WO2004067565A1

WO2004067565A1 - Levaduras modificadas geneticamente con capacidad de flotacion en un medio liquido, precedimiento de obtencion y uso de las mismas

Info

Publication number: WO2004067565A1
Application number: PCT/ES2003/000048
Authority: WO
Inventors: Manuel Fidalgo Merino; Jose Ignacio Ibeas Corcelles; Ramon Ramos Barrales; Juan Jimenez Martinez
Original assignee: OSBORNE DISTRIBUIDORA SA; Universidad Pablo de Olavide
Current assignee: OSBORNE DISTRIBUIDORA SA; Universidad Pablo de Olavide
Priority date: 2003-01-29
Filing date: 2003-01-29
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2005-07-29
Also published as: EP1589032A1; AU2003209770A1; US20070014890A1; AU2003209770A8

Abstract

La presente invención tiene por objeto nuevas levaduras modificadas genéticamente con capacidad de formar biofilm en la interfase líquido/aire, aií como un procedimiento de obtención de hongos y levaduruas con capacidad de formar un biofilm con esas caracterísitcas, y el uso de la mismas.

Description

"LEVADURAS MODIFICADAS GENÉTICAMENTE CON CAPACIDAD DE FLOTACIÓN EN UN MEDIO LÍQUIDO, PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y USO DE LAS MISMAS"

La presente invención tiene por objeto nuevas levaduras modificadas genéticamente con capacidad de formar biofilm en la interfase líquido/aire, así como un procedimiento de obtención de hongos y levaduras con capacidad de formar un biofilm con esas características, y el uso de las mismas.

Son también objeto de esta patente los biofilms formados en la interfase liquido-aire por hongos o levaduras con dicha capacidad innata o adquirida y sus diferentes aplicaciones, especialmente indicada en la producción de biofilms para la elaboración del vino fino de crianza biológica.

Es sabido, que determinadas cepas de S. cerevisiae presentan capacidad de crecer en la superficie de los vinos, formando un biofilm, conocido como flor en el ámbito de producción del vino fino de crianza biológica.

A este respecto, en la patente WO02/14493, se describe la capacidad por parte de hongos y levaduras de formar biofilm en superficies sólidas o semisólidas y sus aplicaciones, y más específicamente, el diseño de un modelo para el estudio de biofilms producidos por S. cerevisiae y el estudio de fármacos que influyen positiva y negativamente en su crecimiento, así como la identificación de genes necesarios para la formación del biofilm.

Los estudios realizados por A. Bakalinsky y S. Zara, de la Universidad de Oregón y la Universidad de Sassari, respectivamente, se centraron en el papel del gen HSP12 en la formación y el mantenimiento de biofilms producidos por ciertas cepas de S. cerevisiae, así como la posible conexión del metabolismo alterado de los lípidos y la formación de dicho biofilm ("HSP12 is essential for biofilm formation by Sardinian wine strain ofS. cerevisiae").

Los investigadores S. Kuchin, VK Vyas, y M. Cansón, de la Universidad de Columbia, han publicado recientemente un artículo en el que se detalla el papel de la proteína quinasa Snf 1 de S. cerevisiae, en la regulación de la transcripción del gen

VLOl l "Snfl protein kinase and the repressors NRgl and Nrg2 regúlate FLOll, haploid invasive growth, and diploid pseudohypal dijferentation ").

Existen además numerosos trabajos científicos que describen problemas y aplicaciones relacionados con la formación de biofilms en cuatro aspectos principales:

a) Los relacionados con la crianza biológica del vino. En este sentido, la flor del vino fino es un biofilm de levaduras del género Saccharomyces que evita su oxidación en la bota de crianza, y que le otorga a través de su metabolismo sus características organolépticas. Mantener y reproducir este biofilm escapa muchas veces al control del enólogo, como se describe en los trabajos científicos:

Ibeas, J. I, Lozano, I, Perdigones, F, Jiménez, J. (1997). Effects of ethanol and temperature on the biological aging of sherry wines. Am J Enol Vitic. 48: 71-74

Ibeas, J.I, Lozano, I, Perdigones, F, Jiménez, J. (1997). Population dinamic of flor yeasts during the biological aging of sherry wines. Am J Enol Vitic. 48: 75-79

Martínez P, Codon AC, Pérez L, Benitez T. (1995) Physiological and molecular characterization of flor yeasts: polymorphism of flor yeast populations. Yeast. 14: 1399-1411. Martínez P, Pérez L, Benitez T. (1997) Factors which affect velum formation by flor yeasts isolate from Sherry wine. System. Appl. Microbiol.20: 154-157

Martínez P, Pérez L, Benitez T. (1997) Evolution of flor yeast population during the biological aging of fino Sherry wine. Amer. J. Enol. Vitic. 48: 130-138

b) Las levaduras y hongos filamentosos son microorganismos de interés aplicado por sí mismos, como medio para la producción industrial de proteínas y otros compuestos de interés aplicado, y como microorganismo que realiza transformaciones de alimentos y bebidas por fermentación. Cuando esta actividad industrial se realiza cultivando los hongos o las levadura en medios líquidos, es costoso separar el microorganismo de este medio donde se cultiva, y cualquier procedimiento que facilite esta labor aumenta notablemente la eficacia del proceso industrial.

Riesemberg D., and Guthke R. (1999) High-cell-density cultivation of microorganisms. ppl. Microbiol. Biotechnol. 51: 422-430.

da Matta VM, Medronho R de A. (2000) A new method for yeast recovery in batch ethanol fermentations: filter aid filtration followed by separation of yeast from filter aid using hydrocyclones. Bioseparation 9 :43-53

Domingues L, Teixeira JA, Lima N. (1999) Construction of a flocculent Saccharomyces cerevisiae fermenting lactose. Appl Microbiol Biotechnol. 51: 621-6.

Domingues L, Teixeira JA, Penttila M, Lima N. (2002) Construction of a flocculent Saccharomyces cerevisiae strain secreting high levéis of Aspergillus niger beta- galactosidase. Appl Microbiol Biotechnol 58: 645-50. c) Los hongos, bacterias y levaduras patógenos son particularmente resistentes a antibióticos debido a la formación de biofilms en las mucosas y tejidos infectados.

Singh PK, Parsek MR, Greenberg EP, Welsh MJ. (2002) A component of innate immunity prevents bacterial biofilm development. Nature 30 : 552-5

Prouty AM, Schwesinger WH, Gunn JS.(2002) Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infecí Immun 70 :2640-9

Donlan RM, Costerton JW. (2002) Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev 15 : 167-93

Wilson M (2001) Bacterial biofilms and human disease. Sci Prog 84 :235-54

Donlan RM. (2001) Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin Infecí Dis 33: 1387-92

Chandra J, Kuhn DM, Mukherjee PK, Hoyer LL, McCormick T, Ghannoum MA. (2001) Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. J Bacteriol 183 :5385-94

Un objetivo de la industria farmacéutica es conocer las proteínas implicadas en el desarrollo del biofilm, para producir nuevos antibióticos específicos contra ellas y combatir esta resistencia, como se describe en la siguiente revisión científica:

Costerton et al. (1999). Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections.Science 284: 1318-1322. d) El control de los bioíϊlms en general, es una herramienta potente de trabajo en los sistemas de depuración de aguas y para el control de otros ambientes acuáticos relacionados con el medio ambiente, como se describe en la siguiente revisión científica:

Winpenny et al. 2000. Heterogeneity in biofilms. FEMS microb. rev. 24: 661-671.

El objeto de la presente invención consiste en lograr el crecimiento de un biofilm en la interfase liquido-aire empleando hongos o levaduras que poseen dicha capacidad, o bien hongos y levaduras que de forma natural no poseen esta propiedad y se les confiere mediante los procedimientos que también son objeto de esta patente, y controlar la cantidad y calidad de dicho biofilm en hongos y levaduras que originalmente carecen o que ya poseen esta característica de formación de biofilm.

Para una mejor comprensión se hace a continuación una descripción con referencia a los dibujos, en los cuales:

Figura 1

Representa al plásmido pBSFLOl-13, resultante de la clonación de los fragmentos FLO 1 - 13 en el sitio EcoRV (Kpnl-Sacl) del vector pBSSK.

Figura 2

Representa la generación del plásmido pBSFLO 1 -42. Figura 3

Representa la generación el plásmido pBSFLOl-1342.

Figura 4

Representa la generación el plásmido pFLOl-1342-KANloxP.

Figura 5

Representa la generación el plásmido pDBGall.

Figura 6 Representa la generación el plásmido pFLT.

Figura 7

Representa la generación el plásmido pFLT-FLOl 1.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Figura 8

Representa esquemáticamente los diferentes pasos seguidos en la producción de compuestos empleando hongos o levaduras.

Figura 9

Muestra el efecto producido por la deleción del gen FLO11 en una cepa con capacidad de formar biofilm en la interfase líquido-aire.

Las ventajas de emplear el sistema objeto de esta patente se describen en función del campo de aplicación y son las siguientes:

a) Elaboración de vinos finos: La disrupción del gen FLO1 en una cepa formadora de biofilm en la interfase líquido aire, provoca que el biofilm formado por ésta proporcione un mejor aislamiento del vino contenido en la bota evitando así su oxidación, acelera el metabolismo del vino y por tanto la aparición de los componentes organolépticos característicos del vino fino, mejora la estabilidad de este biofilm en los meses de verano y en caso remoto de pérdida de este biofilm, permitirá una rápida regeneración a partir de las levaduras supervivientes o a partir de inóculos crecidos en laboratorio e introducidos en las botas. La transformación con el plásmido conteniendo el gen FLOl l-F clonado de una levadura formadora de biofilm en la interfase líquido aire (objeto de la patente) permitirá que hongos y levaduras no formadores de biofilm adquirieran esta capacidad. El empleo conjunto de los dos procedimientos anteriormente citados

incrementará la capacidad de formar biofilm en las cepas que no posean dicha capacidad, pudiendo aumentar de esta forma la variabilidad de cepas a emplear en la producción de vinos finos lo que permitirá mejorar o variar el proceso productivo.

b) Separación de hongos y levaduras del medio de cultivo en procesos industriales: El empleo de los plásmidos objeto de esta patente permitiría obtener cepas que lleven a cabo el proceso fermentativo metabólico en forma de biofilm en la interfase líquido-aire, de manera que una vez llevada a cabo la fermentación se elimina el medio usado por la parte inferior del fermentador y se bombea medio nuevo, sin

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) necesidad de retirar el hongo o la levadura ni afectar a su crecimiento consiguiendo así un cultivo continuo de alto rendimiento. (Figura 1)

c) Empleo de S. cerevisiae como organismo modelo para el estudio de la formación de biofilm en la interfase líquido-aire.

S. cerevisiae es el hongo mas estudiado desde todos los puntos de vista. Debido a que la formación de biofilms en otros hongos e incluso en bacterias comparte muchos elementos comunes con S. cerevisiae, el empleo de este último como organismo modelo puede proporcionar gran cantidad de información.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención se basa en el descubrimiento de los autores de que la capacidad de formar un biofilm en la superficie del vino, conocido como flor en el ámbito de producción del vino fino de crianza biológica, depende de modificaciones en el gen FLOl 1 de las levaduras, y que por tanto esta característica de crecer y permanecer en la superficie líquida puede controlarse con modificaciones en la correspondiente proteína Flol lp. (Figura 2) Las principales modificaciones que permiten a los inventores inducir la formación de un biofilm en la interfase líquido aire son de tres tipos:

1) Eliminación de proteínas que compiten por los mismos lugares de actuación que Flol lp en la levadura, como por ejemplo la proteína homologa Flolp o el gen FLOl que la codifica.

2) Aumento de la cantidad de proteína Flol lp que tiene la célula, lo que se logra entre otras formas mediante la expresión con un promotor muy potente, o mediante deleción de los elementos que limitan o reprimen la expresión de su propio promotor.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) 3) Flol lp está formada por repeticiones de dos tipos de péptidos: tipo a), representado por la secuencia de aminoácidos P-V/A-P-T-P-S-S-S-T-T-E-S-S-S-

A y análogas, y tipo b) representada por la secuencia P-V/P-T/S/F-S-S-T/S-T-E-

S-S-S/V-A/V y análogas. El crecimiento en la interfase líquido-aire también se logra expresando variantes de la proteína Flollp que alternen estos dos tipos básicos de repeticiones evitando que existan más de dos repeticiones juntas del mismo tipo, así como aumentando el número de repeticiones de la proteína.

Cada uno de estos elementos por si solos o combinados permiten que una levadura forme un biofilm en la interfase líquido-aire.

Los experimentos que a continuación se relacionan, se describen como soporte de aspectos particulares de la invención y en ningún caso para limitar el alcance de la misma. Dichos experimentos se desarrollaron en las etapas que a continuación se detallan:

1) Disrupción del gen FLOl en la cepa MY138

1.1. Para llevar a cabo la disrupción del gen FLOl, que codifica la pFLOl, proteína de pared celular con alta homología a FLOl 1 , se clonaron por PCR los

fragmentos FLOl -13 (-222 a 245 con respecto al +1 del ORF) y FLOl -42 (3135 a 3551) correspondientes a los extremos 5 ' y 3' respectivamente de dicho gen en el vector pBSSK. Para ello, el fragmento FLO1-13 se amplifica por PCR con Taq empleando los cebadores FLO1-1 y FLOl -3 y el programa siguiente:

FLO1-1 TGGTAAACAGCTCTGCAGCAGGG FLO 1 -3 TC AATCGAGATATC AGTTTGTCCTCC

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Proεrama:

95° C 5 min.

95° C 30 seg.

53° C 30 seg. x 30 ciclos 72° C 4 min.

72° C 10 min.

4^o C 5 min.

Se clonó el FLOl -13 en el sitio EcoRV (Kpnl-Sacl) del vector pBSSK, generando el plásmido pBSFLOl-13 (Fig. 1).

1.2. El fragmento FLO1-42 se amplifica por PCR con Taq empleando los cebadores FLOl -2 y FLOl -4 y el mismo programa que en el caso anterior.

FLO 1 -4 TG AACCATGAATTCGTACTTTTACTTCG FLOl -2 ACGGATCCAGCTGAACTCGTTTCG

Se corto con EcoRI y BamHI y se clono en PBSSK en los sitios EcoRI/BamHI, generando el plásmido pBSFLO 1 -42 (Fig.2).

1.3. A continuación se extrajo el fragmento FLO 1-42 del plásmido pBSFLOl-42 con las enzimas EcoRI y Xbal y se clono en el plásmido pBSFLOl-13 en los sitios EcoRI y Xbal generando el plásmido pBSFLOl-1342 (Fig.3).

1.4. En el plásmido pBSFLOl-1342 se clonó entre las regiones FLO1-13 y FLO1-42 en el sitio EcoRV el fragmento correspondiente al gen KAN (confiere resistencia dominante a geneticina) flanqueado por las secuencias LoxP provenientes del

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) plásmido pUG6 (Guldener et al 1996) cortado con EcoRV y PvuII generando el plásmido denominado pFLOl-1342-KANloxP (Fig. 4).

Guldener U, Heck S, Fielder T, Beinhauer J., and Hegemann JH. (1996) A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. 24 :2519-24.

1.5. La digestión con BamHI de la construcción anterior genera un fragmento de 2500 pares de bases. Este fragmento se transformó por el método del Acetato de Litio (Ito et al 1983) en la cepa MY138 y se seleccionaron transformantes resistentes a geneticina en placas de medio rico conteniendo 200 μg/ml de geneticina. Varios transformantes seleccionados se recomprobaron para el fenotipo de resistencia a geneticina y posteriormente se llevó a cabo una reacción de PCR empleando los cebadores FLO1-1 y FLO 1-2 y los ciclos descritos anteriormente y un southern blot empleando como sonda los fragmentos FLOl -13 y FLO 1-42 para comprobar que el fragmento transformado se había integrado y por tanto disrumpido únicamente el gen FLOl.

1.6. Para eliminar los fragmentos de ADN ajenos a la levadura y conseguir de esa forma una cepa GRAS, se transformó un disruptante seleccionado con el plásmido Yep32cre-cyh (Ito H., Fukada Y., Murata K., and Kimura A (1983) J. Bacteriol. 153, 163) que porta la secuencia correspondiente a la recombinasa ere bajo el control del promotor GAL1. Una vez seleccionado los transformantes mediante crecimiento en

placas de medio YNB conteniendo 200 μg/ml de cicloheximida, estos se crecieron en medio conteniendo galactosa como fuente de carbono para inducir la expresión de la recombinasa ere. Posteriormente se seleccionaron colonias sensibles a cicloheximida (han perdido el plásmido Yep32cre-cyh) y sensibles a geneticina (han perdido el gen Kan del fragmento empleado para la disrupción de FLOl). Posteriormente se comprobó la perdida de dichos elementos mediante reacciones de PCR empleando los cebadores FLO1-1 y FLO 1-2 como anteriormente y mediante southern blot

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) empleando como sonda fragmentos correspondientes al gen Kan, URA3 y el fragmento FLO 1-13. Una vez seleccionada una cepa que cumple todas esas condiciones, se repitió el proceso para eliminar la segunda copia del gen FLOl que posee la cepa MY138, obteniendo de esta forma una cepa GRAS con la doble disrupción del gen FLOl a la que denominamos OSB101.

La aplicación de la disrupción del gen FLOl es la mejora de la capacidad de formar flor de cepas que ya poseen dicha capacidad.

2) y 3) Construcción del plásmido pFLT-FLOll-F que confiere la capacidad de formar biofilm en la interfase líquido-aire a las cepas que no la poseen mediante el aumento de la cantidad de proteína y la producción de una variante de esta proteína FLOll-Fp presente en la cepa formadora de biofilm en la interfase líquido-aire MY138.

2.1. Para la construcción del plásmido pFLT-FLOl l-F se amplificó por PCR el promotor del gen FLOl 1 -Frecuencia en documento anexo) empleando para ello la enzima Pfu, ADN genómico extraído de la cepa 133d mediante el método descrito por Hoffman & Winston, Gene 57, 267-272 (1987) y los cebadores FLO11-P5 y FLO11-P6.

FLOl 1-P5: ATTGAATTCCTAAATTCTTTACAGATGACATCTGG FLOl 1-P6: GTAGAATTCGTCTTTGGATAGTGTGCGTATATGG

El programa utilizado es:

94° C 2 min.

94° C 45 seg.

56° C 30 seg. x 30 ciclos

72° C 7 min.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) 2.2. El fragmento obtenido de 3.1 Kb se digirió con la enzima EcoRI y se clonó en el vector pRS316. El plásmido resultante se denomina pRSPFLOl 1. A continuación se clonó el terminador TADH del plásmido pDBGall (Fig. 5) mediante digestión HindIII-Xbal y reacción de extremos romos en el plásmido pRSPFLO 11. El plásmido resultante se denominó pFLT (Fig.6).

2.3. Sobre el vector pBSSK+ se clonó el fragmento correspondiente al gen FLOl 1-F (5 Kb) previamente amplificado por PCR empleando la enzima Pfu, ADN genómico de la cepa 133d y los cebadores FLO 11 -END5 y FLO 11 -END3

FLOl 1-END5: GCGAATTCTCAAAAATCCATATACGCACACTATGC FLOl 1-END3: GCTCTAGACTTATGGCAGCGAAAACAGAATGGTGG

El programa utilizado es:

94° C 2 min.

94° C 45 seg.

53° C 30 seg. (aumentar 0.5°C/ciclo)

72° C 9 min.

N° de ciclos. 10

94° C 45 seg.

58° C 30 seg.

72° C 9 min. (aumentar 5 seg./ciclo)

N° de ciclos. 20

72 °C 7 min.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Se obtiene un tamaño de DNA amplificado de 5 Kb. El plásmido resultante se denomina pFLOl 1-C.

2.4. Finalmente se extrajo el fragmento FLOl l del plásmido pFLOl l-C mediante digestión con Apal (y reacción para hacer extremos romos) y Notl y se clonó en el plásmido pFLT en Smal-Notl. El plásmido resultante se denomina pFLT-FLOl l (Fig. 7).

La aplicación de la construcción pFLT-FLOll es conferir la capacidad de formar biofilm en la interfase líquido-aire a cepas carentes de dicha capacidad y mejorar esta capacidad en las que ya la poseen.

La figura 8 muestra los diferentes pasos en la producción de compuestos empleando hongos y levaduras, aprovechando la capacidad de formar biofilm.

En dicha figura: 1 representa el desarrollo del cultivo, 2 el trasvase del medio o sustrato metabolizado, 3 el biofilm ceparado y 4 el llenado con nuevo medio o sustrato.

La figura 9 permite apreciar el efecto de la deleción del gen FLOl 1 en una cepa con capacidad de formar biofilm en la interfase liquido aire, correspondiendo 5 a la cepa 133d y 6 a la cepa 133dΔFLOl 1

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) SECUENCIAS DE LOS GENES EMPLEADOS

FLOl -1000 hasta el final de la fase abierta de lectura

AAAAAAAAGTGCATTTATTTAGGTAAGTCTCATTACCTAAACGCCAGTTT GTTTCACGTAATTGGTAACGATGAGGGAACCGCAGTAGAAAAAACTTTC ATTCACAAACGATTAAAGTGTTATGCTAGCCAGTTTCAGGCTTTTTGTTTT ATGCAAGAGAACATTCGACTAGATGTCCAGTTAAGTGTGCGTCACTTTTC CTACGGTGCCTCGCAC ATGAATGTTATCCGGCGCACGATACTTATCACCG AAAAACCTTATTCTACGGAAAACCTTATTTACATTAAAGTTGGAAAAATT TCCTCTTTTTCCTAATAAGGTGGAGCTTTTGGCTTCCAGTATGCTTTCACG GAATTATTTCTCATGTACATTTAGCTCCATTTCCAGTGCCTCCGATAGGGA GGCATCATGGTACTACCGTGACGGAGAATACGTAGGCTGACTTTTTCGTC AGTTTGTTGTCCGTTTACAAAATTGGTGAATGAATTCTAGCCTTCCTCTGC TCATTAATTGCCCTCACAAGAATTTGGAAGTGCGTAGACAGGTAAAAGAT TGTACTACAGAGGTATTGTGGAACCTTCTACAGTACTTCGGAATACACCT AAAAGGTTGTTGGATGCTAAATTTAGCAAAAGTCTTTTTTAGCTCACTATT AGGCTTGTTAAAGTCTGAAATTGTTGAAAGGCACTCAAAAAGATAAATC AACAATCAGCATTAACGGCACAGTTGAAAGAGTCACCCACTTGAAATTA GCTCGGTTATCAAATATAATTATCTCTGGTAAAGAGCTCTGCAGCAGGGT TAATCTATTCGCATACTTACGCTGTAGGAACATTTTATTATTAGGATCCGA CTACTGCCTACATATTTATTCGGAAGGCATGATGTCGAAAATTTTTGAGC TTATAAAAGGAACATATTTCACTCTTGCTCGTTGATGTAAGCTCTCTTCCG GGTTCTTATTTTTAATTCTTGTCACCAGTAAACAGAACATCCAAAAATGA CAATGCCTCATCGCTATATGTTTTTGGCAGTCTTTACACTTCTGGCACTAA CTAGTGTGGCCTCAGGAGCCACAGAGGCGTGCTTACCAGCAGGCCAGAG GAAAAGTGGGATGAATATAAATTTTTACCAGTATTCATTGAAAGATTCCT CCACATATTCGAATGCAGCATATATGGCTTATGGATATGCCTCAAAAACC AAACTAGGTTCTGTCGGAGGACAAACTGATATCTCGATTGATTATAATAT TCCCTGTGTTAGTTCATCAGGCACATTTCCTTGTCCTCAAGAAGATTCCTA TGGAAACTGGGGATGCAAAGGAATGGGTGCTTGTTCTAATAGTCAAGGA ATTGCATACTGGAGTACTGATTTATTTGGTTTCTATACTACCCCAACAAAC GTAACCCTAGAAATGACAGGTTATTTTTTACCACCACAGACGGGTTCTTA CACATTCAAGTTTGCTACAGTTGACGACTCTGCAATTCTATCAGTAGGTG GTGCAACCGCGTTCAACTGTTGTGCTCAACAGCAACCGCCGATCACATCA ACGAACTTTACCATTGACGGTATCAAGCCATGGGGTGGAAGTTTGCCACC TAATATCGAAGGAACCGTCTATATGTACGCTGGCTACTATTATCCAATGA AGGTTGTTTACTCGAACGCTGTTTCTTGGGGTACACTTCCAATTAGTGTGA CACTTCCAGATGGTACCACTGTAAGTGATGACTTCGAAGGGTACGTCTAT TCCTTTGACGATGACCTAAGTCAATCTAACTGTACTGTCCCTGACCCTTCA AATTATGCTGTCAGTACCACTACAACTACAACGGAACCATGGACCGGTAC TTTCACTTCTACATCTACTGAAATGACCACCGTCACCGGTACCAACGGCG TTCCAACTGACGAAACCGTCATTGTCATCAGAACTCCAACAACTGCTAGC ACCATCATAACTACAACTGAGCCATGGAACAGCACTTTTACCTCTACTTC TACCGAATTGACCACAGTCACTGGCACCAATGGTGTACGAACTGACGAA ACCATCATTGTAATCAGAACACCAACAACAGCCACTACTGCCATAACTAC AACTGAGCCATGGAACAGCACTTTTACCTCTACTTCTACCGAATTGACCA CAGTCACCGGTACCAATGGTTTGCCAACTGATGAGACCATCATTGTCATC AGAACACCAACAACAGCCACTACTGCCATGACTACAACTCAGCCATGGA ACGACACTTTTACCTCTACTTCTACCGAATTGACCACAGTCACCGGTACC AATGGTTTGCCAACTGATGAGACCATCATTGTCATCAGAACACCAACAAC AGCCACTACTGCCATGACTACAACTCAGCCATGGAACGACACTTTTACCT CTACTTCTACCGAATTGACCACAGTCACCGGTACCAATGGTTTGCCAACT GATGAGACCATCATTGTCATCAGAACACCAACAACAGCCACTACTGCCAT GACTACAACTCAGCCATGGAACGACACTTTTACCTCTACATCCACTGAAA TCACCACCGTCACCGGTACCAATGGTTTGCCAACTGATGAGACCATCATT GTCATCAGAACACCAACAACAGCCACTACTGCCATGACTACACCTCAGCC ATGAACGACACTTTTACCTCTACATCCACTGAAATGACCACCGTCACCGG TACCAACGGTTTGCCAACTGATGAAACCATCATTGTCATCAGAACACCAA CAACAGCCACTACTGCCATAACTACAACTGAGCCATGGAACAGCACTTTT ACCTCTACATCCACTGAAATGACCACCGTCACCGGTACCAACGGTTTGCC 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GAATTCCTAAATTCTTTACAGATGACATCTGGGTCTAGGGAGATCATGCA AAAAAATAAGACATCATTTATAACTTTCAACCTTCCGCTCACAGGACTAA TTCTCGAAGACGCTACGAAAAGATGCTGAGCTTGATCATAATTCTTCAGG CTCCCAATTCAAGAATACAATTACTTAGTGTGGGTGCTTCTGCTCAGTCTT CGTTTCCTATCTCCACATACGAATCACTCGCTTGTTACTAATTCGAATAAT TTACTGCTGTAAGGAGTCGTACCGCCAACTAAATCTGAATAACAATTTGG CTGCTAGAAGTCAAAAAGTAGGCGCTGCAATGATTATGTGGTATGATCAG ATTGTGTCGCAACATTCAGCGGGGTTTTGATTCAATGGGACCGCTGCTAA TAAAGTGTTTAACTAGCGAATTTTGGAACACACCCGTTGACAAAAGTATA AGGAGTCTCTTTCCGTGAGTTCCCCTCTTCCTCTCACTGCACTTCAACTAT GCCTTATAGCAACCAAGAAGCTAGAAAATGCCAACTATTAAAAAGATAA CCTCTTTGGAATTAAATAAAACGGAGATTATCTTGGGATCTATTTCACAA ATTTACGGCTAATTGGAATGAACAGCGCCAAGTAGCACTGGACAAACTG CAGAGAGTATTAGAACTTGCTTTATTCCGTATATCGTACTTTAGGTCGTCA GTTTTACCACTTCGGTACGCAAATGAAAATAAAAAGCTCATTCACAACTT AGACACAATTTCGCCGTTTACAAGTAGCTGAAAAGTCCATCTATCGAATT ATGAATGATACTATTTTAAATATCGTCGTTACTGCACTCGTTTTCCACGTT CTTTTTATCCACACATCCGATGTTTTATTTACAGTTGAGCATCTCAGGGCC AGCGACAAATATAAACATATTATACTCAAAATGAAGCTCGTTGAAAAGA GAATATTTCTTAACCTCTTTTACAGTGCTTTCAACACCTTTTCACCTGTGT GCCATGTCAGATTAAGGATGCTCAACTTTTCGAATTATTATTACAAATTTC AAAGAAATTACTAGTCCTTTTTGTCCCCTAATGTATCCCTCATTTCATACC GTCGTTTTGGGGTTCCAACTACGTATAGCTTTCAAGTGTGGTTTTACGGTA AGAACAACCCCCCATTGGTTGGTGCGGAATACTTTCCTATTCTCATCGAG AGCCGAGCCATACACCTAAGGTGGACAGAAAGCTAAAATTCCAAAACAG AAAAATCTAACATCTTTGCTCCCTTACAAGTAGGAACGCTGGCGTATCAA CCCGTCTCCAGATTTGCCCAGCATTTCTGTAGAACACCCAATGCGAATGA AGACTAATGAATATTGTAAAGACAAAAAATAGGAAAAGTTTAATTAGTG ATGGTTCTCACCACCCCAAAACGGTCACTTGCATGCATTGAGGACATGCA CCTGCAGTACTTGTTTTTCTCGAATGTTTTTACCATCTCTTTTTTCCTTATC TGAGCTACTGACGCAGACGGACATTGTTTCATATTTCGAAAGCTGTGCGG GAAAACGGACCCTAACACGAATGTGAATGCGCTAATCAGTATTTCCACCA CATGAAACCTGCTACTTTTTCAGTCCTCTTCGTATGCATTTCCCAAAATTC ATTCGTAGCCTTGTCAACTTAGACTCAGTTCCACGGCGTGCAGGACGGGG TATTATGAATAAAAGGATCCACGGGTGAGATTTGTTCTGTGTTTTAGGTA TGGAGTTTTGTACCACAAAACTTTAGGAATACCGGATTTTGTGCCTACGC CAGCCCCAGAGTATGTTCTCACAGCTGTAATTCCTAGTGATCTTTTCCTGG CTCCAATAGGAACGCCGGTAGGCAAATTAAGGTTTTTTTCTTCTGTTTTCT TGACAAGAAAATGTCGCCCAAAGAGTTTCGGCCGTTATTTTCCTATCGAA GTGGGTCCTTTTTGTCTTTAGTCCTTCTCTGGGGCTAGCGATCACTGCAAA ATTAGGCTTCACTGGTACGAGTTAACTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTGTCATC CTTTTCTTTGGGGCTAAGAATGGACTTCCCTTTTCTTTTTCTTTGTTGCAGC AGTGGCTTCAAAGAACTGCTGATTGCTCAAGGCAATCAGTCCGAGCGTTT AGAAGGTGATTGTAGGCAGAAATTAACTTTGCGGTAAAAGAATGACATT CTTTCTTAAAAGAAAAATTAGCTTTTTTTTTGTCAGGCATTGCACAAACTT TTTTATTTCTGCCTATACTCTTAAACAGATCAGTCATTCATGTTGTCTTTTT AACGGTCGTACTGGGACATCACATGCCTTGGGATTCCGTAATTAGGTGCA ACAATACGGGCACAACTCATTCTGCGCTATCTTCACGGACAGAACTTCTA TTGCCTATCGGTGGTGTGATTAACAATTGGAGGCGCAGAGCTTGGAATGG ATTTCCAATTCAATGGATTTGGAGGTATTCGTTTGTTTACTAATATTTACT TTGAGGACATTGCCCAACCCTAAAAGTGCCTGTTCCAGAATAGAATAACA TTATGATACGTTTTCTTGACCGCTGAGCAATTTAAAGCGATTATTAGGGT ACGATTGTTTCTAGAGAAATGTGGGTCATCTTTTTAGGTCCGTTCTCTTCT GATGAGGTAACCTTTACAAAAATGTCATAGAGTTACCAATTGGGATTCAA GGCATCATCGCAATATACTTCGTTCTTTTACGGAGAAATTAAGCTCTTTCT ACTTTGAATTAACTGTTAGACTTGTCTTATCTGAGGAATGTCCGTGTTCAA ATTAAATAAAAATTTAGGGCAGTTTTATTTACCTTAACAAATATGTTCAA GCATGTACGTTACTGCGCTCTCTTCTAGTTCAAGAACGGATAACTCATAG ACTTACCAGTACAAGTTGTTGAAGGGTTCCCAATTGATAAAAAAGGATCT TTTGCTTCCTGAAATAAACGTATAAAAAGCACCCTATTCATCAGTTATAC TCCCTCATCATGTTGTGGTTCTAATTAAGAATATACTTTTGTAGGCCTCAA AATCCATATACGCACACTATCCAAAGACGAATTC

FLOllFase abierta de lectura de la levadura de flor

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para conferir capacidad de formar un biofilm en la interfase líquido-aire en hongos y levaduras, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) eliminación de proteínas que compiten por los mismos lugares de actuación que Flol lp en el hongo o la levadura,; b) aumento de la cantidad de proteína Flollp o equivalentes que tiene la célula mediante la expresión con un promotor muy potente, o mediante deleción de los elementos que limitan o reprimen la expresión de su propio promotor; c) producción de variantes de la proteína Flollp o equivalentes en el hongo o la levadura.

2. Procedimiento para mejorar la capacidad de formar un biofilm en la interfase líquido-aire en hongos y levaduras, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) eliminación de proteínas que compiten por los mismos lugares de actuación que Flol lp en el hongo o la levadura,; b) aumento de la cantidad de proteína Flol lp o equivalentes que tiene la célula mediante la expresión con un promotor muy potente, o mediante deleción de los elementos que limitan o reprimen la expresión de su propio promotor; c) producción de variantes de la proteína Flollp o equivalentes en el hongo o la levadura.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se prescinde de la etapa a) y se llevan a cabo las dos etapas restantes b) y c).

4. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque se inicia en cualquiera de las etapas a), b) o c), y se prescinden de las dos etapas restantes no seleccionadas .

5. Procedimiento según reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la etapa a) se lleva a cabo mediante disrupción del gen FLOl en una cepa denominada MY138.

6. Procedimiento según reivindicaciones 1, 2 y 5, caracterizado porque la etapa a) comprende las siguientes etapas: clonación del fragmento FLO1-13 en el sitio EcoRV (Kpnl-Sacl) del vector pBSSK, generando el plásmido pBSFLOl-13; clonación el fragmento FLO 1-42 en los sitios EcoRI/BamHI del vector pBSSK, generando el plásmido pBSFLOl-42 ; extracción del fragmento FLO1-42 del plásmido pBSFLOl-42 con las enzimas EcoRI y Xbal y se clono en el plásmido pBSFLOl-13 en los sitios

EcoRI y Xbal generando el plásmido pBSFLOl-1342; clonación entre las regiones FLO1-13 y FLO1-42 del plásmido pBSFLOl- 1342 en el sitio EcoRV el fragmento correspondiente al gen Kan, flanqueado por las secuencias loxP provenientes del plásmido pUG6, generando el plásmido denominado pFLOl-1342-KanloxP; digestión del plásmido con BamHI, generando un fragmento que se transforma en la cepa MY138 de la cual se seleccionan transformantes resistentes a geneticina, y se realiza una PCR para comprobar que el fragmento transformado se ha integrado y por tanto se ha disrumpido el gen

FLOl; eliminación de los fragmentos de ADN ajenos a la levadura y obtención de una cepa GRAS con doble disrupción del gen FLOl, denominada OSB101.

7. Procedimiento según la reivindicación 1 y 2, caracterizado porque las etapas b) y c) se llevan a cabo mediante la construcción del plásmido pFLT-FLOl l y la producción de una variante de esta proteína FLOl l presente en la cepa de flor MY138.

8. Procedimiento según reivindicaciones 1, 2 y 7, caracterizado porque la construcción del plásmido pFLT-FLOll confiere capacidad de formar biofilms a cepas carentes de dicha capacidad.

9. Nueva cepa de levadura, caracterizada por su número de identificación, Saccharomyces cerevisae /OSB101, y su número de orden CECT 11781.

10. Nueva cepa de levadura, caracterizada por su número de identificación, Saccharomyces cerevisae /OSB 102, y su número de orden CECT 11782.

11. Nuevas cepas de levaduras y hongos con capacidad de formar biofilms obtenidas según el procedimiento descrito en las reivindicaciones anteriores.

12. Nuevas cepas de levaduras y hongos según reivindicaciones 9, 10, y 11, para la producción de biofilms en la elaboración de vino fino de crianza biológica.

13. Uso de nuevas cepas de levaduras y hongos en la producción de vino fino de crianza biológica.

14. Uso de nuevas cepas de levaduras y hongos en procesos de separación de levaduras del medio de cultivo en procesos industriales.

15. Uso de nuevas cepas de levaduras y hongos en procesos de depuración de aguas.