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WO2004076472A1 - 新規なグアノシン誘導体及びその用途 - Google Patents

新規なグアノシン誘導体及びその用途 Download PDF

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WO2004076472A1
WO2004076472A1 PCT/JP2004/002068 JP2004002068W WO2004076472A1 WO 2004076472 A1 WO2004076472 A1 WO 2004076472A1 JP 2004002068 W JP2004002068 W JP 2004002068W WO 2004076472 A1 WO2004076472 A1 WO 2004076472A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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group
guanosine
type dna
lower alkyl
stabilizing
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2004/002068
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Sugiyama
Yan Xu
Reiko Ikeda
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
Japan Science and Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science and Technology Agency filed Critical Japan Science and Technology Agency
Priority to US10/546,107 priority Critical patent/US7550581B2/en
Priority to EP04713641A priority patent/EP1604995A4/en
Publication of WO2004076472A1 publication Critical patent/WO2004076472A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/167—Purine radicals with ribosyl as the saccharide radical

Definitions

  • the present invention relates to a novel guanosine derivative useful as, for example, a reagent for stabilizing Z-type DNA, and a method for stabilizing Z-type DNA using the same.
  • Z-type DNA is a nucleotide with a left-handed DNA structure discovered about 30 years ago, but its biological role is still unknown. The reason for this is that it is difficult to stably turn left-handed in solution with a 6- to 20-mer length used for research. Therefore, to study Z-type DNA, it is necessary to develop a mononuclear unit that stabilizes Z-type DNA.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and can stabilize Z-type DNA more effectively; a novel monomer and a reagent for incorporating the monomer into an oligonucleotide. , And a method for stabilizing Z-type DNA using the reagent.
  • R 1 represents an acyl group
  • 'R 2 represents a lower alkyl group
  • R 3 represents a trisubstituted silyl group
  • R 4 represents a cyanoethyl group or a aryl group
  • the present invention relates to a reagent for stabilizing Z-type DNA, comprising the guanosine derivative.
  • the present invention relates to a method for stabilizing Z-type DNA, comprising using the above guanosine derivative.
  • the present invention relates to a method for introducing guanosine having a lower alkyl group at the 8-position into an oligonucleotide, which comprises using the guanosine derivative.
  • the present invention relates to an oligonucleotide having guanosine having a lower alkyl group at the 8-position.
  • FIG. 1 shows circular dichroism spectroscopy (CD) spectra of three kinds of oligonucleotides according to the present invention obtained in Example 3.
  • CD circular dichroism spectroscopy
  • the acyl group represented by R 1 may be any acyl group that is commonly used in this field as a modifying group for an amino group, for example, isobutyryl And bulky acyl groups such as a benzoyl group, a 4- (t-butyl) benzoyl group and the like.
  • the lower alkyl group represented by R 2 includes, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, s-butyl group, t-butyl group, etc. Although a lower alkyl group of 4 is preferred, a methyl group is particularly preferred in terms of ease of synthesis and the like.
  • the trisubstituted silyloxy group represented by R 3 includes, for example, t-butyldimethylsilyloxy group, triisopropylsilyloxy group, triphenylsilyloxy group and the like. Preferred is a substituted silyloxy group.
  • the guanosine derivative of the present invention represented by the above general formula [1] is extremely useful as a monomer unit for stabilizing Z-type DNA.
  • Z-type DNA can be strongly stabilized.
  • Z-type DNA can be stabilized by introducing guanosine having a lower alkyl group at the 8-position into DNA by the solid phase DNA synthesis method using the guanosine derivative of the present invention.
  • R 1 is an isoptyryl group
  • R 2 is a methyl group
  • R 3 is a t-butyldimethylsilyloxy group
  • R 4 is a cyanoethyl group according to the present invention.
  • the derivative with 8-methylguanosine introduced into various oligonucleotides using the derivative has a B-Z transposition midpoint compared to those with 8-methyldeoxyguanosine introduced into various oligonucleotides by the same method. It was remarkably reduced, and it was found that the stabilizing effect was several times to several tens times.
  • R 1 is an isobutylyl group
  • R 2 is a methyl group
  • R 3 is a t-butyldimethylsilyloxy group
  • R 4 is Taking the case of a guanosine derivative that is a cyanoethyl group as an example, the reaction scheme is as follows.
  • Step a) involves the action of trimethylsilyl chloride in pyridine, followed by isobutyric anhydride.
  • step c dimethoxytrityl chloride.
  • Triethylamine and 4-dimethylaminopyridine are reacted in pyridine.
  • step d imidazole and 2′-t-butyldimethylsilyl chloride are allowed to act in dichloromethane.
  • step e N, N-diisopropylamine and 2-cyanoethyl N, N-diisopropylphosphoramidite are allowed to act in dichloromethane.
  • Step b) above is a step of methylation of guanosine at the 8-position.
  • Alkylation at the position can also be accomplished by the following methods, including methylation. That is, after protecting the hydroxyl group of the report with, for example, t-butyldimethylsilyl group, Lithium is lysated at position 8 with lithium diisopropylamine (LDA) and then reacted with an appropriate alkyl halide to introduce an alkyl group selectively. Therefore, when introducing another alkyl group, this method may be used [see Chem. Pharm. Bull., 72-79 (1987)]. ]. Of course, when a methyl group is introduced, this method may be used.
  • LDA lithium diisopropylamine
  • Examples of a method for incorporating a guanosine having a lower alkyl group at the 8-position into an oligonucleotide using the guanosine derivative of the present invention include a solid phase synthesis method of a DNA oligomer using a commercially available DNA synthesizer. It is sufficient that the operation procedure is performed according to the protocol attached to each DNA synthesizer. The contents described in the specification of Japanese Patent Application No. 2003-03-052187 are incorporated herein in their entirety.
  • Example 1 8-Methyl-N-isobutyryl-5'-O-dimethoxytrityl-2'-t-butyldimethylsilyl-guanosine-1 (2-cyanoethyl-N, N-diisopropylphosphoramidite (compound) ( In the general formula [1], R 1 is an isoptyryl group, R 2 is a methyl group, R 3 is a t-butyldimethylsilyloxy group, R
  • Guanosine (7 g, 25 mm o 1) is dried three times with pyridine,
  • Example 1 The compound obtained in Example 1 (200 mg, 0.2 mmo 1) was placed in a rubber shielded pot, 2 mL of dry acetonitrile was added, and the mixture was evaporated under reduced pressure. Dried acetonitrile was added and dissolved, attached to OLI GO 100 DNA Synthesizer (manufactured by Beckman), and oligonucleotides d (C GCM er GCG), d (CM er GCACM er GCG) and d (CM er GCATMer GTG) was synthesized according to the protocol attached to the DNA synthesizer.
  • composition and concentration of the synthesized oligonucleotide was confirmed by hydrolyzing to mononucleoside by enzymatic degradation.
  • Circular dichroism spectrum analysis of the three oligonucleotides obtained in Example 2 was carried out using a circular dichroism spectrometer AVIV MOD EL 62 DS / 202 CD spectrophotometer (manufactured by Aviv). It measured using.
  • the CD (circular dichroism spectroscopy) spectrum of the oligonucleotides (concentration: 0.15 mM base concentration, 5 mM sodium codylate buffer, pH 7.0) was 1 at various NaC1 concentrations. Measured using a cm length cell. The results are shown in FIG. Fig.
  • Me G represents 8-methyldeoxyguanosine-
  • Mer G represents 8-methylguanosine.
  • the base is more likely to assume the syn orientation, and furthermore, the introduction of a hydroxyl group at the 2 'position of the sugar increases the hydrophilicity, and the puckering of the sugar is further stabilized by adopting the C3' endo conformation. It is believed that there is.
  • the present invention relates to 8-methylguanosine, a novel monomer unit capable of stabilizing Z-type DNA more effectively, and a guanosine derivative represented by the general formula [1], which is a reagent for incorporating the same into an oligonucleotide,
  • An object of the present invention is to provide a method for stabilizing Z-type DNA using the same.
  • the 8-methylguanosine having a methyl group introduced at the 8-position of guanosine according to the present invention is the same as the previously known 8-methyldeoxyguanosine (Me). Since it is possible to stabilize Z-type DNA several times stronger than G), it is expected to be an innovative tool for studying Z-type DNA.

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Description

明 細 書 新規なグアノシン誘導体及びその用途 技術分野
本発明は、 例えば、 Z型 DNAを安定化するための試薬等として有用な新規な グアノシン誘導体と、 これを用いた Z型 DN Aの安定化方法に関する。 背景技術
Z型 DN Aは約 3 0年前に発見された左巻きの DN A構造を有するヌクレオチ ドであるが、 その生物学的な役割は未だ不明である。 その理由は、 溶液中で安定 に左巻きを取らせることが、 研究用に用いる 6— 2 0量体程度の長さでは難しい ためにある。 従って、 Z型 DNAを研究するためには Z型 DNAを安定化するモ ノマ一ュニッ 卜の開発が必要である。
本発明者らは、 先にデォキシ型の 8—メチルグアノシン ( M e G ) によって、 Z型 D N Aが安定化されることを見出し-, 文献等により報告している （例えば、 先行技術文献 1参照。 ） 。 また、 このデォキシ型の 8—メチルグアノシンを用い てこれまで種々の研究を行ってきた （例えば、 先行技術文献 1、 先行技術文献 2、 先行技術文献 3 , 先行技術文献 4等参照。 ) 。
この 8—メチルデォキシグアノシンの使用により、 これまで極めて困難であつ た Z型 D N Aの安定化が取り敢えず可能になった。 しかしながら、 未だ充分と言 うまでには到っておらず、 Z型 DNAをより効果的に安定化するモノマ一ュニッ トを探索する、 更なる検討が待たれている現状にある。 本願の発明に関連する先行技術文献としては次のものがあり、 これは参照して 本明細書中に取り込まれる。
1. Suiyama, H.； Kawai , K.； Matsunaga, A,； Fuj imoto, K.； Sai to, I.； Robinson, H.； Wang, A. H. -J. , " Synt es i s, Structure and Thermodynamic Properties of 8- Methylguanine - Containing Oligonucleotides Z-DNA under Physiological Salt Conditions,; Nucleic Acids Res. , 1996, 24, 1272.
Kawai,K.； Saito.I.； Sugiyama, H. Conformat i on Dependent
Photochemistry of 5-Halouracil -Containing DNA: S t er eospee i f i c V a -Hydroxylation of Deoxyr ibose in Z - form DNA. ； J. Am. Chem. So 1999, 121, 1391-1392.
Kawai, K.； Sa'i t o, I .； Kawasliima, E. ; I sh ι do, Y.； Sugiyama, H. , " Intras tr and 2' β - Hydrogen Abstraction of 5' -Adj acent Deoxy guanos ine by Deoxyur idin-5-yl in Z form DNA. "； Tetrahedron Letters 1999, 40, 2589-2592. ·
Oyoshi, T.； Kawai, K.； Sugiyama H. , "Efficient C2' a -Hydroxylat ion of Deoxyr ibose in Protein-Induced Z-Form DNA. ； J. Am. Chem. Soc. , 2003,
125, 1526-1531. 発明の開示
本発明は、 上記した如き現状に鑑みなされたもので、 Z型 DNAをより効果的 に安定化し得る.新規なモノマ一ュニッ トと、 該モノマ一ュニッ トをオリ fヌクレ ォチドに組み込むための試薬、 並びに該試薬を用いた Z型 DN Aの安定化方法を 提供することを目的とする。
Figure imgf000004_0001
(式中、 R1はァシル基を表し、 ' R2は低級アルキル基を表し、 R3はトリ置換シリ ルォキシ基又はテトラヒドロピラニルォキシ基を表し、 R 4はシァノエチル基又は ァリル基を表す。 ） で示されるグアノシン誘導体に関する。
また、 本発明は、 上記グアノシン誘導体を含んでなる、 Z型 D N Aを安定化す るための試薬に関する。
更に、 本発明は、 上記グアノシン誘導体を用いることを特徴とする、 Z型 D N Aの安定化方法に関する。
更にまた、 本発明は、 上記グアノシン誘導体を用いることを特徴とする、 8位 に低級アルキル基を有するグアノシンのオリゴヌクレオチドへの導入方法に関す る。
また、 本発明は、 8位に低級アルキル基を有するグアノシンを導入してなるォ リゴヌクレオチドに関する。
即ち、 本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 グアノシ ンの 8位にメチル基を導入した 8 一メチルグアノシンが、 前記 8—メチルデォキ シグアノシン ( M e G ) に比べ、 数倍強力に Z型 D N Aを安定化することを見出 し本発明を完成するに到った。 図面の簡単な説明
第 1図は、 実施例 3で得られた.. 本発明に係る 3種のオリゴヌクレオチドにつ いての円二色性分光 ( C D ) スぺク トルである。 発明を実施するための最良の形態
上記一般式 [ 1 ] において、 R 1で表されるァシル基としては、 ァミノ基の修飾 基としてこの分野で通常使用されているァシル基であればどのようなものでもよ いが、 例えば、 イソプチリル基、 ベンゾィル基、 4 一 ( t 一プチル) ベンゾィル 基等、 嵩高いァシル基が好ましいものとして挙げられる。
また、 R 2で表される低級アルキル基としては、 例えば、 メチル基、 ェチル基、 n—プロピル基、 イソプロピル基、 n—ブチル基、 s —ブチル基、 t 一ブチル基 等、 炭素数 1 ~ 4の低級アルキル基が好ましいものとして挙げられるが、 合成の し易さ等の点から、 メチル基が特に好ましい。 上記一般式 [ 1 ] において、 R3で表されるトリ置換シリルォキシ基としては、 例えば、 t一プチルジメチルシリルォキシ基、 トリイソプロピルシリルォキシ基、 トリフエニルシリルォキシ基等、 嵩高いトリ置換シリルォキシ基が好ましいもの として挙げられる。
上記一般式 [ 1 ] で示される本発明のグアノシン誘導体は、 Z型 DNAを安定 化するモノマーュニッ 卜として極めて有用である。
即ち、 上記一般式 [ 1 ] で示される本発明のグアノシン誘導体を用いることに より、 Z型 D N Aを強力に安定化することが出来る。
より詳しくは、 本発明のグアノシン誘導体を用いて、 DNA固相合成法により、 8位に低級アルキル基を有するグアノシンを DN Aへ導入することにより、 Z型 DN Aを安定化させることが出来る。
因みに、 一般式 [ 1 ] において、 R 1がイソプチリル基であり、 R 2がメチル基 であり、 R 3が t—プチルジメチルシリルォキシ基であり、 R 4がシァノエチル基 である本発明のグアノシン誘導体を用いて、 8一メチルグアノシンを各種オリゴ ヌクレオチドに導入したものは、 同様の手法で 8ーメチルデォキシグアノシンを 各種ォリゴヌクレオチドに導入したものと比べて、 B - Z転位中点が著しく低下 し、 数倍〜数十倍も安定化効果があることが判った。
本発明のグアノシン誘導体の製造法を一般式 [ 1 ] において、 R1がイソプチリ ル基であり、 R2がメチル基であり、 R 3が t—プチルジメチルシリルォキシ基で あり、 R4がシァノエチル基であるグアノシン誘導体の場合を例にして、 反応スキ ームで示すと以下のようになる。
Figure imgf000007_0001
上記反応スキーム中、
a) の工程は、 ピリジン中、 トリメチルシリルクロライ ド.， 次いで、 無水イソ 酪酸を作用させる。
b ) の工程は、 水溶媒中、 H2S '〇4、 F e S 04、 t —プチルハイ ド口パーォキ サイ ドを作用させる。 '
. c ) の工程は ピリジン中、 ジメ トキシト リチルクロライ ド . トリェチルアミ ン、 4ージメチルアミノピリジンを作用させる。
d ) の工程は, ジクロロメタン中、 イミダゾールと 2 '— t 一プチルジメチルシ リルクロライ ドを作用させる。
e ) の工程は、 ジクロロメタン中、 N， N—ジイソプロピルァミンと 2—シァ ノエチル N， N—ジイソプロピルフォスフォロアミダイ トを作用させる。
なお、 詳細は、 後記実施.例の項参照。 .
なお、 上記 b) の工程はグアノシンの 8位のメチル化の工程であるが、 ここで は、 .Tetrahedron 30, 2677-2682 (1974)に記載の方法を採用しているが、 グアノシ ンの 8位のアルキル化は、 メチル化を含め、 下の方法によっても可能である。 即ち、 リポースの水酸基を例えば t —プチルジメチルシリル基等で保護した後、 リチウム ジイソプロピルアミン （LDA) で 8位をリチォ化し、 次いで、 これを 適当なアルキルハラィドと反応させれば選択的にアルキル基が導入できる。 従つ て、 他のアルキル基を導入する場合はこの方法で行えばよい [Chem.Pharm.Bull· ， 72 - 79 (1987)参照。 ] 。 勿論、 メチル基を導入する場合もこちらの方法で行つ てもよい。
本発明のグアノシン誘導体を用いて、 8位に低級アルキル基を有するグアノシ ンをオリゴヌクレオチドへ組み込む方法としては、 市販の D N A合成機を使用し た D N Aオリゴマーの固相合成法が挙げられる。 操作手順等はそれぞれの D N A 合成機に添付されているプロトコ一ルに従つでこれを行うことで足りる。 なお、 特願 2 0 0 3— 0 5 2 8 1 7明細書に記載された内容を、 本明細書にす ベて取り込む。 実施例
以下、 実施例により本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施 例により何ら限定されるものではない。 実施例 1 8—メチル— N—イソプチリル一 5 '— O—ジメ トキシトリチルー 2 ' 一 t一プチルジメチルシリル一グアノシン一 ( 2一シァノェチル一 N， N—ジィ ソプロピルフォスフォロアミダイ ト (化合物 ) (一般式 [ 1 ] において、 R 1が イソプチリル基、 R 2がメチル基、 R 3が t 一プチルジメチルシリルォキシ基、 R
4がシァノエチル基であるグアノシン誘導体） の合成
( 1 ) N—イソプチリル—グアノシン （化合物丄） の合成
グアノシン （ 7 g , 2 5 mm o 1 ) を、 ピリジンで 3回乾燥させ、 ピリジン
( 1 0 mL ) 中で、 1 7. 5 m L ( 1 2 5 mm o 1 ) のトリメチルシリルクロ ライ ドを加えて、 2時間撹拌した後、 2 1 mL ( 1 2 5 mm o 1 ) の無水イソ酪 酸を加えて室温で 4時間撹拌反応させた。 反応後、 氷冷しながら、 水 （ 3 5m L) を加えて 1 5分間撹拌した後、 2 9 %アンモニア永 ( 3 5 mL ) を加えて 1 0分間撹拌した。 減圧濃縮して溶媒を溜去した後、 2 0 0 mLのジクロロメタン で抽出し、 シリカゲルカラムクロマトグラフィ一 （展開溶媒： メタノール/ジクロ ロメタン = 2/8) で精製し、 化合物丄を 3. 6 g得た （収率 3 9 %) 。
得られた化合物のスペクトルデータを以下に示す。
JH NM R (500 MHz, D SO-de) δ 8.24 (s, 1Η, H- 8), 5.80 (m， 1H， 1'), 4. 42 (m， 1H, 2')， 3.88 (m 4')， 4.08 (m, 1H, 3'), 3.33 (m, 2H, 5'), 2.77 ( m, 1H， isobutyryl CH )， 1.12 (d， 6H, J = 7Hz, 2 CH3) p pm。
(2) 8—メチルー N—イソプチリル一グアノシン (化合物 ) の合成
( 1 ) で得られた化合物丄 （ 1 g， 2. 6 mm o 1 ) と F e S〇4 ' 7 H20 (6. 7 g , 24. Immo l ) を含む H2S 04 ( 1 N) 溶液 1 6 0 mLに 7 0 % t一ブチルハイ ドロパ一ォキサイ ド （9. 5 mm o 1 ) を含む 1 0 0 mL水溶 液を 5分間で滴下し、 0°Cで 1時間反応後、 KOH飽和水溶液で中和した。 遠心 分離により得られた上澄み液を減圧濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグ ラフィ一 （展開溶媒 ： メタノール/ジクロロメタン = 1/9) で精製し、 化合物！_ を 0. 4 g得た （収率 4 1 %) 。
得られた化合物のスぺクトルデータを以下に示す。
Ή NMR (500 MHz, DMSO-de) o 5.81 (m, 1H， )， 4.32 (m, 1H, 2')， 3.86 (m 4')， 4.12 (m， 1H, 3'), 3.29 (m, 2H, 5')' 2.78 ( m, 1H, isobutyryl CH ), 2.47 (s、 3H、 - 8 C H 3 ) 1.11 (d, 6H， J = 7Hz, 2C H 3) p p m。
(3) 8—メチル _N—ィソプチリル一 5 '— O—ジメトキシトリチル一グアノシ ン （化合物 ） の合成
( 2 ) で得られた化合物 ( 5 0 0 m g、 2. 4 mm o 1 ) を、 ピリジンで 3 回乾燥させ、 ピリジン （ 1 5mL) 中で、 7 0 0mg ( 3. 7 mm o 1 ) のジメ トキシトリチルクロライ ド （DMT r C l ) 、 0. 3 mL ( 2. I mmo l ) の トリェチルアミン、 4. 2 m g (0. 0 3 5 mm o 1 ) の 4一ジメチルアミノピ リジンを加えて室温で一晩撹拌反応させた。 反応後、 反応液に 5 %の N aHCO 3水溶液 （ 5 0m l ) を氷冷しながら加えた後、 6 0 mLのジクロロメタンで抽出 し、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー （展開溶媒 ： メタノール/ジクロロメタ ン = 3/9 7 ) で精製して化合物 Aを 0. 5 g得た （収率 6 0 %) 。
得られた化合物のスぺク トルデ一夕を以下に示す。
XH NMR (500 MHz, DMS0-d6) δ 5.81 (m, 1Η, Γ), 4.32 (m, 1H, 2')， 3.86 (m 4'), 4.12 (m, 1H, 3')， 3.29 (m, 2H, 5')， 2.78 ( m， 1H, isobutyryl CH )' 2.47 (s、 3H、 一 8 CH3) 1.11 (d, 6H, J = 7Hz, 2CH3) p pm。
(4) 8 —メチル— N—イソプチリル一 5 '— O—ジメ トキシトリチル一 2 ' — t 一プチルジメチルシリル一グアノシン (化合物 J_) の合成
( 3 ) で得られた化合物！ _ ( 1 g、 1. 4 mm o 1 ) とイミダゾ一ル ( 2 3 8 g , 3. 5 mm o 1 ) を含むジクロロメタン溶液 2 5 mLに 2 '— t 一ブチルジメ チルシリルクロライ ド ( 2 5 2 m g) を加えて 2 0 °Cで 1 6時間撹拌反応させた。 反応後、 反応液に 1 0 %N a H C O 3水溶液 3 0 m 1 を加えた後、 4 0 mLのジ クロ口メタンで抽出し、 シリカゲルカラムクロマ トグラフィー (展開溶媒 ： へキ サン/酢酸ェチル = 5 /1 ) で精製して化合物 Aを 0. 3 g得た (収率 3 0 %) 。 得られた化合物のスぺク トルデータを以下に示す。
:H NMR (500 MHz, DMS0-d6) δ 7.20-7.39 (m， 9H, ph) , 6.89 (d， 4H， J = 8.5Hz. ph), 4.96 (m, 1H, Γ), 4.16 (m， 1H. 3'), 3.74 (s， 6H, 2C H3), 3. 18 (m, 2H， 5' ), 3.02 (m, III 6'), 2.77 (m, 1H， isobutyryl CH)， 2.14 (m， 1 H， 2'), 2.05 (m， 2H, 2' ' and 4')， 1.88 (s, 3H, -8CH3)， 1.62 (ra， 1H, 6' '), 1.10 (d, 6H, J = 7Hz, 2C H3) p pm。
( 5 ) 8 —メチルー N—イソプチリル一 5 '— O—ジメ トキシトリチル一 2 '— t 一プチルジメチルシリル一グアノシン一 ( 2 —シァノエチル一 N, N—ジイソプ 口ピルフォスフォロアミダイ ト （化合物 の合成
( 4 ) で得られた化合物 J_ ( 3 0 0 m g， 0. 4mmo 1 ) をゴムシールドポ トルに入れ、 密封した後乾燥ァセトニトリル 3 mLを加え、 針を通じて減圧しァ セトニトリルを蒸発させ水を共沸させた。 乾燥ジクロロメタン 3 mLをシリ ンジ で注入し、 乾燥 N， N—ジイソプロピルアミン （ 0. 4 5 mL、 0. 6 mm o 1 ) と 2—シァノエチルー N， N—ジイソプロピルフォスフォロアミダイ ト （0. 2 5mL、 1 mm o 1 ) を加えて室温でー晚撹拌反応させた。 反応後、 反応液に 1 0 % N a H C 03水溶液 1 0m l を加えた後、 2 OmLのジクロロメタンで抽出 し、 有機層を N a 2S〇4で乾燥させ、 シリカゲルカラムクロマトダフィー （展開 溶媒： へキサン/ァセトン/トリェチルァミン =4 9/4 9/2) で精製して化合物 を 240 mg得た （収率 6 0 %) 。
得られた化合物のスぺクトルデータを以下に示す。
E S I MS (m/e) C52H75N7。9P S i として ： 計算値 （M + H) 1 0 0 0. 5。 実測値 1 0 0 0. 8。 （P E S C I EX AP I 1 6 5を用いて測定） 実施例 2 D N Aオリゴマーの固相合成
実施例 1で得られた化合物 ( 2 0 0 m g , 0. 2 mm o 1 ) をゴムシ一ルド ポ卜ルに入れ、 乾燥ァセトニトリル 2 mLを加え減圧して蒸発させた後、 0. 3 mLの乾燥ァセトニトリを加えて溶解し、 OL I GO 1 0 0 0 DNA合成機 (べックマン社製) に取り付け、 オリゴヌクレオチド d (C GCM e r G C G) 、 d (CM e r GCACM e r G C G ) 及び d ( C M e r G C A T M e r G T G) を DNA合成機に添付されたプロトコ一ルに従って合成した。
合成したオリゴヌクレオチドの組成と濃度は.. 酵素分解によってモノヌクレオ シドに加水分解することによつて確認した。
なお、 上記オリゴヌクレオチドの式中、 Me r Gは 8一メチルグアノシンを表 す。 実施例 3 円二色性分光実験 （Circular Dichroism Experiments)
実施例 2で得られた 3種のオリゴヌクレオチドについて、 円二色性スぺク トル 解析を円二色性分光計 A V I V MOD E L 6 2 D S/2 0 2 CD s p e c t r o p h o t ome t e r (ァビブ社製） を用いて測定した。 オリゴヌクレオチ ド （濃度： 0. 1 5mMベ一ス濃度、 5 mM 力コジル酸ナトリウム緩衝液、 pH 7. 0 ) の CD (円二色性分光） スペク トルは種々の N a C 1濃度において 1 c mの長さセルを使用して測定した。 結果を第 1図に示す。 第 1図の （ a ) は、 オリゴヌクレオチド 5 '— C G CM e r GC G— 3 'につい ての C Dスペク トルの結果を、 （b) は、 オリゴヌクレオチド 5 '— C M e r G C A CM e r G C G— 3 'についての CDスぺク トルの結果を、 （ c )'は、 .オリゴヌ クレオチド 5 '— CM e r GCATMe r GT G— 3 'についての CDスペク トル の結果をそれぞれ示す。
また、 塩濃度を変化させ、 CDスぺク小.ルを測定して B— Z転移の中点の N a C 1濃度を求めた。 結果を表 1に示す、 また、 比較のため、 8—メチルグアノシ ン （Me r G) の代りに 8—メチルデォキシグアノシン (M e G) が導入された オリゴヌクレオチドについて同様に測定した結果も表 1に併せて示す。
'なお、 表 1中、 M e Gは 8ーメチルデォキシグアノシンを表し-, Me r Gは 8 一メチルグァソシンを表す。
実験 1 d、し " し y 2.6 M 実験 2 d(CGCMeGCG) 30 mM 実験 3 d(CGCMerGCG) <5 mM 実験 4 d(CGCGTGCG)/d(CMeGCACMeGCG) 800 mM 実験 5 d(CGCGTGCG)/d(CMerGCACMerGGG) 50 mM 実験 6 d(CMeGCATMeGTG)/d(GCGTACAG) 2450 mM 実験 7 d(GMerGGATMerGTG)/d(GCGTACAC) 200 mM 表 1から明らかなように、 各種ォリゴヌクレオチドに 8—メチルグアノシンを 組み込むことにより、 何れの場合も、 転移中点が著しく低下し、 非常に低い塩濃 度でも Z型 DNAを安定化することが判る。 その理由としては、 グアノシンの 8 位にメチル基を導入すると、. その塩基が s y nの配向をとり易くなり、 更に、 糖 の 2 '位に水酸基を導久することにより親水性が高まり、 糖のパッカリングが C 3 ' e n d oコンホメーシヨンをとることによって更に安定化するためであると考え られる。 産業上の利用可能性
本発明は、 Z型 DNAをより効果的に安定化し得る新規なモノマーュニッ卜で ある 8—メチルグアノシンと、 これをオリゴヌクレオチドに組み込むための試薬 である一般式 [ 1 ] で示されるグアノシン誘導体と、 これを用いた Z型 DNAの 安定化方法を提供するものであり、 本発明に係るグアノシンの 8位にメチル基を 導入した 8—メチルグアノシンは、 従前から知られている 8—メチルデォキシグ ァノシン （Me G) に比べ、 数倍強力に Z型 DN Aを安定化することが出来るの で、 Z型 D N Aを研究する上で画期的なツールとなることが予想される。

Claims

求 の 範 囲
下記一般式 [.1 ]
Figure imgf000014_0001
(式中、 R1はァシル基を表し、 R 2は低級アルキル基を表し、 R 3はトリ置換シリ ルォキシ基又はテトラヒドロビラ二ルォキシ基を表し、 R4はシァノェチル基又は ァリル基を表す。 また、 DMT rはジメ トキシトリチル基を表す。 ） で示される グアノシン誘導体。
2. —般式 [ 1 ] において、 R2がメチル基である請求の範囲第 1項に記載のグ ァノシン誘導体： "
3. —般式 [ 1 ] において、 R 1がイソブチリル基であり、. R2がメチル基であ り、 R 3が tーブチルジメチルシリルォキシ基であり、 R 4がシァノエチル基であ る請求の範囲第 1項に記載のグアノシン誘導体。
4. 請求の範囲第 1項〜第 3項の何れかに記載のグアノシン誘導体を含んでな る、 ' Z型 D N Aを安定化するための試薬。
5. 請求の範囲第 1項〜第 3項の何れかに記載のグアノシン誘導体を用いるこ とを特徴とする、 Z型 D N Aの安定化方法。
6. 請求の範囲第 1項〜第 3項の何れかに記載のグアノシン誘導体を用いるこ とを特徴とする、 8位に低級アルキル基を有するグアノシンのオリゴヌクレオチ ドへの導入方法。
7. 8位に低級アルキル基を有するグアノシンを導入してなるオリゴヌクレオ チド。
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