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WO2004078975A1 - 新規タンパクおよびその用途 - Google Patents

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WO2004078975A1
WO2004078975A1 PCT/JP2004/002902 JP2004002902W WO2004078975A1 WO 2004078975 A1 WO2004078975 A1 WO 2004078975A1 JP 2004002902 W JP2004002902 W JP 2004002902W WO 2004078975 A1 WO2004078975 A1 WO 2004078975A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
antibody
disease
present
screening
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2004/002902
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English (en)
French (fr)
Inventor
Nobuhiko Katunuma
Hiroshi Shiota
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Senju Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Senju Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Senju Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Senju Pharmaceutical Co Ltd
Publication of WO2004078975A1 publication Critical patent/WO2004078975A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/8139—Cysteine protease (E.C. 3.4.22) inhibitors, e.g. cystatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • a protein characterized by having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence at the N-terminal and having a molecular weight of 31 kDa.
  • the present invention relates to a screening method for a disease such as Behcet's disease, which is characterized by the following. Background art
  • Examples of the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include human salivary gland proline-rititanium protein known as acidic PRP-1 and pHL E 1 F 1 encoded from mRNA in human lacrimal gland. Proline-rich proteins (molecules 4: 15, 097) are known (see, for example, Douglas P. Dickinson et al., (1995) Investigative Ophthalmology & Visual Science, 36 (10), 2020-203). Among the above prolinritsu titanium proteins, human salivary gland prolinritz titanium protein acts at the point of contact between teeth and saliva, regulates calcium phosphate precipitation and crystal formation, and acts as a protein that binds oral bacteria such as Streptococcus mutans. (See, for example, Japanese Patent Publication No. 2002-5 16997).
  • Behcet's disease is a multi-organ invasive inflammatory disease, the cause of which is currently unknown. The main symptoms are
  • Behcet's disease diseases are classified into complete and incomplete types according to the appearance of the above symptoms. As described above, diagnosis of Behcet's disease can be difficult because it is diagnosed only according to the type of the symptoms.Particularly, diagnosis is made in cases where the disease is suspected as Behcet's disease or a disease which has a finding that is confusingly similar to Behcet's disease. It is difficult at present.
  • Zymography is a method that uses electrophoresis.It uses a gel in which a protein that serves as an enzyme substrate such as gelatin or zein is encapsulated.After electrophoresis of a sample, the gel is placed in an appropriate solution in which the enzyme and enzyme substrate react. After incubating, the gel is stained in an appropriate protein staining solution, and the portion where the substrate has been degraded by the protease is detected as a transparent band. The approximate activity of the protease is determined by its position and the degree of omission. That's the way you can. If SDS-polyacrylamide gel is used, its activity and molecular weight can be measured simultaneously.
  • lipase zymography similarly, after electrophoresis on a substrate-containing gel, a protease is added to an enzyme reaction solution to digest the substrate in the gel. If the protease inhibitor is present in the separated protein, the whole gel after staining will have substrate degradation The part where the enzyme activity inhibitor is present is detected as a stained band because the substrate is not degraded, and is used for the analysis of protease inhibitors.
  • this lipase zymography is used for the study of cancer metastasis and the screening method of matrix meta-oral protease inhibitors (eg, Kaori Takasaki et al., (1998) Biophysical Chemistry, 42, 87- See 92.).
  • the present invention is expressed in diseases such as Behcet's disease, belongs to cysteine protease inhibitory protein due to its characteristic of lipase zymography, and is used for screening an excellent anti-Behcet's disease agent and the like. Cysteine proteinase inhibiting protein and its DNA.
  • the present inventors have conducted repeated investigations and studies on samples such as tears, saliva, and blood collected from patients, and found that proteins specifically detected when Behcet's disease or Harada's disease developed, and (4) The inventors discovered that there was a protein whose concentration increased in the sample, and conducted further research to complete the present invention. Therefore, by detecting and identifying such substances, that is, these specific proteins, from the sample, the function of diseases such as Behcet's disease can be examined, and furthermore, diagnosis of Behcet's disease and the like can be performed. It can be used for the objective decision-making, and for the screening and treatment of prophylactic and therapeutic agents such as Behcet's disease.
  • an antisense D having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the DNA encoding the protein of the above [1] or a part thereof, and having an action of suppressing the expression of the protein; NA,
  • a protein having a cysteine protease inhibitory activity wherein the N-terminal sequence has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and the molecular weight is 65 kDa.
  • [[26] A function of the protein, characterized by using a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the N-terminal sequence and having a molecular weight of 65 kDa. (27) The screening method according to the above (25), wherein the function is a cystine protease inhibitory activity or a factor associated with Behcet's disease, wherein the compound has a promoting or inhibiting activity or a salt thereof.
  • Cells having the ability to express the protein gene according to the above [1] are cultured in the presence or absence of the test compound, and in each case, the expression level of the mRNA of the protein is determined. Measuring and comparing the screening method according to the above (25), (31) the promoter region and the enhancer region of the protein according to the above (1), or the protein according to the above (1). Promoter region upstream of reporter gene.
  • the cells described above which are characterized by culturing the cells transformed with the DNA ligated to, in the presence and absence of the test compound, and measuring the expression level of the reporter gene in each case. Screening method,
  • (33) having the activity of promoting or inhibiting the function of the protein of (1), which can be obtained using the screening method of (29) or the screening kit of (32) A compound or a salt thereof,
  • Prevention and treatment of Behcet's disease containing salt
  • FIG. 1 shows a lipase zymography of tears from patients with Behcet's disease and Harada's disease.
  • FIG. 2 shows Western plotting using three kinds of egret polyclonal antibodies.
  • Lane 1 marker
  • lane 2 polyclonal antibody after ammonium sulfate treatment
  • lane 3 polyclonal antibody after DEAE-Affi-Ge1B1ue column treatment
  • lane 4 polyclonal after treatment with Mono Q column antibody.
  • the 31 kDa protein of the present invention is a substance that is detected in association with, for example, Behcet's disease or the like, or whose concentration is confirmed to increase.
  • the 31 kDa protein of the present invention is a PRP-1 containing the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, since the 15-mer amino acid at the N-terminal shows the sequence represented by SEQ ID NO: 1. Or at least about 50% or more of the amino acid sequence having homology with the amino acid sequence of aspartic acid 76 to as amino acid 134 of tryptophan in the amino acid sequence of pHL E 1 F 1 proline litupitamin protein, and further about 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ° / 0 or more.
  • the 31 kDa protein of the present invention can be produced from tears, blood, cells or tissues of patients with Behcet's disease or the like by a known protein separation / purification method, and the protein of the present invention can be coded. It can also be produced by culturing a transformant containing the DNA of interest.
  • the tears When manufactured from patient's tears, blood, cells or tissues, for example, the tears may be used as-is, such as chromatographic methods such as reverse-phase chromatography,
  • the blood can be purified and isolated by combining the fibrils, and the blood can be purified and isolated by centrifugation to separate the serum or plasma and then to the above-mentioned mouth chromatography.
  • the cells or tissues After homogenizing the cells or tissues, the cells or tissues are extracted or fractionated with salting out acid and the like, and the extracts or fractions are purified and purified by a combination of chromatography such as reverse phase chromatography and ion exchange chromatography. Can be released.
  • the 31 kDa protein of the present invention is produced by recombinant DNA technology, for example, a DNA encoding the above protein is prepared, and inserted into an expression vector to produce Escherichia coli, Bacillus subtilis, and actinic radiation.
  • a transformant may be introduced into a host such as a fungus or yeast to obtain a transformant, and the protein of the present invention may be collected from the culture.
  • the present invention also includes providing a DNA comprising the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention.
  • a DNA comprising the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention.
  • those incorporated in a plasmid vector to be maintained in transformed Escherichia coli described below can be suitably used.
  • the present invention provides a recombinant vector containing the above DNA.
  • a recombinant vector that is incorporated into a vector that enables the expression of a peptide consisting of an amino acid sequence encoded by the above-mentioned DNA can be suitably used.
  • a method for preparing a DNA having a desired nucleotide sequence for example, chemically synthesizing sense and antisense nucleotides, which are partial sequence nucleotides of the desired DNA and having both ends overlapping, are then subjected to a polymerase chain reaction.
  • a polymerase chain reaction for example, chemically synthesizing sense and antisense nucleotides, which are partial sequence nucleotides of the desired DNA and having both ends overlapping.
  • Prokaryotic or eukaryotic host cells can be transformed by incorporating a DNA encoding the amino acid sequence of the protein of the present invention into a suitable vector. Involved in various promoters and transformations By introducing such a sequence, the DNA can be expressed in each host cell. That is, the present invention also relates to a host cell having a recombinant vector having the DNA of the present invention incorporated in a vector enabling the expression of the protein of the present invention.
  • Prokaryotic host cells include, for example, Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • the host cells can be transformed with a replicon from a species compatible with the host, i.e., a plasmid vector containing an origin of replication and regulatory sequences. Just fine. It is also desirable that the vector has a sequence capable of imparting phenotypic (phenotypic) selectivity to the transformed cells.
  • E. coli K12 strain, JM109 strain and the like are often used, and as a vector, pBR322 and pUC-type plasmids are generally used, but not limited thereto, and various known strains and vectors may be used. Both can be used.
  • promoters include E. coli tryptophan (trp) promoter, ratatose (lac) promoter, tryptophan lactose (tac) promoter, V-poplin (1p) promoter, lambda (X) PL promoter derived from pacteriophage, and poly (E. coli).
  • Peptide chain elongation factor Tu (tuf B) promoter, 1 ac UV5 promoter and the like, and any promoter can be used for production of the protein of the present invention.
  • Bacillus subtilis for example, strain 207-25 is preferable, and as a vector, pTUB228 [see Ohmura, K., et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93] and the like are used. It is not limited.
  • pTUB228 As a promoter for Bacillus subtilis, the regulatory sequence of the ⁇ -amylase gene of Bacillus subtilis is often used, and if necessary, the bacterial sequence is ligated by linking a D D sequence encoding the signal peptide sequence of ⁇ -amylase. It also enables extracellular secretory expression.
  • a plasmid having a pBR322 replication origin, capable of autonomous growth in Escherichia coli, and further having a transcription promoter and a translation initiation signal can be used as an expression vector.
  • the expression vector was prepared by the calcium monochloride method [Mandel, M. and Higa, A. (1970) J. Mol.
  • Eukaryotic host cells include cells such as vertebrates, insects, and yeast.
  • vertebrate cells include COS cells derived from monkey kidney cells [Gluzman, Y. (1981) Cell23, 175- 182], and hamster ovary cells (CHO), human malva cells, and muster BHK cells are often used, but are not limited thereto.
  • a vertebrate cell expression vector a vector having a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, a transcription termination sequence, and the like located upstream of a gene to be normally expressed can be used. May be included. Examples of such expression vectors include the early promoter of SV40.
  • yeasts are commonly used. Among them, yeasts belonging to the genus Saccharomyces and Saccharomyces' Saccharorayces cerevisiae are preferred. Examples of eukaryotic expression vectors such as the yeast include, for example, a promoter for an alcohol dehydrogenase gene [Bennetzen, J.L. and Hall, BD (1982) J. Biol.
  • the expression vector has an SV40 replication origin and is capable of autonomous growth in COS cells. Furthermore, those having a transcription promoter, a transcription assembly signal, and an RNA splice site can be used.
  • the expression vector is a DEAE-dextran method
  • the transformed cells may be any cells as long as they have been transformed to produce the protein of the present invention, and are not particularly limited.
  • the desired transformant obtained above can be cultured according to a conventional method, and the protein of the present invention is produced intracellularly or extracellularly by the culture.
  • the medium used for the culture can be appropriately selected from those commonly used depending on the host cell used. For example, in the case of Escherichia coli, tryptone-yeast medium (batato tryptone 1.6%, yeast extra Tat 1.0%, sodium chloride 0.5% (pH 7.0)) and peptone medium (manufactured by Difco) can be used.
  • a culture medium such as RPMI 1640 medium or Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) to which serum components such as fetal bovine serum (FBS) are added as necessary
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Examples of such a method include, for example, treatment with a normal protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, abinity chromatography, partition chromatography, Examples include various types of chromatography such as high performance liquid chromatography (HPLC), dialysis methods, and combinations thereof.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the peptide can be solubilized by denaturing the peptide with a strong denaturing agent such as guanidine isothiosinate.
  • the protein of the present invention may be in the form of a complex obtained by adding a saccharide-polyethylene recall to the thus obtained polypeptide, and further, the polypeptide may be acetylated, amidated, and / or It may be in the form of a derivative or a polymer obtained by crosslinking polymerization with a polyfunctional reagent.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonication, lysozyme and Z or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by such methods as mentioned above, a method of obtaining a crude extract of polypeptide by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as ketoxynol (for example, Triton X-100).
  • the polypeptide When the polypeptide is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a known method, and the supernatant is collected. Purification of the polypeptide contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be performed by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, Methods that mainly use the difference in molecular weight, such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, methods that use the difference in charge, such as ion exchange chromatography, and abundance chromatography.
  • solubility such as salting out and solvent precipitation
  • Methods that mainly use the difference in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • methods that use the difference in charge such as ion exchange chromatography, and abundance chromat
  • Methods that use specific affinity such as chromatography, methods that use differences in solubility such as partition chromatography, methods that use differences in hydrophobicity such as reverse-phase high-performance liquid chromatography, and isoelectric focusing. For example, a method utilizing the difference between isoelectric points is used.
  • the presence or activity of the protein of the present invention thus produced can be measured by, for example, enzyme immunoassay using a specific antibody.
  • the protein of the present invention has an N-terminus at the left end (amino terminus) and a right end according to the convention of peptide notation. Terminal (carboxyl terminal). Protein of the present invention, C-terminal, usually force Rupokishiru group (- COOH) s-carboxylate (one COO-), amide (one CO NH 2) or an ester (- COOR) or may be any of the salts thereof .
  • alkyl group e.g. methyl, E Ji Le, propyl, isopropyl, etc. heptyl
  • C 6 - 1 2 Ariru group e.g. Hue - le, 1-naphthyl, etc.
  • the protein of the present invention includes a carboxyl group amidated or esterified.
  • ester for example, the above-mentioned c-terminal ester and the like are used.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue (for example, methionine residue) is protected by a protecting group (for example, Ci-eacyl group such as formyl group, acetyl group, etc.).
  • a protecting group for example, Ci-eacyl group such as formyl group, acetyl group, etc.
  • N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, pyroglutamic acid residue, substituent on the side chain of amino acid in the molecule (eg, hydroxy group, sulfanyl group)
  • An amino group an imidazolyl group, an indolyl group, a guanidino group, etc.
  • protecting groups for example, an acyl group such as an alkanol group such as a formyl group or an acetyl group.
  • Protected or complex polypeptides such as so-called sugar polypeptides having sugar chains bonded thereto are also included.
  • a salt with a physiologically acceptable acid for example, an inorganic acid or an organic acid
  • a base for example, an alkali metal salt
  • a physiologically acceptable salt is used, and particularly, a physiologically acceptable salt is used.
  • Acid addition salts are preferred.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid
  • Acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid
  • the antisense DNA of the present invention may be a modified DNA.
  • the modified DNA include a sulfur derivative and a thiophospho derivative of DNA, and those which are resistant to the decomposition of polynucleoside amide polynucleonucleoside amide, but are not limited thereto. Absent.
  • the antisense DNA of the present invention is intended to be more stable in cells, to enhance cell permeability, to increase the affinity for a target sense strand, or to reduce toxicity. It can be preferably designed and modified.
  • the antisense DNA of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, and may be provided in a special form such as ribosome or microsphere, applied by gene therapy, It could be provided in an added form.
  • antisense DNA examples include polycations such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, to enhance interaction with cell membranes, and to increase nucleic acid uptake. Lipids (eg, phospholipids, cholesterol, etc.). Such additions can be attached to the nucleic acid at the 3, 5 or 5 ends, and can be attached through bases, sugars, or intramolecular nucleoside linkages.
  • the inhibitory activity of antisense DNA can be examined using the transformant of the present invention or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention.
  • the DNA can be applied to cells by various known methods.
  • the antibody against the protein of the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein of the present invention, but a monoclonal antibody is more preferable.
  • An antibody against the protein of the present invention may be a known antibody or antibody using the protein of the present invention or a part of the amino acid sequence of the protein of the present invention or a polypeptide having antigenicity having a part of the amino acid sequence as an antigen. It can be produced according to the method for producing serum.
  • an antibody against the 31 kDa protein a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, or a partial sequence thereof is specifically used.
  • An antibody that recognizes is preferred, and an antibody against the 61 kDa protein is preferably an antibody that specifically recognizes a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or a partial sequence thereof.
  • Such an antibody can be prepared by using, as an antigen, a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, or a partial sequence thereof.
  • the polypeptide comprising the partial distribution sequence is not particularly limited as long as it has antigenicity.
  • the amino acid of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 It may be a polypeptide consisting of at least 6, preferably at least 8, more preferably at least one or more contiguous amino acids selected from the sequence.
  • the polypeptide having the antigenicity can be prepared, for example, by a conventional peptide synthesis method known as a “solid phase method” or “liquid phase method”. For example, details of peptide synthesis can be found in “The New Chemistry Laboratory Course”, edited by The Biochemical Society of Japan, Vol. 1, “Protein VI”, pp. 3-44, 1992, published by Tokyo Chemical Dojin. Has been described.
  • a part of the amino acid sequence of the protein described in the present invention or a polypeptide having a part of the amino acid sequence can be synthesized by a solid-phase synthesis method using Fmoc (9-fluorenyl methyloxycarbonyl) using a peptide synthesizer (Shimadzu Corporation).
  • Fmoc 9-fluorenyl methyloxycarbonyl
  • a peptide synthesizer Shiadzu Corporation
  • DMF piperidinenodimethylformamide
  • the above-mentioned polypeptide having antigenicity is administered to a warm-blooded animal at a site where the antibody can be produced by administration to itself or together with a carrier or a diluent.
  • • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance antibody production.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, preferably about 2 to 10 times in total.
  • Examples of the warm-blooded animal to be used include monkeys, puppies, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and preferably mice, rats, and puppies.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, an individual with an antibody titer from a heron is selected, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum is performed, for example, by reacting a labeled polypeptide labeled with a radioactive substance or an enzyme with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. be able to.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1.
  • P3U1 is preferably used, although myeloma cells from any warm-blooded animal can be used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG100 to PEG600) is used.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by adding at a concentration of about 10 to 80% and incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes.
  • Various methods can be used for screening the monoclonal antibody-producing hybridoma.
  • the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (for example, a microplate) on which the polypeptide antigen is adsorbed directly or together with a carrier.
  • a solid phase for example, a microplate
  • Anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice
  • the monoclonal antibody bound to the solid phase is added to the antibody.
  • Detection method Monoclonal antibody bound to solid phase by adding hybridoma culture supernatant to solid phase to which anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, adding polypeptide labeled with radioactive substances, enzymes, etc. And the like.
  • Selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hippoxanthin, aminopterin, thymidine).
  • HAT hippoxanthin, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a serum-free medium for hybridoma culturing SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the cultivation can usually be performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by known methods, for example, immunoglobulin analysis. Separation / purification method [eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, adsorption / desorption method with ion exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase Alternatively, a specific purification method in which only the antibody is collected using an active adsorbent such as protein A or protein G and the bond is dissociated to obtain an antibody].
  • separation / purification method eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, adsorption / desorption method with ion exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase
  • ion exchanger eg, DEAE
  • ultracentrifugation method eg, ultracentr
  • scFv single-chain antibody
  • a monoclonal antibody eg, Mol. Biol. 296, 55 (2000); http: //. Morphosys. Com / start, see php ".
  • Hu CAL registered trademark
  • Hu CAL which is a single-chain FV-based phage display library
  • Conversion of the scFv into a monoclonal antibody is performed by cloning the heavy chain and light chain variable regions from the scFV obtained above and linking them to the immunoglobulin heavy chain and light chain constant regions, respectively.
  • nucleotide mutations are introduced as necessary to add a leader sequence, modify the Kozak sequence, remove or add a restriction site, and the like.
  • the ligated product thus obtained is introduced into the Clawing site of the expression vector, and the host cell is transformed to obtain a transformant.
  • those expressing an immunoglobulin capable of binding to an anti-immune glopurin antibody are selected by a method known per se such as ELISA.
  • a monoclonal antibody is expressed in the selected transformant, and the target monoclonal antibody can be obtained by separation and purification.
  • the expression vector, host cell The same method as described above can be used, and the transformation method, separation and purification method, etc. can be performed in the same manner as described above.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto.
  • an immunizing antigen having antigenicity against the protein of the present invention
  • a carrier protein is prepared, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting an antibody-containing substance against the protein of the present invention from an immunized animal and separating and purifying the antibody. Complete Freund's adjuvant ⁇ Incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, or the like of a warm-blooded animal immunized by the above method, preferably from the blood.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • serum was subjected to ammonium sulfate precipitation and then treated with a DEAE-Affi-Ge1B1ue column and / or a Mono Q column to achieve a higher purity.
  • Excellent polyclonal antibodies can also be isolated and purified.
  • the antibody against the protein of the present invention include, for example, a partial amino acid sequence of human salivary gland proline rititanium protein (PP-1).
  • a polypeptide consisting of Gln-Gln-Arg-Pro-Pro-Arg-Arg-Gly-His-Arg-Gln-Leu-Ser-Leu-Pro-Arg-Phe-Pro-Ser-Val (SEQ ID NO: 3)
  • Antibodies used as antigens can be mentioned.
  • the protein of the present invention can be suitably detected when the peptide is separated and visualized by reverse zymography using electrophoresis.
  • the gel used for reverse zymography contains polyacrylamide.
  • the content of the polyacrylamide is preferably about 2 to 30 w / V%, and more preferably about 5 to 15 w / v%.
  • the gel used in the Lipase Zymodarafi method preferably contains a surfactant such as SDS, and the concentration of the SDS is about 0.0001 to 15 wZv%. More preferably, it is about 0.01-5 wZv%.
  • the gel used in the reverse zymography method preferably contains a substrate such as gelatin, casein, elastin and fipurin, and gelatin is particularly preferred.
  • the substrate concentration is preferably about 0.01 to lw / v%, more preferably about 0.05 to 0.5 w / v%.
  • cysteine protease for example, papain, fusin, promelain, cathepsin B, H, L, calpain and the like are preferable, and papain is particularly preferable.
  • the protein of the present invention is detected or its concentration is increased at least at the onset of Behcet's disease or Harada disease. According to the reverse zymography method, if the protein of the present invention is detected in the organism from which the specimen was collected, it may be a polypeptide that is specifically expressed in diseases such as Behcet's disease and Harada's disease. The protein of the present invention can be used as an indicator of Behcet's disease ⁇ Harada's disease.
  • the 31 kDa protein of the present invention As an indicator substance which is detected at least at the onset of Behcet's disease or whose concentration is confirmed to be increased, for example, the 31 kDa protein of the present invention can be mentioned.
  • the “31 kDa protein” refers to, for example, a substance that is detected as a band near 31 kDa when an indicator substance is detected by the reverse zymography method.
  • an indicator substance that is detected or whose concentration is confirmed to be increased is, for example, the amino acid sequence at the N-terminal side is SEQ ID NO: 5 and has a molecular weight of about 65 kDa.
  • Cysteine protease inhibitors and the like are, for example, 65% when an indicator substance is detected by the reverse zymography method described above. A substance detected as a band near kDa.
  • the protein of the present invention has a protein inhibitory activity due to one of the characteristics of reverse zymography. Therefore, the protein of the present invention, or an amide or ester thereof, or a salt thereof can be used as a composition for a therapeutic or prophylactic agent for diseases involving cysteine protease, for example, osteoporosis.
  • the DNA encoding the protein of the present invention When used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, the DNA may be used alone or in a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector. After insertion into a human, it can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it is purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. It is preferable to use one.
  • the protein of the present invention or an amide or estenole thereof or a salt thereof can be used, for example, orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., if necessary coated with sugar or water or other water.
  • Pharmaceutically acceptable It can be used parenterally in the form of an injectable preparation, such as a sterile solution with an acceptable liquid, or a suspension.
  • an injectable preparation such as a sterile solution with an acceptable liquid, or a suspension.
  • physiologically acceptable carriers, excipients, preservatives, stabilizers, binders, sweeteners, and the like in the unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice. can do.
  • the amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, Swelling agents such as alginic acid, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin are used.
  • suitable coating agents eg, cellulose acetate phthalenolate, methacrylic acid copolymer, hydroxypropylcellulose phthalate, carboxymethylethyl cellulose, etc.
  • enteric coating agents eg, cellulose acetate phthalenolate, methacrylic acid copolymer, hydroxypropylcellulose phthalate, carboxymethylethyl cellulose, etc.
  • the skin may be applied with such as.
  • a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • the capsule can be an enteric-coated capsule, a gastric resistant capsule, or a controlled-release capsule other than ordinary capsules.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice of dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. .
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing butudose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mantol, sodium chloride, etc.).
  • Solubilizers for example, alcohols (eg, ethanol, etc.), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50) Etc.).
  • examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like as a solubilizing agent.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents eg, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • storage Agents e.g., penzino oleanol, phenol, etc.
  • antioxidants e.g., antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated in the same manner as described above, and is usually used parenterally.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, warm-blooded animals (e.g., humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, stags, pests, pomas, cats, Dogs, monkeys, chimpanzees, etc.).
  • the dosage of the protein of the present invention varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.
  • the protein of the present invention is orally administered for the purpose of treating osteoporosis, generally the adult (60 kg) is used. ).
  • the administration is about 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 500 mg per day.
  • the protein of the present invention or DNA encoding the protein of the present invention is also useful as a probe for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the protein of the present invention. That is, the present invention provides a method for screening a compound having an activity of promoting or inhibiting the expression of the protein of the present invention, which comprises using the protein of the present invention. Specifically, for example, cells having the ability to express the gene of the protein of the present invention are cultured in the presence of a test compound, and the DNA encoding the protein of the present invention or its complementary DNA or a partial DNA thereof is used. And a method for screening a compound having an activity of promoting or inhibiting the expression of the protein of the present invention or a salt thereof, which comprises measuring the amount of mRNA encoding the protein of the present invention.
  • Examples of the cells capable of expressing the protein gene of the present invention include animal cells into which the protein gene of the present invention has been introduced and transformed.
  • Animal cells into which the protein gene of the present invention has been introduced and transformed can be produced by the method described above. Wear.
  • the cells having the ability to express the protein gene of the present invention are cultured in the same manner as in a known animal cell culture method.
  • a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMME medium [Virology, 8 volumes, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 5 19 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] and the like are used.
  • the pH is about 6-8.
  • the cultivation may be carried out usually at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and subculturing may be carried out if necessary. C The culturing may be conducted with aeration or stirring as necessary.
  • the protein of the present invention is encoded!
  • the amount of nRNA is measured by contacting RNA extracted from a cell according to a known method with DNA complementary to the DNA encoding the protein gene of the present invention or a partial DNA thereof, and It is performed by measuring the amount of niRNA bound to the complementary DNA of the gene DNA of the protein.
  • the amount of mRNA bound to the complementary DNA of the gene DNA of the protein of the present invention by labeling the DNA complementary to the gene DNA of the protein of the present invention or a partial DNA thereof with, for example, a radioisotope, a dye, or the like. Can be easily measured.
  • the radioisotope for example, [ 32 P], [ 3 H] or the like is used, and as the dye, for example, a fluorescent dye such as fluorescein is used.
  • the amount of the mRNA of the protein of the present invention is determined by converting RNA extracted from cells into complementary DNA by reverse transcriptase, and then transforming the DNA encoding the protein gene of the present invention or its complementary DNA. It can be performed by measuring the amount of complementary DNA to be amplified by PCR using A or its partial DNA as a primer. Measurement of the amount of mRNA of the protein of the present invention
  • Examples of the DNA complementary to the DNA of the protein of the present invention used for determination include DNA (lower chain) having a sequence complementary to the gene DNA (upper chain) of the protein of the present invention.
  • the present invention relates to a cell (eg, an adipocyte, a macrophage, a skeleton) transformed with a known promoter-enhancer region of the protein of the present invention, which is cloned from genomic DNA and ligated upstream of a suitable reporter gene.
  • Stimulating or inhibiting the expression of the protein of the present invention which comprises culturing a muscle cell or the like in the presence of a test compound and detecting the expression of a reporter gene in place of the expression of the protein of the present invention.
  • a method for screening a compound having the activity of As a reporter gene for example, a staining marker gene such as 1 & cZ galactosidase gene) or the like is used.
  • a test compound that increases the amount of the reporter gene product promotes the expression of the protein gene of the present invention.
  • a test compound that reduces the amount of a reporter gene product can be selected as a compound that inhibits the expression of the protein gene of the present invention.
  • the cells can be cultured in the same manner as in the known animal cell culture described above.
  • the present invention provides (i) expressing the protein of the present invention in, for example, Escherichia coli, purifying the protein, and adding a test compound together with the cysteine protease inhibitory activity of the protein of the present invention and (ii) the protein of the present invention.
  • a compound having the activity of promoting or inhibiting the function of the protein of the present invention which is characterized in that the cysteine protease inhibitory activity when cultivated is measured using lipase zymography and the like, and comparison is performed. And a method for screening for a salt thereof.
  • the present invention provides a method for culturing cells capable of expressing the gene of the protein of the present invention in the presence of a test compound, and measuring the expression level of the protein of the present invention using the antibody of the protein of the present invention.
  • Promotes or inhibits the expression of the protein of the present invention which is characterized by A method for screening a compound having a harmful activity or a salt thereof, more specifically, (i) the expression level of the protein of the present invention when cells having the ability to express the gene of the protein of the present invention are cultured; ) Measuring the expression level of the protein of the present invention when cells having the ability to express the gene of the protein of the present invention in the presence of the test compound are measured using the antibody of the protein of the present invention, and compared.
  • the antibody of the protein of the present invention can be produced by the method described above.
  • the cells can be cultured in the same manner as in the known animal cell culture described above.
  • a cell having the above is cultured in the presence of a test compound, and the culture solution (test solution) and the antibody of the protein of the present invention insolubilized on the carrier and another labeled antibody of the present invention are simultaneously or continuously treated.
  • Measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier in the case of reacting with a protein, or a method for screening a compound or a salt thereof having an activity of promoting or inhibiting the expression or secretion of a protein according to the present invention. provide.
  • one of the antibodies is the N-terminal of the protein of the present invention. It is desirable that the antibody recognize the end and the other antibody react with the C-terminal of the protein of the present invention.
  • examples of the test compound include peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • the product may be a novel compound or a known compound.
  • the screening kit of the present invention includes a cell capable of expressing the gene of the protein of the present invention, a labeled protein of the present invention, an antibody of the protein of the present invention, a DNA encoding the protein of the present invention, Alternatively, it contains a DNA complementary to the DNA encoding the protein of the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention may be any of the test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, and plants. It is a compound selected from extracts, animal tissue extracts, plasma and the like, and is a compound having an activity of promoting or inhibiting the function of the protein of the present invention.
  • the salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • a compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as a therapeutic / prophylactic agent for diseases such as Behcet's disease, it can be carried out according to a conventional method.
  • a conventional method for example, in the same manner as the above-mentioned composition containing the protein of the present invention, orally or parenterally as tablets, forcepsels, elixirs, microforces, sterile solutions, suspensions, etc. Can be administered.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example warm-blooded animals
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, administration route, and the like.
  • a compound that inhibits the function of the protein of the present invention for the purpose of treating Behcet's disease may be used.
  • oral administration generally adult (assuming a body weight of 6 O kg) , The compound is administered in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • an antibody against the protein of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention, and therefore, the quantification of the protein of the present invention in a test solution, particularly It can be used for quantification by sandwich immunoassay. That is, the present invention provides: (i) a step of competitively reacting an antibody of the present invention with a test solution and a labeled protein of the present invention to form a labeled protein of the present invention bound to the antibody.
  • a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution which comprises measuring the ratio, and (ii) the antibody of the present invention insolubilized on the test solution and a carrier and another method of the labeled present invention.
  • the present invention provides a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution, which comprises reacting an antibody simultaneously or successively and then measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier.
  • a quantitative method for quantifying the protein of the present invention comprises reacting an antibody simultaneously or successively and then measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier.
  • one of the antibodies is an antibody that recognizes the N-terminal portion of the protein of the present invention, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal portion of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of an antigen (eg, the amount of a polypeptide) in a test solution.
  • any method can be used, as long as the amount is determined by chemical or physical means, and this is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • the sandwich method described below in terms of the sensitivity and specificity in which the nef mouth method, the competitive method, the immunometric method and the sandwich method are suitably used.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, Enzymes, fluorescent substances, luminescent substances and the like are used.
  • a radioisotope for example,
  • a stable enzyme having a high specific activity is preferable.
  • 3-galactosidase, ⁇ -dalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, / reciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the insolubility of an antigen or an antibody physical adsorption may be used, or a chemical bond usually used to insolubilize and immobilize polypeptides or enzymes may be used.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent, the amount of the protein of the present invention in the test solution can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at different times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. You can.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, the antibody used in the secondary reaction
  • the antibody used in the primary reaction is preferably an antibody which recognizes other than the C-terminal part, for example, the N-terminal part.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • a competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) is separated from the labeled antigen (B) bound to the antibody. (B / F separation), and the amount of B or F label is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody to the antibody a solid phase antibody is used as the first antibody
  • An immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the immunometric method the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the antigen is allowed to react with an excessive amount of the labeled antibody, then the immobilized antigen is added, and the unreacted labeled antibody is bound to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of the label in the phase is measured to determine the amount of the antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble sediment resulting from an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method.
  • the protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method.
  • the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the protein of the present invention when the protein of the present invention is detected by quantifying the concentration of the protein of the present invention using the antibody of the present invention, for example, there is a possibility of Behcet's disease or future disease. It can be diagnosed as high.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • detecting the protein of the present invention in each fraction during purification analyzing the behavior of the protein of the present invention in test cells, and the like. Can be used for
  • a composition containing the antisense DNA of the present invention for the DNA encoding the protein of the present invention can complementarily bind to the polynucleotide of the present invention (for example, DNA), and enhance the expression of the polypeptide. Can be suppressed. Since the antisense DNA of the present invention has low toxicity and can suppress the expression of the protein of the present invention or the polynucleotide of the present invention in vivo, for example, diseases caused by overexpression of the protein of the present invention, Behcet, It can be used as a preventive and therapeutic agent for diseases such as Harada disease.
  • the above-mentioned antisense polynucleotide is replaced with the above-mentioned polynucleotide of the present invention. It can be formulated in the same manner as in the case of the peptide.
  • the preparations thus obtained have low toxicity and may be orally or non-toxic to humans or non-human mammals (eg, rats, puppies, sheep, sheep, puppies, cats, cats, dogs, monkeys, etc.). It can be administered orally.
  • the antisense 'polynucleotide can be administered as it is or together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary for promoting uptake
  • a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the dose of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the subject of administration, the route of administration, and the like.For example, an antisense nucleotide against DNA encoding the protein of the present invention for the purpose of treating Behcet's disease may be used. When administered topically to the eyes and the like, the dose is preferably about 0.1 to 100 mg per day for an adult (body weight 60 kg).
  • the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of expression thereof.
  • the antibody of the present invention which has the activity of neutralizing the activity of the protein of the present invention, is useful for, for example, preventing diseases caused by overexpression of the protein of the present invention, such as Behcet's disease and Harada's disease. It can be used as a composition such as a therapeutic agent.
  • the therapeutic or prophylactic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used as it is as a liquid or as a composition of an appropriate dosage form in a human or non-human mammal (for example, rat, porch egret, sheep, pig, porcine, It can be administered orally or parenterally to cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dosage varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route, etc.
  • the antibody of the present invention when used in adults, is usually administered in a single dose of 0.01 to 2 Omg / kg body weight.
  • Intravenous injection preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight, about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day
  • an equivalent dose can be administered, but it may be increased or decreased depending on the symptoms.
  • the antibody of the present invention may be administered by itself or as a suitable composition.
  • composition used for the above administration contains the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration. That is, for example, compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules ( Soft capsules), syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a yarn composition is produced by a known method and contains a carrier, a diluent or an excipient commonly used in the pharmaceutical field.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc. are used. Injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. Is included. Such injections are prepared according to known methods, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing pudose and other adjuvants and the like are used, and suitable solubilizing agents, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene dalicol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50) and the like.
  • suitable solubilizing agents for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene dalicol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50) and the like.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • Suppositories used for rectal administration are prepared by mixing the above-mentioned antibody or a salt thereof with a usual base for suppositories.
  • the above-mentioned oral or parenteral compositions are conveniently prepared in dosage unit form so as to be compatible with the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit dosage forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg per dosage unit form, especially for injections. 5 to 100 mg, other It is preferable that the above dosage form contains 10 to 250 mg of the above antibody.
  • Each of the above-mentioned compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • DNA Deoxyribonucleic acid
  • RNA Liponucleic acid
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • PVDF Polyvinylidene fluoride
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • Ser Serine G 1 u: gnoretamic acid
  • H histidine
  • Trt trityl group
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • Example 1 Separation of proteins by reparse zymography
  • the tears are diluted 2-fold with a normal temperature (20 ° C) sample buffer (0.125 M Tris-HCl (pH 6.8) / 4% SDS / 20% glycerol / 0.02% bromphenol blue) did.
  • a normal temperature (20 ° C) sample buffer (0.125 M Tris-HCl (pH 6.8) / 4% SDS / 20% glycerol / 0.02% bromphenol blue) did.
  • 10-15 L of tears diluted with this buffer for electrophoresis was applied to a polyacrylamide gel (0.1% gelatin 0.1% SDS / 10-12% polyacrylamide) containing gelatin as a substrate.
  • Electrophoresis was performed using running buffer (0.025 M Tris-HCl Z0.12 M glycine 0.1% SDS). After the electrophoresis, the gel was incubated with papain solution (0.0075 U papain).
  • the gel was washed with 2.5% Triton X-100 and purified water, and incubated with 50 mM acetic acid-10 IBM cysteine buffer (pH 6.0) for 10 hours. After immersion in 20% TCA for 1 minute, the cells were immersed in a staining solution (Coomassie Brilliant Blue 0.025 ° /./ methanol 40 ° /./ acetic acid 10% / water 49.975%) for 2 hours or more for staining. After staining, wash the gel with the first wash solution (methanol 40 ° / acetic acid 10% / water 50%), then wash the gel with the second wash solution (methanol 5% Z acetic acid 7% Z water 88%). Was.
  • Fig. 1 shows the results of reverse zymography of tears from patients with Behcet's disease and Harada's disease.
  • the amino acid sequence at the N-terminal of the protein was determined using the HPG1005A protein sequencing system (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA). That is, after the electrophoresis in Example 1, the stained band was transferred to a PVDF membrane, and the method of Majima et al. [E. Majiraa, et al., J. Biol. Chem. 276 (13), 9792-9799 (1991) ] was used for an amino acid sequence analyzer.
  • the amino acid sequence on the N-terminal side of the 31 kDa protein was as shown in SEQ ID NO: 1. This sequence showed 100% homology with the amino acid sequence at positions 76 to 90 of the known PRP-1 and pHLE1F1 proline-rich proteins. This means that the amino acid sequences of PRP-1 and pHL E1F1 prolin litita titan protein from position 91 onwards are at least 50 ° /. It is considered that the above homology is shown.
  • Example 4 Synthesis of polypeptide of SEQ ID NO: 3
  • Fmoc-Val-Wang resin After swelling Fmoc-Val-Wang resin into which amino acid (Val) corresponding to the C-terminal residue of the polypeptide has been introduced with dimethylformamide (DMF), it is transferred to a reactor of a peptide synthesizer (manufactured by Shimadzu Corporation). The resin was treated with piperidine / DMF to remove the Fmoc group to release amino acids, and washed with DMF. This amino group has the following Fmoc-Ser (tBu) corresponding to the amino acid was condensed by the HOBt / PyBop method.
  • DMF dimethylformamide
  • Fmoc-Pro, Fmoc-Phe, Fmoc-Arg (Pbino, Fmoc-Pro, Fmoc Leu, Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Gin (Trt), Fmoc-Arg (Pbf) , Fmoc-His (Trt), Fmoc-Gly, 'Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Pro, Fmoc-Pro, Fmoc-Arg (Pbf),
  • Fmoc-Trp-Wang resin After the Fmoc-Trp-Wang resin was swollen with DMF, it was put into a reactor of a peptide synthesizer (manufactured by Shimadzu Corporation). The resin was treated with piperidine and DMF to remove the Fmoc group to release the amino acid, and washed with DMF. Fmoc-Leu corresponding to the next amino acid was condensed to this amino group by the HOBt / PyBop method. Thereafter, similarly, Fmoc- Pro, Fmoc- Gin (Trt),
  • Fmoc-Glu OtBu N Fmoc-Gin (Trt), Fmoc-Pro, Fmoc-His (Trt), Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Ala, Fmoc-Pro, Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Asp (OtBu), Fmoc-Arg (Pbf),
  • Fmoc-Gln (Trt) was sequentially condensed to complete the reaction. After the resin was dried, it was treated with a solution containing TFA for 5 hours according to a conventional method to cut off the peptide from the resin and remove the peptide protecting group. The deprotected peptide was washed with getyl ether and dried. This was dissolved in a solution containing acetonitrile / TFA according to a conventional method, and was eluted with a gradient using an HPLC apparatus, and purified. The purified peptide fraction was collected and freeze-dried to obtain a white powder.
  • Example 6 Preparation of Egret Polyclonal Antibody
  • KLH Keyhole Limbet Hemosian
  • a rabbit egret polyclonal antibody was prepared using the prepared polypeptide-KLH complex as an antigen.
  • the immunized animals were Japanese white egrets (male, 2.5-3 kg)-feathers, and the sensitization was with an adjuvant (first time: complete, second and third time: incomplete) suspensions, intradermally on the back This was done by injection and repeated four times every 14 B. Seven days after the last sensitization, blood was collected from the carotid artery under anesthesia to obtain serum. The serum thus obtained was used as a polyclonal antibody. The increase in the antibody titer in the antiserum was confirmed by Enzymnoassy.
  • Example 7 Western plotting
  • the samples were subjected to SDS-electrophoresis using a 15-25 w / v% gradient polyacrylamide gel in the presence of 5 w / v% 2-mercaptoethanol.
  • SDS-electrophoresis was based on a modified method of Lae orchid li [K. U. Laemmli, Nature, 227, 680-685 (1920)].
  • the protein was electrically transferred to a PVDF transfer membrane (Millipore, Bedford, MA).
  • the perforated polyclonal antibody prepared in Example 6 was used as the primary antibody.
  • Goat anti-Peacock IgG conjugate was used as a secondary antibody.
  • the alkaline phosphatase reaction was carried out on the membrane using nitro blue tetrazolium and 5-bromo-4-oct-3-indolyl phosphat.
  • cysteine protease inhibitory activity was based on the method of Barrett [JA Barrett et al., Methods in Enzymology, 80, 535-561 (1981)]. That is, after preincubating a solution containing 85 mM acetate buffer (H5.5), 2 mM dithiolate, 1 mM EDTA, papain (0.0075 U) and test substance for 15 minutes, Z- Phe-Arg-MCA (80 nM) was added to start the reaction. After reacting at 37 ° C for 10 minutes, acetate buffer (pH 4.0) was added to stop the reaction.
  • acetate buffer pH 4.0
  • the amount of released 4-methyl-7-aminocoumarin was measured using a fluorometer at an excitation wavelength of 360 nm and an emission wavelength of 440 nm. Control values those treated in the same manner with the test substance without addition, those papain no added pressure as the blank value, IC 5. I asked.
  • KLH was bound to the polypeptide synthesized in Example 5.
  • a heron polyclonal antibody was prepared using the prepared polypeptide-KLH complex as an antigen.
  • the immunized animal used two Japanese white egrets (male, 2.5-3 kg), and the sensitization was a suspension of adjuvant (first time: complete, second to sixth: incomplete), and the skin on the back It was performed by intravenous injection and repeated 6 times every 14 days. Seven days after the final sensitization, blood was collected from the carotid artery under anesthesia to obtain serum. The serum thus obtained was used as polyclonal-nanore antibody.
  • Example 10 Purification of Escherichia coli Polynal Antibody
  • the DEAE-Affi-Gel Blue column was equilibrated with 5 volumes of binding buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5).
  • the sample obtained in (1) was applied to a column, the flow fraction was collected (flow rate 1-3 ml / min), and the unbound protein was eluted with 3 to 15 volumes of the binding buffer.
  • the bound IgG fraction was eluted with an elution buffer (20 mM Tris-HC1, 1 M NaCl, pH 7.5), and the eluted fraction was analyzed by 12% SDS-PAGE under reducing conditions. ⁇ 1 was analyzed to identify an IgG-containing fraction.
  • the IgG-containing fractions were pooled and desalted on a PD-10 column.
  • the sample is 5 ° /.
  • SDS-electrophoresis was performed using a 15-25% (w / v) gradient polyacrylamide gel in the presence of (w / v) 2 -mercaptoethanol.
  • SDS-electrophoresis was based on a modified method of Lae bandit li [KU Laemmli, Nature, 227, 680-685 (1920)].
  • the protein was electrically transferred to a PVDF transfer membrane (Millipore, Bedford, MA).
  • the egret polyclonal antibody obtained in Example 10 was used as a primary antibody.
  • Goat anti-Peacock IgG conjugate was used as a secondary antibody.
  • Alkaline phosphatase reaction was performed on the membrane using nitro blue tetrazolium and 5-bromo-4 -.- coupe raw 3-indolinolephosphate. SDS-PAGE low-range standard as molecular weight marker (Bio-Rad Laboratories, CA) was used.
  • FIG. 2 shows the results of estan printing using three kinds of egret polyclonal antibodies obtained in Example 10 (after treatment with ammonium sulfate, DEAE-Affi-Gel Blue column, and MonoQ column, respectively).
  • Example 10 recognized the 31 kDa protein. Since this polyclonal antibody is an antibody against a protein corresponding to the known amino acid sequence at positions 119 to 134 of PRP-1, the results were as follows: PRP-1 and pHL as partial sequences of the 31 kDa protein. This is considered to indicate that the sequence has a higher homology with the amino acid sequence of the ElFl proline litz titanium pack than the amino acid number 119. Further, it was confirmed that the purified polyclonal antibody obtained in Example 10 had high specificity.
  • Example 1 2 Synthesis of polypeptide of SEQ ID NO: 1
  • Fmoc-His-Wang resin After swelling Fmoc-His-Wang resin with dimethylformamide (DMF), put it into a reactor of a peptide synthesizer (manufactured by Shimadzu Corporation). The above resin is treated with piperidine / DMF to remove the Fmoc group to release the amino acid, and washed with DMF. Fmoc-His (Trt) corresponding to the following amino acid is condensed to this amino group by the HOBt / PyBop method. Thereafter, similarly,
  • Fmoc-Asp (OtBu) is sequentially condensed to complete the reaction.
  • the resin After the resin is dried, it is treated with a solution containing trifluoroacetic acid (TFA) for 5 hours according to a conventional method to separate the peptide from the resin and to remove the peptide protecting group.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the deprotected peptide is washed with getyl ether and dried.
  • Dissolve the solution containing acetonitrile / TFA according to the standard method.
  • gradient elution is performed using an HPLC apparatus, and purification is performed.
  • the purified peptide fraction is collected and lyophilized to give a white powder.
  • HuCAL registered trademark
  • HuCAL-scFv in E. coli TG-1 is amplified with 2XTY medium (hereinafter abbreviated as 2XTY-CG) containing Kucamu ramphenicol (appropriate amount) and 1% glucose. 0D 6 . .
  • 2XTY-CG 2XTY medium
  • Kucamu ramphenicol appropriate amount
  • 1% glucose 0D 6 .
  • the phage is recovered by PEG precipitation, resuspended in PBS / 20% glycerol, and stored at -80 ° C.
  • TG-1 cells infected with the phage are grown in liquid culture, and those obtained after helper virus infection are directly used. Change the carrier (transferrin, BSA) used in each round of Banning. After two paungings, prepare polyclonal phagemid DNA (BioRobot, Qiagen). Next, the polyclonal phage mid DNA is digested with a restriction enzyme, the resulting insert is subcloned into an expression vector, and then transformed into JM83 cells (Gene 33, 103 (1985)). The transformant is subjected to screening.
  • HuCAL registered trademark
  • BSA carrier
  • the resulting transformant is plated on an agar plate supplemented with chloramphenicol (appropriate amount) and 1% dalcose.
  • the obtained coloeie is transferred to 2XTY-CG medium, grown, and then transferred to an expression plate containing 2XTY / chloramphenicol medium. Add IPTG (final concentration 1 mM) and allow to grow.
  • the periplasmic E. coli extract [Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, New York, USA] is transferred to an antigen-coated MaxiSorp TM plate (Nunc) and ELISA is performed.
  • the scFv is detected using an anti-FLAG Ml and M2 antibody (manufactured by Kodak), and an anti-mouse IgG antibody-specific phosphatase conjugate (manufactured by Sigma) and an AttoPhos substrate (manufactured by Roche Diagnostics). Then, after growing positive clones, DNA is isolated and the nucleotide sequence is determined.
  • a stuffer matching the restriction site used for HuGAL® design was used as a leader sequence, the VH domain obtained in (3) above, Ligation for ligation of immunoglobulin constant region. Subjecting the Kozak sequence leader sequence (EMBL M 83 133) [:... ⁇ Mol Biol 196 , 947 (1987) ].
  • the constant region of human IgGl (PIRJ00228) is synthesized by cleaving this sequence into overlapping oligonucleotides having a length of about 70 bases. Introduce silent mutations to eliminate restriction sites that are incompatible with HuCAL® design. These oligonucleotides are linked by overlap extension PCR.
  • Cotransfect CH0-K1 cells with an equimolar mixture of an IgG heavy chain expression vector and an IgG light chain expression vector are selected using G418 and Zeomycin (Invitrogen). Next, the obtained culture supernatant of the CH0-K1 cell clone is evaluated by IgG capture-ELISA.
  • the microtiter wells are coated with a heron anti-human IgG (Fcy specific, Dako).
  • Proskin with Tris buffered physiological saline / 5% non-fat dry milk After that, the culture supernatant of the obtained CH0-K1 cell clone is added. After washing several times, goat anti-human kappa or e-chain lipophosphatase conjugate, and p-tropophyl phosphate (manufactured by Sigma) are added to determine the presence or absence of IgG.
  • the obtained CHO-K1 cell clone is grown in RPMI-1640 medium supplemented with 10% ultra-low IgG-FCS (manufactured by Life Technologie).
  • the P H of the culture supernatant was adjusted to 8.0, after subjected to sterilization filtration, and subjected solution Protein A column chromatography (Poros 20A, PE manufactured Biosystems) to purified human IgG.
  • the protein of the present invention is a unique protein that is expressed in diseases such as Behcet's disease and Harada's disease, it is possible to accurately and efficiently diagnose, for example, Behcet's disease and Harada's disease.

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Abstract

本発明は、ベーチェット病、原田病などで特異的に発現するタンパク、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、リバースザイモグラフィーを用いることを特徴とするシステインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパクのスクリーニング方法、本発明のタンパクの機能を促進または阻害する活性を有する化合物またはそれらの塩などのスクリーニング方法などを提供する。本発明のスクリーニング方法は、ベーチェット病などの疾患に特異的なポリペプチドを検出し、同定することにより、ベーチェット病などの疾患の機能を調べることができ、さらにはベーチェット病を診断するための客観的な判断材料、さらにはベーチェット病などの治療剤のスクリーニングに使用することができる。

Description

明 細 書
新規タンパクおよびその用途 技術分野
本発明は、 N末端部の配列に配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有し、 かつ分子量が 3 1 kD aであることを特徴とするタンパクおょぴその DNA, 該 タンパクなどを用いることを特徴とするベーチェット病などの疾患のスクリー二 ング方法などに関する。 背景技術
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパクとしては、 例えば、 酸性 PRP— 1で知られるヒ ト唾液腺プロリンリツチタンパクや、 ヒ ト涙腺中の mRNAからェンコ一ドした pHL E 1 F 1 プロリンリッチタンパク (分子 4: 15, 097)が知られている (例えば、 Douglas P. Dickinson et al. , (1995) Investigative Ophthalmology & Visual Science, 36(10), 2020— 203参照。）。 上記プロリンリツチタンパクのうち、 ヒ ト唾液腺プロリンリツチタンパクにつ いては歯と唾液との接点で作用し、 リン酸カルシウム沈殿、 結晶形成を規制し、 連鎖状球菌ミュータンスなどの口内菌を結びつけるタンパクとして作用している ことが分かっている (例えば、 特表 2002-5 16997号公報参照。）。
しかし、 上記プロリンリッチタンパクとベーチェット病との関係などについて は未だ分かっていない。
ベーチェット病とは多臓器侵襲性の炎症性疾患であり、原因は現在不明である。 主症状として、
(1) 口腔粘膜の再発性ァフタ性潰瘍、
(2) 皮膚症状 〔（a) 結節性紅斑、 （b) 皮下の血栓性静脈炎、 （c) 毛嚢炎様皮 疹など〕、 ( 3 ) 眼症状 〔（a ) 虹彩毛様体炎、 （b ) 網膜ぶどう膜炎 （網脈絡膜炎） など〕、
( 4 ) 外陰部潰瘍、
およぴ副症状として、
( 1 ) 変形や硬直を伴わない関節炎、
( 2 ) 副睾丸炎、
( 3 ) 回盲部潰瘍で代表される消化器病変、
( 4 ) 血管病変、
( 5 ) 中等度以上の中枢神経病変
を示す慢性再発性の全身性炎症性疾患をいう。
病型診断は上記症状の出現の仕方により、完全型、不完全型に分けられている。 このようにべーチエツト病は症状の種類によってのみ診断づけられているため診 断が困難な場合があり、 特にベーチェット病として疑わしい場合や、 ベーチェッ ト病とまぎらわしい所見を呈する疾患などの場合に、 診断が困難であるというの が現状である。
また、 ベーチェット病以外の原因のはっきりしない自己免疫疾患、 例えば原田 病などについても同様の困難さが認められている。
ザィモグラフィーは電気泳動を利用する方法であり、 あらかじめゼラチンや力 ゼィンなどの酵素基質となるタンパクを封入したゲルを用い、試料を電気泳動後、 ゲルを酵素と酵素基質が反応する適当な溶液中でィンキュベートした後、 ゲルを 適当なタンパクの染色液中で染色すると、 プロテアーゼによって基質が分解され た部分は、 透明なバンドとして検出され、 その位置と抜けた度合いにより、 プロ テアーゼのおよその活性を測定できる方法である。 またゲルとして S D S—ポリ アクリルアミドゲルを用いると、 その活性と分子量が同時に測定できる方法であ る。一方リパースザィモグラフィ一は、同様に基質含有ゲル上で電気泳動した後、 酵素反応液中にプロテアーゼを添加してゲル中の基質を消化させる。 分離タンパ クにそのプロテアーゼ阻害物質が存在すると、 染色後のゲル全体は、 基質が分解 され白く抜けるが、 酵素活性阻害物質が存在する部分は、 基質が分解されないた め染色されたパンドとして検出されるのでプロテアーゼ阻害剤の分析に利用され ている。 現在、 このリパースザィモグラフィ一は、 癌転移の研究やマトリックス メタ口プロテアーゼ阻害剤のスクリーニング方法などに活用されている（例えば、 宫崎 香ら， （1998) 生物物理化学， 42， 87 - 92参照。）。
しかし、 プロテアーゼとしてシスティンプロテアーゼを使用して、 プロテア一 ゼ阻害剤のスクリーニング方法として利用された報告は認めていない。 発明の開示
本発明は、 ベーチエツト病などの疾患において発現し、 リパースザィモグラフ ィ一の特質からシスティンプロテアーゼ阻害タンパクに属し、 優れた抗ベーチェ ット病剤などをスクリ一二ングするため等に用いることができるシスティンプロ テアーゼ阻害タンパクおよびその D N Aなどに関する。
本発明者らは、患者から採取した涙液、唾液、血液などの検体について、調査、 研究を重ねたところ、 ベーチェット病または原田病を発症したときに、 特異的に 検出されるタンパク、 およぴ検体中で濃度が増大するタンパクが存在することを 見出し、 さらに研究をすすめ本発明を完成した。 したがって、 検体中からこのよ うな物質、 すなわちこれら特異的なタンパクを検出し、 同定することにより、 ベ ーチエツト病などの疾患の機能を調べることができ、 さらにはべーチエツト病な どを診断するための客観的な判断材料、 さらにはべ一チェット病などの予防 ·治 療剤のスクリーユングに使用することができる。
すなわち、 本発明は、
〔1〕 N末端部の配列に配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有し、 かつ分 子量が 3 1 k D aであることを特徴とするタンパク （本明細書において 3 1 k D aタンパクと記載することもある。）、
〔2〕 上記 〔1〕 記載のタンパクをコードするポリヌクレオチドを含有するポリ ヌクレオチド、
〔3〕 D N Aである上記 〔2〕 記載のポリヌクレオチド、
〔4〕 配列番号： 2で表わされる塩基配列を含有する上記 〔3〕 記載の D NA、 〔5〕 上記 〔2〕 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、 〔6〕 上記 〔5〕 記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
〔7〕上記〔6〕記載の形質転換体を培養し、上記〔1〕記載のタンパクを生成、 蓄積せしめ、 これを採取することを特徴とする上記 〔1〕 記載のタンパグの製造 方法、
〔8〕 上記 〔1〕 記載のタンパクもしくはそのアミ ドもしくはそのエステルまた はそれらの塩を含有してなる組成物、
〔9〕 上記 〔2〕 記載のポリヌクレオチドを含有してなる組成物、
〔1 0〕 システィンプロテアーゼ阻害剤である上記 〔8〕 または 〔9〕 記載の組 成物、
〔1 1〕 上記 〔1〕 記載のタンパクに対する抗体、
〔1 2〕上記〔1〕記載のタンパクの活性を不活性化する中和抗体である上記〔1
1〕 記載の抗体、
〔1 3〕 上記 〔1 1〕 記載の抗体を含有してなる組成物、
〔1 4〕 ベーチエツト病の予防 *治療剤である上記 〔1 3〕 記載の組成物、
〔1 5〕 上記 〔1 1〕 記載の抗体を含有してなる診断剤、
〔1 6〕 ベーチエツト病の診断剤である上記 〔1 5〕 記載の診断剤、
〔1 7〕 上記 〔2〕 記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断剤、
〔1 8〕 ベーチェット病の診断剤である上記 〔1 7〕 記載の診断剤、
〔1 9〕 上記 〔1〕 記載のタンパクをコードする D NAに相補的または実質的に 相補的な塩基配列またはその一部を有し、 該タンパクの発現を抑制し得る作用を 有するアンチセンス D NA、
〔2 0〕 上記 〔1 9〕 記載のアンチセンス D NAを含有してなる組成物、 〔2 1〕 ベーチェット病の予防'治療剤である上記 〔2 0〕 記載の組成物、 〔2 2〕 リパースザィモグラフィーを用いることを特徴とするシスティンプロテ ァーゼ阻害活性を有するタンパクのスクリ一ユング方法、
〔2 3〕 システィンプロテアーゼ阻害活性を有するタンパクが上記 〔1〕 記載の タンパクである上記 〔2 2〕 記載のスクリーニング方法、
〔2 4〕 システィンプロテアーゼ阻害活性を有するタンパクが N末端部の配列に 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ分子量が 6 5 k D aであるこ とを特徴とするタンパクである上記 〔2 2〕 記載のスクリーニング方法、 〔2 5〕 上記 〔1〕 記載のタンパクを用いることを特徴とする上記 〔1〕 記載の タンパクの機能を促進または阻害する活性を有する化合物またはそれらの塩のス クリーユング方法、
" 〔2 6〕 N末端部の配列に配列番号： 5で表されるァミノ酸配列を有し、 かつ分 子量が 6 5 k D aであるタンパクを用いることを特徴とする該タンパクの機能を 促進または阻害する活性を有する化合物またはそれらの塩のスクリ一ユング方法、 〔2 7〕 機能がシスティンプロテアーゼ阻害活性またはべ一チヱット病関連因子 である上記 〔2 5〕 記載のスクリーニング方法、
〔2 8〕 機能が原田病関連因子である上記 〔2 6〕 記載のスクリーニング方法、
〔2 9〕 上記 〔1〕 記載のタンパクのシスティンプロテアーゼ阻害活性を試験化 合物の存在下おょぴ非存在下に測定し、 比較することを特徴とする上記 〔2 5〕 記載のスクリ一ユング方法、
[ 3 0〕 上記 〔1〕 記載のタンパクの遺伝子を発現する能力を有する細胞を試験 化合物の存在下おょぴ非存在下に培養し、 それぞれの場合における当該タンパク の m R NAの発現量を測定し、 比較することを特徴とする上記 〔2 5〕 記載のス クリーユング方法、 〔3 1〕上記〔1〕記載のタンパクのプロモーター領域およぴェンハンサー領域、 または上記 〔1〕 記載のタンパクのプロモーター領域をレポーター遺伝子の上流 に連結させた D NAで形質転換した細胞を試験化合物の存在下および非存在下に 培養し、 それぞれの場合におけるレポーター遺伝子の発現量を測定することを特 徴とする上記.〔2 9〕 記載のスクリーニング方法、
〔3 2〕 上記 〔1〕 記載のタンパクの機能を促進または阻害する活性を有する化 合物またはその塩のスクリーニング用キット、
〔3 3〕 上記 〔2 9〕 記載のスクリーニング方法または上記 〔3 2〕 記載のスク リーユング用キットを用いて得られうる、 上記 〔1〕 記載のタンパクの機能を促 進または阻害する活性を有する化合物またはその塩、
〔3 4〕 上記 〔2 9〕 記載のスクリーニング方法または上記 〔3 2〕 記載のスク リー-ング用キットを用いて得られうる、 上記 〔1〕 記載のタンパクの機能を促 進または阻害する活性を有する化合物またはその塩を含有してなる組成物、
〔3 5〕 上記 〔2 9〕 記載のスクリーニング方法または上記 〔3 2〕 記載のスク リーユング用キットを用いて得られうる、 上記 〔1〕 記載のタンパクの機能を阻 害する活性を有する化合物またはその塩を含有してなるベーチェット病の予防 · 治療剤、
〔3 6〕 配列番号： 4で表わされるァミノ酸配列であることを特徴とするポリべ プチド、
〔3 7〕 有効量の上記 〔1 1〕 記載の抗体を患者に投与することを含むベーチェ ット病の予防 ·治療方法、
〔3 8〕 有効量の上記 〔1 9〕 記載のアンチセンス D N Aを患者に投与すること を含むベーチエツト病の予防 ·治療方法、
〔3 9〕 ベーチェット病の予防 ·治療剤の製造のための上記 〔1 1〕 記載の抗体 の使用、 および
〔4 0〕 ベーチェット病の予防'治療剤の製造のための上記 〔1 9〕 記載のアン チセンス D N Aの使用、
に関する。 本発明のさらなる特徴及び本発明の利点は、 以下の 「発明を実施するための最 良の形態」 の記載から明らかとなるであろう。 図面の簡単な説明
図 1は、 ベーチェット病患者、 原田病患者おょぴ正常人の涙液のリパースザィ モグラフィーを示す。
図 2は、 3種のゥサギポリクローナル抗体を用いたウェスタンプロッティング を示す。 レーン 1 ：マーカー、 レーン 2 ：硫酸アンモニゥム処理後のポリクロー ナル抗体、 レーン 3 ： DEAE-A f f i一 G e 1 B 1 u eカラム処理後のポ リクローナル抗体、 レーン 4 ： Mo n o Qカラム処理後のポリクローナル抗体。 発明を実施するための最良の形態
本発明の 3 1 kD aタンパクは、 例えばべーチエツト病などに関連して検出さ れ、 もしくは濃度の増大が確認される物質である。
本発明の 3 1 kD aタンパクは、 N末端部の 1 5me rァミノ酸が配列番号： 1で示される配列を示すことから、 配列番号： 1と同一のァミノ酸配列を含有す る PRP— 1または pHL E 1 F 1プロリンリツチタンパクのアミノ酸配列の 76番目のァスパラギン酸から 1 34番目のトリプトフアンのァミノ酸配列との 相同性をもつアミノ酸配列を少なくとも約 50 %以上、 更には約 60、 70、 7 5、 80、 85、 90、 95 °/0以上有すると考えられる。
本発明の 3 1 kD aタンパクは、 ベーチェット病などの患者の涙液、 血液、 細 胞または組織などから公知のタンパク分離精製方法によつて製造することもでき るし、 本発明のタンパクをコードする D N Aを含有する形質転換体を培養するこ とによっても製造することができる。
患者の涙液、 血液、 細胞または組織から製造する場合、 例えば、 涙液はそのま ま逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラ フィ一を組み合わせることにより精製単離することができ、 血液は遠心分離で血 清または血漿を分離した後、 上記ク口マトグラフィ一などにより精製単離するこ とができる。 細胞または組織はホモジナイズなどした後、 塩析ゃ酸などで抽出ま たは分画を行ない、 該抽出液または画分を逆相クロマトグラフィー、 イオン交換 クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィ一を組み合わせることにより精製単 離することができる。
本発明の 3 1 k D aタンパクを組換え D NA技術により製造する場合、例えば、 上記タンパクをコードする D NAを調製し、 これを発現用ベクターに挿入したも のを大腸菌、 枯草菌、 放線菌、 酵母等の宿主に導入して形質転換体とし、 その培 養物から本発明のタンパクを採取してもよい。
従つて本発明は、 上記の本発明のタンパクをコードするヌクレオチド配列を含 む D NAを提供することも含むものである。 本発明において、 特に、 後述の形質 転換大腸菌に保持されるプラスミドベクターに組み込まれているものが好適に使 用しうる。 別の観点として、 本発明は、 上記 D NAを含む組換えベクターを提供 する。 本発明において、 糸且換えベクターとしては、 上記 D NAにコードされるァ ミノ酸配列からなるぺプチドの発現を可能ならしめるベクター中に組み込まれて いるものが好適に使用しうる。
所望のヌクレオチド配列を有する D N Aを調製する方法としては、 例えば、 該 所望の D N Aの部分配列ヌクレオチドであって、 両端がオーバーラップするよう なセンスおよびアンチセンスヌクレオチドを化学合成し、 次いでポリメラーゼ連 鎖反応 [Saiki, R. K. et al (1988) Science 239, 487-491参照] 等の D NAポ リメラーゼ反応やリガーゼ反応を利用することにより、 それら部分配列が連結し たものを得る方法等が挙げられる。
本発明のタンパクのアミノ酸配列をコ^ "ドする D N Aを好適なベクタ一に組み 込むことにより、 原核生物または真核生物の宿主細胞を形質転換させることがで きる。 さらに、 これらのベクターに適当なプロモーターおよび形質転換にかかわ る配列を導入することにより、 それぞれの宿主細胞において該 DN Aを発現させ ることができる。 すなわち本発明はまた、 本発明のタンパクの発現を可能ならし めるべクター中に本発明の DNAが組み込まれている組換えベクターを保持する 宿主細胞に関する。
原核細胞の宿主としては、例えば大腸菌（Escherichia coli)や枯草菌（Bacillus subtilis) 等が挙げられる。 目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質発現させ るには、 宿主と適合し得る種由来のレブリコン、 すなわち複製起点おょぴ調節配 列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させればよい。 またべ クタ一は形質転換細胞に表現形質 （表現型） の選択性を付与することができる配 列を持つものが望ましい。
大腸菌としては E. c o l i K12株、 JM109株等がよく用いられ、ベタ ターとしては一般に p BR 322や pUC系のプラスミドがよく用いられるが、 これらに限定されず、 公知の各種の菌株およびベクターがいずれも利用できる。 プロモーターとしては、 大腸菌においてはトリプトファン （t r p) プロモータ 一、 ラタトース ( l a c) プロモーター、 トリプトファン ·ラクトース ( t a c) プロモーター、 Vポプロティン ( 1 p) プロモーター、 パクテリオファージ由 来のラムダ (X) PLプロモーター、 ポリぺプチド鎖伸長因子 T u ( t u f B) プロモーター、 1 a c UV 5プロモーター等が挙げられ、 いずれのプロモーター も本発明のタンパクの産生に使用することができる。
枯草菌としては、 例えば 207— 25株が好ましく、 ベクターとしては pTU B 228 [Ohmura, K. , et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93 参照] 等が用い られるが、 これに限定されるものではない。 枯草菌用プロモーターとしては、 枯 草菌の α—アミラーゼ遺伝子の調節配列がよく用いられ、 さらに必要により α— アミラーゼのシグナルぺプチド配列をコードする D Ν Α配列を連結することによ り、 菌体外.での分泌発現も可能となる。
宿主細胞として大腸菌を用いる場合を例に挙げると、 発現ベクターとしては、 p B R 3 2 2複製起点を有し、 大腸菌において自立増殖が可能であり、 さらに転 写プロモーター、 翻訳開始シグナルを備えたものを用いることができる。 該発現 ベクターはカルシウム一クロライド法 [Mandel, M. and Higa, A. (1970) J. Mol.
Biol. 53, 154参照]、 Hanahanの方法 [Hanahan, D. and Meselson, M. (1980) Gene 10, 63参照] および電気パルス穿孔法 [Neumann, E. , et al. (1982) EMBO J. 1，
841-845 参照] 等により大腸菌に取り込ませることができ、 力べして所望のベタ ターが形質転換された細胞を得ることができる。
真核生物の宿主細胞には、 脊椎動物、 昆虫、 酵母等の細胞が含まれ、 脊椎動物 細胞としては、 例えばサルの腎細胞由来である C O S細胞 [Gluzman, Y. (1981) Cell23, 175 - 182参照] やチヤィ ーズハムスター卵巣細胞 （C H O)、 ヒ トナマ ルバ細胞ノ、ムスター B H K細胞等がよく用いられるが、これらに限定されない。 脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、 通常発現させようとする遺伝子の上流 に位置するプロモーター、 R N Aのスプライス部位、 ポリアデニル化部位および 転写終結配列等を有するものを使用でき、 これはさらに必要により複製起点を有 してもよい。 該発現べクタ一の例としては、 S V 4 0の初期プロモーターを有す
¾ p S V 2 d h f r [Subramani, S. , et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864 参照] 等を例示できるが、 これに限定されない。
また真核微生物としては酵母が一般によく用いられており、 その中でもサッカ 口ミセス属酵母、列えぱサッカロミセス 'セレビシェ (Saccharorayces cerevisiae) が好ましい。 該酵母等の真核生物の発現べクターとしては、 例えばアルコール脱 水素酵素遺伝子のプロモーター [Bennetzen, J. L. and Hall, B. D. (1982) J. Biol.
Chem. 257, 3018-3025参照] や酸性ホスファターゼ遺伝子のプロモーター
[Miyanohara, A. , et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80， 1-5参照] 等を好ましく利用できる。
宿主細胞として、 C O S細胞を用いる場合を例に挙げると、 発現ベクターとし ては、 S V 4 0複製起点を有し、 C O S細胞において自立増殖が可能であり、 さ らに転写プロモーター、 転写集結シグナルおょぴ R N Aスプライス部位を備えた ものを用いることができる。 該発現べクタ一は DEAE—デキストラン法
[Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11， 1295—1308参 照]、 リン酸カルシウム一 DN A共沈澱法 [Graham, F. L. and van der Ed, A. J. (1973) Virology 52, 456- 457参照] および電気パルス穿孔法 [Neumann, E. , et al. (1982) EMBO J. 1, 841 - 845 参照] 等により C O S細胞に取り込ませること ができ、 かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。 また、 宿主細胞とし て CHO細胞を用いる場合には、 発現ベクターとして G418耐性マーカーとし て機能する n e o遣伝子を発現し得るベクター、例えば p RS Vn e o [Sambrook, J. , et al. u989) Mo丄 ecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Haroor Laboratory, NY参照] や p SV2 n e o [Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1， 327-341 参照] 等を使用し、 G418耐性のコロニー を選択することにより本発明のタンパクを安定に産生する形質転換細胞を得るこ とができる。
上記のように、 本発明において、 形質転換細胞は本発明のタンパクを産生する ように形質転換されたものであればいずれでも良く、 特に制限されるものではな レ、。
上記で得られる所望の形質転換体は、 常法に従い培養することができ、 該培養 により細胞内または細胞外に本発明のタンパクが生産される。 該培養に用いられ る培地としては、 採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択で き、 例えば、 大腸菌であればトリプトン一イースト培地 （バタト トリプトン 1. 6 %、イース トエキストラタ ト 1. 0%、塩化ナトリウム 0. 5% (pH7. 0)) やペプトン培地 （ディフコ社製） 等を使用できる。 また、 上記 COS細胞であれ ば RPMI 1640培地やダルベッコ修正イーグル培地 （DMEM) 等の培地に 必要に応じゥシ胎児血清 （FBS) 等の血清成分を添加したものを使用できる。 上記により、 形質転換体の細胞内または細胞外に生産される本発明のタンパク は、 該タンパクの物理的性質や化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法 により、 分離 ·精製することができる。 かかる方法としては、 具体的には例えば 通常のタンパク沈澱剤による処理、限外ろ過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲ ルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アブイニテ ィークロマトグラフィー、 分配クロマトグラフィー、 高速液体クロマトグラフィ 一 (H P L C ) 等の各種クロマトグラフィー、 透析法、 これらの組合せ等を例示 できる。 外来遺伝子を大腸菌等に導入して大量発現させた場合、 産生されたぺプ チドが、 封入体と呼ばれる水に不溶の集塊を形成することがある。 そのような場 合、 グァニジンィソチオシァネート等の強力な変性剤を用いて該ぺプチドを変性 させることにより該ぺプチドを可溶化することができる。
さらに、 本発明のタンパクは、 かくして得られるポリぺプチドに糖質ゃポリェ チレンダリコールを付加して得られる複合体としての形態、 さらには、 ポリぺプ チドをァセチル化、 アミド化および/または多官能試薬により架橋重合させて得 られる誘導体または重合体としての形態であってもよい。
上記培養物から本発明のタンパクを分離精製するには、 例えば、 下記の方法に より行なうことができる。 本発明のタンパクを培養菌体あるいは細胞から抽出す るに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩 衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体ぁ るいは細胞を破壊したのち、 遠心分離やろ過によりポリべプチドの粗抽出液を得 る方法などが適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァ-ジンなどのタンパ ク変性剤や、 才クトキシノール (例えば、 トリ トン X— 1 0 0など） などの界面 活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、 培養終了後、 公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。 このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるポリべプチドの 精製は、 公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 これら の公知の分離、精製法としては、塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲル電気 泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグラフィ 一などの荷電の差を利用する方法、 アブイユティークロマトグラフィーなどの特 異的親和性を利用する方法、 分配クロマトグラフィーなどの溶解度の差を利用す る方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、 等 電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
このようにして生成する本発明のタンパクの存在または活性は、 特異抗体を用 いたェンザィムィムノアッセィなどにより測定することができる。
本発明のタンパクは、ぺプチド標記の慣例に従って左端が N末端（ァミノ末端)、 右端が。末端 （カルボキシル末端） である。 本発明のタンパクは、 C末端が通常 力ルポキシル基 (- C O O H) s カルボキシレート（一 C O O— )、 アミド (一 C O NH 2) またはエステル (- C O O R ) もしくはそれらの塩のいずれであっても よい。
ここでエステルにおける Rとしては、 6アルキル基 （例えばメチル、 ェチ ル、 プロピル、 イソプロピル、 プチルなど）、 C 6— 1 2ァリール基 (例えばフエ- ル、 1—ナフチルなど） などが用いられる。 本発明のタンパクが C末端以外に力 ルボキシル基 (またはカルボキシレート) を有している場合、 カルボキシル基が アミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパクに含まれる。 この 場合のエステルとしては、 例えば上記した c末端のエステルなどが用いられる。 さらに、 本発明のタンパクには、 N末端のアミノ酸残基 (例えば、 メチォニン残 基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの アル力 ノィルなどの C i— eァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断されて 生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸ィヒしたもの、 分子内のアミ ノ酸の側鎖上の置換基 （例えばヒドロキシ基、 スルファニル基、 アミノ基、 イミ ダゾリル基、 インドリル基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホル ミル基、 ァセチル基などの アルカノィル基などの ァシル基など） で 保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ポリペプチドなどの複 合ポリぺプチドなども含まれる。
本発明のタンパクの塩としては、 生理学的に許容される酸 （例えば、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例えば、 アルカリ金属塩） などとの塩が用いられ、 とりわけ生 理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 (例えば、塩酸、 リン酸、臭化水素酸、硫酸） との塩、 あるいは有機酸（例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン 酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との 塩などが用いられる。
本発明のアンチセンス D N Aは修飾された D NAであってもよい。 修飾された D NAの具体例としては D NAの硫黄誘導体やチォホスフヱ一ト誘導体、 そして ポリヌクレオシドアミ ドゃォリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙 げられるが、 それに限定されるものではない。 本発明のアンチセンス D N Aは、 細胞内でより安定なものにするため、 細胞透過性をより高めるため、 目標とする センス鎖に対する親和性をより大きなものにするため、 または毒性をより小さく するため、 好ましく設計、 修飾されうる。 本発明のアンチセンス D NAは、 変化 せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与されたり、 遺伝子治療により適用され たり、 付加された形態で与えられることができうる。 このようなアンチセンス D N Aに対する修飾としては、 リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジ ンのようなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増 大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コレステロールなど） といった 疎水性のものが挙げられる。 このような付加は、 核酸の 3， 端あるいは 5， 端に 付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付着させる ことができうる。 アンチセンス D NAの阻害活性は、 本発明の形質転換体、 ある いは本発明のタンパクの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。 該 D NAは、 公知の各種の方法で細胞に適用できる。
本発明のタンパクに対する抗体は、 本発明のタンパクを認識し得る抗体であれ ば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよいが、 モノク ローナル抗体がより好ましい。 本発明のタンパクに対する抗体は、 本発明のタン パクまたは本発明のタンパクのアミノ酸配列の一部あるいはそのアミノ酸配列の 一部を有する抗原性を有するポリべプチドを抗原として用い、 公知の抗体または 抗血清の製造法に従つて製造することができる。
より具体的には、 3 1 k D aタンパクに対する抗体としては、 配列番号： 1、 配列番号： 3若しくは配列番号： 4.のアミノ酸配列、 又はそれらの部分配列から なるポリぺプチドを特異的に認識する抗体が好ましく、 6 1 k D aタンパクに対 する抗体としては、 配列番号： 5のァミノ酸配列又はその部分配列からなるポリ ペプチドを特異的に認識する抗体が好ましい。 かかる抗体は、 配列番号： 1、 配 列番号： 3、 配列番号： 4若しくは配列番号： 5のアミノ酸配列、 又はその部分 配列からなるポリペプチドを抗原として用いることで作製できる。 なお、 部分配 列からなるポリぺプチドは、抗原性を有する限り特に限定されるものではないが、 例えば配列番号： 1、 配列番号： 3、 配列番号： 4若しくは配列番号： 5のアミ ノ酸配列から選ばれる少なくとも 6個、 好ましくは少なくとも 8個、 より好まし くは少なくとも 1ひ個以上の連続したアミノ酸からなるポリペプチドであり得る。 上記抗原性を有するポリペプチドは、例えば、 「固相法」 または 「液相法」 とし て知られる慣用のぺプチド合成法により調製することができる。 例えば、 社団法 人日本生化学会編「新生化学実験講座」、第 1卷、 「タンパク質 V I」、第 3〜4 4 頁、 1 9 9 2年、 東京化学同人発行などにはペプチド合成の詳細が記載されてい る。 また本発明に記載のタンパクのアミノ酸配列の一部あるいはそのアミノ酸配 列の一部を有するポリペプチドは、 ペプチド合成装置 （島津製作所製） を用い、 Fmoc (9- fluorenyl methyloxycarbonyl)固相合成法にて同装置のプロトコールに 従って合成することができる。 すなわち、 合成する各ペプチドの C末端に相当す るァミノ酸が導入されている Fmoc - L-ァミノ酸 Wang樹脂 （または C1 - Trt樹脂） を上記べプチド合成装置の反応容器にセットし、 デブロテクション溶液を用いて Fmocを除く。 デプロテクション溶液としては、 ピぺリジンノジメチルホルムアミ ド （DMF ) が好適に利用できる。 さらに C末端から 2番目のアミノ酸に相当す るァミノ酸溶液とァクチベータ一溶液を反応せしめ、反応後再ぴ Fmoc基のデプロ テク'シヨンを行い、 同様の操作を繰り返すことにより、 目的とするペプチドを合 成することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
上記抗原性を有するポリべプチドは、 温血動物に対して投与により抗体産生が 可能な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して •抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジ ュパントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程 度行われることが好ましい。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサ ギ、 ィヌ、 モルモッ ト、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられる が、 好ましくはマウス、 ラット、 ゥサギである。 モノクローナル抗体産生細胞の 作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばゥサギから抗体価の認めら れた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、 それら に含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることに より、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製することができる。 抗血清 中の抗体価の測定は、 例えば、 放射性物質や酵素などで標識した標識化ポリぺプ チドと抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定すること により行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルス タインの方法 〔Nature、 256、 495 (1975) ] に従い実施することができる。 融合促 進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （P E G) やセンダイウィルス などが挙げられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2 / 0、 A P— 1な どの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。 用 いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1 〜2 0 ： 1程度であり、 P E G (好ましくは P E G 1 0 0 0〜P E G 6 0 0 0 ) が 1 0〜 8 0 %程度の濃度で添加され、 2 0〜 4 0 °C、 好ましくは 3 0〜 3 7 °C で 1〜1 0分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーユングには種々の方法が使用 できるが、 例えば、 ポリペプチド抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固 相 （例えば、 マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 次に放射 性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞 がマウスの場合、抗マウス免疫グロプリン抗体が用いられる。)またはプロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロプリ ン抗体またはプロティン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したポリぺプチドを加え、 固相に結合したモノクロ ーナル抗体を検出する方法などが挙げられる。 モノクローナル抗体の選別は、 公 知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。 通常 HAT (ヒポキ サンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうこと ができる。 選別および育種用培地としては、 ハイプリ ドーマが生育できるものな らばどのような培地を用いても良い。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株）） あるいはハイプリ ドーマ培養用無血清培地 （S FM— 1 0 1、 日水製薬 （株）） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ま しくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができ る。 ハイプリ ドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様 にして測定できる。
モノクローナル抗体の分離精製は、 公知の方法、 例えば、 免疫グロブリンの分 離精製法 〔例えば、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 ィ オン交換体 （例えば、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原 結合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗 体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうこ とができる。
また、 ファージディスプレイ法を用いて単鎖抗体 （s c F v ) を調製した後、 モノクローナル抗体に変換することもできる 〔例えば Mol. Biol. 296, 55 (2000)； http: // . morphosys. com/start, php参照」。
ファージディスプレイ法を用いる単鎖抗体 （s c F v ) の調製は、 自体公知の 方法により行うことができる 〔例えば米国特許第 5, 565, 332号； Nature 352：
624-628 (1991)； Science 246： 1275 - 1281 (1989)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88： 11120-11123 (1993)； J. Mol. Biol. 222： 581-597 (1991)； Nature 348： 552-554 (1990) 参照〕。 なお、 この際、 ファージディスプレイライプラリーとし て単鎖 F Vベースのファージデイスプレイライブラリ一である H u C A L (登録 商標) を用いることもできる [J. Mol. Biol. 296, 55 (2000) ； http：〃 www. morphosys. com/ start, php j。
scFvのモノクローナル抗体への変換は、上記で得られた s c F Vから重鎖、軽 鎖可変領域をクローニングし、 それぞれ、 免疫グロブリン重鎖、 軽鎖定常領域に 連結することで行なわれる。 この際、必要に応じて、 リーダー配列の付加、 Kozak 配列への修飾、 制限部位の除去、 付加などのために、 ヌクレオチド変異を導入す る。このようにして得られた連結物を発現べクターのクローユング部位に導入し、 宿主細胞を形質転換して、 形質転換体を得る。 得られた形質転換体のうち、 抗免 疫グロプリン抗体に対する結合能を有する免疫グロプリンを発現する形質転換体 を、 E L I S A等の自体公知の方法により選別する。 次いで、 選別した形質転換 体にモノクローナル抗体を発現させ、 分離精製を行なうことにより、 目的のモノ クローナル抗体を取得できる。 なお、 本方法において、 発現ベクター、 宿主細胞 などは上述と同様のものを用いることができ、 また、 形質転換法、 分離精製法な どについても、 上述と同様にして行うことができる。
〔ポリク口ーナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って製造 することができる。 例えば、 免疫抗原 （本発明のタンパクに対し抗原性を有する もの） 自体、 あるいはそれとキャリアータンパクとの複合体をつくり、 上記のモ ノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本 発明のタンパクに対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことに より製造することができる。 投与に際して抗体産生能を高めるため、.完全フロイ ントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なわれる。 ポリクローナル 抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液か ら採取することができる。 抗血清中のポリク口ーナル抗体価の測定は、 上記の抗 血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製 は、 上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法 に従って行なうことができる。 また、 実施例に開示されるように、 血清を硫安沈 殿に付し、 次いで D E A E— A f f i - G e 1 B 1 u eカラム及び/又は M o n o Qカラムで処理することにより、-より純度に優れたポリクローナル抗体を分 離精製することもできる。本発明のタンパクに対する抗体 (以下、 「本発明の抗体」 と称することもある。）としては、例えば、ヒト唾液腺プロリンリツチタンパク ( P P - 1 ) の部分ァミノ酸配列である
Gln-Gln-Arg-Pro-Pro-Arg-Arg-Gly-His-Arg-Gln-Leu-Ser-Leu-Pro-Arg-Phe-Pro- Ser-Val (配列番号： 3 ) からなるポリペプチドを抗原とする抗体が挙げられる。 本発明のタンパクは、 電気泳動法を利用するリバースザィモグラフィ一法によ りペプチドの分離とその可視化を行うと、 好適に検出を行うことができる。 リバ ースザィモグラフィ一法に用いられるゲルは、 ポリアクリルアミドを含有してい ることが好ましく、 該ポリアクリルアミドの含有量は、 2〜 30 w/ V %程度で あることが好ましく、 5〜15 w/v%程度であることがより好ましい。 また、 リパースザィモダラフィ一法に用いられるゲルは、 S D S等の界面活性剤を含有 していることが好ましく、 該 SDSの濃度は、 0. 0001〜 1 5 wZv%程度 であることが好ましく、 0. 0 l〜5wZv%程度であることがより好ましい。 また、 リバースザィモグラフィ一法に用いられるゲルは、 例えばゼラチン、 カゼ イン、 エラスチン、 フィプリンなどの基質を含有していることが好ましく、 特に ゼラチンが好ましい。基質濃度は、例えばゼラチンの場合、 0. 0 1〜lw/v% 程度が好ましく、 0. 05〜0. 5 w/v %程度がより好ましい。 電気泳動後の ゲルはトリ トン X— 100などを含む緩衝液中で洗浄し、 システィンプロテア一 ゼ添加溶液中でィンキュベートした後ゲルを洗浄後、 ク一マシープリリアントブ ルーなどでゲルを染色する。
システィンプロテアーゼとしては、例えばパパイン、フイシン、プロメライン、 カテブシン B， H, Lおよびカルパインなどが好ましく、 特にパパインが好まし い。
本発明のタンパクは、 少なくともべ一チヱット病ゃ原田病などの発症時に、 検 出され、 もしくは濃度の増大が確認される。 本リバースザィモグラフィ一法によ れば検体を採取した生物で、 本発明のタンパクが検出されると、 ベーチェット病 や原田病などの疾患時に特異的に発現するポリペプチドでありうるので、 本発明 のタンパクをべーチエツト病ゃ原田病の指標物質とすることができる。
このような物質を指標物質として用いると、 患者から採取した検体 （例えば、 涙液、 血液、 唾液など） を検査することにより、 特にベーチェット病として疑わ しい場合や、 ベーチェット病とまぎらわしい所見を呈する疾患などの場合に、 的 確な診断が行うことができるようになる。
少なくともべーチエツト病の発症時に、 検出され、 もしくは濃度の増大が確認 される指標物質としては、 例えば、 本発明の 31 kD aタンパクが挙げられる。 なお、 「3 1 k D aタンパク」 とは、例えば、上記リバースザィモグラフィ一法に より指標物質の検出を行った場合に、 3 1 k D a近傍にパンドとして検出される 物質をいう。
少なくとも原田病の発症時に、 検出され、 もしくは濃度の増大が確認される指 標物質としては、 例えば、 N末端側のァミノ酸配列が配列番号： 5であり、 分子 量約 6 5 k D aのシスティンプロテアーゼ阻害物質などが挙げられる。なお、 「配 列番号： 5であり、 分子量約 6 5 k D aのシスティンプロテアーゼ阻害物質」 と は、 例えば、 上記リバースザィモグラフィ一法により指標物質の検出を行った場 合に、 6 5 k D a近傍にバンドとして検出される物質をいう。
本発明のタンパクは上記リバースザィモグラフィ一の特質から、 プロテイン阻 害活性を有する。 したがって本発明のタンパクもしくはそれらのアミドもしくは エステルまたはそれらの塩は、 システィンプロテアーゼが関与する疾患、 例えば 骨粗鬆症などの治療 ·予防剤などの ,钽成物として使用できる。
本発明のタンパクをコードする D NAを上記の治療 ·予防剤として使用する場 合は、 該 D N Aを単独あるいはレトロウィルスベクター、 アデノウイルスベクタ ―、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクターなどの適当なベクターに 挿入した後、 常套手段に従って、 ヒトまたは温血動物に投与することができる。 本発明の D NAは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学 的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのよ うなカテーテルによって投与できる。 本発明のタンパクを上記の治療 ·予防剤と して使用する場合は、 少なくとも 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましく は 9 8 %以上、 さらに好ましくは 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好 ましい。
本発明のタンパクもしくはそれらのアミドもしくはエステノレまたはそれらの塩 は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイ クロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許 容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用 できる。 例えば、 本発明のタンパクを生理学的に認められる担体、 賦形剤、 防腐 剤、 安定剤、 結合剤、 甘味剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求され る単位用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤にお ける有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。 錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化 剤、 ステアリン酸マグネシゥムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリン のような甘味剤などが用いられる。錠剤には、適当なコーティング剤（ゼラチン、 白糖、 アラビアゴム、 カルナパロウなど）、腸溶性コーティング剤 (例えば、酢酸 フタノレ酸セルロース、 メタアクリル酸コポリマー、 ヒドロキシプロピルセルロー スフタレート、 カルボキシメチルェチルセルロースなど) などで剤皮を施しても よい。 カプセルである場合には、 前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担 体を含有することができる。 また、 カプセル剤は通常のカプセルの他、 腸溶性コ 一ティンダカプセル、 胃内抵抗性力プセル、 放出制御力プセルとすることもでき る。注射のための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、ゴマ油、 椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製 剤実施に従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理 食塩水、 ブドゥ糖やその他の補助薬を含む等張液 (例えば、 D—ソルビトール、 D—マン-トール、 塩化ナトリウムなど） などが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノールなど）、 ポリアルコール （例えば、 プロ ピレングリコール、 ポリエチレングリコールなど）、非ィォン性界面活性剤（例え ば、 ポリソルベート 8 0、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 5 0など） などと併 用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが挙げられ、 溶解 補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 ま た、緩衝剤（例えば、 リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリゥム緩衝液など）、無痛化剤（例 えば、塩酸プロ力インなど）、安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレ ングリコールなど）、 保存剤 （例えば、 ペンジノレアノレコール、 フエノールなど）、 酸ィ匕防止剤などと配合してもよレ、。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプル に充填される。本発明の D NAが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、 通常、 非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 温血動物 (例えば、 ヒ ト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 プタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与することがで きる。 本発明のタンパクの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば骨粗鬆症の治療目的で本発明のタンパクを経口投与する 場合、一般的に成人 （6 0 k gとして） においては、 1日約 0 . 1 m g〜 1 0 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0〜 5 0 0 m g投与する。
本発明のタンパクまたは本発明のタンパクをコードする D NAは、 本発明のタ ンパクの発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのため のプローブとしても有用である。 すなわち、 本発明は、 本発明のタンパクを用い ることを特徴とする本発明のタンパクの発現を促進または阻害する活性を有する 化合物のスクリーニング方法などを提供する。 具体的には、 例えば、 本発明のタ ンパクの遺伝子を発現する能力を有する細胞を試験化合物の存在下に培養し、 本 発明のタンパクをコードする D N Aもしくはその相補的 D N Aまたはその部分 D N Aを用いて本発明のタンパクをコードする m R N Aの量を測定することを特徴 とする本発明のタンパクの発現を促進または阻害する活性を有する化合物または その塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のタンパクの遺伝子を発現する能力を有する細胞としては、 例えば、 本 発明のタンパクの遺伝子を導入し形質転換した動物細胞などがあげられる。 本発 明のタンパクの遺伝子を導入し形質転換した動物細胞は上述の方法により製造で きる。 本発明のタンパクの遺伝子を発現する能力を有する細胞の培養は、 公知の 動物細胞培養法と同様にして行われる。 例えば、 培地としては、 約 5〜 20 %の 胎児牛血清を含む MEM培地 〔Science， 1 22卷， 50 1 (1952)〕， DME M培地〔Virology， 8卷， 396 (1 959)〕， RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association, 1 99卷， 5 1 9 (1967)], 1 99 培地 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73卷， 1 (1 950)〕等が用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。培養は通常約 3 0〜40°Cで約 1 5〜60時間行ない必要に応じて継代培養をおこなってもよい c また、 培養は必要に応じて通気や撹拌を加えてもよい。
mRNAの発現量の比較をハイプリダイゼーシヨン法によって行うには、 公知 の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ·クロ一ニンク"
(Molecular Cloning) 2 n a (J. Sambrook et al. , Cold Spring harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法等に従って行なうことができる。 具体的には、 本発明 のタンパクをコードする！ nRNAの量の測定は、 公知の方法に従って細胞から抽 出した RNAと本発明のタンパクの遣伝子をコードする D N Aの相補的 D N Aま たはその部分 D N Aとを接触させ、 本究、明のタンパクの遺伝子 D N Aの相補的 D N Aに結合した niRNAの量を測定することによって行われる。 本発明のタンパ クの遺伝子 DNAの相補的 DNAまたはその部分 DNAを、 例えば放射性同位元 素、 色素などで標識することによって、 本発明のタンパクの遺伝子 DNAの相補 的 D N Aに結合した m R N Aの量が容易に測定できる。放射性同位元素としては、 例えば 〔32P〕、 〔3H〕 などが用いられ、 色素としては、 例えば fluoresceinな どの蛍光色素が用いられる。 また、 本発明のタンパクの mRNAの量は、 細胞か ら抽出した RN Aを逆転写酵素によって相補的 DN Aに変換した後、 本発明のタ ンパクの遺伝子をコードする DN Aもしくはその相補的 DN Aまたはその部分 D NAをプライマーとして用いる PCRによって、 増幅される相補的 DNAの量を 測定することによって行うことができる。 本発明のタンパクの m R N Aの量の測 定に用いられる本発明のタンパクの遺伝子 D NAの相補的 D NAとしては、 本発 明のタンパクの遺伝子 D N A (上鎖） に相補的な配列を有する D N A (下鎖） が あげられる。
また、 本発明は、 本発明のタンパクの公知プロモーターゃェンハンサー領域を ゲノム D NAよりクローユングし、 適当なレポーター遺伝子の上流に連結させた D NAで形質転換した細胞 （例えば、 脂肪細胞、 マクロファージ、 骨格筋細胞な ど） を試験化合物の存在下で培養し、 本発明のタンパクの発現に代えてレポータ 一遺伝子の発現を検出することを特徴とする、 本発明のタンパクの発現を促進ま たは阻害する活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。 レポーター遺伝子としては、 例えば、 1 & c Z ガラクトシダーゼ遺伝子） などの染色マーカ一遺伝子等などが用いられる。レポータ一遺伝子産物（例えば、 m R N A、 ポリペプチド） の量を公知の方法を用いて測定することによって、 レ ポーター遺伝子産物の量を増加させる試験化合物を本発明のタンパクの遺伝子の 発現を促進する活性を有する化合物として、 レポーター遺伝子産物の量を減少さ せる試験化合物を、 本発明のタンパクの遺伝子の発現を阻害する化合物として選 択できる。 細胞の培養は、 上記した公知の動物細胞培養と同様に行うことができ る。
さらに、 本発明は （i ) 本発明のタンパクを例えば大腸菌に発現させ、 それを 精製した後、 本発明のタンパクのシスティンプロテアーゼ阻害活性と （ii) 本発 明のタンパクと一緒に試験化合物を添カ卩した場合のシスティンプロテアーゼ阻害 活性を、 リパースザィモグラフィ一法などを用いて測定し、 比較を行うことを特 徴とする、 本発明のタンパクの機能を促進または阻害する活性を有する化合物ま たはその塩のスクリーニング方法を提供する。
さらに、 本発明は、 本発明のタンパクの遺伝子を発現する能力を有する細胞を 試験化合物の存在下に培養し、 本発明のタンパクの抗体を用いて本発明のタンパ クの発現量を測定することを特徴とする本発明のタンパクの発現を促進または阻 害する活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、より具体的には、 ( i ) 本発明のタンパクの遺伝子を発現する能力を有する細胞を培養した場合の 本発明のタンパクの発現量と、 （i i )本発明のタンパクの遺伝子を発現する能力 を有する細胞を試験化合物の存在下に培養した場合の本発明のタンパクの発現量 とを本発明のタンパクの抗体を用いて測定し、 比較することを特徴とする、 本発 明のタンパクの機能を促進または阻害する活性を有する化合物またはその塩のス クリーニング方法を提供する。 本発明のタンパクの抗体は前記した方法により製 造できる。 細胞の培養は、 上記した公知の動物細胞培養と同様に行うことができ る。
すなわち、 より具体的には （i ) 本発明のタンパクの遺伝子を発現する能力を 有する細胞を培養し、 本発明のタンパクの抗体と、 該培養液 (被検液) およぴ標 識化された本発明のタンパクとを競合的に反応させた場合と、 ( i i )本発明のタ ンパクの遺伝子を発現する能力を有する細胞を試験化合物の存在下に培養し、 本 発明のタンパクの抗体と、 該培養液 （被検液） および標識化された本発明のタン パクとを競合的に反応させた場合との、 該抗体に結合した標識化された本発明の タンパクの割合の比較を行うことを特徴とする、 本発明のタンパクの発現または 分泌を促進または阻害する活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方 法、 （ i )本発明のタンパクの遺伝子を発現する能力を有する細胞を培養し、該培 養液 (被検液) と担体上に不溶化した本発明のタンパクの抗体および標識化され た本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させた場合と、 ( i i )本発明 のタンパクの遺伝子を発現する能力を有する細胞を試験化合物の存在下に培養し、 該培養液 （被検液） と担体上に不溶化した本発明のタンパクの抗体および標識化 された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させた場合との不溶化担 体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする、 本発明のタンパクの発現また は分泌を促進または阻害する活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング 方法を提供する。 上記の方法においては、 一方の抗体が本発明のタンパクの N末 端部を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパクの C末端部に反応する抗 体であることが望ましい。 上記したスクリーニング方法において、 試験化合物と しては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵 生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げられ、 これら化合 物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
本発明のスクリーエング用キットは、 本発明のタンパクの遺伝子を発現する能 力を有する細胞、 標識された本発明のタンパク、 本発明のタンパクの抗体、 本発 明のタンパクをコードする D NA、 または本発明のタンパクをコードする D N A の相補的 D N Aなどを含有するものである。
本発明のスクリーエング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ぺプチド、 タンパク、 非 ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組 織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物であり、 本発明のタンパクの機能を促進 または阻害する活性を有する化合物である。 該化合物の塩としては、 前記した本 発明のタンパクの塩と同様のものが用いられる。
本発明のスクリーエング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物をべーチエツト病などの疾患の治療 ·予防剤として使用する場合、 常套手 段に従って実施することができる。 例えば、 前記した本発明のタンパクを含有す る組成物と同様にして、錠剤、力プセル剤、ェリキシル剤、マイクロ力プセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとして、 経口的または非経口的に投与することができ る。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 温血動物
(例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 プタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど) に対して投与することができる。 該化合 物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 ベーチェット病治療の目的で本発明のタンパクの機 能を阻害する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O k gとして） においては、 1日につき該化合物を約 0 . 1〜1 0 O m g、好ましくは約 1 . 0〜 5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m g投与する。
本発明のタンパクに対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） は、 本発明のタンパクを特異的に認識することができるので、 被検液中の本発明 のタンパクの定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用すること ができる。 すなわち、本発明は、 （i )本発明の抗体と、被検液および標識化され た本発明のタンパクとを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発 明のタンパクの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパクの 定量法、 および （ii) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化さ れた本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上 の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパクの定量 法を提供する。 上記 (ii) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク の N末端部を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパクの C末端部に反応 する抗体であることが望ましい。
また、 本発明のタンパクに対するモノクローナル抗体 (以下、 本発明のモノク 口ーナル抗体と称する場合がある。）を用いて本発明のタンパクの定量を行なえる ほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分 子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b，、 あるいは F a b画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本発明のタンパクの定量法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗原量 (例えば、 ポリペプチド 量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的 手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線 より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよレ、。 例えば、 ネフ口 メトリー、 競合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられ る力 感度、特異性の点で、後述するサンドィツチ法を用いるのが特に好ましい。 標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、 酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、
〔1 2 5 I〕、 〔1 3 1 I〕、 〔3 H〕、 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上記酵素としては、安 定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 ]3—ガラクトシダーゼ、 β一ダル コシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵 素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレ ッセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミ ノール、 ルミノール誘導体、 /レシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さら に、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビォチン一アビジン系を用いることも できる。
, 抗原あるいは抗体の不溶ィ匕に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常ポ リぺプチドあるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用レ、 る方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの 不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あ るいはガラス等が挙げられる。 サンドィッチ法においては不溶化した本発明のモ ノクローナル抗体に被検液を反応させ（1次反応）、 さらに標識化した別の本発明 のモノクローナル抗体を反応させ ( 2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の 活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク量を定量することができ る。 1次反応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし 時間をずらして行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに 準じることができる。 また、 サンドィツチ法による免疫測定法において、 固相用 抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよレ、。 本 発明のサンドィツチ法による本発明のタンパクの測定法においては、 1次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のタンパクの結合 する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応および 2次 反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明のタン パクの C末端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C末 端部以外、 例えば N末端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、ィムノメ トリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたの ち、 未反応の標識抗原（F)と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し ( B / F分離)、 B , Fいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反 応法には、抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエチレングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固相化 抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体として固相 化抗体を用いる固相化法とが用いられる。 ィムノメトリック法では、 被検液中の 抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相 を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相 を分離する。次に、レ、ずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。 また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた 不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降物 しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなど が好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパクの測定系を構築す ればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照 することができる。 例えば、 入江寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行)、入江寛編「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、昭和 5 4年発行）、 石川栄治ら編「酵素免疫測定法」 （医学書院、昭和 5 3年発行)、石川栄治ら編「酵 素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫 測定法」 (第 3版) (医学書院、昭和 6 2年発行）、 rMethods in ENZYMOLOGYj Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) )、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B) )、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) )、 同 書 Vol. 8 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays) ) |P] 書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E : Monoclonal Antibodies and Genera丄 immunoassay Methods) )、 同 Vol. 121 (Immunochemical
Techniques (Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) ) (以上、 ァカデミックプレス社発行）などを参照することができる。以上のようにして、本 発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパクを感度良く定量することが できる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパクの濃度を定量することによ つて、 本発明のタンパクが検出された場合、 例えば、 ベーチェット病である、 ま たは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパクを検出するために使用す ることができる。 また、 本発明のタンパクを精製するために使用する抗体カラム の作製、 精製時の各分画中の本発明のタンパクの検出、 被検細胞内における本焭 明のタンパクの挙動の分析などのために使用することができる。
また、 本発明のタンパクをコードする D NAに対する本発明のアンチセンス D NAを含有する,組成物は、 本発明のポリヌクレオチド （例えば、 D NA) に相補 的に結合し、 ポリペプチドの発現を抑制することができる。 本発明のアンチセン ス D N Aは低毒性であり、 生体内における本発明のタンパクまたは本発明のポリ ヌクレオチドの発現を抑制することができるので、 例えば、 本発明のタンパクの 過剰発現に起因する疾患、 ベーチェット病ゃ原田病などの予防 ·治療剤として用 いることができる。 上記アンチセンス D N Aを上記の治療 '予防剤として使用す る場合は、 該アンチセンス .ポリヌクレオチドを、 上記した本発明のポリヌクレ ォチドの場合と同様にして製剤化することができる。 このようにして得られる製 剤は低毒性であり、 ヒトまたは非ヒト哺乳動物 （例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッ ジ、 プタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に投与 することができる。 なお、 該アンチセンス 'ポリヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進用の補助剤などの生理学的に認められる担体とともに、 遺伝子 銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することもできる。 該アンチセンス ·ポリヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルー トなどにより異なるが、 例えば、 ベーチェット病の治療の目的で本発明のタンパ クをコードする DN Aに対するアンチセンス ·ヌクレオチドを目などに局所投与 する場合、 成人 （体重 60 k g) に対して、 1日あたり約 0. l〜100mgで あることが好ましい。 さらに、 該ァンチセンス ·ポリヌクレオチドは、 組織や細 胞における本発明の DN Aの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌ クレオチドプローブとして使用することもできる。
本発明のタンパクの活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、 例えば、 本 発明のタンパクの過剰発現に起因する疾患、 例えばベーチェット病や原田病など の予防。治療薬などの組成物として使用することができる。 本発明の抗体を含有 する上記疾患の治療'予防剤は、 そのまま液剤として、 または適当な剤型の組成 物として、 ヒトまたは非ヒト哺乳動物 (例えば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に投与することが できる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異な る力 例えば、成人に使用する場合には、本発明の抗体を 1回量として、通常 0. 01〜2 Omg/k g体重程度、好ましくは 0. 1〜10mg/k g体重程度、 さ らに好ましくは 0. l〜5mg/k g体重程度を、 1日 1〜 5回程度、好ましくは 1日 1〜3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与 および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができるが、 症状に応じ て増減してもよい。 本発明の抗体は、 それ自体または適当な組成物として投与す ることができる。 上記投与に用いられる組成物は、 上記またはその塩と薬理学的 に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物 は、 経口または非経口投与に適する剤形として提供される。 すなわち、 例えば、 経口投与のための,組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には錠剤 （糖 衣錠、 フィルムコーティング錠を含む）、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフ トカプセル剤を含む）、 シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。 かかる糸且成 物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用いられる担体、 希釈 剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤として は、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。 非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤などの 剤形を包含する。 かかる注射剤は、 公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体また はその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁また は乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩 水、プドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノール）、 ポリアルコール （例えば、 プロピレ ングリコール、 ポリエチレンダリコール）、非イオン界面活性剤 (例えば、 ポリソ ルベート 8 0、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安 息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどを併用してもよい。 調製された注射液 は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗 体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによつて調製される。 上記の 経口用または非経口用組成物は、 活性成分の投与量に適合するような投薬単位の 剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル)、 坐剤などが例示され、 それぞれの投薬単 位剤形当たり通常 5〜5 0 0 m g、 とりわけ注射剤では 5〜 1 0 0 m g、 その他 の剤形では 10〜250mgの上記抗体が含有されていることが好ましい。 なお 前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない 限り他の活性成分を含有してもよい。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC— I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号ある ヽ は当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミ ノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものと する。
DNA：デォキシリボ核酸
A：アデニン
T ：チミン
G ： グァニン
C ：シトシン
RNA： リポ核酸
mRNA：メッセンジャーリボ核酸
DMF ：ジメチルホルムアミ ド
P VDF ：ポリビ-リデンジフルオリ ド
TC A： トリクロ口酢酸
TF A： トリフルォロ酢酸
SDS ： ドデシル硫酸ナトリウム
EDTA：エチレンジアミン四酢酸
G 1 y ：グリシン
A l a :ァラニン
V a 1 ：ノ リン
L e u : ロイシン
S e r ：セリン G 1 u ： グノレタミン酸
As :ァスパラギン酸
L y s ： リジン
A r g ：ァノレギニン
H i s : ヒスチジン
P h e ： フエニノレアラニン
T r p ： トリプトファン
P r o :プロリン
G i n : グルタミン
また、 本明細書中で汎用される置換基および保護基を下記の記号で表記する。 T r t ： トリチル基
P b f ： 2, 2, 4, 6， 7—ペンタメチノレジヒ ドロべンゾフラン一 5—スノレフ ォ-ル基
t B u ： t e r t -プチル基
O t Bu : t e r t—ブトキシ基
Fmo c ： 9—フノレオレニノレメ トキシカノレボニノレ基
MCA： 4一メチルクマリル一 7—アミ ド基
Z ：ベンジノレオキシカノレポ二ノレ基
B o c ： t e r t—プトキシカノレポ二ノレ基
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕 31 k D aタンパクの N末端部のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕 3 1 kD aタンパクの N末端部のポリぺプチドの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 3〕 1 ?_ 1の9 1_ 1 10番目のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 4〕 PRP— 1の 1 1 9— 1 34番目のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 5〕 本発明の 65 k D aタンパクの N末端部のアミノ酸配列を示 す。
以下に、 実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はそれら に限定されるものではない。 実施例 1 リパースザィモグラフィ一によるタンパクの分離
涙液を、 常温 （20°C) のサンプルバッファー （0. 125 M トリス塩酸 (pH 6. 8) /4% SDS/20%グリセ口ール /0. 02%ブロムフエノールブルー）で 2倍希釈した。 次に、 この電気泳動用緩衝液で希釈した涙液 10 - 15 Lを、 基質としてゼラチ ンを含むポリアクリルアミドゲル （0. 1%ゼラチン 0. 1% SDS/10-12% ポリアク リルアミ ド）、 ランニングバッファー (0. 025 M トリス塩酸 Z0. 192 Mグリシン 0. 1% SDS) で電気泳動を行った。 電気泳動終了後、 ゲルはパパイン溶液 （パパィ ン 0. 0075 U) でインキュベートした。 その後、 ゲルを 2. 5% トリ トン X- 100およ ぴ精製水で洗浄し、 50 mM酢酸- 10 IBM システィン緩衝液 （pH 6. 0) で 10時間ィ ンキュベートした。 20% TCAに 1分間、 浸漬後、 染色液 （クマシーブリリアント ブルー 0. 025°/。/メタノール 40°/。/酢酸 10%/水 49. 975%)に 2時間以上浸して染色 を行った。 染色後、 第 1の洗浄液 （メタノール 40°ん /酢酸 10%/水 50%) でゲルを 洗浄し、 次いで第 2の洗浄液 （メタノール 5%Z酢酸 7%Z水 88%) でゲルを洗浄し た。
(結果）
ベーチェット病患者および原田病患者の涙液のリバースザィモグラフィ一法に よる結果を図 1に示す。
図 1に示すように、 ベーチェット病患者の涙液には、 正常人の涙液にはほとん ど認められない、 分子量 31 kDa付近に特異的な物質が発現することが確認され、 原田病患者の涙液からは、 65 kDa付近の物質に著しい増加が見られた。 実施例 2 タンパクの単離 ベーチヱット病患者涙液の 31 kDaタンパクの分離は、 Fernandezらの方法 [Biotechniques. 12, 564-573 (1992)〕 に従った。 すなわち涙液 (10-15 を 同量のサンプルパッファー （0. 125 Μ トリス ^4% SDS/20%グリセリン Ζθ· 02%プ ロモフエノールプル一、 ρΗ 6. 8) で希釈し、 実施例 1と同じ条件で電気泳動を行 つた後、 ゲルは 0. 2 Μイミダゾール溶液で 10分間ィンキュベートした。 その後、 ゲルを 0. 2-0. 3 Μ硫酸亜鉛溶液に 1分間浸漬した。 31 kD aタンパク部のゲルを カットし、 緩衝液で抽出した。 実施例 3 N末端部のアミノ酸配列の決定
タンパクの N末端部のァミノ酸配列は HPG1005A protein sequencing system (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) を用いて決定した。 すなわち、 実施例 1の電 気泳動後、 染色パンドは PVDF膜に転写し、 マジマらの方法 〔E. Majiraa, et al. , J. Biol. Chem. 276 (13) , 9792-9799 (1991)〕 を使用するアミノ酸シークェンス 分析器に付した。
(結果）
31 kDaタンパクの N末端側のァミノ酸配列は配列番号: 1に示すものであった。 本配列は、公知の PRP-1および pHL E1F1プロリンリッチタンパクの 76-90番目の ァミノ酸配列と 100%の相同性を示した。 このことは、 PRP - 1および pHL E1F1プロ リンリツチタンパクの 91番以降のアミノ酸配列についても少なくとも 50°/。以上の 相同性を示すものと考えられる。 実施例 4 配列番号： 3のポリぺプチドの合成
ポリペプチドの C末端残基に相当するアミノ酸 （Val) が導入されている Fmoc - Val - Wang樹脂をジメチルホルムアミド （DMF)で膨潤させた後、 ペプチド合 成機 （島津製作所製） の反応器に入れた. 上記樹脂をピペリジン/ DMFで処理し Fmoc基を除去してアミノ酸を遊離させ、 DMFで洗浄した。 このアミノ基に次のァ ミノ酸に相当する Fmoc- Ser (tBu)を HOBt/PyBop法で縮合した。 以後同様に、 Fmoc - Pro、 Fmoc- Phe、 Fmoc- Arg (Pbiノ 、 Fmoc - Pro、 Fmoc Leu、 Fmoc - Ser (tBu)、 Fmoc- Leu、 Fmoc - Gin (Trt)、 Fmoc - Arg (Pbf )、 Fmoc- His (Trt)、 Fmoc - Gly、 ' Fmoc- Arg (Pbf)、 Fmoc- Arg (Pbf)、 Fmoc- Pro、 Fmoc- Pro、 Fmoc - Arg (Pbf )、
Fmoc- Gin (Trt)、 Fmoc- Gin (Trt)を順次縮合し、反応を完了した。 樹脂を乾燥した 後、常法に従いトリフルォロ酢酸 （TFA) を含む溶液にて 5時間処理し、ぺプチド を樹脂から切り離すと共にぺプチド保護基を除去した。 この脱保護べプチドをジ ェチルエーテルで洗浄し乾燥した。 これを常法に従い、 ァセトニトリル ZTFAを 含む溶液を溶解し、 HPLC装置にてグラジェント溶出し， 精製した。 この精製ぺプ チド分画を集め、 凍結乾燥し、 白色粉末を得た。 実施例 5 配列番号： 4のポリぺプチドの合成
ポリペプチドの C末端残基に相当するァミノ酸 (Trp) が導入されている
Fmoc- Trp - Wang樹脂を DMFで膨潤させた後、 ペプチド合成機 （島津製作所製） の 反応器に入れた。上記樹脂をピぺリジン, DMFで処理し Fmoc基を除去してァミノ 酸を遊離させ、 DMFで洗浄した。このアミノ基に次のアミノ酸に相当する Fmoc - Leu を HOBt/PyBop法で縮合した。 以後同様に、 Fmoc- Pro、 Fmoc- Gin (Trt)、
Fmoc-Glu (OtBu) N Fmoc- Gin (Trt)、 Fmoc- Pro、 Fmoc- His (Trt)、 Fmoc- Arg (Pbf )、 Fmoc- Ala、 Fmoc - Pro、 Fmoc- Arg (Pbf)、 Fmoc - Asp (OtBu)、 Fmoc- Arg (Pbf)、
Fmoc-Gln (Trt)を順次縮合し、 反応を完了した。 樹脂を乾燥した後、 常法に従い TFAを含む溶液にて 5時間処理し、 ぺプチドを樹脂から切り離すと共にぺプチド 保護基を除去した。 この脱保護べプチドをジェチルエーテルで洗浄し乾燥した。 これを常法に従い、 ァセトニトリル/ TFAを含む溶液を溶解し、 HPLC装置にてグ ラジェント溶出し、 精製した。 この精製ペプチド分画を集め、 凍結乾燥し、 白色 粉末を得た。 実施例 6 ゥサギポリクローナル抗体の作製
実施例 4で合成したポリペプチドに KLH (キーホールリンべットへモシアン） を結合した。 作製したポリぺプチド · KLH複合体を抗原としてゥサギポリクロー ナル抗体を作製した。 免疫動物は日本白色ゥサギ （雄、 2. 5 - 3 kg) —羽を用い、 感作はアジュバンド （1回目 ：コンプリート、 2， 3回目 ：インコンプリート） 懸濁液を用い、背部に皮内注射により行い 14 B毎に 4回繰り返した。最終感作 7 日後に麻酔下頸動脈採血を行い、 血清を得た。 このようにして得られた血清をポ リクローナル抗体とした。 抗血清中の抗体価の上昇はェンザィムノアッセィにて 確認した。 実施例 7 ウェスタンプロッティング
検体は、 5 w/v% 2-メルカプトエタノール存在下、 15-25 w/v%濃度勾配ポリアク リルアミドゲルを使用し、 SDS-電気泳動を行った。 SDS-電気泳動は Lae蘭 liの変 法 [K. U. Laemmli, Nature, 227, 680-685 (1920)〕 によった。 タンパクは PVDF 転写膜 （Millipore, Bedford, MA) に電気的に転写した。 抗原抗体反応は、 1次 抗体として実施例 6で作製したゥサギポリク口一ナル抗体を使用した。 2次抗体 としてャギ抗ゥサギ IgG接合を使用した。 アルカリフォスファターゼの反応は、 二トロブルーテトラゾリゥムと 5-ブロモ -4-ク口口- 3 -ィンドリルフォスフエ一 トを用いて膜上で行つた。 分子量マーカーとして、 SDS - PAGE low-range standard
(Bio-Rad Laboratories, CA) を使用した。
(結果）
実施例 6のゥサギポリク口ーナル抗体は 31 kDaタンパクを認識することが確認 された。本ポリクローナル抗体は、公知の PRP- 1の 91 - 110番目のアミノ酸配列に 相当するタンパクに対する抗体であるので、 本結果は、 31 kDaタンパクの部分配 列として、 PRP - 1および pHL E1F1プロリンリツチタンパクの 91番以降のァミノ 酸配列との相同性がより高い配列を有していることを示していると考えられる。 実施例 8 システィンプロテアーゼ阻害活性の測定
システィンプロテアーゼ阻害活性の測定は Barrett の方法 〔 J. A. Barrett et al. , Methods in Enzymology, 80, 535 - 561 (1981)〕 に基づいた。 すなわち、 85 mM 酢酸緩衝液 ( H 5. 5)、 2 mMジチォスレイト一ル、 1 mM EDTA, パパイン （0. 0075 U) および被験物質を含む溶液を 15分間プレインキュペートした後、 基質として Z-Phe-Arg-MCA (80 nM) を添加し反応を開始した。 37°C、 10分間反応させた後、 酢酸緩衝液 (pH 4. 0) を添加し、 反応を停止させた。 遊離した 4 -メチル- 7 -アミ ノクマリンの量を蛍光光度計を用いて、 励起波長 360 nm、 蛍光波長 440 nmで測 定した。 被験物質無添加で同様に処理したものをコントロール値、 パパイン無添 加のものをブランク値とし、 IC5。を求めた。
(結果）
31 kDaタンパクのパパインに対する阻害活性の IC50は、 10- 6 Mであった。 また 、 実施例 5で合成したポリぺプチドのそれは、 10_4 Mであった。 実施例 9 ゥサギポリク口ーナル抗体の作製
実施例 5で合成したポリぺプチドに KLHを結合した。 作製したポリべプチド · KLH複合体を抗原としてゥサギポリクローナル抗体を作製した。 免疫動物は日本 白色ゥサギ (雄、 2. 5-3 kg) 2羽を用い、 感作はアジュパンド (1回目 ： コンプリ ート、 2- 6回目 ：インコンプリート） 懸濁液を用い、 背部に皮内注射により行い 14日毎に 6回繰り返した。 最終感作 7日後に麻酔下頸動脈採血を行い、血清を得 た。 このようにして得られた血清をポリク口ーナノレ抗体とした。 実施例 1 0 ゥサギポリク口ーナル抗体の精製
( 1 ) 硫酸アンモニゥムによる血清の沈殿
実施例 9で得られた血清 10 mlを 25°Cで温め、硫酸アンモニゥムを 30% (w/v) と なるように添加し、 4°Cで 30分間攆拌して溶解させた。 遠心分離 （15000 X g、 20 分間、 4°C) 後、 上清を捨て、 沈殿に 20 mM Tris- HC1 (pH 7. 5)を加え、 容量を 10 mlとした。
( 2 ) DEAE-AFFI- Gel Blueカラムクロマトグラフィー、 及び MonoQカラムクロ マトグラフィ一による IgGの分画
DEAE-Affi- Gel Blueカラムを、 5容量の結合緩衝液 (20 mM Tris - HC1、 pH 7. 5) にて平衡化した。 （1 )で得られたサンプルをカラムにかけ、フロー画分を回収し (流速 1 - 3 ml/分）、未結合タンパクを 3容量の結合緩衝液 10-15 mlで溶出させた。 次いで、 結合 IgG画分を溶出緩衝液 （20 mM Tris- HC1、 1 M NaCl、 pH 7. 5) で溶 出させ、 還元条件下での 12% SDS-PAGEにより、 各溶出画分 10-15 μ 1を解析し、 IgG含有画分を同定した。 IgG含有画分をプールし、 PD-10カラムで脱塩した。 次 に、 MonoQカラムを結合緩衝液で平衡化し、 脱塩したサンプルを MonoQカラムに 力け、 溶出緩衝液により結合 IgGを溶出させた。 還元条件下での 12% SDS-PAGE により、 各溶出画分 10 - 15 /i lを解析し、 IgG含有画分を同定した後、 IgG含有画 分をプールし、 PD - 10カラムにより脱塩することで、 ゥサギポリクローナル抗体 を精製した。 実施例 1 1 ウェスタンプロッティング
検体は、 5°/。(w/v) 2 -メルカプトエタノール存在下、 15 - 25% (w/v)濃度勾配ポリア クリルアミドゲルを使用し、 SDS -電気泳動を行った。 SDS -電気泳動は Lae匪 liの 変法 〔K. U. Laemmli, Nature, 227, 680-685 (1920) ] によった。 タンパクは PVDF 転写膜 （Millipore, Bedford, MA) に電気的に転写した。 抗原抗体反応は、 1次 抗体として実施例 1 0で得られたゥサギポリクローナル抗体を使用した。 2次抗 体としてャギ抗ゥサギ IgG接合を使用した。アルカリフォスファターゼの反応は、 二トロブルーテトラゾリゥムと 5 -ブロモ -4. -ク口ロー 3-ィンドリノレフォスフエ一 トを用いて膜上で行った。 分子量マーカーとして、 SDS- PAGE low- range standard (Bio-Rad Laboratories, CA) を使用した。
(結果）
実施例 1 0で得られた 3種のゥサギポリクローナル抗体 （それぞれ、 硫酸アン モニゥム、 DEAE- Affi- Gel Blueカラム、 MonoQカラム処理後） を用いたゥエスタ ンプロッテイングによる結果を図 2に示す。
実施例 1 0で得られたゥサギポリク口ーナル抗体は 31 kDaタンパクを認識する ことが確認された。 本ポリクロ一ナル抗体は、 公知の PRP-1の 119-134番目のァ ミノ酸配列に相当するタンパクに対する抗体であるので、 本結果は、 31 kDaタン パクの部分配列として、 PRP-1および pHL ElFlプロリンリツチタンパクの 119番 以降のァミノ酸配列との相同性がより高い配列を有していることを示していると 考えられる。 また、 実施例 1 0で得られた精製ポリク口ーナル抗体が高い特異性 を有することが確認された。 実施例 1 2 配列番号： 1のポリぺプチドの合成
( 1 ) 配列番号： 1のポリぺプチドの合成 1
ポリペプチドの C末端残基に相当するアミノ酸 （His) が導入されている
Fmoc - His- Wang樹脂をジメチルホルムアミド (DMF)で膨潤させた後、 ぺプチド合 成機 （島津製作所製） の反応器に入れる。 上記樹脂をピペリジン/ DMFで処理し Fmoc基を除去してァミノ酸を遊離させ、 DMFで洗浄する。 このアミノ基に次のァ ミノ酸に相当する Fmoc- His (Trt)を HOBt/PyBop法で縮合する。 以後同様に、
Fmoc Gly、Fmoc - Gly、Fmoc - Pro、Fmoc - Lys (Boc)、Fmoc-Pro、Fmoc-Pro、Fmoc-Arg (Pbf)、 Fmoc - Gin (Trt)、 Fmoc - Gin (Trt)、 Fmoc- Pro、 Fmoc - Gly、 Fmoc- Asp (OtBu)、
Fmoc- Asp (OtBu)を順次縮合し、 反応を完了する。 樹脂を乾燥した後、 常法に従い トリフルォロ酢酸 （TFA) を含む溶液にて 5時間処理し、ぺプチドを樹脂から切り 離すと共にペプチド保護基を除去する。 この脱保護ペプチドをジェチルエーテル で洗浄し乾燥する。 これを常法に従い、 ァセトニトリル/ TFAを含む溶液を溶解 し、 HPLC装置にてグラジェント溶出し，精製する。この精製べプチド分画を集め、 凍結乾燥し、 白色粉末を得る。
( 2 ) 配列番号： 1のポリぺプチドの合成 2
配列番号： 1のポリぺプチドの合成は、 HBTU/DIEA活性化を用いる標準的 Fmoc プロ卜コルを使用して、 MultiSynTec Syro Multiple peptide synthesizerで行 つた。 TentaGelHLRAM樹脂を使用して、 C末端アミドを調製した。 各アミノ酸を 2X30分ダブル力ップリングし、 Fmoc脱保護サイクルは 2 X 7分であり、 その後 DMFで徹底的に洗浄した。 樹脂からの切断は、 TFA、 TIPS, フエノール、 0の混 合液 (87.5:2.5:5:5) で 2時間処理することにより行つた。 粗ぺプチドを冷メチ ル- tert-プチルエーテルで沈殿させ、 2回洗浄した。 粗ペプチドの精製は、 1- 50°/0 B (A=0.1% TFA、 B=0.1% TFAのァセトニトリル溶液）の線形勾配を使用して、 C18 Lichrosphereカラム (7 μ m、 250 X 25腿) で行なった。 実施例 13 ファージディスプレイ法を利用する、 配列番号： 1のポリペプチド を抗原とするモノクローナル抗体の作製
(1) ファージの増幅
HuCAL (登録商標） ライブラリーを用いて行う Gournal of Immunological Methods 254, 67-84 (2001)〕。 先ず、 E. coli TG-1中の HuCAL (登録商標) - scFv を、ク口ラムフエニコール (適量)、 1%グルコース含有 2XTY培地 (以下、 2X TY-CG と省略） で増幅する。 0D6。。約 0.5において 37°Cでヘルパーファージを感染させた 後 （VCSM13)、 遠心分離し、 2XTY/34 g/mlクロラムフエ二コール /50 g/ml カナマイシン /0. ImMIPTG中に再懸濁し、 細胞を 30°Cでー晚増殖させる。 ファー ジを PEG沈殿により回収し、 PBS/20%グリセ口ール中に再懸濁し、 - 80°Cで保存す る。
(2) バニング
MaxiSorp™マイクロタイタ一プレート (Nunc製) のゥエルを、 抗原 (実施例 1 2で合成した配列番号： 1のポリペプチドの C末端にシスティンを付加し、 この システィンでの架橋によりキャリアに結合させたもの） でコーティングする。 1 ゥエル当たりの抗原量は、 1回目のバニングでは 500 ngとし、 以降のパユングで は 100 ngとする。 5%非脂肪ドライミルクの PBS溶液でプロッキングした後、 HuCAL (登録商標） scFvファージを含有する上清を加え、 20°Cで 1時間放置する。なお、 HuCAL (登録商標） scFvファージを含有する上清としては、 ファージに感染した TG-1細胞を液体培養で増殖させ、ヘルパーウィルス感染後に得られるものを直接 使用する。 バニングのラウンド毎に使用するキャリア （トランスフェリン、 B S A) を交換する。 2回のパユング後、 ポリクローナルファージミド D N Aを調製 する （BioRobot、 Qiagen製）。 次いで、 ポリクローナルファージミ ド D NAを制 限酵素で消化し、得られるインサートを発現べクタ一にサブクローユングした後、 JM83細胞 (Gene 33, 103 (1985)〕 を形質転換する。 次に、 形質転換体をスクリ 一二ングに供する。
( 3 ) スクリーユング
得られた形質転換体を、 クロラムフエニコール (適量)、 1%ダルコースを補充し たァガ一プレートにプレーティングする。 次いで、得られたコロエーを 2 X TY-CG 培地に移し、 増殖させた後、 2 X TY/クロラムフエ二コール培地を含む発現プレー トに移す。 IPTGを添加し （終濃度 l mM)、 ー晚増殖させる。 ペリプラズム E. coli 抽出物 [Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, New York, USA] を、 抗原でコーティングした MaxiSorp™プレート (Nunc製）に移し、 ELISAを行なう。 scFvを抗 FLAG Ml及び M2抗体 (Kodak製）、 並びに抗マゥス IgG抗体一アル力リ ホスファターゼコンジユゲート（Sigma製）及ぴ AttoPhos基質（Roche Diagnostics 製） を用いて検出する。 次いで、 陽性クローンを増殖させた後、 DNAを単離し、 塩基配列を決定する。
( 4 ) scFvのヒ ト IgGへの変換
( i ) 免疫グロブリン発現ベクターの構築 ( a ) 重鎖クローニング
pcDNA3. 1+ (Invitrogen) のマルチクローニング部位を除き、 HuGAL (登録商標） 設計に使用した制限部位と適合するスタッファ一 （stuffer) をリーダー配列、上 記（3 ) で得られた VHドメイン、免疫グロプリン定常領域のライゲーションのた めに連結する。 リーダー配列 （EMBL M83133) に Kozak配列を付す 〔： Γ. Mol. Biol. 196， 947 (1987)〕。 ヒト IgGl (PIRJ00228) の定常領域を、 この配列を約 70塩基 の長さを有する重複 （overlapping) オリゴヌクレオチドに切断することによつ て合成する。 サイレント変異を導入して、 HuCAL (登録商標） 設計に非適合性の制 限部位を除く。 これらオリゴヌクレオチドを、重複 (overlap)伸長 PCRにより連 結する。
( b ) 軽鎖クローユング
pcDNAS. l/Zeo + (Invi trogen) のマルチクローニング部位を、 異なる 2つのス タッファーにより交換する。 κスタッファ一は、 κリーダー、 HuCAL (登録商標) -scFv V K ドメイン、 κ鎖定常領域の挿入に適した制限部位を保持するように作 製し、 λスタッファ一は、 ν ドメイン、 鎖定常領域の揷入に適した制限部位 を保持するように作製する。 κリーダー （EMBL Ζ000229)、 Lリーダー （EMBL L27692) の両方に、 Kozak配列を付す。 ヒ ト / c鎖 （EMBL J00241)、 λ鎖 (EMBL M18645) を、 上記と同様にァセンプルする。
( i i ) IgG発現 CH0細胞の作製
CH0- K1細胞に、 IgG重鎖発現ベクター、 IgG軽鎖発現ベクターの等モル混合物 を共トランスフエクトする。共トランスフエクト CH0-K1細胞を、 G418、ゼォマイ シン （Invitrogen製） により選別する。 次いで、 得られた CH0 - K1細胞クローン の培養上清を、 IgG捕捉- ELISAにより評価する。
( i i i ) ヒ ト IgG捕捉一 ELISA
先ず、マイクロタイターのゥエルをゥサギ抗ヒト IgG (Fc y特異的、 Dako製）で コーティングする。 Tri s緩衝化生理贵塩水/ 5%非脂肪ドライミルクでプロッキン グした後、 得られた CH0 - K1細胞クローンの培養上清を加える。 数回洗浄した後、 ャギ抗ヒト κ又はえ鎖アル力リホスファターゼコンジユゲート、及び p- -トロフ ェ-ルホスフェート （Sigma製） を加え、 IgGの有無を判別する。
( i v ) ヒト IgGの精製
得られた CHO- K1細胞クローンを、 10% ultra- low IgG- FCS (Life Technologie 製） を補充した RPMI - 1640培地中で増殖させる。 培養上清の PHを 8. 0に調整し、 滅菌ろ過処理に付した後、溶液をプロテイン Aカラムクロマトグラフィー （Poros 20A， PE Biosystems製） に供して、 ヒト IgGを精製する。 産業上の利用可能性
本発明のタンパクはべ一チェット病ゃ原田病などの疾患時に発現する特異なタ ンパクであるので、 例えば、 ベーチェット病や原田病の診断を正確に効率良く行 うことができる。 本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得る ことは当業者にとって自明であろう。 本発明は、 本紫明が本明細書に詳細に記载さ れた以外の方法で実施され得ることを意図する。 したがって、 本発明は添付の 「請 求の範囲」 の精神おょぴ範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は、日本国で出願された特願 2 0 0 3 - 0 5 9 0 8 2を基礎としており、 そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。 また、 ここで 述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、 ここに引用されたことによって、 その全てが明示されたと同程度に本明細書に組 み込まれるものである。

Claims

請 求 の 範 囲
I. N末端部の配列に配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有し、 かつ分子 量が 31 kD aであることを特^ [とするタンパク。
2. 請求項 1記載のタンパクをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌク レオチド。
3. DN Aである請求項 2記載のポリヌクレオチド。
4. 配列番号： 2で表わされる塩基配列を含有する請求項 3記載の DNA。
5. 請求項 2記載のポリヌク ォチドを含有する組換えベクター。
6. 請求項 5記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体。
7. 請求項 6記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載のタンパクを生成、 蓄積 せしめ、 これを採取することを特徴とする請求項 1記載のタンパクの製造方法。
8. 請求項 1記載のタンパクもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはそ れらの塩を含有してなる組成物。
9. 請求項 2記載のポリヌクレオチドを含有してなる組成物。
10. システィンプロテアーゼ阻害剤である請求項 8または 9記載の組成物。
I I. 請求項 1記載のタンパクに対する抗体。
1 2. 請求項 1記載のタンパクの活性を不活性化する中和抗体である請求項 1 1 記載の抗体。
1 3. 請求項 1 1記載の抗体を含有してなる組成物。
14. ベーチェット病の予防 ·治療剤である請求項 13記載の組成物。
1 5. 請求項 1 1記載の抗体を含有してなる診断剤。
16. ベーチェット病の診断剤である請求項 1 5記載の診断剤。
1 7. 請求項 2記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断剤。
18. ベーチヱット病の診断剤である請求項 1 7記載の診断剤。
1 9. 請求項 1記載のタンパクをコードする DN Aに相補的または実質的に相補 的な塩基配列またはその一部を有し、 該タンパクの発現を抑制し得る作用を有す るアンチセンス D NA。
2 0 . 請求項 1 9記載のアンチセンス D NAを含有してなる組成物。
2 1. ベーチエツト病の予防 ·治療剤である請求項 2 0記載の組成物。
2 2 . リパースザィモグラフィーを用いることを特徴とするシスティンプロテア ーゼ阻害活性を有するタンパクのスクリーニング方法。
2 3 . システィンプロテアーゼ阻害活性を有するタンパクが請求項 1記載のタン パクである請求項 2 2記载のスタリーニング方法。
2 4 . システィンプロテアーゼ阻害活性を有するタンパクが N末端部の配列に配 列番号： 5で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ分子量が 6 5 k D aであること を特徴とするタンパクである請求項 2 2記載のスクリーユング方法。
2 5 . 請求項 1記載のタンパクを用いることを特徴とする請求項 1記載のタンパ クの機能を促進または阻害する活性を有する化合物またはそれらの塩のスクリ一 ニング方法。
2 6 . N末端部の配列に配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を有し、 かつ分子 量が 6 5 k D aであるタンパクを用いることを特徴とする該タンパクの機能を促 進または阻害する活性を有する化合物またはそれらの塩のスクリーニング方法。
2 7 . 機能がシスティンプロテアーゼ阻害活性またはべ一チェット病関連因子で ある請求項 2 5記載のスクリーニング方法。
2 8 . 機能が原田病関連因子である請求項 2 6記載のスクリ一ユング方法。
2 9 . 請求項 1記載のタンパクのシスティンプロテアーゼ阻害活性を試験化合物 の存在下および非存在下に測定し、 比較することを特徴とする請求項 2 5記載の スクリーニング方法。
3 0 . 請求項 1記載のタンパクの遺伝子を発現する能力を有する細胞を試験化合 物の存在下おょぴ非存在下に培養し、 それぞれの場合における当該タンパクの m
R N Aの発現量を測定し、 比較することを特徴とする請求項 2 5記載のスクリー ユング方法。
3 1 . 請求項 1記載のタンパクのプロモーター領域およびェンハンサー領域、 ま たは請求項 1記載のタンパクのプロモータ一領域をレポーター遺伝子の上流に連 結させた D N Aで形質転換した細胞を試験化合物の存在下およぴ非存在下に培養 し、 それぞれの場合におけるレポーター遺伝子の発現量を測定することを特徴と する請求項 2 9記載のスクリーニング方法。
3 2 . 請求項 1記載のタンパクの機能を促進または阻害する活性を有する化合物 またはその塩のスクリ一ユング用キット。
3 3 . 請求項 2 9記載のスクリ一ユング方法または請求項 3 2記載のスクリーュ ング用キットを用いて得られうる、 請求項 1記載のタンパクの機能を促進または 阻害する活性を有する化合物またはその塩。
3 4 . 請求項 2 9記載のスクリーユング方法または請求項 3 2記載のスクリー- ング用キットを用いて得られうる、 請求項 1記載のタンパクの機能を促進または 阻害する活性を有する化合物またはその塩を含有してなる組成物。
3 5 . 請求項 2 9記載のスクリ一二ング方法または請求項 3 2記載のスクリー- ング用キットを用いて得られうる、 請求項 1記載のタンパクの機能を阻害する活 性を有する化合物またはその塩を含有してなるベーチェット病の予防 ·治療剤。
3 6 . 配列番号： 4で表わされるァミノ酸配列であることを特徴とするポリぺプ チド。
3 7 . 有効量の請求項 1 1記載の抗体を患者に投与することを含むベーチェット 病の予防 ·治療方法。
3 8 . 有効量の請求項 1 9記載のアンチセンス D NAを患者に投与することを含 むべ一チヱット病の予防 ·治療方法。
3 9 . ベーチヱット病の予防 ·治療剤の製造のための請求項 1 1記載の抗体の使 用。
4 0 . ベーチヱット病の予防 ·治療剤の製造のための請求項 1 9記載のアンチセ ンス DNAの使用。
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DICKINSON D.P. ET AL: "A major human lacrimal gland mRNA encodes a new proline-rich protein family member", INVEST. OPHTHALMOL. VIS. SCI., vol. 36, no. 10, 1995, pages 2020 - 2031, XP002980398 *

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