not only in the depth direction of the substrate 1, that is, in the direction perpendicular to the mask 13, but also in the lateral direction, that is, in the direction parallel to the mask 13.
  • the etched portion passes through the opening 13A of the mask 13 as shown in FIG. It becomes a hemispherical shape with a center, and a depression 3 is formed.
  • the substrate 1 is dry-etched at an angle of 45 ° with respect to the traveling direction 61 of ions of the etching gas.
  • a gas that promotes etching and a gas that suppresses etching are alternately used.
  • Xe F 2 , CF 4 , SF 6 and the like can be used as a gas for promoting the etching.
  • CHF 3 , C 4 F 8 and the like are gases that suppress the etching.
  • the substrate 1 is slightly etched by a gas for promoting the etching.
  • a high frequency is applied to the substrate 1 in the plasma generated by the inductive coupling method using an external coil.
  • the bias voltage of Ma Inasu generated in the substrate 1 is SF 5 + and CF 3 + is a positive ion in the etching gas plasma collides against the substrate 1, the substrate 1 is preferentially in the direction 61 Dry etching is performed.
  • there are some components in the direction of travel of the positive ions in the plasma that are not parallel to the direction 61, so that a hole 3D having a diameter slightly larger than the etching hole 13A is formed in the diaphragm 2 by this etching.
  • a protective film 31 is formed on the etched portion of the substrate 1 as shown in FIG. 16C by using a gas for suppressing etching.
  • no high frequency is applied to the substrate 1.
  • no bias voltage is generated on the substrate 1, so that CF +, which is the material of the protective film 31, is not deflected, and the protective film 31 is uniformly formed on the wall surface of the etched portion of the substrate 1.
  • the substrate 1 is slightly etched again as shown in FIG. 16D by a gas for promoting the etching.
  • a high frequency is applied to the substrate 1 again.
  • a bias is applied to the substrate 1, and the ions of the etching gas moving parallel to the direction 61 increase.
  • These ions have high energy, and the protective film 31 formed on the bottom surface of the etched portion is etched by the ions moving parallel to the direction 61.
  • ions moving in a direction not parallel to the direction 61 have low energy, so that the protective film 31 formed on the wall surface cannot be easily removed.
  • the etching proceeds only in the direction 61 from the etching hole 13 A, and the etching hole is formed.
  • a through hole 4 extending only in the direction 61 from 13 A can be formed.
  • etching proceeds only from the etching hole 13A in the gas ion traveling direction 61, and extends at an angle of 45.degree.
  • a through hole 4 is formed, and the through hole 4 is formed at a position closer to the opening 3A than the deepest portion 3B of the depression 3. Since the substrate 1 is etched obliquely, the cross-sectional shape of the through hole 4 is different from the shape of the etching hole 13 A of the resist mask 13.
  • the cross-sectional shape of the through hole 4 can be made circular.
  • the angle at which the substrate 1 is inclined is limited by the shape of the etching hole 13 A and the thickness of the resist mask 13. For example, when the diameter of the etching hole 13 A is 1 m and the thickness of the resist mask 13 is 1 m, the direction 61 is 4 5 with respect to the thickness direction 2 A of the diaphragm 2 due to geometrical restrictions.
  • the substrate 1 cannot be etched unless the inclination is smaller than °.
  • a through hole 14 is formed in the deepest portion 3 B of the recess 3.
  • the through hole 14 may be formed at the position shown in FIG.
  • the etching hole 13A of the resist mask 13 may be rectangular, U-shaped, or a combination thereof in addition to the above-mentioned round and elliptical shapes.
  • the shape of the etching hole 13 A is rectangular, a gas that promotes etching As a result, as shown in FIG. 22, a substantially semi-cylindrical depression 16 having a rounded upper surface and a lower surface is obtained, and the cross section of the through hole 15 is the same rectangle as the etching hole 13A. Further, since the length of the long side of the rectangle is longer than the diameter of the circle, a plurality of detection electrodes can be easily formed in one through hole.
  • the gas that promotes etching etches the substrate 1 in all directions from the hole 13A, so that a hemispherical shape is formed as shown in Fig. 23. Recess 18 is obtained.
  • the cross section of through hole 17 has the same U-shape as etching hole 13A.
  • the step of forming a through hole 4 is performed on the substrate 1 as shown in FIG.
  • a plurality of through holes are formed by changing the angle of inclination of the substrate and etching.
  • the resist mask 13 is removed after the etching.
  • the detection electrodes 5 a and 5 b mainly composed of gold are brought close to the through holes 4 by a thin film forming process.
  • the surface 1B of the substrate 1 has irregularities, the coating, exposure and patterning of the photoresist can be performed on such irregular surfaces.
  • a depression 3 is formed on the surface 6 2 B on the side of the concave portion 1 A of the diaphragm 62. You may.
  • Surface 62C can be machined more precisely than surface 62B by mechanical or chemical methods. Since the detection electrodes 5a and 5b require high precision, and generally the recess 3 does not need to be more precise than the detection electrodes 5a and 5b, the device can be easily manufactured by this method.
  • electrodes 1 la and 11 are generally easier than electrodes 5 & and 5 b because the accuracy is not required more than electrodes 5 a and 5 b when one through hole 4 shown in FIG. 3 communicates with recess 3. Can be formed.
  • a concave portion 1A is formed in the substrate 1, a lower surface 2B of the diaphragm 2 is formed, and a structure for supporting the diaphragm 2 by the convex portion 1C of the substrate 1 is formed.
  • the recess is formed in the substrate 1. Even if 1 A is formed to form the lower surface 2 B of the diaphragm 2 and the diaphragm 2 is supported by the convex portion 1 C of the substrate 1, an extracellular potential measuring device having the same configuration can be obtained.
  • FIG. 24 is a cross-sectional view of still another extracellular potential measuring device according to the first embodiment.
  • silicon is used as the substrate 1.
  • the extracellular potential measuring device is an SOI substrate 8 1 having a silicon layer 8 2 A, a silicon oxide layer 8 3, and a silicon layer 8 2 B, as shown in FIG. May be used.
  • a silicon oxide layer 83 is provided on the periphery of lower surface 2B of diaphragm 2, and a silicon layer 82B is provided on silicon oxide layer 83.
  • FIG. 25 is a perspective view of an extracellular potential measurement device 15 1 according to Embodiment 2 of the present invention.
  • FIG. 26 is a cross-sectional view of the device 15 1 shown in FIG. 25, taken along line 26-26.
  • FIG. 27 is an enlarged view of a main part of the device 151.
  • a concave portion 101A is formed in a silicon substrate 101, and a lower surface 102A of a diaphragm 102 is formed.
  • Diaphragm 102 is supported by convex portion 101C of substrate 101.
  • the material of the diaphragm 102 is the same silicon as that of the substrate 101, and the thickness thereof is about 25.
  • the depression 103 is formed of a hemispherical curved surface, and the diameter of the opening 103 A opening on the surface of the substrate 101 is about 20 ⁇ .
  • the depression 103 has a through-hole 104 having a uniform cross-sectional shape in the longitudinal direction, which communicates with the depression 102 so as to penetrate the diaphragm 102.
  • the through hole 104 is provided at the deepest portion 103 mm of the depression 103 and has a cross section of a circle having a diameter of 5 m or an elliptical shape having a long diameter of 5 m.
  • a depression 106 extending toward the surface 102B is formed on the opposite side from the depression 103 of the through hole 104.
  • the detection electrodes 105 a and 105 b mainly composed of gold are formed near the opening 106 A of the depression 106.
  • FIG. 28A is an enlarged cross-sectional view of a main part for explaining the operation of the device 151.
  • a procedure for detecting a physicochemical change of a culture solution will be described.
  • Fig. 28A when the upper part of the upper surface 102B opposite to the lower surface 102A of the diaphragm 102 is filled with the culture solution 107 as an electrolyte, the depressions 103 and the through holes 1 04 is filled in this order with the culture solution 107.
  • Pressurizing the space above the upper surface 102B of the diaphragm 102 or depressurizing the space below the lower surface 102A of the diaphragm 102 allows the culture solution 107 to pass through the through hole 104. Jump out from the outside.
  • the pressure in the pressurization or depressurization is set to an appropriate value, the culture solution 107 forms a meniscus shape in the opening 106A of the depression 106 and stabilizes.
  • the culture solution 107 comes into stable contact with the detection electrodes 105a and 105b.
  • the detection electrodes 105a and 105b are electrically insulated from each other.
  • the culture solution 107 contacts the detection electrodes 105 a and 105 b by forming a meniscus shape from the depression 106, and the electrode 105 passes through the culture solution 107 which is an electrolyte.
  • a 105 b is electrically connected.
  • the resistance value between the detection electrodes 105a and 105b is related to the ion concentration of the culture solution 107. Therefore, a change in the ion concentration of the culture solution 107 can be detected by a change in the resistance value between the detection electrodes 105a and 105b. In addition, if the meniscus shape of the culture solution 106 is incomplete, the detection electrodes 105a and 105b are not sufficiently connected, and the resistance between them becomes large. Therefore, by measuring this resistance value, it can be determined whether or not the culture solution 107 has formed an appropriate meniscus shape in the depression 106.
  • the portion that opens from the through hole 104 to the lower surface 102A of the diaphragm 102 is not a linear shape, but the linear portion and the curved surface of the depression 106. And has a stepped shape.
  • the culture solution 107 easily forms a meniscus in the depression 106 after passing through the through hole 104. This is because the surface tension of the culture solution 107 increases due to the concave surface 106 having a curved surface, and the pressure balance is maintained even if the vertical pressure difference fluctuates slightly.
  • the depression 106 stabilizes the meniscus shape of the culture solution 107 even if the pressure fluctuates slightly. This phenomenon was confirmed by finite element analysis for hydrodynamics.
  • the stable shape of the meniscus means that the amount of the culture solution 107 in the through-holes 104 and the depressions 106 is stable, and the ion concentration can be measured more stably.
  • the detection electrodes 105 a and 105 b are formed so as to extend into the recesses 106, so that the culture solution 107 and the culture solution 107 are formed in a meniscus shape.
  • the test cells 108 are introduced together with the culture solution 107, and the space above the upper surface 102B of the diaphragm 102 is pressurized or the lower surface of the diaphragm 102 is pressed.
  • the space below 102 A is depressurized, both the test cell 108 and the culture solution 107 are drawn into the depression 103. Since the depression 103 is constituted by a curved surface, the subject cell 108 can be held efficiently.
  • the culture solution 107 has formed a diaphragm 102 so as to form an appropriate meniscus shape at the opening 106A of the recess 106. Adjust the pressure above and below. As described above, the pressure can be adjusted while measuring the resistance between the detection electrodes 105a105b.
  • test cell 108 After the subject cell 108 is held so as to cover the opening of the through hole 104 in the recess 103, the test cell 108 is stimulated.
  • stimuli include, for example, chemical stimuli such as chemicals and poisons, as well as physical stimuli such as mechanical displacement, light, heat, electricity, and electromagnetic waves.
  • the subject cell 108 When the subject cell 108 responds actively to these stimuli, the subject cell 108 releases or absorbs various ions through ion channels carried by the cell membrane. This reaction occurs when the test cell 108 comes in contact with the culture solution 107, and the culture solution 107 in the through-hole 104 and the depression 106 and the test cell 106 The ion exchange is also performed during the period. As a result, the ion concentration of the culture solution 107 A in the through-holes 104 and the depressions 106 changes, so that the detection electrodes 105 a, 1 The change can be measured by 05b.
  • FIG. 28A the change of the detection electrodes was measured at 105a and 105b, but the change can be measured with one detection electrode.
  • FIG. 28B is a main-portion enlarged cross-sectional view for explaining the operation of the extracellular potential measurement device according to Embodiment 2.
  • the through-hole 104 is obtained. It is possible to measure the change in the ion concentration of the culture solution 107A in the inside and the depression 106, and to measure the extracellular potential of the subject cell 108 or the physicochemical change generated by the cell.
  • the change in ion concentration can be measured not only by resistance but also by measuring other physical quantities such as current, charge, and potential.
  • the through holes 109a and 109b are provided at positions closer to the opening 103A than the deepest portion 103B of the recess 103, and from the recess 103 in the thickness direction of the diaphragm 102. Extends at an angle of 45 ° to 102C. With such a configuration, a plurality of through-holes 109a and 109b can be provided in the recess 103. Further, portions of the through-holes 109a and 109b that open from the respective diaphragms 102 face the surface 102A. Dents 110a and 110b can be provided. As shown in FIG.
  • detection electrodes 111a and 111b mainly composed of gold are provided in the recesses 110a and 110b, respectively. Since the recesses 110a and 110b are formed apart from each other, the detection electrodes 111a and 111b can be easily formed.
  • the depression 103 and the through holes 109a and 109b are filled with the culture solution 107A.
  • the culture solution 107A forms a meniscus shape at the tips of the depressions 110a and 110b due to the pressure difference between the upper and lower portions of the diaphragm 102, and comes into contact with the detection electrodes 111a and 111b, respectively.
  • By measuring the resistance value between the detection electrodes 111a and 111b it can be determined whether or not a proper meniscus is formed at the tip of the culture solution 107A and the through-holes 109a and 109b.
  • the change in ion concentration in the depressions 110a and 110b can also be measured.
  • the test cells 108 (not shown) are added together with the culture solution 107, it can be determined whether or not the test cells 108 are held so that the through-holes 109a and 109b are covered with the cell membrane. For example, when the cell membrane blocks only the through-hole 109a and the through-hole 109b is not closed, the resistance value between the detection electrode 111a and the reference electrode 111c obtained from the culture solution 107 at the top of the diaphragm 102 is Therefore, the resistance between the detection electrode 111b and the reference electrode 111c is low.
  • the subject cell 108 When a stimulus is given to the subject cell 108 in the above state, the subject cell 108 is activated, and the ion concentration of the culture solution in the through holes 109 a and 109 b and in the depressions 110 a and 11 Ob is changed.
  • the extracellular potential of the cell 108 or the physicochemical change generated by the cell can be measured.
  • the depression 103 can be easily formed into an appropriate size and shape according to the subject cell 108 so that the subject cell 108 can easily reach the deepest portion 103B.
  • the cross-sectional shapes of the through holes 104, 109a, and 109b are round or elliptical, but may be rectangular or U-shaped.
  • FIGS. 41 and 42 are perspective views of the extracellular potential measuring device in which the through holes 115 and 117 are rectangular and U-shaped. As shown in FIG. 41, when the through hole 115 is rectangular, the shape of the recess 116 is a substantially semi-cylindrical shape with upper and lower surfaces rounded. As shown in FIG. 42, when the through-hole 117 has a U-shape, the shape of the depression 118 becomes substantially hemispherical.
  • the substantially semi-cylindrical depression 1 16 is most suitable when the subject cell 108 is elongated (for example, ganglion cells derived from a mussel).
  • the hemispherical recesses 118 and the through-holes 117 having a U-shaped cross section are effective for, for example, deformed subject cells 108 that pass through the through-holes 104.
  • the through-hole 117 is formed in a U-shape, the minimum width of the opening 117A can be reduced without significantly reducing the amount of the culture solution 107 filling the through-hole 117. Therefore, it is possible to prevent the subject cells 108 from entering the through holes 117 and being destroyed.
  • the size of the recesses 103, 116, 118, and the through holes 104, 115, 117 is determined by the size, shape, and properties of the subject cell 108.
  • the diameter of the dents 103, 116, 118 is 10-: L 00 m, and the diameter of the through holes 104, 115, 117 is 1-
  • the response of the subject cell 108 having a size of about 5 to 100 m can be measured.
  • 29 to 34 are process cross-sectional views for explaining a method of manufacturing the extracellular potential measurement device shown in FIG.
  • a resist mask 112 is formed on the surface 101A of the substrate 101 made of silicon, a predetermined depth from the surface 101A is formed as shown in FIG. Only by etching, a concave portion 101B is formed, and a diaphragm 102 supported by the convex portion 101C is formed on an upper portion of the substrate 101. After that, the resist mask 112 is removed.
  • a resist mask 113 is formed on the outer surface 102 B of the diaphragm 102.
  • the shape of the etching hole 113 A of the resist mask 113 is made substantially the same as the desired shape of the through hole 104.
  • the diaphragm 102 is dry-etched from the etching hole 113A using a gas for promoting etching as an etching gas.
  • the gas to promote the etching or the like can be used SF 6. CF 4, X e F 2. These gases promote the etching of the silicon substrate 101 not only in a direction perpendicular to the resist mask 113 but also in a direction parallel to the resist mask 113. As a result, the substrate 101 is hemispherically etched around the etching hole 113A as shown in FIG. 32, and a depression 103 is formed.
  • a hole 104 is formed from the depression 103 of the substrate 101.
  • the hole 104 is formed by dry etching alternately using a gas that promotes etching and a gas that suppresses etching, and terminates the etching before passing through the diaphragm 102.
  • CHF 3 or C 4 F 8 can be used as a gas for suppressing the etching.
  • By adjusting the time ratio between the gas that promotes etching and the gas that suppresses etching only the portion immediately below the resist hole 113A of the substrate 101 can be dry-etched in the same manner as in Embodiment 1. .
  • depression On the wall of 103 and hole 104 as shown in Fig. 33B, the gas that suppresses etching is recessed by the gas that suppresses the etching.
  • the inner surface of 103 and the wall of hole 104 are formed.
  • a protective film 13 1 is formed on A.
  • the cross-sectional shape of the hole 104 can be rectangular, U-shaped, or a combination thereof.
  • the substrate 101 is etched using only a gas that promotes etching. Since the protective film 13 1 is formed on the wall surface of the depression 10 3 and the hole 10 4, when etching is performed using only a gas that promotes etching, the lower surface 10 of the diaphragm 10 2 of the through hole 10 4 is formed. Only the 2 A side is etched to form a depression 106.
  • a thick protective film 1331 may be formed on the wall surface with a gas that suppresses etching.
  • the thickness of the protective film 131 can be adjusted by changing the time ratio between the gas that promotes etching and the gas that suppresses etching. In this way, the depressions 103 and 106 formed of curved surfaces and the through holes 104 connecting these are formed.
  • detection electrodes 105a and 105b are formed in the vicinity of the depression 106 by ordinary thin film forming means. Since the depression 106 has a larger diameter than the through hole 104, high precision is not required when forming the detection electrodes 105a and 105b. Therefore, the detection electrodes 105a and 105b can be easily manufactured.
  • FIGS. 37A to 40 are cross-sectional views illustrating a method of manufacturing the extracellular potential measurement device shown in FIG.
  • the depression 103 is formed by the same method as the manufacturing process shown in FIGS.
  • the upper surface 102 B of the substrate 101 is tilted at 45 ° with respect to the traveling direction 16 1 of the ions of the etching gas, and the substrate 101 is etched.
  • Dry etching is performed by alternately using a promoting gas and a gas that suppresses etching.
  • XeF 2 , CF 4 , and SF 6 can be used as a gas for promoting the etching.
  • CHF is a gas that suppresses etching.
  • CF 8 can be used.
  • a protective film 132 made of a CF 2 polymer is formed on the wall surface of the etched portion of the substrate 101 as shown in FIG. 37B. Therefore, the substrate 101 can be etched only below the etching hole 113A of the resist mask 113, and the through hole 109a can be formed.
  • the substrate 101 can be etched only below the etching hole 113A in the same manner as in the first embodiment, detailed description is omitted here.
  • the angle at which the substrate 101 is inclined when etching the through hole 109a is limited by the shape of the etching hole 113A and the thickness of the resist mask 113.
  • the direction 161 is more than 45 ° with respect to the thickness direction 102C of the substrate 101 due to the geometrical limitation.
  • the substrate 101 cannot be etched unless the inclination is small.
  • the substrate 101 is etched using only a gas that promotes etching.
  • the diaphragm of the hole 109a is formed. Only the lower surface 102A side of 102 is etched to form a depression 110a as shown in FIG. Thereafter, as shown in FIG. 40, the substrate 101 is tilted with respect to the direction 161, and the ion of the gas which promotes the etching which proceeds in the symmetric direction 162 of the direction 161 shown in FIG.
  • the holes 109b are formed by alternately using the ions of the gas that suppresses the etching, and then the depressions 110b are formed by using only the gas that promotes the etching. The same effect can be obtained even if the direction 162 is not symmetrical to the direction 161 in the direction 102C or is different from the direction 161.
  • the resist mask 113 is removed after the etching.
  • the detection electrodes 11a, 11b) mainly composed of gold are brought close to the depressions 110a and 110b by a normal thin film forming process. Formed. Since the formed through-holes 109 a and 109 b communicating with the recess 103 need only be lower in precision than the electrodes 105 a and 105 b shown in FIG. 27, the electrodes 1 1 1 a and 1 1 1 b can be formed more easily. .
  • the through-hole 109a is formed in the recess 103 as shown in FIG. 109 b and depressions 110 a, 110 ob can be formed.
  • the inclination angle between the traveling direction 161 of the ions in the plasma of the etching gas and the thickness direction 102 C of the substrate 101 is 45 °. It is preferable from the productivity point of view to form a, 109b, and depressions 110a, 110b, and more preferably, they can be formed to be inclined in the range of 20 ° to 70 °.
  • the cells 108 cover the through holes 109a and 109b more reliably. Therefore, the extracellular potential can be measured more reliably by the detection electrodes 111a and 111 provided in the depressions 110a and 110b.
  • the size of the dent 103 and the through holes 109a and 109b is determined by the size, shape, and properties of the subject cell to be measured.
  • the diameter of the depression 103 is 10 to 100 m, and the diameter of the through holes 109 a and 109 b is:! By setting the length to ⁇ 10 m, the extracellular potential of cells having a diameter of about 5 to 100 m can be measured.
  • the diameter of the depressions 110 a and 110 b is determined by the diameter of the through holes 109 a and 109 b and the fluid characteristics of the culture solution 107.
  • the diameter of the through holes 109a and 109b is 5 m
  • the diameter of the depressions 1 10a and 110 b is 10 Assuming m, it was confirmed that the culture solution 107 stably formed a meniscus shape.
  • FIG. 44 shows still another device for measuring extracellular potential according to the second embodiment.
  • a recess 170 similar to the recess 106 shown in FIG. 26 may be formed in a portion of the device 51 for measuring extracellular potential 51 according to the first embodiment shown in FIG.
  • Electrodes 17a and 171b similar to the electrodes 105a and 105b shown in FIG. 3 are formed around the recess 170.
  • FIG. 43 is a cross-sectional view of still another extracellular potential measurement device according to the second embodiment.
  • a silicon substrate 1 is used as the substrate 101.
  • an SOI substrate 181 having silicon layers 183A and 183B and a silicon oxide layer 184 may be used instead of the substrate 1 made of silicon.
  • silicon oxide layer 183A is provided on the periphery of the surface 182B, and a silicon layer 182B is provided on the silicon oxide layer 183A. Since the dry etching stops at the silicon oxide layer 184, the thickness of the diaphragm 182 can be made highly accurate, and the through hole 104 can be formed more easily by etching.
  • the electrodes 105 a, 105 b, llla, 111 b, 171 a, and 17 lb in the actual form 2 extend to the inner walls of the depressions 106, 170, 110 a, and 11 Ob, as shown in FIG. Similar to the electrodes 5a and 5b of the first embodiment, the electrodes may be formed only on the lower surfaces 102A and 2A of the diaphragms 102 and 2 without extending to the inner wall of the depression.
  • a concave portion 101A is formed in the substrate 1
  • a lower surface 02A of the diaphragm 102 is formed, and a structure for supporting the diaphragm 102 by the convex portion 101C of the substrate 1 is formed.
  • Form 104 is formed.
  • a concave portion 101A is formed in the substrate 1 to form the lower surface 102A of the diaphragm 102, and the diaphragm 102 is supported by the convex portion 101C of the substrate 1.
  • the portions of the substrates 1 and 101 other than the diaphragms 2 and 102 are not limited to the shapes described above.
  • the shapes of the diaphragms 2 and 102 are the same as those of the devices according to the first and second embodiments. If they are the same, they have the same effect.
  • the extracellular potential measuring device of this invention can measure the physicochemical change which arises when a cell activates efficiently and stably by a detection electrode.

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Abstract

細胞外電位測定デバイスは、第１面と第１面の反対側の第２面とを有するダイヤフラムと、ダイヤフラムの第２面上に設けられた電極とを備える。ダイヤフラムには、第１面に開口する開口部を有する窪みと、窪みからダイヤフラムの第２面に貫通する貫通孔とが形成される。貫通孔は窪みの最深部より窪みの開口部に近い位置からダイヤフラムの第２面に貫通する。電極は、ダイヤフラムの第２面上で貫通孔の開口部の周囲に設けられる。このデバイスでは、被験体細胞が窪み内の最深部に到達しなくても、より確実に貫通孔に被験体細胞の細胞膜が隙間無く密着できるので、貫通孔内の培養液とダイアフラムの上面側の培養液は遮断され、細胞が活動する際に発する電気化学的変化を検出電極によって効率よく検出できる。

Description

細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法 技術分野
本発明は細胞外電位あるいは細胞の活動に発生する物理化学的変化を測定する ために用いられる細胞外電位測定デバイスおよびその製造方法であり、 例えば化 学物質によって細胞が発する反応を検出する薬品スクリーニングに用いられる。 背景技術
従来、 新しい薬品を開発する際には、 細胞の電気的活動を指標にして候補薬品 がパッチクランプ法、 蛍光色素または発光指示薬を用いる方法によりスクリー二 ングされる。
このパッチクランプ法では、 マイクロピぺットの先端部分に付けた細胞膜のパ ツチと呼ばれる微小部分での、 単一のチャネルタンパク質分子を介するイオンの 輸送を微小電極プローブによって電気的に記録する。 この方法は 1個のタンパク 質分子の機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の 1つである (たとえは、 Μ o 1 e c u 1 a r B i o l ogy o f t he Ce l l Th i r d Ed i t i on」 、 Ga r l and Pub l i s h i ng I n c . 、 New Yo r k, 1994、 B r u c e A l b e r t s他、 日本語 版 「細胞の分子生物学 第三版」 181〜 182頁、 1995年、 教育社） 。 また、 特定のイオンの濃度変化に応じて光を発する蛍光色素または発光指示薬 により、 細胞内のイオンの移動をモニタすることで細胞の電気的活動を測定する ことができる。
しかし、 パッチクランプ法は、 マイクロピペットの作成及び操作に特殊な技術 を必要とし、 1つの試料の測定に多くの時間を要するので大量の薬品候補化合物 を高速でスクリーニングするには適していない。 また、 蛍光色素などを利用する 方法は大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングできるが、 細胞を染色する 工程が必要であり、 測定においては色素の影響でバックグラウンドも変色する上 に時間とともに脱色するため S ZN比が悪い。
WO 0 2 / 0 5 5 6 5 3号公報は、 細胞の保持手段を有する基板および保持手 段に設けられた電極によって細胞外電位を測定する従来のデバイスを開示してい る。 このデバイスではパッチクランプ法で得られるデータと同等の高品質なデー 夕が得られ、 しかも蛍光色素を用いる方法のように簡易に高速で大量の試料を測 定できる。
この従来の細胞外電位測定デバイスの動作について図面を用いて詳細に説明す る。
図 4 5は従来の細胞外電位測定デバイス 4 9の断面図である。 ゥエル 4 0内に 培養液 4 8 Aが入れられ、 被験体細胞 4 7は基板 4 2に設けられた細胞保持部に よって捕捉されて保持されている。 細胞保持部は基板 4 2に形成された窪み 4 1 と、 開口部 4 4 Aを介して窪み 4 1に連絡する貫通孔 4 4よりなる。 貫通孔 4 4 の中にはセンサ一部である測定電極 4 5が配置されており、 測定電極 4 5は配線 を経て貫通孔 4 4内での培養液 4 8 Bの電位を出力する。
測定の際には、 被験体細胞 4 7は貫通孔 4 4側から吸引ポンプにより窪み 4 1 の開口部 4 1 Aに密着し保持される。 これにより、 被験体細胞 4 7の活動により 発生する電気信号 4 9 Aはゥエル 4 0内の培養液 4 8 Aに漏れることなく 貫通 孔 4 4に設けた測定電極 4 5によって検出される。
従来の細胞外電位測定デバイス 4 9では貫通孔 4 4が窪み 4 1の最深部に形成 されている。 したがって、 被験体細胞 4 7が窪み 4 1の中に保持された場合でも、 窪み 4 1の中間部に細胞膜が密着してしまうと貫通孔 4 4内の培養液 4 8 Bはゥ エル 4 0の培養液 4 8 Bと電気的に導通し、 精度の高い測定ができない。
さらに、 被験体細胞 4 7が窪み 4 1の中に保持され、 さらに貫通孔 4 4を覆う ように細胞膜が密着しているかどうかを調べることは不可能である。
被験体細胞 4 7を保持する窪み 4 1の直径は 1 0〜 3 0 程度であり、 貫通 孔 4 4の基板 4 2に開口する開口部 4 4 Bの直径が 1〜 5 mと 2つの径の開口 部 4 1 A、 4 4 Bが基板 4 2の両面にそれぞれ開口する。 この形状を正確に形成 するためには 2種類のマスクが必要であり、 第 1のマスクによるフォトリソダラ
'を行って窪み 4 1が形成された後、 第 2のマスクによる フォトリソグラフィのドライエッチングを行って貫通孔 4 4が形成される。 第 1のマスクによるドライエッチングを行った後に第 2のマスクを用いてドラ ィエッチングを行う際に 2つのマスクのァライメントずれが生じ、 さらに 2枚の マスクで別々にドライエッチングを行うので、 従来のデバイス 4 9は製造に手間 がかかり、 コスト高を招く。
また、 従来のデバイス 4 9では、 被験体細胞 4 7を窪み 4 1内に保持するため にゥエル 4 0側から培養液 4 8 Aを加圧するか、 貫通孔 4 4の培養液 4 8 Bを減 圧することの少なくとも一方が必要になる。 このとき同時に窪み 4 1側に培養液 4 8 Bが圧力差によって導入されることにより測定電極 4 5と接触することが必 要である。 この上下の圧力差を適当な値とすることで、 培養液 4 8 Bは貫通孔 4 4の開口部 4 4 Bでメニスカス形状を形成して安定する。
図 4 5に示す直線的な開口部 4 4 Bの形状では培養液 4 8 Bのメニスカス形状 を形成することができる適当な圧力差の値は狭い範囲である。 すなわち、 最適な 値から圧力差がわずかでも外れると、 メニスカス形状が破壊されて培養液 4 8 B の容量を一定にできない。 発明の開示
細胞外電位測定デバィスは 第 1面と第 1面の反対側の第 2面とを有するダイ ャフラムと、 ダイヤフラムの第 2面上に設けられた電極とを備える。 ダイヤフラ ムには、 第 1面に開口する開口部を有する窪みと、 窪みからダイヤフラムの第 2 面に貫通する貫通孔とが形成される。 貫通孔は窪みの最深部より窪みの開口部に 近い位置からダイヤフラムの第 2面に貫通する。 電極は、 ダイヤフラムの第 2面 上で貫通孔の開口部の周囲に設けられる。
このデバイスでは、 被験体細胞が窪み内の最深部に到達しなくても、 より確実 に貫通孔に被験体細胞の細胞膜が隙間無く密着できるので、 貫通孔内の培養液 ダイァフラムの上面側の培養液は遮断され、 細胞が活動する際に発する電気化学 的変化を検出電極によって効率よく検出できる。 図面の簡単な説明 図 1は本発明の実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの斜視図である 図 2は実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの平面図である。
図 3は実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの断面図である。
図 4は実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの要部拡大図である。 図 5は実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの要部拡大図である。 図 6は実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの動作を説明するための 要部拡大断面図である。
図 7は実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの要部拡大断面図である 図 8は実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの要部拡大断面図である 図 9 Aは実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの要部拡大断面図であ る。
図 9 Bは実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの要部拡大断面図であ る。
図 1 0は実施の形態 1における細胞外電位測定デバィスの断面図である。 図 1 1は実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの要部拡大図である。 図 1 2は実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すため の断面図である。
図 1 3は実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すため の断面図である。
図 1 4実施の形態 1における細胞外電位測定デバィスの製造方法を示すための 断面図である。
図 1 5実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すための 断面図である。
図 1 6 Aは実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すた めの断面図である。
図 1 6 Bは実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すた めの断面図である。
図 1 6 Cは実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すた めの断面図である。 図 1 6 Dは実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すた めの断面図である。
図 1 7は実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すため の断面図である。
図 1 8は実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すため の断面図である。
図 1 9実施の形態 1における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すための 断面図である。
図 2 0は実施の形態 1における他の細胞外電位測定デバイスの断面図である。 図 2 1は実施の形態 1におけるさらに他の細胞外電位測定デバイスの断面図で める。
図 2 2は図 2 1に示す細胞外電位測定デバイスの斜視図である。
図 2 3は図 2 1に示す細胞外電位測定デバイスの斜視図である。
図 2 4は実施の形態 1におけるさらに他の細胞外電位測定デバイスの断面図で ある。
図 2 5は本発明の実施の形態 2における細胞外電位測定デバイスの斜視図であ る。
図 2 6は実施の形態 2における細胞外電位測定デバイスの断面図である。 図 2 7は実施の形態 2における細胞外電位測定デバイスの要部拡大図である。 図 2 8 Aは実施の形態 2における細胞外電位測定デバイスの動作を説明するた めの要部拡大断面図である。
図 2 8 Bは実施の形態 2における細胞外電位測定デバイスの動作を説明するた めの要部拡大断面図である。
図 2 9は実施の形態 2における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すため の断面図である。
図 3 0は実施の形態 2における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すため の断面図である。
図 3 1は実施の形態 2における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すため の断面図である。 図 3 2は実施の形態 2における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すため の断面図である。
図 3 3 Aは実施の形態 2における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すた めの断面図である。
図 3 3 Bは実施の形態 2における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すた めの断面図である。
図 3 4は実施の形態 2における細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すため の断面図である。
図 3 5は実施の形態 2における他の細胞外電位測定デバイスの断面図である。 図 3 6は図 3 5に示す細胞外電位測定デバィスの要部拡大断面図である。 図 3 7 Aは図 3 5に示す細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すための断面 図である。
図 3 7 Bは図 3 5 Aに示す細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すための断 面図である。
図 3 8は図 3 5に示す細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すための断面図 である。
図 3 9は図 3 5に示す細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すための断面図 である。
図 4 0は図 3 5に示す細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すための断面図 である。
図 4 1は実施の形態 2におけるさらに他の細胞外電位測定デバイスの斜視図で ある。
図 4 2は図 4 1に示す細胞外電位測定デバイスの斜視図である。
図 4 3は実施の形態 2におけるさらに他の細胞外電位測定デバイスの斜視図で ある。
図 4 4は実施の形態 2におけるさらに他の細胞外電位測定デバイスの斜視図で ある。
図 4 5は従来の細胞外電位測定デバイスの断面図である。 発明を実施するための最良の形態
(実施の形態 1 )
図 1は本発明の実施の形態 1における細胞外電位測定デバイス 5 1の斜視図で ある。 図 2はデバイス 5 1の平面図であり、 図 3は図 2の線 3— 3におけるデバ イス 5 1の断面図である。 図 5はデバイス 5 1の要部拡大図である。 図 1 2〜図 2 1はデバイス 5 1の製造工程を説明するための断面図である。 図 2 2、 図 2 3 は実施の形態 1による他の細胞外電位測定デバイスの斜視図である。
図 1〜図 3において、 シリコンの基板 1には凹部 1 Aが形成され、 ダイアフラ ム 2が基板 1の一部として形成され、 ダイアフラム 2が基板 1の凸部 1 Cによつ て支えられている。 ダイアフラム 2の材質は基板 1と同じシリコンであり、 厚み は約 2 である。 窪み 3は半球形の曲面で構成されており、 基板 1の表面に 開口する開口部 3 Aの径は約 2 0 z mである。 窪み 3にはダイアフラム 2を貫通 する長さ方向に渡って断面形状が均一な貫通孔 4が連通する。 貫通孔 4は図 3に 示すように窪み 3の最深部 3 Bより開口部 3 Aに近い位置に設けられており、 ダ ィァフラム 2の厚み方向 2 Aに対して約 4 5 0 傾いている。 貫通孔 4は径が約 5 mの円形状または長径が約 5 mの楕円形状の断面を有する。
図 5に示すように、 面 2 B上に複数の検出電極 5 a、 5 bが貫通孔 4の開口部 に近接して形成されている。
以下、 細胞外電位測定デバイス 5 1の動作を説明する。 図 6〜図 9 Aはデバイ ス 5 1の動作を説明するための要部拡大断面図である。
まず、 培養液の物理化学的変化を検出する手順について説明する。 図 6、 図 7 はダイアフラム 2における窪み 3、 貫通孔 4、 検出電極 5 a、 5 bの拡大断面図 である。 図 7に示すように、 ダイアフラム 2の上面 2 C上を電解質の培養液 6で 満たすと、 窪み 3、 貫通孔 4は培養液 6によってこの順に満たされる。 ダイァフ ラム 2の上面 2 Aの上方の空間 6を加圧する、 またはダイアフラム 2の下面 2の 下方の空間を減圧すると培養液 6は貫通孔 4から外方へ飛び出す。 この時、 加圧 あるいは減圧における圧力を適度な値にすると貫通孔 4の先端においては開口部 より培養液 6がメニスカス形状を形成して安定する。
これにより、 培養液 6は検出電極 5 aおよび 5 bに安定的に接触する。 図 5に 示すように、 検出電極 5 aと 5 bは互いに電気的に絶縁されている。 しかし、 培 養液 6が貫通孔 4からメニスカス形状を形成することによって検出電極 5 a、 5 bに接触し、 電解質である培養液 6を介して電極 5 a、 5 bは電気的に接続され る。
検出電極 5 a、 5 b間の抵抗値は培養液 6のイオン濃度と関係している。 した がつて、 培養液 6のィオン濃度の変化は検出電極 5 a、 5 b間の抵抗値の変化に よって検出できる。 また、 培養液 6のメニスカス形状が不完全であれば検出電極 5 a、 5 bは十分接続されずこれらの間の抵抗値が大きくなる。 したがって、 こ の抵抗値を測定すれば培養液 6が貫通孔 4において適切なメニスカス形状を形成 しているかどうかがわかる。
次に、 被験体細胞の細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定す る手順について説明する。
図 8に示すように、 被験体細胞 8を培養液 6と共に投入し、 ダイアフラム 2の 面 2 C上方の空間を加圧する、 またはダイアフラム 2の面 2 Bの下方の空間を減 圧すると、 被験体細胞 8は培養液 6と共に窪み 3内へ引き込まれる。 さらに被験 体細胞 8は、 図 9 Aに示すように、 貫通孔 4側へ引き込まれ、 被験体細胞 8の細 胞膜は貫通孔 4の窪み 3に開口する開口部 4 Aを塞ぐように吸着される。 貫通孔 4の開口部 4 Aは窪み 3の最深部 3 Bより開口部 3 Aに近い位置に形成されてい る。 したがって、 被験体細胞 8が窪み 3の開口部 3 Aの径より若干大きい場合で は、 図 9 Aに示すように、 最深部 3 Bの近くに隙間 3 Cができ、 かつ被験体細胞 8が若千変形する。 しかし、 この場合でも、 被験体細胞 8は貫通孔 4の開口部 4 Aを塞ぐことができる。 つまり、 より確実に被験体細胞 8は窪み 3内に保持でき る。 窪み 3は曲面で構成されているので、 効率的に被験体細胞 8を保持できる。 被験体細胞 8が窪み 3内に保持された後に、 培養液 6が貫通孔 4の開口部 4 B で適当なメニスカス形状を形成するように、 ダイヤフラム 2の上下の圧力は検出 電極 5 a、 5 b間の抵抗値を測定しながら適切に調整できる。
被験体細胞 8が窪み 3内で貫通孔 4の開口部 4 Aを塞ぐように保持した後は、 被験体細胞 8への刺激を施す。 この刺激としては、 例えば化学薬品、 毒物などの 化学的な刺激に加え、 機械的変位、 光、 熱、 電気、 電磁波などの物理的な刺激な どがある。 被験体細胞 8がこれらの刺激に対して活発に反応する場合、 被験体細 胞 8は細胞膜が保有するイオンチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収 する。 この反応は被験体細胞 8が培養液 6と接している箇所で起こり、 貫通孔 4 内の培養液 6と被験体細胞 8の間でもイオン交換が行われる。 この結果として、 貫通孔 4内の培養液 6のイオン濃度は変化し、 前述したように検出電極 5 a、 5 bの間の抵抗値によってイオン濃度の変化を検出できる。
なお、 上記では検出電極 5 a、 5 bの 2つの電極を形成したが、 検出電極は 1 つでも測定は可能である。 図 5に示す電極 5 a、 5 bの代りに、 図 4に示すよう に、 ダイアフラム 2の凹部 1 Aの側の面 2 B上に金を主体とする検出電極 5が貫 通孔 4の開口部に近接して形成されている。 図 9 Bに示すように、 ダイアフラム 2の上面 2 Cの上方を満たす培養液 6と同電位の参照電極 5 cと検出電極 5との 間の電圧を測定することで、 貫通孔 4内のイオン濃度の変化を測定でき、 被験体 細胞 8の細胞外電位や細胞 8が発する物理化学的変化を測定できる。
なお、 イオン濃度の変化は抵抗値だけではなく、 電流値、 電荷量、 電位などの 別の物理量を測定することでも測定可能である。
図 1 0は、 実施の形態 1による他の細胞外電位測定デバイス 5 2の断面図であ る。 図 3に示すデバィス 5 1では、 貫通孔 4は窪み 3内の最深部 3 Bより開口部 3 Aに近い位置に設けられ、 ダイアフラム 2の厚み方向 2 Aに対して 4 5 ° の 角度で傾いている。 実施の形態 1において、 図 1 0に示すデバイス 5 2では、 貫 通孔 1 0 a、 1 0 bを窪み 3からダイヤフラム 2の下面 2 Bに設けられている。 デバイス 5 2では、 図 1 1に示すように、 金を主体とする検出電極 1 1 a、 1 1 bが貫通孔 1 0 a、 1 0 bにそれぞれ設けられる。 デバイス 5 2では貫通孔 1 0 a、 1 0 bは離れて形成されているので、 検出電極 1 1 a、 1 1 bを容易に形成 できる。
ダイアフラム 2の上面 2 Cの上方を培養液 6で満たすと、 窪み 3、 貫通孔 1 0 a、 1 0 bが培養液 6で満たされ、 ダイヤフラム 2の上下の圧力差によって培養 液 6が貫通孔 1 0 a、 1 0 bの先端でメニスカス形状を形成し、 検出電極 1 1 a、 1 1 bにそれぞれ接触する。 検出電極 1 1 a、 1 1 b間の抵抗値を測定すること により、 貫通孔 1 0 a、 1 0 bの先端で適当なメニスカス形状が形成されている かがわかり、 貫通孔 1 0 a、 1 0 b内のイオン濃度の変化もわかる。
被験体細胞 8を培養液 6と共に投入した後で検出電極 1 1 a、 l i b間の抵抗 値を測定することにより、 被験体細胞 8はその細胞膜が貫通孔 1 0 a、 1 0 bを 覆うように保持されているかどうかが判断できる。 たとえば貫通孔 1 0 aのみを 細胞膜が塞ぎ、 貫通孔 1 0 bは塞がれていない場合は、 検出電極 1 1 aとダイァ フラム 2の上部の培養液 6に接する参照電極 5 2 c間の抵抗値は高く、 検出電極 1 1 bと参照電極 5 2 c間の抵抗値は低くなる。 この場合は、 参照電極と検出電 極 1 1 aの間の抵抗値を測定することで、 後述する被験体細胞 8の活動を測定で きる。 逆に被験体細胞 8が貫通孔 1 1 bを塞ぎ、 かつ貫通孔 1 1 aを塞いでいな い場合は、 参照電極 5 2 cと検出電極 1 1 bの間の抵抗値を測定することで、 被 験体細胞 8の活動を測定できる。 このように、 被験体細胞 8の細胞膜が貫通孔 1 0 a , 1 0 bのいずれかを覆えば細胞 8の活動を測定できる。 したがって、 活動 を測定できる確率が高くなり、 デバイスの信頼性が増す。
さて、 被験体細胞 8の細胞膜が貫通孔 1 0 a、 1 0 bを覆うように保持されて いる状態で被験体細胞 8に外部より刺激を与えると、 被験体細胞 8が活動し、 貫 通孔 1 1 a、 1 1 b内のイオン濃度が変化するので被験体細胞 8の細胞外電位あ るいは細胞 8が発する物理化学的変化が測定できる。
また、 図 3、 図 1 0に示すデバイス 5 1、 5 2では、 窪み 3の最深部 3 Bより 開口部 3 Aに近い位置に貫通孔 4、 1 0 a , 1 0 bが形成されるが、 図 2 1に示 すように貫通孔 1 4を最深部 3 Bに容易に設けることができる。 この場合には、 被験体細胞 8が容易に最深部 3 Bに到達できるように被験体細胞 8に応じて窪み 3の径、 形状を適切に調整する必要がある。
実施の形態 1では貫通孔 4、 1 0 a、 1 0 bの断面は丸形状あるいは楕円形状 であるが、 矩形あるいは U字形状でもよい。
図 2 2、 図 2 3は貫通孔 1 5、 1 7を矩形、 U字形状にした細胞外電位測定デ バイスの斜視図である。 図 2 2に示すように、 貫通孔 1 5が矩形の場合は窪み 1 6の形状は半円筒状に丸みを持った形状となる。 図 2 3に示すように貫通孔 1 7 が U字形状の場合には窪み 1 8の形状はほぼ半球状になる。
半円筒形状の窪み 1 6は被験体細胞 8の固定形状が細長い場合 （例えば、 モノ ァラガイ由来の神経節細胞） に最適である。
半球状の窪み 1 8に U字形状の断面の貫通孔 1 7は、 被験体細胞 8が変形しや すい場合に有効である。 被験体細胞 8が変形しやすい場合には、 丸形状の断面の 貫通孔 4を通り抜ける可能性がある。 つまり、 U字形状の貫通孔 1 7内を満たす 培養液 6の容量をさほど減らすことなく、 貫通孔 1 7の窪み 1 8に開口する開口 部 1 7 Aの最小幅部分を小さくできる。 したがって、 被験体細胞 8が貫通孔 1 7 内に進入して破壊されることが防止できる。 なお、 貫通孔 1 7の断面は複数の U 字形状、 複数の矩形形状、 あるいはこれらの組み合わせなどの形状でもよい。 なお、 窪み 3、 1 6、 1 8、 貫通孔 4、 1 5、 1 7の径は被験体細胞 8の大き さ、 形状、 性質によって決められる。 窪み 3、 1 6、 1 8の径を 1 0〜1 0 0 mとし、 貫通孔 4、 1 5、 1 7の径を 1〜1 0 mにすることによって 5〜1 0 0 z m程度の径の被験体細胞 8を測定できる。
次に実施の形態 1による細胞外電位測定デバイス 5 1の製造方法について説明 する。 図 1 2〜図 2 1は実施の形態 1における細胞外電位測定デバィス 5 1の製 造方法を説明するための断面図である。
図 1 2に示すように、 シリコンからなる基板 1の下面 1 B上にレジストマスク 1 2を形成した後、 図 1 3に示すように、 下面 1 Bから所定の深さだけエツチン グすることによって凹部 1 Aを形成し.. ダイアフラム 2の下面 2 Bを形成する。 ダイアフラム 2は基板 1の凸部 1 Cによって支えられている。 その後、 レジス卜 マスク 1 2は除去する。
次に、 図 1 4に示すようにダイアフラム 2の上面 2 C上にレジストマスク 1 3 を形成する。 レジス卜マスク 1 3のエッチングホール 1 3 Aの形状は所望する貫 通孔 4の断面形状とほぼ同じである。
その後、 図 1 5に示すように、 上面 2 Cからダイヤフラム 2を、 エッチングを 促進するガスのみによりエッチングする。 シリコンの基板 1に対しては、 エッチ ングを促進するガスには S F 6、 C F 4、 X e F 2などを用いることができる。 こ れらのガスは基板 1の深さ方向すなわちマスク 1 3に直角な方向だけでなく、 横 方向すなわちマスク 1 3に平行な方向へのエッチングも促進する。 これによつて、 エッチングされた部分は、 図 1 5に示すように、 マスク 1 3の開口部 1 3 Aを中 心とする半球形となり、 窪み 3が形成される。
次に、 図 16Aに示すように、 基板 1をエッチングガスのイオンの進行方向 6 1に対して 45° 傾けてドライエッチングする。 エッチングガスとしてエッチ ングを促進するガスとエッチングを抑制するガスとを交互に'用いる。 エッチング を促進するガスとしては Xe F2、 CF4、 SF6などが使用できる。 エッチング を抑制するガスとしては CHF3、 C4F8などがある。 エッチングを抑制するガ スで基板 1をエッチングすることで、 図 16Cに示すように、 エッチングされた 壁面に CF2のポリマ一である保護膜 31が形成されるので、 ドライエッチング はエッチングホール 13 Aから方向 61にのみ進行し、 貫通孔 4は方向 61に形 成される。
エッチングがエッチングホール 13 Aから方向 61にのみ進行することを詳し く説明する。
まず、 エッチングを促進するガスによって、 図 16 Bに示すように、 基板 1を 少しエッチングする。 この工程では、 外部コイルによる誘導結合法によって生成 されたプラズマ中で高周波を基板 1に加える。 これにより、 基板 1に発生するマ ィナスのバイアス電圧によりエッチングガスのプラズマ中のプラスイオンである S F 5 +や C F 3 +が基板 1に向かって衝突するので、 基板 1は方向 61に優先的 にドライエッチングされる。 しかしながらプラズマ中のプラスイオンの進行方向 には方向 61と平行ではない成分も若干存在するので、 ダイヤフラム 2にはエツ チングホール 13 Aよりわずかに大きい径の孔 3 Dがこのエツチングで形成され る。
この後、 エツチングを抑制するガスによつて保護膜 31を図 16 Cに示すよう に基板 1のエッチングされた部分上に形成する。 この工程では、 基板 1に高周波 を加えない。 これにより基板 1にはバイアス電圧が発生しないので、 保護膜 31 の材料となる CF+が偏向を受けず、 基板 1のエッチングされた部分の壁面へ保 護膜 31が均一に形成される。
次にエッチングを促進するガスによって図 16 Dのように基板 1を再び少しェ ツチングする。 この工程では再び基板 1に高周波を加える。 これにより基板 1に はバイアスがかかり、 方向 61と平行に動くエッチングガスのイオンが増える。 このイオンはエネルギーが高く、 エッチングされた部分の底面に形成された保護 膜 3 1は方向 6 1と平行に動くイオンによってエッチングされる。 しかし、 方向 6 1と平行ではない方向に動くイオンはエネルギーが低いので壁面に形成された 保護膜 3 1を容易には除去できない。 このようにエッチングを促進するガスによ るエッチングとエッチングを抑制するガスによるエッチングとを交互に行う工程 を繰り返すことで、 エッチングがエッチングホール 1 3 Aから方向 6 1にのみ進 行し、 エッチングホール 1 3 Aから方向 6 1にのみ延びる貫通孔 4が形成できる。 なお、 上記の製造方法の結果として貫通孔 4の壁面には図 1 6 Dに示すように段 差を有するが、 この段差は貫通孔 4の径に比べて小さいので実質的に無視でき、 貫通孔 4はほぼ方向 6 1のみに延びる。
この工程では、 エツチングはェッチングホール 1 3 Aからガスのィオンの進行 方向 6 1にのみ進行し、 図 1 7に示すように、 ダイァフラム 2の厚み方向 2 Aに 対して 4 5 ° 傾いて延びる貫通孔 4が形成され、 貫通孔 4は窪み 3の最深部 3 Bより開口部 3 Aに近い位置で形成される。 なお、 基板 1を斜めに傾けてエッチ ングするので、 貫通孔 4の断面形状はレジストマスク 1 3のエッチングホ一ル 1 3 Aの形状と異なる。 エッチングホ一ル 1 3 Aの形状を、 基板 1を傾ける方向に 長軸を有する楕円形状にすることで、 貫通孔 4の断面形状を円形にできる。
なお、 基板 1を傾ける角度はエッチングホール 1 3 Aの形状とレジストマスク 1 3の厚みによって制限される。 例えば、 エッチングホール 1 3 Aの径が 1 m でレジス卜マスク 1 3の厚さが 1 mの場合は、 幾何的な制限から方向 6 1はダ ィャフラム 2の厚さ方向 2 Aに対し 4 5 ° よりも小さな傾きでなければ基板 1 はエッチングできない。
基板 1を傾けてエッチングしない場合は、 図 2 1に示すように、 窪み 3の最深 部 3 Bに貫通孔 1 4が形成される。 被験体細胞 8が窪み 3の最深部 3 Bまで容易 に到達する大きさを有する場合には、 貫通孔 1 4は図 2 1に示す位置に形成され てもよい。
レジストマスク 1 3のエッチングホール 1 3 Aは前述の丸形や楕円形の他に矩 形、 U字形あるいはこれらを組み合わせた形状でもよい。
エッチングホール 1 3 Aの形状が矩形の場合には、 エッチングを促進するガス によって、 図 2 2に示すように、 丸みのある上面と下面を有する略半円筒形状の 窪み 1 6が得られ、 貫通孔 1 5の断面はエッチングホール 1 3 Aと同じ矩形とな る。 さらに、 矩形の長辺の長さは円形状の径より長くなるので、 1つの貫通孔に 複数の検出電極を容易に形成できる。
また、 エッチングホール 1 3 Aの形状が U字形の場合には、 エッチングを促進 するガスはホール 1 3 Aから全方向に基板 1をエッチングするので、 図 2 3に示 すように、 半球形の窪み 1 8が得られる。 また図 3に示す貫通孔 4と同様に、 貫 通孔 1 7の断面はエッチングホール 1 3 Aと同じ U字形となる。
なお、 図 1 0と図' 1 1に示すように 1つの窪み 3に複数の貫通孔を形成する場. 合には、 図 1 9に示すように、 貫通孔 4を形成する工程を基板 1を傾ける角度を 変えてエッチングすることで複数の貫通孔が形成される。 レジストマスク 1 3は エッチング後に除去する。
次に、 図 1 8に示すように基板 1の凹部 1 Aの側の面 1 B上に薄膜形成工程に より、 金を主体とする検出電極 5 a、 5 bを貫通孔 4に近接して形成する。 基板 1の面 1 Bには凸凹があるが、 このような凸凹のある面でもフォトレジス卜の塗 布、 露光、 パ夕一ニングは可能である。 しかし、 極めて精密な電極が必要な場合 には、 基板 1にダイアフラム 2を形成後、 図 2 0に示すように、 ダイアフラム 6 2の凹部 1 Aの側の面 6 2 Bに窪み 3を形成してもよい。 機械的または化学的な 方法で面 6 2 Cは面 6 2 Bより精密に加工できる。 検出電極 5 a、 5 bは高い精 度が必要であり、 一般に窪み 3は検出電極 5 a、 5 bより精密でなくてもよいの で、 この方法によりデバイスが容易に製造できる。
なお、 図 1 0に示すように、 窪み 3に貫通孔 1 0 a、 1 0 bが形成されている 場合にも、 上記と同様に通常の薄膜形成工程によって、 図 1 1に示すように検出 電極 1 1 a、 1 1 bを形成する。 この場合は、 一般に図 3に示す 1つの貫通孔 4 が窪み 3に連通する場合の電極 5 a、 5 bより精度が要求されないので、 電極 1 l a、 1 1 は電極5 &、 5 bより容易に形成できる。
実施の形態 1では、 基板 1に凹部 1 Aを形成してダイアフラム 2の下面 2 Bを 形成し、 ダイアフラム 2を基板 1の凸部 1 Cによって支える構造を形成した後、 窪み 3、 貫通孔 4を形成するが、 窪み 3、 貫通孔 4を形成した後、 基板 1に凹部 1 Aを形成してダイアフラム 2の下面 2 Bを形成し、 ダイアフラム 2を基板 1の 凸部 1 Cによって支える構造を形成しても、 同じ構成の細胞外電位測定デバイス を得られる。
図 2 4は実施の形態 1におけるさらに他の細胞外電位測定デバイスの断面図で ある。 図 1〜図 2 3に示す細胞外電位測定デバイスでは、 基板 1としてシリコン を用いる。 細胞外電位測定デバイスはシリコンよりなる基板 1の代りに、 図 2 4 に示すように、 ダイヤフラム 2となるシリコン層 8 2 Aと酸化シリコン層 8 3と シリコン層 8 2 Bを有する S O I基板 8 1を用いてもよい。 ダイヤフラム 2の下 面 2 Bの周縁部上に酸化シリコン層 8 3が設けられ、 酸化シリコン層 8 3上にシ リコン層 8 2 Bが設けられる。 S O I基板 8 1では、 酸化シリコン層 8 3でエツ チングが止まるので、 基板 8 1の凹部 8 1 Aをエッチングによって形成する場合 においても、 ダイアフラム 8 2に貫通孔をエッチングによつて形成する場合にお いても、 高精度な厚みのダイアフラム 2や貫通孔 4が容易に得られる。 (実施の形態 2 )
図 2 5は本発明の実施の形態 2における細胞外電位測定デバイス 1 5 1の斜視 図である。 図 2 6は図 2 5に示すデバイス 1 5 1の線 2 6— 2 6での断面図であ る。 図 2 7はデバイス 1 5 1の要部拡大図である。
図 2 5〜図 2 7において、 シリコンの基板 1 0 1には凹部 1 0 1 Aが形成され、 ダイァフラム 1 0 2の下面 1 0 2 Aが形成される。 ダイアフラム 1 0 2は基板 1 0 1の凸部 1 0 1 Cによって支えられている。 ダイアフラム 1 0 2の材質は基板 1 0 1と同じシリコンであり、 厚みは約 2 5 である。 窪み 1 0 3は半球形の 曲面で構成され、 基板 1 0 1の表面に開口する開口部 1 0 3 Aの径は約 2 0 πι である。 窪み 1 0 3には長さ方向に渡って断面形状が均一な貫通孔 1 0 4がダイ ァフラム 1 0 2を貫通するように連通している。 貫通孔 1 0 4は窪み 1 0 3の最 深部 1 0 3 Βに設けられており、 径が 5 mの円または長径が 5 mの楕円形状 の断面を有する。
貫通孔 1 0 4の窪み 1 0 3から反対側には面 1 0 2 Bに向って広がる窪み 1 0 6が形成されている。 ダイアフラム 1 0 2の凹部 1 Aの側の面 1 0 2 A上には、 図 2 7に示すように、 金を主体とする検出電極 1 0 5 a、 1 0 5 bが窪み 1 0 6 の開口部 1 0 6 Aに近接して形成されている。
次に、 細胞外電位測定デバイス 1 5 1の動作について説明する。 図 2 8 Aはデ バイス 1 5 1の動作を説明するための要部拡大断面図である。
まず、 培養液の物理化学的変化を検出する手順について説明する。 図 2 8 Aに 示すように、 ダイアフラム 1 0 2の下面 1 0 2 Aの反対の上面 1 0 2 Bの上方を 電解質である培養液 1 0 7で満たすと、 窪み 1 0 3と貫通孔 1 0 4は培養液 1 0 7によってこの順に満たされる。 ダイアフラム 1 0 2の上面 1 0 2 Bの上方の空 間を加圧する、 またはダイアフラム 1 0 2の下面 1 0 2 Aの下方の空間を減圧す ると培養液 1 0 7は貫通孔 1 0 4から外方へ飛び出す。 この時、 加圧あるいは減 圧における圧力を適度な値にすると窪み 1 0 6の開口部 1 0 6 Aに培養液 1 0 7 がメニスカス形状を形成して安定する。
これにより、 培養液 1 0 7は検出電極 1 0 5 aおよび 1 0 5 bに安定的に接触 する。 検出電極 1 0 5 aと 1 0 5 bは電気的に互いに絶縁されている。 しかし、 培養液 1 0 7が窪み 1 0 6からメニスカス形状を形成することによって検出電極 1 0 5 a , 1 0 5 bに接触し、 電解質である培養液 1 0 7を介して電極 1 0 5 a 1 0 5 bは電気的に接続される。
検出電極 1 0 5 a、 1 0 5 b間の抵抗値は培養液 1 0 7のイオン濃度と関係し ている。 したがって、 培養液 1 0 7のイオン濃度の変化は検出電極 1 0 5 a、 1 0 5 b間の抵抗値の変化によって検出できる。 また、 培養液 1 0 6のメニスカス 形状が不完全であれば検出電極 1 0 5 a、 1 0 5 bは十分接続されず、 これらの 間の抵抗値が大きくなる。 したがって、 この抵抗値を測定すれば培養液 1 0 7が 窪み 1 0 6において適切なメニスカス形状を形成しているかどうかがわかる。 窪み 1 0 6が設けられていることにより貫通孔 1 0 4からダイヤフラム 1 0 2 の下面 1 0 2 Aに開口する部分は直線的な形状ではなく、 直線的な部分と窪み 1 0 6の曲面で構成される段差のある形状を有する。 このような構造によって培養 液 1 0 7は貫通孔 1 0 4を通過した後、 窪み 1 0 6内でメニスカスを形成しやす くなる。 これは窪み 1 0 6が曲面を有するので培養液 1 0 7の表面張力が増大し、 上下の圧力差が多少変動しても、 圧力均衡が保たれるからである。 つまり、 一度 メニスカス形状が形成されると多少の圧力が変動しても、 窪み 1 0 6により培養 液 1 0 7のメニスカス形状が安定する。 この現象は流体力学用の有限要素法解析 によっても確認できた。 このメニスカス形状が安定であるということは貫通孔 1 0 4、 窪み 1 0 6内の培養液 1 0 7の量が安定し、 より安定にイオン濃度を測定 できる。
検出電極 1 0 5 a、 1 0 5 bは図 2 6に示すように窪み 1 0 6内にまで延びて 形成されているので、 培養液 1 0 7のメニスカス形状によって培養液 1 0 7と安 定に接続される。
次に、 被験体細胞の細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定す る手順について詳細に説明する。
図 2 8 Aに示すように、 被験体細胞 1 0 8を培養液 1 0 7と共に投入し、 ダイ アフラム 1 0 2の上面 1 0 2 Bの上方の空間を加圧もしくはダイアフラム 1 0 2 の下面 1 0 2 Aの下方の空間を減圧すると、 被験体細胞 1 0 8および培養液 1 0 7は共に窪み 1 0 3の内へ引き込まれる。 窪み 1 0 3は曲面で構成されているの で、 被験体細胞 1 0 8を効率的に保持できる。
被験体細胞 1 0 8が窪み 1 0 3の内に保持された後に、 培養液 1 0 7が窪み 1 0 6の開口部 1 0 6 Aで適当なメニスカス形状を形成するようにダイヤフラム 1 0 2の上下の圧力を調整する。 圧力は 前述のように、 検出電極 1 0 5 a 1 0 5 b間の ί氐抗値を測定しながら調整できる。
被験体細胞 1 0 8を窪み 1 0 3の内で貫通孔 1 0 4の開口部を塞ぐように保持 した後に、 被検体細胞 1 0 8に刺激を与える。 この刺激としては、 例えば化学薬 品、 毒物などの化学的な刺激に加え、 機械的変位、 光、 熱、 電気、 電磁波などの 物理的な刺激などがある。
被験体細胞 1 0 8がこれらの刺激に対して活発に反応する場合、 被験体細胞 1 0 8は細胞膜が保有するイオンチャネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収 する。 この反応は被験体細胞 1 0 8が培養液 1 0 7と接している箇所において起 こり、 貫通孔 1 0 4の内および窪み 1 0 6の培養液 1 0 7 Αと被験体細胞 1 0 8 の間でもイオン交換が行われる。 この結果として貫通孔 1 0 4の内および窪み 1 0 6の内の培養液 1 0 7 Aのイオン濃度が変化するので、 検出電極 1 0 5 a、 1 05 bによってその変化を測定できる。
なお、 図 28 Aでは、 検出電極は 105 a、 105 bで変化を測定したが、 1 つの検出電極でも変化を測定できる。 図 28 Bは実施の形態 2における細胞外電 位測定デバイスの動作を説明するための要部拡大断面図である。 ダイアフラム 1 02の上面 102 Bの上方を満たす培養液 107と同電位の参照電極 105 cと 窪み 106の近傍に設けた単体の検出電極 105との間の電圧を測定することに より、 貫通孔 104の内および窪み 106の内の培養液 107 Aのイオン濃度の 変化を測定でき、 被験体細胞 108の細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学 的変化を測定できる。
なお、 イオン濃度の変化は抵抗値だけではなく、 電流値、 電荷量、 電位などの 別の物理量を測定することでも測定可能である。
また、 図 35、 図 36に示すように、 貫通孔 109 a、 109 bは窪み 103 の内の最深部 103 Bより開口部 103 Aに近い位置に設けられ、 窪み 103か らダイアフラム 102の厚み方向 102 Cに対して 45° の角度で延びている。 このような構成により複数の貫通孔 109 a、 109 bを窪み 103の内に設け ることができ、 さらに貫通孔 109 a、 109 bのそれぞれのダイヤフラム 10 2から開口する部分に面 102 Aに向って広がる窪み 110 a 110 bを設け ることができる。 図 36に示すように、 金を主体とする検出電極 111 a、 11 1 bをそれぞれの窪み 110 a、 110 bに設けられる。 なお、 窪み 110 a、 110 bは離れて形成されているので検出電極 111 a、 111 bを容易に形成 できる。
上記のデバイスにおいて、 ダイアフラム 102の上面 102の上方を培養液 1 07で満たすと、 窪み 103、 貫通孔 109 a、 109 bが培養液 107 Aで満 たされる。 ダイヤフラム 102の上下の圧力差によって培養液 107 Aが窪み 1 10 a、 110 bの先端でメニスカス形状を形成し、 検出電極 111 a、 111 bにそれぞれ接触する。 検出電極 111 a、 111 b間の抵抗値を測定すること により、 培養液 107 Aが窪み 1 10 a、 110 bの先端で適当なメニスカスが 形成されているかどうかがわかり、 貫通孔 109 a、 109 bおよび窪み 110 a、 110 bの内のイオン濃度の変化も測定できる。 被験体細胞 108 (図示せず） を培養液 107と共に投入した場合は、 貫通孔 109 a, 109 bを被験体細胞 108がその細胞膜が覆うように保持されてい るかどうかが判断できる。 例えば、 貫通孔 109 aのみを細胞膜が塞ぎ、 貫通孔 109 bは塞がれていない場合は、 検出電極 111 aとダイアフラム 102の上 部の培養液 107からとる参照電極 111 c間の抵抗値は高く、 検出電極 111 bと参照電極 111 c間の抵抗値は低くなる。
上記の状態で被験体細胞 108に刺激を与えると被験体細胞 108が活動し、 貫通孔 109 a、 109 bの内および窪み 110 a、 11 Obの培養液のイオン 濃度が変化するので、 被験体細胞 108の細胞外電位あるいは細胞が発する物理 化学的変化が測定できる。
また、 窪み 103は、 被験体細胞 108が容易に最深部 103 Bまで到達でき るように被検体細胞 108に応じて適当な大きさ、 形状に容易に形成できる。 実施の形態 2では貫通孔 104、 109 a、 109 bの断面の形状は丸形状あ るいは楕円形状であるが、 矩形あるいは U字形状でもよい。 図 41、 図 42は貫 通孔 115、 117を矩形、 U字形状にした細胞外電位測定デバイスの斜視図で ある。 図 41に示すように、 貫通孔 115が矩形の場合は窪み 116の形状は上 下面が丸い略半円筒形状となる。 図 42に示すように、 貫通孔 117が U字形状 の場合には窪み 1 18の形状はほぼ半球状になる。
略半円筒形状の窪み 1 16は被験体細胞 108が細長い場合 （例えば、 モノア ラガイ由来の神経節細胞） に最適である。
半球状の窪み 118と断面が U字形状の貫通孔 117は、 例えば貫通孔 104 では通り抜けてしまうような変形しゃすい被験体細胞 108に有効である。 つま り、 貫通孔 117を U字形状にすると、 貫通孔 117を満たす培養液 107の量 をさほど減らすことなくその開口部 117 Aの最小幅部分を小さくできる。 した がって、 被験体細胞 108が貫通孔 117の内に進入して破壊されることが防止 できる。
窪み 103、 1 16、 1 18、 貫通孔 104、 1 15、 117の大きさは被験 体細胞 108の大きさ、 形状、 性質によって決められる。 窪み 103、 116、 118の径を 10〜： L 00 mとし、 貫通孔 104、 115、 117の径を1〜 1 0 mにすることによって 5〜1 0 0 m程度の大きさの被験体細胞 1 0 8の 反応を測定できる。
次に、 実施の形態 2による細胞外電位測定デバイスの製造方法について説明す る。 図 2 9〜図 3 4は図 2 6に示す細胞外電位測定デバイスの製造方法を説明す るための工程断面図である。
図 2 9に示すように、 シリコンからなる基板 1 0 1の面 1 0 1 Aにレジストマ スク 1 1 2を形成した後、 図 3 0に示すように、 面 1 0 1 Aから所定の深さだけ エッチングすることによって凹部 1 0 1 Bを形成して、 基板 1 0 1の上部に凸部 1 0 1 Cに支えられているダイアフラム 1 0 2を形成する。 その後レジストマス ク 1 1 2は除去する。
次に、 図 3 1に示すように、 ダイアフラム 1 0 2の外表面 1 0 2 B上にレジス トマスク 1 1 3を形成する。 レジストマスク 1 1 3のエッチングホール 1 1 3 A の形状は所望する貫通孔 1 0 4の形状とほぼ同じにする。
その後、 図 3 2に示すように、 ダイァフラム 1 0 2をエッチングホール 1 1 3 Aから、 エツチングを促進するガスをェッチングガスとしてドライエツチングす る。
シリコンの基板 1 0 1に対しては., エッチングを促進するガスには S F 6 . C F 4 , X e F 2などを用いることができる。 これらのガスはシリコンの基板 1 0 1をレジストマスク 1 1 3と直角な方向だけでなく、 レジストマスク 1 1 3と平 行な方向へのエッチングも促進する。 これによつて、 基板 1 0 1は図 3 2に示す ようにエッチングホール 1 1 3 Aを中心に半球形にエッチングされ、 窪み 1 0 3 が形成される。
次に、 図 3 3 Aに示すように基板 1 0 1の窪み 1 0 3から孔 1 0 4を形成する。 孔 1 0 4はエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスとを交互に用 いるドライエッチングにより形成され、 ダイアフラム 1 0 2を貫通する前にエツ チングを終了する。 エッチングを抑制するガスとしては C H F 3、 C 4 F 8を用い ることができる。 エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを使用 する時間比を調整することで、 実施の形態 1と同様に基板 1 0 1のレジストホー ル 1 1 3 Aの直下の部分のみをドライエッチングできる。 この工程により、 窪み 1 0 3と孔 1 0 4の壁面上には、 図 3 3 Bに示すように、 エッチングを抑制する ガスにより窪み 1 0 3の内面 1 0 3 C上と孔 1 0 4の壁面 1 0 4 A上に保護膜 1 3 1が形成されている。
孔 1 0 4の断面形状は矩形あるいは U字状もしくはこれらの組み合わせを用い ることができる。
次に、 図 3 4に示すように、 エッチングを促進するガスのみを用いて基板 1 0 1をエッチングする。 窪み 1 0 3および孔 1 0 4の壁面には保護膜 1 3 1が形成 されているので、 エッチングを促進するガスのみを用いてエッチングすると貫通 孔 1 0 4のダイアフラム 1 0 2の下面 1 0 2 A側のみがエッチングされて窪み 1 0 6が形成される。
保護膜 1 3 1の厚みが不十分な場合には、 窪み 1 0 3、 孔 1 0 4の壁面もエツ チングされてしまうので、 ？し 1 0 4を形成した後、 その壁面にエッチングを抑制 するガスで保護膜 1 3 1を厚く形成してもよい。 保護膜 1 3 1の厚さはエツチン グを促進するガスとエッチングを抑制するガスの時間比を変えることで調整でき る。 このようにして、 曲面で構成される窪み 1 0 3、 窪み 1 0 6およびこれらを 接続する貫通孔 1 0 4が形成される。
その後、 図 2 6に示すように 窪み 1 0 6の近傍に検出電極 1 0 5 a、 1 0 5 bを通常の薄膜形成手段によって形成する。 窪み 1 0 6は貫通孔 1 0 4より大き ぃ径を有するので、 検出電極 1 0 5 a、 1 0 5 bを形成する際に高い精度を要求 されない。 したがって、 容易に検出電極 1 0 5 a、 1 0 5 bを製造できる。
次に、 図 3 5に示す細胞外電位デバイスの製造方法について説明する。 図 3 7 A〜図 4 0は図 3 5に示す細胞外電位測定デバイスの製造方法を示すための断面 図である。
まず、 図 2 9〜図 3 2に示した製造工程と同じ方法で窪み 1 0 3を形成する。 次に、 図 3 7 Aに示すように、 基板 1 0 1の上面 1 0 2 Bをエッチングガスの イオンの進行方向 1 6 1に対して 4 5 ° に傾けて基板 1 0 1を、 エッチングを 促進するガスとエツチングを抑制するガスを交互に用いてドライエツチングする。 エッチングを促進するガスとしては X e F 2、 C F 4、 S F 6を用いることができ る。 エッチングを抑制するガスとしては C H F。、 C F 8を用いることができる。 これらのガスを交互に用いて基板 101をエッチングすることで、 基板 10 1の エッチングされた部分の壁面に、 図 37 Bに示すように CF2のポリマーである 保護膜 132が形成される。 したがって、 基板 1 01をレジストマスク 1 1 3の エッチングホール 1 13 Aの下方のみにエッチングでき、 貫通孔 109 aを形成 できる。
基板 101をエッチングホール 1 13 Aの下方のみに実施の形態 1と同様にェ ツチングできるので、 ここでは詳しい説明は省略する。
なお、 貫通孔 109 aのエッチングの際に基板 101を傾ける角度はエツチン グホール 1 13 Aの形状とレジストマスク 1 13の厚みによって制限される。 例 えば、 エッチングホール 1 13 Aの径が 1 mでレジストマスク 1 13の厚さが 1 /imの場合は、 幾何的な制限から方向 161は基板 101の厚さ方向 102 C に対し 45° よりも小さな傾きでなければ基板 1 0 1はエッチングできない。 次に、 エッチングを促進するガスのみを用いて基板 101をエッチングすると.. エツチングを抑制するガスによって窪み 103および孔 109 aの壁面には保護 膜 132が形成されているので、 孔 109 aのダイアフラム 102の下面 102 A側のみがエッチングされて、 図 39に示すように、 窪み 1 10 aが形成される。 その後、 図 40に示すように、 基板 10 1を方向 16 1に対して傾け、 厚さ方 向 102 Cについて図 38に示す方向 161の対称な方向 162に進行するエツ チングを促進するガスのイオンとエッチングを抑制するガスのイオンとを交互に 用いて孔 109 bを形成する、 その後、 エッチングを促進するガスのみを用いて 窪み 1 10 bを形成する。 方向 162は、 方向 102 Cについて方向 161と対 称でなくても、 方向 1 61と異なっていても同様の効果が得られる。 レジス卜マ スク 1 13はエツチング後に除去する。
次に、 図 35に示すように基板 101の下面から通常の薄膜形成工程により、 金を主体とする検出電極 1 1 1 a、 1 1 1 )を窪み1 10 &、 1 1 O bに近接し て形成する。 窪み 103に連通する形成された貫通孔 109 a、 109 bは図 2 7に示す電極 105 a、 105 bより低い精度でよいので、 より簡単に電極 1 1 1 a、 1 1 1 bは形成できる。
このような方法によって、 図 35に示すような窪み 103に貫通孔 109 a、 109 bおよび窪み 1 10 a、 1 1 O bを形成できる。 このエッチング工程にお いて、 エッチングガスのプラズマ中のイオンの進行方向 161と基板 101の厚 さ方向 1 02 Cとのなす傾斜角度は 45° であるが、 この角度は 89° 以下が 貫通孔 109 a、 109 b、 窪み 1 10 a、 1 10 bを形成することが生産性か ら好ましく、 より好ましくは 20° 〜70° の範囲で傾斜させてこれらを形成 できる。
このように、 複数の貫通孔 109 a、 109 bを設けることによって、 被験体 細胞 108が窪み 103の内に保持された時に、 より確実に細胞 108が貫通孔 109 a, 109 bを覆う。 したがって、 窪み 1 10 a、 1 1 O bに設けられた 検出電極 11 1 a、 1 1 1わにより、 より確実に細胞外電位を測定できる。 窪み 103および貫通孔 109 a、 109 bの大きさは測定する被験体細胞の 大きさ、 形状、 性質によって決められる。 窪み 103の径を 10〜100 m、 貫通孔 109 a, 109 bの径を:！〜 10 mにすることによって 5〜 100 m程度の径の細胞の細胞外電位を測定できる。
窪み 1 10 a、 1 10 bの径は貫通孔 109 a、 109 bの径と培養液 107 の流体特性によって決められる。 有限要素法による流体解析の結果、 培養液 10 7が水と同じ流体特性を有する場合、 貫通孔 109 a、 109 bの径が 5 mで あり、 窪み 1 10 a、 1 10 bの径を 10 mとすると培養液 107はメニスカ ス形状を安定して形成することが確認できた。
図 44は実施の形態 2によるさらに他の細胞外電位測定デバィスである。 図 3 に示す実施の形態 1による細胞外電位測定デバィス 51の貫通孔 104の面 2 B へ開口する部分に、 図 26に示す窪み 106と同様の窪み 170を形成してもよ い。 窪み 170の周辺には図 3に示す電極 105 a、 105 bと同様の電極 1 7 1 a、 171 bが形成される。
図 43は実施の形態 2におけるさらに他の細胞外電位測定デバイスの断面図で ある。 図 25〜図 42に示す細胞外電位測定デバイスでは基板 101としてシリ コン基板 1を用いる。 図 43に示すデバイスでは、 シリコンよりなる基板 1の代 りに、 シリコン層 183 A、 183Bと酸化シリコン層 184とを有する SO I 基板 181を用いてもよい。 ダイヤフラム 182となるシリコン層 183 Aの下 面 182 Bの周縁部上に酸化シリコン層 183Aが設けられ、 酸化シリコン層 1 83 A上にシリコン層 182 Bが設けられる。 酸化シリコン層 184でドライエ ツチングが止まるので、 ダイアフラム 182の厚みを高精度にでき、 かつ貫通孔 104をエッチングによってより容易に形成できる。
なお、 実勢の形態 2による電極 105 a、 105 b, l l l a、 111 b, 1 71 a、 17 l bは窪み 106、 170窪み 110 a、 11 Obの内壁上にまで 延びているが、 図 3に示す実施の形態 1の電極 5 a、 5 bと同様に、 窪みに内壁 にまで延びずダイヤフラム 102、 2の下面 102A、 2Aのみに形成されても よい。
実施の形態 2では、 基板 1に凹部 101 Aを形成してダイアフラム 102の下 面 02 Aを形成し、 ダイアフラム 102を基板 1の凸部 101 Cによって支える 構造を形成した後、 窪み 103、 貫通孔 104を形成する。 しかし、 窪み 103、 貫通孔 104を形成した後、 基板 1に凹部 101 Aを形成してダイアフラム 10 2の下面 102 Aを形成し、 ダイアフラム 102を基板 1の凸部 101 Cによつ て支える構造を形成しても、 同じ構成の細胞外電位測定デバイスが得られる。 なお、 実施の形態 1、 2によるデバイスではダイヤフラム 2、 102以外の基 板 1、 101の部分は上記で説明した形状以外でも .. ダイヤフラム 2、 102の 形状が実施の形態 1、 2によるデバイスと同じであれば同様の効果を有する。 産業上の利用可能性
本発明の細胞外電位測定デバイスは、 細胞が活動する際に発する物理化学的変 化を検出電極によって効率よく安定に測定できる。

Claims

請求の範囲
1 . 第 1面と前記第 1面の反対側の第 2面とを有し、 前記第 1面に開口する開 口部を有する第 1の窪みと、 前記第 1の窪みの最深部より前記第 1の窪みの前記 開口部に近い第 1の位置から前記第 2面に貫通する第 1の貫通孔とが形成された ダイヤフラムと、
前記ダイヤフラムの前記第 2面上で前記第 1の貫通孔の前記開口部の周囲 に設けられた第 1の電極と、
を備えた細胞外電位測定デバイス。
2 . 前記ダイヤフラムの前記第 2面の上方で前記第 1の貫通孔の前記開口部の周 囲に設けられた第 2の電極をさらに備えた、 請求の範囲第 1項に記載の細胞外電 位測定デバイス。
3 . 前記ダイヤフラムは、 前記第 2面に開口する前記第 1の貫通孔の開口部に、 前記ダイヤフラムの前記第 2面に向って径が広がる第 2の窪みが形成された、 請 求の範囲第 1項に記載の細胞外電位測定デバイス。
4. 前記第 1の電極は、 前記第 2の窪みの壁面の少なくとも一部まで延びる、 請 求の範囲第 3項に記載の細胞外電位測定デバイス。
5 . 前記ダイヤフラムの前記第 2面の上方で前記第 1の貫通孔の前記開口部の周 囲に設けられた第 2の電極をさらに備えた、 請求の範囲第 3項に記載の細胞外電 位測定デバイス。
6 . 前記第 2の電極は、 前記第 2の窪みの壁面の少なくとも一部まで延びる、 請 求の範囲第 5項に記載の細胞外電位測定デバイス。
7 . 前記第 1の貫通孔は均一な形状の断面の部分を有する、 請求の範囲第 1項に 記載の細胞外電位測定デバイス。
8 . 前記第 1の貫通孔の断面は矩形状と U字形状のうちの 1つである、 請求の範 囲第 1項に記載の細胞外電位測定デバイス。
9 . 前記ダイヤフラムはシリコンを含む、 請求の範囲第 1項に記載の細胞外電位 測定デバイス。
1 0 . 前記ダイヤフラムの前記第 2面上に設けられた酸化シリコン層と、
前記酸化シリコン層上に設けられたシリコン層と、
をさらに備えた、 請求の範囲第 9項に記載の細胞外電位測定デバイス。
1 1 . 前記酸化シリコン層は、 前記ダイヤフラムの前記第 2面の周縁部上に設け られた、 請求の範囲第 1 0項に記載の細胞外電位測定デバイス。
1 2 . 前記第 1の窪みの前記開口部の径は 1 0〜1 0 0 mであり、 前記第 1の 貫通孔の前記第 1の窪みに開口する開口部の幅が 1〜 1 0 である、 請求の範 囲第 1項に記載の細胞外電位測定デバィス。
1 3 . 前記ダイヤフラムは、 前記第 1の窪みの前記最深部から前記第 1の窪みの 前記開口部に近い第 2の位置から前記第 2面に貫通する第 2の貫通孔とが形成さ れた、 請求の範囲第 1項に記載の細胞外電位測定デバイス。
1 4 . 前記ダイヤフラムの前記第 2面の上方で前記第 2の貫通孔の前記開口部の 周囲に設けられた第 2の電極をさらに備えた、 請求の範囲第 1 3項に記載の細胞 外電位測定デバイス。
1 5 . 前記ダイヤフラムは、 前記第 2面に開口する前記第 2の貫通孔の開口部に、 前記ダイヤフラムの前記第 2面に向って径が広がる第 2の窪みが形成された、 請 求の範囲第 1 3項に記載の細胞外電位測定デバイス。
1 6 . 前記ダイヤフラムの前記第 2面の上方で前記第 2の貫通孔の前記開口部の 周囲に設けられた第 2の電極をさらに備えた、 請求の範囲第 1 5項に記載の細胞 外電位測定デバイス。
1 7 . 前記第 2の電極は、 前記第 2の窪みの壁面の少なくとも一部まで延びる、 請求の範囲第 1 6項に記載の細胞外電位測定デバイス。
1 8 . 前記第 2の貫通孔は均一な形状の断面の部分を有する、 請求の範囲第 1 3 項に記載の細胞外電位測定デバイス。
1 9 . 前記第 2の貫通孔の断面は矩形状と U字形状のうちの 1つである、 請求の 範囲第 1 3項に記載の細胞外電位測定デバイス。
2 0 . 前記第 1の窪みの前記開口部の径は 1 0〜1 0 0 i mであり、 前記第 2の 貫通孔の前記第 1の窪みに開口する開口部の幅が 1〜1 0 i mである、 請求の範 囲第 1 3項に記載の細胞外電位測定
2 1 . 第 1面と前記第 1面の反対側の第 2面とを有し、 前記第 1面に開口する開 口部を有する曲面からなる第 1の窪みと、 前記第 1の窪みから前記第 2面に向つ て形成された均一な形状の断面を有する孔と、 前記ダイヤフラムの前記第 2面に 開口する開口部を有し前記孔から前記ダイヤフラムの前記第 2面に向って径が広 がる第 2の窪みが形成されたダイヤフラムと、
前記ダイヤフラムの前記第 2面上で前記第 2の窪みの前記ダイヤフラムに 開口する開口部の周囲に設けられた第 1の電極と、
を備えた細胞外電位測定デバイス。
2 2 . 前記第 1の電極は、 前記第 2の窪みの壁面の少なくとも一部まで延びる、 請求の範囲第 2 1項に記載の細胞外電位測定デバィス。
2 3 . 前記ダイヤフラムの前記第 2面の上方で前記第 2の窪みの前記開口部の周 囲に設けられた第 2の電極をさらに備えた、 請求の範囲第 2 1項に記載の細胞外 電位測定デバイス。
2 4. 前記第 2の電極は、 前記第 2の窪みの壁面の少なくとも一部まで延びる、 請求の範囲第 2 3項に記載の細胞外電位測定デバイス。
2 5 . 前記孔の前記断面が矩形状と U字形状のうちの 1つである、 請求の範囲第 2 1項に記載の細胞外電位測定デバイス。
2 6 . 前記ダイヤフラムはシリコンを含む、 請求の範囲第 2 1項に記載の細胞外 電位測定
2 7 . 前記ダイヤフラムの前記第 2面上に設けられた酸化シリコン層と、
前記酸化シリコン層上に設けられたシリコン層と、
をさらに備えた 請求の範囲第 2 6項に記載の細胞外電位測定デバイス。
2 8 . 前記酸化シリコン層は、 前記ダイヤフラムの前記第 2面の周縁部上に設け られた、 請求の範囲第 2 7項に記載の細胞外電位測定デバイス。
2 9 . 前記第 1の窪みの前記開口部の径は 1 0〜 1 0 0 mであり、 前記孔の径 は 1〜1 0 mであり、 前記第 2の窪みの前記開口部の径は 5〜1 0 mである、 請求の範囲第 2 1項に記載の細胞外電位測定デバイス。
3 0 . 第 1面と前記第 1面の反対側の第 2面とを有するダイヤフラムを準備する 工程と、
前記ダイァフラムの前記第 1面上にエッチングホールを有するレジス卜マ スクを設ける工程と、 前記ダイャフラムの前記ェッチングホールの周囲の部分にェツチングによ つて前記ダイヤフラムの前記第 1面に開口する開口部を有する第 1の窪みを形成 する工程と、
前記第 1の窪みの最深部より前記第 1の窪みの前記開口部に近い第 1の位 置から前記ダイヤフラムの前記第 2面に貫通する第 1の貫通孔を形成する工程と、 前記ダイヤフラムの前記第 2面上で開口する前記第 1の貫通孔の開口部の 周囲に設けられた第 1の電極を形成する工程と、
を含む、 細胞外電位測定デバイスの製造方法。
3 1 . 前記第 1の窪みを形成する工程は、 エッチングを促進する第 1のガスのみ によるドライエッチングにより前記ダイヤフラムに前記第 1の窪みを形成するェ 程を含む、 請求の範囲第 3 0項に記載の製造方法。
3 2 . 前記第 1の貫通孔は均一な形状の断面の部分を有する、 請求の範囲第 3 0 項に記載の製造方法。
3 3 . 前記第 1の貫通孔を形成する工程は、
前記第 1の窪みの前記第 1の位置から前記ダイャフラムの前記第 2面に向 つて孔を形成する工程と、
前記孔を前記ダイヤフラムの前記第 2面に貫通させるように、 前記孔から 前記ダイヤフラムの前記第 2面に向って広がる第 2の窪みを形成する工程と、 を含む、 請求の範囲第 3 0項に記載の製造方法。
3 4 . 前記第 1の電極は、 前記第 2の窪みの壁面の少なくとも一部に延びる、 請 求の範囲第 3 3項に記載の製造方法。
3 5 . 前記第 1の貫通孔を形成する工程は、 エッチングを促進する第 1のガスと エッチングを抑制する第 2のガスとを用いたドライエッチングにより前記ダイヤ フラムに前記第 1の貫通孔を形成する工程を含む、 請求の範囲第 3 0項に記載の 製造方法。
3 6 . 前記第 1の貫通孔を形成する工程は、 前記第 1のガスと前記第 2のガスと を交互に用いたドライエッチングにより前記ダイヤフラムに前記第 1の貫通孔を 形成する工程を含む、 請求の範囲第 3 5項に記載の製造方法。
3 7 . 前記第 1の貫通孔を形成する工程は、 前記エッチングホールを通して前記 第 1のガスと前記第 2のガスとを第 1の方向に進行させることにより前記ダイャ フラムに前記第 1の貫通孔を形成する工程を含む、 請求の範囲第 3 5項に記載の 製造方法。
3 8 . 前記ダイヤフラムの前記第 1面から前記第 2面に向う厚さ方向と前記第 1 の方向とのなす角度は 8 9 ° 以下である、 請求の範囲第 3 7項に記載の製造方 法。
3 9 . 前記ダイヤフラムの前記厚さ方向と前記第 1の方向とのなす前記角度は 2
0 ° 〜7 0 ° である、 請求の範囲第 3 8項に記載の製造方法。
4 0 . 前記ダイヤフラムの前記厚さ方向と前記第 1の方向とのなす前記角度は 4 5 ° である、 請求の範囲第 3 9項に記載の製造方法。
4 1 . 前記第 1の窪みの前記最深部より前記第 1の窪みの前記開口部に近い第 2 の位置から前記ダイヤフラムの前記第 2面に貫通する第 2の貫通孔を形成するェ 程と、
前記ダイヤフラムの前記第 2面上で開口する前記第 2の貫通孔の開口部の 周囲に設けられた第 2の電極を形成する工程と、
をさらに含む、 請求の範囲第 3 0項に記載の製造方法。
4 2 . 前記第 2の貫通孔は均一な形状の断面の部分を有する、 請求の範囲第 4 1 項に記載の製造方法。
4 3 . 前記第 2の貫通孔を形成する工程は、 エッチングを促進する第 1のガスと エッチングを抑制する第 2のガスとを用いたドライエッチングにより前記ダイヤ フラムに前記第 2の貫通孔を形成する工程を含む、 請求の範囲第 4 1項に記載の 製造方法。
4 4. 前記第 2の貫通孔を形成する工程は、 前記第 1のガスと前記第 2のガスと を交互に用いたドライエッチングにより前記ダイヤフラムに前記第 2の貫通孔を 形成する工程を含む、 請求の範囲第 4 3項に記載の製造方法。
4 5 . 前記第 2の貫通孔を形成する工程は、
前記第 1の窪みの前記位置から前記ダイヤフラムの前記第 2面に向う孔を 形成する工程と、
前記孔を前記ダイヤフラムの前記第 2面に貫通させるように、 前記孔から 前記ダイヤフラムの前記第 2面に向って広がる第 2の窪みを形成する工程と を含む、 請求の範囲第 4 1項に記載の製造方法。
4 6 . 前記第 1の電極は、 前記第 2の窪みの壁面の少なくとも一部に延びる、 請 求の範囲第 4 5項に記載の製造方法。
4 7 . 前記第 1の貫通孔を形成する工程は、 前記エッチングホールを通して前記 第 1のガスと前記第 2のガスとを第 1の方向に進行させることにより前記ダイャ フラムに前記第 1の貫通孔を形成する工程を含み、 ， 前記第 2の貫通孔を形成する工程は、 前記エッチングホールを通して前記 第 1のガスと前記第 2のガスとを第 2の方向に進行させることにより前記ダイャ フラムに前記第 2の貫通孔を形成する工程を含む、 請求の範囲第 4 5項に記載の 製造方法。
48. 前記ダイヤフラムの前記第 1面から前記第 2面に向う厚さ方向と前記第 1 の方向とのなす角度は 89° 以下であり、
前記ダイヤフラムの前記厚さ方向と前記第 2の方向とのなす角度は 8 9° 以下である、 請求の範囲第 47項に記載の製造方法。
49. 前記第 1の方向と前記第 2の方向は前記ダイヤフラムの前記厚さ方向に ついて対称である、 請求の範囲第 48項に記載の製造方法。
50. 前記ダイヤフラムの前記厚さ方向と前記第 1の方向とのなす前記角度は 2 0° 〜70° である、 請求の範囲第 48項に記載の製造方法。
51. 前記ダイヤフラムの前記厚さ方向と前記第 1の方向とのなす前記角度は 4 5° である、 請求の範囲第 50項に記載の製造方法。
52. 前記ダイヤフラムの前記厚さ方向と前記第 2の方向とのなす前記角度は 2 0° 〜70° である、 請求の範囲第 48項に記載の製造方法。
53. 前記ダイヤフラムの前記厚さ方向と前記第 1の方向とのなす前記角度は 4 5° である、 請求の範囲第 52項に記載の製造方法。
54. 前記第 1のガスは SF6、 CF4、 Xe F2のうちの 1つを含む、 請求の範 囲第 31、 35、 または 43項に記載の製造方法。
55. 前記第 2のガスは C4F8、 CHF3の少なくとも 1つを含む、 請求の範囲 第 35または 43項に記載の製造方法。
56. 第 1面と前記第 1面の反対側の第 2面とを有するダイヤフラムを準備する 工程と、
前記ダイァフラムの前記第 1面上にエッチングホールを有するレジストマ スクを設ける工程と、
前記ダイャフラムの前記ェッチングホールの周囲の部分にエツチングによ つて前記ダイヤフラムの前記第 1面に開口する開口部を有する第 1の窪みを形成 する工程と、
前記第 1の窪みから前記ダイヤフラムの前記第 2面に向う均一な形状の断 面を有する孔を形成する工程と、
前記孔を前記ダイヤフラムの前記第 2面に貫通させるように、 前記孔から 前記ダイャフラムの前記第 2面に向つて広がる前記ダイャフラムの前記第 2面に 開口する開口部を有する第 2の窪みを形成する工程と、
前記ダイヤフラムの前記第 2面上で前記第 2の窪みの前記開口部の周囲に 設けられた第 1の電極を形成する工程と、
を含む、 細胞外電位測定デバィスの製造方法。
57. 前記第 1の窪みを形成する工程は、 エッチングを促進する第 1のガスのみ を用いたドライエッチングにより前記ダイヤフラムに前記第 1の窪みを形成する 工程を含む、 請求の範囲第 56項に記載の製造方法。
58. 前記孔を形成する工程は、 エッチングを促進する第 1のガスとエッチング を抑制する第 2のガスとを用いたドライエッチングにより前記孔を形成する工程 を含む、 請求の範囲第 56項に記載の製造方法。
59. 前記第 2のガスは、 C4F8、 CHF3の少なくとも 1つを含む、 請求の範 囲第 58項に記載の製造方法。
60. 前記第 2の窪みを形成する工程は、 エッチングを促進する第 1のガスのみ を用いたドライエッチングにより前記第 2の窪みを形成する工程を含む、 請求の 範囲第 56項に記載の製造方法。
61. 前記第 1のガスは、 SF6、 CF4、 Xe F2のうちの 1つを含む、 請求の 範囲第 5 7、 5 8または 6 0項に記載の製造方法。
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