WO2004073742A1

WO2004073742A1 - Ｂ型肝炎ウイルスx相互作用蛋白質の分解阻害剤

Info

Publication number: WO2004073742A1
Application number: PCT/JP2004/002138
Authority: WO
Inventors: Hirofumi Doi; Shoichi Masuda; Yoshitaka Isumi; Noriko Sakaiya
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd; Celestar Lexico Sciences Inc
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd; Celestar Lexico Sciences Inc
Priority date: 2003-02-24
Filing date: 2004-02-24
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2005-08-24
Also published as: EP1607101A1; JPWO2004073742A1; US20060217299A1; EP1607101A4

Abstract

キャスペース−１によりＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）が切断されて分解することおよびその切断認識部位を見出したことに基づいて、ＸＩＰの分解阻害、より具体的にはキャスペース−１によるＸＩＰの分解阻害、ＸＩＰの分解に基づく疾患の予防および／または治療、Ｂ型肝炎ウイルスの複製および／または転写の阻害、Ｂ型肝炎の予防および／または治療、並びにＢ型肝炎ウイルスによる肝癌の予防および／または治療のための手段を提供する。

Description

明細書

B型肝炎ウィルス x相互作用蛋白質の分解阻害剤技術分野

本発明は、 B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（He p a t i t i s B v l r u s x i n t e r a c t i n g p r o t e i n ;以、 X I Pと略杯することがある）の分解阻害、より具体的にはキャスペース一 1 (C a s p a s e— 1) による X I Pの分解阻害、 X I Pの分解に基づく疾患の予防および/または治療、 B型肝炎ウィルス（H e p a t i t i s B v i r u s ；以下、 H BVと略称することがある）の複製および Zまたは転写の阻害、 B型肝炎の予防および Zまたは治療、並びに H B Vに起因する肝癌の予防および/または治療のための手段に関する。背景技術

キャスペース一 1は広く組織に分布するシスティンプロテアーゼであり、炎症性サイトカインの産生やアポトーシスの誘導に関与する。細胞質内では不活性体

(プロ体）として存在し、細胞内外の刺激により活性体へと変換される。最近、 D型肝炎ウィルスの感染と、キャスペース一 1の発現量との相関が報告されている（非特許文献 1)。

肝炎を引き起こす肝炎ウィルスは A型、 B型、 C型、 D型および E型の 5つのゲノムタイプに類別される。最近では、 F型や G型の存在も知られるようになつてきている。

B型肝炎ウィルスは、急性肝炎および慢性肝炎を引き起こす（非特許文献 2)。さらに、慢性的な HBV感染による慢性 B型肝炎は肝細胞癌（h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n oma) へ進展することが知られている（非特許文献 3)。肝細胞癌は、原発性肝癌（h e p a t i c c a n c e r) の中で最も多く見られる癌であり、肝癌の約 9割を占める。 B型肝炎の肝細胞癌への進展のメ力二ズムには、 HBV遺伝子由来の蛋白質、例えば B型肝炎ウィルス X蛋白質（H e p a t i t i s B v i r u s x p r o t e i n ;以下、 HB xと略称することがある）の関与が報告されている。

HB xは、 DNA結合領域を持たなレ、が、転写因子と相互作用することにより、様々なウィルスプロモーターや細胞のプロモーターのトランス作用因子として働く（非特許文献 4)。すなわち、 HB Xはこれらプロモーターの転写活性を促進する。具体的には、 HB xが、 HBV由来の遺伝子の発現を増強し、 HBVの複製を促進することが報告されている（非特許文献 5)。また、 HB x力細胞増殖に関する細胞内情報伝達経路を活性化することが知られている。このように HB x は、遺伝子の転写調節等の作用により、肝臓の発癌に関与すると考えられる（非特許文献 4)。

一方、 X I Pは、 HB Xと結合する因子として肝細胞癌由来の c DNAライプラリーから発見され、 HB Xの HBV複製促進作用を抑制することが報告されている（非特許文献 6)。

以下に本明細書で引用した文献を列記する。

非特許文献 1：ジアン（ J i a n g Υ·) ら、「Z h o n g h u a G a n Z a n g B i n g Z a Z h i .」、 200 1年、第 9卷、増刊： p . 9— 1 1。非特許文献 2 ：シーガー（S e e g e r C .) ら、「マイクロバイオロジーァンドモレキュラーバイオロジーレビューズ（M i c r o b i o l o g y a n d Mo l e c u l a r B i o l o g y R e v i e w s)J、 2000年、第 64卷、 p. 5 1— 6 8。

非特許文献 3 ：ビースレイ（B e a s 1 e y R P.) ら、「ランセット（L a n c e t)」、 1 9 8 1年、第 2卷、 p. 1 1 2 9— 1 1 33。

非特許文献 4 ：ラブ（R a b e C.) ら、「ダイジエステイブディジージィズ（D i g e s t i v e D i s e a s e s)」、 200 1年、第 1 9卷、 p . 2 79— 28 7。非特許文献 5 ··ゼンミン（Z h e nm i n g X u T S)ら、「ジャーナルォブヴィロロジー（J o u r n a l o f V i r o l o g y)」、 2002年、第 76卷、 p. 25 7 9— 2584。

非特許文献 6 ：メレガリ（Me 1 e g a r i Μ·) ら、「ジャーナルォブヴイロ口ジー（J o u r n a l o f V i r o l o g y)」、 1 9 98年、第 72 卷、 p. 1 7 3 7— 1 74 3。

非特許文献 7 ：ウルマー（U 1 me r )、「サイエンス（S c i e n c e)」、 1 98 3年、第 2 1 9卷、 p . 666— 67 1。

非特許文献 8 ：「ペプチド合成」（日本国）、丸善株式会社、 1 9 75年。

非特許文献 9：「ペプチド合成（P e p t i d e S y n t h e s i s )」（米国）、インターサイエンス、 1 9 96年。発明の開示

本発明においては、キャスペース一 1と相互作用する蛋白質を見出し、キャスペース一 1による当該蛋白質の分解に基づく疾患の予防手段および/または治療手段を提供すべく種々の検討を重ねた。

そして、キャスペース一 1が X I Pと相互作用することをインシリコ（ i n s i 1 i c o ) で予測した。さらに、キャスペース一 1により X I Pが切断され分解されることを実験的に明らかにし、キャスペース一 1による X I Pの切断部位を見出して、本発明を完成した。

すなわち、本発明の一態様は、キャスペース一 1による X I Pの切断を阻害することを特徴とする、 X I Pの分解に基づく疾患の予防剤および Zまたは治療剤に関する。

また、本発明の一態様は、キャスペース一 1による X I Pの切断を阻害することを特徴とする、 HBVの複製および/または転写の阻害剤に関する。

さらに、本発明の一態様は、キャスペース一 1による X I Pの切断を阻害することを特徴とする、抗 HBV剤に関する。さらにまた、本発明の一態様は、キャスペース一 1による X I Pの切断を阻害することを特徴とする、 B型肝炎の予防剤および/または治療剤に関する。また、本発明の一態様は、キャスペース一 1による X I Pの切断を阻害することを特徴とする、肝癌の予防剤および Zまたは治療剤に関する。

さらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号 2、配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6または配列番号 7に記載のアミノ酸配列からなるぺプチドに関する。

さらにまた、本発明の一態様は、配列表の配列番号 2、配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6または配列番号 7に記載のアミノ酸配列を含有するペプチドに関する。

また、本発明の一態様は、上記ペプチドを含んでなる X I P分解阻害剤に関する。

さらに、本発明の一態様は、上記ペプチドを含んでなり、キャスペース一 1による X I Pの切断を阻害することを特徴とする X I P分解阻害剤に関する。

さらにまた、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を含んでなる医薬組成物に関する。

また、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を含んでなる X I Pの分解に基づく疾患の予防剤および Zまたは治療剤に関する。

さらに、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を含んでなる H B Vの複製おょぴ /または転写の阻害剤に関する。

さらにまた、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を含んでなる抗 H B V剤に関する。

また、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を含んでなる B型肝炎の予防剤および/または治療剤に関する。

さらに、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を含んでなる肝癌の予防剤および Zまたは治療剤に関する。

さらにまた、本発明の一態様は、キャスペース一 1を阻害する工程を含む X I Pの分解阻害方法に関する。

また、本発明の一態様は、キャスペース一 1による X I Pの切断を阻害するェ程を含む X I Pの分解阻害方法に関する。

さらに、本発明の一態様は、上記分解阻害方法を用いることを特徴とする X I Pの分解に基づく疾患の予防方法および/または治療方法に関する。

さらにまた、本発明の一態様は、上記分解阻害方法を用いることを特徴とする H B Vの複製および Zまたは転写の阻害方法に関する。

また、本発明の一態様は、上記分解阻害方法を用いることを特徴とする B型肝炎の予防方法および/または治療方法に関する。

さらに、本発明の一態様は、上記分解阻害方法を用いることを特徴とする肝癌の予防方法および Zまたは治療方法に関する。

さらにまた、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を用いることを特徴とする X I Pの分解に基づく疾患の予防方法および Zまたは治療方法に関する。

また、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を用いることを特徴とする H B Vの複製および/または転写の阻害方法に関する。

さらに、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を用いることを特徴とする B型肝炎の予防方法および/または治療方法に関する。

さらにまた、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を用いることを特徴とする肝癌の予防方法およびまたは治療方法に関する。

また、本発明の一態様は、 X I Pの分解阻害剤の同定方法であって、キャスべース一 1による X I Pの切断を可能にする条件下、キャスペース一 1および Zまたは X I Pを化合物と接触させ、ついで X I Pの分解を検出することができるシグナルおよぴ zまたはマーカ一を使用する系を用いて、該シグナルおよぴノまたはマーカーの存在若しくは不存在および/または変化を検出することにより、該化合物が X I Pの分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。

さらに、本発明の一態様は、 X I Pの分解阻害剤の同定方法であって、キャスペース一 1による X I Pの切断を可能にする条件下、キャスペース一 1および Z または X I Pを化合物と接触させ、ついで X I P量または X I P分解物量の存在若しくは不存在および/または変化を検出することにより、該化合物が X I Pの分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。

さらにまた、本発明の一態様は、上記同定方法により同定された化合物に関する。

また、本発明の一態様は、キャスペース一 1、キャスペース一 1をコードするポリヌクレオチドおよびキャスペース一 1をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1つと、 X I P、 X I Pをコードするボリヌクレオチドおよび X I pをコードするポリヌクレオチドを含有するべクタ一のうちの少なくともいずれか 1つを含んでなるキットに関する。図面の簡単な説明

第 1図は、 X I P (配列番号 1) のキャスペース一 1による切断認識部位を示す図である。アミノ酸配列は 1文字表記し、切断部位は「Z」で示した。

第 2図は、キャスペース一 1 (CAS P 1) と X I P (配列番号 1) の相互作用をインシリコで予測した結果を示す図である。キャスペース一 1と X I P (配列番号 1) の間でローカルァライメントを行い、高いスコア（ s c o r e) を示した領域を図示した。アミノ酸配列は 1文字表記した。（実施例 1)

第 3図は、キャスペース一 1が、ダルタチオン S_トランスフェラーゼ (GS T) と X I P (配列番号 1) の融合蛋白質（GST— X I P) を切断したが、 G S Tは切断しなかったことを示す図である。図中の「十」および「一」はそれぞれ、キャスペース一 1の有無を示す。各矢印は、図示したように、 GST— X I Pまたは GSTを示す。矢頭は、 G S T— X I Pがキャスペース一 1により切断され分解されて生じた断片を示す。（実施例 2)

第 4図は、 GSTと X I P (配列番号 1) の融合蛋白質（GST— X I P) がキャスペース一 1により切断されて生じる高分子量側の断片および/または低分子量側の断片が、 X I P変異体と G S Tの融合蛋白質〔G S T— X I P (D 25 A)、 G S T-X I P (D 3 9A)ヽ GST— X I P (D 5 8A)ヽ GST— X I P (D 70A)、 GST— X I P (D 25 A, D 70 A)] がキャスペース一 1により切断されて生じた断片中に見出されたことを示す図である。また、 GST— X I P (D 25 A, D 70 A) の断片には、上記断片を示す 2つのバンド以外に、別な断片を示すバンドが検出された。このバンドは、 G S T-X I P (D 25 A, D 70 A, D 80A) の断片には検出されなかった。図中の「十」および「一」はそれぞれ、キャスペース一 1の有無を示す。（実施例 4) 発明を実施するための最良の形態

本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本国特許出願番号第 20 03- 045 7 1 1号からの優先権を請求するものである。

本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により通常に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物等の資料は、引用により、本明細書中にそれらの全体が完全に記載されていると見なす。

以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示に過ぎず、本発明を何ら限定しない。本発明においては、キャスペース一 1と X I p (配列番号 1) が相互作用することを、国際公開 WO 0 1 /6 7 29 9号公報記載の方法に従ってィンシリコで予測した。さらに実験的に、キャスペース一 1が X I P (配列番号 1) を切断し分解することを初めて明らかにした。

X I P (配列番号 1) のアミノ酸配列において、キャスペース一 1による切断認識配列は、 HLED/T (配列番号 2)、 LCTD/S (配列番号 3 )、 TL S D/E (配列番号 4)、 LT SD/PTD/ I (配列番号 5)、 L E S D/N (配列番号 6) および QKHD/G (配列番号 7) であると予想された（図 1参照）。ここで、アミノ酸配列は 1文字表記により記載した。アミノ酸配列中の「Z」は切断部位を表わす。また、キャスペース一 1による切断認識配列とは、キャスべース一 1により認識される配列であって切断される部位を含む配列を意味する。

X I P (配列番号 1) は、 HB Xと結合してその HB V複製促進作用を抑制することが知られている（非特許文献 6)。 HB xは、 HBV複製促進作用の他に、様々なウィルスプロモーターや細胞のプロモーターの転写活性を促進すること、および細胞増殖に係わる細胞内情報伝達経路を活性化することが知られている。これらから、 X I P (配列番号 1) は、 HB Xに結合してその作用を抑制することにより、ウィルス、例えば HBVの複製および Zまたは転写や、細胞の異常な増殖を抑制する防御因子であると考えられる。

発明者らは、キャスペース一 1により X I p (配列番号 1) が切断されて分解し、その結果、 HB Xの作用の抑制が解除され、それによりウィルス、例えば H BVの複製および/または転写や、細胞の異常な増殖が引き起こされると考えた。例えば、 B型肝炎の発症および進行、並びに肝癌への進展のメカニズムにおいて、キャスペース一 1が X I P (配列番号 1) を分解して切断することにより、 X I P (配列番号 1) の HBV複製抑制作用が解除されるという経路が存在すると考えられる。

したがって、キャスペース一 1による X I P (配列番号 1) の切断を阻害することにより、例えば、 HB Xの作用の抑制が可能になり、その結果 HBVの複製および Zまたは転写や細胞の異常な増殖の抑制が可能になる。さらには、 X I P (配列番号 1) の分解に基づく疾患の予防およびまたは治療が可能になる。具体的には、例えば、 B型肝炎の発症おょぴ進行、並びに肝癌への進展を阻害することが可能になる。

これら知見に基づいて達成した本発明の一態様は、 X I P分解阻害剤に関する。上記 X I P分解阻害剤は好ましくは、キャスペース一 1による X I P (配列番号 1) の切断を阻害することを特徴とする。ここで X I P (配列番号 1) の分解とは、 X I P (配列番号 1) のペプチド結合がそのアミノ酸配列のある箇所で切断され、その結果、 X I P (配列番号 1) が断片化されることをいう。また、阻害剤とは、ある機能に対して阻害効果を奏する化合物（後述する例として競合阻害効果を有するペプチド類、抗体および低分子化合物等が挙げられる）あるいは該化合物を含む組成物をいう。すなわち、

X I P分解阻害剤とは、 X I P (配列番号 1) の分解を阻害する効果を奏する化合物あるいは該化合物を含む組成物を意味する。

本発明に係る分解阻害剤は、 X I P (配列番号 1) の分解を阻害する化合物、好ましくはキャスペース _ 1による X I P (配列番号 1) の切断を阻害する化合物を含んでなる。より好ましくは、キャスペース一 1による X I P (配列番号 1) の切断を特異的に阻害する化合物を含んでなる。キャスペース一 1による X I P (配列番号 1) の切断を特異的に阻害する化合物とは、キャスペース一 1による

X I P (配列番号 1) の切断を強く阻害するが、キャスペース一 1による他の蛋白質の切断を阻害しないか、弱く阻害する化合物を意味する。

このような化合物として、キャスペース一 1の酵素活性を阻害する化合物や、キャスペース一 1と X I p (配列番号 1) の相互作用を阻害する化合物等が挙げられる。こで、「キャスペース一 1と X I P (配列番号 1) の相互作用」とは、キャスペース一 1と X I P (配列番号 1 )がある様式により互いに作用を及ぼし、その結果、具体的には X I p (配列番号 1)が切断されて分解されることをいう。上記「ある様式」には、例えば結合、接触あるいは近接等が含まれるが、結果として互いに作用を及ぼし得る様式であればいずれの様式であってもよい。

キャスペース一 1と X I p (配列番号 1 )の相互作用を阻害する化合物として、具体的には例えば、両蛋白質が相互作用する部位のアミノ酸配列からなるぺプチドを例示できる。特に、キャスペース一 1の基質となる X I P (配列番号 1) 由来のかかるペプチドは、両蛋白質の相互作用を競合的に阻害し、キャスペース一 1による X I P (配列番号 1) の切断を阻害できるため有用である。このようなペプチドは、キャスペース一 1または X I P (配列番号 1) のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したペプチドから、キャスペース一 1による X I P (配列番号 1) の切断を阻害するペプチドを選択することにより取得できる。選択は、後述するような、 X I P (配列番号 1) の分解を阻害する化合物の同定方法を利用して実施可能である。ここでペプチドとは、ペプチド結合または修飾されたぺプチド結合により互いに結合している 2個以上のアミノ酸を含むもの、例えば、ポリペプチドまたはオリゴペプチド等を意味する。

このようなペプチドとして、キャスペース一 1による X I P (配列番号 1) の切断認識配列からなるペプチドが好適である。具体的には、 HLED/T (配列番号 2)、 L C TD/S (配列番号 3)、 TL SDノ E (配列番号 4)、 L T S Ό/ PTD/I (配列番号 5)、 LE SD/N (配列番号 6 ) および QKHDZG (配列番号 7) 等を例示できる。

キャスペース一 1が少なくとも、 X I P (配列番号 1) の第 2 5、 70、 80 番目の各ァスパラギン酸（D) の C末端側を切断することを実験的に明らかにしたことから、 X I P (配列番号 1) のアミノ酸配列中のこれら各ァスパラギン酸を含む部分配列からなるペプチドがさらに好適である。 X I P (配列番号 1) の第 25番目のァスパラギン酸（D) を含むペプチドとして L CTD/S (配列番号 3)、第 70番目のァスパラギン酸（D)を含むぺプチドとして LESDZN (配列番号 6)、また第 80番目のァスパラギン酸（D) を含むぺプチドとして QKH D/G (配列 ΪΙ号 7) を例示できる。

さらに、配列番号 2から 7のいずれか 1つまたは 2つ以上のアミノ酸配列を含むペプチドも、同様に X I P分解阻害剤の有効成分として使用できる。 X I P分解阻害剤に使用できるこのようなペプチドの範囲に X I P (配列番号 1) 自体は含まれない。また、上記ペプチドに 1個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異が導入されたべプチドも、上記阻害剤の有効成分として使用できる。配列番号 2から 7のいずれか 1つまたは 2つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは上記のような変異が導入されたペプチドは、さらにキャスべースー 1による X I P (配列番号 1) の切断を阻害するペプチドが好ましい。変異が導入されたぺプチドは天然に存在するぺプチドであってよく、また変異を導入したペプチドであってもよい。欠失、置換、付加または揷入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばゥルマ一の技術（非特許文献 7 )を利用できる。このような変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるペプチドは、その構成アミノ基または力ルポキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。

上記ぺプチドは、ぺプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。例えば、成書（非特許文献 8および 9 ) に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用可能である。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えば F m o c法等を挙げることができる。または市販のアミノ酸合成装置を用いて製造可能である。あるいは遺伝子工学的手法により取得することもできる。例えば目的とするぺプチドをコ一ドする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換え D N A (発現ベクター）を作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフエクシヨンして形質転換体を得る。該形質転換体を培養し、得られる培養物から目的とするペプチドを回収することにより、ぺプチドの製造が可能である。

X I P (配列番号 1 ) の分解を阻害する化合物として、その他に、キャスぺースー 1または X I P (配列番号 1 ) を認識する抗体であって、キャスペース一 1 による X I P (配列番号 1 ) の切断を阻害する抗体を例示できる。このような抗体は、キャスペース一 1または X I P (配列番号 1 ) 自体、またはこれらの断片ぺプチド、好ましくはこれらが相互作用する部位のアミノ酸配列からなるぺプチドを抗原として、自体公知の抗体作製法により取得できる。

X I P (配列番号 1 ) の分解を阻害する化合物として、さらに、後述する同定方法により得られた化合物、好ましくは低分子量化合物を挙げることができる。本発明の一態様は、 _{X I P} (配列番号 1) の分解を阻害する化合物の同定方法に関する。 X I P (配列番号 1) の分解を阻害する化合物の同定方法は、キャスペース一 1または X I P (配列番号 1)、これらをコードする各遺伝子、該遺伝子を組込んだベクター、該ベクターを導入されてなる形質転換体、あるいは該遺伝子を発現している細胞等を単独でまたは組み合わせて用い、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。

化合物の同定方法に使用するキャスペース一 1および X I P (配列番号 1)は、一般的に知られている化学合成法や遺伝子工学的手法により取得できる。すなわち、これらは、化学合成産物、無細胞系合成産物、またはこれらを発現している若しくは発現させた細胞自体、あるいは該細胞や生体試料から調製した産物のいずれでもよく、これら産物からさらに精製された産物であってもよい。また、キヤスペース一 1と X I P (配列番号 1)の相互作用、およびこれら蛋白質の機能、例えばキャスペース一 1の蛋白質分解酵素活性や X I P (配列番号 1) の酵素基質としての性質に影響がなければ、 N末端側や C末端側に標識物質が付加されていてもよい。標識物質としては、別の蛋白質やポリペプチド、例えば GST、 β 一ガラクトシダーゼ、 I g G等の免疫グロプリン F c断片、 H i s _ t a g、 Μ y c— t a g、 HA— t a g、 F LAG— t a g、または Xp r e s s— t a g 等のタグペプチド類、ビォチン、放射性同位体等が例示できる。これら標識物質は、直接的に、またはリンカ一ペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加できる。これら標識物質自体またはその機能の測定により、キヤスペース一 1または X I P (配列番号 1)の精製または検出を容易に実施できる。また、これら標識物質は、例えば、キャスペース一 1または X I P (配列番号 1) との相互作用の検出に利用可能である。

上記同定方法は、キャスペース— 1による X I P (配列番号 1) の切断を可能にする条件を選択し、当該条件下でキャスペース一 1および/または X I P (配列番号 1) を調べようとする化合物（被検化合物）と接触させ、ついで X I P (配列番号 l ) の分解を検出できるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在および/または変化を検出することにより実施できる。キャスペース一 1による X I p (配列番号 1 ) の切断を可能にする条件は、インビトロ（ i n v i t r o ) およびインビポ（ i n v i v o ) のいずれの条件であってもよい。例えば、キャスぺースー 1および X I P (配列番号 1 )を共発現させた細胞を用いることもできる。キャスペース一 1およぴノまたは X I p (配列番号 1 ) と被検化合物の接触は、キャスペース一 1と X I p (配列番号 1 ) の反応前に行ってもよいし、当該反応に共存させることにより行ってもよい。ここでシグナルとは、それ自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得る物質を指し、マーカーとはその物質の物理的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得る物質を指す。シグナルとしてはルシフェラーゼ、グリーン蛍光蛋白質、および放射性同位体等、マーカーとしては、レポーター遺伝子、例えばクロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子等、または検出用のェピトープタグ、例えば 6 X H i s 一 t a g等、公知のシグナルが利用できる。これらシグナルまたはマーカーの検出方法は当業者には周知である。簡便には、 X I P (配列番号 1 ) の分解は、 X I P量または X I P分解物量の存在若しくは不存在および/または変化の検出により測定できる。 X I P量または X I P分解物量の定量は、自体公知の蛋白質またはべプチドの検出方法、例えばウェスタンプロッティング法等を用いて実施でさる。

被検化合物としては、例えば化学ライプラリーや天然物由来の化合物、またはキャスペース一 1や X I p (配列番号 1 ) の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等が挙げられる。あるいは、 X I P (配列番号 1 ) のキャスペース一 1による切断認識部位のぺプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物として好適である。

上記べプチドおよび上記同定方法で得られた化合物も、本発明の範囲に含まれる。上記ペプチドおよぴノまたは上記化合物を、単独でまたは 2つ以上を組み合わせて、本発明に係る X I P分解阻害剤を製造できる。例えば 2つ以上のぺプチドを組み合わせて製造した X I P分解阻害剤は、 X I P (配列番号 1 ) におけるキャスペース一 1による数箇所の切断を阻害できるため、 X I P (配列番号 1 ) の分解阻害において高い効果が得られる場合がある。これらべプチドおよび化合物は、その他、試薬として利用できる。例えば X I P (配列番号 1 ) や H B x等の、 B型肝炎の発症、進行、およぴ肝癌への進展のメカニズムへの関与を分子レベルで研究するために有用である。

上記ペプチドおよび/または上記化合物を含む X I P分解阻害剤は、生物学的有用性と毒性のパランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製可能である。かかる医薬組成物も本発明の範囲に包含される。

本発明の一態様は、キャスペース一 1による X I P (配列番号 1 ) の切断を阻害することを特徴とする、 X I P (配列番号 1 ) の分解に基づく疾患の予防剤および Zまたは治療剤に関する。キャスペース一 1による X I P (配列番号 1 ) の切断の阻害は、例えば、キャスペース一 1の作用を阻害すること、あるいは、キヤスペース一 1と X I P (配列番号 1 ) の相互作用を阻害することにより達成できる。キャスペース一 1の作用の阻害は、例えば、キャスペース一 1の酵素活性を阻害することにより実施できる。キャスペース一 1の酵素活性を阻害することは、該活性を阻害し得る化合物を本発明に係る同定方法を利用して取得し、該化合物を利用して行うことができる。また、公知のキャスペース一 1の酵素活性阻害剤を使用して実施することもできる。キャスペース一 1と X I P (配列番号 1 ) の相互作用の阻害は、例えば、本発明に係るペプチドおよび Zまたは上記同定方法により得られた化合物を用いて実施可能である。すなわち、上記予防剤および

Zまたは治療剤として、上記化合物および上記べプチドのうち少なくとも 1つを含んでなる予防剤および Zまたは治療剤を例示できる。

X I P (配列番号 1 ) 力 S、 H B Xによる H B Vの複製および転写の抑制に関与していることから、 X I P (配列番号 1 ) の分解に基づく疾患としては、 B型肝炎が挙げられる。キャスペース一 1による X I P (配列番号 1 ) の切断を阻害することにより、 H B xによる H B Vの複製および転写を抑制することが可能になり、さらに B型肝炎の予防および Zまたは治療が可能になる。また、 B型肝炎から進展する肝癌の予防および Zまたは治療も、キャスペース一 1による X I P (配列番号 1 ) の切断を阻害することにより可能である。これらから、キャスペース一 1による X I P (配列番号 1 ) の切断を阻害することを特徴とする、 H B Vの複製およびノまたは転写の阻害剤、並びに抗 B型肝炎ウィルス剤も本発明の範囲に包含される。また、キャスペース一 1による X I P (配列番号 1 ) の切断を阻害することを特徴とする、 B型肝炎の予防剤および Zまたは治療剤、並びに肝癌の予防剤おょぴ Zまたは治療剤も、同様に本発明に包含される。具体的には、上記化合物おょぴ上記べプチドのうち少なくとも 1つを含んでなる阻害剤並びに予防剤および/または治療剤を例示できる。

さらに、 X I P (配列番号 1 ) の分解に基づく疾患の予防剤および/または治療剤の有効成分として、本発明に係る X I P分解阻害剤を利用できる。上記 X I P分解阻害剤はまた、 H B Vの複製および Zまたは転写の阻害剤、並びに抗 B型肝炎ウィルス剤の有効成分として使用できる。また、上記 X I P分解阻害剤は、 B型肝炎の発症および進行、並びに肝癌に対する予防剤およぴ Zまたは治療剤の有効成分として好適である。

本発明に係る X I P分解阻害剤、 H B Vの複製おょぴ Zまたは転写の阻害剤、抗 B型肝炎ウィルス剤、並びに X I P (配列番号 1 ) の分解に基づく疾患、例えば B型肝炎や肝癌の予防剤および Zまたは治療剤は、好ましくは、適当な医薬上許容される担体（医薬用担体）を含む。医薬用担体は、製剤の剤形に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等を例示できる。例えば、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビュルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコーノレ、ポリエチレングリコーノレ、ヮセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラタトース等が挙げられるが、これらに限らない。これらは、剤形に応じて適宜 1種類または 2種類以上を組み合わせて使用できる。さらに、所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、 p H調整剤等を適宜含むこともできる。

本発明に係る X I P分解阻害剤、 H B Vの複製および Zまたは転写の阻害剤、抗 B型肝炎ウィルス剤、並びに X I P (配列番号 1 ) の分解に基づく疾患、例えば B型肝炎や肝癌の予防剤および Zまたは治療剤に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、約 0 . 0 0 0 0 1〜 7 0重量％、好ましくは 0 . 0 0 0 1〜 5重量％程度の範囲とするのが適当である。

用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、おょぴ担当医師の判断等に応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重 1 k gあたり約 0 . 0 1 /i g乃至 1 0 0 m g程度、好ましくは約 0 . 1 g〜l m g程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験によりこれら用量を変更できる。上記投与量は 1日 1〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に 1回の割合で間欠的に投与してもよい。また、治療に必要な他の化合物または医薬を一緒に処方してもよい。

投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口による投与も可能である。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することが好ましレ、。

剤形としては、各種の投与形態が治療目的に応じて選択できる。その代表例には、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リボソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、ェリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤'、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。

散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラタトース、グルコース、シユークロースおよびマンニトール等の賦形剤、澱粉およびアルギン酸ソーダ等の崩壌剤、マグネシウムステアレートおよびタルク等の滑沢剤、ポリビュルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースおよぴゼラチン等の結合剤、脂肪酸ェステル等の界面活性剤、およびグリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。

懸濁剤は、水、シユークロース、ソルビトールおょぴフラタトース等の糖類、ポリエチレングリコール等のダリコール類、および油類を使用して製造できる。注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。

リボソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロ口ホルム等）に溶解した溶液に、上記有効成分を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。

脂肪乳剤化は、例えば上記有効成分、油成分（大豆油、ゴマ油おょぴォリーブ油等の植物油、 M C T等）、および乳化剤（リン脂質等）等を混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型等）を用いて、乳化 ·均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばダリセリンゃ糖類（例えばプドウ糖、ソルビト一ルおよび果糖等）が例示される。

シクロデキストリン包接化は、例えば上記有効成分を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水に加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。この際、使用されるシクロデキストリンは、上記有効成分の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン (_α、 β γ型）を適宜選択すればよい。

本発明の一態様はまた、 X I Ρ (配列番号 1) の分解阻害方法に関する。本発明に係る X I Ρ (配列番号 1) の分解阻害方法は、例えば、キャスペース— 1の作用を阻害することにより実施できる。あるいは、 X I Ρ (配列番号 1) の分解阻害方法は、キャスペース一 1と X I Ρ (配列番号 1) の相互作用を阻害することにより達成できる。キャスペース一 1の作用の阻害、およびキャスペース一 1 と Χ Ι Ρ (配列番号 1) の相互作用の阻害は、上記したように実施可能である。本発明に係る X I Ρ (配列番号 1) の分解阻害方法を用いることにより、 X I Ρ (配列番号 1) の分解に基づく疾患の予防方法および Ζまたは治療方法を実施できる。 X I Ρ (配列番号 1) が ΗΒ Xによる ΗΒ Vの複製および転写を抑制することから、上記 X I Ρ (配列番号 1) の分解阻害方法を用いて、 HBVの複製および/または転写の阻害方法を達成できる。さらに、上記 X I Ρ (配列番号 1) の分解阻害方法を用いることにより、 Β型肝炎および Β型肝炎に起因する肝癌の予防方法および/または治療方法を実施できる。

このような阻害方法並びに予防方法および/または治療方法はまた、上記 X I ρ分解阻害剤を用いて実施可能である。例えば、上記予防方法および Ζまたは治療方法は、 X I Ρ (配列番号 1) の分解に基づく疾患の罹患患者に上記 X I Ρ分解阻害剤を投与することにより達成できる。

上記阻害方法並びに疾患の予防方法および Ζまたは治療方法も、本発明の範囲に包含される。

本発明の一態様は、さらに試薬キットに関する。本発明の試薬キットは、キヤスペース一 1、キャスペース一 1をコードするポリヌクレオチドおよびキャスぺースー 1をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1つと、 X I P (配列番号 1 )、 X I P (配列番号 1 ) をコードするポリヌクレオチドおよび X I P (配列番号 1 ) をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1つを含んでなる。上記キットは、例えば本発明に係る同定方法に使用できる。

キャスペース一 1および X I p (配列番号 1 ) は、上記のように、一般的に知られている化学合成法や遺伝子工学的手法により取得できる。

キャスペース一 1または X I p (配列番号 1 ) をコードするポリヌクレオチドは、ヒト c D N Aライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製できる。キャスペース一 1または X I P (配列番号 1 ) をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、上記ポリヌクレオチドを適当な発現 D N Aベクター、例えば細菌プラスミド由来のベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより得られる。

上記キットは、 X I P (配列番号 1 ) の分解を検出するためのシグナルおよび /またはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および Zまたは防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。実施例

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。

実施例 1

(キャスペース一 1と X I P (配列番号 1 ) の相互作用のインシリコでの探索）キャスペース一 1と相互作用する蛋白質を、国際公開第 0 1ノ 6 7 2 9 9号公報に記載の予測方法に従ってインシリコで予測した。まず、キャスペース一 1のアミノ酸配列をある長さのぺプチドに分解し、各ぺプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索した。ついで、得られた蛋白質とキャスペース一 1との間でローカルァラィメントを行い、ローカルァラィメントのスコアが高い蛋白質をキャスペース一 1 と相互作用すると予測した。

解析の結果、キャスペース一 1の部分配列である 5ァミノ酸残基からなるぺプチド T S D S Tおよび D S QGVとそれぞれ相同性のあるべプチド T S D P Tおょぴ DSQGLが、 X I P (配列番号 1) のアミノ酸配列中に存在することが分かった（図 2)。ここにおいて、アミノ酸配列は 1文字表記する。さらに、キャスペース一 1と X I P (配列番号 1) との間でローカルァライメントを行なった結果、スコアが 20以上に達した領域が 4箇所見出された（図 2)。この結果から、 X I P (配列番号 1) はキャスペース一 1と相互作用する蛋白質であると予測した。実施例 2

(キャスペース一 1による X I P切断の解析）

<材料〉

ヒト X I P (配列番号 1) の c DNAは、ヒト脳 c DNAライブラリーから、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT— PCR) により獲得した。ヒト X I P (配列番号 1) の c DNAを、大腸菌用発現ベクター p GEX— 4T (アマシャム社）へ組込み、 X I P (配列番号 1) の発現プラスミド、 p GEX—4T— X I Pを構築した。この発現プラスミドを用いて、 X I P (配列番号 1) の N末端に GS T- t a gが付加された融合蛋白質（以下、 GST— X I Pと呼称する）を得た。クローニングした X I P c DNAのアミノ酸翻訳配列は、 NCB I蛋白質データベースのァクセッション番号 NP— 0063 9 3の配列と同一であった。

ぐ方法 >

G S T— X I Pの作製と精製を次のように行った。まず、 p GEX_4T— X I Pを保持している大腸菌を対数増殖期（OD₆₀。= 0. 6— 0. 8) になるまで 25°Cで培養した。その後、イソプロピル一 1一チォー — D—ガラクトピラノシド（ I P TG) を終濃度 0. 1 mMとなるように添加し、さらに 2 5 °Cで 4 時間インキュベーションして発現誘導を行った。集菌後、リン酸緩衝生理食塩水 (P B S) で洗浄し、溶解用緩衝液（ l y s i s b u f f e r ) ( 5 0 mM T r i s — HC 1， p H 7. 5/ 1 mM ジチォスレイトール（DTT) / 1 mM エチレンジァミン四酢酸/ 1 niM フエ二ルメチルスルホニルフルオリド）に懸濁後、リゾチームを終濃度 0. 5 m g/m 1 となるように加え、氷中に 3 0分間静置した。ノニデット P— 4 0 (N o n i d e t P - 4 0 ) を終濃度 1 %となるように添加して超音波処理を行った後、遠心分離処理により上清を回収した。この上清から、ダルタチオン一セファロース 4 Bを用いて G S T-X I Pを精製した。精製した G S T— X I Pは、透析用溶液（5 O mM HE P E S , p H 7. 5/0. 1 % CHAP S/ l O mM D T T) で透析後、使用時まで一 8 0 °C で保存した。

キャスペース一 1 プロテアーゼアツセィは次のように行った。 5 O mM H E P E S , p H 7. 5、 0. 1 % CHAP Sおよび 1 O mM D T Tを含む反応液中に、キャスペース一 1 (C a 1 b i o c h e m社）の存在下または非存在下で G S T— X I Pを添加し（反応液全量 1 0 μ 1 )、 3 7 °Cで 2時間反応させた。陰性対照として、 G S T— X I Pの代わりに G S Tを用いて同様の反応を行った。反応後、 2 Xドデシル硫酸ナトリウム（S D S) サンプルバッファーを 1 0 μ 1 加え、 1 0 0°Cで 2分間熱処理を行い、氷上で 2分間放置した。このうち、 1 0 1を S D S— PAGE (ゲル濃度 1 0 %) で展開し、抗 G S T抗体（アマシャム社）を用いたウェスタンブロット法にて G S Tおよび G S T— X I Pを検出した。

<結果 >

キャスペース一 1と G S T— X I Pを反応させた結果、 G S T— X I Pのバンドの減少とそれに伴う断片の増加が認められた（図 3)。一方、 G S Tは、キャスペース一 1により切断されなかった。このことから、キャスペースー 1が X I P (配列番号 1 ) を切断し分解することが判明した。実施例 3

X I P (配列番号 1) について、キャスペース一 1により認識されて切断される部位のアミノ酸配列（切断認識配列）を検討した。キャスペース一 1の既知基質における切断認識配列として、下記の配列が知られている：プロインターロイキン一 1 J3の YVHDZA (配列番号 8)；プロインターロイキン一 18の LE S D/N (配列番号 9)；カルパスタチンの ALDDZL (配列番号 10)、 L S S D/F (配列番号 1 1) および AL AD/S (配列番号 12)； P I TS LREキナーゼの YVPDZS (配列番号 13)；キャスペース一 3の I ETDZS (配列番号 14)；並びにァクチンの L VCDZN (配列番号 1 5) および ELPDZG (配列番号 1 6)。ここで、「/」は切断部位を表わす。これら配列との類似性から、キャスペース一 1による X I P (配列番号 1) の切断認識配列は、 HLED /T (配列番号 2)、 LCTD/S (配列番号 3)、 TL SD/E (配列番号 4)、 LTSD/PTD/I (配列番号 5)、 L E S D/N (配列番号 6 ) および QKH D/G (配列番号 7) であると推定できた（図 1)。この結果は、 X I P (配列番号 1) がキャスペース一 1により分解されることを支持する。実施例 4

(キャスペース— 1による X I Pの切断位置の同定）

<材料 >

X I Pのアミノ酸配列（配列番号 1) 中の 1箇所あるいは数箇所のァスパラギン酸（D) がァラニン（A) に変換された X I P変異体の N末端に G S T— t a gが付加された GST _X I P変異体を発現させる各種 GST— X I P変異体発現プラスミドを作製した。これら変異体発現プラスミドの作製は、実施例 2で作成した X I P発現プラスミド、 p GEX—4 T— X I Pを铸型として、 Qu i k Ch a n g e S i t e—D i r e c t e d Mu t a g e n e s i s K i t (S TRATAGENE社）を用いて行った。上記 G S T— X I P変異体発現プラスミドを用いて、下記の G S T— X I P変異体を作製した： X I Pのアミノ酸配列（配列番号 1) 中の最初のメチォニンから第 2 5、 3 9、 58または 70番目のァスパラギン酸（D) がァラニン（A) に変換された GST— X I P変異体；第 25および 70番目の 2箇所のァスパラギン酸（D) がァラニン（A) に変換された GST— X I P変異体；並びに、第 25、 70および 80番目の 3箇所のァスパラギン酸（D) がァラニン（A) に変換された G S T— X I P変異体。

<方法〉

各 GST— X I P変異体の作製と精製は、上記各 GST— X I P変異体発現プラスミドを用いて、実施例 2に記載の方法と同じ方法で行った。以下、 X I Pの第 25、 3 9、 58または 70番目のァスパラギン酸（D) をァラニン（A) に変換した各 G S T-X I P変異体を、それぞれ G S T-X I P (D 25 A)、 G S T一 X I P (D 3 9A)、 GST— X I P (D 58 A) または GST— X I P (D 7 OA) と呼称する。第 25および 70番目の 2箇所のァスパラギン酸（D) がァラニン（A)に変換された G S T— X I P変異体を G S T— X I P (D 25 A, D 70 A) と呼称する。また、第 25、 70および 80番目の 3箇所のァスパラギン酸（D) がァラニン（A) に変換された G S T— X I P変異体を G S T— X I P (D 25 A, D 70 A, D 80 A) と呼称する。

キャスペース一 1 プロテアーゼアツセィは、 G S T_X I Pおよび上記各 G S T_X I P変異体を用いて、実施例 2に記載の方法と同じ方法で行った。 <結果〉

結果を第 4図に示す。キャスペース一 1 プロテアーゼアツセィの結果、野生型 X I Pである G S T— X I Pでは、断片が生じたことを示すバンドが 2本認められた。この 2本のバンドが示す断片のうち高分子量側に位置する断片は、 GS T-X I P (D 25A)、 GST— X I P (D 3 9A)ヽ GST— X I P (D 5 8 A) で検出されたが、 GST— X I P (D 70 A) では検出されなかった。一方、低分子量側に位置する断片は、 GST— X I P (D 3 9.A) GST— X I P (D W 200

24

5 8 A)、 GST— X I P (D 70 A) で検出されたが、 GST— X I P (D 2 5 A) では検出されなかった。

GST— X I P (D 2 5 A, D 70 A) を基質としたときには、上記断片以外に新たな別の断片が検出された。この断片は、 GST— X I P (D 25 A, D 7 OA, D 80 A) を基質としたときには検出されなかった。

以上の結果から、キャスペース一 1は少なくとも、 X I P (配列番号 1) の第 2 5、 70、 80番目の各ァスパラギン酸（D) の C末端側を切断すると判定できた。産業上の利用可能性

本発明ではキャスペース一 1と相互作用する蛋白質 X I P (配列番号 1) を見出した。そして、その相互作用においてキャスペース一 1が X I P (配列番号 1) を切断し分解することを初めて明らかにし、その切断認識部位を見出した。 X I P (配列番号 1) は、 HB V遺伝子由来の蛋白質 HB Xの作用を阻害する。 HB Xは、 HBVの複製促進作用および転写活性化作用を有し、 B型肝炎の発症、進行おょぴ肝癌への進展に関与すると考えられる。これらから、本発明において提供する X I P分解阻害剤おょぴノまたは X I P分解阻害方法は、 HBVの複製おょぴ Zまたは転写の阻害、 B型肝炎の予防および Zまたは治療、並びに HBVによる肝癌の予防おょぴ Zまたは治療のために非常に有用である。配列表フリーテキスト

配列番号 2 ：キャスペース一 1により認識される、 B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（配列番号 1) の部分配列。

配列番号 3 ：キャスペース— 1により認識される、 B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（配列番号 1) の部分配列。

配列番号 4 ：キャスペース一 1により認識される、 B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（配列番号 1) の部分配列。配列番号 5 ：キャスペース一 1により認識される、 B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（配列番号 1 ) の部分配列。

配列番号 6 ：キャスペース一 1により認識される、 B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（配列番号 1 ) の部分配列。

配列番号 7 ：キャスペース一 1により認識される、 B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（配列番号 1 ) の部分配列。

配列番号 8 ：キャスペース一 1により認識される、プロインターロイキン一 1 の部分配列。

配列番号 9 ：キャスペース一 1により認識される、プロインターロイキン一 1 8 の部分配列。

配列番号 1 0 キャスペース一 1により認識される. 部分配列 ^ 配列番号 1 1 キャスペース一 1により認識される. 部分配列 c 配列番号 1 2 キャスペース一 1により認識される. 部分配列：配列番号 1 3 キャスペース一 1により認識される、 P I T S L R Eキナーゼの部分配列。

配列番号 1 4 キャスペース一 1により認識される、キャスペース一 ₃の部分配列。

配列番号 1 5 キャスペース一 1により認識される、ァクチンの部分配列。配列番号 1 6 キャスペース一 1により認識される、ァクチンの部分配列。配列番号 1 7 キャスペース一 1と B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示す、キャスペース一 1の部分配列。配列番号 1 8 ：キャスペース一 1と B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示す、 B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質の部分配列。

配列番号 1 9 ：キャスペース一 1と B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質の配列において同一の部分配列。

配列番号 2 0 ：キャスペース一 1と B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示す、キャスペース一 1の部分配列。配列番号 2 1 ：キャスペース一 1と B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示す、 B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質の部分配列。

配列番号 2 2 ：キャスペース一 1と B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示す、キャスペース一 1の部分配列。配列番号 2 3 ：キャスペース一 1と B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質とのローカルァラィメントにおいて高いスコアを示す、 B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質の部分配列。

配列番号 2 4 ：キャスペース一 1と B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示す、キャスペース一 1の部分配列。配列番号 2 5 ：キャスペース一 1と B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質とのローカルァライメントにおいて高いスコアを示す、 B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質の部分配列。

Claims

請求の範囲

1. キャスペース一 1 (C a s p a s e— 1) による B型肝炎ウィルス x相互作用蛋白質（X I P) の切断を阻害することを特徴とする、 B型肝炎ウィルス X 相互作用蛋白質（X I P) の分解に基づく疾患の予防剤および Zまたは治療剤。

2. キャスペース一 1 (C a s p a s e — 1) による B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（X I P) の切断を阻害することを特徵とする、 B型肝炎ウィルス（H B V) の複製および/または転写の阻害剤。

3. キャスペース一 1 (C a s p a s e— 1 ) による B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（X I P) の切断を阻害することを特徴とする、抗 B型肝炎ウィルス

(HB V) 剤。

4. キャスペース一 1 (C a s p a s e— 1 ) による B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（X I P) の切断を阻害することを特徴とする、 B型肝炎の予防剤および Zまたは治療剤。

5. キャスペース一 1 (C a s p a s e— 1 ) による B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（X I P) の切断を阻害することを特徴とする、肝癌の予防剤および

/または治療剤。

6. 配列表の配列番号 2、配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6 または配列番号 7に記載のアミノ酸配列からなるぺプチド。

7. 配列表の配列番号 2、配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6 または配列番号 7に記載のアミノ酸配列を含有するぺプチド。

8. 請求の範囲第 6項または第 7項に記載のぺプチドを含んでなる B型肝炎ゥィルス X相互作用蛋白質（X I P) 分解阻害剤。

9. 請求の範囲第 6項または第 7項に記載のペプチドを含んでなり、キャスぺースー 1 (C a s p a s e— 1) による B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（X

I P) の切断を阻害することを特徴とする X I P分解阻害剤。

1 0. 請求の範囲第 8項または第 9項に記載の阻害剤を含んでなる医薬組成物。

1 1. 請求の範囲第 8項または第 9項に記載の阻害剤を含んでなる B型肝炎ゥィルス X相互作用蛋白質（X I P) の分解に基づく疾患の予防剤および/または治療剤。

1 2. 請求の範囲第 8項または第 9項に記載の阻害剤を含んでなる B型肝炎ゥィルス（HBV) の複製および Zまたは転写の阻害剤。

1 3. 請求の範囲第 8項または第 9項に記載の阻害剤を含んでなる抗 B型肝炎ウィルス（HBV) 剤。

14. 請求の範囲第 8項または第 9項に記載の阻害剤を含んでなる B型肝炎の予防剤および Zまたは治療剤。

1 5. 請求の範囲第 8項または第 9項に記載の阻害剤を含んでなる肝癌の予防剤およびノまたは治療剤。

16. キャスペース一 1 (C a s p a s e— 1 ) を阻害する工程を含む B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（X I P) の分解阻害方法。

1 7. キャスペース一 1 (C a s p a s e— 1) による B型肝炎ウィルス x相互作用蛋白質（X I P) の切断を阻害する工程を含む X I Pの分解阻害方法。

1 8. 請求の範囲第 1 6項または第 1 7項に記載の阻害方法を用いることを特徴とする B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（X I P) の分解に基づく疾患の予防方法および Zまたは治療方法。

19. 請求の範囲第 16項または第 1 7項に記載の阻害方法を用いることを特徴とする B型肝炎ウィルス（HBV) の複製およびまたは転写の阻害方法。

20. 請求の範囲第 1 6項または第 1 7項に記載の阻害方法を用いることを特徴とする B型肝炎の予防方法および Zまたは治療方法。

21. 請求の範囲第 16項または第 1 7項に記載の阻害方法を用いることを特徴とする肝癌の予防方法およぴ zまたは治療方法。

22. 請求の範囲第 8項または第 9項に記載の阻害剤を用いることを特徴とする B型肝炎ウィルス _X相互作用蛋白質（X I P) の分解に基づく疾患の予防方法および Zまたは治療方法。

23. 請求の範囲第 8項または第 9項に記載の阻害剤を用いることを特徴とする B型肝炎ウィルス（HBV) の複製および/または転写の阻害方法。

24. 請求の範囲第 8項または第 9項に記載の阻害剤を用いることを特徴とする B型肝炎の予防方法および/または治療方法。

25. 請求の範囲第 8項または第 9項に記載の阻害剤を用いることを特徴とする肝癌の予防方法および/または治療方法。

26. B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（X I P) の分解阻害剤の同定方法であって、キャスペース一 1 (C a s p a s e— 1) による X I Pの切断を可能にする条件下、 C a s p a s e— 1および Zまたは X I Pを化合物と接触させ、ついで X I pの分解を検出することができるシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在および Zまたは変化を検出することにより、該化合物が X I pの分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。

27. B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（X I P) の分解阻害剤の同定方法であって、キャスペース一 1 (C a s p a s e— 1) による X I Pの切断を可能にする条件下、 C a s p a s e— 1および/ または X I Pを化合物と接触させ、ついで X I P量または X I P分解物量の存在若しくは不存在おょぴ Zまたは変化を検出することにより、該化合物が X I Pの分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。

28. 請求の範囲第 26項または第 27項に記載の同定方法により同定された化合物。

2 9. キャスぺース一 1 (C a s a s e— 1)、 C a s p a s e— 1をコードするポリヌクレオチドおよび C a s p a s e - 1をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1つと、 B型肝炎ウィルス X相互作用蛋白質（X I P)、 X I Pをコードするポリヌクレオチドおよび X I Pをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1つを含んでなるキット。