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WO2004063371A1 - タンパク質複合体及びその製造方法並びにその用途 - Google Patents

タンパク質複合体及びその製造方法並びにその用途 Download PDF

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WO2004063371A1
WO2004063371A1 PCT/JP2004/000032 JP2004000032W WO2004063371A1 WO 2004063371 A1 WO2004063371 A1 WO 2004063371A1 JP 2004000032 W JP2004000032 W JP 2004000032W WO 2004063371 A1 WO2004063371 A1 WO 2004063371A1
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WO
WIPO (PCT)
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protein
protein complex
amino acid
polyhedron
complex
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2004/000032
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Keiko Ikeda
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Protein Crystal Corp
Original Assignee
Protein Crystal Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Protein Crystal Corp filed Critical Protein Crystal Corp
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Priority to DE602004026157T priority patent/DE602004026157D1/de
Priority to EP04700519A priority patent/EP1582589B1/en
Priority to US10/541,752 priority patent/US7619060B2/en
Priority to JP2005507964A priority patent/JP5253715B2/ja
Publication of WO2004063371A1 publication Critical patent/WO2004063371A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a protein complex, a method for producing the same, and uses such as a biosensor and an immobilized enzyme using the protein complex.
  • a so-called protein complex in which a protein is wrapped in a protein has been known.
  • a method of applying a dissolved protein solution to the surface of a crystalline protein can be considered.
  • target proteins useful proteins such as enzymes, antigens, antibodies, cytokines and receptors (hereinafter referred to as target proteins).
  • target proteins useful proteins such as enzymes, antigens, antibodies, cytokines and receptors
  • a method of covalently bonding a polymer such as a polysaccharide polymer or polyethylene dalicol to the target protein has been adopted.
  • a polymer is bound to a functional group such as an amino group or a carboxyl group of a target protein under mild reaction conditions.
  • this method could not control the binding site and catalytic site of the target protein.
  • binding sites and catalytic sites vary depending on the type of target protein.
  • the present invention has been completed by further improving the above-mentioned invention and identifying VP3 as a polyhedron-embedded signal in a specific range.
  • the present invention makes it possible to encompass a target protein having a large size (molecular weight), a target protein having a fluorescence or luminescence function or a physiologically active function, and a high-molecular-weight target protein, and a target protein in a complex state.
  • the purpose is to provide a protein complex whose quality function can be verified.
  • Another object of the present invention is to provide a production method capable of efficiently producing a protein complex surrounding a target protein having various properties without deteriorating the function of the protein complex.
  • an object of the present invention is to provide uses such as a biosensor and an immobilized enzyme using a protein complex.
  • the gist of the present invention is a protein complex comprising a polyhedral protein in which an insect virus is encapsulated and a target protein having a restricted region of the outer protein VP3 of cytoplasmic polyhedrosis virus as a polyhedron-embedded signal. .
  • the restricted region of VP3 is either in the range from the N-terminus to 40 amino acid residues or in the range from 41 amino acid residues to 79 amino acid residues.
  • Body protein and cytoplasmic polyhedrosis virus outer protein 40-amino acid residues from the N-terminus of VP3 and 41 amino acids (Non-Patent Document 1)
  • the present inventor relates to a protein complex that contributes to protection, storage, and improvement of stability of a target protein, and a method for producing the same.
  • the invention was completed and the application was filed earlier (Patent Document 1).
  • the specification of the invention described above aims at embedding a high-molecular-weight target protein in the polyhedron and increasing the embedding efficiency.
  • the size (molecular weight) of the protein that can be embedded in the polyhedron is increased, and the efficiency is improved.
  • the protein of interest is embedded in the body.
  • the amino acid sequence of VP3, a protein constituting the outer layer of cytoplasmic polyhedrosis virus is introduced into the N-terminal or C-terminal of the target protein, and this fusion protein is expressed in a baculovirus virus vector.
  • the fusion protein is embedded in the polyhedron by infecting insect cells together with a virus that expresses the polyhedron protein of the cytoplasmic polyhedrosis virus.
  • the foreign protein expressed by the baculovirus vector that is, the target protein
  • the target protein is inserted into the N-terminal or C-terminal of the protein constituting the cytoplasmic polyhedrosis virus so that the structure of the cytoplasmic polyhedrosis virus is constructed.
  • Protein 3 ⁇ 4 It is necessary to fuse the encoding cDNA with the target protein gene. At this time, it is important that the open reading frame encoding the constituent protein and the protein of the target protein gene be in frame, and thus the constituent protein of the cytoplasmic polyhedrosis virus and the target protein are combined. Describes that a recombinant PacuMouth virus is formed that is expressed as two fusion proteins.
  • Patent Document 1 International Publication WO 0 2/3 6 7 8 5 A 1 Two
  • a method of storing the target protein at a low temperature is used.
  • a method of adding and mixing a protective substance eg, polysaccharide polymer, polyethylene glycol, etc.
  • a protective substance eg, polysaccharide polymer, polyethylene glycol, etc.
  • the stability and function of the target protein were sometimes impaired due to external factors such as environmental changes. This is because if the appearance of water in the surroundings, an increase in temperature or humidity, or condensation occurs, the target protein is easily dissolved together with the protective substance. Also, if spoilage bacteria such as bacteria and fungi are present, invaded or generated, the target protein is degraded and predated together with the protective substance.
  • the target protein is a high molecular weight protein such as a part of an enzyme or a protein molecule of an antibody, even if a part of the target protein is structurally changed or a part thereof is degraded by the action of a protease, Complete loss of functionality.
  • the stability of the target protein in the stored state must be individually verified.However, in the case of the conventional technology, the target protein must be removed from the protective substance. May be easily denatured. In the late stage of infection, cytoplasmic polyhedrosis virus forms polyhedra composed of polyhedral proteins in the infected cells, and embeds a large number of virus particles therein.
  • the reason that virus particles specifically enter this polyhedron is that the specific protein between VP3, the outer shell protein of the virus particle, and the polyhedron protein A gist is a protein complex that produces the above or any combination of these effects.
  • the present invention relates to a method of infecting a cell incorporating a gene encoding a protein of interest with a vector incorporating a polyhedrin protein gene, and culturing the cell.
  • the gist is a method for producing a protein complex for producing a protein complex having a complex structure comprising a target protein and a polyhedral protein.
  • the present invention relates to a limited region of the polyhedron protein in which insect virus is encapsulated and the outer protein of cytoplasmic polyhedrosis virus, specifically, the region from the N-terminus of VP3 to 40 amino acid residues and 41 amino acids.
  • a target protein having a limited region in any range from an acid residue to a 79-amino acid residue as a polyhedron-embedded sidana specifically, a protein, enzyme, or antigen having a fluorescent or luminescent function
  • a protein complex comprising at least one protein of interest selected from the group consisting of antibodies, cytokines, receptors, and bioactive proteins, preferably a polyhedral protein is stable to the target protein A protein complex that has the effect of improving protein stability or protecting or preserving, or a combination of any of them, onto a substrate.
  • the gist of the present invention is a biosensor characterized in that a biosensor or a protein complex is filled in a container so that the protein complex can contact with a substance in a sample solution.
  • the gist of the present invention is a protein complex comprising a target protein having a restricted region in any range from a noic acid residue to a 79 amino acid residue as a polyhedron embedding signal.
  • the polyhedral protein has an effect of improving stability, protecting or preserving the target protein, or a combination of any of them, and in this case, the present invention relates to a polyhedral protein in which an insect virus is encapsulated.
  • a limited region of the coat protein of the cytoplasm and cytoplasmic polyhedrosis virus specifically, either from the N-terminus of VP3 to 40 amino acid residues or from 41 amino acid residues to 79 amino acid residues
  • a polyhedron protein with a polyhedron-embedded signal having a limited region in the range of The summary is the protein complex that is producing the effect.
  • the target protein is at least one selected from the group consisting of a protein having a fluorescent or luminescent function, an enzyme, an antigen, an antibody, a cytokine, a receptor, and a bioactive protein.
  • the present invention relates to an insect ⁇ Limited regions of polyhedra proteins encapsulating the virus and outer proteins of cytoplasmic polyhedrosis virus, specifically from the N-terminus of VP3 to 40 amino acid residues and from 41 amino acid residues to 79 amino acid residues Group consisting of proteins, enzymes, antigens, antibodies, cytokines, receptors, and bioactive proteins that have a restricted region in any range up to the group as a polyhedron-embedded signal and have a fluorescent or luminescent function
  • a protein complex consisting of at least one target protein selected from the group consisting of Stability or protection or preservation of protein
  • the present invention also relates to a limited region of a polyhedron protein in which an insect virus is encapsulated and a shell protein of a cytoplasmic polyhedropathy virus, specifically,
  • a protein of interest having a restricted region in the range from the N-terminus of VP3 to the 40 amino acid residues or from 41 amino acid residues to the 79 amino acid residues as a polyhedron-embedded signal specifically A protein complex comprising at least one target protein selected from the group consisting of proteins having fluorescent or luminescent functions, enzymes, antigens, antibodies, cytokines, receptors, and bioactive proteins
  • the immobilization in which the protein complex in which the polyhedral protein has improved stability, protection or storage stability for the target protein, or a combination effect of any of them is filled in a container.
  • the enzyme is the abstract.
  • FIG. 1 is a drawing explaining the method for shortening the VP3 gene and the preparation of a transfer vector.
  • FIG. 2 is a drawing showing the relationship between the weakened VP3 gene and the amino acid residues encoded thereby.
  • Figure 3 shows that the truncated VP3 gene was introduced into the EGFP gene, and whether the encoded protein was surrounded by the polyhedron was measured by the presence or absence of green fluorescence from the polyhedron. It is.
  • FIG. 4 shows the intensity of green fluorescence observed in a state where EGFP having a shortened VP3 sequence at its N-terminal is surrounded by a polyhedron.
  • the intensity of the fluorescence intensity was expressed in five levels of 1+, 2+, 3+, 4+, and 5+.
  • Figure 5 shows the signole that surrounds the VP3 from 39 amino acid residues to 79 amino acid residues in a polyhedron, and was introduced into the N-terminus of Cyclin-dependent kinase 5. After surrounding this protein in a polyhedron, It is attached to glass and subjected to an antigen-antibody reaction on the surface of the polyhedron.
  • the protein complex according to the present invention is a polyhedral protein in which an insect virus is encapsulated, and surrounds a target protein having a limited region of the outer protein VP3 of cytoplasmic polyhedrosis virus as a polyhedron embedding signal. It becomes.
  • the term “surrounding” means a state in which the target protein is completely enveloped in the polyhedral protein and a state in which the protein is partially exposed and embedded outside the polyhedral protein.
  • the shape of the composite includes a regular or irregular particle such as a cube, a rectangular parallelepiped, or a cylinder.
  • the restricted region of VP3 ranges from 41 amino acid residues to 79 amino acid residues in addition to the N-terminal to 40. Although it is troublesome and inefficient, it is also possible to use a region from 41 amino acid residues to 79 amino acid residues from the N-terminal and 10 amino acid residues added to the N-terminal or C-terminal of the region. .
  • the target protein is an enzyme, an antigen, an antibody, a receptor, or a cytokine when considering the binding to a biologically relevant chemical substance, and is a luminescent protein when considering the photochemical characteristics.
  • they are metal-binding proteins and metal ion-containing enzymes. In view of the characteristics of these target proteins, it is preferable to select at least one type from among them. 04 000032
  • the method for producing a protein complex according to the present invention includes the steps of simultaneously or together with a setter incorporating DNA of a target protein having a restricted region of VP3 as a signal and a setter incorporating DNA of a polyhedral protein. After transfection into cells such as cells, plant cells, and cell-free cells, the cells are cultured under conditions suitable for each cell. This allows efficient production without reducing the function of the protein complex.
  • the vector incorporating the DNA of the target protein and the vector incorporating the DNA of the polyhedral protein are plasmid vector vectors, etc., each of which is suitable for the cell into which the DNA is to be introduced. Just do it.
  • the protein complex of the present invention can be used as a receptor by arranging and fixing the protein complex on a substrate, and using a transducer such as an SPR, a photon counter, or a quartz oscillator to measure the amount of light or mass as an electrical signal. By converting to and displaying it, it can be applied as a biosensor such as an immunosensor, a gene sensor, or a lipid sensor. Glass, plastic, metal, etc. can be used for the material of the base. In addition, it is possible to use an adhesive such as gelatin or a polymer polymer as a means of bonding the substrate and the protein polyhedron.
  • a cylindrical container through which the sample liquid can pass is used, and the protein complex is filled in this container so as to be in contact with the substance in the sample liquid, so as to be applied as a biosensor. I can do it.
  • the DNA of the enzyme having catalytic activity such as protease, lipase, or esterase is formed into a particulate protein complex in the same manner as in Example 1, and the complex is filled into containers of various forms to thereby fix the catalytic activity. Conversion Can be applied as an enzyme. Examples of the present invention will be described in detail. The present invention is not limited by these examples. Example 1
  • IPLB_Sf21-AE Sf21 derived from insect cell Spodoptera Frugiperda
  • BraCPV is used to form cubic polyhedra of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus (BmCPV).
  • the recombinant virus (AcCP-H) (Hori et al. (1993) J. Gen. Virol. 74, 99-102) which integrated the polyhedrin protein gene of the H strain was inoculated.
  • This AcCP-H is a recombinant virus that incorporates the polymorphic protein gene of the H strain into the downstream of the polyhedrin promoter of the no'culovirus vector derived from Autographa cal ifornica nucleopolyhedrovirus (AcNPV).
  • AcNPV Autographa cal ifornica nucleopolyhedrovirus
  • Plasmid pVP3 (XbaI) EGFP (International Publication No. WO02 / 369785A1) was digested with the restriction enzyme Xbal and further digested with the restriction enzyme Kpnl.
  • This DNA was dissolved in ExoI II buffer 100 / x1 in a tube, added with Exonucleaselll 1 / x1, stirred, and incubated at 25 ° C. 5 ⁇ l of this DNA solution was sampled every 30 seconds, and MB prepared in a separate tube Added to Nuclease Buffer 100. 65.
  • the recovered DNA was digested with the restriction enzyme Xbal for 1 hour, and then transformed into 100 1 competent cell JM109.
  • the above operation was performed using, for example, a Kilo-Sequence Deletion Kit (TaKaRa) according to the protocol (Fig. 1).
  • the transformed Escherichia coli was spread on a 2XTY plate containing kanamycin and cultured at 37 ° C, and the resulting colony was cultured overnight at 37 ° C in a 2XTY medium containing kanamycin. After extracting the plasmid DNA, it was digested with restriction enzymes Bglll and BamHI, and electrophoresed. After confirming that the DNA fragment was shortened, sequence analysis was further performed to confirm the nucleotide sequence of the DNA fragment.
  • the plasmid DNA solution required for the confirmation of the nucleotide sequence was digested with a restriction enzyme Notl and inserted into a Notl site of a baculovirus vector transfer vector-PVL1392 (manufactured by PHARMINGEN). This was transformed into ⁇ of the Combinent Cell JM109, spread on a 2 ⁇ plate containing ampicillin, and cultured at ° 37 ° C. The resulting colonies were cultured at 37 ° C in a 2XTY medium containing ampicillin, plasmid DNA was extracted, and sequence analysis was performed. As a result of analysis, select the insert that is inserted in the correct direction, and select the recombinant transfection vector. TJP2004 / 000032
  • pAcVP3 (x) / EGFP (where x represents the number of bases of S4 cDNA encoding VP3 of BmCPV) (FIG. 2).
  • Each of the constructed recombinant transfer vectors pAcVP3 (x) / EGFP was transfected to insect cultured cells Sf21 by the lipofection method simultaneously with 0.5 / g linear Baculogold Baculovirus DNA (manufactured by PHARMINGEN). Thereafter, plaque purification was performed to produce recombinant virus AcVP3 (x) / EGFP. 3 Creation of protein complex with EGFP as target protein
  • Controls of AcVP3 / GFP (Ikeda et al. (2001) J. Virol. 75, 988-995) and AcCP-H (Mori et al. (1993) J. Gen. Virol. 74, 99-102) were used as controls.
  • double infection with AcVP3 (x) / GFP and AcCP-H was performed. Each of these double infections was performed at 10 p.fu./cell. After allowing the virus to adsorb to the cells for 1 hour at room temperature, remove the virus solution and add 2 ml of TC-100 containing 10% fetal calf serum 27. In C, 4 incubated.
  • a cubic polyhedron was recovered from the infected cells on the fourth day, washed with PBS (20 mM NaH2P04, 20 mM Na2HP04, 150 mM NaCl, pH 7.2), and then triturated on ice using a homogenizer. After washing the trituration solution with 1% Tween20, the polyhedron was recovered by centrifugation. Further, the mixture was centrifuged at 50,000 X g for 45 minutes by a density gradient method using 1.5M-2.2M sucrose to extract a polyhedral fraction. The extracted sample was washed with PBS, and then centrifuged at 15,000 X g for 10 minutes to recover a purified polyhedron. 00032
  • Polyhedra were purified from cells infected with AcVP3 (x) / GFP and AcCP_H and double infected with AcVP3 / GFP and AcCP- ⁇ as a control or double infected with AcVP3 (XbaI) / GFP and AcCP-H.
  • the surroundings of EGFP in the polyhedron were determined based on the presence or absence of fluorescence from the polyhedron (Fig. 3). As a result, in each case, green fluorescence from the polyhedron was observed, and it was confirmed that VP3 / GFP and VP3 (XbaI) / GFP were surrounded by the polyhedron.
  • AcVP3 (x) / GFPs produced as shown in FIG.
  • the VP3 (250) / GFP molecule encoded by the chimeric gene with the region including the VP3 gene from the 5 'end to 250 bases introduced into the 5' end of the EGFP gene is embedded in the polyhedron.
  • a signal for specifically embedding a protein molecule in a polyhedron exists in the region up to 79 amino acid residues at the N-terminus of VP3. Due to the presence of the signal, the VP3 (250) / GFP molecule was surrounded by a polyhedron, so that green fluorescence from the polyhedron could be observed as shown in FIG. '
  • the protein molecule is embedded in the polyhedron via VP3 in a very limited region at the N-terminus of VP3, that is, in the region from the N-terminal 41 amino acid residue of VP3 to 79 amino acid residues. Function as a polyhedron-embedded signal.
  • the signal for enclosing the target protein in the VP3 polyhedron obtained by the present invention has a function sufficient to enclose the target protein in the polyhedron when introduced into the target protein molecule, and However, the target protein had a length that would not hinder the physiological activity of the protein. Furthermore, by shortening the length of VP3 according to the present invention, it is shown that a larger molecule can be embedded in a polyhedron by the length of VP3, and the effect of the present invention is high. 4 000032
  • Example 2 a biosensor using a cubic protein complex of about 10 microns on a side, using human-derived Cycl-independent kinase (CDK5) as the target protein, is described. I do.
  • CDK5 human-derived Cycl-independent kinase
  • the biosensor is created by arranging the composites on slide glass.
  • gelatin solution (gelatin 0.5, Crk O.sub.02) is placed on the slide glass.
  • the complex solution refers to a solution obtained by purifying a complex expressed in large amounts in Sf21 cells and suspending the complex in distilled water. Verification
  • a hydrogen peroxide solution (adjusted to a final concentration of 1% with PBS) was placed on the portion where the complex was dropped, treated at room temperature for 15 minutes, and then washed with PBS (because the hydrogen peroxide solution does not stick).
  • the temperature was adjusted to 5% and added. After 20 minutes at room temperature, wash with PBS.
  • the anti-Cdk5 monoclonal antibody was diluted 100-fold with T-PBS containing 5% serum and reacted at 37 ° C for 3 hours. Then wash with PBS.
  • the biotin-labeled secondary antibody was diluted 100-fold with T-PBS and reacted at 37 ° C for 1 hour. Wash with PBS.
  • solution A and solution B used for ABC reaction are diluted 100-fold with T-PBS and allowed to react for at least 30 minutes. .
  • DAB powder was added to a 5 O mM Tris-HCr solution to a concentration of 50 rag / ml, and 16 ⁇ l of hydrogen peroxide solution was further added thereto, followed by reaction at room temperature for 25 minutes. After completion of the reaction, the plate was immersed in a 5 O mM Tris-HCr solution.
  • an antigen-antibody reaction against Cdk5 molecules and anti-Cdk5 antibody on the surface.
  • an antigen-antibody reaction that is, an interaction between protein molecules between the antigen protein and the antibody protein can be observed.
  • the polyhedron protein which is a protein constituting the polyhedron in which the insect virus is originally encapsulated, and the outer protein VP3 of the cytoplasmic polyhedrosis virus are signaled.
  • a protein complex consisting of the polyhedral protein and the target protein can be efficiently produced.
  • a protein complex obtained by surrounding a protein molecule having a physiological activity function such as enzyme activity, antigen-antibody reaction, or protein-protein interaction with a polyhedral protein is an excellent biosensor and immobilized enzyme. It can be used as

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Abstract

　タンパク質複合体およびその機能を低下させることなく効率よく生産し得る製造方法の提供。タンパク質複合体を利用したバイオセンサー、固定化酵素などの用途の提供。　昆虫ウイルスが封入される多角体タンパク質と細胞質多角体病ウイルスの外殻タンパク質VP3の限定された領域、具体的には、N末端から40アミノ酸残基までと41アミノ酸残基から79アミノ酸残基までのいずれかの範囲にある領域を多角体包埋シグナルとして有する目的タンパク質とからなるタンパク質複合体およびその製造方法。多角体タンパク質は目的タンパク質に対して安定性向上または保護または保存性向上または、それらのいずれかの組み合わせ効果をもたらしている。目的タンパク質は、蛍光または発光機能を有するタンパク質、酵素、抗原、抗体、サイトカイン、受容体、および生理活性タンパク質からなる群から選ばれた少なくとも１種である。上記のタンパク質複合体を基盤上にドット状または線上に配列、固定したことを特徴とするバイオセンサー。

Description

タンパク質複合体及びその製造方法並びにその用途
技術分野 明
この発明は、 タンパク質複合体及びその製造方法並ぴにタンパク質複合体を用 いたバイオセンサ ·固定化酵素等の用途に関する。
書 背景技術
従来から、 タンパク質をタンパク質で包みこんだいわゆるタンパク質 複合体は知られている。 この種タンパク質複合体の作製には、 例えば、 結晶状のタンパク質の表面に溶解したタンパク質溶液を塗布する方法が 考えられる。
しかし、 この方法では、 結晶状のタンパク質を溶解せずに行うことが 極めて困難であった。 このため、 上記方法は、 酵素、 抗原、 抗体、 サイ トカイン、 受容体などの有用なタンパク質 （以下、 目的タンパク質とい う） を保護する目的ではほとんど採用されていないのが実情である。 目的タンパク質の保護には、 多糖類高分子やポリエチレンダリコール などの高分子を目的タンパク質に共有結合させる方法が採用されている。 この方法は、 目的タンパク質のアミノ基ゃカルボ-ル基などの官能基に 温和な反応条件で高分子を結合させるものである。 しかし、 この方法で は、 目的タンパク質の結合部位、 触媒部位などの制御が出来なかった。 また、 結合部位や触媒部位などが目的タンパク質の種類によつて異なる 非特許文献 1 Ikeda et al. (2001) J. Virol. 75， 988-995
発明の開示
本発明は、 上記発明をさらに改良して、 多角体包埋シグナルとなる VP 3を特定範囲に同定することにより、 完成したものである。
本発明は、 サイズ （分子量） を大きく した目的タンパク質、 また蛍光 または発光機能や生理活性機能を有する目的タンパク質、 さらに高分子 性の目的タンパク質を包囲可能にし、 また、 複合体の状態で目的タンパ ク質の機能を検証可能にしたタンパク質複合体を提供することを目的と する。
また、 本発明は、 種種の性質を有する目的タンパク質を包囲したタン パク質複合体の機能を低下させることなく効率よく生産し得る製造方法 を提供することを目的とする。
さらに、 本発明は、 タンパク質複合体を利用したバイオセンサー、 固 定化酵素などの用途を提供することを目的とする。 本発明は、 昆虫ウィルスが封入される多角体タンパク質と細胞質多角 体病ウィルスの外殻タンパク質 VP3の限定された領域を多角体包埋シグ ナルとして有する目的タンパク質とからなるタンパク質複合体を要旨と する。
VP3の限定された領域が、 N末端から 40アミノ酸残基までと 41アミノ酸 残基から 79アミノ酸残基までのいずれかの範囲にあり、 その場合、 本発 明は、 昆虫ウィルスが封入される多角体タンパク質と細胞質多角体病ゥ ィルスの外殻タンパク質の VP3の N末端から 40アミノ酸残基までと 41ァミ 関係によるものであることがわかっている （非特許文献 1 ) 本発明者は、 上述の背景技術に鑑みて、 目的タンパク質の保護、 保存、 安定性向上に寄与するタンパク質複合体及びその製造方法に関する発明 を完成し、 先に出願した （特許文献 1 ) 。 上記発明の明細書は、 この多 角体の中に高分子性の目的タンパク質を包埋させ、 またその包埋効率を 高めることを目的とする。 そこで、 細胞質多角体病ウィルスの外殻タン パク質をコードする遺伝子を短くすることにより、 多角体の中に包埋さ せることができるタンパク質のサイズ （分子量） を大きく し、 さらに効 率良く多角体の中にこの目的とするタンパク質を包埋させる。 さらにそ の手段として目的タンパク質の N末端または C末端に細胞質多角体病ウイ ルスの外層を構成するタンパク質である VP3のアミノ酸配列を導入し、 この融合タンパク質をバキュ口ウィルスべクターで発現させるが、 この 際、 細胞質多角体病ウィルスの多角体タンパク質を発現するウィルスと 共に、 昆虫細胞に感染させることにより、 多角体中に融合タンパク質が 包埋される。 このため、 バキュロウィルスベクターで発現させた外来タ ンパク質、 すなわち目的タンパク質が、 細胞質多角体病ウィルスの構成 タンパク質の N末端または C末端に揷入されるように、 細胞質多角体病ゥ ィルスの構成タンパク質 ¾：コードする cDNAと目的タンパク質遺伝子とを 融合させる必要がある。 この際、 構成タンパク質と目的タンパク質遺伝 子のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームがインフレ ームになるようにすることが重要であり、 このようにして細胞質多角体 病ウィルスの構成タンパク質と目的タンパク質を一つの融合タンパク質 として発現させる組み換えパキュ口ウィルスが形成される、 ということ を記述している。
特許文献 1 国際公開 WO 0 2 / 3 6 7 8 5 A 1号 2
ため、 すべての目的タンパク質に適用することが出来なかった。 目的タンパク質の保存には、 一般に、 低温度で保存する方法が行われ ている。 また、 目的タンパク質に、 その構造を安定化させる機能がある と'期待される保護物質 （例えば、 多糖類高分子、 ポリエチレングリコー ルなど） を添加、 混合する方法も行われている。 しかし、 これらの方法 による時は、 外的要因である環境の変化によって、 目的タンパク質の安 定性や機能が損なわれることがあった。 というのは、 もし周辺への水の 出現、 温 '湿度の上昇、 結露などが生じると、 目的タンパク質が保護物 質とともに容易に溶解するからである。 また、 もし細菌ゃカビなどの腐 敗菌が存在、 侵入または発生すると、 目的タンパク質が保護物質ととも に分解 '捕食されるからである。 よって、 目的タンパク質が一部の酵素 や抗体のタンパク質分子のような高分子のタンパク質のときには、 その 一部でも構造上に変化を受けたり、 タンパク質分解酵素の働きによって その一部が分解されると機能が完全に失われる。 しカゝし、 目的タンパク 質を用いる時には、 その機能を十分に有していることが必須条件である。 このため、 保存状態の目的タンパク質の安定性を個々に検証しなければ ならないが、 従来技術による時は、 目的タンパク質を保護物質から取り 出さなければならず、 このために手数がかかるばかりか目的タンパク質 が変性しやすいことがある。 所で、 細胞質多角体病ウィルスは感染の後期に、 その感染細胞におい て多角体タンパク質からなる多角体を形成し、 その中に多数のウィルス 粒子を包埋する。
この多角体の中にウィルス粒子が特異的に入る理由は、 同ウィルス粒 子の外殻タンパク質である VP 3と多角体タンパク質との間での特異的な 上または、 それらのいずれかの組み合わせ効果をもたらしているタンパ ク質複合体を要旨とする。 また、 本発明は、 目的とするタンパク質をコードする遺伝子を組み込 んだベクターを、 多角体タンパク質遺伝子を組み込んだベクターととも に細胞に感染させた後、 この細胞を培養して、 その中で目的とするタン パク質と多角体タンパク質からなる複合構造のタンパク質複合体を製造 するタンパク質複合体の製造方法を要旨とする。 さらにまた、 本発明は、 昆虫ウィルスが封入される多角体タンパク質 と細胞質多角体病ウィルスの外殻タンパク質の限定された領域、 具体的 には VP3の N末端から 40ァミノ酸残基までと 41ァミノ酸残基から 79ァミノ 酸残基までの ずれかの範囲にある限定された領域を多角体包埋シダナ ルとして有する目的タンパク質、 具体的には蛍光または発光機能を有す るタンパク質、 酵素、 抗原、 抗体、 サイ トカイン、 受容体、 および生理 活性タンパク質からなる群から選ばれた少なく とも 1種である目的タン パク質とからなるタンパク質複合体、 好ましくは多角体タンパク質が目 的タンパク質に対して安定性向上または保護または保存性向上または、 それらのいずれかの組み合わせ効果をもたらしているタンパク質複合体 を基盤上にドット状または線上に配列、 固定したことを特徴とするバイ ォセンサー、 または該タンパク質複合体が基盤上に形成した凹み検体液 中の物質と接触が可能であるように充填されていることを特徴とするバ ィォセンサー、 または該タンパク質複合体が検体液中の物質と接触が可 能であるように容器内に充填ざれていることを特徴とするバイオセンサ 一を要旨とする。 5
ノ酸残基から 79ァミノ酸残基までのいずれかの範囲にある限定された領 域を多角体包埋シグナルとして有する目的タンパク質とからなるタンパ ク質複合体を要旨とする。 多角体タンパク質が目的タンパク質に対して安定性向上または保護ま たは保存性向上または、 それらのいずれかの組み合わせ効果をもたらし ており、 その場合、 本発明は、 昆虫ウィルスが封入される多角体タンパ ク質と細胞質多角体病ウィルスの外殻タンパク質の限定された領域、 具 体的には VP3の N末端から 40ァミノ酸残基までと 41アミノ酸残基から 79ァ ミノ酸残基までのいずれかの範囲にある限定された領域を多角体包埋シ グナルとして有する目的タンパク質とからなり、 多角体タンパク質が目 的タンパク質に対して安定性向上または保護または保存性向上または、 それらのいずれかの組み合わせ効果をもたらしているタンパク質複合体 を要旨とする。 目的タンパク質が、 蛍光または発光機能を有するタンパク質、 酵素、 抗原、 抗体、 サイ トカイン、 受容体、 および生理活性タンパク質からな る群から選ばれた少なくとも 1種であり、 その場合、 本発明は、 昆虫ゥ ィルスが封入される多角体タンパク質と細胞質多角体病ウィルスの外殻 タンパク質の限定された領域、 具体的には VP3の N末端から 40アミノ酸残 基までと 41ァミノ酸残基から 79ァミノ酸残基までのいずれかの範囲にあ る限定された領域を多角体包埋シグナルとして有する、 蛍光または発光 機能を有するタンパク質、 酵素、 抗原、 抗体、 サイ トカイン、 受容体、 および生理活性タンパク質からなる群から選ばれた少なく とも 1種であ る目的タンパク質とからなるタンパク質複合体、 好ましくは多角体タン パク質が目的タンパク質に対して安定性向上または保護または保存性向 また、 本発明は、 昆虫ウィルスが封入される多角体タンパク質と細胞 質多角体病ウィルスの外殻タンパク質の限定された領域、 具体的には
VP3の N末端から 40ァミノ酸残基までと 41ァミノ酸残基から 79ァミノ酸残 基までのいずれかの範囲にある限定された領域を多角体包埋シグナルと して有する目的タンパク質、 具体的には蛍光または発光機能を有するタ ンパク質、 酵素、 抗原、 抗体、 サイ トカイン、 受容体、 および生理活性 タンパク質からなる群から選ばれた少なく とも 1種である目的タンパク 質とからなるタンパク質複合体、 好ましくは多角体タンパク質が目的タ ンパク質に対して安定性向上または保護または保存性向上または、 それ らのいずれかの組み合わせ効果をもたらしているタンパク質複合体が容 器内に充填された固定化酵素を要旨とする。 図面の簡単な説明
第 1図は、 VP3遺伝子を短くするための方法と トランスファーベクタ 一の作成を説明する図面である。
第 2図は、 短所化された VP3遺伝子とそれによつてコードされたァミ ノ酸残基の関係を示す図面である。
第 3図は、 短小化された VP3遺伝子を EGFP遺伝子に導入し、 これによ つてコードされたタンパク質が多角体の中に包囲されているかどうかを 多角体からの緑色蛍光の有無によって測定したものである。
第 4図は、 短小化された VP3の配列をその N末端に持つ EGFPが、 多角体 に包囲された状態で観察された緑色蛍光の強度を示したものである。 蛍 光強度の強さは 1 +、 2 +、 3 +、 4 +、 5 +の 5段階表記した。
第 5図は、 VP3の 39ァミノ酸残基から 79ァミノ酸残基までを多角体に 包囲させるためのシグナノレとして、 これを Cyclin- dependent kinase 5 の N末端に導入した。 このタンパク質を多角体に包囲させた後、 スライ ドガラスに貼付け、 多角体表面上で抗原抗体反応を行わせたものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明に係るタンパク質複合体は、 昆虫ウィルスが封入される多角体 タンパク質で、 細胞質多角体病ウィルスの外殻タンパク質 VP 3の限定さ れた領域を多角体包埋シグナルとして有する目的タンパク質を包囲して なる。 ここで、 包囲とは、 目的タンパク質が多角体タンパク質内に完全 に包み込まれた状態と多角体タンパク質外に一部露出して埋入された状 態とを含むことを意味する。 また、 複合体の形状としては、 立方体、 直 方体、 円柱などの定形や不定形の粒子状が含まれる。 このことによって、 包囲される目的タンパク質の量を増加させたり、 目的タンパク質のサイ ズを大きくすることが出来、 又生理活性機能や触媒機能などの機能を飛 躍的に高めることができる。 本発明において、 VP 3の限定された領域は、 N末端から 40までに加え、 41アミノ酸残基から 79アミノ酸残基の範囲である。 なお、 手数がかかり 非効率になるが、 N末端から 41アミノ酸残基から 79アミノ酸残基の領域 とその領域の N末端もしくは C末端に 10アミノ酸残基付加したものも使用 することは可能である。
さらに、 目的タンパク質は、 生体関連化学物質との結合の点を考慮す ると酵素、 抗原、 抗体、 受容体、 サイ トカインであり、 光化学特性の点 を考慮すると発光タンパク質であり、 電子授受反応の点を考慮すると金 属結合タンパク質、 金属イオン含有酵素である。 これらの目的タンパク 質の特性の点を考慮するとこれらの中から選択し少なくとも 1種である 構成が好適である。 04 000032
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本発明に係るタンパク質複合体の製造方法は、 VP3の限定された領域 をシグナルとして有する目的タンパク質の DNAを組み込んだベタターと 多角体タンパク質の DNAを組み込んだベタターとを同時またはともに昆 虫細胞、 動物細胞、 植物細胞、 無細胞などの細胞に導入した後、 それぞ れの細胞に適した条件で培養することことからなる。 このことによって、 タンパク質複合体の機能を低下させることなく効率よく製造することが できる。 ただし、 目的タンパク質の DNAを組み込んだベクターと多角体 タンパク質の DNAを組み込んだベクターとは、 プラスミ ドベクターゃゥ ィルスべクタ一などであり、 これらはそれぞれ DNAを導入する細胞に適 したものを選択すれば良い。 本発明のタンパク質複合体の用途としては、 基盤上にタンパク質複合 体を配列 · 固定することにより受容体とし、 SPR、 フォトンカウンター または水晶振動子などのトランスデューサ一によつて、 光量または質量 を電気信号に変換し、 表示することにより、 免疫センサー、 遺伝子セン サー、 脂質センサーなどのバイオセンサーとして適用することができる。 基盤の材質には、 ガラス、 プラスチック、 金属などの使用が可能である。 又、 基盤とタンパク質多角体との接着手段に、 ゼラチン、 高分子ポリマ 一などの接着剤の使用が可能である。
また、 上記基盤に代えて、 検体液が通過可能にした筒状の容器をもち いて、 この容器内にタンパク質複合体を検体液中の物質と接触可能に充 填することによりバイオセンサーとして適用することが出来る。
さらに、 触媒能を有するプロテアーゼ、 リパーゼ、 エステラーゼなど の酵素の DNAを実施例 1 と同じ方法で粒子状タンパク質複合体となし、 これを種々の形態の容器に充填することにより、 触媒能を有する固定化 酵素として適用することが出来る。 本願発明の詳細を実施例で説明する。 本願発明はこれら実施例によつ て何ら限定されるものではない。 実施例 1
本発明をより詳細に説術するために、 実施例及び添付の図面に従って これを説明する。
①多角体タンパク質を作るウィルスの作成
昆虫細胞 Spodoptera Frugiperda由来の IPLB_Sf 21- AE ( Sf21) で多角 体を作製する場合、 カイ コ細胞質多角体病ウィルス （Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus, BmCPV) の立方体の多角体を开成さ せるために BraCPVの H系統の多角体タンパク質遺伝子を組み込んだ組み換 えウィルス （AcCP- H) (Mori et al. (1993) J. Gen. Virol. 74, 99- 102 ) を 接 種 し た 。 こ の AcCP- H は Autographa cal ifornica nucleopolyhedrovirus (AcNPV) 由来のノ 'キュロウィルスベクターの polyhedri nプロモーターの下流に H系統の多角本タンパク質遺伝子を組 み込んだ組換えウィルスである。 ②外殻タンパク質 VP 3の限定された領域のみからなるシグナルの解析 1 ) 外殻タンパク質 VP 3をコードする BmCPV S4の短小化
プラスミ ド pVP3 (XbaI) EGFP (国際公開 W0 0 2 / 3 6 7 8 5 A 1号） を 制限酵素 Xbalで消化し、 さらに制限酵素 Kpnlで消化した。 この DNAをチ ユーブ内で ExoI II buffer 100 /x 1に溶角 し、 Exonucleasel l l 1 /x 1を 加えて撹拌した後、 25°Cにてインキュベートした。 この DNA溶液を 30秒 ごとに 5 μ 1ずつサンプリングし、 別のチューブに用意しておいた MB Nuclease Buffer 100 に加えた。 65。Cで 5分間インキュベートして Exonuclease lllを失活させた後、 37°Cに戻して Mung Bean Nuclease 2 μ ΐを加え、 37°Cで 30分間インキュベートした。 フエノール抽出、 エタ ノール沈殿を行った後、 DNAを Klenow Buffer 50 1に溶解して、 Kl enow Flagment を加えた。 37°Cで 15分間インキュベートして完全に末 端修復した後、 10 /z lを分取して、 別のチューブに用意しておいた Ligation Solution A 100 μ ΐにカロえた。 2·らに、 Ligation Solution B 12 μ 1を加えて撹拌し、 16°Cで 3時間反応させてエタノール沈殿おょぴ リンスを行った。 回収した DNAを制限酵素 Xbalで 1時間消化した後、 100 1のコンビテントセル JM109に入れ形質転換させた。 なお、 以上の操作 は例えば Ki lo-Sequence用 Deletion Kit (TaKaRa社製） を用い、 そのプ ロ トコールに従って行ったものである （第 1図） 。
2 ) リコンビナント トランスフ.ァーベクターの構築
形質転換した大腸菌はカナマイシンを含む 2 X TYプレートに撒いて 37 °Cでー晚培養し、 生じたコロニーをカナマイシン含有 2 X TY培地にて 37 °Cで一晩培養した。 プラスミ ド DNAを抽出した後、 制限酵素 Bgl llおよび BamHIで消化し、 電気泳動を行った。 DNA断片が短くなつていることを確 認し、 さらにシークェンス解析を行い、 その DNA断片の塩基配列を確認 した。 塩基配列の確認によって必要となったプラスミ ド DNA溶液を制限 酵素 Not lで消化し、 バキュロウィルスベクターのトランスファーベクタ — PVL1392 (PHARMINGEN社製） の Notl部位に挿入した。 これを ΙΟΟ μ Ιの コンビテントセル JM109に形質転換させ、 アンピシリンを含む 2 Χ ΤΥプレ 一トに撒いて 37°Cでー晚培養した。 生じたコロニーをアンピシリン含有 2 X TY培地にて 37°Cでー晚培養し、 プラスミ ド DNAを抽出し、 シークェン ス解析を行った。 解析の結果、 インサートが正しい方向に挿入されてい る も のを選択 し、 リ コ ン ビナン ト ト ラ ンス フ ァ ーベク タ ー TJP2004/000032
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pAcVP3 (x) /EGFP (ただし xは BmCPVの VP3をコードする S4 cDNAの塩基数 をあらわす） とした （第 2図） 。
3) リコンビナントバキュロウィルス.の構築
構築したリ コンビナント トランスファーべクター pAcVP3(x)/EGFP の それぞれ を 0.5 / gの線状の Baculogold Baculovirus DNA (PHARMINGEN社製） と同時にリポフエクチン法により昆虫培養細胞 Sf21 にトランスフエクシヨンを行った。 その後プラーク純化を行い、 リコン ビナントウィルス AcVP3(x)/EGFPを作製した。 ③ EGFPを目的タンパク質とするタンパク質複合体の作成
1 ) Sf 21細胞におけるリコンビナントタンパク質の発現
対照と して AcVP3/GFP (Ikeda et al. (2001) J. Virol. 75， 988- 995) と AcCP - H (Mori et al. (1993) J. Gen. Virol. 74, 99-102) の ダブル感染や AcVP3(XbaI)/GFP (国際公開 WO 0 2/3 6 7 8 5A1号） と AcCP - Hのダブノレ感染を行った。 一方、 VP3の短小化を目的と して AcVP3 (x) /GFPと AcCP-Hのダブル感染を行った。 これらのダブル感染はそ れぞれ 10 p. f. u. /cellで行った。 ウィルスを 1時間室温で細胞に吸着さ せた後、'ウィルス液を除去し、 2mlの 10%仔ゥシ胎児血清を含む TC- 100 を加え 27。Cで 4曰間ィンキュベートした。
2 ) 多角体の精製
4日目の感染細胞から立方体の多角体を回収した、 PBS (20mM NaH2P04, 20mM Na2HP04, 150m NaCl, pH7.2) で洗った後、 氷中でホモジナイザ 一を用いて磨砕した。 磨砕液は 1%の Tween20で洗浄後、 遠心により多角 体を回収した。 さらに 1.5M - 2.2Mの蔗糖を用いた密度勾配法で 50, 000 X gで 4 5分間遠心し、 多角体の分画を抽出した。 抽出したサンプルは PBS で洗浄した後、 15,000 X gで 10分間遠心して精製した多角体を回収した。 00032
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3 ) 多角体への EGFP包囲の測定
AcVP3 (x) /GFPと AcCP_Hおよび対照として AcVP3/GFPと AcCP-Ηのダプル 感染や AcVP3 (XbaI) /GFPと AcCP- Hのダブル感染した細胞から多角体を精 製し蛍光顕微鏡 （OLYMPUS- 1X7 土製） を用いて、 多角体への EGFPの包囲 を、 多角体からの蛍光の有無によって判別した （第 3図） 。 その結果、 いずれの場合にも多角体からの緑色蛍光が観察され、 多角体の中に VP3/GFPや VP3 (XbaI) /GFPが包囲されることを確認した。 次に、 第 2図に示す通りに作製した AcVP3 (x) /GFPについてすべて、 多 角体への EGFPの包囲を調べた。 その結果、 VP3遺伝子の 5 ' 末端から 250 塩基までを含む領域を EGFP遺伝子の 5 ' 末端に導入したキメラ遺伝子に よってコードされる VP3 (250) /GFP分子は多角体の中に包埋されることが わかった。 すなわち、 VP3の N末端の 79アミノ酸残基までの領域にタンパ ク質分子を多角体の中に特異的に包埋するためのシグナル （多角体包埋 シグナル） が存在することを意味し、 このシグナルの存在によって、 VP3 (250) /GFP分子は多角体に包囲され、 その結果、 第 3図に見られるよ うに多角体からの緑色蛍光を観察することができた。 '
しかし、 VP3遺伝子の 5 ' 末端から 130塩基までを EGFP遺伝子の 5 ' 末端 に導入したキメラ遺伝子の場合、 このキメラ遺伝子によってコードされ る融合 GFP分子 VP3 (130) /GFPは、 多角体に包囲される機能を消失してお り、 多角体からの緑色蛍光は全く観察されなかった （第 3図） 。 これは、
VP3の N末端の 39ァミノ酸残基までの領域には多角体包埋シグナルが存在 しないことを示している。
さらに VP3の 135塩基から 292塩基までを PCR法により增幅させ、 これを EGFP遺伝子の 5 ' 末端に導入したキメラ遺伝子を作製した。 この結果、 これは VP3の N末端の 41アミノ酸残基から 93アミノ酸残基をコードする領 域が EGFPの N末端に導入される こ とになる。 同様にこの VP3 ( 135- 292) /EGFPが多角体の中に包囲されるかどうかを確認したところ、 多角 体からの緑色蛍光が観察された。
以上の結果から、 VP3を介して多角体にタンパク質分子が包埋される には、 VP3の N末端の極限られた領域、 すなわち VP3の N末端 41アミノ酸残 基から 79ァミノ酸残基までの範囲が多角体包埋シグナルとして機能する ことがわかった。
VP3を短くすることの効果
VP3遺伝子の 5 ' 末端から、 様々な長さの領域をコードする遺伝子を GFP遺伝子の 5 ' 末端に導入することによって、 GFPの N末端に VP3由来の 様々なアミノ酸配列の領域を導入した。 このキメラ遺伝子から発現した 融合 GFP分子による緑色蛍光の発色を比較した。 その結果、 第 4図に示' す通り、 GFPの N末端に導入される VP3の領域が短くなるにつれて、 緑色 蛍光の発色が増大した。 しかし、 VP3の N末端から 79アミノ酸残基よりも 短く した場合では、 ほぼ同じ緑色蛍光の発色であった。 このように、 目 的タンパク質に他のァミノ酸配列を導入した場合、 その配列の長さが短 くなるにつれ目的タンパク質の生理活性が高くなる。 しかし、 その配列 が必要以上に短くなるとそのシグナルとしての機能が失われる。
本発明で得られた VP3の多角体に目的タンパク質を包囲させるための シグナルは、 目的タンパク質分子に導入した場合、 その目的タンパク質 を多角体の中に包囲させるのに十分な機能を有し、 なおかつ、 その目的 タンパク質の生理活性の妨げとはならない長さであった。 さらに、 本発 明により VP3の長さを短く したことによって、 その削除した分だけ大き な分子を多角体に包埋できることを示しており、 本発明の効果は高い。 4 000032
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次に、 実施例 1の手順に従い、 目的タンパク質と して人由来の Cycl in- dependent kinase (CDK 5 )を適用した、 一辺が約 1 0ミクロンの 立方体のタンパク質複合体を用いたバイオセンサについて説明する。 実施例 2
スライ ドガラス上に複合体を並べバイオセンサを作成する。
スライ ドガラスにゼラチン溶液 （ゼラチン 0 . 5、 Crk O . 0 2 ) を
5 1滴下した。 なお、 Crkは CHROMIUM POTASSIUM SULFATE (防腐剤） で ある。
新しいスライ ドガラスと表側どうしを静かに合わせ、 溶液が広がった らゆっく り両側に引いた。 ゼラチンが完全に乾いたら、 よく撹拌した複 合体溶液を Ι μ ΐ滴下し、 その後乾燥させバイオセンサを作成した。 こ のセンサを使用するまで蒸留水中に浸漬しておく。
なお、 複合体溶液とは Sf21細胞内で大量発現させた複合体を精製し、 蒸留水に懸濁したものを指す。 検証
検証方法
①ペルォキシダ一ゼ活性の抑制
複合体を滴下した部分に過酸化水素溶液 （PBSで終濃度 1 %に調節） をのせ、 1 5分間室温で処理後、 PBSで洗浄 （過酸化水素溶液がのこさ ないため） した。
これによつて、 バックグランドとなるペルォキシダ一ゼ活性を抑制し た。
②正常血清ブロッキング （5 %NHS)
正常ゥマ血清を 0 . 3 %TritonX— 1 0 0を含む PBS (T- PBS) で終濃 T JP2004/000032
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度 5 %になるように調節し、 添加した。 室温で 2 0分間経過後、 T一 PBS で洗浄。
③一次抗体反応
5 %血清を含む T— PBSで抗 Cdk 5モノク口ール抗体を 1 0 0倍希釈し、 3 7 °C 3時間反応させた。 その後 T一 PBSで洗浄。
④ビォチン標識抗マウス: [ gG抗体反応
ビォチン標識した二次抗体を T— PBSで 1 0 0倍希釈し、 3 7 °〇で1時 間反応させた。 T一 PBSで洗浄。
一方、 ABC反応に使用する A液、 B液を T一 PBSで 1 0 0倍希釈し、 少な く とも 3 0分は反応させておく。 .
⑤ ABC試薬との反応（VECTASTAIN ABC KIT STANDARD PK— 6 1 0 0 ) 室温で一時間反応させた後、 Τ一 PBSで洗浄した。
⑥洗浄
次の DABはリン酸と反応して沈殿を形成するので、 PBSを置き換えるた めに、 5 0 mMTRIS— HC (pH 7 . 5 )で軽く洗浄し、 液を置換した。
⑦ DAB基質とのインキュベーション
5 O mM Tri s— HCr溶液に DAB粉末を 5 0 rag/mlの濃度になるよう添カロし、 さらに 1 6 μ 1の過酸化水素水を加え、 室温で 2 5分間反応させた。 反 応終了後、 5 O mM Tris— HCr溶液中に浸けた。
⑧グリセリン PBSでの封入
スライ ドガラスが乾いたらグリセリン PBSをサンプル上に一滴おとし て、 うえからカバーガラスを気泡が入らない様にのせた。 上記の検証方法を用いて、 目的タンパク質が包囲されたタンパク質複 合体と何もタンパク質を包囲していない多角体に抗原 ·抗体反応を試み た。 その結果は第 5図に示すように Cdk5を包囲したタンパク質複合体で P T/JP2004/000032
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は、 その表面上で Cdk5分子と抗 Cdk5抗体に対する抗原 ·抗体反応を見る ことができた。 このように、 融合目的タンパク質を包囲したタンパク質 複合体の表面上で抗原抗体反応、 すなわち抗原タンパク質と抗体タンパ ク質との間におけるタンパク質分子間相互作用を見ることできる。
産業上の利用可能性
以上、 詳しく説明したとおり、 本発明によって、 本来昆虫ウィルスが 封入される多角体を構成するタンパク質である多角体タンパク質と細胞 質多角体病ウィルスの外殻タンパク質 VP3の限定された領域のみをシグ ナルとして、 これを目的タンパク質に導入することにより、 多角体タン パク質と目的タンパク質からなるタンパク質複合体を効率よく生産でき る。
又、 酵素活性、 抗原 ·抗体反応、 タンパク質間相互作用などの生理活 性機能を有するタンパク質分子を多角体タンパク質によって包囲するこ とによって得られたタンパク質複合体は、 優れたバイオセンサーや固定 化酵素としての使用が可能である。

Claims

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1 . 昆虫ウィルスが封入される多角体タンパク質と細胞質多角体病'ゥ ィルスの外殻タンパク質 VP3の限定された領域を多角体包埋シグナルと して有する目的タンパク質とからなるタンパク質複合体。
請
2 . VP3の限定された領域が、 N末端から 40アミノ酸残基までと 41アミ ノ酸残基から 79ァミノ酸残基までのいずれかの範囲にある請求項 1記載 のタンパク質複合体。
3 . 多角体タンパク質が目的タンパク質に対して安定性向上または保 囲
護または保存性向上または、 それらのいずれかの組み合わせ効果をもた らしている請求項 1のタンパク質複合体。
4 . 目的タンパク質が、 蛍光または発光機能を有するタンパク質、 酵 素、 抗原、 抗体、 サイ トカイン、 受容体、 および生理活性タンパク質か らなる群から選ばれた少なく とも 1種である請求項 1記載のタンパク質 複合体。
5 . 目的とするタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベタタ一 を、 多角体タンパク質遺伝子を組み込んだベクターとともに細胞に感染 させた後、 この細胞を培養して、 その中で目的とするタンパク質と多角 体タンパク質からなる複合構造のタンパク質複合体を製造するタンパク 質複合体の製造方法。
6 . 請求項 1ないし 4のいずれかに記載のタンパク質複合体を基盤上 にドッ ト状または線上に配列、 固定したことを特徴とするバイオセンサ
7 . 請求項 1ないし 4のいずれかに記載のタンパク質複合体が基盤上 に形成した凹み検体液中の物質と接触が可能であるように充填されてい ることを特徴とするバイオセンサー。
8 . 請求項 1ないし 4のいずれかに記載のタンパク質複合体が検体液 中の物質と接触が可能であるように容器内に充填されていることを特徴 とするバイオセンサー。
9 . 請求項 1ないし 4のいずれかに記載のタンパク質複合体の目.的タ ンパク質が酵素である容器に充填された固定化酵素。
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