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WO2004067742A1 - 切断可能な対応付け分子およびそれを用いるスクリーニング方法 - Google Patents

切断可能な対応付け分子およびそれを用いるスクリーニング方法 Download PDF

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WO2004067742A1
WO2004067742A1 PCT/JP2004/001004 JP2004001004W WO2004067742A1 WO 2004067742 A1 WO2004067742 A1 WO 2004067742A1 JP 2004001004 W JP2004001004 W JP 2004001004W WO 2004067742 A1 WO2004067742 A1 WO 2004067742A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
protein
molecule
assigning
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2004/001004
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Yanagawa
Nobuhide Doi
Tetsuya Nagano
Hideaki Takashima
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Keio University
Original Assignee
Keio University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Keio University filed Critical Keio University
Priority to JP2005504788A priority Critical patent/JP4761202B2/ja
Priority to US10/543,682 priority patent/US20060210982A1/en
Publication of WO2004067742A1 publication Critical patent/WO2004067742A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to an assigning molecule and a screening method using the same.
  • nucleic acids encoding proteins, nucleic acids, and other unknown proteins interacting with biological molecules were synthesized from nucleic acids from various organisms and tissues, and artificially synthesized.
  • in vitro application of protein in vitro (in vitro) is expected.
  • This molecule is called an associating molecule because the phenotype and the genotype are associated by linking the protein to the nucleic acid that encodes it.
  • assigning molecules those based on the STABLE method (Patent Document 1, Non-Patent Document 1) and those based on the in vitro virus method (Patent Document 2, Non-Patent Document 2, Patent Document 3) are known.
  • Selection of a protein that interacts with a target substance such as a biomolecule in a test tube is performed by binding the protein to a target substance immobilized on a solid phase and recovering the bound protein.
  • a method for reducing contaminating molecules due to non-specific binding has been proposed.
  • the target substance is a protein
  • a calmodulin-binding protein, a sequence-specific protease cleavage site, and the IgG binding domain (ZZ domain) of protein A are fused to the C-terminal side of the target protein.
  • the ZZ domain of the fusion protein is immobilized by adsorption to IgG-bound beads, and then bound to the target protein by cleavage of sequence-specific protease.
  • the complex containing the protein is eluted, and in the second screening, calmodulin-binding protein of the fusion protein is immobilized on calmodulin.
  • a target protein and a protein-binding complex are eluted with a calcium chelating agent such as EDTA by immobilizing the solid phase by binding to immobilized beads.
  • the substance to be screened is an assigning molecule
  • the nucleic acid is bound to the protein, in addition to the interaction between the protein and the target substance, the non-specificity between the nucleic acid and the solid phase or the target substance Assignment molecules that do not specifically bind to the target substance may be screened due to specific binding. Therefore, when using the assigning molecule, it is desired to provide a method for reducing non-specific contaminant molecules based on a principle different from the conventional method.
  • an object of the present invention is to reduce the contamination of a mapping molecule non-specifically bound to a solid phase or a target substance, and to screen a mapping molecule specifically bound to a target substance with high efficiency. To provide a screening method for the assigning molecule.
  • the present inventors focused on the fact that when an assigning molecule is screened in evolutionary molecular engineering or genomic function analysis, the part of the nucleic acid is used for the next step, As a result, by linking a protein and a nucleic acid that encodes the protein via a specific linker and releasing only the nucleic acid by cleaving the linker, the above-mentioned problems associated with the screening of the assigning molecule can be solved. And completed the present invention.
  • the present invention provides the following.
  • nucleic acid constructed such that the translated protein is linked to the nucleic acid when the nucleic acid encoding the protein is transcribed and / or translated and using the prepared nucleic acid in a cell-free protein synthesis system.
  • a method for producing an assigning molecule that links the protein and the nucleic acid by transcription and / or translation using a living cell in a method for producing an assigning molecule that links the protein and the nucleic acid by transcription and / or translation using a living cell,
  • the nucleic acid When the nucleic acid is transcribed and / or translated, the nucleic acid is constructed such that the protein and the nucleic acid are linked via a cleavable linker under conditions that do not change the base sequence of the nucleic acid.
  • a method for producing a library of mapping molecules comprising producing a mapping molecule from each nucleic acid constituting the nucleic acid library by the method of (4).
  • Step of recovering released nucleic acid The method comprising: BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is an explanatory diagram of a screening method using an assigning molecule including a cleavage type linker.
  • Figure 2 is an illustration of how genotype molecules are released from assigned molecules by irradiation with long-wave ultraviolet light (excitation peak: 365 nm).
  • Figure 3 is a diagram (electrophoresis photograph) showing the results of an experiment on the release of genotype molecules from assigned molecules by irradiation with long-wavelength ultraviolet light. Lanes:! To 6 show the results using fluorescein and PCB-labeled DNA. Lanes 7 to 12 show the results using fluorescein and biotin labeled DNA.
  • Figure 4 is a diagram (electrophoresis photograph) showing the results of confirming the formation of the PCB-labeled MA-associated molecule in the cell-free transcription / translation system by electrophoresis. Lane 1 shows the case where the assigning molecule was formed. Lane 2 shows the case where protein synthesis was inhibited and no corresponding molecule was formed.
  • Fig. 5 shows the results of an experiment in which hATlR / CHO-K1 cells were bound to STA-ATII assigning molecules and sta-ati DNA, a genotype molecule, was eluted by irradiation with long-wavelength ultraviolet light (electrical Electrophoresis photograph). Lanes 1 and 3 show the results using MT1R / CH0-K1 cells, and lanes 2 and 4 show the results using Mock / Cho-K1 cells. Lane 5 is sample A before the combining operation. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the assigning molecule of the present invention is a linker (also referred to as a “cleavable linker” in the present specification) that allows a protein and a nucleic acid encoding the protein to cleave under conditions that do not change the base sequence of the nucleic acid. Characterized by being connected via Of the present invention
  • the configuration of the assigning molecule may be the same as that of a normal assigning molecule, except that the protein and the nucleic acid encoding the protein are linked via the cleavage type linker.
  • the nucleic acid may be either DNA or RNA depending on the mode of the assigning molecule.
  • the protein may be a fusion protein depending on the mode of the assigning molecule.
  • the expression that a protein and a nucleic acid are linked includes that the protein and the nucleic acid are linked via another molecule, and the bond between them is a covalent bond or a biomolecule. Any non-covalent bond such as a bond due to the affinity of the compound may be used. Examples of the binding based on the affinity of a biomolecule include binding between an antigen and an antibody, binding between a hormone and a receptor, binding between DNA and a DNA-binding protein, and the like.
  • assigning molecules examples include the STABLE method (Patent Document 1, Non-patent Document 1) and the in vitro (in vitro) virus method (Patent Document 2, Non-patent Document 2, 03/062417, W098 / 31700).
  • STABLE method Patent Document 1, Non-patent Document 1
  • in vitro virus method Patent Document 2, Non-patent Document 2, 03/062417, W098 / 31700.
  • the assigning molecule by the STABLE method is composed of a fusion protein of a protein (target protein) to be subjected to functional analysis or modification and an adapter protein, and a DNA encoding the fusion protein and binding with a ligand.
  • the adapter is configured to be linked via a bond between the protein and the ligand.
  • the target protein may be a natural protein or a variant thereof, and an artificial protein or a variant thereof.
  • Natural proteins include those having a diverse library of proteins that are transcribed and translated from cDNA libraries derived from organs, tissues or cells of various organisms.
  • the artificial protein is a sequence obtained by combining all or partial sequences of natural proteins, or a sequence containing a random amino acid sequence.
  • the adapter-protein refers to a protein capable of specifically binding to a certain molecule (ligand), and includes a binding protein, a receptor protein constituting a receptor, an antibody, and the like.
  • a ligand refers to a molecule that specifically binds to an adapter protein.
  • adapter overnight ligands include, for example, avidin and streptavidin, and other biotin-binding proteins / piotins, maltose-binding proteins / maltoses, G proteins / guanine nucleotides, polyhistidine peptides / nickel or Metal ions such as cobalt, glutathione-S-transferase glutathione, DNA binding protein ZDNA, antibody / antigen molecule (epitope), calmodulin / calmodulin binding peptide, ATP binding protein / ATP, or S Various receptor proteins such as estradiol, a ligand thereof, and the like.
  • adapter proteins / ligands include biotin-binding proteins such as avidin and streptavidin / biotin, maltose-binding proteins / maltose, polyhistidine peptides / nickel or Kovart, etc.
  • biotin-binding proteins such as avidin and streptavidin / biotin
  • maltose-binding proteins / maltose polyhistidine peptides / nickel or Kovart, etc.
  • metal ions dal thione-S-transferase / dal thione
  • antibodies / antigen molecules (epitopes) antibodies / antigen molecules (epitopes)
  • streptavidin / biotin preferably streptavidin / biotin.
  • a ligand is usually bound to one end.
  • the fusion protein and the DNA are physically linked via a bond between the ligand bound to the end of the DNA and the adapter-protein portion of the fusion protein expressed by the DNA.
  • the assigning molecule of this embodiment has at least a transcription / translation initiation region, a region encoding a fusion protein of the target protein and the adapter-protein, and
  • the DNA can be produced by expressing the DNA bound to the protein in a cell-free transcription / translation system and synthesizing the protein.
  • a library of DNA that has at least a transcription translation initiation region, a region encoding a fusion protein of a target protein and an adapter protein, and has a ligand bound thereto, It is produced by expressing the protein in a cell-free transcription / translation system isolated so as to contain one kind or one molecule at a time, and synthesizing the protein.
  • the assigning molecule obtained by the in vitro virus method is obtained by binding a phenotype molecule containing a protein to be subjected to function analysis, function modification and the like, and a genotype molecule containing a nucleic acid encoding the protein.
  • a genotype molecule is formed by binding a coding molecule having a protein-coding region in such a form that the nucleotide sequence of the region can be translated, and a spacer molecule.
  • the spacer molecule in this embodiment includes a donor region capable of binding to the 3 ′ end of a nucleic acid, a PEG region containing polyethylene glycol as a main component bound to the donor region, and a peptide transfer bound to the PEG region. And a peptide acceptor region containing a group capable of binding to the peptide by the reaction.
  • the PEG area may not be present.
  • Donor region capable of binding to the 35 end of the nucleic acid is typically Ru 1 or more nucleotides Tona.
  • the number of nucleotides is usually 1-15, preferably 1-2.
  • the nucleotide may be a ribonucleotide or a deoxyribonucleotide.
  • the sequence at the 5 'end of the donor region affects ligation efficiency.
  • the type of base is preferably in the order of C> (U or T)> G> A.
  • the PEG region is mainly composed of polyethylene glycol.
  • the term “main component” means that the total number of nucleotides contained in the PEG region is 20 bases or less, or the average molecular weight of polyethylene glycol is 400 or more. Preferably, it means that the total number of nucleotides is 10 bases or less, or the average molecular weight of polyethylene glycol is 1000 or more.
  • the average molecular weight of polyethylene glycol in the PEG region is usually 400 to 30,000, preferably 1,000 to 10,000, more preferably 2,000 to 8,000.
  • the molecular weight of polyethylene glycol is lower than about 400, when the genotype molecule containing a part of the spacer derived from this spacer molecule is mapped and translated, post-processing of the mapped translation is performed. May be required (Liu, R "Barrick, E” Szostak, JW, Roberts, RW (2000) Methods in Enzymology, vol. 318, 268-293), but with a molecular weight of 1000 or more, more preferably 2000 or more If PEG is used, high-efficiency mapping can be performed only by mapping translation, so that post-translation processing is not required.
  • a molecular weight of polyethylene glycol increases, the stability of genotype molecules tends to increase.Particularly, a molecular weight of 1000 or more is favorable, and a molecular weight of 400 or less is not as stable as a DNA spacer and its properties are unstable. Sometimes.
  • the peptide acceptor region is not particularly limited as long as it can bind to the C-terminus of the peptide.
  • puromycin 3, -N-aminoacylpuromycin aminonucleoside (3, -N-Aminoacy
  • PANS-all amino acids corresponding to all amino acids such as PANS-Gly of glycine, PANS-Val of palin, PAS-Ala of alanine, and other amino acids can be used.
  • the 3'-N-aminoacyl adenosine aminonucleoside (3, -Aminoacyl adenosine aminonucleoside,
  • AANS-Gly of glycine, AANS-Val of valine, AANS-Ala of alanine, and other AANS-amino acids corresponding to all amino acids can be used.
  • nucleosides or those in which a nucleoside and an amino acid are ester-linked can also be used.
  • any substance can be used as long as it has a bonding form capable of chemically bonding a nucleoside or a substance having a chemical structure skeleton similar to a nucleoside and an amino acid or a substance having a chemical structure skeleton similar to an amino acid.
  • the peptide peptide region preferably comprises puromycin or a derivative thereof, or puromycin or a derivative thereof and one or two residues of deoxyribonucleotides or ribonucleotides.
  • a derivative is an inducer that can bind to the C-terminus of a peptide in a protein translation system. Means conductor.
  • the buromycin derivatives are not limited to those having a complete puromycin structure, but also include those in which a part of the puromycin structure is missing.
  • Specific examples of the puromycin derivative include PANS-amino acids, S-amino acids and the like.
  • the peptide acceptor region may be composed of pure mouth mycin alone, but preferably has a nucleotide sequence of one or more residues of DNA and / or RNA on the 5 ′ side.
  • the sequence may be dC-puromycin, rC-puromycin, etc., more preferably dCdC-puromycin, rCrC-puromycin, HC-puromycin, dCrC-puromycin, etc., and the aminoacyl-tRNA 3 terminal.
  • a CC A sequence Philipps, GR (1969) Nature 223, 374-377) that mimics is appropriate.
  • the type of base is preferably in the order of C> (U or T)> G> A.
  • the spacer molecule preferably contains at least one functional unit between the donor region and the PEG region.
  • the function-imparting unit is preferably one in which at least one residue of deoxyribonucleotide or ribonucleotide base is functionally modified.
  • a function modifying substance e.g., a fluorescent substance, piotin, or various separation groups such as His-tag.
  • the coding molecule comprises a 5 'untranslated region containing a transcriptional promoter and a translation enhancer, an 0RF region encoding a protein, bound to the 3' side of the 5 'untranslated region, and an 0RF region.
  • a nucleic acid comprising a poly A sequence and a 3 'terminal region containing a sequence recognized by a restriction enzyme Xhol on the 5' side thereof, which is linked to the 3 'side of the nucleic acid.
  • the coding molecule may be DNA or RNA, and in the case of A, the terminal may or may not have a Cap structure.
  • the coding molecule may be incorporated into any vector or plasmid.
  • the 3 'terminal region contains an Xhol sequence and a polyA sequence downstream thereof.
  • the poly A sequence in the 3 ′ terminal region is important, and the poly A sequence has at least 2 dA and / or rA is a mixed or single polycontinuous chain, preferably a polyA continuous chain of 3 or more residues, more preferably 6 or more, still more preferably 8 or more residues.
  • Factors that affect the translation efficiency of a coding molecule include transcription promoters and translation enzymes.
  • 5 'untranslated region comprising a Hanser, and, there is a combination of 35-terminal region containing the poly-A sequence. The effect of the poly A sequence in the 3 'terminal region is usually exerted with 10 residues or less.
  • T7 / T3 or SP6 can be used, and there is no particular limitation. SP6 is preferred, and SP6 is particularly preferred when an Omega sequence or a sequence containing a part of an Omega sequence is used as a translation enhancer sequence.
  • the translation enhancer is preferably a part of an omega sequence, and the omega sequence includes a part of a TMV omega sequence (029; Gallie DR, Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., Vol. 20, 4631-4638 and FIG. 3 of WO 02/48347).
  • the combination of the Xhol sequence and the polyA sequence is important. Also important is the combination of a polyA sequence with a tag having a affinity tag at the downstream portion of the 0RF region, ie, upstream of the Xhol sequence.
  • the affinity tag sequence is not limited as long as it is a sequence for using any means capable of detecting a protein such as an antigen-antibody reaction. Preferably, it is a Flag-tag sequence which is a tag for affinity separation analysis by antigen-antibody reaction.
  • the translation efficiency increases when the X o I sequence is added to the affinity tag such as Flag-tag and when the poly A sequence is further added thereto.
  • the configuration effective for the translation efficiency is also effective for the association efficiency.
  • any sequence consisting of DNA and / or MA may be used. Gene sequences, exon sequences, intron sequences, random sequences, or any natural or artificial sequences are possible, and there are no sequence restrictions.
  • the coding molecule in this embodiment comprises a transcription promoter and a translation enhancer. Including 5 'untranslated region, 5 5 3' untranslated region containing bound to side, and 0RF region encoding a protein was attached to the 3 'side of 0RF region, the 3 3-terminal region containing the poly-A sequence It is a nucleic acid.
  • the code molecule constituting the genotype molecule preferably has an Xhol sequence.
  • the genotype molecule converts the above-described coding molecule into a form in which, if necessary, the base sequence of the protein-coding region can be translated (for example, after transcription). It can be produced by combining the donor region of a single molecule with a conventional ligase reaction.
  • the reaction conditions are usually 4 to 25 hours at 4 to 25 ° C, and polyethylene glycol having the same molecular weight as the polyethylene glycol in the PEG region of one molecule of the spacer containing the PEG region is included. When adding 1 liter to the reaction system, it can be reduced to 0.5 to 4 hours at 15 ° C.
  • the combination of spacer molecules and coding molecules has a significant effect on ligation efficiency.
  • a partial sequence of an omega sequence (029) is preferable, and as the donor region of the spacer molecule, at least one residue of dC (doxycytidylic acid) is preferred.
  • dCdC (dideoxycytidylic acid) having two residues is preferable.
  • a 5 'untranslated region containing a transcription promoter and a translation enhancer, a 0RF region encoding a protein bound to the 3 side of the 5' untranslated region, and a 3 'side bound to the 0RF region , and 3 5 end of the coding molecule is a dish containing 3 'terminal region containing the poly-a sequence, and which consists of RNA a donor a region of (b) above spacer per molecule, scan Bae colonel It is preferable to bind with RNA ligase in the presence of free polyethylene glycol having the same molecular weight as the polyethylene glycol constituting the PEG region in one molecule.
  • a polyether molecule of a spacer molecule is added.
  • the ligation efficiency is improved to 80-90% or more irrespective of the molecular weight of tylene glycol, and the separation step after the reaction can be omitted.
  • the assigning molecule of this embodiment is linked to a phenotype molecule, which is a protein encoded by the 0RF region in the genotype molecule, in a transpeptidation reaction by translating the above genotype molecule in a cell-free translation system.
  • the cell-free translation system is preferably of wheat germ or egret reticulocytes.
  • the conditions for translation may be the conditions normally used. For example, a condition of 25 to 37 ° (15 to 240 minutes) may be mentioned.
  • the cleavage type linker used in the assigning molecule of the present invention is a linker that can be cleaved under the condition that the nucleotide sequence of the nucleic acid in the coding molecule does not change.
  • the nucleotide sequence of the nucleic acid is not changed, the nucleic acid is not cleaved or its base is not modified, and the nucleotide sequence of the released nucleic acid in the coding molecule is a phenotype molecule of the assigning molecule. It means to retain the nucleotide sequence encoding the protein.
  • Table 1 shows an example of such a cleavage type linker. The cutting method is shown in parentheses in the table.
  • DNA type linker deoxyribonuclease, restriction enzyme
  • Disulfide bond type linker (DTT,? -Mercaptoethanol)
  • T- (EDTA) type linker iron ion, DTT
  • Abasic nucleotide (Abasic) type linker (weak base)
  • a linker itself and its cleavage method are known to those skilled in the art, It is easy for those skilled in the art to set a cleavage condition that does not change the base sequence of the nucleic acid in the coding molecule when used for the assigning molecule, and to select a cleavage condition that can be cut under that condition.
  • nucleic acids are damaged by irradiation with short-wavelength ultraviolet rays, and those that can be cut by irradiation with long-wavelength ultraviolet rays that do not damage nucleic acids are selected.
  • the type of nuclease and reaction conditions are selected so that the nucleic acid encoding the protein is not degraded.
  • the cleavable linker is preferably a photocleavable linker.
  • the photocleavable linker may be any one that can be cut by irradiation with long-wavelength ultraviolet light.
  • long-wave ultraviolet light means ultraviolet light having a wavelength that does not change the base sequence of the nucleic acid in the code molecule when irradiated, and is usually from 300 to 400 nm, preferably from 310 to 400 nm. UV light with a wavelength of 360 nm.
  • the photocleavable linker was specifically bound because it is unlikely to affect binding, including specific binding of the protein to the target substance and non-specific binding of the target substance or solid phase to the nucleic acid This is particularly preferable because it is highly likely that only the nucleic acid in the coding molecule of the assigning molecule is released.
  • the photocleavable linker that can be cleaved by long-wavelength ultraviolet light include those having a structure of an ⁇ -substituted-2-nitrobenzyl group.
  • the substituent include (i) a phosphoramidite which reacts with a hydroxyl group, (ii) an N-hydroxysuccinimide carbonate which reacts with an amino group, and (ii) a halogen which reacts with a thiol group.
  • the photocleavable linker described in the above (i) include PC biotin phosphoramidite, PC amino-modified phosphoramidite, and PC spacer phosphoramidite (all of which are trade names, manufactured by Glen Research). No.
  • the position of the cleavable linker in the assigning molecule is between the protein and the nucleic acid in the coding molecule, and is not particularly limited as long as cleavage is possible, and depends on the mode of the assigning molecule and the type of the cleavable linker. Selected as appropriate.
  • a cleavage type linker can be located between the DNA encoding the fusion protein and the ligand.
  • a cleavable linker is included as a component of one spacer molecule. Or positioned between a spacer molecule and a coding molecule.
  • the cleavable linker When the cleavable linker is composed of a nucleic acid, it may be integrated with the nucleic acid encoding the protein. When the cleavable linker is composed of a peptide, the C-terminal of the protein as a phenotype molecule May be fused. ⁇ 2> Production method of the present invention
  • the assigning molecule of the present invention can be used to synthesize a protein from a nucleic acid that encodes a protein, that is, when a nucleic acid that is a coding molecule is transcribed and / or translated, a protein as a phenotype molecule and a nucleic acid as a genotype molecule.
  • it is produced by linking a protein as a phenotype molecule and a nucleic acid as a genotype molecule.
  • the cell-free protein synthesis system may be a cell-free translation system or a cell-free transcription / translation system, and is appropriately selected according to the type of nucleic acid constituting the assigning molecule.
  • a ligand having at least the above-mentioned transcription / translation initiation region and a region encoding a fusion protein of a target protein and an adapter protein is bound to the MA via a cleavage linker. It is produced by quasi-binding the bound DNA and synthesizing proteins from the DNA in a cell-free transcription / translation system.
  • a library of DNA in which a ligand is bound to a DNA having at least a transcription translation initiation region and a region encoding a fusion protein of a target protein and an adapter protein via a cleavage type linker is prepared. Synthesize proteins from the DNA in one library using a cell-free transcription / translation system that is segregated to contain one or more molecules.
  • a genotype molecule may be prepared by linking a sequence coding for a cleavage type linker to the 3 'end of 0RF so that the coding frame matches.
  • a method for producing a genotype molecule for example, after chemically synthesizing a coding molecule such that either a 3 ′ terminal side of 0RF or a spacer molecule contains a cleavable linker, ⁇ 1-1> The method described in (b) may be performed. As the chemical synthesis method, a method known per se can be appropriately selected and used.
  • a method for synthesizing a coding molecule and a spacer molecule containing a cleavable linker specifically, for example, a cleavable linker having a structure of a 2-substituted-2-nitropentyl group
  • a phosphoramidite that reacts with a hydroxyl group is used as the group
  • a method of introducing the linker into any of the 3, terminal side of the 0RF of the coding molecule or a spacer molecule by a phosphoramidite DNA synthesis method may be mentioned.
  • ⁇ -hydroxysuccinimide carbonate which has a structure of -substituted-2-nitrobenzyl group and reacts with an amino group as an ⁇ substituent
  • a method is used in which the linker is introduced into either the 3 'end of the ORF of the coding molecule or one spacer molecule by a phosphoramidite DNA synthesis method, and then modified with an active ester.
  • the linker has a structure of a para-substituted-2-nitrobenzyl group, and a halogen that reacts with a thiol group is used as a cleavage type linker as the substituent, the linker is used as a phosphoramidite DNA synthesizer.
  • the linker is used as a phosphoramidite DNA synthesizer.
  • nuclease Ichize or DNA type linker one is a nucleic acid having a nucleotide sequence recognized by restriction enzyme, 3 5-terminal side or scan Bae one server molecules 0RF the coding molecule It can be produced by inserting into any of the above and synthesizing.
  • the orchid to be cleaved by the restriction enzyme must be double-stranded, and the nucleic acid having the nucleotide sequence of the DNA linker is produced by synthesizing the strands one by one and allowing them to be aligned. can do.
  • the thioester method can be used to easily convert the peptide of interest into the 3 'end of the ORF of the coding molecule or a spacer.
  • a coding molecule and a spacer molecule can be produced by introducing the compound into any one of the molecules and synthesizing it.
  • nucleic acid encoding a protein is transcribed and / or translated
  • the nucleic acid is constructed such that the protein and the nucleic acid are linked via a cleavable linker.
  • the nucleic acid is transcribed and / or translated in a cell-free protein synthesis system.
  • it is preferably constructed such that, when translated, the protein and the nucleic acid are linked via a cleavable linker.
  • nucleic acid encoding a protein When transcribed and / or translated in a cell-free protein synthesis system, the nucleic acid constructed so that the protein and the nucleic acid are linked via a cleavable linker can be prepared using live cells. However, it is thought that transcription and Z or translation are performed in the same manner as when a cell-free protein synthesis system is used.
  • the assigning molecule obtained by transcription and / or translation using a cell-free protein synthesis system or a living cell may be purified if necessary.
  • the assigning molecule library of the present invention can be produced by applying the above-described producing method of the present invention to an aggregate of nucleic acids in a nucleic acid library, that is, to each nucleic acid in a nucleic acid library. .
  • the screening method of the present invention is a method for screening a nucleic acid encoding a protein that interacts with a target substance from a nucleic acid library, comprising the steps of: Preparing a library of the mapping molecules; mixing the library of mapping molecules with a target substance; separating the mapping molecules bound to the target substance; and a linker of the separated mapping molecules. A step of releasing the nucleic acid by cutting under conditions that the sequence is not changed; and a step of recovering the released nucleic acid.
  • Target substances include proteins (including peptides, antibodies, etc.), nucleotides and the like.
  • the interaction can be measured by a method suitable for the type of target substance (for example, Rigaut, G. et al. (1999) Nature Biotech. 17, 1030-1032).
  • the library of the assigning molecules and the target substance may be mixed under the condition that the target protein of the assigning molecule interacts with the target substance. These conditions are appropriately selected depending on the interaction to be detected and the type of the target substance.
  • the separation of the assigning molecules bound to the target substance And the step of separating the assigning molecule that does not bind to the target substance.
  • the target substance is immobilized on the solid phase, so that the solid phase on which the target molecule after mixing with the assigning molecule is immobilized. Separation can be performed by washing. Washing conditions are appropriately selected depending on the interaction to be detected and the type of target substance.
  • immobilizing on a solid phase means that the conjugate of the assigning molecule and the target substance can be separated from the unbound molecule.
  • the target substance is a membrane protein
  • Membrane proteins expressed in cell membranes and the like and proteins embedded in artificial membranes are also included in the target substance immobilized on the solid phase.
  • the cleavage of the separated linker of the assigning molecule under the condition that the base sequence of the nucleic acid does not change and the release of the nucleic acid are performed using a cleavage type linker as exemplified above under the conditions corresponding thereto. Can be.
  • a cleavage type linker as exemplified above under the conditions corresponding thereto.
  • releasing the nucleic acid is also called elution.
  • “free” is used to mean “elution”.
  • the released nucleic acid may be modified as long as the nucleotide sequence of the nucleic acid can be analyzed.
  • the released nucleic acid can be recovered by a usual method. For example, a method of recovering by electrophoresis, a method of precipitating components other than the released nucleic acid and recovering a supernatant, and the like can be mentioned.
  • the recovered nucleic acid is subjected to amplification and sequence analysis for purposes such as functional analysis and evolutionary engineering.
  • GPCR G protein-coupled receptor
  • the streptavidin gene is expressed in a DNA library such as a random library or a cDNA library so that streptavidin and the protein encoded by the DNA are expressed as a fusion protein.
  • a DNA library such as a random library or a cDNA library
  • the protein and the MA are linked via a cleavable linker.
  • the modified DNA is transcribed and translated by a cell-free transcription / translation system using a water / oil emulsion prepared so that one micelle contains almost one molecule of DNA, and a fusion protein is synthesized.
  • streptavidin, a component of the fusion protein, and biotin, a component of the modified DNA bind to generate an assigning molecule.
  • the assigning molecules are recovered from the emulsion and a library of assigning molecules is obtained.
  • the assigning molecule is mixed with cells that have expressed the GPCR on the cell membrane.
  • the DNA is released and recovered by cutting the linker.
  • sequence of the collected DNA can be analyzed, or the above steps can be repeated by amplifying by PCR and ligating biotin again via a cleavage type linker.
  • cleavage type linker that can be cleaved by long-wavelength ultraviolet light is used as the cleavage type linker.
  • the upper diagram in FIG. 2 shows a state in which the assigning molecule is bound to the target substance GPCIU.
  • the assigning molecule bound to GPCR is exposed to long-wavelength ultraviolet light that cleaves the photocleavable linker, DNA is released as shown in the lower diagram of Figure 2.
  • Example 1 Ultraviolet Cleavage of Assigning Molecules Containing Photocleavable Linker After DNA and Protein Linked Molecules are Formed via Photocleavable Linker, DNA and Protein are Cleaved and Separated by Long-Wavelength UV Irradiation O
  • the DNA-protein linked molecules used in this example do not contain the DNA-encoded protein, but have the same behavior for cleavage by ultraviolet light as the assigned molecules In this example, for convenience of explanation, it is called an associating molecule.
  • PCB-labeled DNA DNA labeled with fluorescein and PCB (hereinafter abbreviated as PCB-labeled DNA) was obtained.
  • PCB-labeled DNA DNA labeled with fluorescein and PCB
  • biotin-labeled DNA DNA labeled with photocleavable linker
  • STA-ATII streptavidin-angiotensin II fusion protein
  • This sample was electrophoretically separated on a 3% Sechem Gold Agarose gel, and the fluorescence of fluorescein was detected using an image analyzer.
  • a control experiment was performed in which palin was added to 0.2%, a protein synthesis inhibitor.
  • Figure 4 shows the results of detection of STA-ATII-associated molecules synthesized by the cell-free transcription / translation system.
  • heparin a protein synthesis inhibitor
  • the streptavidin-angiotensin II fusion protein is not synthesized, so the band of sta-atii DNA labeled with fluorescein and PCB (see “DNA ⁇ ” in the figure) Only the position shown is detected (lane 2).
  • MT1R / CH0-K1 cells expressing human angiotensin II type 1 receptor (hereinafter abbreviated as hATIR)
  • hATIR human angiotensin II type 1 receptor
  • PCB-labeled sta-atii DNA (total length 670 bp) was obtained.
  • PCR was performed in the same manner using DNA-type DNA encoding vasopressin (SEQ ID NO: 4) that does not bind to MT1R, and PCB-labeled sta-avp DNA ( A total length of 604 bp was obtained.
  • a streptavidin-angiotensin II fusion protein is synthesized by adding 10 nM of PCB-labeled sta-atii DNA to cell-free transcription and translation system derived from reticulocytes from egrets and reacting at 30 ° C for 90 minutes. A STA-AT II assigning molecule was formed. Similarly, streptavidin.pasopressin-fused protein (hereinafter abbreviated as STA-AVP) was synthesized using 10 nM of PCB-labeled sta-avp DNA as type II, and this protein and sta-avp DNA were synthesized. Was formed.
  • STA-AVP streptavidin.pasopressin-fused protein
  • Human fetal liver cDNA library for cloning the MT1R gene (Provided by Prof. Junichiro Inoue, Keio University) 0.05 zl, lOxEx Taq buffer 51, 2.5 mM dNTP juU 10 M ATF primer 1 2.5 10 ⁇ M ATR primer (SEQ ID NO: 6) 2.5, "1, 5 U” 1 Mix with 0.25 zl of Ex Taq DNA polymerase, adjust to a total volume of 50 ⁇ 1 with sterile water, and perform PCR (95 ° C: one minute> ((98 ° C .: 20 seconds, 55 ° C .: 1 minute, 72 ° C .: 4 minutes)> 35 cycles 4 ° C.) to obtain an MT1R gene fragment.
  • PCR 95 ° C: one minute> ((98 ° C .: 20 seconds, 55 ° C .: 1 minute, 72 ° C .: 4 minutes)> 35 cycles 4 ° C.
  • This MT1R gene fragment was treated with EcoRI and Xbal with restriction enzymes, and ligated to pEFl / Myc-His A (Invitrogen) which had been similarly treated to obtain pEFl-hATlR-MycHis (neomycin resistance).
  • This pEF hATIR-MycHis was transfected into CH0-K1 cells, selected on a medium supplemented with 400 g / ⁇ l G418, and expressed hATlR by stamp lotting using a Myc epitope antibody. CHO-K1 cells Obtained.
  • HBSS Hank's balanced salt solution
  • binding buffer 100 zM GRGDS (SEQ ID NO: 7), 1 mg / ml sonicated salmon sperm DNA (Sonicated Salmon Sperm) DNA, 1% BSA / basic buffer
  • the composition of the basic buffer is 1% protease inhibitor overnight cocktail, 0.5 M sucrose, 20 mM HEPES, pH 7.3, HBSS.
  • the pretreated sample A was transferred to a 1.5 ml tube, centrifuged at 2,000 rpm for 1 minute, and 1 ml of the supernatant was added to the similarly blocked hATlR / CH0-Kl cells. After binding for 60 minutes at room temperature with a shaker (50 rpm) for binding, sample A was removed by suction. For washing, add 3 ml of washing buffer (450 mM NaCl, 10 ⁇ M GRGDS (SEQ ID NO: 7), 100 ⁇ g / ml sonicated salmon sperm DNA / basic buffer), wash, aspirate, and remove. The operation was performed six times.
  • washing buffer 450 mM NaCl, 10 ⁇ M GRGDS (SEQ ID NO: 7), 100 ⁇ g / ml sonicated salmon sperm DNA / basic buffer
  • elution buffer 100 / M GRGDS (SEQ ID NO: 7), 0.5 ⁇ g / ml sonicated salmon sperm DNA / basic buffer
  • Long-wave ultraviolet light was irradiated for 5 minutes under the same conditions as in Example 1.
  • the supernatant was collected in a 1.5 ml tube, and this elution operation was performed twice.
  • the solution after the elution was subjected to ethanol precipitation, and the dried pellet was dissolved in pure water (Milli-Q water) 25/1.
  • PCR was performed using a 10,000-fold diluted solution of sample A as type I, and DNA was detected in the same manner.
  • a negative control the same operation as that for hATlR / CHO-K1 cells was performed for Mock / CHO-K1 cells to detect DNA.
  • Figure 5 shows the results.
  • hATIR and the STA-ATII-associated molecule are bound, exposure to long-wavelength ultraviolet light releases sta-atii DNA by photocleavage, so a 670 bp band (“sta-atii DNA ⁇ ” in the figure) Is detected.
  • the STA-AVP assigning molecule that does not bind to hATIR is non-specifically adsorbed and eluted, the band of sta-avp DNA (full length 604 bo, indicated by “sta-avp DNA ⁇ ” in the figure) Detected.
  • Sample A contains the assigning molecules in a ratio of STA-ATII: STA-AVP: 1: 5.
  • sta-atii DNA and sta-avp DNA were 1
  • an assigning molecule that specifically binds to a target substance can be screened with high efficiency.

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Abstract

　核酸ライブラリーから、標的物質と相互作用するタンパク質をコードする核酸をスクリーニングする方法であって、前記核酸ライブラリーから、タンパク質とそのタンパク質をコードする核酸とが、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカーを介して連結されている対応付け分子のライブラリーを製造する工程、前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、標的物質に結合した対応付け分子を分離する工程、選択された対応付け分子のリンカーを、前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断して前記核酸を遊離させる工程、および、遊離した核酸を回収する工程を含む前記方法。この方法により、標的物質に特異的に結合した対応付け分子を高効率でスクリーニングできる。

Description

明細書
切断可能な対応付け分子およびそれを用いるスクリーニング方法 技術分野
本発明は、 対応付け分子およびそれを用いるスクリーニング方法に関する。 背景技術
進化分子工学やゲノム機能解析において、 タンパク質、 核酸、 その他の生体分 子と相互作用する未知のタンパク質をコードする核酸を、 種々の生物や組織に由 来する核酸ライブラリーや人工的に合成された核酸ライブラリーの中から効率的 に選択するために、 タンパク質の試験管内（in vitro)選択の応用が期待されてい る。 タンパク質の試験管内選択を実現するために、 タンパク質 （表現型） とそれ をコードする核酸 （遺伝子型） とを連結した分子を用いる方法が提案されている。 この分子は、 タンパク質とそれをコードする核酸との連結により表現型と遺伝子 型が対応付けられているため、 対応付け分子と呼ばれる。 対応付け分子としては、 STABLE法 （特許文献 1、 非特許文献 1 ) によるもの、 試験管内ウィルス法 （特許 文献 2、 非特許文献 2、 特許文献 3 ) によるものが知られている。
生体分子等の標的物質と相互作用するタンパク質の試験管内での選択は、 固相 に固定ィ匕した標的物質にタンパク質を結合させた後、 結合したタンパク質を回収 することによって行われている。 この選択方法においては、 固相または標的物質 に非特異的に結合した夕ンパク質の存在が選択効率に大きく影響するため、 非特 異的な結合による夾雑分子を減少させる方法が提案されている。 例えば、 標的物 質がタンパク質の場合、 標的タンパク質の C末端側に、 カルモジュリン結合タン パク質、 配列特異的なプロテア一ゼの切断部位、 および、 プロテイン Aの IgG結 合ドメイン ( Z Z ドメイン) を融合させた融合タンパク質を用い、 1段目のスク リーニングでは、 融合タンパク質の Z Z ドメインを IgG結合ビーズに吸着結合さ せることにより固相化し、 配列特異的なプロテアーゼの切断により標的タンパク 質とそれに結合するタンパク質とを含む複合体を溶出し、 2段目のスクリ一ニン グでは、 融合タンパク質のカルモジュリン結合タンパク質をカルモジュリン固定 化ビーズに結合させることにより固相化し、 EDTA等のカルシウムキレート剤によ り標的タンパク質とそれに結合するタンパク質とを含む複合体を溶出する夕ンデ ムァフィニティー精製法が知られている （非特許文献 3 ) 。
<非特許文献 1 >
FEBS Lett. , 457, 227 ( 1999)
<特許文献 1 >
特閧 2 0 0 1— 1 2 8 6 9 0
<特許文献 2 >
国際公開第 W0 98/16636号パンフレツト
<非特許文献 2 >
FEBS Lett" 414, 405 ( 1997)
<特許文献 3 >
国際公開第 W0 02/48347号パンフレツト
<非特許文献 3 >
Nat. Biotec noL , 17， 1030 ( 1999) 発明の開示
スクリーニングされる物質が対応付け分子である場合、 夕ンパク質に核酸が結 合しているため、 タンパク質と標的物質との相互作用の他に、 核酸と固相や標的 物質との間の非特異的な結合によって、 標的物質に特異的に結合しない対応付け 分子もスクリーニングされることがある。 そのため、 対応付け分子を用いる場合 には、 従来の方法とは異なる原理に基づく、 非特異的な夾雑分子を減少させる方 法の提供が望まれる。
従って、 本発明の課題は、 固相や標的物質に対して非特異的に結合した対応付 け分子の夾雑を減少させ、 標的物質に特異的に結合した対応付け分子を高効率で スクリーニングできる、 対応付け分子のスクリ一ニング方法を提供することであ
Ό
本発明者らは、 対応付け分子が進化分子工学やゲノム機能解析においてスクリ 一二ングされる場合、 核酸の部分が次の工程に使用されることに着目し、 研究を 行った結果、 タンパク質とそれをコードする核酸とを特定のリンカーを介して連 結させ、 そのリンカ一の切断により核酸のみを遊離させることで、 対応付け分子 のスクリーニングに伴う上記の課題が解決できることを見出し、 本発明を完成し た。
本発明は、 以下のものを提供する。
( 1) タンパク質とそのタンパク質をコードする核酸とが、 前記核酸の塩基配列 が変化しない条件で切断可能なリンカーを介して連結されている対応付け分子。
(2) 前記リンカ一が、 長波長紫外線により切断可能なリンカ一である ( 1) の 対応付け分子。
(3) (1) または (2) の対応付け分子からなるライブラリ一。
(4) タンパク質をコードする核酸を転写および/または翻訳したときに翻訳さ れたタンパク質と前記核酸とが連結されるように構築された前記核酸を準備し、 準備した核酸を無細胞タンパク質合成系または生細胞を用いて転写および/また は翻訳することにより、 前記タンパク質と前記核酸とを連結する対応付け分子の 製造方法において、
前記核酸を転写および/または翻訳したときに、 前記タンパク質と前記核酸と が、 前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカーを介して連結さ れるように前記核酸が構築されている、 （ 1) の対応付け分子の製造方法。
(5) 核酸ライブラリーを構成する各核酸から （4) の製造方法により対応付け 分子を製造することを含む、 対応付け分子のライブラリーの製造方法。
(6) 核酸ライブラリーから、 標的物質と相互作用するタンパク質をコードする 核酸をスクリーニングする方法であって、
前記核酸ライブラリーから、 ( 5 ) の製造方法により対応付け分子のライブラ リーを製造する工程、
前記対応付け分子のライブラリ一と標的物質とを混合する工程、
標的物質に結合した対応付け分子を分離する工程、
分離した対応付け分子のリンカーを、 前記核酸の塩基配列が変化しない条件で 切断して前記核酸を遊離させる工程、 および、
遊離した核酸を回収する工程 を含む前記方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 開裂型リンカ一を含む対応付け分子を用いたスクリーニング方法の説 明図である。
図 2は、 長波長紫外線 （励起ピーク ： 365 nm) の照射による対応付け分子から の遺伝子型分子の遊離方法の説明図である。
図 3は、 長波長紫外線の照射による対応付け分子からの遺伝子型分子の遊離実 験の結果を示す図 （電気泳動写真） である。 レーン；!〜 6はフルォレセインおよび PCBラベル化した DNAを用いた場合である。 レーン 7〜12はフルォレセィンおよび ピオチンラベル化した DNAを用いた場合である o
図 4は、 無細胞転写 ·翻訳系における PCBラベル化した MAの対応付け分子の形 成を電気泳動により確認した結果を示す図 （電気泳動写真） である。 レーン 1は 対応付け分子を形成させた場合である。 レーン 2はタンパク質合成を阻害し、 対 応付け分子を形成させなかつた場合である。
' 図 5は、 hATlR/CHO- K1細胞と STA- AT I I対応付け分子を結合させ、 長波長紫外 線の照射により遺伝子型分子である sta-ati i DNAを溶出した実験結果を示す図 (電気泳動写真） である。 レーン 1、 3は MT1R/CH0- K1細胞を用いた場合、 レーン 2、 4は Mock/Cho- K1細胞を用いた場合である。 また、 レーン 5は結合操作前のサン プル Aである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明についてさらに詳細に説明する。 なお、 本明細書において引用し た全ての文献の記載は本明細書の一部を構成するものである。
< 1 >本発明の対応付け分子
本発明の対応付け分子は、 タンパク質とそのタンパク質をコードする核酸とが、 前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカ一 （本明細書では 「開 裂型リンカ一」 ともいう） を介して連結されていることを特徴とする。 本発明の 対応付け分子は、 閧裂型リンカーを介してタンパク質とそのタンパク質をコード する核酸とが連結されている他は、 通常の対応付け分子の構成と同様でよい。 対応付け分子のライブラリーも同様である。 すなわち、 対応付け分子として本 発明の対応付け分子を用いることの他は、 通常の対応付け分子からなるライブラ リーの作成方法に従って作成することができる。 例えば、 進化分子工学では、 Error-prone PGR (Leung, D.W., et al. (1989) J. Methods Cell Mol. Biol. 1， 11-15)、 Sexual PGR (Stemraer, W.P.C. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91， 10747-10751)、 DNAシャッフリング、 変異ライブラリー （柳川弘志、 辻 融， 「変異 DNAライブラリ —の構築方法」 、 W0 02/26964) などの方法を使って構築したライブラリ一など を、 ゲノム機能解析では、 ランダムブライミングゃ dTブライミングにより構築し た cDNAラィブラリーなどを銪型として用いることにより対応付け分子のライブラ リーを作成することができる。
< 1 - 1 >対応付け分子における開裂型リンカーの他の構成
核酸は、 対応付け分子の態様に応じて DNAおよび RNAのいずれでもよい。 また、 タンパク質は、 対応付け分子の態様に応じて融合タンパク質とされていてもよい。 タンパク質と核酸とが連結されているとは、 タンパク質と核酸とが、 その他の 分子を介して連結されていることも包含し、 また、 それらの相互間の結合は、 共 有結合、 生体分子が持つ親和力による結合等の非共有結合のいずれでもよい。 生 体分子が持つ親和力による結合の例としては、 抗原と抗体との結合、 ホルモンと 受容体との結合、 DNAと DNA結合蛋白質との結合等が挙げられる。
対応付け分子の例としては、 STABLE法 (特許文献 1、 非特許文献 1 ) によるも の、 試験管内（in vitro)ウィルス法 (特許文献 2、 非特許文献 2、 0 03/062417、 W0 98/31700) によるものが挙げられる。 以下、 具体例を説明する。
( a ) STABLE法による対応付け分子
STABLE法による対応付け分子は、 機能解析、 機能改変等の対象となるタンパク 質 （被標的タンパク質） とアダプタ一タンパク質との融合タンパク質と、 該融合 タンパク質をコードし、 かつリガンドが結合した DNAとが、 該アダプタ一タンパ ク質と該リガンドとの結合を介して連結されることによって構成されている。 被標的タンパク質は、 天然タンパク質またはその変異体、 及び人工タンパク質 またはその変異体の何れでもよい。 天然タンパク質としては、 種々の生物の器官、 組織または細胞に由来する c D N Aライブラリーから転写翻訳される多様性を有 するタンパク質のライブラリーを含むものである。 人工タンパク質としては、 天 然夕ンパク質の全てもしくは部分配列を組み合わせた配列、 またはランダムなァ ミノ酸配列を含むものである。
アダプタ一タンパク質とは、 ある分子 （リガンド） と特異的に結合する能力を 有するタンパク質を意味し、 これらの中には、 結合タンパク質、 受容体を構成す る受容体タンパク質、 抗体等も含まれる。 リガンドとは、 アダプタータンパク質 に特異的に結合する分子を意味する。 アダプタ一夕ンノ ク質ダリガンドの組み合 わせとしては、 例えば、 アビジン及びストレプトアビジン等のピオチン結合蛋白 質/ピオチン、 マルトース結合蛋白質/マルト一ス、 Gタンパク質/グァニンヌ クレオチド、 ポリヒスチジンべプチド /ニッケルまたはコバルト等の金属イオン、 グル夕チオン一 S—トランスフェラ一ゼ グル夕チオン、 DNA結合タンパク質 ZD NA、 抗体/抗原分子 (ェピトープ） 、 カルモジュリン /カルモジュリン結合ぺプ チド、 ATP結合タンパク質/ ATP、 またはエス卜ラジオ一ル受容体タンパク質 エ ストラジオール等の各種受容体タンパク質 Zそのリガンド等が挙げられる。
これらの中で、 アダプタータンパク質/リガンドの組み合わせとしては、 アビ ジン及びストレブトアビジン等のビォチン結合タンパク質/ピオチン、 マルト一 ス結合夕ンパク質/マルトース、 ポリヒスチジンべプチド /二ヅケルまたはコバ ルト等の金属イオン、 ダル夕チオン一 S—トランスフェラ一ゼ /ダル夕チオン、 抗体/抗原分子 （ェピトープ） 等が好ましく、 特に、 ストレプトアビジン/ピオ チンが最も好ましい。
この態様で用いる融合タンパク質をコードする D N Aにおいては、 通常、 その 一方の末端にリガンドが結合している。 該 D N Aの末端に結合したリガンドと該 D N Aにより発現される融合タンパク質中のアダプタ一タンパク質部分との結合 を介して、 融合タンパク質と D N Aとが物理的に連結される。
この態様の対応付け分子は、 少なくとも転写翻訳開始領域、 被標的タンパク質 とアダプタ一タンパク質との融合タンパク質をコードする領域を有し、 かつリガ ンドが結合した D N Aを、 無細胞転写翻訳系で発現させてタンパク質を合成する ことにより製造できる。 好ましくは、 少なくとも転写翻訳開始領域、 被標的タン パク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質をコードする領域を有し、 か つリガンドが結合した D N Aのライブラリーを、 該 D N Aのライブラリー内の D N Aが、 一種類もしくは 1分子ずつ含まれるように隔離した無細胞転写翻訳系で 発現させてタンパク質を合成することにより製造される。
( b ) 試験管内ウィルス法による対応付け分子
試験管内ウィルス法による対応付け分子は、 機能解析、 機能改変等の対象とな るタンパク質を含む表現型分子と、 該タンパク質をコードする核酸を含む遺伝子 型分子とが結合してなる。 遺伝子型分子は、 タンパク質をコードする領域を、 そ の領域の塩基配列が翻訳され得るような形態で有するコード分子と、 スぺーサ一 分子とが結合してなる。
この態様におけるスぺ一サー分子は、 核酸の 3'末端に結合できるドナー領域と、 ドナー領域に結合した、 ポリエチレングリコ一ルを主成分とした PEG領域と、 PEG 領域に結合した、 ぺプチド転移反応によってべプチドと結合し得る基を含むぺプ チドアクセプ夕一領域とを含む。 PEG領域はなくてもよい。
核酸の 35末端に結合できるドナー領域は、 通常、 1以上のヌクレオチドからな る。 ヌクレオチドの数は、 通常には 1〜 1 5、 好ましくは 1〜2である。 ヌクレ ォチドはリボヌクレオチドでもデォキシリボヌクレオチドでもよい。
ドナ一領域の 5'末端の配列は、 ライゲーシヨン効率を左右する。 コード分子と スぺーサ一分子をライゲ一シヨンさせるためには、 少なくとも 1残基以上を含む ことが必要であり、 ポリ A配列をもつァクセプ夕一に対しては、 少なくとも 1残 基の dC (デォキシシチジル酸）または 2残基の d C d C (ジデォキシシチジル酸）が好ま しい。 塩基の種類としては、 C>(Uまたは T)>G>Aの順で好ましい。
PEG領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。 ここで、 主成 分とするとは、 PEG領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が 20塩基以下、 また は、 ポリエチレングリコールの平均分子量が 400以上であることを意味する。 好 ましくは、 ヌクレオチドの合計の数が 10塩基以下、 または、 ポリエチレングリコ ールの平均分子量が 1000以上であることを意味する。 PEG領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、 通常には、 400~30, 000、 好ましくは 1, 000〜10, 000、 より好ましくは 2, 000〜8, 000である。 ここで、 ポリ エチレングリコールの分子量が約 400より低いと、 このスぺーサ一分子に由来す るスぺーサ一部を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、 対応付け翻訳の 後処理が必要となることがあるが (Liu, R" Barrick, E" Szostak, J.W., Roberts, R.W. (2000) Methods in Enzymology, vol. 318, 268-293) 、 分子量 1000以上、 より好まし くは 2000以上の PEGを用いると、 対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができる ため、 翻訳の後処理が必要なくなる。 また、 ポリエチレングリコールの分子量が 増えると、 遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、 特に分子量 1000以上で良好 であり、 分子量 400以下では DNAスぺーサ一と性質がそれほどかわらず不安定とな ることがある。
ぺプチドアクセプ夕一領域は、 ぺプチドの C末端に結合できるものであれば特 に限定されないが、 例えば、 ピューロマイシン、 3，- N-アミノアシルピューロマ イシンアミノヌクレ才シド (3， -N-Aminoacy lpuromyc in aminonucleoside, PANS- アミノ酸） 、 例えばァミノ酸部がグリシンの PANS- Gly、 パリンの PANS- Val、 ァラ ニンの PA S-Ala、 その他、 全アミノ酸に対応する PANS -全アミノ酸が利用できる。 また、 化学結合として 3' -アミノアデノシンのァミノ基とアミノ酸のカルボキシ ル基が脱水縮合した結果形成されたアミ ド結合でつながった 3' -N-アミノアシル アデノシンアミノヌクレオシド (3，—Aminoacyl adenosine aminonucleoside, AAN S-アミノ酸） 、 例えばアミノ酸部がグリシンの AANS-Gly、 バリンの AANS-Val、 ァ ラニンの AANS- Ala、 その他、 全アミノ酸に対応する AANS-全アミノ酸が利用でき る。 また、 ヌクレオシドまたはヌクレオシドとァミノ酸のエステル結合したもの なども利用できる。 その他、 ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構 造骨格を有する物質と、 アミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有す る物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。 ペプチドァクセプ夕ー領域は、 好ましくは、 ピューロマイシンもしくはその誘 導体、 または、 ピューロマイシンもしくはその誘導体と 1残基もしくは 2残基の デォキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。 ここで、 誘導体とはタンパク質翻訳系においてべプチドの C末端に結合できる誘 導体を意味する。 ビューロマイシン誘導体は、 ピューロマイシン構造を完全に有 しているものに限られず、 ピュー口マイシン構造の一部が欠落しているものも包 含する。 ピューロマイシン誘導体の具体例としては、 PANS-アミノ酸、 S-アミ ノ酸などが挙げられる。
ぺプチドアクセプ夕一領域は、 ピュー口マイシンのみの構成でもかまわないが、 5'側に 1残基以上の DNAおよび/または RNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。 配列としては、 dC-ピューロマイシン， rC -ピューロマイシンなど、 より好ましく は dCdC -ピューロマイシン， rCrC-ピューロマイシン， H C -ピューロマイシン， dCrC-ピュー口マイシンなどの配列で、 アミノアシル- tRNAの 3，末端を模倣した CC A配列 (Philipps, G.R. (1969) Nature 223, 374-377) が適当である。 塩基の種類とし ては、 C>(Uまたは T )>G>Aの順で好ましい。
スぺーサ一分子は、 ドナー領域と PEG領域との間に、 少なくとも 1つの機能付 与ュニットを含むことが好ましい。 機能付与ユニットは、 好ましくは、 少なくと も 1残基のデォキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの塩基に機能修飾 を施したものである。 例えば、 機能修飾物質として、 蛍光物質、 ピオチン、 また は His- tagなど各種分離夕グなどを導入したものが可能である。
この態様におけるコード分子は、 転写プロモ一夕一および翻訳ェンハンサーを 含む 5'非翻訳領域と、 5'非翻訳領域の 3'側に結合した、 タンパ'ク質をコードする 0RF領域と、 0RF領域の 3'側に結合した、 ポリ A配列及びその 5'側に制限酵素 Xhol が認識する配列を含む 3'末端領域を含む核酸である。
コード分子は、 DNAでも RNAでもよく、 Aの場合、 5，末端に Cap構造があっても なくても良い。 また、 コード分子は任意のベクターやプラスミ ドに組み込まれた ものとしてもよい。
3'末端領域は、 Xhol配列とその下流にポリ A配列を含む。 スぺ一サ一分子とコ ード分子とのライゲーシヨン効率に影響を与える要素としては 3'末端領域のポリ A配列が重要であり、 ポリ A配列は、 少なくとも 2残基以上の dAおよび/または rA の混合または単一のポリ Α連続鎖であり、 好ましくは、 3残基以上、 より好ましく は 6以上、 さらに好ましくは 8残基以上のポリ A連続鎖である。
コード分子の翻訳効率に影響する要素としては、 転写プロモーターと翻訳ェン ハンサーからなる 5'非翻訳領域、 および、 ポリ A配列を含む 35末端領域の組み合 わせがある。 3'末端領域のポリ A配列の効果は通常には 10残基以下で発揮される。 5'非翻訳領域の転写プロモーターは T7/T3または SP6などが利用でき、 特に制限は ない。 好ましくは SP6であり、 特に、 翻訳のェンハンサ一配列としてオメガ配列 やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合は SP6を用いることが特に好まし い。 翻訳ェンハンサ一は好ましくはオメガ配列の一部であり、 オメガ配列の一部 としては、 TMVのオメガ配列の一部（029; Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638、 および、 WO 02/48347の図 3参照）を含んだものが 好ましい。
また、 翻訳効率に関し、 3'末端領域においては、 Xhol配列とポリ A配列の組み 合わせが重要となる。 また、 0RF領域の下流部分、 すなわち Xhol配列の上流に親 和性タグがついたものとポリ A配列の組み合わせも重要となる。 親和性タグ配列 としては、 抗原抗体反応など、 タンパク質を検出できるいかなる手段を用いるた めの配列であればよく、 制限はない。 好ましくは、 抗原抗体反応によるァフィ二 ティ一分離分析用タグである Flag- tag配列である。 ポリ A配列効果としては、 Fla g - tag等の親和性夕グに X o I配列がついたものとそこへさらにポリ A配列がついた ものの翻訳効率が上昇する。 この翻訳効率に関し効果のある構成は、 対応付け効 率にも有効である。
0RF領域については、 DNAおよび/または MAからなるいかなる配列でもよい。 遺 伝子配列、 ェキソン配列、 イントロン配列、 ランダム配列、 または、 いかなる自 然界の配列、 人為的配列が可能であり、 配列の制限はない。 また、 コード分子の 53非翻訳領域を SP6+029とし、 35末端領域を、 たとえば、 Flag+XhoI+An(n=8)とす ることで、 各長さは、 53非翻訳領域で約 60bp、 33末端領域で約 40bpであり、 PCR のプライマーにアダプタ一領域として組み込める長さである。 このため、 あらゆ るべクタ—やプラスミ ドゃ cDNAライブラリ一から PCRによって、 5，非翻訳領域と 3
'末端領域をもったコード分子を簡単に作成できる。 コード分子において、 翻訳 は 0RF領域を超えてされてもよい。 すなわち、 0RF領域の末端に終止コドンがなく てもよい。
この態様におけるコード分子は、 転写プロモーターおよび翻訳ェンハンサーを 含む 5'非翻訳領域と、 55非翻訳領域の 3'側に結合した、 タンパク質をコードする 0RF領域と、 0RF領域の 3'側に結合した、 ポリ A配列を含む 33末端領域を含む核酸 である。
遺伝子型分子を構成するコ一ド分子は、 Xhol配列を有することが好ましい。 遺伝子型分子は、 上記コード分子を、 必要により、 タンパク質をコードする領 域の塩基配列が翻訳され得るような形態に変換した後 （例えば、 転写した後） 、 コード分子の 3'末端と、 スぺーサ一分子のドナー領域を、 通常のリガーゼ反応に より結合させることにより製造できる。 反応条件としては、 通常、 4〜2 5 °Cで 4〜4 8時間の条件が挙げられ、 PEG領域を含むスぺーサ一分子の PEG領域内のポ リエチレングリコ一ルと同じ分子量のポリエチレングリコ一ルを反応系に添加す る場合には、 15°Cで 0.5〜4時間に短縮することも可能である。
スぺ—サー分子とコード分子の組み合わせはライゲ一ション効率に重要な効果 をもたらす。 ァクセプ夕一にあたるコード分子の 3'末端領域において、 少なくと も 2残基以上、 好ましくは 3残基以上、 さらに好ましくは 6〜 8残基以上の DNA および/または RNAのポリ A配列があること、 さらに、 5'非翻訳領域の翻訳ェンハ ンサ一としては、 オメガ配列の部分配列（029)が好ましく、 スぺ一サー分子のド ナ一領域としては、 少なくとも 1残基の dC (デォキシシチジル酸）または 2残基の dCdC (ジデォキシシチジル酸）が好ましい。 このことによって、 RNAリガ一ゼを用 いることで DNAリガーゼのもつ問題点を回避し、 かつ効率を 60〜80%に保つことが できる。
(a)転写プロモータ一および翻訳ェンハンサ一を含む 5'非翻訳領域と、 5'非翻 訳領域の 3，側に結合した、 タンパク質をコードする 0RF領域と、 0RF領域の 3'側に 結合した、 ポリ A配列を含む 3'末端領域を含む皿であるコード分子の 35末端と、 (b)上記スぺーサ一分子のドナ一領域であって RNAからなるものとを、 スぺ一サ一 分子内の PEG領域を構成するポリエチレングリコールと同じ分子量をもつ遊離の ポリエチレングリコールの存在下で、 RNAリガーゼにより結合させることが好ま しい。
ライゲーシヨン反応時に、 PEG領域を含むスぺーサ一分子の PEG領域と同じ分子 量のポリエチレングリコ一ルを添加することによって、 スぺーサ一分子のポリエ チレングリコールの分子量によらずライゲーシヨン効率が 80〜90%以上に向上し、 反応後の分離工程も省略することができる。
この態様の対応付け分子は、 上記の遺伝子型分子を無細胞翻訳系で翻訳するこ とにより、 ペプチド転移反応で、 遺伝子型分子内の 0RF領域によりコードされた タンパク質である表現型分子と連結することができる。 無細胞翻訳系は、 好まし くは、 小麦胚芽またはゥサギ網状赤血球のものである。 翻訳の条件は通常に採用 される条件でよい。 例えば、 2 5〜3 7 °(で 1 5〜240分の条件が挙げられる。
< 1— 2 >閧裂型リンカ一
本発明の対応付け分子に用いられる開裂型リンカ一は、 前記コード分子中の核 酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカ一である。 核酸の塩基配列が 変化しないとは、 核酸が切断されたり、 その塩基が改変されたりすることがなく、 遊離したコード分子中の核酸の塩基配列が、 その対応付け分子の表現型分子であ るタンパク質をコードする塩基配列を保持することを意味する。
このような開裂型リンカ一の例を表 1に示す。 なお、 表中の括弧内にその切断 方法を示す。
表 1
光開裂型リンカ一 （長波長紫外線）
DNA型リンカ一 (デォキシリボヌクレアーゼ、 制限酵素)
腿型リンカ一 （リボヌクレァ一ゼ）
腿扉ハイプリッド型リンカ一 (リボヌクレァーゼ H)
ペプチド型リンカ一 （プロテアーゼ）
エステル結合型リンカー (エステラーゼ)
ジスルフィ ド結合型リンカ一 （DTT、 ? -メルカプトエタノール）
T-(EDTA) 型リンカ一 (鉄イオン、 DTT)
糖鎖型リンカ一 （糖分解酵素）
脱塩基ヌクレオチド （Abasic) 型リンカ一 （弱塩基） このようなリンカー自体およびその切断方法は、 当業者に知られているので、 対応付け分子に使用したときに、 コード分子中の核酸の塩基配列を変化させない 切断条件を設定し、 その条件で切断できるものを選択することは当業者であれば 容易である。 例えば、 光開裂型リンカ一の場合には、 核酸は短波長の紫外線の照 射により損傷を受けるため、 核酸に損傷を与えない長波長紫外線の照射により切 断できるものが選択される。 また、 DNA型リンカ一、 RNA型リンカ一および DNA/RN Aハイプリッド型リンカ一の場合には、 タンパク質をコードする核酸が分解され ないようにヌクレァーゼの種類および反応条件を選択する。
本発明において、 開裂型リンカ一は、 好ましくは、 光開裂型リンカ一である。 上述のように、 光開裂型リンカ一は、 長波長紫外線の照射により切断することが できるものであればよい。 ここで長波長紫外線とは、 照射したときに、 コード分 子中の核酸の塩基配列を変化させない波長の紫外線を意味し、 通常には 3 0 0〜 4 0 0 n m、 好ましくは 3 1 0〜3 6 0 n mの波長の紫外線である。 光開裂リン カーは、 タンパク質と標的物質との特異的結合および標的物質や固相と核酸との 非特異的結合を含めて、 結合に影響を与える可能性が低いので、 特異的に結合し た対応付け分子の、 コード分子中の核酸だけを遊離させる可能性が高いため、 特 に好ましい。
長波長紫外線で切断できる光開裂型リンカ一として、 具体的には、 例えば、 α -置換- 2-二トロべンジル基の構造を持つもの等が挙げられる。 ひ置換基として、 ( i )水酸基と反応するホスホアミダイ ト、 （i i )ァミノ基と反応する N-ヒドロキシ スクシンイミ ドカルボネート、 ( i i i )チオール基と反応するハロゲン等が挙げら れる。 上記（ i )に記載の光開裂型リンカ一としては、 PCピオチンホスホアミダイ ト、 PCァミノ修飾ホスホアミダイ ト、 PCスぺーサーホスホアミダイ ト （いずれも 商品名、 グレンリサーチ社製） 等が挙げられる。
対応付け分子における開裂型リンカーの位置は、 タンパク質とコード分子中の 核酸との間であって、 切断が可能な限り、 特に制限されず、 対応付け分子の態様 および開裂型リンカ一の種類に応じて適宜選択される。 例えば、 STABLE法による 対応付け分子の場合には、 融合タンパク質をコードする DNAとリガンドとの間に 開裂型リンカ一を位置させることができる。 また、 試験管内ウィルス法による対 応付け分子の場合には、 開裂型リンカーをスぺーサ一分子の構成要素として含ま せたり、 スぺ一サ一分子とコード分子との間に位置させたりすることができる。 開裂型リンカ一が核酸からなる場合には、 タンパク質をコードする核酸と一体 とされていてもよく、 また、 開裂型リンカ一がペプチドからなる場合には表現型 分子としての夕ンパク質の C末端に融合させていてもよい。 く 2 >本発明の製造方法
本発明の対応付け分子は、 タンパク質をコードする核酸からタンパク質を合成 したとき、 すなわち、 コード分子である核酸を転写および/または翻訳したとき に、 表現型分子としてのタンパク質と遺伝子型分子としての核酸とが開裂型リン カーを介して連結されるように構築された遺伝子型分子である核酸を準備し、 準 備した核酸を無細胞タンパク質合成系または生細胞を用いて転写および/または 翻訳することにより、 表現型分子としてのタンパク質と遺伝子型分子としての核 酸とを連結して製造される。
無細胞タンパク質合成系は、 無細胞翻訳系であっても、 無細胞転写翻訳系であ つてもよく、 対応付け分子を構成する核酸の種類に応じて適宜選択される。 例えば、 STABLE法の場合には、 上記の少なくとも転写翻訳開始領域、 被標的夕 ンパク質とアダプタータンパク質との融合タンパク質をコ一ドする領域を有する MAに、 閧裂型リンカ一を介してリガンドが結合した DNAを準傭し、 その DNAから 無細胞転写翻訳系でタンパク質を合成することにより製造される。 あるいは、 少 なくとも転写翻訳開始領域、 被標的タンパク質とアダプタータンパク質との融合 タンパク質をコードする領域を有する DNAに、 開裂型リンカ一を介してリガンド が結合した DNAのライプラリーを準備し、 該丽 Aのライブラリ一内の DNAから、 ― 種類もしくは 1分子ずつ含まれるように隔離した無細胞転写翻訳系で夕ンパク質 を合成する。
また、 試験管内ウィルス法による対応付け分子の場合には、 開裂型リンカ一を 含むスぺーサ一分子を用いたり、 スぺーサ一分子とコード分子を開裂型リンカ一 を介して結合させたり、 0RFの 3， 末端に開裂型リンカ一をコードする配列をコ —ディング枠が合うように連結させたりすることにより遺伝子型分子を準備すれ ばよい。 遺伝子型分子の製造方法としては、 例えば、 コード分子の 0RFの 3 ' 末端側ま たはスぺーサ一分子のいずれかに開裂型リンカ一を含むように化学合成した後に、 < 1 - 1 > ( b ) に記載の方法を行うことが挙げられる。 化学合成方法は、 それ 自体既知の方法を適宜選択して用いることができる。
開裂型リンカ一を含むコード分子およびスぺーサ分子の合成法として、 具体的 には、 例えば、 開裂型リンカ一としてひ-置換- 2-ニトロペンジル基の構造を持つ ものであって、 ひ置換基として、 水酸基と反応するホスホアミダイ トを用いる場 合には、 該リンカーをホスホアミダイ ト DNA合成法によりコード分子の 0RFの 3 ， 末端側またはスぺ一サー分子のいずれかに導入する方法等が挙げられる。 また、 -置換- 2-ニトロべンジル基の構造を持つものであって、 α置換基として、 アミ ノ基と反応する Ν-ヒドロキシスクシンィミ ドカルボネートを開裂型リンカーとし て用いる場合には、 該リンカーをホスホアミダイ ト DNA合成法によりコード分子 の 0RFの 3 ' 末端側またはスぺーサ一分子のいずれかに導入した後、 活性エステ ルで修飾する方法等が用いられる。 さらに、 ひ-置換- 2-ニトロべンジル基の構造 を持つものであって、 ひ置換基として、 チオール基と反応するハロゲンを開裂型 リンカ一として用いる場合には、 該リンカーをホスホアミダイ ト DNA合成法によ りコ一ド分子の 0RFの 3 ' 末端側またはスぺ一サー分子のいずれかに導入する方 法等が挙げられる。
また、 DNA型リンカ一を用いる場合には、 ヌクレア一ゼまたは制限酵素により 認識される塩基配列を有する核酸である DNA型リンカ一を、 コード分子の 0RFの 3 5 末端側またはスぺ一サー分子のいずれかに挿入して合成することにより製造す ることができる。 ここで、 制限酵素により切断される蘭 Αは、 2本鎖である必要 があるため、 該 DNAリンカ一の塩基配列を有する核酸は、 1本鎖ずつ合成してァ 二一リングさせることにより製造することができる。
また、 プロテア一ゼで切断されるペプチド型リンカ一を用いる場合には、 例え ば、 チォエステル法を用いることで、 簡単に、 目的のペプチドをコード分子の OR Fの 3 ' 末端側またはスぺーサ一分子のいずれかに導入して合成することにより コード分子、 スぺ一サー分子を作製することができる。
生細胞としては、 原核または真核生物例えば大腸菌の細胞などが使用できる。 タンパク質をコードする核酸を転写および/または翻訳したときに、 タンパク 質と核酸とが開裂型リンカーを介して連結されるように構築された核酸は、 無細 胞タンパク質合成系で核酸を転写および/または翻訳したとき、 タンパク質と核 酸とが開裂型リンカーを介して連結されるように構築されたものであることが好 ましい。 無細胞タンパク質合成系でタンパク質をコードする核酸を転写および/ または翻訳したときに、 タンパク質と核酸とが開裂型リンカ一を介して連結され るように構築された核酸は、 生細胞を用いた場合でも無細胞タンパク質合成系を 用いた場合と同様に転写および Zまたは翻訳されると考えられる。
無細胞タンパク質合成系または生細胞を用いて転写および/または翻訳するこ とにより得られた対応付け分子は、 必要により精製してもよい。
本発明の対応付け分子のライブラリ一は、 核酸ラィブラリ一の核酸の集合体に 対し、 すなわち、 核酸ライブラリ一の各核酸に対し、 上記の本発明の製造方法を 適用することにより製造することができる。
< 3 >本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、 核酸ライブラリ一から、 標的物質と相互作用 するタンパク質をコ一ドする核酸をスクリ一ニングする方法であって、 前記核酸 ライブラリーから、 本発明の製造方法により対応付け分子のライブラリーを製造 する工程、 前記対応付け分子のライブラリーと標的物質とを混合する工程、 標的 物質に結合した対応付け分子を分離する工程、 分離した対応付け分子のリンカー を、 前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断して前記核酸を遊離させる工程、 および、 遊離した核酸を回収する工程を含む。
標的物質としては、 タンパク質 （ペプチド、 抗体などを含む） 、 ヌクレオチド などが挙げられる。 相互作用の測定は、 標的物質の種類に適合した方法により行 うことができる （例えば、 Rigaut, G. et al. (1999) Nature Biotech. 17, 1030-1032) 。 対応付け分子のライブラリーと標的物質との混合は、 対応付け分子の被標的夕 ンパク質が標的物質と相互作用する条件で混合すればよい。 この条件は、 検出し ようとする相互作用および標的物質の種類に応じて適宜選択される。
標的物質に結合した対応付け分子の分離は、 標的物質に結合した対応付け分子 と、 標的物質に結合しない対応付け分子を分離する工程であり、 通常には、 標的 物質を固相に固定化しておくことによって、 対応付け分子と混合後の標的分子を 固定化した固相を洗浄することにより分離を行うことができる。 洗浄の条件は、 検出しょうとする相互作用および標的物質の種類に応じて適宜選択される。 ここ で固相に固定化するとは、 対応付け分子と標的物質との結合体が非結合の分子か ら分離可能になっていることを意味し、 例えば、 標的物質が膜タンパク質の場合、 細胞の細胞膜等に発現した膜タンパク質や人工膜中に埋め込まれたタンパク質も、 固相に固定化された標的物質に包含される。
分離した対応付け分子のリンカーを、 前記核酸の塩基配列が変化しない条件で 切断して前記核酸を遊離させることは、 上記に例示したような開裂型リンカ一を 用い、 それに応じた条件で行うことができる。 標的物質が固相に固定化されてい る場合、 核酸を遊離させることは、 溶出とも呼ばれる。 本発明において 「遊離」 とは 「溶出」 も包含する意味で用いる。 また、 遊離される核酸は、 核酸の塩基配 列が解析可能な限り、 改変されたものであってよい。
遊離した核酸の回収は、 通常の方法によって行うことができる。 例えば、 電気 泳動により回収する方法、 遊離した核酸以外の成分を沈殿させて上清を回収する 方法などが挙げられる。 . 回収された核酸は、 機能解析、 進化工学などの目的に応じて増幅や配列の解析 が行われる。
以下、 スクリーニングの例を図 1を参照して説明する。 この例では、 標的分子 として Gタンパク質共役受容体 (GPCR)、 対応付け分子として STABLE法によるもの (リガンドがビォチン、 アダプタ一タンパク質がストレプトアビジン） が用いら れている。
まず、 ランダムライブラリーや cDNAライブラリーなどの DNAライプラリーを構 成する DNAに対し、 ス卜レプトアビジン遗伝子を、 ストレブトアビジンと前記 DNA にコードされるタンパク質とが融合タンパク質として発現されるように連結し、 さらに開裂型リンカーを介してピオチンを連結して、 前記 DNAから無細胞転写翻 訳系で前記タンパク質を合成したときに前記タンパク質と前記 MAとが開裂型リ ンカーを介して連結されるように改変された DNAを準備する。 改変された DNAを、 一ミセルにほぼ一分子の DNAが含まれるように調製した水/ 油型ェマルジヨンとした無細胞転写翻訳系で転写翻訳し、 融合タンパク質を合成 する。 そうすると、 融合タンパク質の構成要素のストレプトアビジンと、 改変 DN Aを構成要素のビォチンが結合し、 対応付け分子が生成する。
ェマルジヨンから、 対応付け分子を回収し、 対応付け分子のライブラリーを得 る。 対応付け分子を、 GPCRを細胞膜に発現した細胞と混合する。 リンカ一を切断 することにより、 DNAを遊離させ回収する。
目的に応じて、 回収された DNAの配列解析を行ったり、 PCRにより増幅して再度 ピオチンを開裂型リンカーを介して連結し、 上記の工程を繰り返したりすること ができる。
次に、 図 2を参照して開裂型リンカーの切断の例を説明する。 この例では、 図 1に示した例において、 開裂型リンカーとして長波長紫外線で切断可能な光閧裂 型リンカーが使用されている。
図 2の上図は、 対応付け分子が標的物質である GPCIUこ結合した状態を示す。 GP CRに結合した対応付け分子に、 光開裂型リンカーを切断する長波長紫外線を照射 すると、 図 2の下図に示すように DNAが遊離する。 実施例
以下、 具体的に本発明の実施例を記述するが、 下記の実施例は本発明について の具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、 本発明の範囲は下記の実施例 により何ら限定されるものでない。 実施例 1 光開裂型リンカーを含む対応付け分子の紫外線による切断 光開裂型リンカーを介して DNAとタンパク質が連結した分子を形成させた後、 長波長紫外線の照射'により DNAとタンパク質が切断 ·分離されることを確認した o 本実施例で用いた DNAとタンパク質とが連結した分子には、 DNAのコードするタン パク質が含まれていないが、 紫外線による切断については対応付け分子と同じ挙 動を示すと考えられるので、 本実施例では、 説明の便宜のため、 対応付け分子と 呼ぶ。 ( 1 ) 光閧裂型リンカ一を介してピオチンラベル化した DNAの調製 光開裂型リンカ一が結合したピオチン （Photocleavable Biotin：以下、 PCBと 略す） は Glen Research社から購入した。 ストレブトアビジン遺伝子の下流にァ ンジォテンシン I I遺伝子が融合した sta-atii DNA (配列番号 1 ) を錶型 DNAとし て調製した。 0.5 nMの錶型 DNA (配列番号 1 ) 、 55末端が PCBラベル化された 1 zM のプライマ一 T7F (配列番号 2 ) 、 5'末端がフルォレセイン ·ラベル化された 1 Mのプライマ一 T7R (配列番号 3 ) 、 l x Ex Taqバッファ一、 0.2 mM dNTP、 および 1.25 Uの Ex Taq DNAポリメラ一ゼ （宝酒造） を含む反応液 50〃1を用いて PCR ( 9 5°C： 1分間 （98°C： 20秒間、 62°C： 30秒間、 72°C： 30秒間） x 25サイクル- >72°C
： 1分間→4°C )を行なった。 これによりフルォレセインおよび PCBラベル化された DNA (以下、 PCBラベル化 DNAと略す） を得た。 同様に、 ネガティブコントロール として、 5'末端がピオチンラペル化されたプライマ一 T7Fを用いて、 光開裂型リ ンカーを含まないフルォレセィンおよびピオチンラベル化された DNA (以下、 ビ ォチンラベル化 DNAと略す） も調製した。
,( 2 ) 対応付け分子の形成および長波長紫外線の照射による切断
上記 PCBまたはピオチンラペル化 DNA (30 nM) とストレプトアビジン （l〃g/〃 1 ; プロメガ社） を等量ずつ混合し、 室温で 60分間インキュベートして結合させ、 タンパク質と DNAとが連結した対応付け分子を形成させた。 紫外線灯 （ハンディ 一ランプ XX- 15BLB ； Ultra- Violet Products社) を用いて 15 cmの距離から長波長 紫外線を 2.5分間、 5分間、 10分間、 および 15分間照射したサンプルを 3% シーケ ムゴールドァガロースゲルにより泳動分離し、 イメージアナライザーを用いてフ ルォレセインの蛍光を検出した。 結果を図 3に示す。 PCBラベル化された DNAを用 いた場合、 高分子量の対応付け分子として検出されていたバンド （図中の 「対応 付け分子 」 で示されている位置) が、 長波長紫外線の照射時間に依存して低分 子量のバンド (図中の 「DNA 」 で示されている位置) に移行した （レーン 1〜5) 。 —方、 光開裂型リンカ一を含まないピオチンラベル化 DNAを用いた場合では、 高 分子量から低分子量への移行は全くみられなかった （レーン 7〜11) 。 このこと から、 対応付け分子の中の光開裂型リンカ一が長波長紫外線により切断され、 対 応付け分子から遺伝子型分子である DNAが遊離されることが確認できた。 実施例 2 GPCRリガンドぺプチドを用いた対応付け分子の無細胞転写 ·翻訳系 における合成
GPCRのリガンドとして知られているアンジォテンシン 11を用いて、 対応付け分 子の形成を行なった。 9 nMの、 フルォレセインおよび PCBでラベル化された sta- a tii DNA (実施例 1で調製したもの） をゥサギ網状赤血球由来の無細胞転写 ·翻 訳系 （プロメガ社） に加え 30°Cで 90分間反応させることによりストレブトァビジ ン -アンジォテンシン I I融合タンパク質 （以下、 STA- AT IIと略す） を合成し、 このタンパク質と sta- atii MAがストレプトアビジンとピオチンの結合を介して 連結した対応付け分子を形成させた。 このサンプルを 3%シーケムゴールドアガロ ースゲルにより泳動分離し、 イメージアナライザーを用いてフルォレセィンの蛍 光を検出した。 また、 タンパク質合成阻害剤である 0.2%へパリンを加えたコント ロール実験を行なった。
図 4に、 無細胞転写 ·翻訳系により合成された STA- AT II 対応付け分子の検出 結果を示す。 タンパク質合成阻害剤であるへパリンを加えた場合、 ストレブトァ ビジン ·アンジォテンシン II融合タンパク質は合成されないため、 フルォレセィ ンおよび PCBラベル化された sta-atii DNAのバンド （図中の 「DNA→」 で示されて いる位置） のみが検出される （レーン 2) 。 一方、 へパリンを加えていない場合、 合成されたストレブトアビジン ·アンジォテンシン I I融合タンパク質が PCBラベ ル化された sta-atii DNAに結合するため、 高分子量側にシフ トしているバンド (図中の 「対応付け分子 」 で示されている位置） が検出された （レーン 1) o この結果から、 PCBラベル化された DNAを鎵型 DMとして無細胞転写 ·翻訳系で夕 ンパク質を合成することにより、 対応付け分子の形成が確認できた。 対応付け効 率 （無細胞転写 ·翻訳系に加えた全 DNAに対する対応付け分子を形成した肩 Aの割 合） は約 80%であった。 実施例 3 GPCR発現細胞を用いたリガンド濃縮実験
ヒト 'アンジォテンシン IIタイプ 1受容体 （以下、 hATIRと略す） を発現してい る CH0- K1細胞 （以下、 MT1R/CH0-K1細胞と略す) を用いて、 STA-AT I I対応付け 分子の濃縮実験を行なった。
(1) 光開裂型リンカ一を介してビォチンラベル化した DNAの調製
実施例 1と同様の方法で、 PCBラベル化された sta-atii DNA (全長 670 bp) を 得た。 また、 ネガティブコントロールとして、 アンジォテンシン IIの代わりに、 MT1Rとは結合しないバソプレツシンをコードする鎵型 DNA (配列番号 4) を用い て同様に PCRを行ない、 PCBラベル化された sta-avp DNA (全長 604 bp) を得た。
(2) 対応付け分子の形成
10 nMの、 PCBラベル化された sta-atii DNAをゥサギ網状赤血球由来の無細胞転 写 ·翻訳系に加え 30°Cで 90分間反応させることによりストレブトアビジン■アン ジォテンシン II融合タンパク質を合成し、 STA-AT II対応付け分子を形成させた。 同様にして、 10 nMの、 PCBラベル化された sta-avp DNAを鎢型としてストレブト アビジン .パソプレッシン融合夕ンパク質 (以下、 STA-AVPと略す） を合成し、 このタンパク質と sta-avp DNAからなる対応付け分子を形成させた。 これらの対 応付け分子が含まれる無細胞転写 ·翻訳系に 20〃Mビォチンを等量加えて 15分間 反応させ、 余分なビォチン結合部位をブロッキングした後、 STA-AT 11： STA-AVP = 2.4X108個： 1.2X109個 = 1： 5となるように混合して、 下記 （4) の濃縮実 験に用いた。
(3) hATIRを安定に発現する細胞株の樹立
MT1R遺伝子をクローニングするため、 ヒト胎児肝臓 cDNAラィブラリ― (慶應 大 ·井上純一郎教授より供与) 0.05 zlを、 lOxEx Taqバッファ一 5 1、 2.5 m M dNTP juU 10 Mの ATFプライマ一 (配列番号 5 ) 2.5 10〃Mの ATRプライ マ一 (配列番号 6 ) 2.5,"1、 5 Uん" 1 Ex Taq DNAポリメラーゼ 0.25 zlと混合し、 滅菌水により総容量 50〃1に調整後、 PCR (95°C： 1分間一 >(98°C： 20秒間、 55°C： 1分間、 72°C： 4分間）〉く35サイクル 4°C)を行ない、 MT1R遺伝子断片を得た。 こ の MT1R遺伝子断片を EcoRIおよび Xbalにより制限酵素処理し、 同様に処理した pE Fl/Myc-His A ( Invitrogen社) にライゲ一シヨンし、 pEFl-hATlR-MycHis (ネオ マイシン耐性） を得た。 この pEF卜 hATIR- MycHisを CH0- K1細胞へトランスフエク シヨンし、 400 g/〃l G418を加えた培地により選択を行ない、 Mycェピト一プ抗 体を用いたゥヱスタンプロッテイングにより hATlRを発現している CHO- K1細胞を 得た。
(4) 細胞を用いた結合 ·濃縮実験
まず、 細胞表面に非特異的に吸着する対応付け分子を除去するために、 以下の 前処理を行なった。 受容体を発現していない CHO- K1細胞 （以下、 Mock/CHO- K1細 胞と略す） をコンフルェントまで培養した 6 cmディッシュ内の完全培地を吸引除 去し、 Hankの平衡塩溶液 (Hank5 s Balanced Salt Solution) (以下、 HBSSと略す) 2 mlを加えてディッシュ内を洗浄した。 結合バッファ一 （100 zM GRGDS (配列番 号 7 )、 1 mg/ml超音波処理サケ精子（Sonicated Salmon Sperm) DNA、 1% BSA / 基本バヅファー） 1 mlを加えて、 室温で 15分間シヱ一力一により振とう （50 rpm) してプロヅキングを行なった。 基本バッファ一の組成は 1%プロテアーゼインヒビ 夕一カクテル、 0.5 Mスクロース、 20 mM HEPES、 pH 7.3、 HBSSである。 結合バヅ ファーを吸引除去後、 上記 （2) で調製した対応付け分子 STA-AT I I： STA-AVP = 2.4 X 108個： 1.2 X 103個およびゥサギ網状赤血球由来の転写 ·翻訳系 40 lを結 合バッファ一に加えたサンプル A 1 mlを Mock/CHO- K1細胞に加えて、 室温で 60分 間シヱ一力一により振とう （50 rpm) して前処理を行なった。
前処理後のサンプル Aを 1.5 mlチューブに移し、 2，000 rpmで 1分間遠心した上 清 1 mlを、 同様にブロッキングを行なった hATlR/CH0-Kl細胞に加えた。 結合の ため、 室温で 60分間シェーカーにより振とう （50 rpm) 後、 サンプル Aを吸引除 去した。 洗浄のため、 洗浄バッファ一 （450 mM NaCl、 10〃M GRGDS (配列番号 7 )、 100〃g/ml超音波処理サケ精子 DNA /基本バッファー） 3 mlを加えて洗浄、 吸引 除去後、 この洗浄操作を 6回行った。 溶出のため、 溶出バッファ一（100 /M GRGDS (配列番号 7 )、 0.5〃g/ml超音波処理サケ精子 DNA /基本バッファ一） 1 mlを加 えて、 ディッシュのふたをはずして氷上に置き、 長波長紫外線を実施例 1と同じ 条件で 5分間照射した。 上清を 1.5 mlチューブに回収し、 この溶出操作を 2回行つ た。 溶出後の溶液についてエタノール沈澱を行い、 乾燥させたペレットを純水 (ミリ Q水） 25 / 1に溶解した。 この溶出サンプル l j ls 100 iMのプライマー T7F および T7Rを 0.25〃1ずつ、 lO Ex Taqバッファ一 2.5 / 1、 2.5 mM dNTP 2〃1ヽ および 5 U/ l Ex Taq DNAポリメラ一ゼ 0. 125 / 1を混合し、 滅菌水により総容 量 25〃 1に調整後、 PCR ( 95°C： 1分間" ( 98°C： 20秒間、 62°C： 30秒間、 72°C： 30 秒間） X 30サイクル 72°C： 1分間 4°C)を行なった。 PCR終了後、 2 ァガロース ゲルにより電気泳動し、 DMを検出した。 ポジティブコントロールとしてサンプ ル Aの 10, 000倍希釈液を錶型として PCRを行ない、 同様に DNAを検出した。 また、 ネガティブコントロールとして hATlR/CHO- K1細胞と同様の操作を Mock/CHO- K1細 胞でも行ない、 DNAを検出した。
図 5に結果を示す。 hATIRと STA- AT II対応付け分子とが結合している場合、 長 波長紫外線を照射すると光開裂により sta- atii DNAが遊離するので 670 bpのバン ド （図中の 「sta-atii DNA→」 で示されている位置） が検出される。 hATIRと結 合しない STA-AVP対応付け分子が非特異的に吸着し溶出した場合、 sta-avp DNAの バンド （全長 604 b o 図中の 「sta- avp DNA→」 で示されている位置） が検出さ れる。 サンプル Aには対応付け分子が STA - AT I I： STA-AVP ： 1： 5の比率で含まれ ており、 これを錶型として PCRを行なった場合、 sta- atii DNAと sta- avp DNAが 1
： 5の比率で検出された （レーン 5) 。 MT1R I CH0-K1細胞を用いて実験操作を行 ない、 紫外線照射 ·光開裂による 1回目の溶出および 2回目の溶出を行なつた場合、 sta-atii DNAと sta-avp DNAは 10： 1および 4： 1の比率で検出された （レーン 1お よび 3) 。 検出された各バンドの強度を測定し、 算出した濃縮効率は約 50倍であ つた。 一方、 Mock/CHO- K1細胞を用いて実験操作を行い、 紫外線を照射 ·光開裂 による 1回目の溶出および 2回目の溶出を行なっても、 sta-atii DNAと sta- avp DN Aは予想通り検出されなかった （レーン 2および 4) 。 以上の結果から、 MT1R/CH0 - K1細胞を用いて、 長波長紫外線を照射した光開裂による溶出方法により STA - AT II対応付け分子からの sta- atii DNAが特異的に高効率で回収できることが示され た。 産業上の利用の可能性
本発明によれば、 標的物質に特異的に結合する対応付け分子を高効率でスクリ 一二ングすることができる。

Claims

請求の範囲
1 . タンパク質とそのタンパク質をコードする核酸とが、 前記核酸の塩基配 列が変化しない条件で切断可能なリンカーを介して連結されている対応付け分子。
2 . 前記リンカ一が、 長波長紫外線により切断可能なリンカ一である請求項 1記載の対応付け分子。
3 . 請求項 1または 2記載の対応付け分子からなるライブラリ一。
4 . タンパク質をコードする核酸を転写および/または翻訳したときに前記 タンパク質と前記核酸とが連結されるように構築された前記核酸を準備し、 準備 した核酸を無細胞タンパク質合成系または生細胞を用いて転写および/または翻 訳することにより、 前記タンパク質と前記核酸とを連結する対応付け分子の製造 方法において、
前記核酸を転写および Zまたは翻訳したときに、 前記タンパク質と前記核酸と が、 前記核酸の塩基配列が変化しない条件で切断可能なリンカーを介して連結さ れるように前記核酸が構築されている、 請求項 1記載の対応付け分子の製造方法。
5 . 核酸ライブラリーを構成する各核酸から請求項 4記載の製造方法により 対応付け分子を製造することを含む、 対応付け分子のライブラリーの製造方法。
6 . 核酸ライブラリーから、 標的物質と相互作用するタンパク質をコードす る核酸をスクリーニングする方法であって、
前記核酸ライブラリーから、 請求項 5記載の製造方法により対応付け分子のラ イブラリーを製造する工程、
前記対応付け分子のライブラリ一と標的物質とを混合する工程、
標的物質に結合した対応付け分子を分離する工程、
分離した対応付け分子のリンカーを、 前記核酸の塩基配列が変化しない条件で 切断して前記核酸を遊離させる工程、 および、
遊離した核酸を回収する工程
を含む前記方法。
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