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WO2004067741A1 - 転写活性化因子 - Google Patents

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WO2004067741A1
WO2004067741A1 PCT/JP2003/009165 JP0309165W WO2004067741A1 WO 2004067741 A1 WO2004067741 A1 WO 2004067741A1 JP 0309165 W JP0309165 W JP 0309165W WO 2004067741 A1 WO2004067741 A1 WO 2004067741A1
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WO
WIPO (PCT)
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gcx
amino acid
protein
gene
acid sequence
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2003/009165
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kaoru Miyamoto
Tetsuya Mizutani
Takashi Kajitani
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
Japan Science and Technology Agency
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Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science and Technology Agency filed Critical Japan Science and Technology Agency
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Priority to EP03741488A priority patent/EP1589100A4/en
Priority to CA002508340A priority patent/CA2508340A1/en
Publication of WO2004067741A1 publication Critical patent/WO2004067741A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a transcriptional activator, and more particularly, to a transcriptional activator GCX_1 that is specifically expressed in reproductive organs.
  • Conventional technology a transcriptional activator GCX_1 that is specifically expressed in reproductive organs.
  • the inventors have identified a number of ovarian genes induced by gonadotropin by focusing on the molecular mechanisms of follicular development (Biochem Biophys Res Commun 230: 518-523 (1997) J Biol Chem 275: 22512). -22519 (2000) Biol Reprod 64: 1315-1319 (2001); Biol Reprod 66: 1813-1819 (2002); Sekiguchi T et. Al., Ranscriptional regulation of epiregulin gene in the rat ovary. Endocrinology in press.
  • GIOT-1 gonadotropin-inducible ovarian transcription factor-1
  • the inventors attempted to identify a protein that interacts with GIOT-1 in the ovary in order to elucidate the physiological function of GIOT-1, and found that the transcriptional regulator 1 cofactor TIF1] 3 (transcriptional intermediary factor 1 ⁇ Proc Natl Acad Sci USA 93: 1422-1426 (2001); Mol Cell Biol 18: 5880-5887 (1998); Genes De 15: 3023-3038 (2001)) and transcriptional regulators RIC (rat homologs of human I-mfa domain containing protein, J Biol Chem 275: 4848-4857 (2000)) reported that it has a negative interaction with SGI ⁇ T-11 (Mol Endocrinol 15: 1693 -1705 (2001)).
  • TIF1 transcriptional regulator 1 cofactor
  • Ad4BP / SF-1 and DAX-1 are two transcription factors known to be expressed in reproductive tissues (Endocr Re 18: 361-377 (1997); Recent Prog Horm Res 51: 241-260 (1996) ); Mol Endocrinol 10: 1261-1272 (1996)).
  • Ad4BP / SF-I regulates many genes associated with steroid production, including steroidogenic enzymes, StAR or GIOT-1. It also plays a key role in the development of the reproductive system during embryogenesis, such as Ad4BP / SF-l.
  • DAX-1 3 ⁇ 4 is involved in the development of tissues by antagonizing the function of Ad4BP / SF-l. However, these factors are also expressed in the adrenal glands and are involved in the development of the adrenal glands, so they are not reproductive organ-specific. Problems the invention is trying to solve
  • the present invention relates to transcription factors Ad4BP / SF-1 and DAX-1 expressed in reproductive tissues (Endocr Rev 18: 361-377 (1997); Recent Prog Horm Res 51: 241-260 (1996); Mol Endocrinol 10: 1261-1272 (1996)), a new transcription factor, GCX-1, which is specific to gonads and is thought to play an important role in the hypothalamus-pituitary-gonad axis. provide. Means for solving the problem
  • GCX-1 protein is expressed only in tissues related to reproduction, that is, hypothalamus, pituitary, gonads, and offspring. They found that GCX-1 protein was localized in the nucleus. In addition, the inventors have confirmed that GCX-1 activates gene transcription using a GAL4-based heterology assay.
  • the present invention is a transcription activator comprising the following (a) or (b). (a) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a), and which has a transcription activating ability refers to the ability to activate transcription in tissues related to reproduction, such as the pituitary gland, gonad, and uterus, and can be known by a known method using a reporter gene.
  • this factor can be introduced into germline cells to activate transcription in the cells. Therefore, the present invention is a drug intended to activate transcription, comprising the transcription activation factor as an active ingredient.
  • the present invention relates to an antibody or an antagonist capable of specifically recognizing and binding to the transcriptional activator.
  • This antibody can be collected from an antibody-producing tissue such as spleen by administering the transcription activator of the present invention or an active portion thereof to a suitable animal such as a mouse to cause an immune reaction.
  • this antagonist can be used, for example, to screen for a compound capable of binding from the three-dimensional structure expected from the transcriptional activator of the present invention or its active part, or to combine with the transcriptional activator of the present invention or its active part
  • the peptide library to be bound can be obtained by screening using a two-hybrid system.
  • the present invention provides a method for examining a disease caused by an abnormality in a reproductive organ, which comprises the steps of: collecting a tissue of a reproductive organ from a subject; and examining the reactivity of the antibody or antagonist to the collected cells.
  • the reproductive system organs refer to the hypothalamus, pituitary gland, gonads, uterus, and the like
  • diseases caused by abnormal reproductive organs include infertility, polycystic follicular syndrome, endometriosis, and early puberty. Onset, osteoporosis, etc.
  • the present invention is also a screening agent for a drug aimed at activating transcription, comprising the above antibody or antagonist as an active ingredient.
  • GCX-1 a transcription activator (GCX-1) comprising the following (a) or (b):
  • a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence and having a transcription activating ability.
  • the transcription activating ability can be determined by, for example, introducing the appropriate reporter gene together with this gene into appropriate cells and examining the expression of the reporter gene by the method described in Example 5. it can.
  • genomic DNA can be isolated from leukocytes of patients and examined for abnormalities in the base sequence of GCX-1.
  • the present invention is characterized by the steps of collecting a DNA containing a portion corresponding to the above gene from a subject, and comparing the collected DNA with the nucleotide sequence of this gene. This is a method for examining diseases that occur.
  • FIG. 1 shows the deduced amino acid sequence of GCX-1 (SEQ ID NO: 1). Underlines indicate putative nuclear localization signal (NLS) sites, and bold lines indicate putative HMG-box domains.
  • FIG. 2 shows the gene expression of GCX-1 in rats.
  • FIG. 3 shows in situ fusion of GCX-1 in rat ovaries.
  • the left figure shows bright field observation, the right figure shows dark field, and the scale line shows 0.2 mm.
  • FIG. 4 shows the identification of the endogenous GCX-1 protein.
  • FIG. 5 shows that GCX-1 is a transcriptional activator. Each measurement is shown as the mean and SD from four independent transfer experiments.
  • FIG. 6 shows the determination of the cross-activation domain of GCX-1. Each measurement is shown as the mean and SD of four independent transfer experiments.
  • the present inventors isolated a novel gene, GCX-1, which is predominantly expressed in the ovary from a cDNA library of rat ovarian granule cells (Example 1).
  • the GCX-1 gene is a well-researched DNA-binding motif that encodes a protein containing the HMG-box motif that is widely distributed in all eukaryotes from yeast to mammals.
  • HMG-box is one of the DNA binding motifs widely distributed in eukaryotes from yeast to L-class L (Trends Genet 10: 94-100 (1994); Trends Biocem Sci 26: 163-174). (2001)), Many HMG-box-containing proteins contain various physiological phenomena, for example; : UBF as RA transcriptional regulator (Science 241: 1192-1197 (1988); Nature 344: 830-836 (1990)), SRY as a protein essential for sex determination (Nature 346: 240-244 (1990); Nature 346: 245-250 (1990)), TCF (Nature 374: 70-74 (1995)) and T ⁇ X (Nature Imnmol 3: 272-280 (2002)) It is known to play an important role.
  • HMG-box protein reacts with the nuclear steroid receptor and acts as a transcriptional cofactor (Mol Cell Biol 18: 4471-4487 (1998); Steroids 64: 576-). 586 (1999)). Therefore, HMG-box protein is thought to be strongly involved in the biological functions of the reproductive-endocrine system.
  • Proteins having the HMG-box motif are roughly divided into two groups according to the DNA binding mode.
  • a group of proteins such as SRY or TCF, recognize specific DNA sequences on their target genes.
  • Proteins belonging to other groups such as HMGB1, UBF, show nonspecific DNA binding ability.
  • the former protein has only one HMG-box motif, while the latter protein has White has two or more HMG-box motifs (Mol Endocrinol 10: 1261-1272 (1996); Trends Genet 10: 94-100 (1994)).
  • GCX-1 does not have a single HMG-box motif like a specific type of HMG-box protein (Example 1), but GCX-1 (the amino acid sequence in D HMG-box is non-specific. It shows low but significant similarity to the sequence of the HMG-box protein (Trends Genet 10: 94-100 (1994); Trends Biochem Sci 26: 163-174 (2001)), indicating a specific type of protein. Therefore, GCX-1 is considered to belong to a novel type of HMG-bo protein.
  • GCX-1 gene expression is restricted to the ovaries, testes, pituitary gland, and hypothalamus, indicating that GCX-1 acts on the hypothalamus-pituitary-gonad axis (Example 2) .
  • the transcription factors Ad4BP / SF-l and DAX-1 are essential for steroidogenesis and embryonic development of endocrine tissues and show a similar gene expression pattern to GCX-1 (Endocr Rev 18: 361-377 (1997); Recent Prog Horm Res 51: 241-260 (1996); Mol Endocrinol 10: 1261-1272 (1996)).
  • these genes are also expressed in the adrenal gland where GCX-1 is not expressed at all, and transcription factors expressed only in reproductive tissues are unknown to date.
  • GCX-1 western blotting reveals that the GCX-1 gene product is actually present in the nuclei of ovarian granule cells, and GFP fusion protein analysis suggests that the putative NLS motif is It was found to be essential for nuclear translocation of GCX-1 (results omitted).
  • the strength of the heterologous reporter assay based on the GAL4 fusion protein revealed that GCX-1 was a potent transcriptional activator.
  • the activation domain has a typical transcriptional activation motif such as LXXLL (Genes Dev 12: 3357-3368 (1998); Cell 108: 465-474 (2002); Endocrinology 143: 2461-2465 (2002)).
  • LXXLL transcriptional activation motif
  • the LXXLL motif is known to be required for interaction with nuclear steroid hormone receptors or nuclear activators.
  • the gene (SEQ ID NO: 2) and the gene product (SEQ ID NO: 1) of the present invention are expressed only in the reproductive system, and particularly strongly expressed in the ovaries, and may cause ovulation disorders and abnormal steroid hormone production.
  • the causes of diseases caused by abnormal reproductive organs such as infertility, polycystic follicular syndrome, endometriosis, precocious puberty, and osteoporosis Can be used for investigation and treatment.
  • the present invention will be illustrated by way of examples, but these are not intended to limit the present invention.
  • rat granulosa cells were cultured. Immature Wistar rats (21 days old) were used. Ovarian granulosa cell proliferation was stimulated by adding 2 mg of getyl stilbestrol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 0.1 ml of sesame oil and treating once a day for 4 days. At all times, animals were treated according to the National Institutes of Health guidelines. The ovaries were dissected, granulosa cells were separated by puncturing the follicles with a 26 gauge needle, and the separated granule cells were collected. Cells were washed, harvested by brief centrifugation at 500 g x 5 for 5 minutes at room temperature, and examined for viability by trypan blue staining.
  • getyl stilbestrol Sigma Chemical Co., St. Louis, MO
  • yeast fusion screening was performed.
  • a kit purchased from CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) was used for the yeast two-type fusion system. All experimental procedures were performed according to the manufacturer's instructions except where noted.
  • the parent vector for the yeast two-type fusion system the pGBKT7 vector, expresses the GAL4 DBD fusion protein in yeast.
  • the pGBKT7-GIOT-1 beta an inducible plasmid, was prepared by the method described previously (Mol Endocrinol 15: 1693-1705 (2001)).
  • AH109 cells were transformed with this derived plasmid using a high-efficiency transformation method based on TE / LiAc (see Biotechniques 24: 596-600 (1998)).
  • a plasmid cDNA library was prepared from rat granulosa cells for yeast two-type fusion screening according to a previous report (see Biol Reprod 64: 1315-1319 (2001)).
  • the yeast having PGBKT7-GIOT-1 was transformed with the library 1 to obtain about 7 ⁇ 10 6 first transformed cells. Then all The loans were screened and seven HIS3 + / ADE2 + / MEL1 + positive clones were obtained. Big Dye terminator-FS cycling system (nucleotide sequence analysis using J-Kit kit and 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Japan), and then perform identity search using GenBank DNA database. Characteristics were examined.
  • the nucleotide sequences of the four clones were highly similar to the gene encoding a known protein (Mol Endocrinol 15: 1693-1705 (2001)), while the other three clones It was found that a new protein was coded. From these three new clones, a plasmid named PACT2-GCX-1 and containing 1219-bp having an HMG-box motif was isolated. In order to carry out reentrant angle precipitation, the 758-bp ScoRI / BamHI fragment (nt-160 / 597) was subcloned into the EcoKL / Ba i site of the pBluescript II SK (+) vector (stratagene, La Jolla, 'CA). The resulting plasmid was named pBS-GCX-1.
  • the adapter was bound to the double-stranded cDNA and both ends were phosphorylated with T4 polynucleotide kinase.
  • the cDNA was ligated to an L ZAP Express phage arm (Stratagene), and Gigapack III gold (Stratagene) was used for in vitro cloning to prepare a cDNA library.
  • the cDNA library contained 1 ⁇ 10 7 independent clones.
  • lipase was used to label pBS-GTX-1 with the BcaBest DNA labeling kit (Takara Biomedicals) 758-] op ⁇ - 32 P dCTP ⁇ 3 ⁇ 4 EcoRl Screening was performed using the / BamHI fragment. Approx. 60,000 species Eleven positive clones were isolated from the cDNA clones.
  • the cDNA library was re-screened using the isolated clone as a probe to identify the gene encoding the 473 amino acid protein.
  • a complete cDNA clone was obtained (SEQ ID NO: 2).
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) was obtained from this nucleotide sequence.
  • this protein has one HMG-box motif (position 205-272 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) in the center of the protein. For that reason, we call it GCX-1 (granulosa cell HMG-box protein-1).
  • the protein has one NLS (nuclear localization signal) -like motif (positions 180-199 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) at the N-terminus of the HMG-box and a serine-rich site (amino acid of SEQ ID NO: 1). Sequence-positions 124-164), a proline-rich site (positions 348-431 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1), and a lysine-rich site (positions 180-199 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1). It also has a domain. These structural features are typical of transcriptional regulators.
  • RNA was separated by electrophoresis on a 1% denaturing agarose gel, transferred to a nylon membrane (Biodyne, ICN Biomedicals, Inc., Glen Cove, NY) and exposed to UV light. Cross-linked. ExpressHyb hybridization solution (CLONTECH) was used for prefusion and fusion. Using 32 P dCTP-labeled BamHI fragment as a probe -. Already 1 4-kpa of pBS-GCX-1 of 758- bp radiolabeled ScoRI / BaniHI fragment or rat USF-2 described (upstream stimulatory factor). Conditions for pre-fusion, fusion and washing procedures are according to the protocol obtained from the supplier. Was carried out.
  • the blot was exposed to a FUJIX video board (Fuji Photo Film).
  • the fusion signal was detected using a FUJIX BAS-2000 image analyzer.
  • RT-PCR 5 Az g of total RNA was reverse transcribed, and a part (1/100) of the reaction mixture was used for the PCR reaction.
  • primers 5'-CCCAATGAGCCACAGAAGCCA-3 '(5'-primer: nt 589/609, arrangement [J number 3]) and 5'-GGAAAGCCTGCAGGTCGGAG-3'(3'-primer: nt 936/955, sequence No. 4) was used.
  • GCX-1 act on the hypothalamus-pituitary-gonad axis.
  • FIG. 1 shows the results.
  • A is 8 S age
  • B is ovariectomized of 21 day old rats
  • C is mature (diestrus) shows those engaged fusion
  • D shows ovarian sections from 21-day-old rats fused with a sense strand cRNA probe.
  • a strong signal was detected in the follicles at the very early preantral stage, and its expression was restricted to the granulosa cell layer. Similar levels of expression were also observed in slightly advanced stages of follicles with two or more granulosa cell layers.
  • signals were also detected in the follicles at the large preantral and small follicular stages, but very low levels were observed in the large follicular follicles at the more advanced stages.
  • the signal was slightly not detected in the corpus luteum.
  • An antibody against GCX-1 was prepared to confirm endogenous GCX-1 protein in cells.
  • a GCX-1 specific rabbit heron polyclonal antiserum was prepared by IgG purification.
  • the granulosa cells were cultured under hormone-free conditions for 24 hours in 60 petri dishes containing 5 x 10 6 viable cells in 5 ml of culture solution, and the cells were collected using a scraper and washed with 10 ml of phosphate buffered saline (PBS). Washed.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the obtained cells were suspended in 1 ml of PBS, transferred into an Eppendorf tube, and solidified by centrifugation at 1500 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C.
  • a cell extract of granulosa cells was prepared according to a previous report (Nucleic Acid Res 17: 6419 (1989)).
  • the cell solids are gently pipetted in 600 ⁇ l of cold buffer A (10 mM HEPES, pH 7.9; 10 mM KC1; 10 mM mM EDTA; 0.5 mM EGTA; ImM DTT; 0.5 mM PMSF). And resuspended.
  • the cells were swelled on ice for 15 minutes, and then 37.5 ⁇ l of a 10% solution of Nonidet P-40 was added, followed by vigorous stirring for 10 seconds.
  • the obtained homogenate was centrifuged at 4 ° C. for 5 minutes at 17,000 ⁇ g.
  • the supernatant was used as the cytoplasmic fraction for protein analysis, and the nuclear solid was 40 ⁇ l of ice-cold buffer C (20 HEPES, ⁇ 7.9; 0.4 ⁇ NaCl; ImM EDTA; ImM EGTA; ImM DTT ; And ⁇ ⁇ PMSF) And the tube was shaken vigorously on a shaker at 4 for 15 minutes.
  • the mixture was centrifuged at 4 ° C.
  • Nuclear extracts from HepG2 cells expressing the GFP-GCX-1 fusion protein were made according to the same protocol. Cytoplasmic and nuclear extracts (100 g each) were electrophoresed on a 10% acrylamide gel by SDS-PAGE under reducing conditions. Proteins are electrophoretically transferred to an Iitimobilon-P nitrocellulose membrane (Millipore Co., Bedford, MZ ⁇ .) In milk buffer (PBS-T [PBS containing 0.0001% Tween-20]).
  • FIG. 4 shows the results.
  • A shows the analysis of GCX-1 specific antiserum.
  • Western blot analysis of nuclear extracts of pEGFP-C1E1-transferred (lane 1) or pEGFP-GCX-1 (-61-473) transfected (lane 2) HepG2 cells with anti-GCX-1 serum (IgG purified) was served.
  • a specific band for one GFP-GCX-1 fusion protein is shown.
  • B shows detection of endogenous GCX-1 protein in rat ovarian granulosa cells. Cytoplasmic (lane 1) and nuclear (lane 2) extracts were prepared from cultured granulosa cells, and Western plot analysis was performed using the same antiserum. One GCX-1 specific band is shown.
  • the polyclonal antibody effectively recognized the GFP-GCX-1 protein (lane 2).
  • Immunoreactive GCX-1 is detected only in nuclear extracts of rat granulosa cells (Fig. 4B, lane 2), but in the cytoplasmic fraction (Fig. 4B, lane 1). Not detected.
  • Example 5
  • GCX-1 is a nuclear protein and has HMG-box, one of the typical motifs for transcription factors, the transcriptional activity of GCX-1 was examined.
  • GCX-1 transcriptional ability confirmed, as the target gene for GCX-1 protein is not yet known
  • a non-homologous luciferase reporter system based on GAL4 was used. HepG2 cells were co-transfected with lRL-CMV lng and 5X GAL4-Elb / Luc firefly / Res luciferase reporter plasmid or pGL3-basic reporter plasmid lOOng. The amount of pSG-GCX-1 (-61-473) described in FIG. 5 was similarly transferred into the cells. PSG424 expressing only GAL4 DBD was added to certain samples so that each sample contained an equal amount of DNA.
  • FIG. 5 shows the results. Expression of the DBD-GCX-1 fusion protein greatly enhanced reporter luciferase activity. Addition of 0.1 ng of the GCX-1 plasmid caused an approximately 25-fold induction of luciferase activity, and 1 ng of the plasmid caused an approximately 100-fold induction. On the other hand, when a reporter plasmid having no GAL4 binding sequence was used in place of 5X GAL4-Elb / Luc, no induction was observed even by simultaneous transfer of the GCX-1 plasmid.
  • GCX-1 mutual activation domain was then examined.
  • Various plasmid constructs having GAL4 DBD-GCX-1 deficient mutation were prepared, and pRL-CMV lng, 5X GAL4-Elb / Luc reporter plasmid lOOng and pSG-GCX-1 deficient mutant lng were transferred to HepG2 cells.
  • Fig. 6 shows the results.
  • the site between 25-63 amino acid residues from the N-terminal was proved to be essential for the transcriptional activity of GCX-1. This site does not contain the typical transcriptional activation motifs reported to date.

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Abstract

生殖組織に特異的であり、視床下部−下垂体−生殖腺軸中で重要な役割を有していると考えられる新規な転写因子GCX-1を提供する。　卵巣中に卓越して発現している新規遺伝子GCX-1（配列番号２）をラットの卵巣顆粒細胞のcDNAライブラリーから単離した。この遺伝子及び遺伝子産物（配列番号１）の異常あるいは産生異常を調べたり、この転写活性化領域に作用する薬剤を開発すれば、不妊症、多のう胞性卵胞症候群、子宮内膜症、思春期早発症、骨粗しょう症等の生殖系器官の異常に起因する疾患の原因究明と治療が可能である。

Description

明 細 書 転写活性化因子 技術分野
この発明は、 転写活性化因子に関し、 より詳細には、 生殖系器官に特異的に発 現する転写活性化因子 GCX_ 1に関する。 従来技術
卵巣における特定の現象、 即ち卵胞形成、 又はステロイド産生のような 現象はその組織における遺伝子発現に完全に依存している。 卵巣における機能と 遺伝子の関係を解明するために多くの研究が行われてきた （Endocr Rev 15 ： 725-751 (1994)； Mol Cell Endocrinol 163: 61-66 (2000) Endocrinology 142： 2184-2193 (2001)； rends Endocrinol Me tab 13： 1 69-173 (2002) Biol Reprod 67: 900-910 (2002))。
発明者らは、 卵胞発育の分子的メカニズムに焦点を当てて、 ゴナドトロピンに より誘導される多くの卵巣の遺伝子を同定した （Biochem Biophys Res Commun 230: 518-523 (1997) J Biol Chem 275: 22512-22519 (2000) Biol Reprod 64: 1315-1319 (2001)； Biol Reprod 66: 1813-1819 (2002)； Sekiguchi T et. al . , ranscriptional regulation of epiregulin gene in the rat ovary. Endocrinology in press . )。 ゴナドトロピン処置によりラットの卵巣中に強く誘導される新規の転写抑制因子 を 最 近 報 告 し 、 GIOT - 1 ( gonadotropin-inducible ovarian transcription factor- 1) と命名した (Mol Endocrinol 15: 1693-1705 (2001))。 次いで、 発明者らは GIOT - 1 の生理学的機能を明らかにするために、 卵巣において GIOT- 1と相互作用を示す蛋白を同定する試みを行レヽ、転写性の調 節 1 助因子 TIF1]3 (transcriptional intermediary factor 1 β Proc Natl Acad Sci USA 93: 1422 - 1426 (2001)； Mol Cell Biol 18: 5880-5887 (1998)； Genes De 15: 3023-3038 (2001)) と転写調節因子 RIC (rat homo logs of human I-mfa domain containing protein, J Biol Chem 275 : 4848-4857 (2000) ) 力 S GI〇T一 1 とネ目互作用を示すことを 報告した （Mol Endocrinol 15 : 1693-1705 ( 2001 ) )。
生殖組織中に発現することが知られている転写因子として Ad4BP/SF - 1 と DAX-1力 Sある (Endocr Re 18 : 361-377 ( 1997 )； Recent Prog Horm Res 51 : 241-260 ( 1996)； Mol Endocrinol 10 : 1261-1272 ( 1996) )。 Ad4BP/SF-lは、 ステロイド産生酵素、 StAR又は GIOT-1などを含むステロイ ド産生と関連する多くの遺伝子を調節してる。 また胚形成中の生殖システムの発 育【こお ヽて、 Ad4BP/SF-l ίま重要な役害 ljを演じてレヽる。 DAX-1 ¾ Ad4BP/SF-l の機能と拮抗することによりその組織の発育に関与している。 しかし、 これらの 因子は副腎腺中にも発現しており、 副腎腺の発育にも関与しているため、 生殖系 器官特異的ではない。 発明が解決しょうとする課題
本発明は、 生殖組織中に発現する転写因子である Ad4BP/SF- 1 や DAX - 1 (Endocr Rev 18： 361-377 (1997 )； Recent Prog Horm Res 51 : 241-260 ( 1996)； Mol Endocrinol 10 : 1261-1272 (1996) ) とは異なり、 生殖耝 織に特異的であり、 視床下部一下垂体一生殖腺軸中で重要な役割を有していると 考えられる新規な転写因子 GCX- 1を提供する。 課題を解決するための手段
発明者らは、 生殖組織における転写因子の研究 （Mol Endocrinol 15 : 1693-1705 (2001 ) ) の過程において、 ラットの卵巣顆检膜細胞 cDNAライブラ リーから、 HMG- box ドメインを含有する転写因子様蛋白をコード化する新規のク ローンを単離した。 発明者らは、 この新規遺伝子 GCX-1 (agranulosa cell HMG-box protein - 1、 配列番号 2 ) を単離し、 GCX-1の構造と分布を決定し、 GCX-1の生殖系、特に卵巣における役割を解明するために、その遺伝子の機能を 解析した。 また GCX- 1 の発現パターンについて実験し、 GCX- 1蛋白は生殖と関 連する組織、 即ち、 視床下部、 下垂体、 生殖腺、 子宫においてのみ発現している ことを見出し、 更に GCX-1 蛋白が核内に局在していることを見出した。 更に発 明者らは GAL4を基本とする非相同性検定法を用いて、 GCX - 1が遺伝子転写を活 性化することを確認した。
即ち、 本発明は、 以下の （a ) 又は （b ) から成る転写活性化因子である。 ( a ) 配列番号 1のアミノ酸配列から成るタンパク質
( b ) アミノ酸配列 ( a ) において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若し くは付加されたァミノ酸配列から成り、 転写活性化能を有するタンパク質 この転写活性化能は視床下部、 下垂体、 生殖腺、 子宮などの生殖に関連する組 織における転写活性化能をいい、 レポーター遺伝子を用いた公知の方法により知 ることができる。
また、 遺伝子治療の目的で、 この因子を生殖系細胞に導入し、 細胞内での転写 を活性化することができる。 従って、 本発明は、 この転写活性化因子を有効成分 とする、 転写活性化を目的とする薬剤である。
更に、 本発明は、 この転写活性化因子を特異的に認識し結合することができる 抗体又はアンタゴュストである。
この抗体は、 本発明の転写活性化因子又はその活性部分をマウスなどの適当な 動物に投与して、 免疫反応を起こさせ、 脾臓などの抗体産生組織から採取するこ とができる。
また、 このアンタゴュストは、 例えば、 本発明の転写活性化因子又はその活性 部分から予想される立体構造から、結合可能な化合物をスクリーニングすること、 又は、 本 明の転写活性化因子又はその活性部分と結合するぺプチドライブラリ 一を 2ハイプリッドシステムを用いてスクリーニングすることにより、 取得する ことができる。
また、 このアミノ酸配列を認識する抗体を作成し、 患者の卵巣顆粒膜細胞 （こ れは体外受精の治療の際に卵とともに採取されてくるので利用可能） での量を調 ベることにより、 GCX-1の産生異常を知ることができる。
即ち、 本発明は、 被検者から生殖系器官の組織を採取する段階、 及び採取した 細胞に対する上記抗体又はアンタゴニストの反応性を調べる段階から成る、 生殖 系器官の異常に起因する疾患の検査方法である。 ここで生殖系器官とは視床下部、 下垂体、 生殖腺、 子宮などをいい、 生殖系器 官の異常に起因する疾患とは、 不妊症、 多のう胞性卵胞症候群、 子宮内膜症、 思 春期早発症、 骨粗しょう症等をいう。
また、 本発明は上記抗体又はアンタゴニストを有効成分とする、 転写活性化を 目的とする薬剤のスクリーニング剤である。
更に、 本発明は、 以下の （a ) 又は （b ) から成る転写活性化因子 （GCX - 1) の遺伝子である。
( a ) 配列番号 2の塩基配列から成る D NA
( b ) 配列番号 1のァミノ酸配列から成るタンパク質、 又は該ァミノ酸配列にお いて 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列か ら成り転写活性化能を有するタンパク質をコードする D N A · この転写活性化能は、 例えば、 実施例 5に記載した方法により、 この遺伝子と 共に適当なレポーター遺伝子を適当な細胞に導入して該レポーター遺伝子の発現 を調べることにより知ることができる。
また、 患者の白血球からゲノム DNAを分離し、 GCX- 1 の塩基配列に異常があ るかどうかを調べることができる。
即ち、 本発明は、 被検者から上記遺伝子に相当する部分を含む D NAを採取す る段階、 及び採取した D N Aをこの遺伝子の塩基配列と比較する段階から成る、 生殖系器官の異常に起因する疾患の検査方法である。 図面の簡単な説明
第 1図は、 GCX - 1の推定アミノ酸配列 （配列番号 1 ) を示す。 下線は推定上の 核局在信号 （NLS) 部位を示し、 太線は推定上の HMG-box ドメインを示す。 第 2図は、 ラットにおける GCX- 1の遺伝子発現を示す。
第 3図は、 ラット卵巣中の GCX- 1の in situ融合化を示す。 左図は明視野観 察、 右図は暗視野を示し、 目盛り線は 0 . 2mmを示す。
第 4図は、 内因性 GCX- 1蛋白の同定を示す。
第 5図は、 GCX-1は転写活性化因子であることを示す。 各測定値は、 4回の独 立した移入実験における平均値と SDで示す。 第 6図は、 GCX-1の相互活性化ドメィンの決定を示す。 各測定値は 4回の独立 した移入実験における平均値とその SDで示している。 発明の実施の形態
本発明者らは、 卵巣中に卓越して発現している新規遺伝子 GCX-1 をラットの 卵巣顆粒細胞の CDNAライブラリ一から単離した（実施例 1 )。 GCX-1遺伝子は、 既によく研究されている DNA結合モチーフの一種であり、酵母から哺乳類まで全 ての真核生物に広く分布している HMG- box モチーフを含む蛋白をコードしてい る。
HMG-boxは酵母から哺孚 L類まで真核生物に広く分布している DNA結合モチー フの一つであり （Trends Genet 10: 94-100 (1994)； Trends Bioc em Sci 26: 163-174 (2001))、 多くの HMG-box含有蛋白は、 各種の生理学的現象、 例えば;！: R A転写調節因子としての UBF (Science 241: 1192-1197 (1988)； Nature 344: 830-836 (1990))、 性決定に必須の蛋白としての SRY (Nature 346: 240-244 (1990)； Nature 346: 245-250 (1990))、 T糸则包分匕調節 因子としての TCF (Nature 374: 70— 74 (1995) ) と T〇X (Nature Imnmol 3: 272-280 (2002)) などの重要な役割を演じていることが知られている。 更 に、 ある種の HMG- box含有蛋白が転写調節物質としてではなく、 細胞内の信号 伝達物質として機能していることが最近報告された （Science 1999 285: 248-251 (1999)； J Exp Med 1 92: 565-570 (2000)； Nature 418:
191-195 (2002))。 加えて、 HMG- box蛋白が核のステロイ ドホルモン受容体と 反応し、 転写捕助因子として作用することが報告されてきた （Mol Cell Biol 18: 4471-4487 (1998)； Steroids 64: 576-586 (1999))。 そのために、 HMG-box 蛋白は生殖一内分泌系の生物学的機能に強く関与していると考えられ る。
HMG-box モチ フを有する蛋白は、 DNA結合様式により大まかに 2群に分け られる。 SRY又は TCFのような 1群の蛋白はそれらの標的遺伝子上の特定の DNA 配列を認識する。 HMGB1、 UBFなどの他の群に所属する蛋白は、 非特異的 DNA結 合能を示す。 前者の蛋白は 1個の HMG-box モチーフのみを有するが、 後者の蛋 白は 2個又はそれ以上の HMG-box モチーフを有している （Mol Endocrinol 10: 1261-1272 (1996)； Trends Genet 10: 94-100 (1994))。
GCX-1は特定のタイプの HMG- box蛋白のように 1個の HMG- boxモチーフし 力持たないが （実施例 1)、 GCX-1 (D HMG-box内のアミノ酸配列は、非特異的タ イブの HMG - box蛋白（Trends Genet 10: 94- 100 (1994)； Trends Biochem Sci 26: 163-174 (2001)) の配列と低いが有意な類似性を示しており、 特異 的タイプの蛋白とは明らかに類似性がない。 それ故に、 GCX- 1 は新規タイプの HMG-bo 蛋白に属すると考えられる。
GCX-1の遺伝子発現は、 卵巣、 睾丸、 下垂体、 視床下部に限定されていること 力 ら、 GCX-1は視床下部一下垂体一生殖腺軸で作用していると考えられる （実施 例 2)。 同様に転写因子である Ad4BP/SF-l と DAX-1 はステロイド産生と内分 泌組織の胚発育に必須であり、 GCX-1 と類似した遺伝子発現パターンを示す (Endocr Rev 18: 361-377 (1997)； Recent Prog Horm Res 51： 241-260 (1996)； Mol Endocrinol 10: 1261-1272 (1996))。 し力、し、 これらの遺 伝子は、 GCX-1が全く発現していない副腎腺でも発現しており、生殖組織中での み発現している転写因子は今までに知られていなレ、。 一方、 P450 ァロマターゼ (Endocr Re 15: 342-355 (1994)) と I型 17/3—ヒドロキシステロィド脱 水素酵素をコード化する遺伝子 （Mol Cell Endocrinol 171: 71-76 (2001)； Endocr Re 18: 281-305 (1997)) は生殖組織中にのみ発現していることが 知られているが、 これらは下垂体中では発現していなレ、。 それ故に、 GCX- 1は視 床下部一下垂体一生殖腺システムにおいて重要な役割を演じていると考えられる。 in situ融合研究により GCX- 1の遺伝子発現はステロイド産生活性が未だ非 常に低い、 早期段階の卵胞の顆粒細胞に限定していることが明らかになった （実 施例 3)。 そして、 GCX-1 の遺伝子発現が他のステロイド産生組織である副腎腺 又は胎盤では見られなかったという所見は、 GCX-1がステロイドホルモンの生合 成において重要な役割をしていないことを示唆している。 むしろ、 それは生殖組 織の胚発育又は早期段階の卵胞の成長と発育においてある役割を演じていると考 えられる。 早期段階の卵胞における現象はゴナドトロピン刺激に依存していない と思われている。 顆粒膜細胞中においてゴナドトロピンにより GCX-1 の誘導が ないという所見は、 上の推測と一致していると考えられる。
GCX-1 のウェスターンブロッテイング角 斤により、 GCX- 1 遺伝子産物は卵巣 の顆粒細胞の核内に実際に存在していることが明らかになり、 GFP融合蛋白解析 により、 推定上の NLSモチーフは GCX- 1の核内転座に必須であることが明らか となった （結果は省略する。）。 力 [[えて、 GAL4 融合蛋白を基本とする非相同性レ ポーター検定法により、 GCX-1は強力な転写活性化因子であることが明らかとな つた。 これらのデ タは GCX— 1は生殖組織中で転写活性化因子として作用する ことを示唆している。 GCX-1の活性ィヒドメインを N末端から 25-63個の残基間 の部位であることを示した。 GCX - 1は夫々セリン、 プロリン、 リジン残基が豊富 な部位も有している力 これらの部位は転写活性には不要であった。 活性化ドメ インは LXXLL のような典型的な転写活性化モチーフ （Genes Dev 12 : 3357-3368 ( 1998 )； Cell 108 : 465-474 ( 2002 )； Endocrinology 143 : 2461-2465 (2002 ) ) を有していないが、 その部位は疎水性アミノ酸残基が豊富 で且つ LXXLL様の配列を有している。 LXXLLモチーフは核のステロイドホルモ ン受容体又は核内の相互活性化因子との相互作用に必要であることが知られてい る。 し力 し、 発明者らは GCX-1 活性化ドメインと数種の既知の相互活性化因子 間での相互作用を確認できなかった （データは示さない。）。 位置特定変異解析の 結果から、 発明者らは、 完全な活性を示すためには GCX - 1 活性化ドメインの全 体構造が必要であるに違いないと結論した。 GCX-1活性化ドメインの二次又は三 次構造に関する情報はほとんどないが、 上記の所見は GCX - 1 活性化ドメインは 新規タイプの相互活性化ドメィンであることを示している。 発明の効果
本発明の遺伝子 （配列番号 2 ) 及び遺伝子産物 （配列番号 1 ) は生殖系のみに 発現しており、 特に卵巣で強く発現するため、 排卵障害やステロイドホルモン産 生異常の原因ともなりうること力 ら、 この遺伝子の異常あるいは産生異常を調べ ることにより、 不妊症、 多のう胞性卵胞症候群、 子宮内膜症、 思春期早発症、 骨 粗しょう症等の生殖系器官の異常に起因する疾患の原因究明と治療に利用できる。 またアミノ酸配列 （配列番号 1 ) 中の転写活性化領域に作用する薬剤を開発す れば、 それは上記疾患の治療薬となる。 以下、 実施例により本発明を例証するが、 これらは本発明を制限することを意 図したものではない。 実施例 1
まず、 ラット顆粒膜細胞を培養した。 未成熟の Wistarラット （21 日齢） を 使用した。 ごま油 0 . 1ml中にジェチルスチルベストロール （Sigma Chemical Co . , St . Louis, MO) 2mgを加え、 1 日 1回、 4 日間処置することにより卵 巣顆粒膜細胞の増殖を刺激した。 常時、 国立衛生研究所のガイドラインに従って 動物を処置した。卵巣を切開し、 26ゲージの針を用いて卵胞を穿刺することによ り顆粒膜細胞を分離し、 分離した顆粒細胞を集めた。 細胞を洗浄し、 室温、 5分 間 500gX 5 の簡単な遠心により細胞を採取し、 トリパンブルー染色により生存 性を調べた。細胞生存率は 90%以上であった。その後、顆粒膜細胞をコラーゲン 処理したプレート上に抗生物質と 0 . 1%BSAを添加した Ham F-12： Dulbecco の修正 Eagle培地 （1 : 1， V:V) 中に入れ、炭酸ガス 5%と空気 95%を含む加湿 混合ガス内で 37°C下で培養した。
次に、 酵母 2種融合スクリーニングを行った。 酵母 2 種融合システムには CLONTECH Laboratories , Inc . (Palo Alto, CA) 力 ら購入したキットを 用いた。 全ての実験手順は、 特記した以外は製造元の指示書に従って実施した。 酵母 2 種融合システムのための親ベクターである pGBKT7ベクターは酵母内で GAL4 DBD融合蛋白を発現する。 誘導プラスミドである pGBKT7- GIOT-1ベタタ 一は以前記述した方法 (Mol Endocrinol 15 : 1693-1705 (2001 ) ) により 作製した。 TE/Li〇Ac を基本とした高効率形質転換法 （Biotechniques 24 : 596-600 ( 1998 ) 参照） を用いて、 この誘導プラスミドにより AH109細胞を形 質転換させた。酵母 2種融合スクリーニングのためにラット顆粒膜細胞からブラ スミド cDNAライブラリーを、 既報 (Biol Reprod 64 : 1315-1319 ( 2001 ) 参照） に従って、 作製した。 PGBKT7-GIOT- 1を有する酵母をライブラリ一によ り形質転換し、 約 7 X 106個の最初の形質転換した細胞を得た。 次いで全てのク ローンをスクリーニングし、 7種の HIS3+/ADE2+/MEL1+陽性クローンを得た。 Big Dyeターミネータ一 FSサイクノレ配歹 [J化キットと 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Japan) を用いてヌクレオチド配列解析を行い、 次い で GenBank DNAデータベースを用いて同一性検索を行うことにより全てのク口 ーンの特徴を調べた。 データベースを用いた検索により、 4種のクローンのヌク レオチド配列は既知の蛋白をコード化する遺伝子 （Mol Endocrinol 15 : 1693-1705 (2001 ) ) と高い類似性を有し、 他の 3種クローンは新規の蛋白を コードィ匕することが判明した。 この 3種の新規クローンから、 PACT2- GCX- 1と 名付けられ、 HMG- boxモチーフを有する 1219 - bpを含むプラスミドを単離した。 更こ角旱析を行うため こ、 758— bp ScoRI/BamHI 断片 （nt— 160/597 ) を pBluescript II SK ( + ) ベクター ( stratagene , La Jolla , ' CA) の EcoKL/Ba i 部位へサブクローニングし、 得られたプラスミドを pBS- GCX-1 と命名した。
次に、 λ -ファージ CDNAライブラリ一の作製と全酉己歹 (I GCX-1 CDNAのクロー ニング 行つた。 TRIzol 薬 (invitrogen, Groningen, Netherlands) を用レヽ飞、 ヒッシ FSH (National Hormone and Pituitary Distribution Program, Bethesda, MD) 30ng/mlを 3時間処置して、顆粒膜細胞力 ら全匪 を作製した。 oligotex dT-30 super (Roche Molecular Biochemicals , Indianapolis , IN) を用いて poly (A) +- RNAを単離した。 oligo-dTをプラ イマ一とし、 cDNA合成システムと Superscript II (invitrogen) を用いて 15 の poly (A) + - RNAから cDNAを合成した。
Figure imgf000010_0001
アダプターを二 本鎮 CDNAに結合させ、両端を T4ポリヌクレオチドキナーゼにより燐酸化した。 その cDNA を L ZAP Express ファージアーム （Stratagene) に結合させ、 Gigapack III gold (Stratagene) を用レヽて in i t oで包括することによ り、 cDNAライブラリ を作製した。 その cDNAライブラリ一は 1 X 107個の独立 したクローンを含んでいた。
GCX-1に対応する全配列 CDNAを単離するために、ライプラリ一を BcaBest DNA 標識キット（宝バイオメディカルス）により標識された pBS- GTX-1の 758 -] op α -32 P dCTP ί¾ EcoRl/BamHI断片を用いてスクリーニングした。約 60 , 000種 の cDNAクローンから 11種の陽性のクローンを単離した。
この蛋白をコード化する完全な cDNAクローンを単離するために、 単離クロー ンをプローブとして用いることによりその CDNAライプラリーを再ぴスクリー二 ングし、 473個のアミノ酸の蛋白をコード化する遺伝子の完全な cDNAクローン を得た （配列番号 2 )。 この塩基配列からアミノ酸配列 （配列番号 1 ) を得た。 第 1図に示すように、 この蛋白は蛋白中心部に 1個の HMG-boxモチーフ （配 列番号 1のアミノ酸配列の 205-272位） を有している。 そのために、 発明者ら はそれを GCX- 1 (granulosa cell HMG-box protein - 1) と呼ぶ。 その蛋白 は HMG - boxの N末端に 1個の NLS (nuclear localization signal) 様モ チーフ（配列番号 1のァミノ酸配列の 180-199位） と夫々セリン高含有部位（配 列番号 1のァミノ酸配列の 124-164位)、 プロリン高含有部位（配列番号 1のァ ミノ酸配列の 348-431 位)、 リジン高含有部位 （配列番号 1のアミノ酸配列の 180-199位） から成る 3個のドメインも有している。 これらの構造的特徴は転 写調節因子に典型的なものである。 実施例 2
GCX-1 の組織分存を調べるために、 21 日齢のラットの各種の組織について RT-PCRを行い、 ノーザンブロット解析を行った。
21 齢の雌ラットを PMSG (帝国臓器株式会社） 30IU又は hCG (三共株式会 社） 50IU で感作し、 卵巣を記述した時間に採取した。 未成熟雌ラットの各種組 織 （視床下部、 下垂体、 小脳、 副腎腺、 腎臓、脾臓、 腸管、 肝臓、 子宮及び卵巣） と未成熟雄ラットの睾丸から、 TRIzol試薬を用いて全 RNAを抽出した。 ノーザ ンプロット解析のために、 10 // gの全 RNAを 1%変性ァガロースゲル上で電気泳 動により分離し、ナイロン膜（Biodyne, ICN Biomedicals , Inc . , Glen Cove, NY) に移し、 UV 照射により交差結合させた。 前融合と融合を行うために、 ExpressHybハイブリダィゼーシヨン液 （CLONTECH) を用いた。 既に記述した pBS-GCX-1の 758- bp放射線標識 ScoRI/BaniHI断片又はラット USF-2 (上流 刺激因子） の 1 . 4-k p a -32P dCTP標識 BamHI断片をプローブとして使用し た。 前融合、 融合及び洗浄法に関する条件は、 提供者から得たプロトコールに従 つて実施した。 ブロットを FUJIX 映像板 （富士写真フィルム） に曝露した。 融 合信号を FUJIX BAS-2000画像解析装置を用いて検出した。 RT- PCRを行うた めに、 5Azgの全 RNAを逆転写し、 反応混合液の一部 （1/100) を PCR反応に使 用した。 プライマーとして 5'-CCCAATGAGCCACAGAAGCCA- 3' (5'—プライマ 一： nt 589/609、 配歹【J番号 3 )と 5' - GGAAAGCCTGCAGGTCGGAG - 3' (3' -プラ イマ一： nt 936/955,配列番号 4 )を用いた。反応条件として、 FastStart Taq DNA Polymerase (Roche) を用いて 20秒間 94°Cで変性、 30秒間 55。Cでァニ ールし、 45秒間 72°Cで伸展する操作を 30回行った。 1.5%ァガロースゲル上で PCR産物 ΙΟμΙを電気泳動し、 次いで臭化工チジゥム （EtBr) 染色により可視 化した。 その結果を第 2図に示す。
GCX-1 遺伝子の発現は、 視床下部（hypothalamus), 下垂体（pituitary)、 睾丸（testis)、 子宫（uterus)及ぴ卵巣（ovary)などの、 の限定された組織中 において検出された。 GCX-1 の発現は卵巣中で最も高かったが、 副腎腺 (adrenal) と胎盤 （データは示していない） 中では発現が見られなかった。 こ のことは、 GCX-1は視床下部一下垂体一生殖腺軸上で作用していることを強く示 唆している。 実施例 3
in situ融合法により卵胞発育の各段階での GCX- 1の発現について調べた。 アンチセンスプローブ作製のために、 £coRIにより直線化された pBS- GC - 1 を in vi troで T3 RNAポリメラーゼ （Roche) と α - 35S CTPにより転写した。 T7RNAポリメラーゼ (Roche) と Qi-35S CTPを用いて BaifiHI分角旱 pBS—GCX - 1 力 らセンスプローブを転写した。 次に、 ラット卵巣を铸型にはめ込み、 ドライア イス中で凍結した。 12〜14μιτιの厚さの切片をクリオスタツトで作製し、 in situ j¾合のために APSをコートしたスライドグラス上に包埋した。融合前に切片をプ ロティナーゼ Kを処置し、 ァセチノレ化した。 35S標識 CR Aプロープとの融合は 60°Cで 6 時間行い、 切片を高ストリンジエンシーで洗浄し、 NTB3 乳化剤 (Eastman Kodak Co., Rochester, NY) を用いてオートラジオグラフ解析 を行った。 その結果を第 3図に示す。 Aは 8 S齢、 Bは 21 日齢、 Cは成熟 （発情間期） のラットの卵巣を摘出し、 GCX-1の35 S標識アンチセンス鎖 cRNAプロープと融 合させたものを示す。 Dは、 21 日齢ラットの卵巣の切片をセンス鎖 cRNAプロ一 ブと融合させたものを示す。
第 3図の Aに示すように、 非常に早期の前胞状段階の卵胞において強い信号が 検出され、 その発現は顆粒膜細胞層に限定していた。 同様レベルの発現は 2又は それ以上の顆粒膜細胞層を有する僅かに進行した段階の卵胞でも観察された。 第 3図の Bに示すように、 大型前胞状と小型胞状段階の卵胞においてもその信号が 検出されたが、 更に進行した段階の大型胞状卵胞では非常に低レベルの発現が観 察された。 更に、 第 3図の Cに示すように、 その信号は黄体中では僅かし力検出 されなかった。 これらの所見は、 GCX-1遺伝子発現は早期の発育段階の卵胞中の 未分化顆粒膜細胞に限定されていることを示している。 実施例 4
GCX - 1に対する抗体を作製して、 細胞中の内因性 GCX-1蛋白を確認した。
NH2-SLLHLGDHEAGYHSLC-C02Hぺプチド配列 （配列番号 1のァ ^ノ酸配歹 IJの 39-5 位） を用い、 IgG精製により GCX-1特異的ゥサギポリクローナル抗血清 を作製した。 顆粒膜細胞を培養液 5ml中に 5 X 106生細胞を含む 60謹シャーレ 中で無ホルモン条件下で 24 時間培養し、 細胞をスクレーパーを用いて集め、 燐 酸緩衝食塩液（PBS) 10mlで洗浄した。得られた細胞を 1mlの PBS中に懸濁し、 エツペンドルフ管内へ移し、 4°C下で 1500 X g、 10分間の遠心により、 固形化し た。 既報 (Nucleic Acid Res 17 : 6419 ( 1989 ) ) に従って、 顆粒膜細胞の 細胞抽出物を作製した。 細胞固型物を 600 μ ΐ の冷却緩衝液 A (lOmM HEPES , pH7 . 9； l OmM KC1； lmM EDTA； 0 . 5mM EGTA； ImM DTT；及ぴ 0 . 5應 PMSF) 中で静かにピぺット処理することにより再懸濁した。 細胞を 15分間氷の上で膨 張させ、 その後、 Nonidet P-40 10%液 37 . 5 μ 1を加え、 10秒間強く撹拌し た。 得られたホモジネートを 4°C下で 5分間、 17000 X gで遠心した。 上清を蛋 白分析のための細胞質分画として用い、核固型物を 40 μ 1の氷冷緩衝液 C (20 HEPES, ρΗ7 . 9； 0 . 4Μ NaCl； ImM EDTA； ImM EGTA； ImM DTT；及ぴ ΙκιΜ PMSF) 中に再懸濁し、試験管を振盪台上で 4で 15分間強く振盪した。 その混合液を 4°C 下で 15分間 17000 X gで遠心し、 得られた上清を核分画として蛋白分析に使用 した。 GFP-GCX-1融合蛋白を発現している HepG2細胞から採取した核抽出物を 同じプロトコールに従って作製した。 細胞質と核抽出物 （各 100 ^ g) を還元条 件下で 10%ァクリルアミドゲル上で SDS-PAGEにより電気泳動を行った。 蛋白 を Iitimobilon-P ニトロセルロース膜 (Millipore Co . , Bedford, MZ\.) の 方へ電気泳動により移動させ、 ミルク緩衝液 （PBS-T [ 0 . 0001%の Tween-20を 含有する PBS ]中に 5%のスキムミルク添加） と、 室温中で 1時間、 ミルク緩衝 液中の IgG純ィ匕 GCX-1抗体 (0 . 019 z g/ml) とインキュベートすることにより ブロッキングを行った。 膜を PBS- T を用いて洗浄し、 ECL- Plus キット (Amercham Biosciences Co . , Piscataway, Nj; を用いて、 製造兀の 3¾ 示書に従って免疫反応性の GCX- 1蛋白を検出した。
その結果を第 4図に示す。 図中、 Aは GCX- 1 特異的抗血清の解析を示す。 pEGFP - C1E1 -移入 (lane 1) 又は pEGFP- GCX - 1 (-61-473) 移入 (lane 2) HepG2細胞の核抽出物を抗 GCX-1血清 （IgG精製を行った） によるウェスター ンブロット解析に供した。 1本の GFP-GCX- 1融合蛋白に対する特異的バンドが 示されている。 Bは、 ラット卵巣の顆粒膜細胞における内因性 GCX-1 蛋白の検 出を示す。 培養顆粒膜細胞から細胞質 （lane 1) と核 （lane 2) 抽出物を作製 し、同じ抗血清を用いてウェスターンプロット解析を行った。 1本の GCX-1特異 的バンドが示されている。
第 4図の Aに示すようにポリクローナル抗体は効果的に GFP-GCX-1蛋白（lane 2) を認識した。 免疫反応性の GCX-1はラットの顆粒膜細胞の核抽出物中 （第 4 図の B、 lane 2) でのみ検出されるが、 細胞質分画中 （第 4図の B、 lane 1) では検出されない。 実施例 5
GCX-1は核内蛋白であり、 転写因子に典型的なモチーフの 1種である HMG-box を有していることから、 GCX- 1の転写活性について調べた。
GCX-1 蛋白の標的遺伝子が未だ不明であることから、 GCX - 1 の転写能を確認 するために GAL4を基本とする非相同性ルシフエラーゼレポーターシステムを用 いた。 pRL-CMV lngと 5 X GAL4- Elb/Lucホタ /レズレシフェラーゼレポータープ ラスミド又は pGL3-基本レポータープラスミド l OOngを HepG2細胞に同時移入 した。 第 5図に記述した量の pSG-GCX-1 (-61-473) を同様に細胞内へ移入し た。 各試料中に等量の DNAを含むように GAL4 DBDのみを発現する pSG424を ある試料中へ添加した。
その結果を第 5図に示す。 DBD-GCX-1 融合蛋白の発現はレポ一タール シフェラーゼ活性を大きく増強させた。 GCX-1プラスミド 0 . lngを添加すると、 約 25倍のルシフェラーゼ活性の誘導を起こし、 lngのプラスミドは約 100倍の 誘導を起こした。 一方、 GAL4 結合配列を有しないレポータープラスミドを 5 X GAL4-Elb/Lucの代わりに用いると、 GCX-1 プラスミドの同時移入によっても 誘導は見られなかった。 これらの所見は GCX-1 は非常に強力な転写活性化因子 であることを明確に示している。 実施例 6
次いで GCX-1の相互活性化ドメインについて調べた。 GAL4 DBD- GCX-1欠損 変異を有する各種のプラスミ ド構成物を作製し、 pRL- CMV lng、 5 X GAL4- Elb/Luc レポータープラスミド lOOng及ぴ pSG-GCX- 1欠損各種変異体 lngを HepG2細胞に同時移入した。 その結果を第 6図に示す。
第 6図に示すように、 N末端から 25- 63個のァミノ酸残基間の部位は GCX-1 の転写活性に必須であることが証明された。 この部位は今までに報告されている 典型的な転写活性化モチーフを含有していない。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 以下の （a) 又は （b) から成る転写活性化因子。
(a) 配列番号 1のアミノ酸配列から成るタンパク質
(b) アミノ酸配列 (a) において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若し くは付加されたァミノ酸配列から成り、 転写活性化能を有するタンパク質
2. 請求項 1に記載の転写活性化因子を有効成分とする、 転写活性化を目的と する薬剤。
3. 請求項 1に記載の転写活性化因子を特異的に認識し結合することができる 抗体又はアンタゴ-スト。
4. 被検者から生殖系器官の細胞を採取する段階、 及び採取した細胞に対する 請求項 3に記載の抗体又はアンタゴニストの反応性を調べる段階から成る、 生殖 系器官の異常に起因する疾患の検査方法。
5. 請求項 3に記載の抗体又はアンタゴニストを有効成分とする、 転写活性化 を目的とする薬剤のスクリ ユング剤。
6. 以下の （a) 又は （b) から成る転写活性化因子の遺伝子。
( a ) 配列番号 2の塩基配列から成る D N A
( b ) 配列番号 1のァミノ酸配列から成るタンパク質、 又は該ァミノ酸配列にお いて 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列か ら成り転写活性化能を有するタンパク質をコードする D N A
7. 被検者から請求項 6に記載の遺伝子に相当する部分を含む DN Aを採取す る段階、 及び採取した DNAを請求項 6に記載の遺伝子の塩基配列と比較する段 階から成る、 生殖系器官の異常に起因する疾患の検査方法。
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