WO2004067019A1

WO2004067019A1 - ハスの破砕物または抽出物を含む抗アレルギー剤

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Publication number: WO2004067019A1
Application number: PCT/JP2003/009208
Authority: WO
Inventors: Kiyoshi Goto; Haruhisa Wago
Original assignee: JAPAN ALLERGY APPLIED INSTITUTE Co Ltd; Toyo R&D Inc
Current assignee: JAPAN ALLERGY APPLIED INSTITUTE Co Ltd; Toyo R&D Inc
Priority date: 2003-01-27
Filing date: 2003-07-18
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2005-07-27
Also published as: AU2003255143A8; JP2006151811A; AU2003255143A1

Abstract

本発明は、ハスの破砕物または抽出物を含む抗アレルギー剤、抗アレルギー用食品添加剤および抗アレルギー食品に関するものである。抗アレルギー剤、抗アレルギー用食品添加剤および抗アレルギー用食品は、ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを有効成分として含むことにより、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎をはじめとするアレルギー疾患の改善、治療を可能にする。

Description

明細書ハスの破砕物または抽出物を含む抗アレルギー剤技術分野

本発明は、ハス (Ne 1胆 b o nu c i f e r a) の破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む、抗アレルギー剤、抗アレルギー用食品添加剤および抗アレルギー用食品に関する。背景技術

今日、多くの先進国では、花粉症、気管支喘息あるいはアトピー性皮膚炎などの I型アレルギー反応による疾患が増加しており、社会問題となっている。

I型アレルギー反応には、人間の持つ 5種類の抗体の中で、特に I gEと称される抗体が深く関与しており、アレルギー体質の者はこの抗体をアレルギー体質でない正常人よりも多く産生する傾向がある。 I gEの産生は、タイプ 2のヘルパー Tリンパ球（Th2) に由来するインターロイキン 4 ( I L-4) やインタ一ロイキン 13 (I L- 13) によって促進されるが、近年、タイプ Iのへルパ一 Tリンパ球 (Th 1) に由来するインターロイキン 2 ( I L- 2) やインターフエロン—ァ (I FN-r) によってこれが抑制されることが報告されている。従って、 I gE産生を抑制し、アレルギー体質を改善するには、 IL— 4 I L 一 13の産生を抑制すること.. または I L— 2や I FN-rの産生を促すことが重要である。また、 I型アレルギ一反応には TNF (腫瘍壊死因子）も関与しているので、 TNFの産生を抑制することも炎症反応の抑制に有効である。

上述のような I型アレルギー反応による疾患を改善するために、医薬品として、抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤、ステロイド剤などが開発され使用されている。これらの薬品は、長期投与による症状悪化（リバウンド現象)、中枢神経に作用することによる眠気、経皮吸収による内分泌系への影響、などの副作用を伴う場合がある。

一方で、副作用がなく安全に上記疾患を改善することを目的として、従来食されている食品から、抗アレルギー作用を有するものが探索されている（特開昭 6 1— 291524、特開平 1一 121217、特開平 7— 215884等参照）。また、すでに上巿されており、広く認知されているものとしては、甜茶 (Rub u s s u av i s s imu s) の茶葉から熱水抽出された甜茶エキス、シソ（_ e r i l l a f r u t e s c en s) の葉から熱水抽出された、シソ葉エキスなどがある。

しかし、医薬品として使用されている化合物は、上述のように副作用を有する場合が多いという問題がある。また、甜茶エキス、シソ葉エキスのように食品由来の抗アレルギー素材もあるが、これらとは異なる作用機序、より有効な薬効、および Zまたは経済的優位性といった観点から、これら以外の食品に由来する抗ァレルギ一素材が求められている。発明の開示

本発明者らは、レンコンの破碎物または抽出物が抗アレルギー作用を有することを見出し、これに基づいて本発明を完成するに至った。

本発明は、ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む、坊アレルギー剤、抗アレルギー用食品添加剤および抗アレルギー食品を提供する。また、本発明はハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む、花粉症改善剤、花粉症改善用食品添加剤および花粉症改善用食品を提供する。

さらに、本発明は、ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む、血清中 I gE濃度低下剤、血清中 I gE濃度低下用食品添加剤および血清中 I gE濃度低下用食品を提供する。また、本発明は、ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む I L一 4産生抑制剤、 I L一 4産生抑制用食品添加剤および I L _ 4産生抑制用食品を提供する。

さらに、また、本発明は、ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む TN F産生抑制剤、 TN F産生抑制用食品添加剤および T N F産生抑制用食品を提供する。

本発明において、「ハス」とは、スィレン科（N y m p h a e a c e a e )、ハス亜科 (N e 1 u m b o i d e a e ) に属する N e 1 u m b o n u c i f e r aをいう。当該ハスの地下茎は、一般に「レンコン」と称され市販されている。また、本発明において破碎物または抽出物とされるハスとしては、ハスの植物体の任意の部分を使用することができ、例えば、ハスの地下茎 (レンコン）、茎、葉、根、実等またはこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されるものではない。好ましくは、破碎物または抽出物として使用されるハスは、ハスの地下茎、茎、葉もしくは根、またはこれらの組み合わせであり、より好ましくはハスの地下茎、茎もしくは葉、またはこれらの組み合わせであり、さらにより好ましくはハスの地下茎である。

ハスの破碎物は、二一ダー、ミキサー、破碎機をはじめとする任意の装置を用いた任意の方法で、ハスを破砕処理することにより調製することができる。破碎処理は、水などの溶媒を添加して行っても良いし、ハスのみが破碎処理されるような態様であっても良い。本発明におけるハスの破砕物は、ハスを破碎処理して得られるそのものであっても良いし、破砕処理の前に、破碎処理と同時にもしくは破砕処理の後に、加熱および/または脱水処理されたものであっても良い。なお、加熱おょぴ Zまたは脱水処理の有無は問わない。

好ましくは、ハスの破碎物は、ハスを破碎処理した後に加熱処理し、さらに乾燥処理することにより得られるもの、ハスを乾燥処理した後に破碎処理して得られるもの、ハスを加熱処理した後に破碎処理して得られるもの、ハスを加熱および乾燥処理（この加熱と乾燥の順序は問わない）した後に破碎処理して得られるものなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

また、破砕物は、ペースト、固体、粒状物、粉体、液体状（溶液、懸濁液など任意の状態を含む）など任意の形状であることができ、これらの形状を有する破砕物は、任意の公知の方法を用いて製造することができる。例えば、ハスから直接に、破碎物がこれらの形状となるように製造しても良いし、上述のように、一旦乾燥処理して得られた乾燥状態の破碎物を、これらの形状になるように製造することも可能である。

ハスの破碎物の調製において乾燥処理が行われる場合には、乾燥処理方法としては、任意の、公知の方法を使用することが可能であり、例えば、フリーズドラィ法、および遠赤外線乾燥法、近赤外線乾燥法をはじめとする加熱乾燥法などが挙げられるが、特に限定されるものではない。

本発明においてハスの抽出物とは、ハス中の成分を溶媒に移行させて抽出物を得るといった、いわゆる溶媒を用いた抽出処理により得られる抽出物に限定されるものではなく、ハスを圧搾して得られた絞り汁をはじめとする、ハス中の任意の成分を溶媒等を使用することなく直接的に取出して得られたものも本発明にいう抽出物である。また、抽出物は室温で調製されても良いし、加熱下で調製されても良い。例えば、ハスの抽出物の例としては、ハスの細切物または破碎物を圧搾して得られた絞り汁、ハスの細切物または破碎物を加熱圧搾して得られた絞り汁ハスの細切物または破碎物を加熱下または非加熱下で溶媒抽出して得られた抽出物等が挙げられる。溶媒抽出する場合に使用可能な溶媒としては水、ェタノール、プロピレングリコール、 n—ブタノ一ル、酢酸ェチルおよぴクロロホルムなどの 1種または 2種以上の単独あるいは混合溶媒などが挙げられる。好ましくは、抽出に使用される溶媒は水である。また、抽出物は必要に応じて濃縮あるいは濃縮乾固することができる。抽出物は、ペースト、固体、粒状物、粉体、液体状（溶液、懸濁液など任意の状態を含む）など任意の形状であることができ、これらの形状を有する抽出物は、任意の公知の方法を用いて製造することができる。ハスの抽出物の調製において乾燥処理が行われる場合には、乾燥処理方法としては、任意の、公知の方法を使用することが可能であり、例えば、フリーズドラィ法、および遠赤外線乾燥法、近赤外線乾燥法をはじめとする加熱乾燥法などが挙げられるが、特に限定されるものではない。

本発明における、薬剤、食品添加剤及び食品においては、ハスの破碎物と抽出物はそれぞれ単独で含まれていても良いし、これら両方が含まれていても良い。本発明の 1態様は、ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む抗アレルギー剤であるが、ここでの抗アレルギー剤は、アレルギー反応に起因する疾患を改善、治療するための薬剤であり、好ましくは、 I型アレルギー反応に起因する疾患を改善、治療するための薬剤である。より好ましくは、本発明の抗アレルギー剤は、花粉症（本発明において、花粉症とは、花粉によるァレルギ一反応による症状をいい、主たる症状としては、例えば、鼻水、鼻づまり、くしゃみ、目のかゆみ、咽のかゆみ等が挙げられるが、これに限定されるものではない。）、アトピー性皮膚炎をはじめとする皮膚炎、もしくは気管支喘息、またはこれらの組み合わせを改善、治療するための薬剤、すなわち花粉症改善剤、皮膚炎改善剤、アトピー性皮膚炎改善剤または気管支喘息改善剤である。さらにより好ましくは、本発明の抗アレルギ一剤は花粉症改善剤である。また、他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギー剤は、血清中の I g E濃度を低下させるための血清中 I g E濃度低下剤である。さらに、他の好ましい態様は、本発明の抗ァレルギ一剤は I L一 4産生抑制剤である。また他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギー剤は T N F産生抑制剤である。

本発明における抗アレルギー剤は経口投与、または筋肉内、皮内、皮下、静脈内、下部体腔、皮膚、鼻腔内、経口もしくは経鼻吸引投与などの非経口投与により投与され得る。本発明の薬剤は、薬剤として許容可能な構成成分を含むことができ、当該構成成分については当業者が認識できる事項であり、特に限定されるものではない。本発明の抗アレルギー剤を製剤化するためには、製剤の技術分野における任意の通常の方法で製剤化することが可能であり、例えば、経口投与の場合には、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤などの剤型が採用されうる。また、経皮投与の場合には、軟膏剤、貼付剤、ローション剤、エアゾール剤などが挙げられる。すなわち、経口用固型製剤を調製する場合は、ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせに賦形剤、さらに必要に応じて結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、トローチ剤、糖衣錠剤などとすることができる。本発明の抗アレルギー剤に含まれるハスの破砕物および抽出物の量は、本発明の抗ァレルギ一剤が効果を奏する限りは特に限定されるものではない。

本発明の抗アレルギー剤のヒトに対する投与量は、ハスの破碎物および抽出物の乾燥重量として、経口投与で、成人、 1日あたり、破碎物の場合には、好ましくは、 l g〜1 0 0 g、より好ましくは、 2 g〜4 0 gである。また、抽出物の場合には、好ましくは、 0 . 5 g〜5 0 g、より好ましくは、 l g〜2 0 gである。

本発明の他の態様は、ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む抗アレルギ一用食品添加剤である。本発明における食品添加剤とは、食品に添加されるものであれば良く、その目的は問わない。ここでの抗アレルギー用食品添加剤は、当該食品添加剤を含む食品を摂取した者に対して、アレルギー反応に起因する疾患を改善、治療するための食品添加剤であり、好ましくは、 I 型アレルギー反応に起因する疾患を改善、治療するための食品添加剤である。より好ましくは、本発明の抗ァレルギ一用食品添加剤は、花粉症、アトピー性皮膚炎をはじめとする皮膚炎、もしくは気管支喘息、またはこれらの組み合わせを改善、治療するための食品添加剤、すなわち花粉症改善用食品添加剤、皮膚炎改善様食品添加剤、アトピー性皮膚炎改善用食品添加剤または気管支喘息改善用食品添加剤である。さらにより好ましくは、本発明の抗アレルギー用食品添加剤は花粉症改善用食品添加剤である。また、他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギ一用食品添加剤は、血清中の I g E濃度を低下させるための血清中 I g E濃度低下用食品添加剤である。さらに、他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギー用食品添加剤は I L一 4産生抑制用食品添加剤である。また、他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギー用食品添加剤は T N F産生抑制用食品添加剤である。本発明の抗アレルギー用食品添加剤を製造するためには、食品添加剤の技術分野における通常の方法で固体、顆粒、粉体、カプセル、溶液、懸濁物等の形態に製造することが可能である。本発明の食品添加剤は、食品添加剤として許容可能な構成成分を含むことができ、当該構成成分については当業者が認識できる事項であり、特に限定されるものではない。

本発明の抗アレルギー用食品添加剤に含まれるハスの破碎物および抽出物の量は、食品に添加される当該食品添加剤の量、食品の種類などに応じて変化するものであり、特に限定されるものではない。

本発明の他の態様は、ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む抗アレルギー用食品であるが、ここでの抗アレルギー用食品は、アレルギー反応に起因する疾患を改善、治療するための食品であり、好ましくは、 I型アレルギー反応に起因する疾患を改善、治療するための食品である。より好ましくは、本発明の抗アレルギー用食品は、花粉症、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎、もしくは気管支喘息、またはこれらの組み合わせを改善、治療するための食品、すなわち花粉症改善用食品、皮膚炎改善用食品、アトピー性皮膚炎改善用食品または気管支喘息改善用食品である。さらにより好ましくは-. 本発明の抗アレルギ一用食品は花粉症改善用食品である。また、他の好ましい態様は、本発明の抗ァレルギ一用食品は、血清中の I g E濃度を低下させるための血清中 I g E濃度低下用食品である。さらに、他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギー用食品は I L一 4産生抑制用食品である。また、他の好ましい態様は、本発明の抗アレルギー用食品は T N F産生抑制用食品である。本発明の抗アレルギー用食品としては、ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含んでいるのであれば特に限定されるものではない。また、食品の種類としては、通常食品として摂取されるものであれば特に限定されるものではなく、いわゆる健康食品、サプリメント、栄養補助食品と呼ばれるような、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの形状を有する食品だけでなく、うどん、そば、パス夕、ラーメン等をはじめとする麵類、小麦粉、そば粉、片栗粉、米の粉等の粉類、菓子パン、食パンなどのパン類、ケーキ、クッキー、せんべい、あんこ、ようかん、もち、団子、ゼリーなどの菓子類、ジュース、お茶などの飲料、即席麵、即席みそ汁、即席スープなどの即席食品などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。好ましくは、本発明の食品はハスの破碎物および Zまたは抽出物を含む粉類、例えば、小麦粉、そば粉、片栗粉、米の粉等から製造されるパン、ケーキ、クッキー、せんべいなどの食品である。より好ましくは、本発明の食品は、粉体状にされたハスの破碎物および/または抽出物を含む粉類、例えば、小麦粉、そば粉、片栗粉、米の粉等から製造されるパン、ケーキ、クッキ ―、せんべいなどの食品である。また、他の好ましい態様としては、本発明の食品は、ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含むョーダルトである。当該ヨーグルトは、ハスの破碎物および/または抽出物による効果と、乳酸菌のプロバイオティクス効果の相乗効果という有利な効果を有する。なお、ここでのヨーグルトとは、半固形状の通常のヨーグルトだけでなく、ヨーグルト飲料などのような液体状のヨーグルトも含む。ここで、上述の本発明の食品の製造については、任意の公知の方法、材料を使用することが可能である。

本発明の抗ァレルギ一用食品に含まれるハスの破碎物および抽出物の量は、本発明の抗アレルギ一用食品が効果を奏する限りは特に限定されるものではない。本発明の抗アレルギー用食品は、ヒト成人が 1日あたり、ハスの破碎物および抽出物の乾燥重量として、破砕物の場合には、好ましくは、 l g〜1 0 0 g、より好ましくは、 2 g〜4 0 gを摂取することとなる食品形態のものであり、また、抽出物の場合には、好ましくは、 0. 5 g〜50 g、より好ましくは、 l g〜2 0 gを摂取することとなる食品形態のものである。

本発明の抗アレルギー用食品は、当該食品を構成する原料に、ハスの破碎物および _ または抽出物を添加して製造することができ、また当該食品を構成する原料に、本発明の抗アレルギー用食品添加剤を添加して製造することも可能である。また、食品の種類によっては、製造された食品に、本発明の抗アレルギー用食品添加剤を添加して、本発明の抗ァレルギ一用食品とするような態様も可能である。本発明の経口薬剤、食品添加剤および食品は、好ましくは乳酸菌を含む。本発明における、乳酸菌を含む、経口薬剤、食品添加剤および食品は、ハスの破碎物および Zまたは抽出物による効果と、乳酸菌のプロバイオテイクス効果の相乗効果を達成できるので、抗ァレルギ一作用という点で有利である。この態様において使用可能な乳酸菌としては、ラクトバシラス (L a c t ob a c i l l u s) 属、ストレプトコッカス (S t r e p t o c o c c u s) 属、ビフイドバクテリゥム (B i f i d ob a c t e r i_um) 属、ノシラス（B a c i 1 1 u s ) 属に属する乳酸菌が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。経口摂取した場合に乳酸菌が生きたまま腸に到達し易いとの観点から、乳酸菌としては有胞子性乳酸菌が好ましい。有胞子性乳酸菌は、特に限定されるものではないが、例えば、 Ba c i l l u s c o agu l an s等が挙げられる。

理論に拘束されるのを望むものではないが、本発明におけるハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む抗アレルギー剤をヒトを含む哺乳類に経口投与した場合の抗アレルギー作用のメカニズムの 1つは、当該抗アレルギー剤の経口投与による、生体内におけるタイプ 2のヘルパー Tリンパ球（Th 2) によるインタ一ロイキン 4 ( I L-4) の産生抑制、およびこれによる B細胞での I gEの産生抑制に起因しているものと考えられる。また、他のメカニズムとしては、当該抗アレルギー剤の経口投与による、生体内での TNF、好ましくは、 TNF— aの産生抑制による、炎症反応の抑制に起因しているものと考え 8

1 0 られる。なお、作用メカニズムとして上述の例を挙げたが、これは、他の作用メ力二ズムを排除するものではない。

本発明の抗アレルギー剤、抗アレルギー用食品添加剤および抗アレルギー用食品は、ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを有効成分として含むことにより、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎をはじめとするァレルギ一疾患の改善、治療を可能にするという有利な効果を有する。また、本発明の薬剤、食品添加剤および食品は、ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを有効成分として含むことにより、血清中 I g E濃度を低下できるという有利な効果を有する。

さらに、本発明の薬剤、食品添加剤および食品は、ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを有効成分として含むことにより、生体内での I L - 4産生を抑制できるという有利な効果を有する。

また、本発明の薬剤、食品添加剤および食品は、ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを有効成分として含むことにより、生体内での T N F 産生を抑制できるという有利な効果を有する。

また、本発明の薬剤、食品添加剤および食品は、ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを有効成分として含むことにより、冷え性を改善、治療できるという有利な効果を有する。図面の簡単な説明

図 1は実施例 2におけるレンコン抽出物の摂取開始前（0週目）と摂取 9 週目での、被験者ごとの血清中 I g E濃度を示すグラフである。

図 2は、実施例 2における、レンコン抽出物の摂取開始前（0週目）と摂取 9 週目での、被験者ごとの血清中 I g G濃度を示すグラフである。

図 3は、実施例 2における、レンコン抽出物の摂取開始前（0週目）と摂取 8 週目での、被験者ごとのリンパ球培養上清中の I L一 2濃度を示すグラフである。図 4は、実施例 2における、レンコン抽出物の摂取開始前（0週目）と摂取 6 〜 8週目での、被験者ごとのリンパ球培養上清中の I L一 4濃度を示すグラフである。

図 5は、実施例 3における、花粉体質被験者における I g Eの変動を示すダラフである。

図 6は、実施例 3における、花粉体質被験者における I g Eの変動を示すダラフである。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。

実施例

実施例 1 ：スギ花粉投与マウスのレンコンエキス経口摂取の影響

1 ) レンコン抽出物の調製方法

市販のレンコン 2 0 gを細切し、これに蒸留水 5 O mLを加え、 8分間煮沸した後、ろ過し、ろ液をレンコン抽出物とした。

2 ) レンコン抽出物の経口投与法とスギ花粉エキスの経鼻投与法

スギ花粉エキスを投与する 7日前から、マウス（B AL BZ c ；メス、 3週齢）にゾンデを用いて、 1個体あたりレンコン抽出物を 1日 1回 0 . 5 mL経口投与した (前投与）。なお、マウスは飼料 (一般市販の固形飼料)、水道水を自由に摂取できるようにして、 1 2時間点灯一 1 2時間消灯のサイクルで飼育を行った。上記前投与を 7日間行った後、さらに 1 4日間、 1日 1回レンコン抽出物を経口投与する (本投与) と共に、並行してスギ花粉エキス (鳥居薬品；スギ花粉スクラッチ用アレルゲン）をマイクロピぺットでマウスの鼻腔内に 2 5 滴下して、スギ花粉感作マウスを人為的に作出した（実施例 1 )。

なお、比較例 1として、レンコン抽出物の代わりに蒸留水を同量投与したものをコントロール群とした。なお、実験には各群 9匹のマウスを使用した。

3) 血清の採取法

14日間の本投与の最後の投与の 4時間後に、エーテル麻酔し、肝動脈より 1 mLシリンジを用いて採血し、 37°C、 60分放置後、血清を分離した。

4) SR ID法（平板内単純免疫拡散法）による血清 I gG測定

SR ID法で血清中の I gG濃度を測定した。測定は、後述の実施例 2で記載される方法に準じて行った。

5) EL I SA法（酵素免疫測定法）による血清 I gE測定

EL I S A法で血清中の I gE濃度を測定した。測定は、後述の実施例 2で記載される方法に準じて行った。

6) 腹腔マクロファージの培養と TNF— α産生の測定

腹腔マクロファージ採取 2日前に、腹腔内にチォグリコレートを 1 m L注入した。実験当日採血前に、 3〜5mLの冷 MEMを注入してよくもみ、マクロファージを採取した（3〜4回繰り返して行った）。

細胞濃度を 2 X 10⁶ c e 1 1 ZmLに調整し、 10 g LPS (大腸菌由来）を含む MEMに浮遊させ、 lmLずつ 12穴プレートのゥエルに入れて 37 °Cで 24時間培養した。この培養上清を採取して、測定まで一 80°Cに保存した。

TNF— は和光純薬製のキットを用いて、 EL I S A法によって測定した。

7) 脾臓細胞の培養、並びに I L— 2および I L— 4産生の測定

採血時に、脾臓を無菌的に取り出し、 RPMI 1640培養液を 2mL入れた小型シャーレに細胞用 200メッシュの金属フィルターを置き当該フィルタ一上に摘出した脾臓を置き、 5mL用の注射器のピストンのプッシュ面を用いて脾臓から脾臓細胞を取り出した。

得られた脾臓細胞を最終的に 10% FBS、 20 g ConA (コンカナパリン A) を含む RPMI 1640に、 l X 10⁶c e l 1/mLとなるように調整して浮遊させた。次いで、 12穴プレートに細胞浮遊液を lmLずつ入れ、 5 %C0₂存在下で 48時間培養した。この培養上清を測定まで— 80°Cに保存した。

I L一 2と I L— 4の測定は E L I S A法で行つた。測定は、後述の実施例 2 で記載される方法に準じて行った。

血清中の I gGは、コントロール群である比較例 1では 469mgZdLであつたのに対し、レンコン抽出物投与群である実施例 1では 875mg/dLと比較例の約 1. 86倍増加していた。このことから、レンコン抽出物は血清中の I gG増加による感染防御能を上昇させることが示唆される。

これに対して、 I型アレルギーと密接な関係を有する I gEについては、比較例では 87. 2 ng/dLであったのに対し、実施例 1では 38. 6 ng/dL と、比較例 1の約 0. 44倍に低下していた。

このことから、レンコン抽出物を経口投与することにより、血清中の I gGを上昇させると共に、血清中の I gEを低減できることが明らかとなった。

また、マクロファージの TNF— α産生については、比較例 1では培養液中の TNF— α濃度は 37. 2 p gZmLであったのに対し、実施例 1では 15. 5 p g/mLと、約 0. 42倍に低下していた。

このことから、レンコン抽出物を経口投与することにより、 TNF—ひの産生が抑制されることが明らかとなり、本発明における抗ァレルギ一作用の作用機序の 1つが TN F産生抑制であり得ることが推察される。

また脾臓細胞の I L一 2産生については、比較例 1では培養液中の I L一 2 濃度は 63. 6 p gZmLであったのに対し、実施例 1では 94. 2 p g mL と、約 1. 48倍に増加していた。このことから、レンコン抽出物は ΤΙΊ 1による細胞性免疫を亢進させることが示唆される。

これに対して、生体内において Β細胞における I gE産生に関与する I L一 4 については、比較例 1においては 1 16. 4 p gZmLであったのに対し、実施例 1では 36. 8 pg/mLと、約 0. 32倍に低下していた。このことから、レンコン抽出物を経口投与することにより、 I L一 2の産生が亢進されると共に、 I L— 4の産生が抑制されることが明らかとなった。

実施例 1及び比較例 1から、レンコン抽出物を経口投与することにより、生体内での I L一 2の産生が促進される一方、生体内での I L— 4の産生が抑制され、これにより血清中の I gEが低減され、これにより抗アレルギー作用が生じ得ることが推察される。

実施例 2 ：レンコン抽出物の連続的摂取がヒト免疫系に及ぼす影響

1) レンコン抽出物の調製方法

市販のレンコン 100 k gの皮をむき、水洗後 5〜 10mm厚さにスライスした。水 260 Lを加え、水およびレンコンをニーダ一に投入し 98°Cに昇温して撹拌した。 99t:に昇温後 30分間煮沸した。次いで、煮沸物をニーダ一から取り出し、サラシでろ過して得られたろ液をフリーズドライ法により粉末にした。この操作により、 5. 0 kgのレンコン抽出物粉末を得た。この粉末 5. 0 kg に等量の乳糖を加え、直径 8mmの丸形の白色錠剤（約 250mgZ粒） 10. 0 kgを作成し、これを抗ァレルギ一剤 L R Eとした。

2) レンコン抽出物の投与量および投与スケジュール

4名の女性（21歳、花粉体質）を被験者とした。

被験者による LREの摂取は、朝および夕の 2回、食前に 8粒を水または湯で飲用することとした。なお、朝摂取するのを忘れた場合には、倍量を夕食前に摂取することとした。 LREの摂取は 9週間の間行われた。 '

3 ) 被験者からの血清および末梢血中のリンパ球の採取

レンコン抽出物の連続摂取開始前と摂取後 7日間ごとに、以下の方法で、血清とリンパ球を採取し、実験に用いた。なお、操作は全て無菌的に行い、器具も滅菌済みの器具を使用した。

a)静脈血を 1 OmL採血し、血清分離用採血管に 2 mL、残りを抗凝固剤（クェン酸ナトリウム）の入った 2本の採血管に 4mLずつ分注した。 b) 血清分離用採血管を 37°C、 1時間放置後、 3000 r pm、 15分の遠心操作を行い、得られた血清をマイクロチューブに取り、使用するまで一 80°C 下に冷凍保存した。

c) 末梢血中からリンパ球を得るために、抗凝固剤入りの採血管に採取された血液を PBS (pH7. 2) で 2倍希釈した。これを比重 1. 077のヒトリンパ球分離液（LSM) に重層して 1600 r pm、 20分の冷却遠心を行い、界面の総リンパ球を得た。

d) リンパ球を小試験管に集め、 PBSにて 1400 r pm、 10分の冷却遠心操作を 2回行い、洗浄した。なお、赤血球が混在した場合には、ろ過滅菌したトリス塩化アンモニゥムを用いて 37°C、 10分間放置して、赤血球を溶血させた。

e) 上清を除去し、 20 gZmL濃度のコンカナパリン A (Con A) を含む RPMI 1640培養液を ImL入れ、良く混和後、夕タイ式血算板にて細胞数を求めた。細胞数は 2X 10⁶c e 1 1/mLに調整された。その後、培養用 8穴プレートを用いて、リンパ球浮遊液を 37°C、 48時間培養した。

f )培養後、上清をマイクロチューブに取り、 6000 r pm、 5分間遠心後、その上清を別のマイクロチューブに移して実験日まで一 80で下に冷凍保存した。

4) 血清 I gEのEL I S Aによる測定

被験者の血清中に存在する I gE抗体の定量を以下の EL I S Aによって行つーレ

/こ。

a) 炭酸ナトリウム緩衝液で 100倍希釈した抗 I ^£抗体を5し I SA用 9 6穴プレートのゥエルに 100 入れ、室温、 60分間固相化した。

b) 洗浄液で 2回洗浄後、 p o s t— c o a t用緩衝液を 200； L入れ、 3 7°C、 30分間インキュベートした。

C) 洗浄液で 2回洗浄後、被験者血清並びに I gE標準液（1. 87 ； 3. 7 5 ； 7. 5 ； 15 ； 30 n g/mL) を 100 L入れ、 37°C、 60分間反応させた。

d) 洗浄液で 2回洗浄後、 2000倍希釈したペルォキシダ一ゼ（HRP) 標準抗体を 100 L入れ、 37°C、 60分間反応させた。

e) 洗浄液で 3回洗浄後、発色液（o—フエ二レンジアミン液； OPD液）を 100 L入れ、室温、 30分間反応させた。

f) 発色後、停止液（3 M硫酸）を l O O ^L入れ、 EL I SAリーダーにて 490 nmでの吸光度を測定した。

g) 標準曲線より、被験者の血清中の I gE濃度を算出した。

各被験者における、レンコン抽出物の摂取開始前（0週目）と摂取 9週目での、血清中 I gE濃度のグラフが図 1に示される。

5) 血清 I gGの SR I D法による測定

被験者の血清中に存在する I gG抗体の定量を、以下の SR I D法によって行つた。

a) 生理的食塩水で良く洗浄したマイクロシリンジを用いて、標準 I gG血清 (543、 1604、 3053mgZdL) 並びに被験者血清を正確に 4 ずつ、 MBLヒト I gG定量用ァガロースプレート（医学生物学研究所）の各ゥェルに入れた。プレートカバーをして、室温、 24時間インキュベートした。 b) 反応後、生じた沈降リングの直径を測定し、標準曲線から被験者の血清中の I gG濃度を算出した。

各被験者における、レンコン抽出物の摂取開始前（0週目）と摂取 9週目での、血清中 I gG濃度のグラフが図 2に示される。

6 ) リンパ球培養上清中の I L一 2の E L I S Aによる測定

48時間培養された末梢血中リンパ球から分泌される I L一 2の定量は、以下の EL I SAによって行った。

a) EL I SA用 96穴プレートのゥエルに被験者血清並びに I L— 2標準液 (31、 25、 62. 5、 125、 250、 500、 1000 p g/mL) を 1 00 iiL入れた。

b) ピオチン化抗体（抗 I L一 2) を 50 L入れ、室温、 1時間インキュべ一卜した。

c) 3回洗浄後、ストレプトアビジン— HRPを 100 L入れ、室温、 30 分間反応させた。

d) 3回洗浄後、発色液（TMB) を 100 入れ、遮光して室温、 10〜 15分間反応させた。

e) 停止液（硫酸）を 100 入れ、 EL I SAリーダーにて 450 nmでの吸光度を測定した。

f ) 標準曲線より被験者リンパ球培養上清中の I L一 2濃度を算出した。各被験者における、レンコン抽出物の摂取開始前（0週目）と摂取 8週目での、リンパ球培養上清中の I L一 2濃度のグラフが図 3に示される。

7 ) リンパ球培養上清中の I L一 4の E L I S Aによる測定

48時間培養された末梢血中リンパ球から分泌される I L— 4の定量は、以下の EL I SAによって行った。

a) EL I S A用 96穴プレートのゥエルに被験者血清並びに I L一 4標準液 (1. 21、 . 4、 8. 75、 17. 5、 35 p g/mL) を 100 入れ、室温、 2時間インキュベートした。

b) 3回洗浄後、ピオチン化抗体（抗 I L— 4) を 50 L入れ、室温、 1時間インキュベートした。

c) 3回洗浄後、ストレプトアビジン— HRPを 100 ,"L入れ、室温、 30 分間反応させた。

d) 3回洗浄後、発色液（TMB) を 100 L入れ、遮光して室温、 15〜 20分間反応させた。

e) 停止液（硫酸）を 100 /L入れ、 EL I S Aリーダーにて 450 nmでの吸光度を測定した。

f ) 標準曲線より被験者リンパ球培養上清中の I L一 4濃度を算出した。各被験者における、レンコン抽出物の摂取開始前（0週目）と摂取 6〜 8週目での、リンパ球培養上清中の I L一 4濃度のグラフが図 4に示される。

実施例 2においては、レンコン抽出物を含む抗ァレルギ一剤である L R Eを 9 週間摂取することにより、 4名の被験者いずれにおいても、 LRE摂取前と比較して、血清中の I gE濃度の低下が認められた。これに対して、 I gGについては、 4名の被験者いずれにおいても血清中濃度の上昇が認められた。

また、レンコン抽出物である LREを 8週間摂取することにより、 4名の被験者いずれにおいても、 LRE摂取前と比較して、末梢血中リンパ球における I L 一 2の産生が促進されることが認められた。これに対して、 I L— 4の産生については、 4名の被験者いずれにおいても、 LREを 6〜 8週間摂取することにより、末梢血中リンパ球における I L一 4の産生が抑制されることが認められた。実施例 2から、レンコン抽出物を経口摂取することにより、生体内での I L一 2の産生が促進される一方、生体内での I L一 4の産生が抑制され、これにより血清中の I gEが低減され、これにより抗アレルギー作用が生じ得ることが推察される。

実施例 3 ：レンコン抽出物の連続的摂取が花粉体質改善に及ぼす影響

1) レンコン抽出物の調製方法

実施例 2において使用したレンコン抽出物を含む抗アレルギ一剤 LR Eを使用した。

2) レンコン抽出物の投与量および投与スケジュ一ル

17名の花粉体質の被験者、男性 2名（40代1名、 30代1名）、女性 15 名（50代 3名、 40代 5名、 30代1名、 20代 3名、 10代 3名）、および花粉体質でない 2名の被験者（男性 50代 1名および女性 40代 1名）の合計 1 9名を被験対象者とした。被験対象者による LREの摂取は、朝および夕の 2回、食前に 8粒を水または湯で飲用することとした。なお、朝摂取するのを忘れた場合には、倍量を夕食前に摂取することとした。 LREの摂取は 3ヶ月（1 2月上旬から 3月上旬まで）の間行われた。

3) 被験者からの血清の採取

レンコン抽出物の連続摂取開始前と摂取後約 1月ごとに、病院において採血し、血清を分離して、血清中の I gE (非特異的 I gE)、スギ花粉特異的 I gEおよびヒノキ花粉特異的 I gEの濃度の測定を行った。なお、これらの測定は株式会社ピ一 ·ェム ·エルが行った。

花粉特異的 I gEについては、 I gE濃度を 0〜6の 7段階に分けて評価した。すなわち、クラス 0 ： 0. 34 (UA/HIL, 以下同じ単位）以下、クラス 1 ： 0. 3 5〜0. 6 9、クラス 2 ： 0. 7 0〜 3. 49、クラス 3 ： 3. 5 0〜 1 7. 49、クラス 4 : 1 7. 5〜49. 9、クラス 5 : 50. 0〜9 9. 9、クラス 6 ： 1 0 0以上である。

4) 花粉症症状の改善度

花粉症の症状の改善度は、本試験期間中のアレルギーの症状（くしゃみ、鼻水：鼻づまり、目のかゆみ、なみだ目、眼異物感、まぶた違和感、その他顔のほてり、頭痛、皮膚のかゆみ、咽頭のかゆみ、口のかゆみ、呼吸異常音など）について、本試験が行われる前年度の症状に対する改善度を 4段階（改善無し；軽度の改善；中程度の改善；著しい改善）で被験者が自己申告するものとした。

以下、実施例 3の結果を示す。

花粉体質の被験者における血清 I gE (非特異的 I gE) に及ぼす影響抗アレルギー剤 LREの摂取開始前の I gE濃度と比較して、投与 3ヶ月後の I gE濃度が低下した被験者は全部で 14名（7 3. 7%)であった。そのうち、 4割減は 2名（1 0. 5 %；男性 3 0代 1名、女性 40代 1名）、 3割減は 7名 (3 6. 8%；男性 40代 1名、女性 5 0代 1名、 40代 3名、 20代 1名、 1 0代 1名）、 2割減が 4名（21. 0% ;女性50代1名、 20代 2名、 10代 1名）、 1割減が 1名（5. 3% ;女性 50代）であった。全く変化がなかったのが 1名（5. 3% ;女性 40代）、上昇したがほとんど変化がなかったのは 2 名（10. 5%；女性 30代 1名、 10代 1名）であった。上述のように、抗ァレルギ一剤 LREによる効果が認められたが、この効果については、年齢や性別によるかたよりは認められなかった。

代表例として、 I gE濃度が低下した被験者における、 I gE濃度の変動のグラフを図 5 (男性 30代）および図 6 (女性 20代）に示す。図 5および図 6は、縦軸に I gE濃度（非特異的 I gE濃度）、花粉特異的 I gEをとり、横軸は採血日である。図 5においては試験開始日は 12月 4日であり、図 6においては試験開台日は 12月 5日である。

花粉体質の被験者における血清中花粉特異的 I gEに及ぼす影響

花粉体質の被験者においては、非特異的 I gE濃度が上昇すると、花粉特異的 I gEの濃度が上がり、非特異的 I gE濃度が低下すると、花粉特異的 I gEの濃度も低下する傾向が認められた。図 6においても、非特異的 I gEの低下と共に、スギ特異的 I gEおよびヒノキ特異的 I gEが低減していることが認められる。

花粉体質ではない被験者に対する影響

花粉体質でない 2名の被験者（男性 50代 1名、女性 40代 1名）のいずれも、非特異的 I gE濃度の低下が認められた。低下の程度は、試験開始前から 3ヶ月後で、それぞれ.. 39力、ら 37 I U/mL、 8から 5 I UZmLであった。なお、花粉特異的 I g Eは試験期間中いずれの時点においてもクラス 0であつた。

花粉体質の被験者におけるアレルギー症状改善の評価

17名の花粉体質の被験者のうち 7名（41. 2%) に、前年度と比較してァレルギ一症状の改善が認められた。また、 3ヶ月の試験期間中、当該抗アレルギー剤 L R Eを摂取することによる重大な身体的トラブルは認められず、危険な副作用は無いことが確認できた。また、被験者 5名において、 3ヶ月の投与により、肌荒れ等を含む皮膚炎の症状の改善が認められた。

また、被験者 7名において、 3ヶ月の投与により、自覚症状による冷え性の改善が認められた。

実施例 4 ：レンコン抽出物の連続的摂取が重症の花粉体質改善に及ぼす影響

1 ) レンコン抽出物の調製方法

実施例 2において使用したレンコン抽出物を含む抗ァレルギ一剤 L R Eを使用した。

2 ) レンコン抽出物の投与量および投与スケジュール

実施例 3の被験者よりも、重症の花粉体質の被験者 1 8名〔男性 7名（5 0代 1名、 4 0代 4名、 3 0代 1名、 2 0代 1名）、女性 1 1名（4 0代 2名、 3 0 代 6名、 2 0代 3名）〕を被験対象者とした。なお、重症の判断は被験者の自己申告に基づいて行った。

被験対象者による L R Eの摂取は、朝および夕の 2回、食前に 1 1粒を水または湯で飲用することとした。なお、朝摂取するのを忘れた場合には、倍量を夕食前に摂取することとした。 L R Eの摂取は約 5ヶ月（1 2月上旬から 4月下旬まで）の間行われた。

3 ) 花粉症症状の改善度

花粉症の症状の改善度は、本試験期間中のアレルギーの症状（くしゃみ、鼻水、鼻づまり、目のかゆみ、なみだ目、眼異物感、まぶた違和感、その他顔のほてり、頭痛、皮膚のかゆみ、咽頭のかゆみ、口のかゆみ、呼吸異常音など）について、本試験が行われる前年度の症状に対する改善度を、 4段階（改善無し；軽度の改善；中程度の改善；著しい改善）で被験者が自己申告するものとした。

以下、実施例 4の結果を示す。花粉体質の被験者におけるァレルギ一症状改善の評価

18名の花粉体質の被験者のアレルギ一症状については、著しい改善が認められた被験者 5名（28%)、中程度の改善が認められた被験者 7名（39%)、軽度の改善が認められた被験者 4名（22%)、改善が認められなかった被験者 2名（1 1 %) であり、被験者全体の 89%について、前年度と比較したアレルギ一症状の改善が認められた。また、改善が認められなかった 2名の被験者は、いずれも、 LREの摂取を約 1月以内に中止していた。この点を考慮すると、 L REの摂取を継続した花粉体質の被験者においては、全ての被験者でアレルギー症状の改善が認められた。

実施例 4においては、実施例 3におけるよりもァレルギ一症状の改善の程度が良好であった。この理由については、明確ではないが、抗アレルギ一剤 LREの摂取量が実施例 4において多かったこと、被験者の花粉体質の程度が重症であつたこと等の原因が考えられる。

また、約 5ヶ月の試験期間中、当該抗アレルギー剤 LREを摂取することによる重大な身体的トラブルは認められず、危険な副作用は無いことが確認できた。産業上の利用可能性

本発明の薬剤、食品添加剤および食品は、抗アレルギー、花粉症改善、血清中 I gE濃度低下、 I L一 4産生抑制、 TNF産生抑制のために使用することができる。

Claims

請求の範囲

1. ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む抗ァレルギー剤。

2. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせが、レンコンの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせである請求項 1記載の抗ァレルギ一剤。

3. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む抗ァレルギー用食品添加剤。

4. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む抗ァレルギー用食品。

5. ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせが、レンコンの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせである請求項 4記載の抗ァレルギ一用食品。

6. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む花粉症

7. ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む花粉症改善用食品添加剤。

8. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む花粉症改善用食品。

9. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む血清中 I gE濃度低下剤。

10. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む血清中 I gE濃度低下用食品添加剤。

11. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む血清中 I gE濃度低下用食品。

12. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む I L 一 4産生抑制剤。

13. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む I L 一 4産生抑制用食品添加剤。

14. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む I L 一 4産生抑制用食品。

15. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む TN F産生抑制剤。

16. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む TN F産生抑制用食品添加剤。

17. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む TN F産生抑制用食品。

18. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む粉類から製造される、パン、ケーキ、クッキ一およびせんべいからなる群から選択される食品。

19. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含むョ一ダル卜。

20. ハスの破砕物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含む即席麵、即席みそ汁および即席スープからなる群から選択される即席食品。

21. ハスの破碎物もしくは抽出物、またはこれらの組み合わせを含むもち。